CN114605504A - 一种可诱导植物细胞坏死的小麦黄花叶病毒14k蛋白及其在抗病毒中的用途 - Google Patents

一种可诱导植物细胞坏死的小麦黄花叶病毒14k蛋白及其在抗病毒中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业科学技术领域，涉及农作物病毒病害的分子检测技术，具体涉及一种可诱导植物细胞坏死的小麦黄花叶病毒14K蛋白及其在抗病毒中的用途，所述14K蛋白可显著抑制TRV病毒在本氏烟上系统侵染。同时，经蛋白预测发现14K具有一个跨膜结构域，缺失该结构后丧失诱导植物细胞坏死的能力。该蛋白可为农作物抗性品种的选育提供有效的候选靶标，从而增强作物在田间的抗病毒能力。

Description

一种可诱导植物细胞坏死的小麦黄花叶病毒14K蛋白及其在 抗病毒中的用途
技术领域
本发明属于农业科学技术领域，涉及农作物病毒病害的分子检测技术，具体涉及一种可诱导植物细胞坏死的小麦黄花叶病毒14K蛋白及其在抗病毒中的用途。
背景技术
土传小麦病毒由土壤中的禾谷多黏菌(Polymyxa graminis L.)传播，禾谷多黏菌是一种专性寄生于禾本科植物根部的原生生物。由禾谷多黏菌传播的禾谷类病毒小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)属于大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)。WYMV广泛分布于安徽、河南、江苏、湖北、陕西、四川和山东等冬小麦生态区。上世纪60年代以前，小麦黄花叶病害仅在我国少数地区发生。自70年代至今，已成为河南、江苏、山东等省的重要麦类病害，蔓延迅速发病面积逐年增多，致使小麦病田严重减产。由于其传播介体禾谷多黏菌可在土壤中长期存活，且抗逆性极强，防治困难，因此目前防治土传小麦病毒病的最重要的方式是鉴定和推广抗性品种。
WYMV为弯曲线状病毒粒子，由RNA1和RNA2两条正义单链的RNA组成。RNA1全长共7636个核苷酸，只编码一个由2404个氨基酸组成的多聚蛋白的开放阅读框(Open ReadingFrame，ORF)，经蛋白酶切割后形成8个成熟的蛋白，分别为P3，7K，细胞质内含体蛋白(cytoplasmic inclusion，CI)，14K，基因组连接蛋白(viral genome-linked protein，VPg)，细胞核内含体蛋白a(nuclear inclusion a,NIa)，细胞核内含体蛋白b(nuclearinclusion b，NIb)和外壳蛋白(coat protein,CP)。WYMV RNA2全长共3651个核苷酸，整个基因组也仅有一个ORF，编码一个904个氨基酸组成的约100kDa的多聚蛋白，通过切割产生P1和P2两个成熟的非结构蛋白。14K是WYMV中分子量较小的蛋白，富含疏水性氨基酸，具有一个跨膜结构域(transmembrane domains,TMD)，目前对WYMV 14K蛋白功能解析还是未知的。
病毒属于专性寄生物，必须在宿主细胞内才能完成病毒的生活史，其中包括病毒的增殖和移动。病毒在侵染植物细胞过程中植物通过识别病毒致病因子激活植物免疫反应以抵抗病毒侵染，这其中包括细胞坏死反应。细胞坏死的特点是在病毒侵染的细胞周围诱导程序性细胞死亡以限制病毒扩散，该坏死症状通常从病毒侵染的叶片开始坏死，逐渐扩散到植物茎杆基部及周边叶片的坏死。因此，研究诱导植物细胞坏死的病毒蛋白可为农作物抗性品种的选育提供有效的候选靶标。
发明内容
本发明鉴定了小麦黄花叶病毒14K蛋白的功能。利用烟草脆裂病毒(Tobaccorattle virus,TRV)介导的基因过表达体系，明确了小麦黄花叶病毒基因组中14K蛋白诱导植物细胞坏死并抑制TRV病毒系统侵染。本发明公开了一种氨基酸序列：LVYVICLLILINLIYRLL(SEQ.NO.15,14K蛋白跨膜结构域)。
进一步的，本发明公开了一种含有上述SEQ.NO.15的氨基酸序列：SNDMLTDETLSNALGIFNPKTNLFLLLATKGFKLVYVICLLILINLIYRLLSHWRAWLKNKNDNVNPDALTNTMTVQEGSEILKEVLKMTPAMRREVTKDMKVAVADNDSTFSFVFPHEHIDLE(SEQ.NO.16,14K蛋白)。
同时，本发明公开了一种编码所述14K蛋白的核苷酸序列:TCAAACGACATGTTGACTGATGAAACACTGTCAAACGCTCTAGGCATCTTCAACCCAAAGACCAACCTCTTCCTCCTTCTCGCAACCAAAGGTTTTAAACTTGTTTACGTTATCTGCCTGCTTATATTAATAAACCTCATCTACCGCTTGCTCTCCCACTGGAGAGCTTGGTTGAAGAACAAGAACGATAACGTGAATCCCGATGCCCTCACCAACACCATGACAGTTCAGGAAGGAAGCGAAATTCTCAAGGAAGTATTGAAGATGACTCCAGCGATGCGCAGGGAGGTGACCAAGGATATGAAAGTTGCAGTTGCTGATAACGACAGCACATTCTCTTTCGTGTTCCCTCACGAACACATTGACCTCGAG(SEQ.NO.17,14K蛋白核苷酸序列)。
另一方面，本发明公开一种用于扩增所述基因(SEQ.NO.17)的一对引物：TCAAACGACATGTTGACT(SEQ.NO.18)和TCACTCGAGGTCAATGTGT(SEQ.NO.19)。
另外，本发明提供了一种TRV-14K重组载体。
再一方面，本发明提供了所述14K蛋白跨膜结构域和14K蛋白在制备抗病毒剂中的用途。
本发明的具体研究过程如下：
1.将NCBI中WYMV RNA1(GenBank:NC_002350.1)和RNA2(GenBank：NC_002349.1)分别划分18和9个核酸片段(编为1-1至1-18，2-1至2-9，每个片段约500-600bp，连续的两个片段之间含有重叠片段)，并将这些核苷酸序列正义链连接到TRV载体(TRV-RNA2)中，并与TRV-RNA1农杆菌共浸润本氏烟，设置报告基因GUS片段构建于TRV载体中，以过表达TRV-GUS作为阴性对照，持续观察本氏烟症状表型。实验结果表明农杆菌浸润5天后，与对照组相比，过表达1-9片段(TRV-1-9)引起本氏烟接种叶片及茎基部的明显细胞坏死反应，并且显著抑制TRV病毒系统性侵染(图1)。
2.为明确诱导坏死反应的因子是1-9产生的多肽或病毒来源的小干扰RNA(vsiRNA)，本研究将1-9的反向互补序列构建到TRV载体，发现其并未引起明显坏死症状，表明引起本氏烟坏死症状的不是vsiRNA。另外我们将1-9序列中对应WYMV的7个翻译起始密码子及其5’端的延伸序列进行缺失突变，分别构建到TRV过表达载体中(TRV-1-9M1至TRV-1-9M7)(图2)，并通过农杆菌共浸润法侵染本氏烟并持续观察症状。
Figure BDA0003519849540000031
Figure BDA0003519849540000041
结果表明，侵染5天后除了TRV-1-9M1可以诱导细胞坏死外，其余突变体和对照相比均无明显变化。鉴于1-9中包含有WYMV 14K完整ORF，因此将14K构建到TRV载体中(TRV-14K)并侵染本氏烟，发现14K在本氏烟上出现明显的坏死症状，表明1-9诱导细胞坏死的因子为14K蛋白。为进一步明确14K诱导的细胞坏死是否由其编码的氨基酸引起，本实验对14K基因序列进行碱基缺失突变，使其翻译提前终止。利用缺失突变后的14K基因序列构建TRV重组载体，农杆菌侵染本氏烟5天后观察症状，结果表明缺失突变后的14K并未引起本氏烟叶片及茎基部坏死(图2)，结果表明14K诱导的细胞坏死反应确实是由其编码的蛋白引起。
3.通过软件预测14K蛋白具有一个跨膜结构域，本研究将跨膜结构域中疏水性氨基酸用脯氨酸替代，从而破坏跨膜结构域的功能，构建突变体至TRV载体中(TRV-m14K)，其中m14K氨基酸序列为：SNDMLTDETLSNALGIFNPKTNLFLLLATKGFKLVYVICPPPPINLIYRLLSHWRAWLKNKNDNVNPDALTNTMTVQEGSEILKEVLKMTPAMRREVTKDMKVAVADNDSTFSFVFPHEHIDLE(SEQ.NO.31)。同时，将跨膜结构域两端区域(N端及C端)分别单独缺失，构建突变体TRV-14K(△N)、TRV-14K(△C)，其中14K(△N)氨基酸序列为：SHWRAWLKNKNDNVNPDALTNTMTVQEGSEILKEVLKMTPAMRREVTKDMKVAVADNDSTFSFVFPHEHIDLE(SEQ.NO.32)，14K(△C)氨基酸序列为：SNDMLTDETLSNALGIFNPKTNLFLLLATKGFK(SEQ.NO.33)。农杆菌浸润后持续观察本氏烟上引起的症状，结果表明，浸润5天后这三种突变体在本氏烟中均未引起坏死反应(图3)，表明跨膜结构域对WYMV 14K诱导的植物细胞坏死具有重要作用。
本发明的有益效果：本研究在小麦黄花叶病毒上鉴定了一个可诱导植物细胞坏死的14K蛋白。并且该蛋白可显著抑制TRV病毒在本氏烟上系统侵染。同时，经蛋白预测发现14K具有一个跨膜结构域，缺失该结构后丧失诱导植物细胞坏死的能力。该蛋白可为农作物抗性品种的选育提供有效的候选靶标，从而增强作物在田间的抗病毒能力。
附图说明
图1表示WYMV 1-9在本氏烟上叶片及茎基部引起显著的坏死反应。A：WYMV随机分段示意图；B：过表达1-9序列在本氏烟上引起的症状图；C：RT-qPCR检测TRV CP在TRV-GUS和TRV-1-9中的积累量。
图2表示WYMV 1-9中引起坏死表型的为14K蛋白。A：1-9ATG缺失突变示意图；B：过表达1-9反向序列在本氏烟上引起的症状图；C：过表达1-9ATG缺失突变序列在本氏烟上引起症状图；D：过表达14K序列在本氏烟上引起症状图；E：RT-qPCR检测TRV CP在TRV-GUS和TRV-14K中的积累量；F：14K移码突变示意图及在本氏烟上引起的症状图。
图3表示跨膜结构域对WYMV 14K产生的坏死具有重要作用。A：14K跨膜结构域突变示意图；B：过表达14K跨膜结构域突变体在本氏烟上引起的症状图。
名词解释：
本氏烟(学名：Nicotiana benthamiana)，原产于澳洲，与辣椒，番茄，马铃薯及栽培烟草等一样，归属于茄科，是含有19条染色体的异源四倍体植物。
ORF，表示开放阅读框，在分子生物学中，开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)从起始密码子开始，是DNA序列中具有编码蛋白质潜能的序列，结束于终止密码子连续的碱基序列。
GUS，指编码β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase)的一段基因。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中
UBC，编码聚泛素polyubiquitin C的基因，编码五个头尾相连的聚泛素前体，是在压力条件下维持泛素水平的重要基因。该基因在真核生物中普遍存在且高度保守，常作为植物的内参基因。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明做进一步的说明，这些实施例应被理解为仅为本发明的最佳实例，而非以任何方式限制本发明，凡在本发明原则之内所做的任何改进、修饰和等同替换，均应包含在本发明的范围之内。
实施例1：Trizol法提取Total RNA及cDNA文库的建立
感染WYMV的小麦样品采集于江苏试验田，并保存于本实验室-80℃冰箱备用。取0.1g小麦叶片样品于液氮中研磨，参照Trizol(英骏，杭州)试剂说明书，用Trizol法提取小麦病株叶片的总RNA。参照诺唯赞公司反转录试剂盒HiScript II Q Select RT SuperMixfor qPCR说明书，两步法合成cDNA备用。
实施例2：引物设计
根据NCBI中WYMV两条RNA链RNA1(GenBank:NC_002350.1)和RNA2(GenBank：NC_002349.1)的序列设计全基因组随机引物，用于筛选和鉴定WYMV细胞坏死区域。在设计引物时需要在每个序列前加入PstI序列及其同源臂序列(CCTGCAG)。具体引物列表见表1。
表1.载体构建的引物序列
Figure BDA0003519849540000071
实施例3：目的片段的扩增及回收
根据WYMV-CP序列，设计检测小麦植株是否带毒的检测引物序列为(WYMV-DETECTED-F(SEQ.NO.31):5'-CCGCCACCAAAGAGAAATGG-3'，WYMV-DETECTED-R(SEQ.NO.32):5'-TCGGAGGTGAGCATGGTATT-3')。以感病小麦cDNA为模板，进行扩增反应。
50μL克隆体系如下：
Figure BDA0003519849540000072
Figure BDA0003519849540000081
混匀后按以下反应程序进行PCR扩增：1)94℃预变性5min；2)，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；3)，72℃终延伸10min。PCR产物经1％(质量体积比)的琼脂糖凝胶电泳检测后，用紫外凝胶成像系统拍照记录。若扩增谱带明显，并具有特异性，在长波紫外灯下切取特异的扩增谱带，按照GenStar公司的StarPrep Gel Exraction Kit试剂说明书进行回收。回收产物与单酶切回收后的载体用诺唯赞同源重组酶进行连接，连接产物全部转化大肠杆菌感受态细胞，后用灭菌牙签挑取白色单克隆菌落于150μL含Kan(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，200rpm/min震荡培养3h，待菌液浑浊进行菌液PCR检测。将含有目的条带大小的菌液送往擎科生物公司进行DNA测序以验证序列的准确性。
实施例4：农杆菌共浸润烟草
取上述连接成功的表达载体质粒1μg加入到农杆菌GV3101电击感受态中，电击转化后用含有Kan(50μg/mL)和Rif(20μg/mL)抗生素的平板筛选阳性克隆。将含有目的基因重组载体质粒的农杆菌于瞬时缓冲液(10mM MES、10mM MgCl2和200μM乙酰丁香酮，现配现用)中洗脱重悬，调至OD600为1.0左右，与TRV-RNA1按照1:1的比例混匀，28℃放置2小时后，选取叶片平整，9-10叶期的适龄本氏烟，用去掉针头的针管将菌液均匀缓慢地注射在叶片背面。目的基因及对照组均设置3个重复。将浸润后的本氏烟置24℃温室环境中培养，每日观察并记录烟草生长状况。
实施例5：荧光定量PCR(RT-qPCR)
根据TRV CP基因序列，利用NCBI Primer designing tool设计特异性定量引物，内参基因为烟草UBC。引物序列见表2.2。
表2.2 RT-qPCR涉及引物及序列
Figure BDA0003519849540000082
Figure BDA0003519849540000091
参照上海翊圣生物科技有限公司HieffTM qPCR
Figure BDA0003519849540000092
Green Master Mix(LowRox Plus)说明书进行定量PCR检测，10μL检测体系如下：
Figure BDA0003519849540000093
将上述试剂依次加入384孔定量板(Applied Biosystems)中，混匀后，在实时荧光定量PCR仪中按照以下三步法程序进行反应：
Figure BDA0003519849540000094
定量结果采用2-ΔΔCt的相对定量方法分析，各基因mRNA的表达量对持家基因UBC的表达量进行归一化。本实验共设置3次独立实验，每次独立实验设置3个生物学重复，每个生物学重复分别进行两个技术重复。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁波大学
<120> 一种可诱导植物细胞坏死的小麦黄花叶病毒14K蛋白及其在抗病毒中的用途
<130> NBDA-002
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<223> TRV-14K-(△N)-F2
<400> 14
cctgcaggct tggttgaaga acaa 24
<210> 15
<211> 18
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 14K蛋白跨膜结构域
<400> 15
Leu Val Tyr Val Ile Cys Leu Leu Ile Leu Ile Asn Leu Ile Tyr Arg
1 5 10 15
Leu Leu
<210> 16
<211> 124
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 14K蛋白
<400> 16
Ser Asn Asp Met Leu Thr Asp Glu Thr Leu Ser Asn Ala Leu Gly Ile
1 5 10 15
Phe Asn Pro Lys Thr Asn Leu Phe Leu Leu Leu Ala Thr Lys Gly Phe
20 25 30
Lys Leu Val Tyr Val Ile Cys Leu Leu Ile Leu Ile Asn Leu Ile Tyr
35 40 45
Arg Leu Leu Ser His Trp Arg Ala Trp Leu Lys Asn Lys Asn Asp Asn
50 55 60
Val Asn Pro Asp Ala Leu Thr Asn Thr Met Thr Val Gln Glu Gly Ser
65 70 75 80
Glu Ile Leu Lys Glu Val Leu Lys Met Thr Pro Ala Met Arg Arg Glu
85 90 95
Val Thr Lys Asp Met Lys Val Ala Val Ala Asp Asn Asp Ser Thr Phe
100 105 110
Ser Phe Val Phe Pro His Glu His Ile Asp Leu Glu
115 120
<210> 17
<211> 372
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 14K蛋白核苷酸序列
<400> 17
tcaaacgaca tgttgactga tgaaacactg tcaaacgctc taggcatctt caacccaaag 60
accaacctct tcctccttct cgcaaccaaa ggttttaaac ttgtttacgt tatctgcctg 120
cttatattaa taaacctcat ctaccgcttg ctctcccact ggagagcttg gttgaagaac 180
aagaacgata acgtgaatcc cgatgccctc accaacacca tgacagttca ggaaggaagc 240
gaaattctca aggaagtatt gaagatgact ccagcgatgc gcagggaggt gaccaaggat 300
atgaaagttg cagttgctga taacgacagc acattctctt tcgtgttccc tcacgaacac 360
attgacctcg ag 372
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 18
tcaaacgaca tgttgact 18
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 19
tcactcgagg tcaatgtgt 19
<210> 20
<211> 497
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 1-9M1
<400> 20
gcttctccaa cacttcagag tcacctagag aacataatcg aactacaatc aaacgacatg 60
ttgactgatg aaacactgtc aaacgctcta ggcatcttca acccaaagac caacctcttc 120
ctccttctcg caaccaaagg ttttaaactt gtttacgtta tctgcctgct tatattaata 180
aacctcatct accgcttgct ctcccactgg agagcttggt tgaagaacaa gaacgataac 240
gtgaatcccg atgccctcac caacaccatg acagttcagg aaggaagcga aattctcaag 300
gaagtattga agatgactcc agcgatgcgc agggaggtga ccaaggatat gaaagttgca 360
gttgctgata acgacagcac attctctttc gtgttccctc acgaacacat tgacctcgag 420
ggaaaaggaa acaagtatcg accacgagag gacgcacgtc tgatgtactc cacgagagac 480
gacgcaacct tcgatac 497
<210> 21
<211> 437
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 1-9M2
<400> 21
ttgactgatg aaacactgtc aaacgctcta ggcatcttca acccaaagac caacctcttc 60
ctccttctcg caaccaaagg ttttaaactt gtttacgtta tctgcctgct tatattaata 120
aacctcatct accgcttgct ctcccactgg agagcttggt tgaagaacaa gaacgataac 180
gtgaatcccg atgccctcac caacaccatg acagttcagg aaggaagcga aattctcaag 240
gaagtattga agatgactcc agcgatgcgc agggaggtga ccaaggatat gaaagttgca 300
gttgctgata acgacagcac attctctttc gtgttccctc acgaacacat tgacctcgag 360
ggaaaaggaa acaagtatcg accacgagag gacgcacgtc tgatgtactc cacgagagac 420
gacgcaacct tcgatac 437
<210> 22
<211> 227
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 1-9M3
<400> 22
acagttcagg aaggaagcga aattctcaag gaagtattga agatgactcc agcgatgcgc 60
agggaggtga ccaaggatat gaaagttgca gttgctgata acgacagcac attctctttc 120
gtgttccctc acgaacacat tgacctcgag ggaaaaggaa acaagtatcg accacgagag 180
gacgcacgtc tgatgtactc cacgagagac gacgcaacct tcgatac 227
<210> 23
<211> 182
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 1-9M4
<400> 23
actccagcga tgcgcaggga ggtgaccaag gatatgaaag ttgcagttgc tgataacgac 60
agcacattct ctttcgtgtt ccctcacgaa cacattgacc tcgagggaaa aggaaacaag 120
tatcgaccac gagaggacgc acgtctgatg tactccacga gagacgacgc aaccttcgat 180
ac 182
<210> 24
<211> 170
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 1-9M5
<400> 24
cgcagggagg tgaccaagga tatgaaagtt gcagttgctg ataacgacag cacattctct 60
ttcgtgttcc ctcacgaaca cattgacctc gagggaaaag gaaacaagta tcgaccacga 120
gaggacgcac gtctgatgta ctccacgaga gacgacgcaa ccttcgatac 170
<210> 25
<211> 146
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 1-9M6
<400> 25
aaagttgcag ttgctgataa cgacagcaca ttctctttcg tgttccctca cgaacacatt 60
gacctcgagg gaaaaggaaa caagtatcga ccacgagagg acgcacgtct gatgtactcc 120
acgagagacg acgcaacctt cgatac 146
<210> 26
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 1-9M7
<400> 26
tactccacga gagacgacgc aaccttcgat ac 32
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> UBC-F
<400> 27
tttcggtcct gatgatactc cc 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> UBC-R
<400> 28
cacagagcaa agactggatt ga 22
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> TRV-CP-F
<400> 29
agatcactgg gttactagcg gc 22
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> TRV-CP-R
<400> 30
cagatgaact agcagctgct cc 22
<210> 31
<211> 124
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> m14K氨基酸序列
<400> 31
Ser Asn Asp Met Leu Thr Asp Glu Thr Leu Ser Asn Ala Leu Gly Ile
1 5 10 15
Phe Asn Pro Lys Thr Asn Leu Phe Leu Leu Leu Ala Thr Lys Gly Phe
20 25 30
Lys Leu Val Tyr Val Ile Cys Pro Pro Pro Pro Ile Asn Leu Ile Tyr
35 40 45
Arg Leu Leu Ser His Trp Arg Ala Trp Leu Lys Asn Lys Asn Asp Asn
50 55 60
Val Asn Pro Asp Ala Leu Thr Asn Thr Met Thr Val Gln Glu Gly Ser
65 70 75 80
Glu Ile Leu Lys Glu Val Leu Lys Met Thr Pro Ala Met Arg Arg Glu
85 90 95
Val Thr Lys Asp Met Lys Val Ala Val Ala Asp Asn Asp Ser Thr Phe
100 105 110
Ser Phe Val Phe Pro His Glu His Ile Asp Leu Glu
115 120
<210> 32
<211> 73
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 14K(△N)氨基酸序列
<400> 32
Ser His Trp Arg Ala Trp Leu Lys Asn Lys Asn Asp Asn Val Asn Pro
1 5 10 15
Asp Ala Leu Thr Asn Thr Met Thr Val Gln Glu Gly Ser Glu Ile Leu
20 25 30
Lys Glu Val Leu Lys Met Thr Pro Ala Met Arg Arg Glu Val Thr Lys
35 40 45
Asp Met Lys Val Ala Val Ala Asp Asn Asp Ser Thr Phe Ser Phe Val
50 55 60
Phe Pro His Glu His Ile Asp Leu Glu
65 70
<210> 33
<211> 33
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 14K(△C)氨基酸序列
<400> 33
Ser Asn Asp Met Leu Thr Asp Glu Thr Leu Ser Asn Ala Leu Gly Ile
1 5 10 15
Phe Asn Pro Lys Thr Asn Leu Phe Leu Leu Leu Ala Thr Lys Gly Phe
20 25 30
Lys

Claims (8)

1.一种氨基酸序列：LVYVICLLILINLIYRLL(SEQ.NO.15)。
2.一种氨基酸序列：
SNDMLTDETLSNALGIFNPKTNLFLLLATKGFKLVYVICLLILINLIYRLLSHWRAWLKNKNDNVNPDALTNTMTVQEGSEILKEVLKMTPAMRREVTKDMKVAVADNDSTFSFVFPHEHIDLE(SEQ.NO.16)。
3.一种编码权利要求2所述氨基酸序列的核苷酸序列:
TCAAACGACATGTTGACTGATGAAACACTGTCAAACGCTCTAGGCATCTTCAACCCAAAGACCAACCTCTTCCTCCTTCTCGCAACCAAAGGTTTTAAACTTGTTTACGTTATCTGCCTGCTTATATTAATAAACCTCATCTACCGCTTGCTCTCCCACTGGAGAGCTTGGTTGAAGAACAAGAACGATAACGTGAATCCCGATGCCCTCACCAACACCATGACAGTTCAGGAAGGAAGCGAAATTCTCAAGGAAGTATTGAAGATGACTCCAGCGATGCGCAGGGAGGTGACCAAGGATATGAAAGTTGCAGTTGCTGATAACGACAGCACATTCTCTTTCGTGTTCCCTCACGAACACATTGACCTCGAG(SEQ.NO.17)。
4.一种用于扩增权利要求3所述基因的一对引物：TCAAACGACATGTTGACT(SEQ.NO.18)和TCACTCGAGGTCAATGTGT(SEQ.NO.19)。
5.一种权利要求3所述核苷酸序列的TRV-14K重组载体。
6.一种14K蛋白跨膜结构域或14K蛋白在制备抗病毒剂中的用途。
7.一种权利要求2所述的氨基酸序列功能的鉴定方法：对权利要求2的碱基序列(SEQ.NO.17)进行碱基缺失突变，使其翻译提前终止，利用缺失突变后的14K基因序列构建TRV重组载体，农杆菌侵染本氏烟后观察症状，结果表明缺失突变后的14K并未引起本氏烟叶片及茎基部坏死。
8.一种权利要求1所述的氨基酸序列功能的鉴定方法：通过软件预测14K蛋白具有一个跨膜结构域，将跨膜结构域中疏水性氨基酸用脯氨酸替代，从而破坏跨膜结构域的功能，构建突变体TRV-m14K；同时，将跨膜结构域两端区域(N端及C端)分别单独缺失，构建突变体TRV-14K(△N)、TRV-14K(△C)；农杆菌浸润后持续观察本氏烟上引起的症状，结果表明浸润后这三种突变体在本氏烟中均未引起坏死反应。
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