CN114276443A - 新型冠状病毒（sars-cov-2）刺突蛋白结合分子及其应用 - Google Patents

新型冠状病毒（sars-cov-2）刺突蛋白结合分子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开一种新型冠状病毒(SARS‑COV‑2)刺突蛋白结合分子及其应用。所述结合分子能特异性结合SARS‑COV‑2的刺突蛋白且包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域。本发明提供的SARS‑COV‑2‑Spike蛋白结合分子能够特异性的结合SARS‑COV‑2‑Spike蛋白，并有效阻断SARS‑COV‑2‑Spike蛋白与人体细胞ACE2受体的结合，进而阻断SARS‑COV‑2对细胞的感染过程，抑制SARS‑COV‑2的传染和扩增，在体内发挥长效抑制SARS‑COV‑2的作用，有效避免SARS‑COV‑2在活体内复发。

Description

新型冠状病毒(SARS-COV-2)刺突蛋白结合分子及其应用
本申请是2020年09月23日提交的中国专利申请CN202080002271.4的分案申请。从母案中并列的21个方案中分离出第8个方案即为本申请。
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒(SARS-COV-2)刺突蛋白结合分子及其应用。
背景技术
目前新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在全球累计感染已超过2500多万人，且感染人数依然在增加，对COVID-19目前临床上缺乏特异有效的治疗手段。虽然我国疫情已经得到全面控制，但国外疫情却暴发出来，并且还在迅速增长。此外，越来越多的研究显示，新型冠状病毒(SARS-COV-2)感染可能存在慢性携带状态；部分出院复阳病人也提示病毒可能会长期存在人体。目前尚不清楚长期携带存在的机制、时间等关键因素，未来防止SARS-COV-2卷土重来至关重要。受COVID-19的影响，世界各国由此而产生的经济损失、社会负担及其它负面影响难以计量。
目前针对COVID-19尚无特效药物，亟需快速研制有效的药物。国内外众多研发机构都在针对COVID-19的治疗策略研究上分秒必争。虽然已发掘的瑞德西韦、法匹拉韦等广谱小分子抗病毒药物对COVID-19具有一定疗效，但由于针对SARS-COV-2并无特异性，治疗效果受限，难以成为COVID-19的特效药。
发明内容
针对现有抗病毒药物对新型冠状病毒新型冠状病毒无特异性，治疗效果不佳，难以成为SARS-COV-2的特效药的问题，本发明提供一种新型冠状病毒(SARS-COV-2)刺突蛋白结合分子及其应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：一种SARS-COV-2刺突蛋白结合分子，能特异性结合SARS-COV-2刺突蛋白且包含一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域中的CDR1、CDR2和CDR3为：
SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3。
相对于现有技术，本发明提供的SARS-COV-2刺突蛋白(SARS-COV-2-Spike蛋白)结合分子能够特异性的结合SARS-COV-2-Spike蛋白，并有效阻断SARS-COV-2-Spike蛋白与人体细胞ACE2受体的结合，进而阻断SARS-COV-2对细胞的感染过程，抑制SARS-COV-2的传染和扩增。且本发明提供的SARS-COV-2-Spike蛋白结合分子还具有与SARS-COV-2-Spike蛋白结合的特异性好，生物活性和稳定性高以及无毒副作用的特点。同时本发明提供的SARS-COV-2-Spike蛋白结合分子可以在体内发挥长效抑制SARS-COV-2的作用，有效避免SARS-COV-2在活体内复发或复阳。
优选的，所述免疫球蛋白单一可变域为单域抗体。
优选的，所述单域抗体包含与SEQ ID NO:4序列具有至少80％的序列相同性的氨基酸序列。
优选的，所述单域抗体包含与SEQ ID NO:4序列具有至少90％的序列相同性的氨基酸序列。
优选的，所述单域抗体包含与SEQ ID NO:4序列具有至少99％的序列相同性的氨基酸序列。
优选的，所述单域抗体包含SEQ ID NO:4氨基酸序列。
优选的，所述SARS-COV-2刺突蛋白结合分子还包含免疫球蛋白Fc区。
SARS-COV-2刺突蛋白结合分子中包含免疫球蛋白Fc区可以使所述结合分子形成二聚体，同时进一步延长所述分子的体内半衰期。用于本发明的Fc区可以来自不同亚型的免疫球蛋白，例如，IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM。
优选的，所述免疫球蛋白Fc区是人IgG1的Fc区。
优选的，所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
与上述Fc区融合后的结合分子，稳定性和生物活性进一步提高，并进一步降低了其与SARS-COV-2刺突蛋白结合的KD值。
优选的，所述SARS-COV-2刺突蛋白结合分子包含SEQ ID NO:6氨基酸序列。
本发明还提供编码所述的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子的核酸分子，所述核酸分子为RNA、DNA或cDNA，其可以通过人工合成的方式获得，也可从适合的天然来源加以分离获得。
本发明还提供包含所述核酸分子及其表达调控原件的表达载体。所述表达载体通常包含至少一种本发明提供的核酸分子，其可操作地连接至一个或多个适合的表达调控元件(启动子、增强子、终止子、整合因子、选择标记物、前导序列、报告基因等)。针对在特定宿主细胞中的表达对所述元件及其序列进行选择为本领域技术人员的常识。
本发明还提供包含所述核酸分子并进行表达的宿主细胞。所述的宿主细胞为用于表达异源蛋白的细胞，包括细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
本发明还提供获得所述SARS-COV-2刺突蛋白结合分子的方法，包括：
a、在允许所述SARS-COV-2刺突蛋白结合分子表达的条件下培养所述的宿主细胞；
b、从步骤a的培养物中收集由所述宿主细胞表达的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子。
将特定的核酸分子重组到表达载体上并通过转化或转染方法进入宿主细胞中表达、选择标记物、诱导蛋白表达的方法、培养条件等在本领域中是已知的。同时蛋白结合分子的分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。
此外，本发明的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子也可以通过本领域已知的其它产生已知序列的蛋白质的方法获得，例如化学合成。
本发明还提供了一种免疫缀合物，包含与治疗性部分缀合的所述SARS-COV-2刺突蛋白结合分子。
本发明还提供了一种药物组合物，包含所述的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子和/或所述的免疫缀合物，以及药学上可接受的载体。本发明所述的药物组合物根据需要还可以包括其它佐剂和辅料等。
本发明所述的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即结合分子、免疫缀合物包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用，为本领域技术人员公知。
本发明还提供了所述药物组合物在制备治疗或预防新型冠状病毒病肺炎药物中的应用。
本发明还提供了一种用于检测SARS-COV-2的试剂盒，包含所述的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子。
所述用于检测SARS-COV-2的试剂盒的使用方法为：在所述的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子与SARS-COV-2刺突蛋白之间能够形成复合物的条件下，使检测样品和对照样品接触所述的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子，检测复合物的形成；通过所述检测样品与对照样品之间复合物形成的差异判断样品中SARS-COV-2的存在。
附图说明
图1是本发明实施例1中提取的总RNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNA marker2000，泳道1：总RNA；
图2是本发明实施例1中巢式PCR扩增单域抗体基因的Step1中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNA marker 2000，泳道1：扩增产物；
图3是本发明实施例1中巢式PCR扩增单域抗体基因的Step2中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，DNA marker 2000，泳道1：扩增产物；
图4是本发明实施例1中测算文库插入率的菌落PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNA marker 2000；泳道1-8：挑取的8个菌落；
图5是本发明实施例2中随天数变化治疗组与对照组恒河猴呼吸道中的病毒载量变化图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
定义
除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。
如本文所用的术语“免疫球蛋白单一可变结构域”是指基本上由本领域所称的“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，其中所述框架区由本领域所称的“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。因此，免疫球蛋白单一可变结构域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白单一可变结构域因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。
传统IgG抗体分子一般由轻链和重链组成，轻链包含1个可变区(VL)和1个恒定区(CL)，重链包含1个可变区(VH)和3个恒定区(CH1，CH2，CH3)。单域抗体(Single domainantibody，sdAb)，是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体，因其分子量小，也被称为纳米抗体(Nanobody)。单域抗体特异性结合表位而无需其他抗原结合结构域。单域抗体为由免疫球蛋白单一可变结构域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。
本领域公知对于单域抗体中的各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同。
单域抗体中的氨基酸残基的总数将通常在110至120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本发明所述的目的。
获得结合特定抗原或表位的单域抗体的方法，先前已公开于以下文献中：R.vanderLindenet al.,Journal of Immunological Methods,240(2000)185–195；Li etal.,JBiol Chem.,287(2012)13713–13721；Deffar et al.,African Journal ofBiotechn ology Vol.8(12),pp.2645-2652,17June,2009和WO94/04678。
此外，本领域技术人员还将了解，有可能将一个或多个上述CDR“移植”于其他“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。适于所述CDR移植的支架及技术在本领域中是已知的。
一般而言，术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的免疫球蛋白单一可变结构域)分子可结合的不同类型抗原或表位的数目。可基于抗原结合分子的亲和力和/或亲合力确定其特异性。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)所表示的亲和力，是表位与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间结合强度的量度：KD值越小，表位与抗原结合分子之间的结合强度越强(或者，亲和力也可表示为缔合常数(KA)，其为1/KD)。如本领域技术人员将了解，取决于具体感兴趣的抗原，可以以已知方式测定亲和力。亲合力为抗原结合分子(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变结构域或含有其的多肽)与相关抗原之间结合强度的量度。亲合力与以下两者有关：与其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力，以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目。
发明所用术语“SARS-COV-2刺突蛋白结合分子(SARS-COV-2-Spike蛋白结合分子)”意指任何能够特异性结合SARS-COV-2刺突蛋白的分子。SARS-COV-2刺突蛋白结合分子可以包括针对SARS-COV-2刺突蛋白的如本发明定义的单域抗体或其缀合物。SARS-COV-2刺突蛋白结合分子还涵盖所谓的“SM IP”(“小模块免疫药物”)，或者免疫球蛋白超家族抗体(IgSF)或CDR移植分子。
本发明的“SARS-COV-2刺突蛋白结合分子”可以包含至少一个结合SARS-COV-2刺突蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域如单域抗体。在一些实施方案中，本发明的“SARS-COV-2刺突蛋白结合分子”可以包含两个结合SARS-COV-2刺突蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域如单域抗体。含有一个以上的免疫球蛋白单一可变结构域的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子亦称为“格式化的”SAR S-COV-2刺突蛋白结合分子。格式化的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子除结合SARS-COV-2刺突蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域外也可包含接头和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分(如结合血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或缀合的聚合物(如PEG)和/或Fc区。本发明的“SARS-COV-2刺突蛋白结合分子”还涵盖双特异性抗体，其含有结合不同抗原的免疫球蛋白单一可变结构域。
通常，本发明的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子将以如于Biacore或Kin ExA测定中测量的优选10-8至10-12摩尔/升(M)、更优选10-9至10-11摩尔/升、甚至更优选10-10至10-12、甚至更优选10-11至10-12或更低的解离常数(KD)。任何大于10-4M的KD值一般都视为指示非特异性结合。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以已知的任何适合方式来测定，包括例如本文所述的表面等离子体共振术(SPR)测定、和/或竞争性结合测定(例如酶免疫测定(EIA)及夹心式竞争性测定。
氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或一字母氨基酸编码加以表示。所述保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如保守氨基酸取代优选是以下组(1)-(5)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代：(1)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(2)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(3)极性带正电残基：His、Ar g及Lys；(4)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(5)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。
两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。对于序列相同性的确定，可以参见例如：Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987和Seq uence Analysis Primer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,M Stockton Press,NewYork,1991。
相比于其天然生物来源和/或获得该多肽或核酸分子的反应介质或培养基，当其已与至少一种在该来源或介质(培养基)中通常与之相关的其他组分(例如另一蛋白/多肽、另一核酸、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离时，多肽或核酸分子视为“基本上分离的”。特别地，多肽或核酸分子在其已纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍以上时被视为“基本上分离的”。经适合的技术(例如适合色谱技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定，“基本上分离的”多肽或核酸分子优选基本上为均质的。
实施例1
筛选针对SARS-COV-2-Spike蛋白的单域抗体
1.1文库的构建
1.1.1免疫
用新型冠状病毒的Spike-RBD蛋白免疫羊驼，并分别在第1、2、4、6周免疫，共免疫4次，每次免疫剂量为300ug。
1.1.2提取总RNA
取第6周免疫后的羊驼的外周血50ml，分离淋巴细胞，用Trizol提取淋巴细胞的总RNA，采用紫外分光光度计检测提取的RNA的结果为：OD260/280＝1.97，OD260/230＝2.14，说明提取的RNA没有明显降解，纯度较好；总RNA浓度为937.5ng/μL。用提取的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，可以看到28S和18S两条条带。
1.1.3 RNA反转录
RNA反转录体系如下：
Step 1：
Figure BDA0003418779560000091
混匀后，65℃保温5min，迅速冰浴；
Step 2
Figure BDA0003418779560000101
混匀后，进行反转录得到cDNA，反转录条件为：42℃，30min；50℃，15min；70℃，15min。
1.1.4单域抗体(VHH)基因扩增
采用巢式PCR扩增VHH基因，方法如下：
Step1
Figure BDA0003418779560000102
混匀后，进行PCR反应，反应条件：98℃10s，50℃30s，72℃1min，共20个循环。扩增引物的序列为：Primer For-1:5′-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3′(SEQ ID NO:8)；PrimerRev-1:5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′(SEQ ID NO:9)。
PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化浓缩后，进行琼脂糖凝胶电泳，得到的琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，采用DNA产物凝胶回收试剂盒回收750bp条带，紫外分光光度计定量，作为Step 2的DNA模板；
Step 2
Figure BDA0003418779560000103
Figure BDA0003418779560000111
混匀后，进行PCR反应，反应条件：98℃10s，55℃30s，72℃30s，共20个循环。扩增引物的序列为：Primer For-2:5′-CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT-3′(SEQ ID NO:10)；Primer Rev-2:5′-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG-3′(SEQ ID NO:11)。
得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳图如图3所示，采用DNA产物凝胶回收试剂盒回收，紫外分光光度计定量。最终得到约500bp的目的基因(VHH)200μL，浓度为458ng/μL。
1.1.5文库转化
将得到的目的基因和载体pHEN1采用SfiI和Not1进行双酶切，将酶切后的目的基因和pHEN1片段采用T4 DNA连接酶连接后，转化至大肠杆菌电穿孔感受态细胞TG1中，构建针对SARS-COV-2-Spike蛋白的单域抗体基因文库，命名为S2-Lib。共转化15次，混合后均匀涂布于6块Ф150mm的培养皿(含氨苄青霉素的LB固体培养基)中。
分别取0.1μL，0.01μL，0.001μL和0.0001μL混合后的转化液均匀涂布于Ф90mm的培养皿(含氨苄青霉素的LB固体培养基)，用于文库库容量的计算(以菌落数为30-300的平板为准计数)，如表1所示，计算库容量为1.425×109cfu。
表1
Figure BDA0003418779560000112
在上述用于计算库容量的培养皿中随机挑选8个菌落，进行菌落PCR，并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，测算文库的目的基因插入率，琼脂糖凝胶电泳如图4所示，说明文库插入率为100％，文库实际库容量为1.425×109cfu。
菌落PCR体系如下：
Figure BDA0003418779560000121
菌落PCR反应条件为：98℃10s，50℃30s，72℃1min，共31个循环。
1.1.6文库救援
从上述S2-Lib基因文库中取10-100倍库容量的活细胞进行接种培养，培养至对数期后采用M13K07噬菌体进行救援，救援培养后，离心收集噬菌体，采用PEG-NaCl纯化噬菌体，即得噬菌体展示文库，命名为S2-PDL，滴度为3.5×1013cfu/mL。可直接用于后续特异性噬菌体的亲和筛选。
1.2针对SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体的筛选
用Spike-RBD蛋白(刺突蛋白受体结合区蛋白)3μg/孔包被平板，4℃放置过夜；用1wt％脱脂奶粉室温封闭2h，加入100μl噬菌体(8×1011tfu，来自1.1.6所构建的噬菌体展示文库S2-PDL)，在室温下作用1h。之后用PBST(PBS中含有0.05vt％吐温20)洗脱5遍，以洗掉不结合的噬菌体；用三乙基胺(100mM)将与Spike-RBD蛋白特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选。相同筛选过程重复3轮。由此，阳性的克隆被富集，达到了利用噬菌体展示文库筛取抗体库中Spike-RBD蛋白特异抗体的目的。并将获得的阳性的噬菌体进行测序，获得抗体基因序列。
将获得的抗体基因序列分别构建在pcDNA3.4载体上，用HEK-293细胞表达抗体，用proteinA介质纯化收集培养基上清中的抗体。纯化后的抗体与包被Spike-RBD的板孵育进行ELISA测定。获得可特异性结合Spike-RBD蛋白的抗体。
根据序列比对软件Vector NTI分析获得的抗体序列。获得可特异性结合Spike-RBD蛋白的单域抗体株，单域抗体序列如SEQ ID NO:4，分别携带SEQ ID NO:1-3中的CDR1-3序列，具体如表2所示。
表2
抗体 CDR1 CDR2 CDR3
单域抗体 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3
上述单域抗体株与包被Spike-RBD的板孵育进行ELISA测定，测定的单域抗体与Spike-RBD反应后的复孔中的OD450的值如表3所示。
表3
Figure BDA0003418779560000131
其中，空白为不加抗体的复孔中的OD450值。
由表3中的数据可知单域抗体与Spike-RBD蛋白进行了结合反应。
1.3针对SARS-COV-2-Spike蛋白的单域抗体的评价鉴定
1.3.1单域抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化
将获得的单域抗体的基因编码序列分别重组至表达载体PET32b(Novagen，产品号：69016-3)中，并将测序鉴定正确的重组质粒分别转化到表达型宿主菌BL1(DE3)(天根生化科技，产品号：CB105-02)中，将其涂布在含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜。挑选单菌落接种、培养过夜，第二天将过夜菌种转接扩增，37℃摇床培养至OD值达到0.5-1时，加入0.5mM IPTG诱导，28℃摇床培养过夜。第二天，离心收集菌体，并将收集的菌体破碎获得抗体粗提液。然后纯化单域抗体蛋白，使其纯度达到90％以上。
1.3.2竞争ELISA考察上述SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体对Spike-RBD蛋白与受体ACE2结合的阻断效果
先通过HEK293细胞(pCDNA4，Invitrogen，CatV86220)表达获得Spike-RBD蛋白与ACE2蛋白。再利用Thermo公司的Biotinlytion试剂盒，得到生物素化的ACE2蛋白。
用Spike-RBD蛋白0.5μg/孔，4℃过夜包被平板，之后每孔加入100ng的1.3.1纯化所得的单域抗体以及5μg生物素化的ACE2蛋白，并设置对照组，对照组1的孔中不加入单域抗体，对照组2的孔中不加入生物素化的ACE2蛋白，室温下反应2h。之后加入SA-HRP(购自Sigma公司)，室温反应1小时后加入显色液，450nm波长读取吸收值。当样品OD值比对照OD值<0.8时，则认为单域抗体有阻断效果。
结果如表4所示，单域抗体株表现出对Spike蛋白/ACE2蛋白相互作用的阻断效应。
表4
样品 OD
对照组1 2.271
对照组2 0.022
单域抗体株 0.021
在生物安全级别为P3的实验室，通过用病毒感染VERO细胞模型，将纯化得到的单域抗体加入到培养体系中，具体操作为：将104/孔VERO细胞加到96孔板，24小时后，用PBS洗细胞2次，将单域抗体与病毒混合加入96孔板，抗体初始浓度为10μg/mL，再2倍稀释10个梯度，5个复孔，37℃孵育2小时，第5天检测VERO细胞是否感染病毒(若细胞不发生病变说明单域抗体具有中和病毒并阻断病毒感染VERO细胞的过程)。
检测结果如表5所示，单域抗体在1.25μg/ml以上的浓度下可有效阻断病毒感染细胞的过程。根据表5中得到的IC50(μg/ml)数据说明所获得的单域抗体能够阻断病毒感染细胞的过程，为有效的中和抗体。
表5
Figure BDA0003418779560000151
注：“+”表示可以阻断病毒感染细胞，“-”表示不能阻断病毒感染细胞。
实施例2
1.1制备SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体的Fc融合蛋白
根据蛋白数据库Uniprot上人免疫球蛋白(IgG1)的恒定区氨基酸序列，得到人IgG1-Fc区氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。通过逆转录PCR，从人PBMC总RNA中获得编码人IgG1-Fc的核酸片段(核酸序列如SEQ ID NO:7)，再通过overlapping PCR得到SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc的融合蛋白的编码核酸片段，并重组至载体pCDNA4(Invitrogen，CatV86220)。
将构建成功的含有SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc的融合蛋白的核酸片段的pCDNA4质粒转染HEK293细胞进行表达。具体是将重组表达质粒用Freestyle293培养基稀释并加入转化所需PEI(Polyethylenimine)溶液，将质粒/PEI混合物分别加入HEK293细胞悬液中，放置在37℃，10％的CO2，100rpm的摇床中培养；补加50μg/LIGF-1。4h后补加EX293培养基、2mM谷氨酰胺和50μg/LIGF-1，120rpm摇培。24h后加3.8mMVPA。培养5天后，收集表达培养上清液，通过ProteinA亲和层析法，纯化得到SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc的融合蛋白。获得的SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc的融合蛋白的序列如SEQ ID NO:6。
1.2鉴定SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc的融合蛋白(SEQ ID NO:6)的功能
通过SPR法鉴定SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc融合蛋白对SARS-COV-2-Spike蛋白的结合能力。具体操作是：将获得的SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc的融合蛋白针对spike-RBD的结合动力学通过表面等离振子共振(SRP)方法，使用BIAcoreX100仪器测量，将spike-RBD蛋白直接包被于CM5生物传感器芯片上以获得大约1000应答单位(response units，RU)。对于动力学测量，将SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc的融合蛋白用HBS-EP+1×缓冲液(GE，cat#BR-1006-69)三倍连续稀释(1.37nm至1000nm)，在25℃进样120s，解离时间为30min，加入10mM甘氨酸-HCl(pH2.0)再生120s。使用简单一对一Languir结合模型(BIAcore Evaluation Software version3.2)计算出融合蛋白与SARS-COV-2-Spike蛋白的结合速率(kon)、解离速率(koff)和平衡解离常数(kD)(以比率koff/kon计算)。计算结果如表6所示。
表6
结合速率(kon) 解离速率(koff) 平衡解离常(kD；koff/kon)
融合蛋白 4.52E+05 3.36E-04 7.43E-10
由表6可知，SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc融合蛋白对SARS-COV-2-Spike蛋白的结合速率较高的，解离速率较低，平衡解离常数KD为7.43E-10，说明融合蛋白能更快速的结合SARS-COV-2-Spike蛋白并很难解离下来，进一步说明SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc融合蛋白作为一个阻断型抗体，具有极佳的阻断效果。
1.3通过竞争ELISA法鉴定SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc融合蛋白对Spike蛋白/ACE2的相互作用的阻断能力
利用HEK293细胞表达获得ACE2蛋白。利用Thermo公司的Biotinlytion试剂盒，得到生物素化的蛋白ACE2-Biotin。
用Spike-RBD蛋白0.5μg/孔4℃过夜包被平板，之后每孔加入获得的SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc融合蛋白200ng和ACE2-Biotin 5ug，对照组1中不加入融合蛋白，对照组2中不加入ACE2-Biotin，室温下反应2h。洗涤之后加入SA-HRP(购自Sigma公司)，室温反应1小时，洗涤之后加入显色液，450nm波长读取吸收值。结果如表7所示。
表7
样品 OD
对照组1 2.414
对照组2 0.019
SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体 0.001
结果显示，SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc融合蛋白能有效阻断Spike蛋白与ACE2之间的相互作用。
1.4分析SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc融合蛋白对Spike蛋白结合的特异性
利用人HEK293细胞通过瞬时转染，获得带有目前已知的7种冠状病毒(SARS-COV-2、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV)Spike蛋白全长基因的质粒(pCDNA4,Invitrogen，Cat V86220)，并于膜上瞬时表达Spike蛋白。该质粒使得Spike蛋白C端融合EGFP蛋白，从而可以通过绿色荧光强度来考察膜上Spike蛋白的表达水平。将构建好的细胞重悬于0.5％的PBS-BSA Buffer中，加入SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc融合蛋白，同时设置阴性对照，冰上孵育20min。洗涤后加入eBioscience二抗anti-hIg-PE，冰上20min。洗涤后将细胞重悬于500μl的0.5％PBS-BSABuffer中，流式细胞仪进行检测。结果显示，SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体-Fc融合蛋白只特异性结合SARS-COV-2-Spike蛋白，而不与其他冠状病毒的Spike蛋白结合。
1.5SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc融合蛋白阻断SARS-COV-2感染恒河猴
将感染SARS-COV-2病毒并出现症状的12只恒河猴中的6只(治疗组)利用本发明提供的SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc融合蛋白(SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc融合蛋白100μg/恒河猴)进行给药治疗，另外6只(对照组)不进行给药治疗。在治疗后的6天内，每天进行一次呼吸道病毒载量的检测。经检测，治疗组的6只恒河猴呼吸道中新冠病毒的平均载量相比对照组显著降低，如图5所示。继续对治疗组的6只恒河猴进行观察，每隔一周对其症状和呼吸道病毒载量进行检测。持续观察2周后，检测不出其呼吸道中的病毒载量，也未出现相应的发病症状。持续观察3个月，治疗组的6只恒河猴体内的病毒均无复发的情况，说明上述SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc融合蛋白可在体内发挥长效作用，且可以避免感染新型冠状病毒的活体治愈后出现复阳。其中新冠病毒的载量的检测过程为：分别采取给药治疗的恒河猴(治疗组)和未进行给药治疗的恒河猴(对照组)的咽拭子，提取咽拭子中的病毒的核酸进行检测，检测过程为：采用RNA提取试剂盒(Qiagen)按照说明书操作提取SARS-COV-2的RNA，将获得的RNA溶解在50μL洗脱buffer并作为模板进行RT-PCR扩增。用引物RBD-qF1(5′-CAATGGTTTAACAGGCACAGG-3′，SEQ ID NO:12)和RBD-qR1(5′-CTCAAGTGTCTGTGGATCACG-3′，SEQ ID NO:13)扩增病毒S区基因。采用HiScriptR II OneStep qRT-PCR SYBRRGreen Kit(Vazyme Biotech Co.,Ltd)试剂盒，根据试剂盒说明书进行操作，设置PCR扩增条件为；50℃3min，95℃10s，60℃30s，40个循环，所用PCR扩增仪为ABI定量PCR仪。
上述体内实验结果表明，本发明SARS-COV-2-Spike蛋白单域抗体与Fc融合蛋白在对感染SARS-COV-2的恒河猴体内表现出显著的长效抑制SARS-COV-2感染细胞并扩增的效果，且经过治疗后的恒河猴的复阳率为0。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市因诺赛生物科技有限公司
<120> 新型冠状病毒（SARS-COV-2）刺突蛋白结合分子及其应用
<130> 2020
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> CDR1
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> CDR2
<400> 2
Ile Ser Ser Arg Asp Gly Arg Thr
1 5
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> CDR3
<400> 3
Ala Ala Asn His Leu Thr Tyr Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Phe Pro Tyr
1 5 10 15
Glu Tyr His Tyr
20
<210> 4
<211> 128
<212> PRT
<213> VHH-8
<400> 4
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Ser Arg Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Asn His Leu Thr Tyr Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Phe Pro
100 105 110
Tyr Glu Tyr His Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 232
<212> PRT
<213> Fc
<400> 5
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 6
<211> 360
<212> PRT
<213> VHH-8-Fc
<400> 6
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Ser Arg Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Asn His Leu Thr Tyr Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Phe Pro
100 105 110
Tyr Glu Tyr His Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
130 135 140
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 7
<211> 705
<212> DNA
<213> Fc DNA 序列
<400> 7
cgtacggagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 60
ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 120
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 180
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 240
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 300
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 360
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 420
tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 480
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 540
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 600
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 660
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga 705
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Primer For-1
<400> 8
gtcctggctg ctcttctaca agg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Primer Rev-1
<400> 9
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> Primer For-2
<400> 10
ctagtgcggc cgctggagac ggtgacctgg gt 32
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> Primer Rev-2
<400> 11
gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> RBD-qF1
<400> 12
caatggttta acaggcacag g 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> RBD-qR1
<400> 13
ctcaagtgtc tgtggatcac g 21

Claims (11)

1.一种SARS-COV-2刺突蛋白结合分子，其特征在于：能特异性结合SARS-COV-2刺突蛋白且包含一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域中的CDR1、CDR2和CDR3为：
SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子，其特征在于：所述免疫球蛋白单一可变域为单域抗体。
3.如权利要求2所述的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子，其特征在于：所述单域抗体包含与SEQ ID NO:4序列具有至少80％的序列相同性的氨基酸序列。
4.如权利要求2所述的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子，其特征在于：所述单域抗体包含与SEQ ID NO:4序列具有至少90％的序列相同性的氨基酸序列。
5.如权利要求2所述的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子，其特征在于：所述单域抗体包含与SEQ ID NO:4序列具有至少99％的序列相同性的氨基酸序列。
6.如权利要求2所述的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子，其特征在于：所述单域抗体包含SEQ ID NO:4氨基酸序列。
7.如权利要求1-6任一项所述的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子，其特征在于：还包含免疫球蛋白Fc区，所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
8.如权利要求7所述的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子，其特征在于：包含SEQ ID NO:6氨基酸序列。
9.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-8任一项所述的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子，以及药学上可接受的载体。
10.权利要求9所述的药物组合物在制备治疗或预防新型冠状病毒病肺炎药物中的应用。
11.一种用于检测SARS-COV-2的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-8任一项所述的SARS-COV-2刺突蛋白结合分子。
CN202111556186.5A 2020-09-23 2020-09-23 新型冠状病毒（sars-cov-2）刺突蛋白结合分子及其应用 Active CN114276443B (zh)

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