CN114516903A

CN114516903A - 一种由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23及其应用

Info

Publication number: CN114516903A
Application number: CN202210233083.3A
Authority: CN
Inventors: 孔广辉; 黄琳晶; 司徒俊键; 张梓敬; 张心宁; 连帅利; 习平根; 姜子德
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-03-09
Filing date: 2022-03-09
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2042-03-09
Also published as: CN114516903B

Abstract

本发明公开了一种由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23及其应用。本发明鉴定了一个新的荔枝霜疫霉RXLR类效应蛋白PlAvh23，其氨基酸序列选自如下任一序列：(a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；(b)如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；(c)如SEQID NO：6所示的氨基酸序列。该植物免疫激活蛋白PlAvh23能够诱导植物产生免疫反应，减少病原菌的侵染，为提高植物抗性提供了新途径，可以应用于荔枝霜疫病的防治。

Description

一种由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23及其应用。

背景技术

由荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)引起的荔枝霜疫病是荔枝生产与贮运过程中危害最严重的病害，该病害目前主要分布在泰国、澳大利亚、越南、巴布亚新几内亚等国家。荔枝霜疫病常常引起大量的落花落果，严重影响荔枝的产量和质量。除此之外，即使采摘时看似健康完好的果实，在运输过程中也可能发病，造成严重的经济损失。

效应蛋白是病原菌在侵染寄主植物过程中分泌的一类毒力分子，其能破坏植物细胞的免疫系统，从而促进病原菌的侵染。RXLR效应蛋白(R代表精氨酸，L代表亮氨酸，X代表任意氨基酸)是植物病原卵菌特有的，作用于寄主植物胞内的一类重要致病因子。通过鉴定荔枝霜疫霉分泌的新型植物免疫激活蛋白，研究其与植物互作机理，可为开发新型防控策略及荔枝抗病育种提供理论依据。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23。

本发明的另一目的在于提供所述由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23的编码基因。

本发明的再一目的在于提供所述由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23，其氨基酸序列选自如下任一序列：

(a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(PlAvh23蛋白)；

(b)如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列(PlAvh23蛋白突变体：PlAvh23^24-331)；

(c)如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列(PlAvh23蛋白突变体：PlAvh23^63-331)。

所述的由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23的编码基因，其核苷酸序列选自如下任一序列：

(d)如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列(PlAvh23的编码基因)；

(e)如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列(PlAvh23蛋白突变体的编码基因：PlAvh23^24-331)；

(f)如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列(PlAvh23蛋白突变体的编码基因：PlAvh23^63-331)。

含有所述由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌。

所述的由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23在提高植物抗病能力、提高植物防御能力(诱导植物防御反应)、和/或提高植物对病原菌抗性(减少病原菌的侵染)中的应用。

所述的植物为烟草或荔枝；优选为本氏烟草。

所述的病原菌为疫霉菌；优选为辣椒疫霉和荔枝霜疫霉中的至少一种。

所述的提高植物抗病能力、提高植物防御能力及提高植物对病原菌抗性通过过表达由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23的方式实现；具体包括如下步骤：

(1)将上述由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23的编码基因连接到植物表达载体上，然后转化大肠杆菌，获得重组质粒；

(2)将重组质粒转入农杆菌，并在植物上瞬时表达。

步骤(1)中所述的植物表达载体优选为PVX载体。

步骤(1)中所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌JM109。

步骤(2)中所述的农杆菌优选为农杆菌GV3101。

所述的由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23在诱导植物活性氧积累，诱导植物胼胝质积累，和/或上调植物防卫相关基因的表达方面的应用，可通过过表达由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23的方式实现。

所述的植物为烟草或荔枝；优选为本氏烟草。

所述的植物防卫相关基因包括NbPR1、NbPR2、NbLOX和NbERF1中的至少一种。

所述的由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23在防治植物病原菌或植物育种(培育抗病植株)方面的应用。

所述的植物为烟草或荔枝；优选为本氏烟草。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明鉴定到一个新的荔枝霜疫霉RXLR类效应蛋白PlAvh23，其可以被植物识别从而激发植物免疫反应，该植物免疫激活蛋白N端拥有典型的信号肽及RXLR-dEER基序，并且预测得到三个LWY-domain，第一个LWY-domain在66-133aa，第二个LWY-domain在133-224aa，第三个LWY-domain在225-291aa。

(3)本发明中的由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23能够诱导植物产生免疫反应，减少病原菌的侵染，PlAvh233个LWY-domain对其引起的免疫反应至关重要，该发明为提高植物抗性提供了新途径，可以应用于荔枝霜疫病的防治。

附图说明

图1为实施例2中在烟草叶片上瞬时表达PlAvh23后引起烟草叶片过敏性坏死的照片图。

图2为实施例2中在烟草叶片上瞬时表达PlAvh23后促进烟草叶片活性氧产生和胼胝质积累的照片图。

图3为实施例2中在烟草叶片上注射表达PlAvh23效应蛋白0h、12h及24h后诱导植物防卫相关基因(NbPR1、NbPR2、NbLOX、NbERF1)的表达情况图。

图4为实施例2中在烟草叶片上瞬时表达PlAvh23后诱导烟草对辣椒疫霉抗性反应的结果图。

图5为实施例3中利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达，筛选获得PlAvh23诱导坏死反应的最短片段PlAvh23^63-331。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

本发明实施例中涉及的荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii Chen ex Ko etal.)和辣椒疫霉(Phytophthora capsici)为常规植物病原卵菌，可通过商业途径或自然界分离获得。

本发明实施例中涉及的表达载体、大肠杆菌JM109感受态细胞和农杆菌GV3101可以通过常规市售获得。

实施例1：编码基因的克隆及表达载体构建

一、PlAvh23编码基因的克隆

根据All-In-One DNA/RNA/Protein Mini–Preps Kit(生工BBI)操作说明提取荔枝霜疫霉总mRNA并用PrimeScript^TM RT reagent kit with gDNA Eraser(Takara)反转录成cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增去除信号肽后的PlAvh23编码基因(蛋白序列如SEQ IDNO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。其中，PCR扩增引物序列如下：

上游引物PVX-PlAvh23-F：

5’-CAGCTAGCATCGATTCCCGGGATCGACTCGAAGATCGCTGT-3’；

下游引物PVX-PlAvh23-R：

5’-AATCTCTAGAGGATCCCCGGGCTACGAGCGTCTAGGGGCTA-3’。

PCR扩增反应体系(50μL)：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix(10Mm each)1μL，上游引物(10μM)2μL，下游引物(10μM)2μL，Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1μL，模板cDNA 50～100ng，加水至50μL；

PCR扩增程序：预变性95℃，3min；变性95℃，15s，退火58℃，15s，延伸72℃，60s，进行30个循环，72℃延伸5min。用琼脂糖凝胶电泳及GoldenView染色检测所得条带是否为目的条带，并根据Gel Extraction Kit(omega)操作说明进行切胶回收。

PlAvh23基因全长蛋白序列(SEQ ID NO.1)：

MRSLRFVLVVAAILFVGATTSVAIDSKIAVPDFRPFTTEQNSASTKRLLRAQVASKENDDERAFPGLDKITAPLKASASKMAESVKLNIWLGKGKSASDVLAKLKLNEGVDRTLASPKLNILDNYVDMLNKKHPERQVSLLGTLTTSYDEVALAKAFVLAKRHEHSKDIATKLQTQQLEGWLNSQKSVDDVFNLLKIKDDGVLSMISRKLETMEEYIKLFNAKNPRHETNLFRALRNGFGEDQFALMVSRAMDNPYTSVAASKYQNELFKRWIKEDYDPMSVLIEVFKVDNRNLAAASAREKSIIAAYKPIYYRAKRLNQVGNVVAPRRS；

PlAvh23基因全长核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：

ATGCGATCACTCCGTTTCGTGCTAGTAGTTGCCGCCATTCTGTTCGTAGGTGCTACTACCTCAGTGGCCATCGACTCGAAGATCGCTGTACCCGACTTCCGTCCGTTCACTACTGAGCAAAACAGTGCTTCTACCAAGAGGTTGTTAAGGGCTCAAGTCGCGTCAAAAGAAAATGACGATGAGAGGGCGTTTCCTGGTTTGGACAAGATCACAGCCCCATTGAAAGCAAGCGCATCGAAGATGGCTGAGTCTGTGAAGTTGAACATTTGGCTGGGGAAGGGAAAATCCGCGTCCGATGTTCTGGCTAAGCTGAAGCTTAATGAAGGAGTGGACAGGACTCTTGCTAGTCCAAAACTGAATATCCTAGACAACTACGTGGACATGTTGAACAAAAAGCACCCTGAAAGGCAAGTGTCGTTGCTCGGGACGCTCACGACAAGTTACGATGAAGTTGCTCTGGCAAAGGCGTTCGTGCTAGCAAAACGGCACGAACATTCCAAAGACATCGCGACGAAGTTGCAGACGCAGCAGTTGGAGGGATGGTTAAACAGCCAGAAGTCTGTTGACGATGTCTTTAACCTACTCAAGATCAAGGATGATGGCGTCCTATCCATGATAAGCCGGAAACTGGAGACGATGGAAGAGTACATTAAGCTGTTCAACGCAAAGAACCCCCGTCATGAAACAAATTTGTTCAGAGCTTTAAGGAACGGGTTTGGTGAAGATCAGTTCGCTCTCATGGTTTCGAGGGCAATGGATAATCCATATACGTCTGTAGCAGCCTCGAAATACCAAAATGAGCTGTTTAAGCGATGGATCAAGGAAGACTACGACCCAATGAGTGTTCTCATCGAGGTGTTCAAGGTTGATAACCGCAATTTGGCTGCTGCTAGTGCTCGGGAAAAGTCCATTATAGCCGCGTACAAACCAATCTACTACCGGGCAAAGAGACTCAATCAAGTGGGTAACGTCGTAGCCCCTAGACGCTCGTAG。

二、表达载体构建

根据ClonExpressII One Step Cloning Kit(Vazyme)操作说明，将回收后的PlAvh23与PVX酶切载体(又名pGR107，GenBank:AY297843.1)连接(连接位点：SmaⅠ)，转入大肠杆菌感受态JM109中，在LB平板(含卡那霉素(Kanamycin)50μg/mL)上，37℃培养12～16h后用Green Tag Mix(Vazyme)进行菌落PCR验证，按照质粒提取试剂盒(Aidlab)操作说明提取质粒，送广州生工公司测序，获得重组质粒PVX：：PlAvh23-HA。

实施例2：在烟草叶片上瞬时表达PlAvh23诱导植物防卫反应的产生

(1)农杆菌的培养

将PVX：：PlAvh23-HA质粒转入农杆菌GV3101中，涂于LB(含Kanamycin 50μg/mL)平板上，28℃培养2～3d后，用Green Tag Mix(Vazyme)进行菌落PCR验证，挑取正确克隆进行后续实验。

另外获取阴性克隆—转染了PVX::GFP-HA质粒(PVX::GFP-HA质粒的构建方法参考实施例1，将如SEQ ID NO.3所示的RFP基因序列构建到PVX载体上，酶切位点同上)的农杆菌GV3101单菌落，以及阳性克隆—转染了INF1质粒(GenBank:AY830094.1)的农杆菌GV3101单菌落。

RFP碱基序列(SEQ ID NO.3)：

ATGGCCTCCTCCGAGGACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGATGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCCGAGGTCAAGACCACCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAAGACCGACATCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAGCGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGCCTAA。

分别将含有PVX：：PlAvh23-HA重组质粒、阴性克隆、阳性克隆的GV3101菌株于2mLLB(含50μg/mL Kanamycin和50μg/mL利福平(Rifampicin，Rif)中，28℃、180r·min^-1培养2d。4000r·min^-1离心4min收集菌体后，用MgCl₂缓冲液重悬，再次以4000r·min^-1离心4min收集菌体，重复3次，调整菌液OD600为0.4～0.6。

(2)烟草叶片瞬时表达PlAvh23

将上述配制好的农杆菌菌液分别用1mL去针头注射器注射到5～8周龄本氏烟草苗叶片背面，叶片选从顶部数第3～5片，注射后的烟草于温室(22℃，16h光照/8h黑暗)培养。三次重复。

(3)过敏性坏死反应的检测

农杆菌注射表达5天后，观察烟草叶片的坏死情况，待出现明显表型后，采集叶片进行拍照。

(4)活性氧与胼胝质积累的检测

活性氧积累检测：将待检测的本氏烟草叶片按照叶背向下的方式浸泡于新鲜配制的DAB(1mg/mL二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine)，调pH值至3.8)染液中，26℃，黑暗静置8～12h。再将叶片取出再浸泡到无水乙醇中煮沸10min脱色，取出压干后即可观察拍照。

胼胝质积累检测：将待检测的本氏烟草叶片按照叶背向下的方式浸泡于新鲜配制的苯胺蓝染液(0.1mg/mL苯胺蓝，0.1M NaH₂PO₄，调pH值至9)中，黑暗静置1～2h，即可在显微镜下观察拍照。

(5)诱导防卫相关基因表达的检测

农杆菌注射本氏烟草叶片后，收取注射0h、12h及24h的样品，根据All-In-OneDNA/RNA/Protein Mini–Preps Kit(生工BBI)操作说明提取RNA，并用PrimeScript^TM RTreagent kit with gDNA Eraser(Takara)反转录生成cDNA，取适量的反转录产物利用RT-qPCR检测防卫相关基因(NbPR1、NbPR2、NbLOX、NbERF1)表达情况。其中，实时定量PCR引物序列如下：

NbPR1定量上游引物F：5’-CCGCCTTCCCTCAACTCAAC-3’；

NbPR1定量下游引物R：5’-GCACAACCAAGACGTACTGAG-3’；

NbPR2定量上游引物F：5’-CATCACAGGGTTCGTTTAGGA-3’；

NbPR2定量下游引物R：5’-GGGTTCTTGTTGTTCTCATCA-3’；

NbLOX定量上游引物F：5’-CCTTAAGAGGAGATGGAACT-3’；

NbLOX定量下游引物R：5’-TCTAAGCTCATAAGCAATGG-3’；

NbERF1定量上游引物F：5’-GGCGAATTTTCCGGGAGACT-3’；

NbERF1定量下游引物R：5’-GGCTCCGATTTTACTTCGCC-3’。

实时定量PCR反应：

PCR反应体系(20μL)：SYBR Premix Ex Taq II(Takara)10μL，cDNA20ng,前后引物各0.8μL，加ddH₂O至20μL。反应程序：I：95℃30s；II：95℃30s，60℃30s；程序II 40个循环。溶解曲线分析程序是：95℃15s，60℃1min，95℃15s。

(6)PlAvh23对辣椒疫霉抗性的诱导

分别将含有PVX：：PlAvh23-HA重组质粒、阴性克隆PVX::GFP-HA的GV3101菌株于2mL LB(含50μg/mL Kanamycin和50μg/mL Rif)中，28℃、180r·min^-1培养2d。4000r·min^-1离心4min收集菌体后，用MgCl₂缓冲液重悬，再次以4000r·min^-1离心4min收集菌体，重复3次，调整菌液OD600为0.1。将配制好的农杆菌菌液用1mL去针头注射器注射到5～8周龄本氏烟草苗叶片背面，同一片叶片左半侧注射含有PVX：：PlAvh23-HA重组质粒的农杆菌，右半侧注射PVX::GFP-HA为对照，注射后的烟草于温室(22℃，16h光照/8h黑暗)培养，24h后将注射烟草叶片剪下，置于湿润的滤纸中进行保湿。用灭菌的5mm打孔器在辣椒疫霉菌落边缘打取菌龄一致的菌饼，在叶背面左右两侧分别接种一块菌饼，重复20次。于25℃保湿放置，48h后拍照并测量左右两侧病斑直径。

(7)结果：

结果如图1～4所示：从图1可以看出，与对照(阴性克隆)相比，注射了含有PVX::PlAvh23-HA质粒农杆菌的烟草叶片，培养5天后，出现明显的过敏性坏死反应；从图2可以看出，PlAvh23能促进烟草活性氧产生和胼胝质积累；从图3可以看出，PlAvh23在表达24h时，水杨酸、茉莉酸及乙烯通路上的marker基因均表达上调；从图4可以看出，辣椒疫霉在表达PlAvh23的本氏烟草叶片中，侵染面积较对照显著减小，表明PlAvh23的表达诱导本氏烟草对辣椒疫霉的抗性。说明PlAvh23在烟草叶片中瞬时表达后，能够诱导植物防卫反应和抗性的产生。

实施例3PlAvh23^63-331诱导植物防卫反应的产生

(1)缺失突变体片段的克隆

以PlAvh23(SEQ ID NO.2)全长为模板，分别扩增PlAvh23^24-331、PlAvh23^24-62、PlAvh23^63-331、PlAvh23^{24-65，134-331}，PlAvh23^{24-132，225-331}，PlAvh23^{24-224、292-331}序列。

PCR扩增引物序列如下：

PlAvh23^24-331上游引物F：

5’-AGAGGATCCGTCGACCCCGGGATCGACTCGAAGATCGCTGT-3’；

PlAvh23^24-331下游引物R：

5’-CTGTACAAGGGTACCCCCGGGCTACGAGCGTCTAGGGGCTA-3’；

PlAvh23^24-62上游引物F：

5’-AGAGGATCCGTCGACCCCGGGATCGACTCGAAGATCGCTGT-3’；

PlAvh23^24-62下游引物R：

5’-CTGTACAAGGGTACCCCCGGGCTACCTCTCATCGTCATTTT-3’；

PlAvh23^63-331上游引物F：

5’-AGAGGATCCGTCGACCCCGGGATGGCGTTTCCTGGTTTGGA-3’；

PlAvh23^63-331下游引物R：

5’-CTGTACAAGGGTACCCCCGGGCTACGAGCGTCTAGGGGCTA-3’；

PlAvh23^{24-65，134-331}片段1上游引物F：

5’-AGAGGATCCGTCGACCCCGGGATCGACTCGAAGATCGCTGT-3’；

PlAvh23^{24-65，134-331}片段1下游引物R：

5’-AACGACACTTGCCTTTCAGGGCTGTGATCTTGTCCAAACC-3’；

PlAvh23^{24-65，134-331}片段2上游引物F：

5’-GGTTTGGACAAGATCACAGCCCTGAAAGGCAAGTGTCGTT-3’；

PlAvh23^{24-65，134-331}片段2下游引物R：

5’-CTGTACAAGGGTACCCCCGGGCTACGAGCGTCTAGGGGCTA-3’；

PlAvh23^{24-132，225-331}片段1上游引物F：

5’-AGAGGATCCGTCGACCCCGGGATCGACTCGAAGATCGCTGT-3’；

PlAvh23^{24-132，225-331}片段1下游引物R：

5’-AAATTTGTTTCATGACGGGGCTTTTTGTTCAACATGTCCA-3’；

PlAvh23^{24-132，225-331}片段2上游引物F：

5’-TGGACATGTTGAACAAAAAGCCCCGTCATGAAACAAATTT-3’；

PlAvh23^{24-132，225-331}片段2下游引物R：

5’-CTGTACAAGGGTACCCCCGGGCTACGAGCGTCTAGGGGCTA-3’；

PlAvh23^{24-224、292-331}片段1上游引物F：

5’-AGAGGATCCGTCGACCCCGGGATCGACTCGAAGATCGCTGT-3’；

PlAvh23^{24-224、292-331}片段1下游引物R：

5’-CTAGCAGCAGCCAAATTGCGGTTCTTTGCGTTGAACAGCT-3’；

PlAvh23^{24-224、292-331}片段2上游引物F：

5’-AGCTGTTCAACGCAAAGAAC CGCAATTTGGCTGCTGCTAG-3’

PlAvh23^{24-224、292-331}片段2下游引物R：

5’-CTGTACAAGGGTACCCCCGGGCTACGAGCGTCTAGGGGCTA-3’；

PCR扩增50μL反应体系：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix(10Mm each)1μL，上游引物(10μM)2μL，下游引物(10μM)2μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase1μL，模板cDNA 50～100ng，加水至50μL。PCR扩增程序：预变性95℃，3min，变性95℃，15s，退火58℃，15s，延伸72℃，60s，进行30个循环，最后72℃延伸5min。用琼脂糖凝胶电泳及GoldenView染色检测所得条带是否为目的条带，并根据Gel Extraction Kit(omega)操作说明进行切胶回收。

根据ClonExpressII One Step Cloning Kit(Vazyme)操作说明，将回收后的产物与pBin-GFP(pBin-GFP载体可通过常规市购获得)酶切载体连接(连接位点：SmaⅠ)，分别转入大肠杆菌感受态JM109中，在LB平板(含Kanamycin 50μg/mL)上，37℃培养12～16h后用Green Tag Mix(Vazyme)进行菌落PCR验证，按照质粒提取试剂盒(Aidlab)操作说明提取质粒，送广州生工公司测序，得到5个重组质粒，分别命名为：pBin-GFP：：PlAvh23^24-331-GFP(PlAvh23)、pBin-GFP：：PlAvh23^24-62-GFP(M1)、pBin-GFP：：PlAvh23^63-331-GFP(M2)、pBin-GFP：：PlAvh23^{24-65，134-331}-GFP(M3)，pBin-GFP::PlAvh23^{24-132，225-331}-GFP(M4)，pBin-GFP::PlAvh23^{24-224、292-331}-GFP(M5)重组质粒。

(2)农杆菌的培养

将重组质粒分别转入农杆菌GV3101中，涂于LB(含Kanamycin 50μg/mL)平板上，28℃培养2～3d后，用Green Tag Mix(Vazyme)进行菌落PCR验证，挑取正确克隆进行后续实验。

分别将上述正确克隆在2mL含50μg/mL Kanamycin和50μg/mL Rif的LB液体培养基中28℃、180r·min^-1培养2d。4000r·min^-1离心4min收集菌体，用MgCl₂缓冲液进行重悬浮，再次以4000r·min^-1离心4min收集菌体，重复3次，将OD600调至0.4～0.6。

(3)烟草叶片瞬时表达PlAvh23突变体

将上述配制好的农杆菌菌液用1mL去针头的注射器分别注射到5～8周龄本氏烟草苗叶片背面，叶片选从顶部数第3～5片，注射后的烟草于温室(22℃，16h光照/8h黑暗)培养。

(4)过敏性坏死反应的检测

结果：只有表达保留完整WYL结构域(WYL-domain)的突变体，即PlAvh23^24-331(PlAvh23)和PlAvh23^63-331(M2)，能够诱导植物防卫反应的产生，结果如图5所示。

PlAvh23^24-331(PlAvh23)蛋白序列(SEQ ID NO.4)：

IDSKIAVPDFRPFTTEQNSASTKRLLRAQVASKENDDERAFPGLDKITAPLKASASKMAESVKLNIWLGKGKSASDVLAKLKLNEGVDRTLASPKLNILDNYVDMLNKKHPERQVSLLGTLTTSYDEVALAKAFVLAKRHEHSKDIATKLQTQQLEGWLNSQKSVDDVFNLLKIKDDGVLSMISRKLETMEEYIKLFNAKNPRHETNLFRALRNGFGEDQFALMVSRAMDNPYTSVAASKYQNELFKRWIKEDYDPMSVLIEVFKVDNRNLAAASAREKSIIAAYKPIYYRAKRLNQVGNVVAPRRS；

PlAvh23^24-331(PlAvh23)核苷酸序列(SEQ ID NO.5)：

ATCGACTCGAAGATCGCTGTACCCGACTTCCGTCCGTTCACTACTGAGCAAAACAGTGCTTCTACCAAGAGGTTGTTAAGGGCTCAAGTCGCGTCAAAAGAAAATGACGATGAGAGGGCGTTTCCTGGTTTGGACAAGATCACAGCCCCATTGAAAGCAAGCGCATCGAAGATGGCTGAGTCTGTGAAGTTGAACATTTGGCTGGGGAAGGGAAAATCCGCGTCCGATGTTCTGGCTAAGCTGAAGCTTAATGAAGGAGTGGACAGGACTCTTGCTAGTCCAAAACTGAATATCCTAGACAACTACGTGGACATGTTGAACAAAAAGCACCCTGAAAGGCAAGTGTCGTTGCTCGGGACGCTCACGACAAGTTACGATGAAGTTGCTCTGGCAAAGGCGTTCGTGCTAGCAAAACGGCACGAACATTCCAAAGACATCGCGACGAAGTTGCAGACGCAGCAGTTGGAGGGATGGTTAAACAGCCAGAAGTCTGTTGACGATGTCTTTAACCTACTCAAGATCAAGGATGATGGCGTCCTATCCATGATAAGCCGGAAACTGGAGACGATGGAAGAGTACATTAAGCTGTTCAACGCAAAGAACCCCCGTCATGAAACAAATTTGTTCAGAGCTTTAAGGAACGGGTTTGGTGAAGATCAGTTCGCTCTCATGGTTTCGAGGGCAATGGATAATCCATATACGTCTGTAGCAGCCTCGAAATACCAAAATGAGCTGTTTAAGCGATGGATCAAGGAAGACTACGACCCAATGAGTGTTCTCATCGAGGTGTTCAAGGTTGATAACCGCAATTTGGCTGCTGCTAGTGCTCGGGAAAAGTCCATTATAGCCGCGTACAAACCAATCTACTACCGGGCAAAGAGACTCAATCAAGTGGGTAACGTCGTAGCCCCTAGACGCTCGTAG；

PlAvh23^63-331蛋白序列(SEQ ID NO.6)：

AFPGLDKITAPLKASASKMAESVKLNIWLGKGKSASDVLAKLKLNEGVDRTLASPKLNILDNYVDMLNKKHPERQVSLLGTLTTSYDEVALAKAFVLAKRHEHSKDIATKLQTQQLEGWLNSQKSVDDVFNLLKIKDDGVLSMISRKLETMEEYIKLFNAKNPRHETNLFRALRNGFGEDQFALMVSRAMDNPYTSVAASKYQNELFKRWIKEDYDPMSVLIEVFKVDNRNLAAASAREKSIIAAYKPIYYRAKRLNQVGNVVAPRRS；

PlAvh23^63-331核苷酸序列(SEQ ID NO.7)：

GCGTTTCCTGGTTTGGACAAGATCACAGCCCCATTGAAAGCAAGCGCATCGAAGATGGCTGAGTCTGTGAAGTTGAACATTTGGCTGGGGAAGGGAAAATCCGCGTCCGATGTTCTGGCTAAGCTGAAGCTTAATGAAGGAGTGGACAGGACTCTTGCTAGTCCAAAACTGAATATCCTAGACAACTACGTGGACATGTTGAACAAAAAGCACCCTGAAAGGCAAGTGTCGTTGCTCGGGACGCTCACGACAAGTTACGATGAAGTTGCTCTGGCAAAGGCGTTCGTGCTAGCAAAACGGCACGAACATTCCAAAGACATCGCGACGAAGTTGCAGACGCAGCAGTTGGAGGGATGGTTAAACAGCCAGAAGTCTGTTGACGATGTCTTTAACCTACTCAAGATCAAGGATGATGGCGTCCTATCCATGATAAGCCGGAAACTGGAGACGATGGAAGAGTACATTAAGCTGTTCAACGCAAAGAACCCCCGTCATGAAACAAATTTGTTCAGAGCTTTAAGGAACGGGTTTGGTGAAGATCAGTTCGCTCTCATGGTTTCGAGGGCAATGGATAATCCATATACGTCTGTAGCAGCCTCGAAATACCAAAATGAGCTGTTTAAGCGATGGATCAAGGAAGACTACGACCCAATGAGTGTTCTCATCGAGGTGTTCAAGGTTGATAACCGCAATTTGGCTGCTGCTAGTGCTCGGGAAAAGTCCATTATAGCCGCGTACAAACCAATCTACTACCGGGCAAAGAGACTCAATCAAGTGGGTAACGTCGTAGCCCCTAGACGCTCGTAG。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23及其应用

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh23蛋白序列

<400> 1

Met Arg Ser Leu Arg Phe Val Leu Val Val Ala Ala Ile Leu Phe Val

1 5 10 15

Gly Ala Thr Thr Ser Val Ala Ile Asp Ser Lys Ile Ala Val Pro Asp

20 25 30

Phe Arg Pro Phe Thr Thr Glu Gln Asn Ser Ala Ser Thr Lys Arg Leu

35 40 45

Leu Arg Ala Gln Val Ala Ser Lys Glu Asn Asp Asp Glu Arg Ala Phe

50 55 60

Pro Gly Leu Asp Lys Ile Thr Ala Pro Leu Lys Ala Ser Ala Ser Lys

65 70 75 80

Met Ala Glu Ser Val Lys Leu Asn Ile Trp Leu Gly Lys Gly Lys Ser

85 90 95

Ala Ser Asp Val Leu Ala Lys Leu Lys Leu Asn Glu Gly Val Asp Arg

100 105 110

Thr Leu Ala Ser Pro Lys Leu Asn Ile Leu Asp Asn Tyr Val Asp Met

115 120 125

Leu Asn Lys Lys His Pro Glu Arg Gln Val Ser Leu Leu Gly Thr Leu

130 135 140

Thr Thr Ser Tyr Asp Glu Val Ala Leu Ala Lys Ala Phe Val Leu Ala

145 150 155 160

Lys Arg His Glu His Ser Lys Asp Ile Ala Thr Lys Leu Gln Thr Gln

165 170 175

Gln Leu Glu Gly Trp Leu Asn Ser Gln Lys Ser Val Asp Asp Val Phe

180 185 190

Asn Leu Leu Lys Ile Lys Asp Asp Gly Val Leu Ser Met Ile Ser Arg

195 200 205

Lys Leu Glu Thr Met Glu Glu Tyr Ile Lys Leu Phe Asn Ala Lys Asn

210 215 220

Pro Arg His Glu Thr Asn Leu Phe Arg Ala Leu Arg Asn Gly Phe Gly

225 230 235 240

Glu Asp Gln Phe Ala Leu Met Val Ser Arg Ala Met Asp Asn Pro Tyr

245 250 255

Thr Ser Val Ala Ala Ser Lys Tyr Gln Asn Glu Leu Phe Lys Arg Trp

260 265 270

Ile Lys Glu Asp Tyr Asp Pro Met Ser Val Leu Ile Glu Val Phe Lys

275 280 285

Val Asp Asn Arg Asn Leu Ala Ala Ala Ser Ala Arg Glu Lys Ser Ile

290 295 300

Ile Ala Ala Tyr Lys Pro Ile Tyr Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Asn Gln

305 310 315 320

Val Gly Asn Val Val Ala Pro Arg Arg Ser

325 330

<210> 2

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh23基因序列

<400> 2

atgcgatcac tccgtttcgt gctagtagtt gccgccattc tgttcgtagg tgctactacc 60

tcagtggcca tcgactcgaa gatcgctgta cccgacttcc gtccgttcac tactgagcaa 120

aacagtgctt ctaccaagag gttgttaagg gctcaagtcg cgtcaaaaga aaatgacgat 180

gagagggcgt ttcctggttt ggacaagatc acagccccat tgaaagcaag cgcatcgaag 240

atggctgagt ctgtgaagtt gaacatttgg ctggggaagg gaaaatccgc gtccgatgtt 300

ctggctaagc tgaagcttaa tgaaggagtg gacaggactc ttgctagtcc aaaactgaat 360

atcctagaca actacgtgga catgttgaac aaaaagcacc ctgaaaggca agtgtcgttg 420

ctcgggacgc tcacgacaag ttacgatgaa gttgctctgg caaaggcgtt cgtgctagca 480

aaacggcacg aacattccaa agacatcgcg acgaagttgc agacgcagca gttggaggga 540

tggttaaaca gccagaagtc tgttgacgat gtctttaacc tactcaagat caaggatgat 600

ggcgtcctat ccatgataag ccggaaactg gagacgatgg aagagtacat taagctgttc 660

aacgcaaaga acccccgtca tgaaacaaat ttgttcagag ctttaaggaa cgggtttggt 720

gaagatcagt tcgctctcat ggtttcgagg gcaatggata atccatatac gtctgtagca 780

gcctcgaaat accaaaatga gctgtttaag cgatggatca aggaagacta cgacccaatg 840

agtgttctca tcgaggtgtt caaggttgat aaccgcaatt tggctgctgc tagtgctcgg 900

gaaaagtcca ttatagccgc gtacaaacca atctactacc gggcaaagag actcaatcaa 960

gtgggtaacg tcgtagcccc tagacgctcg tag 993

<210> 3

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RFP碱基序列

<400> 3

atggcctcct ccgaggacgt catcaaggag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60

tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120

acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccctc agttccagta cggctccaag gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacttga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggcga gttcatctac 360

aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc ccgtaatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggcctccac cgagcggatg taccccgagg acggcgccct gaagggcgag 480

atcaagatga ggctgaagct gaaggacggc ggccactacg acgccgaggt caagaccacc 540

tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca agaccgacat caagctggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt acgagcgcgc cgagggccgc 660

cactccaccg gcgcctaa 678

<210> 4

<211> 307

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-331（PlAvh23）蛋白序列

<400> 4

Ile Asp Ser Lys Ile Ala Val Pro Asp Phe Arg Pro Phe Thr Thr Glu

1 5 10 15

Gln Asn Ser Ala Ser Thr Lys Arg Leu Leu Arg Ala Gln Val Ala Ser

20 25 30

Lys Glu Asn Asp Asp Glu Arg Ala Phe Pro Gly Leu Asp Lys Ile Thr

35 40 45

Ala Pro Leu Lys Ala Ser Ala Ser Lys Met Ala Glu Ser Val Lys Leu

50 55 60

Asn Ile Trp Leu Gly Lys Gly Lys Ser Ala Ser Asp Val Leu Ala Lys

65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Glu Gly Val Asp Arg Thr Leu Ala Ser Pro Lys Leu

85 90 95

Asn Ile Leu Asp Asn Tyr Val Asp Met Leu Asn Lys Lys His Pro Glu

100 105 110

Arg Gln Val Ser Leu Leu Gly Thr Leu Thr Thr Ser Tyr Asp Glu Val

115 120 125

Ala Leu Ala Lys Ala Phe Val Leu Ala Lys Arg His Glu His Ser Lys

130 135 140

Asp Ile Ala Thr Lys Leu Gln Thr Gln Gln Leu Glu Gly Trp Leu Asn

145 150 155 160

Ser Gln Lys Ser Val Asp Asp Val Phe Asn Leu Leu Lys Ile Lys Asp

165 170 175

Asp Gly Val Leu Ser Met Ile Ser Arg Lys Leu Glu Thr Met Glu Glu

180 185 190

Tyr Ile Lys Leu Phe Asn Ala Lys Asn Pro Arg His Glu Thr Asn Leu

195 200 205

Phe Arg Ala Leu Arg Asn Gly Phe Gly Glu Asp Gln Phe Ala Leu Met

210 215 220

Val Ser Arg Ala Met Asp Asn Pro Tyr Thr Ser Val Ala Ala Ser Lys

225 230 235 240

Tyr Gln Asn Glu Leu Phe Lys Arg Trp Ile Lys Glu Asp Tyr Asp Pro

245 250 255

Met Ser Val Leu Ile Glu Val Phe Lys Val Asp Asn Arg Asn Leu Ala

260 265 270

Ala Ala Ser Ala Arg Glu Lys Ser Ile Ile Ala Ala Tyr Lys Pro Ile

275 280 285

Tyr Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Asn Gln Val Gly Asn Val Val Ala Pro

290 295 300

Arg Arg Ser

305

<210> 5

<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-331（PlAvh23）核苷酸序列

<400> 5

atcgactcga agatcgctgt acccgacttc cgtccgttca ctactgagca aaacagtgct 60

tctaccaaga ggttgttaag ggctcaagtc gcgtcaaaag aaaatgacga tgagagggcg 120

tttcctggtt tggacaagat cacagcccca ttgaaagcaa gcgcatcgaa gatggctgag 180

tctgtgaagt tgaacatttg gctggggaag ggaaaatccg cgtccgatgt tctggctaag 240

ctgaagctta atgaaggagt ggacaggact cttgctagtc caaaactgaa tatcctagac 300

aactacgtgg acatgttgaa caaaaagcac cctgaaaggc aagtgtcgtt gctcgggacg 360

ctcacgacaa gttacgatga agttgctctg gcaaaggcgt tcgtgctagc aaaacggcac 420

gaacattcca aagacatcgc gacgaagttg cagacgcagc agttggaggg atggttaaac 480

agccagaagt ctgttgacga tgtctttaac ctactcaaga tcaaggatga tggcgtccta 540

tccatgataa gccggaaact ggagacgatg gaagagtaca ttaagctgtt caacgcaaag 600

aacccccgtc atgaaacaaa tttgttcaga gctttaagga acgggtttgg tgaagatcag 660

ttcgctctca tggtttcgag ggcaatggat aatccatata cgtctgtagc agcctcgaaa 720

taccaaaatg agctgtttaa gcgatggatc aaggaagact acgacccaat gagtgttctc 780

atcgaggtgt tcaaggttga taaccgcaat ttggctgctg ctagtgctcg ggaaaagtcc 840

attatagccg cgtacaaacc aatctactac cgggcaaaga gactcaatca agtgggtaac 900

gtcgtagccc ctagacgctc gtag 924

<210> 6

<211> 268

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2363-331蛋白序列

<400> 6

Ala Phe Pro Gly Leu Asp Lys Ile Thr Ala Pro Leu Lys Ala Ser Ala

1 5 10 15

Ser Lys Met Ala Glu Ser Val Lys Leu Asn Ile Trp Leu Gly Lys Gly

20 25 30

Lys Ser Ala Ser Asp Val Leu Ala Lys Leu Lys Leu Asn Glu Gly Val

35 40 45

Asp Arg Thr Leu Ala Ser Pro Lys Leu Asn Ile Leu Asp Asn Tyr Val

50 55 60

Asp Met Leu Asn Lys Lys His Pro Glu Arg Gln Val Ser Leu Leu Gly

65 70 75 80

Thr Leu Thr Thr Ser Tyr Asp Glu Val Ala Leu Ala Lys Ala Phe Val

85 90 95

Leu Ala Lys Arg His Glu His Ser Lys Asp Ile Ala Thr Lys Leu Gln

100 105 110

Thr Gln Gln Leu Glu Gly Trp Leu Asn Ser Gln Lys Ser Val Asp Asp

115 120 125

Val Phe Asn Leu Leu Lys Ile Lys Asp Asp Gly Val Leu Ser Met Ile

130 135 140

Ser Arg Lys Leu Glu Thr Met Glu Glu Tyr Ile Lys Leu Phe Asn Ala

145 150 155 160

Lys Asn Pro Arg His Glu Thr Asn Leu Phe Arg Ala Leu Arg Asn Gly

165 170 175

Phe Gly Glu Asp Gln Phe Ala Leu Met Val Ser Arg Ala Met Asp Asn

180 185 190

Pro Tyr Thr Ser Val Ala Ala Ser Lys Tyr Gln Asn Glu Leu Phe Lys

195 200 205

Arg Trp Ile Lys Glu Asp Tyr Asp Pro Met Ser Val Leu Ile Glu Val

210 215 220

Phe Lys Val Asp Asn Arg Asn Leu Ala Ala Ala Ser Ala Arg Glu Lys

225 230 235 240

Ser Ile Ile Ala Ala Tyr Lys Pro Ile Tyr Tyr Arg Ala Lys Arg Leu

245 250 255

Asn Gln Val Gly Asn Val Val Ala Pro Arg Arg Ser

260 265

<210> 7

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2363-331核苷酸序列

<400> 7

gcgtttcctg gtttggacaa gatcacagcc ccattgaaag caagcgcatc gaagatggct 60

gagtctgtga agttgaacat ttggctgggg aagggaaaat ccgcgtccga tgttctggct 120

aagctgaagc ttaatgaagg agtggacagg actcttgcta gtccaaaact gaatatccta 180

gacaactacg tggacatgtt gaacaaaaag caccctgaaa ggcaagtgtc gttgctcggg 240

acgctcacga caagttacga tgaagttgct ctggcaaagg cgttcgtgct agcaaaacgg 300

cacgaacatt ccaaagacat cgcgacgaag ttgcagacgc agcagttgga gggatggtta 360

aacagccaga agtctgttga cgatgtcttt aacctactca agatcaagga tgatggcgtc 420

ctatccatga taagccggaa actggagacg atggaagagt acattaagct gttcaacgca 480

aagaaccccc gtcatgaaac aaatttgttc agagctttaa ggaacgggtt tggtgaagat 540

cagttcgctc tcatggtttc gagggcaatg gataatccat atacgtctgt agcagcctcg 600

aaataccaaa atgagctgtt taagcgatgg atcaaggaag actacgaccc aatgagtgtt 660

ctcatcgagg tgttcaaggt tgataaccgc aatttggctg ctgctagtgc tcgggaaaag 720

tccattatag ccgcgtacaa accaatctac taccgggcaa agagactcaa tcaagtgggt 780

aacgtcgtag cccctagacg ctcgtag 807

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PVX-PlAvh23-F

<400> 8

cagctagcat cgattcccgg gatcgactcg aagatcgctg t 41

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PVX-PlAvh23-R

<400> 9

aatctctaga ggatccccgg gctacgagcg tctaggggct a 41

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NbPR1定量上游引物F

<400> 10

ccgccttccc tcaactcaac 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NbPR1定量下游引物R

<400> 11

gcacaaccaa gacgtactga g 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NbPR2定量上游引物F

<400> 12

catcacaggg ttcgtttagg a 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NbPR2定量下游引物R

<400> 13

gggttcttgt tgttctcatc a 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NbLOX定量上游引物F

<400> 14

ccttaagagg agatggaact 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NbLOX定量下游引物R

<400> 15

tctaagctca taagcaatgg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NbERF1定量上游引物F

<400> 16

ggcgaatttt ccgggagact 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NbERF1定量下游引物R

<400> 17

ggctccgatt ttacttcgcc 20

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-331上游引物F

<400> 18

agaggatccg tcgaccccgg gatcgactcg aagatcgctg t 41

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-331下游引物R

<400> 19

ctgtacaagg gtacccccgg gctacgagcg tctaggggct a 41

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-62上游引物F

<400> 20

agaggatccg tcgaccccgg gatcgactcg aagatcgctg t 41

<210> 21

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-62下游引物R

<400> 21

ctgtacaagg gtacccccgg gctacctctc atcgtcattt t 41

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2363-331上游引物F

<400> 22

agaggatccg tcgaccccgg gatggcgttt cctggtttgg a 41

<210> 23

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2363-331下游引物R

<400> 23

ctgtacaagg gtacccccgg gctacgagcg tctaggggct a 41

<210> 24

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-65，134-331片段1上游引物F

<400> 24

agaggatccg tcgaccccgg gatcgactcg aagatcgctg t 41

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-65，134-331片段1下游引物R

<400> 25

aacgacactt gcctttcagg gctgtgatct tgtccaaacc 40

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-65，134-331片段2上游引物F

<400> 26

ggtttggaca agatcacagc cctgaaaggc aagtgtcgtt 40

<210> 27

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-65，134-331片段2下游引物R

<400> 27

ctgtacaagg gtacccccgg gctacgagcg tctaggggct a 41

<210> 28

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-132，225-331片段1上游引物F

<400> 28

agaggatccg tcgaccccgg gatcgactcg aagatcgctg t 41

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-132，225-331片段1下游引物R

<400> 29

aaatttgttt catgacgggg ctttttgttc aacatgtcca 40

<210> 30

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-132，225-331片段2下游引物R

<400> 30

ctgtacaagg gtacccccgg gctacgagcg tctaggggct a 41

<210> 31

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-224、292-331片段1上游引物F

<400> 31

agaggatccg tcgaccccgg gatcgactcg aagatcgctg t 41

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-224、292-331片段1下游引物R

<400> 32

ctagcagcag ccaaattgcg gttctttgcg ttgaacagct 40

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-224、292-331片段2上游引物F

<400> 33

agctgttcaa cgcaaagaac cgcaatttgg ctgctgctag 40

<210> 34

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PlAvh2324-224、292-331片段2下游引物R

<400> 34

ctgtacaagg gtacccccgg gctacgagcg tctaggggct a 41

Claims

1.一种由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23，其特征在于，氨基酸序列选自如下任一序列：

(a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

(b)如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；

(c)如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23的编码基因，其特征在于，核苷酸序列选自如下任一序列：

(d)如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

(e)如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；

(f)如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述的由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌。

4.权利要求1所述的由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23在提高植物抗病能力、提高植物防御能力和/或提高植物对病原菌抗性中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的提高植物抗病能力、提高植物防御能力及提高植物对病原菌抗性通过过表达由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23的方式实现。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述的植物为烟草或荔枝；

所述的病原菌为疫霉菌。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述的植物为本氏烟草；

所述的病原菌为辣椒疫霉和荔枝霜疫霉中的至少一种。

8.权利要求1所述的由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23在诱导植物活性氧积累，诱导植物胼胝质积累和/或上调植物防卫相关基因的表达方面的应用，其特征在于：通过过表达由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23的基因的方式实现。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

所述的植物为烟草或荔枝；

10.权利要求1所述的由荔枝霜疫霉分泌的植物免疫激活蛋白PlAvh23在防治植物病原菌或植物育种方面的应用，其特征在于：

所述的植物为烟草或荔枝；

所述的病原菌为疫霉菌。