CN118085092A - 分离的抗人Claudin18.2抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种分离的抗人Claudin18.2抗体及其应用，所述抗体可与人CLDN 18.2(人密蛋白18.2)特异性结合，且不与人CLDN 18.1(人密蛋白18.1)结合。本发明的抗体可有效诱导肿瘤细胞凋亡，在治疗和/或预防CLDN 18.2高表达引起的疾病的药物和/或诊断试剂方面具有广阔的应用前景。

Description

分离的抗人Claudin18.2抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种分离的抗人Claudin18.2抗体及其应用。
背景技术
近年来全球癌症的发病率和死亡率呈不断上升趋势，已经成为严重威胁人类生命健康和社会发展的重大疾病。
肿瘤的攻克一直是人类为之努力奋斗的目标，肿瘤的治疗手段包括三大传统技术：手术治疗、化疗、放疗。将肿瘤完全移除同时对身体的其他正常组织不造成伤害是理想的目的，有时可以通过手术治疗实现这种目的，然而肿瘤浸入到其邻边正常细胞或扩散到更远位置的习性使得手术治疗效果不是非常明显，而化疗和放疗在消灭肿瘤细胞的同时也给正常的细胞造成了一定的副作用。而抗体治疗因其具备靶向性强，副作用低的优势，作为新的治疗手段被广泛应用。
抗体治疗就是用肿瘤细胞表面特异性表达的蛋白或异常表达的蛋白作为靶点，通过抗原-抗体反应，起到封闭靶点，防止受体与其配体发生作用，或通过ADCC和CDC作用直接杀死肿瘤细胞。美国FDA批准的抗体药物包括阿仑单抗(Alemtuzumab)、纳武单抗(Nivolumab)、利妥昔单抗(Rituximab)和德瓦鲁单抗(Durvalumab)等都是通过这样的方式起到治疗效果。
CLDN 18.2
CLDN 18.2是CLDNs蛋白家族成员CLDN18的一个亚型，在细胞连接中发挥重要作用，和细胞迁移、病变、肿瘤浸润转移相关。蛋白由261个氨基酸组成，具有四个跨膜结构域，两个胞外环，N端和C端位于细胞内。CLDN 18.2基因表达调控目前还不是很清楚，主要认为肿瘤细胞的cAMP激活蛋白激酶A(PKA)后，活化的PKA进入细胞核，通过氨基端激酶诱导域(KID)磷酸化来活化CREB，在被PKA磷酸化后，CREB的转录活性会增加10～20倍，引起CLDN18.2的异常表达。
在人体中CLDN 18.2的表达具有组织特异性，在正常的组织细胞中，仅特异性表达于胃上皮细胞中，而相比较松散的癌症细胞，CLDN 18.2表达于胃上皮细胞的紧密连接中，不会暴露抗原表位，因此抗体不易于作用，即使上皮细胞被抗体杀伤，上皮细胞之下的干细胞因为不表达CLDN 18.2，可以通过分化进而补充损伤的胃上皮细胞。但CLDN 18.2在某些癌症中高表达，比如：胃癌或胃与食管交界癌中高表达，另外在胰腺癌、肺癌中也常常观察到CLDN 18.2表达。由于CLDN 18.2在癌细胞和正常细胞之间的差异表达，因此CLDN 18.2成为极具潜力的靶点。
发明内容
据第一方面，在一实施例中，提供一种分离的抗体，所述抗体可与人CLDN 18.2(人密蛋白18.2)特异性结合，且不与人CLDN 18.1(人密蛋白18.1)结合。
根据第二方面，在一实施例中，提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码第一方面任意一项的抗体。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种构建体，所述构建体含有第二方面的多核苷酸。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种表达系统，所述表达系统含有第三方面的构建体或基因组中整合有外源的第二方面的多核苷酸。
根据第五方面，在一实施例中，提供一种药物组合物，其含有第一方面任意一项的抗体以及药学上可接受的载体。
根据第六方面，在一实施例中，提供第一方面的抗体、第二方面的多核苷酸、第三方面的构建体、第四方面的表达系统在制备治疗和/或预防疾病的药物和/或诊断试剂中的应用。
依据上述实施例的一种抗人Claudin18.2抗体及其应用，本发明的抗体可有效诱导肿瘤细胞凋亡，在制备治疗和/或预防Claudin18.2高表达引起的疾病的药物和/或诊断试剂方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为噬菌体抗体库3轮富集筛选Pool ElISA图；
图2为抗体表达纯化后的SDS-PAGE电泳图；
图3为CLDN18.2抗原ELISA检测结果图；
图4A：与293T-CLDN18.1细胞流式结合结果图；
图4B：与293T-CLDN18.2细胞流式结合结果图；
图4C：与NUGC4-CLDN18.2细胞流式结合结果图；
图5为CLDN18.2抗体内吞效率结果图；
图6A为CLDN18.2抗体IMAB362的亲和力检测Scatchard法结果图；
图6B为CLDN18.2抗体B1的亲和力检测Scatchard法结果图；
图6C为CLDN18.2抗体B9的亲和力检测Scatchard法结果图；
图6D为CLDN18.2抗体B35的亲和力检测Scatchard法结果图；
图6E为CLDN18.2抗体B41的亲和力检测Scatchard法结果图；
图6F为CLDN18.2抗体B50的亲和力检测Scatchard法结果图；
图6G为CLDN18.2抗体B78的亲和力检测Scatchard法结果图；
图7A为CLDN18.2抗体对293T-CLDN18.1细胞CDC作用结果图；
图7B为CLDN18.2抗体对293T-CLDN18.2细胞CDC作用结果图；
图8A为CLDN18.2抗体对293T-CLDN18.1细胞ADCC作用结果示意图；
图8B为CLDN18.2抗体对293T-CLDN18.2细胞ADCC作用结果示意图；
图9为CLDN18.2抗体结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接、”“联接，”如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
缩写
ADC-抗体药物缀合物。
ADCC-抗体依赖性细胞的细胞毒性。
CDC-补体依赖性细胞毒性。
CDR-免疫球蛋白可变区中的互补决定区。
FR-抗体框架区，不包括CDR区的免疫球蛋白可变区。
VH或VH-免疫球蛋白重链可变区。
VL或VL-免疫球蛋白轻链可变区。
CH1或CH1-第一恒定区域。
CH2或CH2-第二恒定区域。
CH3或CH3-第三恒定区域。
本文中，如无特别说明，核苷酸序列从左到右默认为5’端到3’端，氨基酸序列从左到右默认为N端到C端。
根据单克隆抗体来源的不同，可分为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。所谓的鼠源抗体是基因100％来源于鼠，全人源抗体就是基因100％来源于人。而人源化抗体是将鼠源抗体的CDR区移植到人源抗体的骨架中，大部分来源是人的，同时融合了鼠源成分。嵌合抗体是将鼠源抗体的可变区直接与人源抗体的恒定区相连，因此含有的鼠源成分更多。不论是何种类型的抗体，都可以用来治疗人类疾病，但由于人源程度的不同也决定了抗体的效果的不同，全人源抗体因为全部来自人类自身，因此排异反应最低，安全性最好。在一实施例中，本发明采用全人源噬菌体抗体库进行人Claudin18.2抗体的筛选，所得到的抗体相比嵌合抗体IMAB362(例如US20090169547A1)、人源化抗体(例如WO2020200196A1)在人体中更具有安全性。
根据第一方面，在一实施例中，提供一种分离的抗体，所述抗体可与人CLDN 18.2(人密蛋白18.2)特异性结合，且不与人CLDN 18.1(人密蛋白18.1)结合，所述抗体包括如下至少一组重链可变区、轻链可变区：
1)重链可变区，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；轻链可变区，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列；
2)重链可变区，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；轻链可变区，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ IDNO：12所示的氨基酸序列；
3)重链可变区，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；轻链可变区，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQID NO：18所示的氨基酸序列；
4)重链可变区，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；轻链可变区，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQID NO：24所示的氨基酸序列；
5)重链可变区，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列；轻链可变区，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQID NO：30所示的氨基酸序列；
6)重链可变区，其包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列；轻链可变区，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQID NO：36所示的氨基酸序列。
在一实施例中，所述抗体的轻链恒定区包括但不限于人抗体k、λ型轻链恒定区或其变体。
在一实施例中，所述抗体的重链可变区框架(FR)序列选自人种系重链序列。
在一实施例中，所述抗体的重链包含人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的重链恒定区或其变体。
在一实施例中，所述抗体是全长抗体。
在一实施例中，所述抗体是抗体片段，抗体片段选自：Fab、Fab’、F(ab)2、Fd、Fv、scFv和scFv-Fc片段、单链抗体、微抗体(minibody)和双抗体。术语“抗体片段”是指除完整抗体之外的分子，其包含与完整抗体结合的抗原结合的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段和残留的“Fc”片段，这一名称反映了易于结晶的能力。Fab片段由一条完整的轻(L)链(VL)以及重(H)链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。胃蛋白酶处理抗体产生单个大F(ab)2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段，且仍能够交联抗原。Fab片段与F(ab)2片段的不同之处在于，在CH1结构域的羧基末端有额外的几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文对Fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基(thiolgroup)。F(ab’)2抗体片段最初是作为其间有铰链的半胱氨酸Fab’片段对产生的。还包括其他的已知抗体片段的其他化学偶联。
在一实施例中，所述抗体是单克隆抗体。
在一实施例中，所述抗体是人抗体。
在一实施例中，所述抗体是嵌合抗体。
在一实施例中，所述抗体是双特异性抗体，其包含未修饰的(例如天然存在的)Fc片段或修饰的Fc片段，所述修饰的Fc片段经设计以优化或替代性地消除特定的Fc介导的功能。
在一实施例中，所述抗体包含如下至少一组重链、轻链：
1)重链，其包含SEQ ID NO：38所示氨基酸序列；轻链，其包含SEQ ID NO：40所示氨基酸序列；
2)重链，其包含SEQ ID NO：42所示氨基酸序列；轻链，其包含SEQ ID NO：44所示氨基酸序列；
3)重链，其包含SEQ ID NO：46所示氨基酸序列；轻链，其包含SEQ ID NO：48所示氨基酸序列；
4)重链，其包含SEQ ID NO：50所示氨基酸序列；轻链，其包含SEQ ID NO：52所示氨基酸序列；
5)重链，其包含SEQ ID NO：54所示氨基酸序列；轻链，其包含SEQ ID NO：56所示氨基酸序列；
6)重链，其包含SEQ ID NO：58所示氨基酸序列；轻链，其包含SEQ ID NO：60所示氨基酸序列。
根据第二方面，在一实施例中，提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码第一方面任意一项的抗体。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种构建体，所述构建体含有第二方面的多核苷酸。所述构建体通常可以通过将所述分离的多核苷酸插入合适的载体中构建获得，本领域技术人员可选择合适的载体，所述载体可以是噬菌体、质粒、或病毒载体、或人工染色体，诸如细菌或酵母人工染色体。换言之，本发明的实施方案的载体包含能够在宿主细胞或其分离的级分中表达的感兴趣的多核苷酸。载体通常还适合作为克隆载体，即在微生物系统中可复制；克隆载体可以被设计用于在一种宿主中复制，而构建体被设计用于在不同的宿主中表达。包含本发明的实施方案的多肽和蛋白的载体还可以包含用于在宿主细胞中繁殖或选择的选择标记。载体可以通过常规转化或转染技术引入到原核或真核细胞中。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种表达系统，所述表达系统含有第三方面的构建体或基因组中整合有外源的第二方面的多核苷酸。所述表达系统可以是宿主细胞，所述宿主细胞可以表达第一方面任意一项的抗体。在本发明另一具体实施例中，所述宿主细胞可以是真核细胞和/或原核细胞，更具体可以是小鼠细胞、人细胞等。
根据第五方面，在一实施例中，提供一种药物组合物，其含有第一方面任意一项的抗体以及药学上可接受的载体。
在一实施例中，药学上可接受的载体包括但不限于稀释剂、赋形剂、溶剂和包封材料。
根据第六方面，在一实施例中，提供第一方面的抗体、第二方面的多核苷酸、第三方面的构建体、第四方面的表达系统在制备治疗和/或预防疾病的药物和/或诊断试剂中的应用。
在一实施例中，所述疾病包括但不限于癌症。
在一实施例中，所述癌症包括但不限于与表达CLDN 18.2的细胞相关的疾病。
在一实施例中，所述癌症包括但不限于与高表达CLDN 18.2的细胞相关的疾病。
在一实施例中，所述癌症包括但不限于胃癌、胰腺癌、食管癌、肺癌。
在一实施例中，本发明提供一种与人CLDN 18.2特异结合的抗体、制备方法及其用途，尤其是其在诊断、治疗与表达CLDN 18.2的细胞相关的疾病中的用途，疾病包括高表达CL DN 18.2肿瘤，例如胃癌、胰腺癌、食管癌、肺癌。
实施例1
图9为本实施例提供的CLDN18.2抗体结构示意图，具体说明如下：
抗体的轻链可变区(简称VL或VL)与重链可变区(简称VH或VH)包含互补决定区(CDR)与构架区(FR)。
抗体的轻链恒定区(CL)与重链恒定区的CH1通过二硫键聚合，重链恒定区还包含CH2、CH3，CH1的C端依次键联至CH2、CH3，CH1与CH2之间键联有铰链(HINGE)。
本实施例提供一种抗人CLDN18.2抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，各序列是从天然人源噬菌体抗体库筛选得到，其中：
(1)B1重链可变区核酸序列
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGTCACGGTGGCACACTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCATCA(SEQ ID NO：37)
(2)B1重链可变区氨基酸序列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGHGGTLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：38)
(3)B1轻链可变区核酸序列
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGTTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAACCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA(SEQ ID NO：39)
(4)B1轻链可变区氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISNLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK(SEQ ID NO：40)
(5)B9重链可变区核酸序列
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAATACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGACGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGAGTGGGAGCTACTACTTTCCCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCATCA(SEQ IDNO：41)
(6)B9重链可变区氨基酸序列
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGNTI YYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRADDTAVYYCARSGSYYFPYYFDYWGQGTLVT VSS(SEQ ID NO：42)
(7)B9轻链可变区核酸序列
AACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGAATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACTCCTTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA(SEQ ID NO：43)
(8)B9轻链可变区氨基酸序列
NIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：44)
(9)B35重链可变区核酸序列
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGACGTGGCCAATCTACTTCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCATCA(SE Q ID NO：45)
(10)B35重链可变区氨基酸序列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDVANLLPWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：46)
(11)B35轻链可变区核酸序列
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAACAGTTTCCCTATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA(SEQ ID NO：47)
(12)B35轻链可变区氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGQGTRLEIK(SEQ ID NO：48)
(13)B41重链可变区核酸序列
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGATAGGTGTGGGAGCTACGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCATCA(SE Q ID NO：49)
(14)B41重链可变区氨基酸序列
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIGVGATDYWGQGTLVTVSS(SE Q ID NO：50)
(15)B41轻链可变区核酸序列
AACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAAAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCATGATCTATGATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAACAGTTTCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA(SEQ ID NO：51)
(16)B41轻链可变区氨基酸序列
NIQLTQSPSSVSASVGDKVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLMIYDASSLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：52)
(17)B50重链可变区核酸序列
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGATCCAATGGCTACTACTACTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACAATGGTCACCGTCTCATCA(SEQ ID NO：53)
(18)B50重链可变区氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSNGYYYYYMDVWGKGTMV TVSS(SEQ ID NO：54)
(19)B50轻链可变区核酸序列
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTGCCGTATCTGCACGTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGCCTATAAGAACCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAGTCAGGGAGAGGCCCGAGACTCTTGATCTCTGCTGCATCCAATTTGCAGAGTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCGGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAACCTGCAACTTGAAGATTCTGCAACTTACTTCTGTCAACAGGCTAGCAGAATCCCGTTCACTTTCGGCGGAGGGACCACGGTTGAGATCAAA(SEQ ID NO：55)
(20)B50轻链可变区氨基酸序列
DIQMTQSPSAVSARVGDRVTITCRASQPIRTWLAWYQQKSGRGPRLLISAASNLQSGVP SRFSGGGSGTDFTLTISNLQLEDSATYFCQQASRIPFTFGGGTTVEIK(SEQ ID NO：56)
(21)B78重链可变区核酸序列
CAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGCTTCAGTGACTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAGCACCCTTTTTCTGCACGTGAACAACTTGAGACCTGAGGATACGGCTGTCTATTACTGTGCGAAGGCAATAAGGGGTGGTTACTTCGGGTTCCTTGACCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCATCA(SEQ IDNO：57)
(22)B78重链可变区氨基酸序列
QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGS TYYADSVKGRFTISRDNSKSTLFLHVNNLRPEDTAVYYCAKAIRGGYFGFLDHWGQGTLVT VSS(SEQ ID NO：58)
(23)B78轻链可变区核酸序列
AACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGCTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATCTCAAA(SEQ ID NO：59)
(24)B78轻链可变区氨基酸序列
NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGPGTKVDLK(SEQ ID NO：60)
(25)抗体的免疫球蛋白可变区中的互补决定区(CDR)序列
表1
/>
表1中的序列均来源于人。
实施例1：抗体库包装
从-80℃冰箱取出人抗体库菌种，冰上融化后取1mL加入10mLCarb+(50μg/mL)的2×YT培养基中，37℃200rpm摇1h。加入到100mLCarb+(50μg/mL)、Tet+(10μg/mL)2×YT培养基，200rpm摇1h，加入1010pfμ/mL的M13K07辅助噬菌体，37℃静置30min，200rpm摇30min。加入终浓度50μg/mL的kan+，37℃，200rpm过夜。
次日以10000×g/min，10min，4℃，离心收集上清，加入1/4倍体积的PEG8000/NaCl，充分混匀，放入4℃冰箱静置30min～1h。将混合液离心，4℃，12000×g/min，20min，弃上清，沉淀用1mLPBS重悬。
重悬液即为包装的抗体文库。
实施例2：抗体库筛选
免疫管法筛选的原理是将CLDN 18.2-VLP包被在具有高吸附力的免疫管表面，通过将噬菌体展示抗体文库加入到免疫管中并和吸附于免疫管表面的抗原进行孵育、洗涤和洗脱的淘选过程，经历2～4轮淘选，最终将针对抗原的特异性单克隆抗体富集下来。
第一轮筛选时，在免疫管中加入1mL浓度为100μg/mL的CLDN18.2-VLP蛋白，4℃包被过夜，第二天弃去包被液，加入1％的PBSB封闭1h，PBST洗涤两次后加入总量为1012个抗体库，孵育1h，用PBST润洗6遍，去除非特异性结合的噬菌体，然后向免疫管中加入500μL，100mM HCl洗脱液，用于洗脱特异性结合目标抗原的噬菌体，加入1.0M Tris-HCl(p H 8)进行中和。将洗脱液加入10倍体积处于对数生长期的TG1中，37℃，先静止30min，后摇床200rpm，30min，再加入M13K07辅助噬菌体，静置30min，继续在220rpm条件下培养过夜。第二天沉淀噬菌体，用于后续2～3轮的筛选。
第二轮用细胞进行筛选，第三轮筛选的抗原包被浓度递减，递减为10μg/mL。选择第三轮所得的克隆进行ELISA的阳性克隆筛选。在44个克隆中共筛选到6个能够与CLDN18.2-VLP蛋白特异性结合的阳性克隆，进行后续的测序分析。
表2噬菌体抗体库3轮筛选富集
图1所示为噬菌体抗体库3轮筛选富集Pool ELISA图，可见，第3轮富集的ELISA结果相比第1轮和第2轮的富集结果更高，说明经过3轮筛选富集，第3轮筛选后序列富集明显。
实施例3：全长构建、表达和纯化
筛选获得的克隆经过测序，得到抗体的DNA序列，设计引物，PCR扩增获取抗体轻、重链可变区片段，通过同源重组方法，分别构建至经过改造的含有轻、重链恒定区片段的真核表达载体质粒pcDNA3.3-TOPO上，抗体结构形式为IgG1，构建的载体转化感受态细胞TOP10，涂板过夜，隔天挑取单克隆，进行扩培，采用无内毒素质粒提取试剂盒进行质粒提取，得到的质粒以供真核细胞CHO表达使用。
转染当天，用37℃预温的新鲜ExpiCHOTMExpression Medium将细胞调整到终浓度为6×106个/mL。用预冷的OptiPROTM-SFM稀释目的质粒(向1mL所述培养基中加入1μg质粒)，用OptiPROTM-SFM稀释ExpiFectamineTM-CHO，再将两者等体积混合并轻轻吹打混匀制备成ExpiFectamineTM-CHO/质粒DNA混合液，室温孵育1～5min，缓慢加入到准备好的细胞悬液中，并同时轻轻摇晃，最后置于细胞培养摇床中，在37℃、5％CO2条件下培养。在转染后18～22h，向培养液中添加ExpiCHOTM-Enhancer和ExpiCHOTM-Feed，摇瓶放置于37℃摇床和5％CO2条件下继续培养，在转染后的第5天，添加相同体积的ExpiCHOTM-Feed，缓慢加入的同时轻轻混匀细胞混悬液，在转染7～15天后，将表达有目的蛋白的细胞培养上清于15000×g高速离心10min，所得上清进行亲和纯化，然后用100mM乙酸钠洗脱目的蛋白，接着用1MTris-HCl中和，最后通过超滤浓缩管将所得蛋白置换至PBS缓冲液中。
抗体的纯度鉴定
用SDS-PAGE检测抗体的相对分子量和纯度。
图2为抗体表达纯化后的SDS-PAGE电泳图，可见，经过Reduced SDS-PAGE电泳检测分析，抗体目的条带清晰，重链大小为50KD，轻链大小为25KD，无杂带，纯度达到95％以上。
实施例4：ELISA检测
包被hCLDN18.2抗原，浓度为2.0μg/mL，50μL/孔，4℃包被过夜。次日，PBST洗涤3次，1％PBSB室温封闭1h，PBST再洗涤3次，加梯度稀释的抗体室温孵育1h。PBST洗涤3次，加Anti-human-IgG-Fc-HRP二抗孵育1h，PBST洗涤5次，加TMB显色，1M硫酸终止，测OD450。
图3为ELISA检测结果图，可见，候选抗体B1、B9、B50在同等浓度下具有和对照嵌合抗体IMAB362相当的亲和活性，而B35、B41、B78较低。
实施例5：细胞水平流式检测结合活性
收集对数生长期的细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，PBS洗3次，1000rpm，离心5min，细胞重悬于0.5mL的PBS中。设置抗体浓度梯度：0.03、0.07、0.1、0.3、0.7、1、1.5、3、7、10(μg/mL)，4.0℃孵育1.0h，PBS洗涤3次，1000rpm，离心5分钟，细胞重悬于0.5mL的PBS中。加APC-二抗5μL，继续孵育0.5小时，PBS洗涤3次，1000rpm，离心5分钟，细胞重悬于0.3mL的PBS中，流式细胞仪上机检测。
图4A为与293T-CLDN18.1细胞流式结合示意图，可见，候选抗体B1、B9、B35、B41、B50、B78在高剂量10μg/mL浓度下与293T-CLDN18.1细胞未发生结合，说明候选抗体不与CLDN18.1抗原结合。
图4B为与293T-CLDN18.2细胞流式结合示意图，可见，候选抗体B1、B9、B41与293T-CLDN18.2细胞的结合，在同等浓度下具有和对照嵌合抗体IMAB362相当的结合活性，而B35、B41、B78较低。
图4C为与NUGC4-CLDN18.2细胞流式结合示意图，可见，同样的，候选抗体B1、B9、B41与NUGC4-CLDN18.2细胞的结合，在同等浓度下具有和对照嵌合抗体IMAB362相当的结合活性，而B35、B50、B78较低。
实施例6：抗体内吞实验
收集NUGC4-CLDN18.2细胞，PBS洗涤3次，调整细胞密度为2.5×106个/ml，将待测抗体稀释成浓度20μg/ml。取200μl细胞悬液，加入抗体200μL，使抗体终浓度为10μg/mL。轻轻吹打混匀，放冰上孵育1小时。PBS离心洗涤3次，去掉未结合的抗体。去上清后每孔加入预热的完全培养基400μL，放入37℃，5％ CO2培养箱内，4小时后取出细胞。用PBS离心洗涤3次每孔加入APC anti human IgG Fc二抗5μL，4℃，染色30分钟。用PBS洗涤3遍。在MA900流式细胞仪上检测几何平均数荧光强度(MFI)，计算CLDN18.2抗体对NUG C4-CLDN18.2细胞的内吞效率。
MFI1H为冰上孵育1小时后的样品的MFI，假设该条件下抗体完成结合，内吞尚未发生。MFI4H为37℃孵育4小时后的样品的MFI。抗体介导的细胞表面CLDN18.2内吞百分比由以下公式计算：内吞百分比(％)＝(MFI1H-MFI4H)/MFI1H×100％。内吞百分比亦称内吞效率、内吞率。
图5为CLDN18.2抗体对内吞效率结果图，可见，阳性对照嵌合抗体IMAB362的内吞效率最高，候选抗体B1、B41次之，B9、B35、B50、B78内吞率较小。
实施例7：Scatchard法测定抗体亲和力
收集293T-hCLDN18.2细胞，每管5×105个细胞。每个抗体加入起始浓度20μg/mL的抗体，依次3倍梯度稀释，设置8个浓度梯度，4℃孵育1h。离心去除未结合的抗体，PBS洗涤3次，再加入5μL/孔APC anti human IgG Fc，4℃避光孵育30分钟，用PBS洗涤3次，流式细胞仪上机检测。使用Flowjo软件分析实验数据得到MFI，再通过Scatchard作图法，转换成抗体摩尔浓度，计算抗体的解离常数KD值。
Scatchard方程如下：
以结合实验为例，式中B为结合上受体的配体浓度，F为游离配体浓度，Kd为平衡解离常数，Bmax为配体结合的最大饱和浓度。以B/F对B作图，即为Scatchard作图，所得曲线之斜率为1/Kd，曲线在横坐标上的截距即为Bmax。图6A～图6G为CLDN18.2抗体亲和力检测Scatchard图。
表3抗体亲和力
IMAB362抗体为一种现有的人-鼠嵌合抗体，具体参考公开号为US20090169547A1的专利说明书制备得到。公开号为CN107050460A的中国专利中也有述及该IMAB362抗体。
可见，候选抗体B9的亲和力高于阳性对照嵌合抗体IMAB362，B1、B41亲和力近似IMAB362，B50、B78稍低于IMAB362，B35亲和力最低。
实施例7：抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)效应评价
消化，离心收集293T-hCLDN18.1-luci和293T-hCLDN18.2-luci细胞，重悬，调整细胞浓度至2×105/mL，加入96孔板，每孔50μL，约1.0×104个，加入不同浓度的抗体(终浓度10、3.33、1.11、0.37、0.12、0.041、0.0137、0.004、0.001μg/mL)50μL，培养箱中孵育1h。取出细胞板，每孔加入5μL补体，250×g，离心5分钟，细胞培养板置含5％CO2的37℃的培养箱孵育6h。孵育结束后，加入1μL100×luciferin底物进行反应10min，在酶标仪中进行化学发光检测。
图7A为CLDN18.2抗体对293T-CLDN18.1细胞CDC作用示意图，可见，候选抗体B1、B9、B35、B41、B50、B78和阳性对照嵌合抗体IMAB362对293T-CLDN18.1细胞无杀伤，说明候选抗体与CLDN18.1抗原不发生结合。，
图7B为CLDN18.2抗体对293T-CLDN18.2细胞CDC作用示意图，可见，候选抗体在同等浓度下，B1、B41展示出比阳性对照嵌合抗体IMAB362更强的CDC细胞杀伤效应。候选抗体B9与IMAB362相似。B35、B50、B78杀伤效果较低。
实施例8：抗体的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)效应评价
收集293T-hCLDN18.1-luci和293T-hCLDN18.2-luci细胞，调整细胞浓度至2×105/mL，加入96孔板，每孔50μL，约1.0×104个细胞。加入不同浓度的抗体(10、3.33、1.11、0.37、0.12、0.041、0.001μg/mL)，培养箱中孵育0.5小时。收集效应细胞PBMC，每孔加入50μL，1.0×105个，E：T＝10：1(效靶比，即效应细胞与靶细胞的数量之比)。在5％CO2的37℃的培养箱孵育4h。孵育结束后，加入2μL 100×luciferin底物进行反应10min，在酶标仪中进行化学发光检测。
图8A为CLDN18.2抗体对293T-hCLDN18.1-luci细胞ADCC作用结果图，可见，候选抗体B1、B9、B35、B41、B50、B78和阳性对照嵌合抗体IMAB362对293T-CLDN18.1细胞无杀伤，说明候选抗体与CLDN18.1抗原不发生结合。
图8B为CLDN18.2抗体对293T-hCLDN18.2-luci细胞ADCC作用结果图，可见，候选抗体在同等浓度下，B1展示出比阳性对照嵌合抗体IMAB362更强的ADCC细胞杀伤效应。候选抗体B9、B41与IMAB362相似。B35、B50、B78杀伤效果较低。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (8)

1.一种分离的抗体，所述抗体可与人CLDN 18.2特异性结合，且不与人CLDN 18.1结合，所述抗体由重链可变区和轻链可变区组成：
重链可变区的3个CDR区分别为HCDR1、HCDR2、HCDR3；
所述HCDR1包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列；
所述HCDR2包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列；
所述HCDR3包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列；
轻链可变区的3个CDR区分别为LCDR1、LCDR2、LCDR3；
所述LCDR1包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列；
所述LCDR2包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列；
所述LCDR3包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链恒定区包括人抗体k、λ型轻链恒定区或其变体；
或，所述抗体的重链可变区框架(FR)序列选自人种系重链序列；
或，所述抗体是全长抗体；
或，所述抗体是抗体片段，抗体片段选自：Fab、Fab’、F(ab)2、Fd、Fv、scFv和scFv-Fc片段；
或，所述抗体是单克隆抗体；
或，所述抗体是人抗体；
或，所述抗体是嵌合抗体。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链为SEQ ID NO：54所示氨基酸序列；轻链为SEQ ID NO：56所示氨基酸序列。
4.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求1～3任意一项所述的抗体。
5.一种构建体，所述构建体含有如权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种表达系统，所述表达系统含有如权利要求5所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求4所述的多核苷酸。
7.一种药物组合物，其含有如权利要求1～3任意一项所述的抗体以及药学上可接受的载体。
8.如权利要求1～3任意一项所述的抗体、如权利要求4所述的多核苷酸、如权利要求5所述的构建体或者如权利要求6所述的表达系统在制备治疗和/或预防CLDN 18.2异常表达引起的疾病的药物和/或CLDN 18.2异常表达引起的疾病的诊断试剂中的应用，所述疾病为癌症，所述癌症为高表达CLDN 18.2的细胞相关的疾病，所述癌症为胃癌、胰腺癌、食管癌或肺癌。
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