CN105420258B - 烟草ATP synthase内参基因的克隆方法及其应用 - Google Patents

烟草ATP synthase内参基因的克隆方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及烟草ATP synthase内参基因的克隆方法及其应用。本发明所获得的ATP synthase基因的部分核苷酸序列可作为研究烟草功能基因或不同组织、不同生长发育阶段以及不同激素处理条件下的基因表达分析的内参基因。利用该内参基因设计的实时荧光定量PCR引物扩增特异性强，能够提高烟草基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性。

Description

烟草ATP synthase内参基因的克隆方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及烟草基因表达过程中所需的一种内参基因ATP synthase。
背景技术
烟草（Nicotianatabacum L.）为茄科烟草属，含有尼古丁（Nicotine）的叶用一年生作物。人类使用烟草大约有1500年的历史，作为烟草工业的重要原料，将叶片采收后经过调制、分级、加工处理，制成卷烟、雪茄烟、斗烟、嚼烟及鼻烟等，供人嗜用。烟草是经典的基因工程研究模式作物之一，然而，在分析烟草基因表达过程中可供选择的内参基因并不多见。目前，文献中报道较多的有GAPDH、EF-1a，而在其他植物中广泛使用的内参基因，在烟草中并未得到明确的克隆和验证。同时，由于内参基因的选择存在不通用性，即不同物种间的内参基因存在差异性。这就要求在烟草中使用其他植物中的内参基因，要根据实验要求开展必要的稳定性评价与鉴定。随着基因芯片技术越来越成熟， 大量的基因芯片数据为新内参基因的挖掘提供了良好的数据基础和平台，为内参基因的选择提供了更为广阔的空间。与传统同源性比对方法所获的内参基因相比较，通过基因芯片表达技术筛选到的内参具有高量表达和稳定表达的特性。
实时荧光定量PCR( real-time quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。利用qRT-PCR分析基因表达水平是现在分子生物学中重要的研究手段，qRT-PCR具有定量准确、灵敏度高和高通量等特点。在qRT-PCR中，对目标基因相对表达量的分析是通过内参基因的均一化来确定。因此，内参基因的选择是qRT-PCR的关键步骤。一个理想的内参基因应该是在不同发育阶段和不同组织器官中稳定表达，且表达量不受其他外界因素、实验处理条件的影响。迄今为止，尚未发现特别理想的内参基因。因此，研究者必须结合各自的实验条件和样品类型来选择合适的内参基因。
ATP synthase是植物细胞能量合成中关键的一个酶，在植物细胞生物学代谢过程中扮演一个基本的重要角色，ATP synthase基因在植物不同组织器官以及不同生长阶段的高量、稳定表达对植物的生命活动有着重要的意义。ATP synthase基因在动物中作为内参基因的研究较多，而在植物中鲜有相关报道。
发明内容
本发明提供烟草ATP synthase基因序列，可作为烟草内参基因的应用。并同时提供克隆烟草ATP synthase基因的特异性引物，建立基于SYBR Green荧光染料技术的qRT-PCR方法，从而作为烟草ATP synthase的内参基因，为利用实时荧光定量PCR对烟草基因表达分析的研究提供有用的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种烟草ATP synthase基因序列的克隆方法，通过对烟草不同生长发育时期的99个不同组织样本的芯片表达数据分析，筛选出在所有样品中稳定表达的变异系数（coefficient of variation，CV）较小的组成型ATP synthase基因序列，以引物对ATPsynthase-F/ATP synthase-R进行PCR扩增、获得阳性克隆，后经质粒测序验证；其中引物序列如SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2所示。
所获得的目的片段如SEQ ID NO.3，大小为681bp。
所述PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，共25个循环，再72℃终延伸10 min，4℃保存。
本发明还提供一种qRT-PCR扩增ATP synthase基因部分序列的方法，以ATPsynthase的基因序列为基础，按照qRT-PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物。以烟草不同生长发育时期、不同组织器官以及不同激素处理条件下的20个样本的cDNA为模板，利用半定量PCR评估ATP synthase基因表达水平的稳定性和可靠性之后，进一步进行实时荧光定量PCR扩增，荧光染料为SYBR Green，其中qRT-PCR的定量引物，其序列如SEQ IDNO.4/SEQ ID NO.5所示。
所述的qRT-PCR扩增反应程序如下：在95℃预变性10 min，先运行40个循环再95℃变性15 s，60℃退火30 s，然后为检测PCR扩增基因的特异性，在PCR反应之后运用溶解曲线，扩增温度以0.5℃的增幅从65℃缓慢递增到95℃，每个增幅的时间为5 s。
本发明的有益效果在于：
1．本发明首次克隆到烟草ATP synthase 基因，其稳定性和特异性经由半定量PCR和实时荧光定量PCR检测和验证；
2．ATP synthase 基因不仅在烟草不同组织器官、不同生长发育阶段的组织中稳定表达，而且能够在各种激素处理条件下亦稳定表达。ATP synthase 基因稳定表达的特性，为烟草不同发育阶段、不同组织器官、不同激素处理相关基因表达的定量研究提供了新的高可信度的内参基因；
3．经实验验证，本发明所设计的用于荧光定量PCR检测的引物亦可用于半定量PCR快速检测，且扩增特异性和稳定性良好。
附图说明
图1: 本发明中烟草ATP synthase 基因扩增的1%琼脂糖凝胶电泳图；
其中：M为BM2000 Marker，1为烟草ATP synthase基因；
图2：本发明的ATP synthase基因在烟草不同生长发育阶段、不同组织器官中PCR扩增的1%琼脂糖凝胶电泳图；
图3：本发明的ATP synthase基因在烟草不同激素处理条件PCR扩增的1%琼脂糖凝胶电泳图；
图4：本发明中ATP synthase基因实时荧光定量PCR扩增曲线图；
图5：本发明中ATP synthase基因实时荧光定量PCR扩增的溶解曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。
实施例1.烟草ATP synthase基因的克隆
1.1烟草总RNA提取：
取约100mg烟草新鲜组织，在液氮中迅速研磨成粉末，加入相应量BB6（每1mLBB6，加10µLβ-巯基乙醇，现用现配），涡旋剧烈振荡混匀；室温孵育3min后，12000g离心2-5 min，小心吸取离心管中的上清至RNase-free的离心管中；向上清中加入0.5倍体积无水乙醇，并涡旋彻底混匀，分散沉淀，再将得到的溶液和沉淀一起加入离心柱中，以12000g离心30s，弃掉流出液后，加500µL CB6， 室温12000g离心30s，弃掉流出液；向离心柱中央加入80μL的DNaseⅠ工作液，室温放置15min，重复该步骤一次，以除去基因组DNA；加500µL WB6，12000g离心30s，弃掉流出液；再12000g离心2min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟，彻底晾干离心柱后，加50µL RNase-free H2O在离心柱的中央，室温静置1min，12000g离心2min，洗脱RNA。将1µL原始样品稀释10倍或100倍后，取5µL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品的完整性检测。并取1µLRNA用微量紫外分光光度计（NanoDrop2000）测定RNA样品的纯度和浓度值。将合格样品 置于-80℃保存待用。
1.2 PCR扩增引物序列
ATP synthase的上游引物如SEQ ID NO.1所示； ATP synthase的下游引物如SEQID NO.2所示。
根据基因芯片表达分析所得到的在不同生长发育时期组织样本中稳定表达、且变异系数较小的ATP synthase 基因，用Primer 5.0软件设计该扩增引物，最后由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
1.3 反转录（RT）
以烟草总RNA为模板，在25 µL的反转录体系设置和反应过程中依次加入以下试剂：2.0µgRNA，1.5μLOligo(dT)Primer(20 μmol/L)，再加RNase-free H2O至 14μL；70℃温浴6 min后，迅速将离心管放入冰浴中，再依次加入5.0µL的M-MLV 5×Buffer，1.0 µL的M-MLV 逆转录酶，1.0µL的RNase inhibitor和4.0µLdNTP Mixture，混匀后，42℃温育75 min，加水稀释5倍后，-20℃保存。
1.4 聚合酶链式反应（PCR）
以步骤1.3得到的cDNA为模板，以步骤1.2中获得的序列为引物进行PCR扩增。PCR采用以下25μl反应体系：50ng模板、1µL的正、反向引物、1µL EasyTaq（全式金生物技术有限公司），加水至25 µL。PCR反应程序设置为：94℃预变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共25个循环，循环结束后进行72℃终延伸10 min，4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳来检测目的片段（图1）。
1.5 目的基因的克隆与测序
对目标片段进行切胶回收，纯化后的DNA片段连接到pMD18T simple vector载体上，转入大肠杆菌感受态细胞中，经蓝白斑筛选和PCR检测，对阳性克隆进行测序，得到681bp 的ATP synthase的核苷酸序列（具体序列见SEQ ID NO.3）。
实施例2.烟草ATP synthase基因在不同组织器官及不同生长发育阶段表达的稳定性分析
2.1 样品的制备
分别以烟草幼苗期根、旺长期根、成熟期根、盛花期根、茎、叶、萼片、花冠、柱头、子房、雄蕊、雌蕊12个组织器官的总RNA反转录得到的cDNA为模板，具体提取方法详见实施例1中1.1、1.3所述。
2.2 RT-qPCR引物的合成
qPCR上游引物如SEQ ID NO.4所示；qPCR下游引物如SEQ ID NO.5所示；
由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
2.3 聚合酶链式反应（PCR）
以步骤2.1中的cDNA为模板，以2.2中获得的引物进行PCR扩增反应。PCR反应体系：在25 µL 的体系中依次加：50 ng模板、1 µL的正、反向引物、1 µL EasyTaq，加水至25 µL。PCR反应程序为：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，共25个循环。再72℃终延伸10 min，4℃保存。PCR反应结束后，取2 µL PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像观察。
2.4实验结果
检测结果如图2所示，扩增到12条亮度基本一致、单一的条带，表明在ATPsynthase基因烟草不同生长发育阶段、不同组织器官中表达稳定，同时还表明，本发明设计的实时荧光定量PCR引物具有很高的特异性。
实施例3.烟草ATP synthase基因在不同激素处理条件下表达的稳定性分析
3.1 不同激素处理的烟草样品的制备
将烟草种子置于培养皿中，加入Hoagland溶液在光照和黑暗12/12 h（25/23℃）条件下培养，至发芽后2周时用以下激素进行处理5小时：10μmol/L的生长素（IAA）、独脚金内酯(GR24)、细胞分裂素（6-BA）和油菜素内酯（BR）， 50μmol/L的脱落酸（ABA）和的赤霉素（GA）以及100μmol/L的茉莉酸甲酯（MeJA），取整株幼苗烟草参照实施例1中1.1方法提取RNA，并参照实施例1中1.3制取cDNA。
3.2聚合酶链式反应（PCR）
以步骤3.1中的cDNA为模板，以2.2中获得的引物进行PCR扩增反应，以具体方法详见实施例2中2.3所述。
3.3实验结果
检测结果如图3所示，在采用实施例2中的实时荧光定量PCR引物为引物时，在经7种激素处理的烟草样品中扩增到与对照（未处理）样品亮度基本一致的条带，从而表明ATPsynthase基因在不同激素的处理后能够稳定表达。
实施例4. ATP synthase基因在烟草中的特异性实时荧光定量PCR的检测
4.1样品的制备
参照实施例1中1.1步骤提取烟草总RNA，并参照实施例1中1.4步骤反转录制成cDNA。
4.2荧光定量PCR
以4.1中cDNA为模板，以2.2中合成的引物为定量引物，用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行PCR扩增反应。在25 µL的反转录体系设置和反应过程中依次加入以下试剂:12.5 µL SYBR Green qPCR Mix，50 ng cDNA为模板，实例2中实时荧光定量PCR的正、反向引物各1 µL（浓度为10 µmol/L），再加蒸馏水至25 µL，反应程序为：95℃预变性10 min，先运行40个循环再95℃变性15 s，60℃退火30 s。为检测PCR扩增基因的特异性，在PCR反应之后运用溶解曲线分析，扩增温度以0.5℃的增幅从65℃缓慢递增到95℃，每个增幅的时间为5 s，连续检测样品的荧光强度以获取溶解曲线。
4.3实验结果
反应结果如图4所示，3次重复的荧光定量PCR扩增曲线在20个循环出现，且稳定良好，表明基因丰度高而稳定；溶解曲线结果如图5所示：Tm值为81℃，只有一个特异而尖锐的峰，表明本发明设计的定量扩增引物特异性强、无非特异性产物扩增出现。
最终表明，ATP synthase基因在烟草内表达稳定，可作为定量烟草的内参基因，通过该内参基因研究烟草基因表达分析时，能够提高烟草基因表达分析研究的可靠性和稳定性。

Claims (8)

1.一种烟草ATP synthase内参基因的克隆方法，其特征在于：通过对烟草组织样本的芯片表达数据分析，筛选出ATP synthase基因序列，以引物对ATP synthase-F/ATPsynthase-R进行PCR扩增、获得阳性克隆，后经质粒测序验证；其中引物序列如SEQ IDNO.1/SEQ ID NO.2所示；
所获得的目的片段如SEQ ID NO.3，大小为681bp。
2.根据权利要求1所述的烟草ATP synthase内参基因的克隆方法，其特征在于：通过对烟草不同生长发育时期的50~150个不同组织样本的芯片表达数据分析，筛选在所有样品中稳定表达且变异系数较小的组成型ATP synthase基因序列。
3.根据权利要求1所述的烟草ATP synthase内参基因的克隆方法，其特征在于：通过对烟草不同生长发育时期的99个不同组织样本的芯片表达数据分析。
4.根据权利要求2所述的烟草ATP synthase内参基因的克隆方法，所述PCR扩增的反应条件如下：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，共25个循环,再72℃终延伸10 min，4℃保存。
5.一种烟草ATP synthase内参基因的qRT-PCR扩增方法，其特征在于：以ATP synthase的基因序列为基础，设计1对荧光定量特异引物，其序列如SEQ ID NO.4/SEQ ID NO.5所示，以10~30个烟草样本的cDNA为模板，进行qRT-PCR扩增，荧光染料为SYBR Green。
6.根据权利要求5所述的烟草ATP synthase内参基因的qRT-PCR扩增方法，其特征在于：以ATP synthase的基因序列为基础，按照实时荧光定量PCR引物设计的原则，设计1对荧光定量特异引物，以不同生长发育时期、不同组织器官，以及不同激素处理条件下的20个烟草样本的cDNA为模板。
7.根据权利要求5所述的烟草ATP synthase内参基因的qRT-PCR扩增方法，其特征在于：在利用半定量PCR评估ATP synthase基因表达水平的稳定性和可靠性之后进行qRT-PCR扩增，所述半定量PCR扩增程序如下：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，共25个循环，再72℃终延伸10 min，4℃保存。
8.如权利要求1所述的烟草ATP synthase内参基因作为烟草功能基因或不同发育时期基因表达的相对水平的内参基因中的应用。
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