CN114891812A

CN114891812A - 一种植物抗病相关蛋白NbXTH1其编码基因和应用

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Publication number: CN114891812A
Application number: CN202210672471.1A
Authority: CN
Inventors: 贺振; 徐小伟; 张坤; 秦朗; 郭枭
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2022-06-15
Filing date: 2022-06-15
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2042-06-15
Also published as: CN114891812B

Abstract

本发明公开了一种植物抗病相关蛋白NbXTH1其编码基因和应用；本发明提供的蛋白，基于马铃薯病毒X(PVX)的表达系统，通过新开发的4维蛋白质组学，在P1^SCSMV的异种表达中鉴定了显著下调的蛋白，命名为NbXTH1，来自本氏烟（Nicotiana benthamiana）。在本氏烟上通过农杆菌介导过表达NbXTH1后接种7种病毒与4种真菌，检测发现过表达NbXTH1后的叶片病毒积累量下调，真菌导致的坏死程度减弱，其抗病性明显增强。本发明可以运用在作物育种抗病性改良方面，有望提高植物的抗病性，从而达到增产减药的目的。

Description

一种植物抗病相关蛋白NbXTH1其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种植物抗病相关蛋白NbXTH1其编码基因和应用。

背景技术

甘蔗花叶病是由一类病毒侵染引起的世界性重要病害，有研究表明，引起甘蔗花叶病的主要病原有甘蔗花叶病毒(sugarcane mosaic virus,SCMV)、高粱花叶病毒(sorghum mosaic virus,SrMV)和甘蔗线条花叶病毒(sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)。SCSMV属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)，禾草病毒属(Poacevirus)，分子量大小约为10kb，编码一个多聚蛋白，经水解酶切割后可产生10个成熟的蛋白质(周国辉等，2005；李文风等，2006)。SCSMV可通过机械传播，也可通过染病植株的无性繁殖传播，是否存在传播介体尚不清楚(贺振等，2014)。甘蔗和高粱是SCSMV的自然寄主，人工接种条件下还可以侵染玉米、谷子等禾本科植物，受侵染植株主要表现出叶片失绿、不规则嵌纹、条斑、植株矮化和生长缓慢等症状。SCSMV首次在美国引自巴基斯坦的甘蔗种质中检测到(Hall et al；1998)。目前在印度、泰国等东南亚国家广泛发生，对当地甘蔗产业造成严重影响。在我国，SCSMV在云南省甘蔗主产区普遍发生，流行危害严重，对我国甘蔗产业构成很大威胁(He etal，2016)。

随着人口的增加及耕地面积的减少，如何提高粮食产量与品质已成为科学研究的重点,而植物抗病基因的发现与功能阐明不仅为揭示植物免疫调控机制提供实验依据,也为更加高效地改善作物品质奠定理论基础。例如,通过转基因技术将抗病基因转入水稻等作物将在增强植物抗性的同时不影响产量,并提高作物的品质(Xu et al.,2017；Deng etal.,2017)。近10年来,虽然植物抗病方面的研究已取得了巨大进展,但目前对于抗病蛋白介导的免疫信号起始、激活与传递等过程还知之甚少,仍存在许多亟待解决的问题。植物抗病基因功能的挖掘与研究对于农业生产具有重要意义,利用转基因技术将抗病基因转入作物中,能够快速高效地培育出优良抗病品种,减少农药的使用,有利于改善不断恶化的农业生态环境。

尽管自然界中效应因子众多，但植物抗病蛋白的结构却十分保守。根据结构特点可将抗病蛋白分为5类：富含亮氨酸重复结构的跨膜受体蛋白、富含亮氨酸重复结构的蛋白激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、毒素还原酶以及NB-LRR(Nucleotide Binding-Leucine RichRepeat)抗病蛋白。目前已克隆到的抗病基因大多数属于NB-LRR类，该类蛋白包含核苷酸结合位点和富含亮氨酸重复序列的结构域。根据NB-LRR蛋白的结构特点又可将其分为3类：典型NB-LRR结构抗病蛋白、非典型NB-LRR结构抗病蛋白和含特殊结构域的NB-LRR抗病蛋白。典型NB-LRR抗病蛋白根据其N端结构的不同又分为TNL(TIR-NB-LRR)和CNL(CC-NB-LRR)。目前，从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆到的抗病基因大多数属于TNL类；从水稻(Oryza sativa)中发现的抗病基因大多数为CNL类，极少数为TNL类；从玉米(Zea mays)中鉴定到的抗病基因大多数为CNL类(Guo et al.,2011)。非典型NB-LRR结构抗病蛋白缺少TIR/CC(Toll/Interleukin-1Receptor like/Coiled Coil)、NBS(NB Site)或LRR(LeucineRich Repeat)结构域。某些抗病蛋白除NB-LRR结构外，还含有如SD(Ser/Thr Domain)激酶区域、WRKY DNA结合结构域和LIM(Lin-11、Isl-1和Mec-3)等特殊结构域，即为含特殊结构域的抗病蛋白。木葡聚糖内葡聚糖酰化酶/水解酶(NbXTH)家族蛋白质在限制纤维素微纤丝承重交联中发挥酶促作用(Sasidharan et al.，2011年)。在拟南芥(Yokoyama&Nishitani，2004)、本氏烟(Wang et al.，2018)和大麦(Fu et al.，2019)中分别发现了XTH基因家族的33、56和24个成员。XTH家族成员的基因表达表现出不同的时空特征，并对各种植物激素和胁迫做出反应。据报道，许多XTH成员在非生物胁迫下发挥作用。辣椒CaXTH3通过增强细胞壁参与保护细胞免受盐胁迫。胡杨XTH促进耐盐性，主要是由于叶肉质植物的发育(Han etal.，2013)，XTH30可以提高耐盐性(Yan et al.，2019)。然而，迄今为止，XTH在植物病原体入侵中的疾病相关作用尚未有报道。基于此通过蛋白组数据筛选出甘蔗线条花叶病毒P1蛋白诱导的本氏烟中XTH家族成员相关的抗病蛋白，进一步研究其功能，为后续抗病育种奠定基础。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种能够提高植物抗病性的基因NbXTH1。本发明研究发现，将所述基因NbXTH1农杆菌介导的瞬时表达在浸润本氏烟后能够显著提高其对真菌及病毒的抗性，以此增强植物抗病性机能。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种植物抗病性相关蛋白NbXTH1，来源于本氏烟(Nicotiana benthamiana)，其核苷酸序列如SEQIDN0.1所示；氨基酸序列组成的蛋白的编码基因如SEQ ID NO:2所示。本发明通过使用了病毒衍生的过表达载体。嵌合病毒(PVX-GFP或PVX-P1^SCSMV)是通过将GFP或P1^SCSMV开放阅读框序列插入病毒载体获得的。将含有PVX-GFP或PVX-P1^SCSMV结合ssGFP的农杆菌渗透到16c转基因的本氏烟上，收集接种PVX-GFP或PVX-P1^SCSMV的上部叶片，分离总蛋白。基于4D无标记液相色谱-质谱/质谱的定量蛋白质组学方法筛选鉴定出广谱谱抗性蛋白NbXTH1，接着将其基因构建至pSuper1300载体上进行农杆菌介导的瞬时表达后接病原，观察其坏死现象并检测。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

第一方面，提供一种基因，命名为NbXTH1，为如下1)-2)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

2)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白的编码基因。

第二方面，提供携带所述的基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。

第三方面，提供如下a)-c)中任一项所述的DNA片段在提高植物抗病性中的应用；a)SEQ ID NO:1所示的DNA片段；b)编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的DNA片段；c)DNA片段，与a)或b)限定的DNA片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ IDNO:2所示的蛋白等价。

进一步地，所述提高植物抗病性包括：提高植物对致病菌的免疫抗性；提高植物抗致病菌以及病毒引起的病害。

第四方面，提供如下1)-3)中任一项所述的蛋白在提高植物抗病性中的应用；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的蛋白；

2)将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO:2所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

3)在SEQ ID NO:2所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

进一步地，携带SEQ ID NO:1所示基因片段的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在提高植物抗病性中的应用。

有益效果：本发明公开了一种植物抗病相关蛋白NbXTH1其编码基因和应用。本发明提供的蛋白，基于马铃薯病毒X(PVX)的表达系统，通过新开发的4维蛋白质组学，在P1^SCSMV的异种表达中鉴定了显著下调的蛋白，命名为NbXTH1，来自本氏烟(Nicotianabenthamiana)。木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(XTH)广泛地存在于植物的各种组织和细胞中，通过催化木葡聚糖分子的断裂与再连接，从而修饰植物细胞壁的纤维素-木葡聚糖复合结构，实现细胞壁的重构，它是植物细胞壁重构过程中的关键酶之一。XTH蛋白在植物细胞生长过程中不仅能够松弛细胞壁，而且参与细胞壁合成，能够强化细胞壁；还具有降解细胞壁功能作用。在本氏烟上通过农杆菌介导过表达NbXTH1后接种7种病毒与4种真菌，检测发现过表达NbXTH1后的叶片病毒积累量下调，真菌导致的坏死程度减弱，其抗病性明显增强。本发明可以运用在作物育种抗病性改良方面，有望提高植物的抗病性，从而达到增产减药的目的。

本发明的实验证明，本发明从本氏烟中筛选到一个基因NbXTH1，通过农杆菌介导的瞬时表达浸润本氏烟，经过接种病毒和真菌检测抗病性等手段。本发明对于培育抗病转基因作物具有重要价值。

附图说明

图1为PVX-GFP或PVX-P1^SCSMV结合ssGFP的农杆菌渗透到16c转基因的本氏烟上，基于4D无标记液相色谱-质谱/质谱的定量蛋白质组学方法筛选鉴定出广谱抗病蛋白。

图2为NbXTH1对植物病原的广谱抗病性。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有陈述，否则所有表达量、百分数或比例的数字及本说明书和所附权利要求书中所用的其它数值被理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。此外，本文公开的所有范围都包括端点在内且可独立组合。

实施例1

实验材料及试剂

野生型本氏烟种子、稳定表达GFP的16c转基因本氏烟种子均由本实验室保存和培养。

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α和农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，GV3101菌株、PVX表达载体pND108、瞬时表达载体pGWB5(Tsuyoshi Nakagawa，Shimane University，Japan)、PVX-P1^SCSMV和PVX-GFP农杆菌菌株均由本实验室保存；pSuper1300-GFP超表达载体由中国农业大学杨淑华教授惠赠。雀麦花叶病毒(BMV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、GFP标记的马铃薯病毒X(PVX-GFP)、GFP标记的烟草花叶病毒(TMV-GFP)、GFP标记的芜菁花叶病毒(TuMV-GFP)和大豆花叶病毒(SMV-GFP)以及辣椒疫霉、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和链格孢菌均由本实验室保存。

限制性内切酶(Pst I、Sal I)、反转录酶M-MLV、dNTPs、5×M-MLV Buffer、RNA酶抑制剂载体、T4 DNA连接酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；Trizol试剂购自TaKaRa公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司；产物回收试剂盒和高纯质粒小量制备试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司；PCR仪购自ProFlex公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司；2×High-FidelityMaster Mix购自擎科生物技术有限公司；2×Taq Master Mix、Marker购自南京诺唯赞生物科技有限公司。碱性磷酸酯酶(Alkaline phosphatase，AP)标记的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG、Tris、甘氨酸、甲醇、30％丙烯酰胺(29：1)、氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)、卡那霉素(Kanamycin，Kan)、利福平(Rifampicin，Rif)均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Anti-FLAG和Anti-GFP的鼠抗体购自AbMART；NBT(ONitro blue tetrazolium)、BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)、彩虹180广谱蛋白Marker、考马斯亮蓝R250、台盼蓝、水饱和酚均购自北京索莱宝科技有限公司；GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme mix购自Invitrogen；Anti-DIG-AP、DIG-11-dUTP购自Roche公司；其它试剂均为国产分析纯；硝酸纤维素膜、尼龙膜和聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene fluoride，PVDF)购自GEHealthcare；引物合成及测序工作由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

如图1所示质粒PVX-GFP和PVX-P1^SCSMV通过前面描述的冻融方法转化到农杆菌GV3101中。农杆菌培养采用LB培养基(100mg/L Kan and 25mg/L Rif)。在28℃下以220rpm振荡培养10-16小时后，通过在3000g离心10分钟收集细胞，悬浮在浸润缓冲液中，并在浸润之前在28℃下孵育超过2小时。将农杆菌渗透到16c转基因的本氏烟上，收集接种PVX-GFP或PVX-P1^SCSMV的上部叶片，分离总蛋白。基于4D无标记液相色谱-质谱/质谱的定量蛋白质组学方法筛选鉴定出广谱抗性蛋白NbXTH1。

接着进行图2所示实验：

1.本氏烟总RNA提取

在研磨植物组织之前，先将研磨杵以及研钵等实验材料用液氮预冷，再取0.3g本氏烟叶片置于预冷研钵用液氮快速研磨至粉状，随即转移叶片粉末至2mL离心管，并加入1mL Trizol溶液于去酶离心管中，充分混匀，将其置于冰上5min后；将含样品溶液的离心管置于4℃低温离心机，12000rpm，离心10min，随后用去酶枪头将上清转移至1.5mL去酶离心管，以除去细胞碎片等杂质；同时取200μL氯仿加入样品溶液中，用振荡混匀仪振荡20s，将其置于冰上10min后，转移至4℃低温离心机，12000rpm，离心10min后，用去酶枪头轻轻将水相层溶液转移至1.5mL去酶离心管；随即加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇RNA提取液，振荡20s，将其置于冰上10min后，转移至4℃低温离心机，12000rpm，离心10min，轻轻将水相层溶液转入1.5mL去酶离心管中；并加入等体积异丙醇溶液进行上下颠倒混匀，置于冰上10min后，转移至4℃低温离心机，12000rpm，离心10min，将上清弃干，最后用提前配制好的75％和100％预冷乙醇分别洗涤，每次将离心管置于4℃低温离心机，12000rpm，离心5min，所获沉淀置于真空泵抽干并保存于-80℃冰箱备用。

2.RT-PCR

本氏烟总RNA反转录合成cDNA第一条链：取1μg RNA1L，并加入1μL特异反向引物，去酶水补足至12μL，置于70℃金属浴孵育10min，立即转移至冰上2min；在上述反应溶液中加入5×M-MLV Buffer(10mmol/L)4uL，dNTPs(10mmol/L)1μL，Recombinant RNaseInhibitor(40U/μL)0.5μL，M-MLV(200U/L)0.5μL，DEPC-H2O补足至20μL，42℃孵育1h，70℃孵育15min，迅速置于冰上2min。将cDNA溶液存于-80℃超低温冰箱备用。体系详见表1。

反转录体系表1

3.PCR扩增

设计引物为NbXTH1-F

(5'-AACTGCAGGAATGGGTGTAAAAGGACTTTTG-3')

NbXTH1-R(5'-ACGCGTCGACATATCCCTGTCCTTAGTGC-3')进行PCR反应，详见表2。

表2 PCR反应体系

4.PCR产物回收

PCR产物回收：根据BioTeke PCR产物回收试剂盒说明书进行操作；凝胶回收：根据AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明书进行操作；乙醇沉淀回收：先将反应溶液用灭菌去离子水补足至90uL，并加入pH为5.2的3M NaAc 10μL至反应溶液中，最后加入2倍体积预冷无水乙醇，颠倒混匀后，将样品溶液置于-20℃冰箱30min以上，沉淀结束后置于4℃低温离心机，12000rpm，离心20min，将上清弃干，并用提前配制好的70％和100％预冷乙醇洗涤沉淀，每次置于4℃低温离心机，

12000rpm，离心10min，洗涤结束后置于超净台吹干，置于-20℃保存备用；

5.载体及片段酶切

根据质粒及片段回收产物相应浓度进行取量，载体酶切体系通常为20μL，片段酶切体系为50μL，限制性内切酶通常取1μL，缓冲液为总体系的1/10，选取限制性内切酶最适反应温度和缓冲液进行酶切反应4h左右。

表3酶切体系

6.载体与片段连接与转化

在PCR反应管中按照1：3至1：10的摩尔比例对载体与片段进行配比混合，并取10×T4 Ligase缓冲液1uL，T4 DNALigase(350U/uL)0.5μL，用灭菌去离子水补足至10μL，将反应溶液吹打混匀后，置于16℃金属浴连接4-6h。转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过菌液PCR、酶切和测序鉴定阳性重组菌。

7.农杆菌转化

(1)将农杆菌感受态取出并置于冰上，待自然融化后，取1ug待转质粒移入感受态细胞中，并用手指轻轻拨动离心管底部，将混匀后的转化产物置于冰上30-45min；

(2)冰上孵育结束后，将含重组质粒的感受态置于液氮速冻1min，37C水浴锅热激5min；

(3)热激结束后，加入800μL无抗生素LB液体培养基，置于28℃摇床，180rpm，孵育4h；

(4)孵育结束后，在含有相应抗生素的LB固体培养基平板上对转化产物进行均匀涂布，无菌超净台吹干后置于28℃培养48h后，用灭菌竹签蘸取单菌落进行划线培养，随后挑取少量菌体至PCR反应管，参照普通Taq DNA聚合酶反应条件进行阳性克隆筛选。

8.农杆菌介导的瞬时表达

(1)待农杆菌菌落被鉴定为阳性克隆后，用灭菌枪头挑取培养好的阳性克隆，将其转入含相应抗生素的LB液体培养基，置于28℃摇床，180rpm，过夜培养；

(2)将过夜培养的农杆菌菌液倒入2mL灭菌离心管，置于室温离心机，8500rpm，离心2min，收集后的农杆菌菌体经农杆菌悬浮缓冲液充分悬浮后，进行OD600值测定；

(3)利用可见分光光度计测定悬浮菌液OD600值，如进行共表达，分别测定不同悬浮菌液的OD600值后，根据终浓度计算来调节相应悬浮菌液OD600值；

(4)将混合后的悬浮液置于28℃培养箱2h或静置过夜；

(5)挑取6-7叶期的本氏烟植株进行农杆菌浸润，先用注射器吸取混合后的悬浮液，去除针头后，将注射器的注射孔顶住叶背，轻轻推压注射器直至悬浮液从叶片背面慢慢浸润，避免压力过大导致叶片破损，若叶片无法正常浸润应换取植株，一般浸润3-4片叶子，后续根据实验需求进行相应观察。

9.病毒接种

利用光照时间为16小时和暗光周期为8小时(24℃)的气候控制室进行本氏烟的生长。将含有雀麦花叶病毒(BMV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、GFP标记的马铃薯病毒X(PVX-GFP)、GFP标记的烟草花叶病毒(TMV-GFP)、GFP标记的芜菁花叶病毒(TuMV-GFP)和大豆花叶病毒(SMV-GFP)的cDNA克隆的感受态转化在含有相应抗生素的LB平板上培养2天，然后转移到液体LB培养基中。收获农杆菌并在过夜振荡培养后悬浮在悬浮缓冲液中。对于接种病毒的叶片进行Western blot检测。

10.真菌接种

选择了4种候选真菌，辣椒疫霉、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和链格孢菌进行基因功能分析。这些真菌在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上培养，直到菌丝体遍布整个平板。然后，将真菌接在本氏烟的叶子上，并进行基于TRV的沉默实验，用于进一步培养。大约2天后，取出圆盘，收集叶片，对接种真菌引起的损伤进行台盼蓝染色。

11.台盼蓝染色

(1)染色液配制：称取0.015g台盼蓝粉末，于通风橱吸取10mL水饱和酚，并量取相同体积的灭菌去离子水、甘油、乳酸，置于沸水中充分溶解；

(2)样品准备：采集带叶柄的叶片组织，用无水乙醇清洗2-3min后，利用佳能EOS

5D单反相机拍摄染色前样品形态，注意避免损伤叶片；

(3)染色：将叶片置于染色液中，若叶片漂浮于表面，可用玻璃棒轻轻按压至烧杯底部，沸水煮15min后，室温静置6-8h；

(4)脱色：称取2.5g/mL的三氯水合乙醛颗粒于温水中充分溶解后，将叶片单独放入脱色液中，置于室温摇床，40rpm脱色至坏死细胞清晰可见，期间更换脱色液3-5次；

(5)拍摄与分析：拍摄时将叶片单独置于装有脱色液的培养皿中，便于叶片展开和形态的完整，细胞坏死强度经ImageJ软件定量分析，SPSS软件对所获数据进行差异显著性分析。

12.Western blot检测

(1)样品制备：采用圆盘打孔器在植株主叶脉两侧各取一次，将取得的圆盘叶片用镊子夹入1.5mL灭菌离心管并进行速冻，随后通过迷你手持均质研磨仪进行研磨，直至叶片成粉状后，加入100μL含5％β-巯基乙醇的2×SDS上样缓冲液，将样品溶液充分振荡混匀后，沸水变性10min，为避免盖子破裂，1min左右打开离心盖，变性结束后置于室温离心机，12000rpm，10min，随后将样品溶液上清吸出转移至1.5mL灭菌离心管保存备用；

(2)制胶与电泳：根据不同浓度SDS-PAGE凝胶配制用量表(表2-1)配制12.5％的SDS-PAGE胶，待凝胶完全凝固后取样品溶液10uL上样至SDS-PAGE胶孔，在溴酚蓝进入分离胶前，保持60V恒定电压，进入分离胶后，将电压调整至120V，直至溴酚蓝彻底离开SDS-PAGE胶；

(3)考马斯亮蓝染色与脱色：

(4)转膜：待SDS-PAGE电泳结束后，将转膜夹黑色一面朝下置于1×转膜缓冲液中，由下至上依次放置海绵滤网，Whatman滤纸，SDS-PAGE胶，PVDF膜，Whatman滤纸，海绵滤网后，用塑料板轻轻去除PVDF膜与SDS-PAGE凝胶之间的气泡，将转膜夹轻轻固定，置于4C冰箱，85V，200mA转膜2h；

(5)封闭：转膜结束后，用镊子将膜取出，并将平衡后的PVDF膜转移至10mL封闭缓冲液中，室温封闭1h或4℃过夜封闭，封闭结束后用1×TBST缓冲液洗膜3次，每次120rpm，洗涤10min；

(6)一抗孵育：取封闭缓冲液10mL并加入相应效价比的一抗，置于室温摇床，120

rpm，孵育90min后，用1×TBST缓冲液洗膜3次，洗膜条件同步骤5；

(7)二抗孵育：取封闭缓冲液10mL并加入二抗2μL，置于室温摇床，120rpm，孵育1h后，用1×TBST缓冲液洗膜3次，洗膜条件同步骤5；

(8)显色：在10mL碱性磷酸酯酶显色缓冲液中加入66μLNBT贮存液和33μL BCIP贮存液，充分混匀后，将PVDF膜置于显色盒中，在室温条件下避光显色，直至目的带清晰可见，随后扫描保存。

通过图2所示，A～G图蛋白质印迹分析用于确定雀麦花叶病毒(BMV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、GFP标记的马铃薯病毒X(PVX-GFP)、GFP标记的烟草花叶病毒(TMV-GFP)、GFP标记的芜菁花叶病毒(TuMV-GFP)和大豆花叶病毒(SMV-GFP)的积累水平。可以发现在过表达NbXTH1条件下，病毒积累量明显下降。H图显示了四种候选真菌的致病性测定。左边绿色填充的补丁是指GFP过表达区域，右边的红色填充区域代表NbXTH1过表达区域。I图显示台盼蓝染色前后四种候选真菌接种叶片的图片。上排指的是真菌接种后的亮叶。中间行显示紫外线(UV)光下的叶子。底行显示台盼蓝染色后接种真菌的叶子。可以发现NbXTH1过表达区域比GFP过表达区域接4种真菌之后坏死程度明显减弱，以上实验说明了NbXTH1作为抗病基因在本氏烟中过表达确实增强了其对病毒与真菌等病原的抗性，证明其拥有一定的广谱抗病性。在后续的生产实践中，可运用在作物育种抗病性改良方面，有望提高植物的抗病性，从而达到增产减药的目的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种植物抗病相关蛋白NbXTH1其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 888

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggtgtaa aaggactttt gtttagtatt gttttgatta atttgtcatt actaggactt 60

tgtgggtatc ccagaaaacc agtggatgta cccttttgga aaaactatga gcccagttgg 120

gctagtcacc acatcaagta cctcagtggt ggttccactg ttgatcttgt tcttgacagg 180

tcttcaggtg ctggatttca gtcaaagaaa tcatatttgt ttgggcactt tagcatgaaa 240

ctgaagcttg ttggtggaga ctcagctggt gttgtcactg cattttacct gtcatcgaat 300

aatgcagagc acgatgagat agattttgaa ttcttaggga acaggactgg gcaaccatac 360

attttgcaga caaatgtgtt cacgggagga aaaggagaca gagaacagag aatctatctc 420

tggtttgacc caaccaaggg ttaccattct tattctgttc tttggaatac cttccagatt 480

gtgatctttg tggatgacgt cccaattaga gcattcaaga actcaaaaga cctaggtgtg 540

aaattcccat tcaatcagcc catgaaaata tactcgagcc tttgggatgc agatgattgg 600

gctacaagag gtggattgga gaaaacagac tggtccaatg ccccatttac tgcctcctac 660

acatcattcc acgtggacgg ctgtgaagct gccacgccac aagaagtcca agtttgtaac 720

accaaaggca tgagatggtg ggatcaaaag gctttccaag atttagatgc tttacaatac 780

agaagacttc gatgggttcg ccaaaaatac actatctata actattgcac tgataggaag 840

aggtacccta ctcttccccc agagtgcact aaggacaggg atatttaa 888

<210> 2

<211> 295

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Val Lys Gly Leu Leu Phe Ser Ile Val Leu Ile Asn Leu Ser

1 5 10 15

Leu Leu Gly Leu Cys Gly Tyr Pro Arg Lys Pro Val Asp Val Pro Phe

20 25 30

Trp Lys Asn Tyr Glu Pro Ser Trp Ala Ser His His Ile Lys Tyr Leu

35 40 45

Ser Gly Gly Ser Thr Val Asp Leu Val Leu Asp Arg Ser Ser Gly Ala

50 55 60

Gly Phe Gln Ser Lys Lys Ser Tyr Leu Phe Gly His Phe Ser Met Lys

65 70 75 80

Leu Lys Leu Val Gly Gly Asp Ser Ala Gly Val Val Thr Ala Phe Tyr

85 90 95

Leu Ser Ser Asn Asn Ala Glu His Asp Glu Ile Asp Phe Glu Phe Leu

100 105 110

Gly Asn Arg Thr Gly Gln Pro Tyr Ile Leu Gln Thr Asn Val Phe Thr

115 120 125

Gly Gly Lys Gly Asp Arg Glu Gln Arg Ile Tyr Leu Trp Phe Asp Pro

130 135 140

Thr Lys Gly Tyr His Ser Tyr Ser Val Leu Trp Asn Thr Phe Gln Ile

145 150 155 160

Val Ile Phe Val Asp Asp Val Pro Ile Arg Ala Phe Lys Asn Ser Lys

165 170 175

Asp Leu Gly Val Lys Phe Pro Phe Asn Gln Pro Met Lys Ile Tyr Ser

180 185 190

Ser Leu Trp Asp Ala Asp Asp Trp Ala Thr Arg Gly Gly Leu Glu Lys

195 200 205

Thr Asp Trp Ser Asn Ala Pro Phe Thr Ala Ser Tyr Thr Ser Phe His

210 215 220

Val Asp Gly Cys Glu Ala Ala Thr Pro Gln Glu Val Gln Val Cys Asn

225 230 235 240

Thr Lys Gly Met Arg Trp Trp Asp Gln Lys Ala Phe Gln Asp Leu Asp

245 250 255

Ala Leu Gln Tyr Arg Arg Leu Arg Trp Val Arg Gln Lys Tyr Thr Ile

260 265 270

Tyr Asn Tyr Cys Thr Asp Arg Lys Arg Tyr Pro Thr Leu Pro Pro Glu

275 280 285

Cys Thr Lys Asp Arg Asp Ile

290 295

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aactgcagga atgggtgtaa aaggactttt g 31

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgcgtcgac atatccctgt ccttagtgc 29

Claims

1.一种基因，命名为NbXTH1，其特征在于，为如下1）-2）中任一所述的基因：

1）其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

2）由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白的编码基因。

2.携带权利要求1所述的基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。

3.如下a）-c）中任一项所述的DNA片段在提高植物抗病性中的应用；

a）SEQ ID NO:1所示的DNA片段；

b）编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的DNA片段；

c）DNA片段，与a）或b）限定的DNA片段具有75%或75%以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO:2所示的蛋白等价。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提高植物抗病性包括：提高植物对致病菌的免疫抗性；和/或，提高植物抗致病菌以及病毒引起的病害。

5.如下1）-3）中任一项所述的蛋白在提高植物抗病性中的应用；

1）氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的蛋白；

2）将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO:2所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

3）在SEQ ID NO:2所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述提高植物抗病性包括：提高植物对致病菌的免疫抗性；和/或，提高植物抗致病菌以及病毒引起的病害。

7.携带SEQ ID NO:1所示基因片段的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在提高植物抗病性中的应用。