CN111603557A - 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

一种包膜替换型病毒载体疫苗，以水泡性口炎病毒VSV为载体，将VSV病毒基因组中的GP基因替换为冠状病毒的刺突蛋白S基因的截短体或病毒刺突蛋白S基因的胞外段与GP‑C段融合体ECD‑CA，刺突蛋白S基因截短体选自C端部分氨基酸缺失的基因，ECD‑CA为病毒刺突蛋白S基因的胞外段融合VSV病毒囊膜蛋白的跨膜和胞内段基因后的基因。本发明还涉及包膜替换型病毒载体疫苗的构建方法，首次将冠状病毒包膜完整的呈现给免疫细胞，此包膜替换型病毒具备良好的复制能力，可规模化快速生产，作为活疫苗接种最高程度地模拟冠状病毒侵染宿主细胞的生物学过程，快速激活机体的免疫系统，产生高强度和持久性的抗新冠病毒的中和抗体。

Description

一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种利用水泡性口炎病毒(VSV)构建的有效预防冠状病毒感染，尤其包含SARS-CoV-2冠状病毒包膜进行替换的病毒载体疫苗及其构建方法。
背景技术
世界卫生组织(WHO)近期宣布2019冠状病毒病(Covid-19)构成国际关注的突发公共卫生事件，截至2020年3月24日,全球共有38万例实验室确诊病例。在近期的研究中,一些Covid-19病例的严重程度与SARS-CoV相似，鉴于Covid-19的迅速传播,针对新冠病毒的疫苗已经迫在眉睫。
冠状病毒(Coronavirus)在病毒学分类上属于巢状病毒目(order Nidovirals)、冠状病毒科(family Coronavirade)、冠状病毒属(genus Coronavirus)的成员，基因组为单股、正链的RNA，基因组全长在26～32kb之间，是目前已知基因组最大的RNA病毒。冠状病毒在自然界的感染普非常广泛，常见的哺乳类动物如犬、猫、鼠、猪、牛以及家禽类都易感。
冠状病毒按照核酸序列的系统发生分析，国际病毒学分类委员会(ICTV，2012)在第九次报告中将冠状病毒属成员分成了α组、β组、γ组和δ组共四组。人冠状病毒主要分布于α组和β组。其中，HCoV-229E和HCoV-NL63位于α组，HCoV-OC43和HCoV-HKU1位于β组中的2a亚组，MERS-CoV属于β组中的2c亚组，而最新席卷全球的SARS-CoV-2与SARS属于β组中的2b亚组。
最新研究表明，该病毒的S刺突蛋白RBD段结合ACE2的能力是SARS的10倍之多，传播能力是目前已知主要的七种感染人的冠状病毒中最强的。SARS-CoV-2与SARS冠状病毒的结构相似，体现在病毒表面的棘突蛋白S蛋白是病毒包膜上特异性的组织结构，在病毒的表面形成了大量的刺突蛋白，在病毒入侵靶细胞以及病毒与细胞识别时发挥着重要作用。
新冠疫情全球范围大爆发致使针对新冠肺炎的药物研制已刻不容缓，美国医学会杂志JAMA研究报道结果表明一部分康复患者仍是新冠病毒携带者，进而也引发了新型冠状病毒是否已成为一种全球流行病的讨论，新冠病毒可能像流感病毒一样，长期流行于人类社会，而包膜替换型病毒载体已经被证实是最具成本效益、最有效和最持久的疾病预防、控制措施，因而全民接种新冠包膜替换型病毒载体势在必行，短期内研发并投放新冠肺炎包膜替换型病毒载体是阻止疫情蔓延的有力手段。
研究表明，当前导致严重感染性疾病的病原体如人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)等均通过粘膜表面(生殖道、呼吸道、胃肠道)入侵和感染机体，由于机体不能诱导有效的粘膜免疫应答清除粘膜感染病原体，使病原体迅速扩散入血、进而侵犯全身，造成机体尤其是肺组织的损伤。
已知常规包膜替换型病毒载体如灭活、蛋白包膜替换型病毒载体、DNA包膜替换型病毒载体、亚单位包膜替换型病毒载体等，经常规途径免疫(肌肉注射、皮下等)通常不能诱导特异性粘膜免疫应答。无论包膜替换型病毒载体的形式是什么，要诱导粘膜免疫应答通常需要将靶抗原从粘膜部位接种，才能有效被粘膜组织中的APC摄取并递呈，进一步激活粘膜免疫系统，诱导有效持久的粘膜免疫应答。
已知的包膜替换型病毒载体-水泡性口炎病毒(VSV)野毒株，在自然环境中可以感染多种动物和昆虫。家畜中自然感染VSV的有马、牛(羊)、猪，而人群中自然状态下不存在水泡性口炎病毒主动感染，因此也避免了预存抗体对病毒载体疫苗的药效影响(人体内预存在对腺病毒、痘病毒的中和抗体)，
因此将水泡性口炎病毒(VSV)作为包膜替换型病毒载体与其它病毒载体相比，具备天然的优势，可以完整的将冠状病毒的S蛋白展露在病毒表面，重组病毒无需通过感染宿主细胞，转录翻译外源病毒抗原蛋白，可直接在细胞外被免疫系统识别，并激活抗病毒的先天和后天特异性免疫应答，缩短抗病毒的反应时间，因此可以推论VSV作为病毒载体采用基因编辑技术通过将冠状病毒的包膜蛋白S展示在病毒表面，会显著增强机体的免疫应答的强度，诱导更强的后天性抗病毒反应(T细胞免疫应答和B细胞免疫应答)。
本发明利用VSV病毒载体的天然优势提出一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法，该类包膜替换型病毒载体疫苗对人患冠状病毒尤其是SARS或者新冠肺炎病毒(SARS-CoV-2)有较好的预防或治疗作用。
发明内容
一种包膜替换型病毒载体疫苗，所述包膜替换型病毒载体疫苗是将弹状病毒基因组中的GP基因替换为冠状病毒的刺突蛋白S基因截短体或病毒刺突蛋白S基因的胞外段融合体ECD-CA，并利用反向遗传系统构建得到的用于预防冠状病毒的包膜替换型病毒载体疫苗，所述ECD-CA定义为病毒刺突蛋白S基因的胞外段ECD融合VSV病毒囊膜蛋白的跨膜和胞内段基因后的基因。
优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述弹状病毒载体选自水泡性口炎病毒VSV，所述VSV选自印第安那株，所述刺突蛋白S基因选自SARS或SARS-CoV-2冠状病毒，所述刺突蛋白S基因截短体选自C端氨基酸缺失对应的基因，所述C端氨基酸缺失个数为18～72个。
优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述刺突蛋白S基因截短体选自C端缺失的基因，所述C端氨基酸缺失数目优选30个，且对应修饰后的刺突蛋白S对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述弹状病毒载体选自水泡性口炎病毒VSV，所述VSV选自印第安那株，所述刺突蛋白S基因的胞外段融合体ECD-CA选自冠状病毒，所述ECD-CA包含冠状病毒刺突蛋白S基因的胞外段ECD，所述ECD的C端融合了VSV的囊膜蛋白的跨膜和胞内段基因CA。
优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述ECD-CA克隆到VSV基因组中M基因和L基因之间的编码序列中，所述ECD-CA氨基酸序列为SEQ ID NO.2,所述ECD-CA人源化密码子基因序列为SEQ ID NO.3。
优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述水泡性口炎病毒是其基质蛋白M的氨基酸发生突变后得到的病毒，所述基质蛋白M中氨基酸突变位点为第20位的亮氨酸、第51位甲硫氨酸、第110位的苯丙氨酸中的一个或多个且为非同义突变。所述第20位的亮氨酸、第51位甲硫氨酸、第110位的苯丙氨酸突变后对应的氨基酸可与下段中所述突变后氨基酸的种类对应相同或不同。
优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述病毒载体是减毒水泡性口炎病毒，所述水泡性口炎病毒的基质蛋白M发生3位点氨基酸的突变，所述基质蛋白M的第20位由亮氨酸L突变为苯丙氨酸F、第51位由甲硫氨酸M突变为丙氨酸A、第110位由苯丙氨酸F突变为亮氨酸L，所述的3位点突变的基质蛋白M氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
一种包膜替换型病毒载体疫苗的构建方法，包括如下步骤：
S1、利用合成生物学得到上述任一所述冠状病毒的S-CN截短体基因或上述任一所述ECD-CA包膜基因，基因片段用MluI和XhoI双酶切克隆至pVSV-3M质粒多克隆位点中，分别得到pCore-3M-S-CN或pCore-3M-ECD-CA质粒，其中所述冠状病毒的S-CN定位为冠状病毒刺突蛋白S基因在C端缺失N个氨基酸后对应的基因序列缩写，所述其中N＝18～72中的任一自然数；
S2、用表达T7-RNA聚合酶的质粒pCAGGS-T7瞬转ACE2稳定表达的细胞；所述的ACE2稳定表达的细胞优选自293T-hACE2，转染24h后将内毒素去除的质粒包括pCAGGS-P、pCAGGS-N、pCAGGS-L及pCore-3M-S-CN或pCore-3M-ECD-CA的质粒制备转染混合液；
S3、对四质粒进行脂质体包裹共转染72h后，将上清液通过0.22um的滤膜过滤后加入到对数生长期的293T-ACE2细胞中；
S4、细胞出现病变，则收集细胞上清液，利用RT-PCR技术进行病毒基因组中包膜替换目的基因拷贝数的鉴定；
S5、用293-ACE2稳定表达的细胞进行空斑纯化，经蛋白免疫印迹鉴定后得所述冠状病毒包膜替换型疫苗VSV-△G-S-CN或VSV-△G-ECD-CA。
优选的，所述的冠状病毒包膜替换型病毒载体疫苗的构建方法，步骤S4中所述RT-PCR中特异性扩增冠状病毒S-CN基因的荧光探针引物对为序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。
优选的，所述的冠状病毒包膜替换型病毒载体疫苗的构建方法，RT-PCR中特异性扩增冠状病毒ECD-CA基因的荧光探针引物对为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。
优异性：
与传统的病毒载体疫苗相比，本发明首次借助VSV病毒包装系统，通过大量的基因优化及构建，体外筛选出可以高效包装出冠状病毒包膜替换型重组病毒，涉及到特定的包膜基因修饰体(S-CN和ECD-CA)，冠状病毒包膜完整的包裹在VSV的遗传物质外，与传统病毒载体疫苗相比(感染宿主细胞后才能转录翻译病毒抗原)可以将高免疫原性的抗原递呈给免疫细胞，缩短了宿主免疫系统的反应时间，同时最大程度的保留了冠状病毒的最重要的抗原蛋白S，与传统的复制缺陷的病毒载体疫苗(腺病毒载体)相比，本发明涉及到的冠状病毒候选疫苗具备一定的复制能力(hACE2稳定表达的细胞系)，可规模化快速生产，同时作为非灭活疫苗接种最高程度的模拟了冠状病毒侵染宿主细胞的整个过程(VSV结构蛋白对宿主细胞没有显著毒性)，可以激活机体免疫系统产生高强度的抗新冠的中和抗体反应。
VSV包膜替换型病毒载体疫苗进一步采取粘膜部位接种的免疫方式，会诱导机体产生更强的针对冠状病毒，尤其是新冠肺炎病毒(SARS-CoV-2)抗原蛋白S的特异性黏膜免疫应答，当外来病原体通过黏膜侵入时，黏膜组织的会被激活，迅速将病原清除,进一步已知VSV病毒载体还拥有其他工具载体不具备的特性，当设计的预防包膜替换型病毒载体是用来预防有包膜的病毒时，VSV病毒可以将目的病毒的包膜蛋白完整的空间结构展示在病毒表面，充分将新冠肺炎病毒(SARS-CoV-2)的三聚体蛋白S充分展露在重组病毒的核衣壳表面，进一步该技术类型的包膜替换型病毒载体在体外灭活后，仍具备有效激活机体的特异性免疫应答，充分激活宿主免疫应答，同时重组病毒包膜替换型病毒载体作为灭活疫苗接种后，不具备二次复制能力，进一步提高疫苗的安全性。
附图说明：
图1A是不同S截短体的S-CN和ECD-CA基因构建到弹状病毒骨架载体示意图,B是分子生物克隆的流程验证图，C是蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测包装拯救得到的候选疫苗的目的蛋白的表达，D是不同修饰体的S包装出重组包膜替换型疫苗的荧光图；
图2筛选出包装效率滴度最高的2株包膜替换型候选疫苗，采取不同的疫苗接种方式，21天后分别检测血清中IgA的含量(A)以及特异性的IgG的含量(B)；
图3将多种包膜替换型候选新冠疫苗免疫21天后的血清取出，体外利用基于慢病毒开发的模拟的新冠假病毒作为检测工具，进行中和抗体效价比较；
图4弹状病毒载体的囊膜改造成为冠状病毒包膜的的示意图。
下面结合具体实施例对本公开做进一步的详细说明
具体实施方式
以下所述是对本发明的解释而非限定，本公开主要通过将SARS-CoV-2病毒刺突蛋白S基因不同截短体(S-CN)或ECD-CA变构体分别构建到VSV病毒骨架载体(pCore-3M)上，重组的载体质粒pCore-3M本身的VSV包膜GP已经利用基因工程技术缺失，特定的区域替代的是冠状病毒的包膜基因S-CN或ECD-CA，进一步通过公开的四质粒系统，在ACE2(人源)稳定表达的293T细胞中进行共转染包装，进一步拯救出冠状病毒刺突蛋白完全展示在VSV病毒表面的重组疫苗，通过多途径接种疫苗，免疫后成功诱导健康小鼠体内产生了特异性抗病毒的体液免疫应答。
本公开采用的试剂及耗材如下：Q5 Hot start High-Fidelity DNA polymerase(NEB M0493L),MluⅠ-HF(NEB R3198L),XhoⅠ(NEB R0146S),T4 DNA Ligase Enzyme(NEBM0202L),E.coli DB3.1 Competent Cells(Takara 9057),TIANGEN无内毒素小提中量试剂盒(天根DP118-02),Lipofectamine LTX(Invitrogen 15338100)，PBS(HycloneSH30256.01)，DMEM高糖培养基(Gibco C11995500)，双抗(Gibco 15140-122)，胎牛血清(Gibco 10091-148)，
Figure BDA0002538974700000051
I Reduced Serum Medium(Gibco 31985-070)，96孔细胞培养板(Corning 3599)，6孔细胞培养板(Corning 3516)，6cm细胞培养板(Corning430166)，0.22um滤器(Millipore SL GP033rb)，T175细胞瓶(Corning 431080)。
细胞系：
将293T-hACE2贴壁细胞培养在37℃、含5％CO2的特定培养环境中(Thermo BB150细胞培养箱)，采用DMEM培养基进行培养。
突变型VSV病毒载体：
在一个技术方案中，修饰型VSV病毒载体优选自水泡性口炎病毒印第安那株，所述的病毒基因组中基质蛋白(M)的第20位置、第51位置和第110位置同时具有氨基酸突变，所述的氨基酸的替换方式为：基质蛋白M的第20位由亮氨酸L突变为苯丙氨酸F、第51位由甲硫氨酸M突变为丙氨酸A、第110位由苯丙氨酸F突变为亮氨酸L。
实施例1利用VSV病毒载体进行冠状病毒包膜替换型疫苗的设计和包装
根据已有的研究报道，SARS的基因S进行人源化密码子优化后，更有利于目的基因在真核细胞中的表达(密码子进行人源化优化后，表达效率提升10倍，有利于重组病毒的包装)，因此，在本实施例中，将发布的SARS-CoV-2的S氨基酸序列进行人源化密码子优化，提高其在哺乳细胞中的表达量，本发明中S基因密码子优化后的序列是通过南京金斯瑞生物科技有限公司合成，进一步分别合成至pCDNA3.1真核表达载体上，PCR扩增目的基因后，经过片段纯化试剂盒回收纯化目的条带，将该片段和pVSV-3M载体用限制性核酸内切酶MCS1具体是Mlul，MCS2具体是指Xhol，2种限制性内切酶于37℃双酶切3h，下一步进行胶回收线性载体和目的片段，然后加入T4连接酶，进行连接过夜，再转至感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆及酶切和测序验证鉴定质粒构建情况(并将构建的质粒分别命名为pCore-3M-S-C19、pCore-3M-S-C30和pCore-3M-ECD-CA)，具体实施步骤如下：
根据(图1中A图)构建了多种基于VSV病毒载体的包膜替换型候选疫苗；
引物合成及引物信息：引物由苏州金唯智生物生物科技有限公司合成，其中构建扩增S-C19所选PCR引物及菌液PCR引物如表1所示：
表1 S-C19扩增引物
Figure BDA0002538974700000052
Figure BDA0002538974700000061
其中扩增S-C30所选PCR引物如表2所示：
表2 S-C30扩增引物
Figure BDA0002538974700000062
其中扩增ECD-CA所选PCR引物如表3所示：
表3 ECD-CA扩增引物
Figure BDA0002538974700000063
Figure BDA0002538974700000071
目的基因的获取：以携带目的基因(新冠S以及VSV-GP)序列的pCDNA3.1质粒为模板，分别以表1、表2、表3引物进行PCR扩增S-C19、S-C30、ECD-CA，其中ECD-CA通过重叠延伸PCR将CA片段融合至S基因的ECD段的C端；
参照AxyPrepTM PCR Cleanup kit说明书纯化上述酶切产物，用Nano-300测定产物浓度；
PCR产物以及载体进行双酶切(37℃酶切2h)；
进行电泳，验证PCR产物是否正确，割取凝胶条带，回收剩下的PCR产物，测定产物浓度；
将上述纯化产物与载体进行连接(16℃连接过夜，连接比按1:10进行)；
参照E.coli DB3.1 Competent Cells(TaKaRa)说明书转化连接产物；
挑取LB(Kana)平板上的单克隆到事先加有100μL LB(Kana)培养基的无菌1.5mL管中，37℃，250rpm，培养2h后，进行菌液PCR筛选阳性克隆；
经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，选取阳性克隆按1：200比例转接到30mL摇瓶中，37℃、250rpm摇床培养过夜；
按照TIANGEN无内毒素小提中量试剂盒说明书进行质粒提取；
将筛选的阳性质粒进行双酶切鉴定(Xho I和Mlu I在37℃酶切2h)；
酶切鉴定后，选取其中鉴定正确的质粒进行质粒测序；
将测序正确的质粒按标准方法进行VSV病毒包装，同时取VSV-WT质粒做阳性包装对照；
48h收取病毒上清液并取500uL感染预先铺在6孔板的293T-hACE2细胞,包装出的病毒分别命名为VSV-WT、VSV-△G-S-C19、VSV-△G-S-C30、VSV-△G-ECD-CA；
待细胞病变后收取细胞进行WB检测抗原表达水平。
上述质粒构建结果及WB检测结果如图1所示：
根据实验结果可知，各片段进行PCR扩增后在相应位置处均出现特异性条带且条带分子大小均正确，表明成功扩增出目的条带(图1中B图)；病毒包装感染后VSV-WT阳性对照荧光表达强度较好，细胞病变明显，VSV-△G-S-C19、VSV-△G-S-C30、VSV-△G-ECD-CA病毒感染细胞后出现病变细胞融合情况(图1中C图)；Western Blot也在相应位置检测到各基因的表达(图1中D图)。
实施例2两种基于VSV病毒载体的包膜替换型疫苗采取不同免疫方式后的免疫应答反应
通过构建S基因不同截短体的包膜替换质粒，通过如实施例1中所述的四质粒可复制包装体系，共转染宿主包装细胞48h后(293T-hACE2),使用稳定表达hACE2的293T细胞的包装效率与对照相比会提高100倍，将包装后0.22um滤膜过滤后的上清进一步感染293T-hACE2细胞，观察细胞病变及荧光报告基因的表达情况，并进行病毒滴度的测定以评估不同截短体(S-CN)或替换体(ECD-CA)病毒的包装情况，结果如表4所示：根据统计结果可知，S-C30和ECD-CA(即新冠S基因的胞外段ECD在C端融合VSV-GP基因的跨膜和胞内区域)能较好的拯救出重组病毒粒子收获的上清中病毒滴度较高，而单独使用不做任何修饰的S全长基因不能获得包膜替换的重组病毒，进一步当S基因C段缺失16或17或73或74个氨基酸时，相同的处理方式依然得不到有效的包膜替换的病毒粒子，因此可以得出结论，S基因的C端部分氨基酸严重影响了蛋白的表达及外泌效率，进一步得出S基因修饰变构体，即C端缺失的氨基酸数目在18-72个，尤其是在缺失30个氨基酸可以得到符合要求的包膜替换型的病毒载体，并且起始包装滴度达到5E6pfu/ml,同时当S基因的ECD胞外端融合上VSV-GP的跨膜和胞内段(CA)后同样可以获得高滴度的重组病毒。
表4 包膜S基因变构体在拯救重组病毒载体疫苗的效率
Figure BDA0002538974700000081
Figure BDA0002538974700000091
实施例3基于VSV病毒载体的包膜替换型疫苗不同免疫方案下的免疫应答效果
通过间接ELISA检测不同免疫方案后小鼠体内特异性sIgA(黏膜免疫应答)、IgG抗体水平：用SARS-CoV-2S病毒的重组RBD蛋白包被酶标板后，将通过肌肉、静脉、滴鼻活病毒载体疫苗给药(充分模拟冠状病毒侵染宿主细胞的过程)，以及灭活的包膜替换型疫苗通过肌肉注射免疫，上述四种免疫途径给药免疫一次后，第21d时的小鼠血清按1:200稀释后加入对应的检测孔中，孵育2h后将不同类型的(sIgA、IgG)二抗按1:10000稀释，检测特异性抗体的水平(图2)，具体操作步骤如下：
取包被抗原(S-RBD)用包被缓冲液稀释至最终浓度为5μg/ml，取酶标板，依次往孔中加样(100μl/孔)，然后放置于4摄氏度下包被过夜；
次日倒掉样品孔中的包被液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次洗涤后要在滤纸上扣干样品孔中的残留液体；
然后往每孔中加入200μl、5％BSA封闭液进行封闭，于37摄氏度下放置1h(板子放置在密封袋中)。倒掉封闭液，用洗涤缓冲液洗涤样品孔1次；
用抗体血清稀释液(1％BSA)将待测血清和阴性血清按合适比例(1：100)稀释，加入孔板中，每孔100ul，37摄氏度孵育2h；
倒掉样品孔中的反应液，用洗涤液洗涤1～3min，洗板5次，每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体；
用稀释液将酶标二抗(Goat anti-mouse IgG HRP)按1：10000稀释后每孔加入100μl，然后于37℃反应1h；
倒掉未结合的酶标抗体，加入洗涤液洗涤，每次1～3min，共5次，每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体；
每孔加入新鲜配制的显色液(A液与B液等比例混合后即成显色液)100μl，置室温，避光反应20min；
每孔加入100μl的ELISA终止液终止反应；
将96孔板放入酶标仪中，读取OD450nm。比较同等稀释比例下的待测样品和阴性样本OD450nm值，判定阳性情况可暂定以阴性样本OD值的2.1倍作为阳性测试标准即：OD(阳性>2.1*OD(阴性样本)；
结果表明两种包膜替换型病毒采用不同免疫方式及策略，一次免疫21天时，血清中特异性IgA和IgG抗体水均显著上升到较高水平，而不同免疫途径下各抗体表达的水平存在一定的差异，其中滴鼻方法免疫主要激活黏膜免疫应答，产生较强IgA特异性抗体，同时滴鼻免疫也诱导产生了全身性的抗体免疫反应(图2中A图)，从图示统计结果可以得出结论：静脉和肌肉的免疫接种途径主要引起机体产生抗原特异性的IgG型免疫应答，不能产生有效的黏膜免疫反应(图2中B图),进一步将包膜替换型的病毒载体疫苗进行特定方式处理灭活后，通过肌肉注射给予小鼠疫苗，检测血清中的特异性抗体的含量(间接Elisa),发现灭活后的包膜替换型候选疫苗也产生了较高的特异性体液免疫应答水平，与活病毒免疫组相比不存在显著差异性，进一步表明将包膜替换的可复制疫苗载体高温灭活后，并没有破坏该疫苗的诱导的体液免疫应答，证明包裹在VSV遗传物质外的刺突蛋白S(C30)仍保留了足够的免疫原性，可以诱导诱导机体产生后天性的抗原特异性的体液免疫应答，同时当通过滴鼻的方式接种活病毒疫苗时，无论是哪种候选疫苗，均激活了局部的黏膜免疫应答，在血清中检测到了较高的IgA的分泌表达，因此通过黏膜接种疫苗，诱导产生的黏膜反应，可以有效在新冠病毒感染的早期阶段结合病毒表面的抗原位置，阻断病毒进入宿主细胞，极大的保护机体免受冠状病毒的感染。
实施例4基于冠状病毒假病毒体系的免疫血清中和抗体检测
通过体外病毒中和实验确定产生的中和抗体滴度，用以评估抗原选择差异，筛选出高效的保护性免疫原，对比不同组别产生的特异性针对SARS或SARS-CoV-2的中和抗体的效价，确定最优的疫苗制备策略及接种方式，具体操作步骤如下：
将待测血清于56℃灭火30min，6000g离心3min，取上清备用；
将293T-hACE2细胞进行传代操作，细胞计数后按2E4 cells/孔加入到96孔板中(200μL/孔，包含8μg/mL polybrene)；
3h后，抗体用Opti-MEM系列稀释(1:2)10μL/管，同时做不加抗体的阳性对照(20μL病毒液，病毒终浓度4E5 TU/mL)和不加病毒的阴性对照(20μL Opti-MEM)；
假病毒(慢病毒骨架包装新冠的刺突蛋白的模拟体系)也进行系列稀释至8E5 TU/mL；
取10μL稀释的病毒液(8E5 TU/mL)加入到步骤2中含有10μL系列稀释的抗体中(1:1吹打混匀)(此时病毒终浓度4E5 pfu/mL)；
于37℃、5％CO2培养箱中孵育1h后，加入到293T-hACE2细胞中感染24h-48h后进行观察荧光及病变情况。
根据最后出现绿色荧光的孔所对应的抗体血清稀释倍数作为血清中和效价。
如图3所示，PBS和VSV野毒株(VSV-WT)免疫组，通过体外中和抗体检测试验中，没有检测到可以有效中和新冠病毒的抗体，与对照组相比，包膜替换的新冠疫苗VSV-△G-S-C30和VSV-△G-ECD-CA免疫的小鼠均诱导产生了中和抗体，表面将S刺突蛋白完整的展示在重组病毒表面，不仅可以激活机体产生足够的特异性抗体(IgG、IgM)，同时机体免疫后小鼠血清中的特异性抗体具备了体外中和病毒的能力，在体外检测中，进一步采用不同免疫途径的给药方式，一次免疫21天时，静脉和肌肉注射免疫产生的中和抗体水平较高，与本疫苗产品在临床使用中的实际给药方式一致，同时将VSV-△G-S-C30和VSV-△G-ECD-CA这2款活病毒疫苗(相同给药剂量)高温灭活后(图3)，肌肉免疫21天后，检测血清中中和抗体的效价，发现候选包膜替换型疫苗灭活后，仍诱导了足量的中和抗体，进一步证实采取本实施例中的候选疫苗可以减轻对可复制病毒载体和复制性缺陷病毒载体的安全性顾虑，候选新冠疫苗在生产时以可复制的形式进行扩增制备，GMP生产纯化后，可以辐照灭活后灌装形成制剂，加快该类候选疫苗的应用和普及。
序列表
<110> 苏州奥特铭医药科技有限公司
<120> 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法
<130> 2020
<141> 2020-03-31
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
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Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
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Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
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Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
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Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
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Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
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Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
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Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
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Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
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Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
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Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
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Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
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Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys
1235 1240
<210> 2
<211> 1249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
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165 170 175
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Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
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275 280 285
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Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu
1205 1210 1215
Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His
1220 1225 1230
Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly
1235 1240 1245
Lys
<210> 3
<211> 3750
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
atgttcgtgt ttctggtgct gctgcctctg gtgagctccc agtgcgtgaa cctgaccaca 60
cggacacagc tgccccctgc ctacaccaac agcttcacaa ggggcgtgta ctaccccgac 120
aaggtgttta gatctagcgt gctgcactcc acacaggatc tgtttctgcc tttcttttct 180
aacgtgacct ggttccacgc tatccacgtg tccggcacca acggaacaaa gaggttcgac 240
aacccagtgc tgccctttaa cgatggcgtg tacttcgcct ccaccgagaa gtctaacatc 300
atcagaggct ggatctttgg aaccacactg gacagcaaga cacagtccct gctgatcgtg 360
aacaacgcca ccaacgtggt catcaaggtg tgcgagttcc agttttgtaa cgatccattc 420
ctgggcgtgt actaccacaa gaacaacaag tcttggatgg agagcgagtt tcgcgtgtac 480
tcctctgcca acaactgtac atttgagtac gtgtcccagc ccttcctgat ggacctggag 540
ggcaagcagg gaaacttcaa gaacctgcgg gagttcgtgt ttaagaacat cgatggctac 600
tttaagatct actccaagca caccccaatc aacctggtgc gcgacctgcc acagggcttc 660
tctgccctgg agccactggt ggatctgccc atcggaatca acatcaccag gtttcagaca 720
ctgctggccc tgcacagaag ctacctgaca ccaggcgaca gctcctctgg atggaccgct 780
ggagctgctg cctactacgt gggctacctg cagccccgga ccttcctgct gaagtacaac 840
gagaacggaa ccatcacaga cgctgtggat tgcgccctgg accccctgtc tgagaccaag 900
tgtacactga agagctttac cgtggagaag ggcatctacc agacaagcaa cttccgggtg 960
cagcctaccg agtccatcgt gcgctttccc aacatcacaa acctgtgccc ttttggagag 1020
gtgttcaacg ctacccgctt cgcctccgtg tacgcttgga accggaagcg catctccaac 1080
tgcgtggccg actactctgt gctgtacaac agcgccagct tcagcacctt caagtgctac 1140
ggcgtgagcc caacaaagct gaacgacctg tgctttacca acgtgtacgc tgattccttc 1200
gtgatcaggg gagacgaggt gcgccagatc gctcccggcc agacaggaaa gatcgctgac 1260
tacaactaca agctgcctga cgatttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa ctctaacaac 1320
ctggatagca aagtgggcgg aaactacaac tacctgtaca ggctgtttag aaagtctaac 1380
ctgaagccat tcgagcggga catctccaca gagatctacc aggctggctc taccccatgc 1440
aacggagtgg agggcttcaa ctgttacttc cctctgcaga gctacggatt ccagccaaca 1500
aacggcgtgg gataccagcc ctaccgcgtg gtggtgctgt cttttgagct gctgcacgct 1560
cctgctacag tgtgcggacc aaagaagagc accaacctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620
ttcaacttta acggactgac cggcacagga gtgctgaccg agtctaacaa gaagttcctg 1680
ccttttcagc agttcggccg ggacatcgcc gataccacag acgctgtgcg cgaccctcag 1740
accctggaga tcctggatat cacaccatgc tccttcggcg gagtgtctgt gatcacacca 1800
ggaaccaaca caagcaacca ggtggccgtg ctgtaccagg acgtgaactg taccgaggtg 1860
cccgtggcta tccacgccga tcagctgacc cctacatgga gggtgtactc taccggcagc 1920
aacgtgttcc agacaagagc cggctgtctg atcggagctg agcacgtgaa caacagctac 1980
gagtgcgaca tccctatcgg cgccggaatc tgtgcttcct accagaccca gacaaactcc 2040
ccaaggagag ccaggtctgt ggctagccag tccatcatcg cctacaccat gagcctgggc 2100
gccgagaact ccgtggctta ctccaacaac tctatcgcta tccctaccaa cttcacaatc 2160
tccgtgacca cagagatcct gccagtgagc atgaccaaga catccgtgga ctgcacaatg 2220
tacatctgtg gagattccac cgagtgctct aacctgctgc tgcagtacgg ctctttctgt 2280
acccagctga acagagccct gacaggaatc gctgtggagc aggacaagaa cacacaggag 2340
gtgttcgccc aggtgaagca gatctacaag accccaccca tcaaggactt tggcggattc 2400
aactttagcc agatcctgcc cgatcctagc aagccatcca agaggtcttt tatcgaggac 2460
ctgctgttca acaaggtgac cctggctgat gccggcttca tcaagcagta cggcgattgc 2520
ctgggagaca tcgctgccag agacctgatc tgtgcccaga agtttaacgg actgaccgtg 2580
ctgcctccac tgctgacaga tgagatgatc gctcagtaca catctgctct gctggccggc 2640
accatcacaa gcggatggac cttcggcgct ggagctgccc tgcagatccc ctttgccatg 2700
cagatggctt acagattcaa cggcatcgga gtgacccaga acgtgctgta cgagaaccag 2760
aagctgatcg ccaaccagtt taactccgct atcggcaaga tccaggactc tctgagctcc 2820
acagctagcg ccctgggaaa gctgcaggat gtggtgaacc agaacgctca ggccctgaac 2880
accctggtga agcagctgtc tagcaacttc ggcgccatct cctctgtgct gaacgatatc 2940
ctgagcaggc tggacaaggt ggaggctgag gtgcagatcg acaggctgat cacaggaaga 3000
ctgcagtccc tgcagaccta cgtgacacag cagctgatca gggctgctga gatcagggct 3060
tctgccaacc tggctgccac caagatgagc gagtgcgtgc tgggccagtc caagagagtg 3120
gacttttgtg gcaagggata ccacctgatg agcttcccac agtccgcccc tcacggagtg 3180
gtgtttctgc acgtgaccta cgtgccagct caggagaaga acttcaccac agctcccgcc 3240
atctgccacg atggcaaggc ccactttcct cgggagggcg tgttcgtgag caacggaacc 3300
cactggtttg tgacacagcg caacttctac gagccacaga tcatcaccac agacaacaca 3360
ttcgtgtccg gcaactgtga cgtggtcatc ggaatcgtga acaacaccgt gtacgatcct 3420
ctgcagccag agctggactc ttttaaggag gagctggata agtacttcaa gaaccacacc 3480
agccctgacg tggatctggg cgacatctct ggaatcaacg ccagcgtggt gaacatccag 3540
aaggagatcg accggctgaa cgaggtggct aagaacctga acgagtccct gatcgatctg 3600
caggagattg cctctttttt ctttatcata gggttaatca ttggactatt cttggttctc 3660
cgagttggta tccatctttg cattaaatta aagcacacca agaaaagaca gatttataca 3720
gacatagaga tgaaccgact tggaaagtaa 3750
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Met Ser Ser Leu Lys Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys
1 5 10 15
Ser Lys Lys Phe Gly Ile Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Ser
20 25 30
Met Glu Tyr Ala Pro Ser Ala Pro Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val
35 40 45
Asp Glu Ala Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gln Leu Arg Tyr Glu Lys Phe
50 55 60
Phe Phe Thr Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr
65 70 75 80
Tyr Ser Asp Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr Ile
85 90 95
Gly Met Ala Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Ile Leu Ala Leu Leu Gly
100 105 110
Ser Ser Asn Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gln Gly Gln
115 120 125
Pro Glu Tyr His Thr His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg
130 135 140
Met Gly Lys Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg
145 150 155 160
Pro Phe Asn Ile Gly Leu Tyr Lys Gly Thr Ile Glu Leu Thr Met Thr
165 170 175
Ile Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met Ile Trp Asp His
180 185 190
Phe Asn Ser Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe
195 200 205
Gly Leu Ile Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Val Leu Asp Ser
210 215 220
Ile Ser His Phe Lys
225
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
tggcttactc caacaactc 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
cagatgtaca ttgtgcag 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> (Artificial sequence)
<400> 7
cgaggtggct aagaacctg 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
tcggagaacc aagaatag 18
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
tttacgcgtc actatgttcg tgtttctggt gctg 34
<210> 10
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ccgctcgagc gtgatatctg ttagtttttt tcatacctag caggatttga gttaacagca 60
gcttccacaa gaacag 76
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
tttacgcgtc actatgttcg tgtttctggt gctg 34
<210> 12
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
ccgctcgagc gtgatatctg ttagtttttt tcatacctag caggatttga gttagcagga 60
acagcagctt g 71
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
tttacgcgtc actatgttcg tgtttctggt gctg 34
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
agaggcaatc tcctgcagat cgatcaggga 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
ctgcaggaga ttgcctcttt tttctttatc 30
<210> 16
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
ccgctcgagc gtgatatctg ttagtttttt tcatacctag caggatttga gttactttcc 60
aagtcggttc atc 73

Claims (10)

1.一种包膜替换型病毒载体疫苗，其特征在于：所述包膜替换型病毒载体疫苗是将弹状病毒基因组中的GP基因替换为冠状病毒的刺突蛋白S基因截短体或病毒刺突蛋白S基因的胞外段融合体ECD-CA，利用反向遗传系统构建得到的用于预防冠状病毒感染的包膜替换型病毒载体疫苗，所述ECD-CA定义为病毒刺突蛋白S基因的胞外段ECD融合VSV病毒囊膜蛋白GP的跨膜和胞内段后的基因。
2.根据权利要求1所述包膜替换型病毒载体疫苗，其特征在于：所述弹状病毒载体选自水泡性口炎病毒VSV，所述VSV选自印第安那株，所述刺突蛋白S基因选自SARS或SARS-CoV-2冠状病毒，所述刺突蛋白S基因截短体选自C端氨基酸缺失对应的基因，所述C端氨基酸缺失个数为18～72个。
3.根据权利要求2所述包膜替换型病毒载体疫苗，其特征在于：所述刺突蛋白S基因截短体选自C端缺失的基因，所述C端氨基酸缺失数目优选30个，且对应修饰后的刺突蛋白S对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
4.根据权利要求1所述包膜替换型病毒载体疫苗，其特征在于：所述弹状病毒载体选自水泡性口炎病毒VSV，所述VSV选自印第安那株，所述刺突蛋白S基因的胞外段融合体ECD-CA选自冠状病毒，所述ECD-CA包含冠状病毒刺突蛋白S基因的胞外段ECD，所述ECD的C端融合了VSV的囊膜蛋白的跨膜和胞内段基因CA。
5.根据权利要求4所述的包膜替换型病毒载体疫苗，其特征在于：所述ECD-CA克隆到VSV基因组中M基因和L基因之间的编码阅读框中，所述ECD-CA氨基酸序列为SEQ ID NO.2,所述ECD-CA人源化密码子基因序列为SEQ ID NO.3。
6.根据权利要求2所述冠状病毒包膜替换型病毒载体疫苗，其特征在于：所述水泡性口炎病毒是其基质蛋白M的氨基酸发生突变后得到的病毒，所述基质蛋白M中氨基酸突变位点为第20位的亮氨酸、第51位甲硫氨酸、第110位的苯丙氨酸中的一个或多个且为非同义突变。
7.根据权利要求4所述冠状病毒包膜替换型病毒载体，其特征在于：所述病毒载体是减毒水泡性口炎病毒，所述水泡性口炎病毒的基质蛋白M发生3位点氨基酸的突变，所述基质蛋白M的第20位由亮氨酸L突变为苯丙氨酸F、第51位由甲硫氨酸M突变为丙氨酸A、第110位由苯丙氨酸F突变为亮氨酸L，所述的3位点突变的基质蛋白M氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
8.一种包膜替换型病毒载体疫苗的构建方法，包括如下步骤：
S1、利用合成生物学得到如权利要求2,3或6中任一所述冠状病毒的S-CN截短体基因或如权利要求1,4,5或7任一所述ECD-CA包膜基因，基因片段用MluI和XhoI双酶切克隆至pVSV-3M质粒多克隆位点中，分别得到pCore-3M-S-CN或pCore-3M-ECD-CA质粒，其中所述冠状病毒的S-CN定位为冠状病毒刺突蛋白S基因在C端缺失N个氨基酸后对应的基因序列缩写，所述其中N＝18～72中的任一自然数；
S2、用表达T7-RNA聚合酶的质粒pCAGGS-T7瞬转293T-ACE2细胞；24h后将内毒素去除的质粒包括pCAGGS-P、pCAGGS-N、pCAGGS-L及pCore-3M-S-CN或pCore-3M-ECD-CA的质粒制备转染混合液；
S3、对四质粒进行脂质体包裹共转染72h后，将上清液通过0.22um的滤膜过滤后加入到对数生长期的ACE2稳定表达的细胞中；
S4、细胞出现病变，则收集细胞上清液，利用RT-PCR技术进行病毒基因组中包膜替换目的基因拷贝数的鉴定；
S5、用ACE2稳定表达的细胞进行空斑纯化，经蛋白免疫印迹鉴定后得所述可复制性的冠状病毒包膜替换型疫苗VSV-△G-S-CN或VSV-△
G-ECD-CA。
9.根据权利要求8所述的冠状病毒包膜替换型病毒载体疫苗的构建方法，其特征在于：步骤S4中所述RT-PCR中特异性扩增冠状病毒S-CN基因的荧光探针引物对为序列SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6。
10.根据权利要求8所述的冠状病毒包膜替换型病毒载体疫苗的构建方法，其特征在于：RT-PCR中特异性扩增冠状病毒ECD-CA基因的荧光探针引物对为SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8。
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