CN109485714B - Tlk蛋白及其在虾蟹类抗病毒品系育种中的应用 - Google Patents
Tlk蛋白及其在虾蟹类抗病毒品系育种中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种TLK蛋白及其在虾蟹类抗病毒品系育种中的应用，其中所述TLK蛋白序列如SEQ ID No.1所示，所述TLK蛋白核酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明提供的TLK蛋白可以促进病毒对虾蟹类动物的侵染过程，实验证实通过利用此基因作为筛选靶标或者通过基因编辑或者基因组编辑的方法敲低或者敲除此蛋白对应核酸获得的虾蟹品系具有显著的抗病毒能力，病毒感染率和死亡率明显降低，预示本发明所述TLK蛋白在虾、蟹抗病毒品系育种中具有重要的应用价值和经济意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种对虾蛋白及其应用，尤其涉及一种对虾TLK蛋白及其编码的核酸序列以及其在虾蟹类抗病毒品系育种中的应用；属于生物技术领域。
背景技术
以虾蟹为代表的甲壳类动物养殖是我国沿海及内陆多个省份重要的经济支柱产业，也是我国重要的出口创汇产业。而对生物体内与病毒感染有关的相关基因功能进行鉴定并且通过遗传筛选或者基因组编辑（Genome editing）手段产生的新品种不仅与常规育种本质相同还能大大缩短育种时间，降低成本。申请人经过长期实践和探索发现一种TLK蛋白及其编码序列，该蛋白能够显著促进病毒对虾蟹类动物的侵染过程，敲低或者敲除此序列可以显著降低虾蟹类动物的病毒感染率和死亡率，具有重要的育种应用价值。经检索，有关对虾TLK蛋白及其编码的核酸序列以及其在虾蟹类抗病毒品系育种中的应用未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种对虾TLK蛋白及其编码的核酸序列以及其在虾蟹类抗病毒品系育种中的应用。
本发明所述的对虾TLK蛋白是具有帮助病毒感染的对虾蛋白TLK，其特征在于：它具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。具体信息为：
(a)序列特征
* 长度：260氨基酸
* 类型：氨基酸
* 链型：单链
（b）分子类型：蛋白质
（c）序列描述：SEQ ID NO.1。
本发明还提供具了编码所述对虾TLK蛋白的核酸序列，其特征在于：它具有SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。具体信息为：
(a)序列特征
* 长度：780碱基
* 类型：碱基
* 链型：单链
（b）分子类型：核酸序列。
（c）序列描述：SEQ ID NO.2。
本发明所述对虾蛋白TLK在虾、蟹抗病毒品系育种中的应用。
本发明提供的TLK蛋白具有显著促进病毒感染虾蟹类动物的功能。这里的病毒包括RNA病毒和DNA病毒，其中：所述RNA病毒包括但不仅限于黄头病毒（YHV）、偷死野田村病毒（CMNV）、传染性肌肉坏死病毒（IMNV）和/或桃拉病毒（TSV）；优选是偷死野田村病毒。DNA病毒包括但不仅限于白斑综合症病毒（WSSV）、传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）、对虾杆状病毒（BP）和/或肝胰腺细小病毒（HPV）；优选是白斑综合征病毒。
本发明提供的TLK蛋白在不同虾蟹物种中具有高度的序列保守性。在其它虾蟹物种中可以通过利用氨基酸与密码子的对应关系，结合不同物种喜爱的密码子反推出编码该蛋白的核酸序列，然后人工合成或者基因克隆的方法获得其相应的核酸序列。
上述对虾蛋白TLK在虾、蟹抗病毒品系育种应用的方法与途径是：以该蛋白序列作为靶标的遗传品系育种筛选和虾蟹类TLK基因敲低或者敲除育种品系。具体的方式包括但不仅限于：
1）利用编码此蛋白的核酸序列作为遗传筛选靶标进行筛选所获得的抗病毒虾蟹品系。
2）利用基因编辑技术如RNAi等方法获得的抗病毒虾蟹品系。
3）利用基因组编辑技术如以CRISPR/Cas9，锌指核酸内切酶（zinc-fingernucleases，ZFN）和（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）ZFN，Talen等方法将编码此蛋白的核酸序列进行敲低后制备的抗病毒虾蟹品系。
本发明公开了一种对虾TLK蛋白及其编码序列，该蛋白能够显著促进病毒对虾蟹类动物的侵染过程，敲低或者敲除此序列可以显著降低虾蟹类动物的病毒感染率和死亡率，为虾蟹类抗病毒品系育种提供了手段，具有重要的育种应用价值和广阔市场应用前景。
附图说明
图1病毒感染后本发明所述TLK蛋白对应核酸在对虾体内的相对表达变化。
图2利用基因编辑技术敲低TLK对应核酸表达显著降低对虾体内病毒含量。
图3利用基因编辑技术敲低TLK对应核酸表达显著降低感染病毒的对虾死亡率。
具体实施方式
在下文中，将具体描述本发明实施例，但本发明内容不受实施例的限制，应延伸理解为与本发明技术思想雷同的各种实施方式均属于本发明内容的范畴。
实施例1 三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）中TLK蛋白核酸序列的获得
输入网址https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，选择Protein blast，将本发明提供的对虾TLK蛋白序列进行拷贝，填入Enter query sequence 方框中，Dtabase选择Non-redundant protein sequences（Nr），Organism方框填入三疣梭子蟹物种学名Portunus trituberculatus，其它内容选择默认选项，点击blast按钮，获得该物种中TLK蛋白的同源序列。点击Alignments选项下面Sequence ID选项，获得该物种蛋白的详细介绍，点击DBSOURCE栏目中accession 后面链接获得该物种相关蛋白的核酸序列。
实施例2 三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）中TLK蛋白的获得
分离蟹组织，按照TRIzon试剂盒（康为世纪公司）说明提取组织总RNA，按照SuperSMART PCR cDNA synthesis Kit user manual（Clontech）试剂盒说明逆转录为cDNA，根据本发明提供SEQ ID NO：2设计表达引物：
ExF：5’-TACTCAGGATCC TTCAACGTCACCACG-3’；
ExR:5’-TACTCACTCGAG CGCCCAGTAGGCGTC-3’，
加入BamH I和Xho I酶切位点。经过PCR扩增获得蛋白的编码序列。
将胶回收后的编码序列与已经准备好的pET30a（+）载体分别双酶切。将酶切后的PCR片段采用产物回收，酶切载体质粒采用胶回收的方法分别将目的片段与质粒进行回收。将回收后的目的片段与载体进行连接，然后转化DH5a宿主菌，进行测序验证。对测序验证正确的表达菌株提取质粒，转化表达菌株BL21 (DE3)，筛选阳性克隆后用诱导剂IPTG进行诱导表达。利用常规Ni柱亲和层析进行分离纯化得到TLK蛋白。
实施例3 利用TLK蛋白作为筛选靶标筛选抗病毒虾蟹品系
用实时定量 PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR) 检测某一虾蟹样本群中TLK基因表达的高低。QRT-PCR 仪使用 CFX96 实时检测系统 (美国，Bio-Rad 公司)。分离不同虾蟹个体的组织或者受精卵，按照TRIzon试剂盒（康为世纪公司）说明提取组织总RNA，按照Super SMART PCR cDNA synthesis Kit user manual（Clontech）试剂盒说明逆转录为cDNA作为PCR模板，根据TLK蛋白在虾蟹中高保守区域设计TLK基因引物，以TLKF：5’-gatgccttcgtgtcgtacagc-3’和TLKR：5’-cacgtcgggcatggcgaacct-3’为基因引物，设计该物种Actin引物并作为内参引物按照相同条件进行PCR扩增。
PCR 反应体系为： 5 μl SYBR Green Supermix，引物各 1 μl，DNA 模板 1 μl，H2O2 μl。所用 qRT-PCR 程序为：94 °C 预变性 10 min；循环扩增阶段 94 °C 变性 10 s，60 °C 退火和延伸 1 min， 72 °C 读板 1 s，共进行40 个循环； 65 °C 至 95 °C 梯度升温 0.5 °C，读取溶解曲线。每个模板设置三个平行反应孔。
数据处理方法参照文献进行，以 Student t-test 进行显著性差异统计分析(Sadasivam et al 2012)。当 P<0.05 时认为两组数据有显著性差异。实验结果以三次独立平行实验数据的 mean ± S.D.进行表示。柱形图通过软件 GraphPadPrism (美国，GraphPad) 绘制。TLK基因表达量较低的个体不易被病毒感染，选择此类样本进行后期遗传操作。
实施例4 利用RNAi方法获得TLK蛋白基因编辑对虾
4. 1 dsRNA 合成用 DNA 模板的制备
设计对虾TLK基因干扰引物F：5’-gcgtaatacgactcactatagggtggagcgtggagacaggccc-3’，R：5’- gcgtaatacgactcactataggggctgttgacactgtacttgt-3’，以含有TLK基因的质粒载体作为模板，进行基因干扰模板的扩增。
PCR 扩增程序为： 94 °C 3 min；94 °C 30 s， 58 °C 30 s， 72 °C 30 s 进行40 个循环； 72 °C 5 min。 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测其条带特异性后，进行酚-氯仿 DNA 抽提纯化。 PCR 产物中加入等体积的 Tris 饱和酚-氯仿-异丙醇混合液 (体积比25:24:1)，剧烈震荡混匀30 s，于 4 °C， 12000 rpm 离心 10 min。转移上层水相于一新的离心管中，加入1/10 体积的乙酸钠 (3 M， pH5.2)、 2 倍体积的无水乙醇，轻摇混匀后置于-20 °C沉淀 DNA。沉淀 6 h 以上，于 4 °C 12000 rpm 离心 20 min 收集 DNA 沉淀，用75%乙醇洗涤沉淀后， 4 °C 8000 rpm 离心，弃尽上清。 DNA 沉淀置于超净工作台风干，加入适量的 DEPC 处理水溶解 DNA 沉淀。
4.2 dsRNA 的合成
dsRNA 体外合成体系： DNA 模板 8 μg， T7 RNA 聚合酶 80 Units， RNase 抑制剂 80 Units， 5×transcription buffer 10 µl，四种 NTP (A/C/G/UTP, 10 mM) 各 2.4μl， DEPC 处理水，总体积为 50 μl。混匀后，置于 37 °C 水浴 5 h。随后加入 DNaseI8units、10×DNase I buffer 10 µl、DEPC 处理水 30 μl，混匀后置于 37 °C 水浴 1 h，以消化 DNA 模板。随后，对 dsRNA 合成产物进行酚-氯仿 RNA 抽提纯化。向合成体系中加入等体积的水饱和酚 (无 RNAase) -氯仿混合液 (体积比 1:1)，剧烈震荡混匀 30 s，于 4°C 12000 rpm 离心 10 min。转移上层水相于一新的无 RNase 离心管中，加入 1/10 体积的乙酸钠 (3 M， pH4.7， DEPC 处理水配制)、 2 倍体积的无水乙醇，轻摇混匀后置于-20°C 沉淀 dsRNA。过夜沉淀后，于 4 °C 12000 rpm离心 20 min 收集 dsRNA 沉淀，用 75%乙醇 (DEPC 处理水配制) 洗涤沉淀后，4 °C8000 rpm 离心，弃尽上清。 DNA 沉淀置于超净工作台风干，加入适量的 DEPC处理水溶解 dsRNA 沉淀。测定 dsRNA 浓度，加入 DEPC处理水稀释 dsRNA 至1.5 μg/μl.
4.3 dsRNA 的注射
按照每克虾 3 μg dsRNA 的剂量注射dsRNA，对照组分别注射等体积的 PBS 或GFP dsRNA (参照上述方法合成)。在第一次注射 24 h 后，再次注射等量的 dsRNA。注射完成 24 h后，取对虾血细胞或鳃组织利用PCR手段或者western blot方法检测干扰效果，获得基因敲低对虾品种，该品系对病毒感染具有显著抗性，死亡率明显降低（附图2，图3）。
实施例5 利用CRISPR/Cas9技术进行基因组编辑获得TLK基因敲除品种
5.1 靶位点的筛选与引物设计
根据目的虾蟹品种的基因组或者基因序列选择具有5’-N20-NGG-3’形式的序列作为gRNA识别区。例如对虾TLK可以选择此序列5’-gagactcattgtcatcgtcc-3’，三疣梭子蟹TLK可以选择5’-ggtgctgtgcttcctgtaccg-3’序列作为靶序列。
5.2 设计靶位点正反向引物
对虾的正向引物为：atagagactcattgtcatcgtcc gt
反向引物为：taaaacggacgatgacaatgagtctc
三疣梭子蟹正向引物为：ataggtgctgtgcttcctgtaccggt
反向引物为：taaaaccggtacaggaagcacagcacc
5.3 制备gRNA
合成靶位点正反向引物，进行体外退火，然后与含有T7引物的线性化的体外转录载体连接，转化DH5a宿主菌，筛选阳性克隆后提取质粒，进行体外转录，获得gRNA。
5.4 制备Cas9mRNA
将含有Cas9 mRNA的载体如pXT7-hCas9蛋白的质粒进行线性化，然后利用质粒所含的T7启动子进行体外转录，然后分离纯化获得的Cas9mRNA转录产物并且测定浓度与纯度。
5.5 显微注射
收集处于单细胞期的虾蟹受精卵，利用显微注射仪将合成的gRNA和Cas9mRNA按照1：1比率进行混合后共注射。每颗受精卵注射约2nl，注射后放于合适的饲养温度下进行饲养，随时观察并清除死卵。
5.6 F0代胚胎检测与靶点有效性检测
取注射后的胚胎20枚左右放于Eppendorf管中，提取基因组DNA，设计合成靶点上下游的PCR检测引物，利用PCR方法扩增靶点附近DNA片段，将PCR产物纯化后送公司测序。鉴定基因是否被敲除。取有敲除存在的批次继续饲养。
5.7 F0代突变体筛选
待F0代性成熟后，取F0代雌雄个体分别与野生型交配，收集F1代胚胎，按照上述PCR方法进行基因表达测序检测。确定基因突变类型，筛选可能具有性腺突变的F0个体，用于后期育种。
5.8 TLK纯合突变体筛选
将可能具有性腺突变的F0雌雄个体进行交配获得F1代个体。然后进行PCR筛选获得纯合F1代雌雄个体。或者将具有杂合形状的F1代雌雄个体进行交配后收集F2代胚胎，进行靶点突变性检测，获得可能的纯合雌雄个体。
5.9 TLK纯合突变体的传代
将筛选到的F1代或者F2代基因敲除突变体进行自交，筛选具有稳定遗传性状的TLK基因敲除品系，然后进行自交扩繁，获得具有病毒抗性的虾蟹新品种。
序 列 表
<110> 山东大学
<120> TLK蛋白及其在虾蟹类抗病毒品系育种中的应用
<141> 2018-12-21
<160> 2
<210> 1
<211> 260
<212> PRT
<213> 日本囊对虾 （Marsupenaeus japonicus）
<221> TLK蛋白氨基酸序列
<222>（1）…（260）
<400> 1
Met Glu Phe Asn Val Thr Thr Cys Met Asn Thr Ser Ser Ser Ser
5 10 15
Thr Val Ile Gln Pro Met Val Leu Asp Asn Leu Leu His Pro Val
20 25 30
Ile Ala Thr Cys Val Ala Phe Val Val Val Val Ile Leu Leu Leu
35 40 45
Cys Phe Val Tyr Arg Gly Thr Ile Arg Val Trp Ile Tyr Ser Gln
50 55 60
Cys Gly Tyr Arg Met Cys His Lys Asn Val Ser Thr Asp Asp Arg
65 70 75
Asp Lys Leu Phe Asp Ala Phe Val Ser Tyr Ser Ser Lys Asp Glu
80 85 90
Ala Trp Val Asn Gln Val Leu Ala Gly Glu Leu Gly Arg Gly Asp
95 100 105
Arg Pro Tyr Arg Val Cys Leu His Tyr Arg Asp Phe Pro Val Thr
110 115 120
Ala Tyr Ile Ala Glu Thr Ile Val Glu Ala Val Glu Ser Ser Arg
125 130 135
Arg Thr Ile Ile Val Leu Ser Lys Asn Phe Ile Glu Asn Glu Trp
140 145 150
Cys Arg Phe Gln Phe Lys Ser Ala His His Glu Val Leu Lys Lys
155 160 165
Arg Arg Gln Arg Leu Ile Val Ile Val Leu Gly Glu Ile Pro Ala
170 175 180
Arg Asp Leu Asp Pro Asp Leu Arg Leu Tyr Leu Lys Thr Asn Thr
185 190 195
Cys Ile Tyr Ala Ser Asp Lys Phe Phe Trp Glu Lys Leu Arg Phe
200 205 210
Ala Met Pro Asp Val Gln Asn Ser Gln Arg Val Val His Thr Tyr
215 220 225
Ser Ser Ile Pro Glu Arg Ser Ser Ser Ser Ala Asn Lys Tyr Ser
230 235 240
Val Asn Ser Pro Ala Ser Met His His Asn Leu His Gly Gly Ser
245 250 255
Asp Ala Tyr Trp Ala
260
<210> 2
<211> 780
<212> DNA
<213> 日本囊对虾 （Marsupenaeus japonicus）
<221> 编码TLK蛋白的核酸序列
<222>（1）…（780）
<400> 2
atggaattca acgtgacgac ctgcatgaac acctcttcat cttcgactgt catccagccc 60
atggtgttgg acaacttgtt gcatccagtt attgctacat gtgtcgcctt tgtcgtcgta 120
gtcatcttgc tgttgtgttt cgtttaccgc ggcaccatcc gtgtgtggat ttactcgcaa 180
tgtggttaca ggatgtgcca caagaacgtc tccaccgacg accgagataa attattcgac 240
gcttttgtgt cctacagctc caaggacgag gcctgggtca accaggtgtt agccggggag 300
ctggggcgtg gagacaggcc ctatcgcgtg tgtttacact atcgcgattt ccccgtcacc 360
gcttacatcg ccgagacgat cgtggaagct gtggaatctt cgcggcgcac cataatcgtc 420
ttgtcgaaga acttcatcga gaacgagtgg tgcagattcc agtttaaaag cgcccaccac 480
gaggttctca agaagcggcg acagagactc attgtcatcg tcctgggcga gatcccggcg 540
cgggacctcg accctgacct ccgtctctac ctcaaaacca acacgtgcat ctacgccagc 600
gacaaattct tctgggagaa gctgagattc gcgatgccag acgttcagaa cagccagcga 660
gtggttcaca cctacagttc catccccgag agatcttcct cctcggccaa caagtacagt 720
gtcaacagcc ccgcgtcaat gcaccataat ttacacggtg gctctgatgc ttactgggcc 780
Claims (4)
1.一种具有帮助病毒感染的对虾蛋白TLK，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述对虾蛋白TLK的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述对虾蛋白TLK在虾、蟹抗病毒品系育种中的应用，其中所述病毒是白斑综合征病毒。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用的方法与途径是：以SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白作为靶标的虾蟹遗传品系育种筛选和通过敲除或者敲低SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白编码基因获得虾蟹抗病毒育种品系。
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