CN113801883B

CN113801883B - 一种钙化相关蛋白基因及其应用

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Publication number: CN113801883B
Application number: CN202111365449.4A
Authority: CN
Inventors: 李法君; 解延年; 付春鹏; 吴丰涛
Original assignee: Weifang University of Science and Technology
Current assignee: Weifang University of Science and Technology
Priority date: 2021-11-18
Filing date: 2021-11-18
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2041-11-18
Also published as: CN113801883A

Abstract

本发明涉及甲壳动物生长发育领域，具体涉及一种钙化相关蛋白（CRP）基因及其在日本沼虾蜕壳过程和生长发育的应用。日本沼虾钙化相关蛋白（CRP）基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。本发明首次阐明了CRP基因的生物学功能：（1）调控日本沼虾的蜕壳；（2）通过调控蜕壳过程，CRP基因也在日本沼虾的生长发育过程中发挥作用。

Description

一种钙化相关蛋白基因及其应用

技术领域

本发明涉及甲壳动物生长发育领域，具体涉及一种钙化相关蛋白（CRP）基因及其在日本沼虾蜕壳过程和生长发育的应用。

背景技术

十足目甲壳动物主要为各种虾、蟹类。蜕壳，也叫蜕壳，即甲壳动物蜕去旧表皮长出新表皮的过程，是甲壳动物生长和发育的标志特征，贯穿其整个生命周期。甲壳动物每一次蜕壳往往会迎来一次跳跃式的增长，蜕壳前后体重差异极大。近几年来，我国的甲壳类水产动物养殖规模不断扩大，虾蟹类的养殖产量逐年上升，蜕壳失败一直是给甲壳类水产养殖造成严重损失的主要原因之一，因此蜕壳的调控机制一直是甲壳类水产动物研究的重点领域之一。

日本沼虾（Macrobrachium nipponense），俗称青虾、河虾，隶属于十足目、长臂虾科、沼虾属。具有适应性强、生长速度快、繁殖力强、个体大、营养丰富等特点，是我国大规模养殖的淡水经济虾类中唯一的本土品种。根据《2021年中国渔业统计年鉴》，我国养殖青虾年产量已超过为23万吨。日本沼虾养殖已经成为渔民增产创收的重要手段之一，在我国的水产养殖中发挥着重要作用。近来随着养殖规模的不断扩大，日本沼虾出现了生产性能逐渐下降的现象，其中蜕壳困难和蜕壳失败导致的死亡率日益提高，特别是夏季高温季节，给养殖户造成的严重的经济损失。日本沼虾蜕壳是一个复杂的生物学过程，其中蜕壳相关基因的表达与调控至关重要。因此，鉴定并明确日本沼虾蜕壳过程中的重要基因就成为当前亟待解决的问题。

钙化相关蛋白（calcification-related peptide，CRP）基因的功能还鲜有研究，是否参与了甲壳动物动物蜕壳过程，还未见报道。

发明内容

本发明目的在于明确一种日本沼虾钙化相关蛋白（CRP）基因及其在调控日本沼虾蜕壳、生长发育中的应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种钙化相关蛋白基因,日本沼虾钙化相关蛋白（CRP）基因的碱基序列如SEQ IDNO:1所示。

一种钙化相关蛋白基因的应用,所述SEQ ID NO:1所示日本沼虾钙化相关蛋白（calcification-related peptide，CRP）基因的双链RNA在调控日本沼虾蜕壳与生长中的应用。

所述日本沼虾CRP基因的双链RNA的碱基序列为SEQ ID NO:5所示。

一种调控日本沼虾蜕壳与生长的基因，调控日本沼虾蜕壳与生长的基因为所述SEQ ID NO:1所示基因的双链RNA，如SEQ ID NO:5中所示的碱基序列。

一种延长日本沼虾蜕壳周期的制剂，含所述的日本沼虾CRP基因的双链RNA（dsRNA-CRP）。

所述制剂中含dsRNA浓度为4-8 μg/μL。

所述日本沼虾CRP基因的双链RNA（dsRNA-CRP）为利用RNA干扰（RNAi）技术，根据SEQ ID NO:1所示的碱基序列CRP基因的开放阅读框设计干扰引物，以日本沼虾的肌肉总RNA为模板进行PCR反应，再以PCR反应液为模板进行体外合成如SEQ ID NO:5所示的双链RNA（dsRNA），将获得的双链RNA（dsRNA-CRP）溶解于DEPC水中即得到延长日本沼虾蜕壳周期的制剂。

所述根据SEQ ID NO:1所示的碱基序列CRP基因的开放阅读框设计干扰引物为正向上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，反向下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。

一种所述制剂的应用，所述制剂在干扰CRP基因调控日本沼虾蜕壳和生长中的应用。

本发明所具有的优点：

本发明首次鉴定了日本沼虾的CRP基因序列。甲壳动物的蜕壳周期分为：蜕壳前期、蜕壳期、蜕壳后期和蜕壳间期。CRP基因在蜕壳后期高丰度表达，表明：CRP参与了新壳的形成过程（蜕壳后期主要是完成新壳的形成），在蜕壳过程中发挥作用。

本发明将dsRNA- CRP提供至到日本沼虾体内，其在dsRNA刺激下的表达变化及其对日本沼虾蜕壳周期、体重的变化，阐明CRP基因的功能，推动CRP在其它甲壳动物中的研究。

本发明通过日本沼虾CRP基因获得其dsRNA，通过显微注射的方式将dsRNA注入日本沼虾体内，结果表明：干扰CRP基因会导致日本沼虾的蜕壳周期延长、生长变缓。证明了CRP基因可以通过蜕壳周期来调控日本沼虾的生长发育，该研究结果为研究日本沼虾的蜕壳、生长提供了重要的参考基因。

附图说明

图1 为本发明实施例提供的日本沼虾CRP基因在不同组织的表达情况；其中，不同的组织包括：肌肉、眼柄、鳃、脑、肝脏、表皮和神经节，a，b，c，d代表各组间差异显著。

图2 为本发明实施例提供的日本沼虾CRP基因在蜕壳周期的表达情况，其中蜕壳周期包括：蜕壳前期、蜕壳期、蜕壳后期和蜕壳间期，a，b，c，d代表各组间差异显著。

图3 为本发明实施例提供的雄性日本沼虾注射dsRNA-CRP后的干扰效率图，其中：7d、14d、21d和28d 分别是指注射后第7天、第14天、第21天和第28天。**代表P<0.01，干扰组为注射dsRNA-CRP，对照组为注射相同剂量的DEPC水。

图4为本发明实施例提供的雌性日本沼虾注射dsRNA-CRP后的干扰效率图，其中：7d、14d、21d和28d 分别是指注射后第7天、第14天、第21天和第28天。**代表P<0.01，干扰组为注射dsRNA-CRP，对照组为注射相同剂量的DEPC水。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J. 萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本文使用的近似语在整个说明书和权利要求书中可用于修饰任何数量表述，其可在不导致其相关的基本功能发生变化的条件下准许进行改变。因此，由诸如“约”的术语修饰的值并不局限于所指定的精确值。在至少一些情况下，近似语可与用于测量该值的仪器的精度相对应。除非上下文或语句中另有指出，否则范围界限可以进行组合和/或互换，并且这种范围被确定为且包括本文中所包括的所有子范围。除了在操作实施例中或其他地方中指明之外，说明书和权利要求书中所使用的所有表示成分的量、反应条件等等的数字或表达在所有情况下都应被理解为受到词语“约”的修饰。

本发明提供的引物从日本沼虾的肌肉中克隆了一种CRP基因；根据CRP基因的开放阅读框设计RNA干扰引物，将双链RNA注射到日本沼虾体内沉默CRP基因，可使日本沼虾的蜕壳次周期缩短、生长速度加快，该结果为提升日本沼虾的生产性能提供了理论参考。本发明首次阐明了CRP基因具有调控甲壳动物生长发育的功能。

本发明提供的引物从日本沼虾的肌肉中克隆了一种CRP基因；在蜕壳后期高丰度表达，表明CRP基因在日本沼虾的蜕壳过程中发挥重要作用；根据CRP基因的开放阅读框设计RNA干扰引物，将双链RNA注射到日本沼虾体内沉默CRP基因，可使日本沼虾的蜕壳周期延长、生长变缓。

实施例1：日本沼虾CRP基因全长cDNA的获得

总RNA提取：选取3 g左右的日本沼虾，取其肌肉，放入盛有液氮的预冷研钵中，迅速研磨。使用Takara公司的RNAiso Plus提取试剂结合传统的酚仿抽提法进行提取肌肉的总RNA。经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，分光光度计分析该样品OD260/280 比值在1.8～2.0 之间，并测定RNA的浓度。

cDNA第一链合成：以上述RNA为模板，按照Takara M-MLV反转录试剂盒说明书进行第一链cDNA的合成。反应体系如下：

总反应体系为 20μl，按顺序加入：

Dnase 处理的RNA 1μg

5× iScript Reaction Mix 4μl

iscript reverse transcriptase 1μl

Nuclease-free water 14μl

轻轻混匀，离心，25℃ 5 min，42℃ 30 min，然后 85℃ 5 min，-20℃保存备用。

日本沼虾CRP全长cDNA序列的克隆：

1)根据上述获得合成的含日本沼虾肌肉转录组的中间片段的cDNA第一链为模板，设计正向引物MF（SEQ ID NO:6）、正向引物MR（SEQ ID NO:7），进行中间片段的验证。PCR扩增反应体系如下：

PCR反应程序为：94℃预变性3min，然后进入下列循环：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃90s，30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

2)利用上海生工生物工程有限公司(Sangon)的柱式DNA 胶回收试剂盒进行目的片段的回收，将产物（上面获得cDNA中间片段）连接到pMD18-T载体（Takara），并转化入大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，将插入目的片段的阳性克隆送至上海铂尚生物公司进行测序分析。

3)根据CRP基因cDNA中间片段序列，设计特异性正向引物3F（SEQ ID NO:8）和5R（SEQ ID NO:9）分别进行3’和5’快速扩增，操作步骤按SMARTer® RACE 5’/3’ Kit试剂盒说明书进行。按上述克隆的步骤进行随后的切胶、回收、转化、克隆及测序最终得到CRP基因的3’和5’端序列。将中间片段和3’和5’端的测序结果进行比对，拼接得到日本沼虾CRP基因全长cDNA序列（SEQ ID NO:1）。

实施例2：日本沼虾CRP基因dsRNA的合成

以SEQ ID NO:1核苷酸序列为依据，在CRP基因开放阅读框（序列表中带有下划线部分）以内设计制备双链RNA 的引物(SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3)，再以日本沼虾的肌肉总RNA为模板进行如下PCR反应，

得到的序列如SEQ ID NO:4所示。

而后根据Transcript AidTM T7 High Yield Transcription kit (Fermentas,Inc., USA)试剂盒说明进行体外转录合成dsRNA，以PCR反应液为模板进行体外合成双链RNA（dsRNA）如SEQ ID NO:5所示

反应体系如下：

将反应液缓慢混匀，转录在PCR仪上进行，反应条件为：37℃ 2h。所得的转录产物进行后续的纯化。

将上述获得体外合成双链RNA（dsRNA）经1.5%琼脂糖凝胶鉴定，而后将dsRNA序列（dsRNA-CRP）溶解在DEPC 水中，浓度为6 μg/μL，待用。

实施例3：日本沼虾CRP的组织分布及在蜕壳周期中的表达

1.组织取样：

挑取健康的日本沼虾，解剖取肌肉、眼柄、鳃、脑、肝脏、表皮、神经节等组织。所取组织放入RNA保存液中，置于-20°C保存，用于RNA提取。

2.蜕壳周期取样：

甲壳动物蜕壳周期主要由蜕壳后期、蜕壳间期、蜕壳前期和蜕壳期 4个时期组成。取上述4个时期的肌肉组织，置于-20°C保存，用于RNA提取。

3.荧光定量PCR：

通过反转录酶的作用将RNA反转录成cDNA，然后通过PCR技术对cDNA进行扩增，并向PCR反应体系中加入荧光基团，通过对荧光信号的观测实时监测整个PCR进程，最后通过内参曲线对未知曲线进行相对定量分析。

如图1所示：日本沼虾CRP基因在肌肉组织中高丰度表达，由此表明：肌肉为日本沼虾CRP基因的主要转录器官；如图2所示：CRP基因在蜕壳后期高丰度表达，而蜕壳后期主要是进行新壳的构建。因为日本沼虾的肌肉与外壳紧密相连，上述结果表明：来源于肌肉的钙化相关蛋白参与了新壳的构建过程。

实施例4：注射dsRNA-CRP对日本沼虾生长发育的影响

1. 实验虾的选择

挑选活力较强，个体均匀，体重在3g左右的成体雌雄沼虾各60只，平均分成两组（每组30只），一组为实验组（RNAi组），即上述获得dsRNA-CRP溶解液，另一组为DEPC水组对照组。实验组与对照组注射剂量为5 μg/g；实验前在的玻璃缸内中充气暂养，水温为25℃，使其适应实验室养殖环境，每天早晚各投喂次螺狮和人工饵料。

2. dsRNA-CRP注射和生长参数检测

以5 μg/g的注射剂量，将dsRNA-CRP溶解液从日本沼虾头胸甲基部注入围心腔内,对照组注射DEPC水。干扰时间为4周，每周注射一次。分别在7d、14d、21d和28d取肌肉组织并保存在RNA保存液中。最后提取各样品的总RNA并反转成cDNA。采用荧光定量PCR技术检测CRP相对于对照组的表达量变化，以此来计算干扰效率。实验结束测量对照组和实验组的体重，并分析数据（参见图3、图4和表1）。

干扰效率=干扰后的表达量/干扰前的表达量

如图3所示，与对照组日本沼虾肌肉的表达量相比，实验组中雄性日本沼虾CRP的表达量在干扰后的7d、14d、21d和28d分别下降了84.29%、83.98%、81.68%和82.38%。

如图4所示，与对照组日本沼虾肌肉的表达量相比，实验组中雌性日本沼虾CRP的表达量在干扰后的7d、14d、21d和28d分别下降了82.30%、84.92%、80.79%和82.10%。

上述结果表明，dsRNA-CRP溶解液有效降低了CRP的表达水平。

表1 日本沼虾RNAi实验中蜕壳个体和平均体重的变化

如表1所示，RNAi干扰组中雄虾和雌虾的蜕壳个数分别为14只和15只，而对照组中雄虾和雌虾的蜕壳个数分别为26只和25只。与对照组相比，RNAi干扰组雄雌虾的平均体重分别减重0.22g和0.32 g。

由上述结果表明，干扰CRP基因会导致日本沼虾的蜕壳周期延长、生长变缓，因此CRP在日本沼虾的蜕壳、生长发育过程中发挥重要调控功能。

SEQ ID NO:1

CTCCGATCCAGCAACATGAAGTTCGCACTCGCCGTAGTTTTGGCCATGGTAGCCATGGTCTATGCCCGA CCAGACAACGTCCTAGACATTGATCTCGAAGACATCCTGCTGGACCAGGACATCGCTGAGGACTCCACCGTCACTGG ATCCTACACATGGACCGACCCCGATGGCAACCAGCACTTCGTCAAGTACGTCGCTGACGAGGACGGCTACAGAGTCC TGGAGTCCAACGTCGTCCCAGCCACTGCTGACGGACTCAGGGCCAACGGCGAACAGGGATCCTTCGTCTCCCTGGAG GATCTCGACGACAAATAAGCGACTAGAACGACTTCTATAGACTCATCGATTTCACGAACCTTCATTTCCCCTTCCATTTT

SEQ ID NO:2

TAATACGACTCACTATAGGGGAAGTTCGCACTCGCCGTAG

SEQ ID NO:3

TAATACGACT CACTATAGGGTTGTCGTCGAGATCCTCCAG

SEQ ID NO:4

GAAGTTCGCACTCGCCGTAGTTTTGGCCATGGTAGCCATGGTCTATGCCCGACCAGACAACGTCCTAGACATTGATCTCGAAGACATCCTGCTGGACCAGGACATCGCTGAGGACTCCACCGTCACTGGATCCTACACATGGACCGACCCCGATGGCAACCAGCACTTCGTCAAGTACGTCGCTGACGAGGACGGCTACAGAGTCCTGGAGTCCAACGTCGTCCCAGCCACTGCTGACGGACTCAGGGCCAACGGCGAACAGGGATCCTTCGTCTCCCTGGAGGATCTCGACGACAA

SEQ ID NO:5

GAAGUUCGCACUCGCCGUAGUUUUGGCCAUGGUAGCCAUGGUCUAUGCCCGACCAGACAACGUCCUAGACAUUGAUCUCGAAGACAUCCUGCUGGACCAGGACAUCGCUGAGGACUCCACCGUCACUGGAUCCUACACAUGGACCGACCCCGAUGGCAACCAGCACUUCGUCAAGUACGUCGCUGACGAGGACGGCUACAGAGUCCUGGAGUCCAACGUCGUCCCAGCCACUGCUGACGGACUCAGGGCCAACGGCGAACAGGGAUCCUUCGUCUCCCUGGAGGAUCUCGACGACAA

SEQ ID NO:6

CAACATGAAGTTCGCACTCG

SEQ ID NO:7

CGATGAGTCTATAGAAGTCG

SEQ ID NO:8

GATCCCTGTTCGCCGTTGGCCCTGAGTCC

SEQ ID NO:9

CATGGTCTATGCCCGACCAGACAACGTCC。

序列表

<110> 潍坊科技学院

<120> 一种钙化相关蛋白基因及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 380

<212> DNA

<213> 日本沼虾(Macrobrachium nipponense)

<400> 1

ctccgatcca gcaacatgaa gttcgcactc gccgtagttt tggccatggt agccatggtc 60

tatgcccgac cagacaacgt cctagacatt gatctcgaag acatcctgct ggaccaggac 120

atcgctgagg actccaccgt cactggatcc tacacatgga ccgaccccga tggcaaccag 180

cacttcgtca agtacgtcgc tgacgaggac ggctacagag tcctggagtc caacgtcgtc 240

ccagccactg ctgacggact cagggccaac ggcgaacagg gatccttcgt ctccctggag 300

gatctcgacg acaaataagc gactagaacg acttctatag actcatcgat ttcacgaacc 360

ttcatttccc cttccatttt 380

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatacgact cactataggg gaagttcgca ctcgccgtag 40

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taatacgact cactataggg ttgtcgtcga gatcctccag 40

<210> 4

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaagttcgca ctcgccgtag ttttggccat ggtagccatg gtctatgccc gaccagacaa 60

cgtcctagac attgatctcg aagacatcct gctggaccag gacatcgctg aggactccac 120

cgtcactgga tcctacacat ggaccgaccc cgatggcaac cagcacttcg tcaagtacgt 180

cgctgacgag gacggctaca gagtcctgga gtccaacgtc gtcccagcca ctgctgacgg 240

actcagggcc aacggcgaac agggatcctt cgtctccctg gaggatctcg acgacaa 297

<210> 5

<211> 297

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaguucgca cucgccguag uuuuggccau gguagccaug gucuaugccc gaccagacaa 60

cguccuagac auugaucucg aagacauccu gcuggaccag gacaucgcug aggacuccac 120

cgucacugga uccuacacau ggaccgaccc cgauggcaac cagcacuucg ucaaguacgu 180

cgcugacgag gacggcuaca gaguccugga guccaacguc gucccagcca cugcugacgg 240

acucagggcc aacggcgaac agggauccuu cgucucccug gaggaucucg acgacaa 297

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caacatgaag ttcgcactcg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgatgagtct atagaagtcg 20

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatccctgtt cgccgttggc cctgagtcc 29

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

catggtctat gcccgaccag acaacgtcc 29

Claims

1.一种钙化相关蛋白基因，其特征在于：日本沼虾钙化相关蛋白基因的碱基序列如SEQID NO:1所示。

2.一种权利要求1所述的钙化相关蛋白基因的应用，其特征在于：所述SEQ ID NO:1所示日本沼虾钙化相关蛋白基因的双链RNA在抑制日本沼虾蜕壳与生长中的应用。

3.按权利要求2所述的应用，其特征在于：所述日本沼虾CRP基因的双链RNA的碱基序列为SEQ ID NO:5所示。

4.一种调控日本沼虾蜕壳与生长的基因，其特征在于：调控日本沼虾蜕壳与生长的基因为权利要求1所述SEQ ID NO:1所示基因的双链RNA，如SEQ ID NO:5中所示的碱基序列。

5.一种延长日本沼虾蜕壳周期的制剂，其特征在于：含权利要求1所述SEQ ID NO:1所示基因的双链RNA，如SEQ ID NO:5中所示的碱基序列。

6.按权利要求5所述的延长日本沼虾蜕壳周期的制剂，其特征在于：所述制剂中含dsRNA浓度为4-8 μg/μL。

7.按权利要求5所述的延长日本沼虾蜕壳周期的制剂，其特征在于：所述日本沼虾CRP基因的双链RNA为利用RNA干扰技术，根据SEQ ID NO:1所示的碱基序列CRP基因的开放阅读框设计干扰引物，以日本沼虾的肌肉总RNA为模板进行PCR反应，再以PCR反应液为模板进行体外合成如SEQ ID NO:5所示的双链RNA，将获得的双链RNA溶解于DEPC水中即得到延长日本沼虾蜕壳周期的制剂。

8.如权利要求7所述的延长日本沼虾蜕壳周期的制剂，其特征在于：所述根据SEQ IDNO:1所示的碱基序列CRP基因的开放阅读框设计干扰引物为正向上游引物序列如SEQ IDNO:2所示，反向下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。

9.一种如权利要求5所述制剂的应用，其特征在于：所述制剂在干扰CRP基因调控日本沼虾蜕壳和生长中的应用。