CN111363857A

CN111363857A - 一种检测罗非鱼TiLV的RPA引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN111363857A
Application number: CN202010398574.4A
Authority: CN
Inventors: 余乃通; 刘志昕; 陈中元
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2020-05-12
Filing date: 2020-05-12
Publication date: 2020-07-03

Abstract

本发明公开了一种检测罗非鱼TiLV的RPA引物、探针及试剂盒，涉及生物技术领域，其技术方案要点是：对罗非鱼罗湖病毒(TiLV)的ORF10基因设计特异性RPA引物、探针及试剂盒，能够对罗非鱼罗湖病毒进行准确的定性检测，基于该RPA扩增引物、探针、试剂盒不仅准确性高，而且操作简单、快速，对罗非鱼养殖、进出口检验检疫具有科学指导意义。

Description

一种检测罗非鱼TiLV的RPA引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，它涉及一种检测罗非鱼TiLV的RPA引物、探针及试剂盒。

背景技术

罗非鱼是全球重要淡水养殖经济鱼种之一，可进行高密度养殖，是发展中国家动物性蛋白质的重要来源。罗非鱼原产非洲，属热带性鱼类，罗非鱼属包括亚种共有100多种。罗非鱼具有生长快、产量高、食性杂、繁殖力强等特点。目前，我国罗非鱼的养殖主要集中在广东、广西、海南等热带、亚热带地区，以池塘精养为主。罗非鱼除了内销外，还可以制作成鱼片、鱼排等出口国外，是我国南方渔民重要经济来源之一。

与其他鱼类比较，罗非鱼曾以易养殖和抗病力强著称。然而，近年来以色列、厄瓜多尔和埃及等国相继暴发与病毒有关的养殖罗非鱼和野生罗非鱼大量死亡事件，给罗非鱼养殖业造成了重大经济损失。经研究，发现引起罗非鱼大量死亡的病原均为罗湖病毒(Tilapia lake virus，TiLV)，是一种负链RNA病毒，基因组由10个独立的基因片段组成。目前，国际病毒分类委员会(ICTV)第十次病毒分类报告里将TiLV单独列为罗非鱼病毒属的罗非鱼病毒种。

2017年5月，世界动物卫生组织(OIE)、联合国粮农组织(FAO)等国际组织都针对TiLV发布了预警公告，要求加强对该病毒的检疫和防范。然而，国内针对TiLV没有有效的预防与治疗技术。因此，如何研究设计一种快速、准确的罗非鱼罗湖病毒(TiLV)检测技术是我们目前迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种能够对罗非鱼罗湖病毒进行准确定性检测的RPA引物、探针及试剂盒。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种检测罗非鱼TiLV的RPA引物，所述RPA引物是基于罗湖病毒的ORF10基因设计的，RPA引物的核苷酸序列为：

上游引物ORF10-F：5’-TTTCCCTCTGACACCCTGTATAGTTAGCGT-3’；

下游引物ORF10-R：5’-AACCCTACTAACACCAAATATAGCTATAAGC-3’。

本发明还提供了上述RPA引物在制备检测罗非鱼TiLV试剂中的应用。

本发明还提供了一种检测罗非鱼TiLV的探针，所述探针是基于罗湖病毒的ORF10基因设计的，探针的核苷酸序列为：

CCCTTCTGTTTTTGGGATTGAAATCAACCCT(FAM-dT)(dSpacer)A(BHQ1-dT)GCCCACTCTGGGATTGCAGAATC-C3spacer；

其中，探针P在第31个bp位置添加有(FAM-dt)基团和(dspacer)修饰，在第32个bp位置添加有(BHQ1-dT)基团，在尾部添加有(C3spacer)修饰。

本发明还提供了上述探针在制备检测罗非鱼TiLV试剂中的应用。

本发明还提供了一种检测罗非鱼TiLV的RPA试剂盒，包括上述RPA引物和探针。

优选的，还包括冻干酶粉、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、去离子水。

优选的，RPA试剂盒包括RPA反应扩增体系：总量为50μL，4μL上游引物ORF10-F、4μL下游引物ORF10-R、2μL探针P、200ng的核酸模板、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、2.5μL醋酸镁溶液(280mmol/L)、余量为去离子水。

本发明还提供了上述RPA试剂盒在制备检测罗非鱼TiLV中的应用。

综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明针对罗非鱼罗湖病毒(TiLV)的ORF10基因设计特异性RPA引物、探针、试剂盒，能够对罗非鱼罗湖病毒进行准确的定性检测，基于该RPA扩增引物、探针、试剂盒不仅准确性高，而且操作简单、快速，对罗非鱼养殖、进出口检验检疫具有科学指导意义。

附图说明

图1为感染罗湖病毒(TiLV)罗非鱼和健康罗非鱼的RPA检测结果。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：基于罗湖病毒的ORF10基因设计RPA引物、探针结构

(1)TiLV-ORF10序列为，如序列4所示：

GCAAATCTTTCCCTCTGACACCCTGTATAGTTAGCGTTGGCCTGTGGATACGAACGAAATCAGAACCGATATTAAGGTGCTAAGACTGCACGTCAAGAGACTTCTTTCCGAAATCTTCGGAAAATCGAGATAGGTCACTCTGCCCATCATCCTCTCTGTCCCTTCTGTTTTTGGGATTGAAATCAACCCTAGCCCACTCTGGGATTGCAGAATCACAGTCGTCCATCTCGAGGTCGACTTCGTCACCCCACTCTATATTATCTTCACCGCTCTCGTCAGCACCATACCTTTCATTCTTCCAACTTCGCTTCTTTGAAGCAGCTTTCTTGCCCTTCTTGATCTTCCGACTTCTTAGTACTAAACATCCTGAGCTCTCAGCCCCCGAGTCACTGTCACTTGACAAATAATCTGCCACACTCATCCTGGCTTATAGCTATATTTGGTGTTAGTAGGGTTAAAATTTGG。

(2)如序列1、2所示，RPA引物的核苷酸序列为：

上游引物ORF10-F：5’-TTTCCCTCTGACACCCTGTATAGTTAGCGT-3’；

下游引物ORF10-R：5’-AACCCTACTAACACCAAATATAGCTATAAGC-3’。

(3)如序列3所示，基于罗湖病毒的ORF10基因设计探针结构，探针的核苷酸序列为：

CCCTTCTGTTTTTGGGATTGAAATCAACCCT(FAM-dT)(dSpacer)A(BHQ1-dT)GCCCACTCTGGGATTGCAGAATC-C3spacer。

实施例2：一种检测罗非鱼TiLV的RPA试剂盒及使用方法

(1)试剂盒包括RPA反应扩增体系：总量为50μL，4μL上游引物ORF10-F、4μL下游引物ORF10-R、2μL探针P、200ng的核酸模板、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、2.5μL醋酸镁溶液(280mmol/L)、余量为去离子水。

(2)使用方法如下：

S1、提取待测病毒的总RNA和cDNA合成。

S2、RPA扩增反应。

反应体系如下：总量为50μL，向含有冻干酶粉(RPA反应的扩增酶，1000IU)的0.2mLTwistAmp反应管(TwistAmpBasic)中加入4μL上游引物ORF10-F、4μL下游引物ORF10-R、2μL探针P、200ng的核酸模板、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、2.5μL醋酸镁溶液(280mmol/L)、余量为去离子水。

将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于37℃金属浴上反应40min，得到RPA扩增产物。

S3、RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后离心2min，取上清液进行琼脂糖凝胶电泳检测，并以感染罗湖病毒(TiLV)的罗非鱼样本作为阳性对照。

本实施中选取五份已感染罗湖病毒(TiLV)的罗非鱼样本A1、A2、A3、A4、A5以及五份未感染的罗非鱼样本B1、B2、B3、B4、B5，分别采用上述方法进行实验检测，其结果如表1和图1所示：

表1实验结果

结果分析：本实施例中的RPA引物、探针、试剂盒，能够对罗非鱼鱼体中罗湖病毒(TiLV)进行准确的定性检测，基于该RPA扩增引物、探针、试剂盒不仅准确性高，而且操作简单、快速。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 一种检测罗非鱼TiLV的RPA引物、探针及试剂盒

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttccctctg acaccctgta tagttagcgt 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaccctacta acaccaaata tagctataag c 31

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccttctgtt tttgggattg aaatcaaccc tagcccactc tgggattgca gaatc 55

<210> 4

<211> 465

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcaaatcttt ccctctgaca ccctgtatag ttagcgttgg cctgtggata cgaacgaaat 60

cagaaccgat attaaggtgc taagactgca cgtcaagaga cttctttccg aaatcttcgg 120

aaaatcgaga taggtcactc tgcccatcat cctctctgtc ccttctgttt ttgggattga 180

aatcaaccct agcccactct gggattgcag aatcacagtc gtccatctcg aggtcgactt 240

cgtcacccca ctctatatta tcttcaccgc tctcgtcagc accatacctt tcattcttcc 300

aacttcgctt ctttgaagca gctttcttgc ccttcttgat cttccgactt cttagtacta 360

aacatcctga gctctcagcc cccgagtcac tgtcacttga caaataatct gccacactca 420

tcctggctta tagctatatt tggtgttagt agggttaaaa tttgg 465

Claims

1.一种检测罗非鱼TiLV的RPA引物，其特征是：所述RPA引物是基于罗湖病毒的ORF10基因设计的，RPA引物的核苷酸序列为：

上游引物ORF10-F：5’-TTTCCCTCTGACACCCTGTATAGTTAGCGT-3’；

下游引物ORF10-R：5’-AACCCTACTAACACCAAATATAGCTATAAGC-3’。

2.权利要求1所述的RPA引物在制备检测罗非鱼TiLV试剂中的应用。

3.一种检测罗非鱼TiLV的探针，其特征是：所述探针是基于罗湖病毒的ORF10基因设计的，探针的核苷酸序列为：

4.权利要求3所述的探针在制备检测罗非鱼TiLV试剂中的应用。

5.一种检测罗非鱼TiLV的RPA试剂盒，其特征是：包括权利要求1所述的RPA引物和权利要求3所述的探针。

6.根据权利要求5所述的一种检测罗非鱼TiLV的试剂盒，其特征是：还包括冻干酶粉、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、去离子水。

7.根据权利要求6所述的一种检测罗非鱼TiLV的试剂盒，其特征是：包括RPA反应扩增体系：总量为50μL，4μL上游引物ORF10-F、4μL下游引物ORF10-R、2μL探针P、200ng的核酸模板、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、2.5μL醋酸镁溶液(280mmol/L)、余量为去离子水。

8.权利要求5-7任意一项所述的RPA试剂盒在制备检测罗非鱼TiLV中的应用。