CN108383899B - 一种调控黄金梨果顶硬化的wrky转录因子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控黄金梨果顶硬化的WRKY转录因子。所述WRKY转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；WRKY转录因子的真核表达载体为pSuper1300。本发明以黄金梨正常果实和果顶硬化果实为试材，在果实发育阶段喷施2%CaCl₂溶液，并通过转录组测序挖掘黄金梨正常果实及果顶硬化症果实间的差异表达基因，进一步验证其表达模式，筛选出在果顶硬化发生过程中起关键作用的基因PpWRKY基因，以期为研究黄金梨果顶硬化症的发生机理提供理论参考。

Description

一种调控黄金梨果顶硬化的WRKY转录因子

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种调控黄金梨果顶硬化的WRKY转录因子。

背景技术

黄金梨属砂梨系统，是我国引进的梨优良品种之一。其成熟时果皮呈黄绿色，贮藏后变为金黄色，且果形端正，果面光洁，果肉细腻，汁多肉脆，综合品质极优，深受消费者和种植者喜爱。然而，近年来黄金梨出现了一种果实生理性病害，俗称“黄顶病”、“铁头病”。发生果顶硬化症的黄金梨果实萼洼及其周围果皮呈铜绿色，果顶突出，果皮变厚，果肉细胞木质化，口感差，贮藏性和商品性降低，严重影响了果实外观品质和食用品质，大大降低了经济效益，也在一定程度上制约了黄金梨产业的发展。因此，探究其发病机制及有效的防治方法是当前亟待解决的问题。

黄金梨果顶硬化症是一种果实顶部细胞发育障碍致使果肉木质化的生理病害，而木质素的合成过程中伴随着多种与木质素合成相关的酶的参与，目前我们已经成功克隆获得了PAL、4CL、POD、CCR基因等，发现通过一系列反应后，最终木质素单体在POD等的催化下合成木质素，从而诱导果顶硬化症的发生。此外果顶硬化症的发生与果实中矿质营养失衡、砧木类型、水肥管理等多种因素相关。目前国外在欧洲梨、巴梨、长十郎上也发现了果顶硬化现象，但由于其发病机制复杂，还有待进一步研究。

WRKY转录因子在植物生长发育过程中具有重要意义，其与种子发育、休眠、发芽以及生物和非生物胁迫响应有关。而且WRKY转录因子是植物中一个较大的转录因子家族，其家族成员的N端包含一个或两个WRKY结构域，由高度保守的氨基酸序列WRKYGQK 组成，C端则为一个锌指类似结构域。通过这些结构域，WRKYs能够直接结合目标基因启动子上的W-box元件（(T)(T)TGAC(C/T)），激活或抑制目标基因的转录。根据WRKY结构域的个数和锌指结构的特点，可将WRKY转录因子家族分为三类：Ⅰ类含有2个WRKY结构域和一个CX4-5CX22-23HXH（C2H2）型锌指结构，Ⅱ类含有 1个WRKY结构域和一个C2H2型锌指结构，Ⅲ类则含有 1个WRKY结构域和一个CX4-5CX22-23HXH（C2HC）型锌指结构。

发明内容

为了探明黄金梨果顶硬化症的发生机理，本发明提供一种调控黄金梨果顶硬化的WRKY转录因子。

本发明首先以黄金梨正常果实和果顶硬化果实为试材，通过转录组测序分析二者之间的差异基因，鉴定了调控黄金梨果顶硬化的WRKY转录因子，然后设计基因特异性引物，从黄金梨果肉中克隆获得WRKY转录因子全长cDNA，通过q-PCR验证、亚细胞定位、果实瞬时表达，发现WRKY在果顶硬化中的果实中高表达，是调控黄金梨果顶硬化的关键基因。

一种调控黄金梨果顶硬化的WRKY转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述WRKY转录因子的真核表达载体为pSuper1300。

本发明首次发现WRKY转录因子在果顶硬化的梨果实中高表达。

本发明的有益技术效果体现在：目前关于梨果顶硬化的报道较少，本发明通过转录组测序挖掘黄金梨正常果实及果顶硬化症果实间的差异表达基因，进一步验证其表达模式，筛选出在果顶硬化发生过程中起关键作用的基因PpWRKY基因，为研究黄金梨果顶硬化症的发生机理提供理论参考，对研究梨果顶硬化机制以及后续应用具有重要的意义。

附图说明

图1为PpWRKY转录因子的PCR扩增电泳图。

图2为黄金梨发育阶段正常果实和果顶硬化果实中PpWRKY转录因子基因表达模式图。

图3为采前CaCl₂处理对黄金梨果实贮藏期间的PpWRKY转录因子基因表达模式的影响图。

图4为PpWRKY在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位图。

图5为PpWRKY瞬时表达对果实表型及木质素染色的影响图。

图6为PpWRKY瞬时表达对木质素合成相关基因表达模式的影响图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，对本发明的技术方案进一步详细说明。

本发明涉及的调控黄金梨果顶硬化的基因，名称为PpWRKY，含1062个bp。WRKY转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，WRKY转录因子的真核表达载体为pSuper1300。

本发明基因的表达载体也在本发明的保护范围之内。

实施例1，转录组测序及数据分析。

1. 用NEBNext Poly（A）mRNA Magnetic Isolation Module（NEB，E7490）富集真核生物mRNA；用MICROBExpres Bacterial mRNA Enrichment Kit（invitrogen，

AM1905）去除rRNA，富集mRNA。以mRNA为模板，用NEBNext mRNA Library PrepMaster Mix Set for Illumina（NEB, E6110）和NEBNext Multiplex Oligosfor

llumina（NEB, E7500）构建上机文库。制备好的文库用1.8 %琼脂糖凝胶电泳检测文库插入片段大小（Insert Size），然后用Library Quantification Kit-Illumina GA

I Universal（Kapa，KK4824）进行q-PCR定量。检测合格的文库在Illumina cbot上进行簇的生成，最后于北京百迈客生物科技公司采用Illumina HiSeq^TM 2500进行测序。

2. 对测序得到的原始双端reads序列进行数据评估，去除低质量的reads和rRNA序列，将过滤后的高质量reads序列与参考序列进行比对，使用TopHat软件将各样品测序得到的reads与西洋梨（Pyrus communis）参考基因组进行比对。再基于比对结果进行插入片段大小检验、随机性检验等基础分析，以及基因结构分析、表达量分析、基因功能注释等高级分析。

实施例2，WRKY基因cDNA序列的获得及测序。

1.RNA的提取及cDNA的合成

（1）每0.1-5 g冷冻的研磨过的植物组织（大概8 mL位置），加入5 mL RNAplantPlus Reagent试剂，震荡至彻底混匀。

（2）室温放置5分钟（平放离心管，使表面积最大）。

（3）4℃10000 rpm离心3min，将上清转入新的无RNAase离心管。

（4）每5 mL上清加1 mL 5 M NaCl，混匀。

（5）每5 mL上清加3 mL氯仿，上下颠倒混匀。

（6）4℃10000 rpm离心15min（可以延长，使蛋白质、DNA与RNA分离更彻底），取上层水相转移至新的离心管。

注意：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可重复步骤5、6一次。

（7）测量所得水相体积，加0.9倍体积异丙醇，混匀，室温放置10分钟。

（8）4℃10000 rpm离心15min，弃上清，注意不要倒出沉淀，加1mL 75%乙醇，转移至1.5 mL离心管中。

（9）4℃5000 rpm离心5min，小心倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，室温晾干3-5min。

（10）加无RNAase水，反复吹打、混匀，充分溶解RNA（例如，每1 g叶片可用200 μL左右无RNAase水溶解），如有絮状物，可室温12000 rpm离心1min，取上清转入干净的无RNAase离心管，-70 ℃保存。

（11）cDNA 反转录按Prime Script^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒（大连TaKaRa）说明书进行操作。

2．PCR分析

反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1min，共30个循环；72 ℃终延伸10 min，4℃ 恒温。

3. 根据转录组测序获得的PpWRKY基因ORF区序列，利用Premier 5.0软件设计克隆用引物，采用的引物为:PpWRKY-F：5’- ATGGAGAAGAGAAAGAGCAT-3’，PpWRKY-R：5’-TTAAGCCAAATATTCTGGGG-3’。以黄金梨果实中RNA反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，见图1，M为DL2000的Marker，获得的片段长度约为1000bp左右。分离和回收特异片段，然后与pMD19-T 载体连接后筛选阳性克隆，目标片段回收连接转化后送至青岛擎科梓熙生物技术进行测序，测序结果为1062 bp。

4. 实时荧光定量（q-PCR）引物设计

通过primer 3（http://primer3.ut.ee/）在线设计q-PCR引物。PpWRKY：

PpWRKY-F 5’-ACAGCTCGTGAAACTATGT-3’

PpWRKY-R 5’-TAGCCTCTTGGATGATTAG-3’

5. q-PCR检测方法

q-PCR检测在Real-time Quantitive PCR 仪上操作（瑞士 Roche 480）。反应体系：总体积20 μL，其中包括2 μL cDNA模板，上下游引物各0.4 μL，10 μL 2×Light Cycler^® 480 SYBR Green I Master（瑞士 Roche），以不加cDNA模板为阴性对照。计算方法为2^-ΔΔCt法。q-PCR结果显示，PpWRKY基因随果实发育表达量先升高后下降，且二者在果顶硬化果实中较正常果实明显上调（见图2）。在采后贮藏阶段，正常果实中，PpWRKY的基因表达量在贮藏阶段亦无显著变化，而在果顶硬化果实中始终上调，且采前CaCl₂处理抑制了该基因的表达。此外，PpWRKY在黄金梨果实贮藏阶段的基因表达模式与发育阶段相同，表明其基因表达模式较稳定（见图3）。

实施例3，洋葱亚细胞定位：洋葱内表皮转化

（1）选择新鲜的黄皮洋葱，剥去外面3-4层鳞片后，在超净工作台上剥取洋葱内部鳞片，用手术刀将内表皮切成1 cm²左右的方块，用镊子剥取内表皮，将其剥离的一面向下平铺在1/2 MS固体培养基上，28 ℃黑暗条件下培养24 h。

（2）制备侵染液：取之前保存的农杆菌菌液（pCAMBIA1300-PpWRKY及空载体pCAMBIA1300）于LB液体培养基（含100 mg/L Kan和100 mg/L Rif）中，置于28 ℃恒温摇床上200 rpm震荡培养至OD600为0.6左右，转移至50 mL离心管中5000 rpm离心10 min，收集菌体，弃上清后用等体积含20 mg/L乙酰丁香酮（AS）的1/2MS液体培养基重悬两次，以空载体pCAMBIA1300为对照。

（3）将预培养的洋葱内表皮放入上述侵染液内，侵染15-20 min，期间不断摇晃，将侵染后的洋葱表皮置于无菌滤纸上展平并吸干多余菌液，转入1/2 MS固体培养基（含20mg/L AS）上28 ℃暗培养16 -24 d。

（4）将暗培养后的洋葱表皮置于1/2 MS液体培养基和无菌水中依次冲洗，将其展平置于干净的载玻片上，盖上盖玻片后排气泡，置于激光共聚焦扫描显微镜下观察目的蛋白的亚细胞定位情况并拍照。亚细胞定位结果如图4所示，pCAMBIA1300空载体在洋葱表皮细胞的细胞膜及细胞核中均有分布，而pCAMBIA1300-PpWRKY则仅在细胞核中分布，说明PpWRKY具有核定位信号。

实施例4，瞬时表达

1、农杆菌悬浮液MMA溶液的配制：配制浓度为0.5 mol/L的脂肪酸甲酯磺酸盐

溶液（MES），1 mol/LMgCl₂溶液，0.1 mol/LAS溶液，分别取上述MES溶液2

mL、MgCl₂溶液1 mL、AS溶液0.1 mL，ddH₂O定容至100 mL，配制成MMA溶液（100mmol/L MES，10 mmol/L MgCl₂，10 μmol/L AS）；

2、制备侵染液：所用载体为pSuper1300，总长度为10844bp，所用酶切位点为HindIII和Kpn I。取之前保存的农杆菌菌液（pSuper1300-PpWRKY及空载体pSuper1300）于LB液体培养基（含100 mg/L Kan和100 mg/L Rif）中，置于28 ℃恒温摇床上200 rpm震荡培养至OD600为0.6-0.8，转移至50 mL离心管中5000 rpm离心10 min，收集菌体，弃上清后用等体积MMA溶液重悬两次，以空载体pSuper1300为对照；

3、果实注射：用无菌一次性注射器针头在果顶硬化症果实萼端扎孔，将注射器去针头后吸取1 mL侵染液，轻轻按压通过针孔注射进入果实（注射速度为1 mL/min），注射后的果实置于室温黑暗保存，分别于注射后1 d、3 d、5 d、10 d取样，液氮速冻后置于-70 ℃超低温冰箱备用。

实施例5，注射后果实的木质素染色

果肉组织中的木质素用Weisner试剂（间苯三酚／浓盐酸）进行染色。切取注射部位厚度约1 mm的果肉，置于Weisner试剂中染色3 min，观察染色情况并拍照。瞬时表达后的结果见图5，注射3 d后，注射pSuper1300空载体侵染液和pSuper1300-PpWRKY侵染液的部位外观无明显差异。注射5 d后，注射pSuper1300-PpWRKY侵染液的果皮比注射pSuper1300空载体侵染液的果皮绿，注射10 d后该表型更明显，且注射pSuper1300-PpWRKY侵染液的果皮呈绿色，硬度较大，出现果顶硬化类似表型。注射部位果肉组织的木质素染色结果显示，自注射后1 d起，注射pSuper1300-PpWRKY侵染液的果肉染色较注射pSuper1300空载体侵染液的果肉染色深，说明PpWRKY在果顶硬化果实中的过表达促进了果肉中木质素的积累。

同时，瞬时过表达PpWRKY基因显著提高了果顶硬化果实中该基因的表达，在注射后5 d时达到表达高峰。瞬时表达PpWRKY基因对木质素合成相关基因PpCCR的表达有较稳定的正调控，PpCCR的基因表达高峰出现在注射后第3 d（见图6）。

综上所述，WRKY在黄金梨果顶硬化的果实中表达量高，瞬时表达后，木质素含量增多，果皮发绿，出现果顶硬化加重症状，说明WRKY在梨果顶硬化果实中过表达促进了果实的果顶硬化症发生。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到技术方案的简单变化或等效替换均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种调控黄金梨果顶硬化的WRKY基因

<130> 1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1062

<212> DNA

<213> PpWRKY

<400> 1

atggagaaga gaaagagcat ggagcgggag caggagagtc taaccagtga gctaaagcaa 60

gggaaggagc tggctgagca gctcatgagc cacctccacc attcctcctc agaagaaaca 120

agagattctc tgatttcaaa gatactgttt tcatatgaga aggcactctc actgctcaca 180

ggtactgggg atggatctgt tggagaatcc aaacacatca cagctcgtga aactatgttg 240

gaatcaccaa cttcatttgg caatagtagc ccactgagtg agatctctga ccaggattgc 300

aagcacaaaa atgtcttcaa gaagacgaaa acaatgccca gctggactga ggaagtgaag 360

gtttcctctg gaacagggtt agatgggagc cttgatgatg gctatagttg gagaaaatat 420

ggccaaaaga atatcctcgg agctaatcat ccaagaggct actacagatg cacacatcgt 480

ggaacacagg gttgcgtagc taccaagcaa gttcagaaat cagatgcaga tccaacaacc 540

ttcgtgataa cctacagggg agtccatact tgtaacaaag cctctcagtt ggctagggtt 600

aagcaagggt taaagggcaa ccaaaataaa accctagaag taaaaaaagc gaaacaattt 660

tcaccagaga tgtcgttcag ttttggaaga gcagggctta gagttaaaac tgaaaatttg 720

gacgctagag aggatgatat attttcaccc ttctccttcc cttccactcc gattgaatcc 780

gaaaaagttg gggaccatat tttctgctca acgatgatgg agaacaattt ggtcgatggc 840

tatgctccaa tatttggatc tccagcagca acgtttgagt cggactactt ggcggtgtca 900

ccgtgccatt tgagcagttt cggactagcg catgatgtgc agacttcaga atctggtctc 960

actgagataa tctcagatcc aacttcagtt accaattcac caattgggga ttttgatttc 1020

tcaattgatg atttggaatt tcccccagaa tatttggctt aa 1062

Claims (2)

1.一种调控黄金梨果顶硬化的WRKY转录因子，其特征在于：所述WRKY转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的一种调控黄金梨果顶硬化的WRKY转录因子，其特征在于：所述WRKY转录因子与pSuper1300构建重组载体WRKY-pSuper1300后，转化到果实中能促进梨果实果顶硬化症的发生。

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