CN104099344A - 梨转录因子PsJOINTLESS及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了梨转录因子PsJOINTLESS及其应用。一种分离自‘库尔勒香梨’具有促进植物器官脱落功能的转录因子PsJOINTLESS基因，属于MADS-box家族成员，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2所示。通过农杆菌介导遗传转化方法将转录因子转化番茄，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PsJOINTLESS基因具有促进植物器官脱落的功能。PsJOINTLESS基因的发现，为促进植物器官脱落的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。

Description

梨转录因子PsJOINTLESS及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及梨转录因子PsJOINTLESS及其应用，具体涉及从‘库尔勒香梨’中分离、克隆得到一个植物器官脱落相关的MADS-box家族成员PsJOINTLESS基因及其应用。

背景技术

器官脱落，是指植物细胞、组织或器官脱离母体的生理过程。器官脱落是细胞结构、代谢和基因表达变化共同作用的结果。一般情况下，把器官或组织脱落的组织区域及其邻近部分称为“离区(Abscission Zone)”，而把此区域内仅发生组织与细胞分离的数层细胞叫“离层”。对多种植物园艺植物器官离区的解剖结构观察显示，不同植物离层细胞大小有3种类型：①离层细胞比邻近细胞小，大多等径；离层细胞比邻近细胞小，大多长方形；离层细胞大小与相邻细胞近似。器官或组织脱落的组织区域内细胞小而等径，胞质致密，胞间隙小(Deng et al,2007；Rosales et al,2009；Ayeh et al,2009)。

植物激素在植物器官脱落的发生过程中起着一定的作用，其中乙烯和生长素类激素发挥主要作用(Meir et al,2010；Patterson and Bleecker,2004)。生长素在器官脱落过程中与乙烯的作用相拮抗，它控制离区细胞在适当的时间对乙烯产生应答，而乙烯则影响生长素的极性运输。

器官分离脱落是细胞壁和中胶层在离层部位断裂的结果。在离层产生的过程中，果胶降解，胞间层增大，开孔并消失，期间伴随微纤丝结构解体，呼吸代谢和细胞壁水解酶活性的增加。目前研究最多的是脱落相关的酶类主要有多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)、纤维素酶(Cellulase，EG)。此外，参与细胞壁降解的酶类还有果胶甲酯酶(Pectinmethylesterase，PME)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)、几丁质酶(Chitinase)、多酚氧化酶、膜相关的类受体蛋白激酶(Burr et al,2011)等也与植物器官脱落有关(Bunya-atichart K et al,2011；Wang et al,2005)。

脱落过程伴随着一系列基因表达的变化，已经鉴定出多个与离区发育相关的基因。如拟南芥中已发现的控制花器官离区发育的唯一一对功能重复基因BLADE ON PETIOLE1/2(BOP1/2)，双突变体bop1bop2中不能形成花器官离区，而像叶柄发育和器官的非对称性生长等性状也受到不同程度的影响(Norberge et al,2005；McKim et al,2008)。影响番茄花柄离区发育的基因LATERAL SUPPRESSOR(LS)，该基因突变后部分花柄离区发育受到影响而消失(Schumacher et al.,1999)。番茄中，还有其他的一些基因本身并不影响离区的形成，但在器官脱落中起着一定的作用。利用VIGS系统特异沉默了TAPGs(tomoto abscission-relatedpolygalacturonases)基因，能够延迟乙烯处理后番茄叶片的脱落和增加叶片断裂力，说明此类基因在番茄叶片脱落的过程中扮演重要的角色(Jiang et al.,2008)。番茄中的CEL1(cellulase1)基因也参与番茄花柄脱落的过程(Gonzalez-Bosch et al.,1997)。番茄1,4-β-葡聚糖酶(cel2)反义抑制转基因植株中，显著提高了番茄果实离区的断裂力(Brummelll et al.,1999)。

对于植物离区发育在模式植物拟南芥、经济作物番茄、禾本科作物水稻、小麦中的解析，很大程度上帮助植物育种专家有效解决禾本科植物落粒、果树生理落果、豆类作物提前开荚等问题。必须指出的是，虽然已经从不同物种中克隆出JOINTLESS序列，但是大部分JOINTLESS序列在器官脱落过程中的功能仍有待进一步验证。此外，有关JOINTLESS的大部分信息来源于茄科植物，如番茄、辣椒等，但有关果树的JOINTLESS的研究则非常有限。本发明以‘库尔勒香梨’为试材，利用同源克隆技术，克隆得到梨JOINTLESS基因的全长序列，并分析其在脱萼处理、宿萼处理下不同时期花萼不同部位的表达特性；构建植物超表达载体，通过根癌农杆菌介导法遗传转化Micro-Tom番茄使其过量表达，证明其可能参与番茄花(果)柄离区发育的过程，从而扩展了离区发育的分子调控途径。另外，克隆梨中有关器官脱落的基因很大程度上提高作物改良和育种的效率，对农业生产也具有非常重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进落花落果转录因子PsJOINTLESS基因。

本发明的另一目的是提供该基因的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种分离自‘库尔勒香梨’具有促进植物器官脱落功能的转录因子PsJOINTLESS基因，属于MADS-box家族成员，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，包含672bp的开放阅读框；编码224个氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2所示，等电点为5.48，分子量为25.43kDa。。

含有本发明所述PsJOINTLESS基因的重组表达载体。

所述的重组表达载体，优选以pCAMBIA1301为出发载体，所述PsJOINTLESS基因的插入位点为Nco I和BstE II之间。

含有本发明所述PsJOINTLESS基因的宿主菌。

克隆本发明所述PsJOINTLESS基因cDNA序列的引物对，上游引物PsJOINTLESS-F1序列如SEQ ID No.3所示，下游引物PsJOINTLESS-R1序列如SEQ ID No.4所示。

本发明所述PsJOINTLESS基因在促进番茄花(果)柄脱落中的应用。

本发明所述的重组表达载体在促进番茄花(果)柄脱落中的应用。

有益效果

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

1.PsJOINTLESS基因的发现，为促进植物器官脱落的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。

2.通过农杆菌介导遗传转化方法将转录因子转化番茄，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PsJOINTLESS基因具有促进植物器官脱落的功能。

附图说明

图1为本发明PsJOINTLESS基因在脱萼处理和宿萼处理后的时空表达模式分析。

图2为本发明PsJOINTLESS基因亚细胞定位示意图。

其中：图A，GFP基因(对照)在明场、图B，紫外线(UV)光下的成像，图C为二者叠加后的成像；图D和图E，PsJOINTLESS基因在明场、UV光下的成像，图F为二者叠加后的图像。

图3为本发明实施例3的载体构建流程示意图。

图4为PsJOINTLESS基因转基因植株PCR鉴定示意图。其中，利用PsJOINTLESS基因特异引物PCR鉴定番茄转基因植株。M：DL2000Marker，P：质粒，WT：野生型植株，1-9：转基因株系；具有特异条带的为转基因植株，没有特定条带的为假阳性植株。

图5为本发明PsJOINTLESS基因在转基因植株的基因表达量分析示意图(半定量RT-PCR)。WT为野生型，其余编号：转基因株系。

图6为转PsJOINTLESS基因的番茄表型观察示意图。其中：图A和图B分别为野生型与转基因株系，与野生型相比，转基因植株表现出易脱落的症状；图C和图D分别为野生型与转基因株系，转基因株系相对于野生型番茄，花柄离区前移，花柄明显变细。

图7转基因番茄植株细胞学分析。其中：WT：野生型；35S::PsJOINTLESS为转基因株系。

图8转基因番茄植株与野生型番茄花柄离区扫描电镜示意图。其中WT：野生型；35S::PsJOINTLESS为转基因株系。

图9转基因番茄植株与野生型番茄花柄离区透射电镜示意图。其中图A和图C为野生型，图B和图D为转基因株系。CW：细胞壁；CH：叶绿体；P：嗜锇颗粒；S：淀粉粒。

图10转基因番茄植株花柄离区多聚半乳糖醛酸酶(A)及纤维素酶(B)活性测定。其中：WT：野生型；35S::PsJOINTLESS为转基因株系。

图11PsJOINTLESS超表达影响离区形成等相关基因的表达。其中：WT：野生型；其余编号为转基因株系。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1PsJOINTLESS基因分离克隆及表达分析

从‘库尔勒香梨’花萼中抽提RNA，经反转录得到的第一链cDNA用于扩增PsJOINTLESS基因全长。

RNA抽提使用Trizol试剂盒(购自TakaRa，按照该试剂盒提供的操作说明书操作)，抽提1μg总RNA样品经1U DNase(购自Thermo公司)。第一链cDNA的合成用TOYOBO反转录试剂盒(按照该试剂盒提供的说明书操作)。扩增基因引物对为：PsJOINTLESS-F1：5’-ATGGATGGCGAGGGAGAAAATTCAG-3’(SEQ ID No.3)；PsJOINTLESS-R1：5’-GGTCACCTTATCAGATGACTTAAACGCAC-3’(SEQ ID No.4)。50μL的反应体系中包括200ng cDNA，1×缓冲液(TransStart FastPfu Buffer)，10mM dNTP，1U Taq聚合酶(TransStartFastPfu DNA Polymerase)(前述缓冲液和Taq聚合酶购自TRANS公司)，1.0μM上述引物。PCR反应在eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃，预变性2分钟，95℃变性20秒，52℃退火20秒，72℃延伸30秒，35个热循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。产生一条单一PCR条带产物。

PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用AxyGEN小量胶回收试剂盒(购自爱思进生物技术杭州有限公司，中国)回收DNA片段，步骤参照使用说明。回收纯化的DNA溶液与pMD19-T载体(购自宝生物工程大连有限公司即TaKaRa公司)进行连接反应，按说明书步骤操作。连接反应体系总体积是10μL，其中包括5μL的2×缓冲液(购自宝生物工程大连有限公司)，4.5μL纯化的PCR产物，0.5μL T载体。16℃连接3-4小时。取10μL连接产物，采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序(由上海英俊生物技术有限公司完成)。测序结果表明，PsJOINTLESS基因全长为694bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，BLAST的结果分析证明从梨中新得到的基因为一个MADS-box基因家族成员，申请人将这个基因命名为PsJOINTLESS。同源性分析表明，PsJOINTLESS编码的氨基酸序列与苹果的氨基酸长度一致，同源性达到98％；与其他植物的JOINTLESS也有较高的同源性，如葡萄、辣椒、棉花及番茄，同源性分别为80％、77％、77％及74％。以上结果表明本发明克隆得到的基因确实是梨中JOINTLESS基因。但是值得一提的是，还未见相关文献报道关于苹果中JOINTLESS基因的功能。

为分析PsJOINTLESS基因在脱落过程是否有所响应，采用实时定量PCR分析该基因在盛花期对‘库尔勒香梨’实施脱萼处理及宿萼处理后的表达量的变化。根据基因全长序列，设计1对该基因的荧光定量引物对，PsJOINTLESS-F2：5’-AGACAAGAAGTGGCGGAGAAATC-3’(SEQ ID No.5)；PsJOINTLESS-R2：5’-CGTTGTTTGAGTTACAGGGATTGG-3’(SEQ IDNo.6)。结果表明，该基因在梨花萼脱落过程中高度表达(图1)。

实施例2PsJOINTLESS基因亚细胞定位

由于PsJOINTLESS基因有1个核定位信号(NLS)，本研究通过农杆菌侵染洋葱表皮来研究PsJOINTLESS基因的亚细胞定位。利用RT-PCR扩增出PsJOINTLESS基因整个ORF(阅读框)，并在其扩增引物两端加上Nco I和Spe I两个酶切位点。首先将扩增产物装在pMD19-T载体上，从而得到一个pMD19-TN/S-PsJOINTLESS重组载体。同时用Nco I和Spe I双酶切pMD19-TN/S-PsJOINTLESS和pCAMBIA1302，将回收酶切的基因与载体骨架相连接，得到pCAMBIA-1302-PsJOINTLESS-GFP重组质粒，对重组的质粒进行双酶切鉴定，将双酶切鉴定正确的重组质粒进行测序，结果表明得到的重组质粒pCAMBIA-1302-PsJOINTLESS-GFP无误，并将其转入农杆菌GV3101。农杆菌侵染洋葱表皮方法详见黄小三博士毕业论文(2011)。结果表明，对照载体转化的洋葱表皮细胞均充满荧光(图2B)，而重组载体转化的细胞中只有核中检测到荧光(图2E)，说明PsJOINTLESS是一个核定位蛋白。

实施例3植物转化超表达载体的构建

根据pCAMBIA-1301载体的多克隆位点和PsJOINTLESS基因的编码区序列上的酶切位点分析，选择Nco I和BstE II作为内切酶。按照一般设计引物的原则用Primer Primer3.0软件设计出带有酶切位点的引物，其引物对序列如下所示：

PsJOINTLESS-F3:TGCCATGGTGATGGCGAGGGAGAAAATTCAG(SEQ ID NO.7)

PsJOINTLESS-R3:GGGGTCACCTTATCAGATGACTTAAACGCAC(SEQ ID NO.8)

以测序正确的保存菌液提取质粒为模板，进行含限制性酶切位点基因的克隆。PCR扩增的退火温度为52℃，PCR反应体系及扩增程序同实施例1。回收目的条带，再连接pMD19-T载体上，从而构建一个重组载体pMD19-T-PsJOINTLESS。双酶切体系总体积为40μL，其中含有PCR的纯化产物12μL，10×K Buffer(购自TakaRa公司)4μL，Nco I2μL，BstE II2μL及水20μL。pCAMBIA1301载体的双酶切体系总体积为40μL，其中含有经过质粒提取获得的pCAMBIA1301载体DNA8μL，10×K Buffer(购自TakaRa公司)4μL，Nco I2μL，BstE II2μL及水24μL。于37℃酶切3-4小时后回收。经过限制性内切酶消化过的表达载体pCAMBIA1301与PsJOINTLESS基因使用T4DNA连接酶(购自TaKaRa公司)于16℃连接14-16小时。反应总体积10μL，其中含有10×T4DNA Ligase Buffer1μL，T4DNA Ligase1μL，PsJOINTLESS基因的双酶切回收产物6μL，pCAMBIA1301载体的双酶切回收产物2μL。取连接产物10μL转化大肠杆菌感受态DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选出阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序结果确定没有读码框突变，获得含有插入目的片段的重组载体，将其命名为pCAMBIA1301-PsJOINTLESS重组载体，构建完成的载体图见图3所示。应用冻融法将重组载体导入到农杆菌GV3101中。

实施例4番茄的遗传转化及转化植株分子鉴定

根癌农杆菌介导的番茄遗传转化具体步骤参照王保全博士毕业论文(2012)。按照上述方法得到转PsJOINTLESS的番茄植株，采用小量法提取番茄植株叶片的总DNA，以此为模板，采用合成的特异引物对进行PCR扩增，鉴定阳性苗，产物大小为419bp。PsJOINTLESS-F4：5’-GAGAACAGCAACTACACCATG-3’(SEQ ID NO.9)；PsJOINTLESS-R4：5’-TATCAGATGACTTAAACGCAC-3’(SEQ ID NO.10)。反应程序：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，59℃退火50秒，72℃延伸1分钟，35个循环，循环完成后72℃延伸10分钟。番茄转基因植株鉴定见图4。

转基因番茄PsJOINTLESS表达水平分析

转基因番茄外源基因表达量采用半定量RT-PCR进行表达水平分析。选取相同发育阶段的经PCR鉴定为阳性番茄植株与野生型番茄植株花柄离区为材料，提取总RNA并反转录为cDNA，半定量检测靶基因的表达量。所用引物为基因特异引物对：PsJOINTLESS-F5：5’-AGACAAGAAGTGGCGGAGAAATC-3’(SEQ ID NO.11)；PsJOINTLESS-R5：5’‐CGTTGTTTGAGTTACAGGGATTGG-3’(SEQ ID NO.12)；以番茄β-actin为内参基因，Leactin-F：5’-ATGGCAGACGGAGAGGATATTCA-3’(SEQ ID NO.13)；Leactin-R：5’-GCCTTTGCAATCCACATCTGCTG-3’(SEQ ID NO.14)。反应程序：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环，循环完成后72℃延伸10分钟。半定量PCR分析结果如图5所示，目的基因在转基因株系中超量表达，野生型中没有表达。其中#57和#61表达丰度较高，而#62和#88表达丰度略低。可以看出，目的基因确实已经整合到了番茄植株中，选取#57、#61、#62及#88用于随后的功能的研究。

实施例5转基因植株的表型观察及脱落相关生理指标测定

(1)转基因植株表型观察

番茄以其独特的花柄离区结构而成为研究器官脱落的理想模式植物。本专利对转基因番茄花柄的脱落率进行统计，并且测定了番茄花柄的直径及离区长度。结果表明，超表达植株表现出花柄离区前移，花柄明显变细(表1)，易脱落等症状(图6)。

表1PsJOINTLESS过表达番茄植株生理指标测定

(2)转基因番茄植株花柄离区解剖结构观察

本实验选取转基因阳性植株和野生型植株同一阶段的花柄离区制备石蜡切片及电镜观察转基因番茄与野生型番茄植株花柄离区解剖结构的差异。结果表明，PsJOINTLESS过表达植株中离区细胞数目增加，细胞变小(图7)。扫描电镜观察显示，野生型植株花柄离区细胞完整，排列规则，而转基因株系花柄离区细胞破裂，排列无序(图8)。透射电镜结果表明野生型番茄花柄离区质膜紧贴细胞壁，细胞壁较厚，含有丰富的细胞器，核质均匀，叶绿体形态正常，含有大量的淀粉类；而转基因植株番茄花柄离区的细胞壁较薄，细胞器较少，且有溶解现象，有大量的嗜锇颗粒散落在细胞质中(图9)。

(3)转基因番茄花柄离区多聚半乳糖醛酸酶及纤维素酶活性的测定

本实验测定了转基因阳性植株和野生型植株同一发育阶段(观察番茄花柄离区出现明显裂痕)花柄离区的多聚半乳糖醛酸酶及纤维素酶的活性(图10)。结果表明，转基因番茄植株的花柄离区与野生型相比，多聚半乳糖醛酸酶活性无明显差异；而纤维素酶活性则显著高于野生型，其活性是野生型的37倍。

(4)PsJOINTLESS超表达影响离区形成等相关基因的表达

为了从离区形成出发，寻找控制其产生的分子机理，以野生型番茄为对照，对正常生长条件下的转基因番茄株系#57、#61、#62和#88的离区发育相关基因进行qRT-PCR检测(图11),引物序列见表2。结果发现4个转基因株系编码转录因子LS基因表达量均显著高于对照，其中#57和#61表达量分别提高了30倍和23倍；BLIND作为花器官脱落的负调控因子，4个转基因株系的BLIND表达量均低于野生型。#57和#61的编码细胞壁水解酶(TAPG2，TAPG4)的表达丰度在转基因株系中较高，但只有57#编码TAPG2的表达丰度比野生型高。4个转基因株系中编码细胞壁纤维素酶(Cel2)表达丰度均高于野生型，其中以#61号表达丰度最高，比对照提高了10倍，这与测定转基因植株花柄离区的纤维素酶活性的结果是一致的。因此推测PsJOINTLESS基因的过表达主要诱导编码离区发育相关转录因子及纤维素酶基因的表达，从而影响离区的发育和形成。

表2用于qRT-PCR分析的引物序列

主要参考文献

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Claims (8)

1.一种分离自‘库尔勒香梨’具有促进植物器官脱落功能的转录因子PsJOINTLESS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的转录因子PsJOINTLESS基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.含有权利要求1所述基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于以pCAMBIA1301为出发载体，权利要求1所述基因的插入位点为Nco I和BstE II之间。

5.含有权利要求1所述基因的宿主菌。

6.克隆权利要求1所述基因cDNA序列的引物对，其特征在于上游引物PsJOINTLESS-F1序列如SEQ ID No.3所示，下游引物PsJOINTLESS-R1序列如SEQ ID No.4所示。

7.权利要求1所述的基因在促进番茄花(果)柄脱落中的应用。

8.权利要求3所述的重组表达载体在促进番茄花(果)柄脱落中的应用。