JP2023130455A - Cd47およびpd-l1に特異的な抗体 - Google Patents

Cd47およびpd-l1に特異的な抗体 Download PDF

Info

Publication number
JP2023130455A
JP2023130455A JP2023112302A JP2023112302A JP2023130455A JP 2023130455 A JP2023130455 A JP 2023130455A JP 2023112302 A JP2023112302 A JP 2023112302A JP 2023112302 A JP2023112302 A JP 2023112302A JP 2023130455 A JP2023130455 A JP 2023130455A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
cancer
seq
antibodies
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023112302A
Other languages
English (en)
Inventor
ソロフエフ,キリル・ウラディミロビッチ
Vladimirovich Solovyev Kirill
ウリティン,アンドレイ・ボリソビッチ
Borisovich ULITIN Andrei
ネマンキン,ティモフェイ・アレクサンドロビッチ
Aleksandrovich Nemankin Timofej
ソロフエフ,バレリイ・ウラディミロビッチ
Vladimirovich Solovev Valerij
モロゾフ,ドミトリ・バレンチノビッチ
Valentinovich MOROZOV Dmitry
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biocad JSC
Original Assignee
Biocad JSC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biocad JSC filed Critical Biocad JSC
Publication of JP2023130455A publication Critical patent/JP2023130455A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005Vertebrate antigens
    • A61K39/0011Cancer antigens
    • A61K39/001102Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001129Molecules with a "CD" designation not provided for elsewhere
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46Hybrid immunoglobulins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55Fab or Fab'
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565Complementarity determining region [CDR]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622Single chain antibody (scFv)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

【課題】CD47およびPD-L1に特異的に結合する抗体、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、発現ベクター、該抗体を得るための方法、ならびに癌療法における前記抗体および組成物の使用を提供する。【解決手段】CD47およびPD-L1に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、CD47に対する1つの結合部位、およびPD-L1に対する少なくとも1つの結合部位を含む抗体を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、バイオテクノロジーの分野に、特に、抗体またはその抗原結合断片に、そしてその使用に関する。より具体的には、本発明は、CD47およびPD-L1に特異的に結合する抗体に関する。本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、発現ベクター、該抗体を得るための方法、ならびに癌療法における前記抗体および組成物の使用にも関する。
T細胞への2つの別個のシグナルの提供は、抗原提示細胞(APC)で残存するTリンパ球をリンパ球活性化する広範なモデルである。このモデルは、自己の非自己からの区別、および免疫寛容を十分に提供する。一次シグナルまたは抗原特異的シグナルは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)の背景で提示された外来(foreign)抗原ペプチドの認識後、T細胞受容体(TCR)を通じて伝達される。二次または共刺激シグナルは、抗原提示細胞(APC)上に発現される共刺激分子によってT細胞に送達され、そしてT細胞がクローン拡大、サイトカイン分泌およびエフェクター機能を刺激するよう誘導する。共刺激の非存在下では、T細胞は抗原刺激に対して免疫となる可能性もあり、これは有効な免疫反応を引き起こし、そしてこれはさらに、枯渇または外来抗原に対する耐性を導く可能性もある。
2シグナルモデルにおいては、T細胞は両方のシグナル:正および負の二次共刺激シグナルを受け取る。こうした正および負のシグナルの制御は、宿主の防御免疫反応を最大にする一方、免疫寛容を維持し、そして自己免疫を防止するために非常に重要である。負の二次シグナルは、T細胞寛容誘導に必要であるようである一方、正のシグナルはT細胞活性化を刺激する。単純な2シグナルモデルはなお、ナイーブなリンパ球に関する有効な説明を提供するが、免疫反応は動的プロセスであり、そして抗原に曝露されたT細胞に対する共刺激シグナルもまた提供されうる。共刺激シグナルを操作すると、免疫反応を増進させるかまたは終結させるかいずれかの手段が提供されることが示されてきているため、共刺激の機構は、療法的観点から関心が持たれる。近年、T細胞機能不全またはアネルギーが、阻害性受容体であるポリペプチド1プログラム細胞死(PD-1)の発現誘導および持続と同時に起こることが見出されてきている。その結果、PD-1、およびPD-1との相互作用を通じてシグナルを伝達する他の分子、例えばプログラム細胞死リガンド1(PD-L1)またはプログラム細胞死リガンド2(PD-L2)の療法的ターゲティングは、非常に関心が持たれる領域である。
PD-L1は、複数の悪性腫瘍において過剰発現され、そしてしばしば劣った予後と関連する。興味深いことに、腫瘍浸潤性Tリンパ球の大部分は、正常組織中のTリンパ球および末梢血Tリンパ球とは対照的に、主にPD-1を発現し、これは、腫瘍反応性T細胞上のPD-1の正の制御が、免疫反応不全に寄与しうることを示す。これは、T細胞活性化の全体的な減弱および免疫監視の回避を伴って、PD-L1を発現し、そしてPD-1を発現するT細胞と相互作用する腫瘍細胞によって仲介されるPD-L1シグナル伝達経路の利用による可能性もある。したがって、PD-L1/PD-1相互作用の阻害は、腫瘍のCD8+ T細胞仲介性殺傷を増進する可能性もある。
PD-1、ならびにPD-1との相互作用を通じてシグナルを伝達する他の分子、例えばPD-L1およびPD-L2の療法的ターゲティングは、非常に関心が持たれる領域である。PD-L1シグナルの阻害は、癌、ならびに急性および慢性感染を含む感染の治療のため、T細胞免疫(例えば抗腫瘍免疫)を増加させる手段として示唆されてきている。
PD-L1/PD-1相互作用を遮断する阻害剤は、とりわけ、WO2001014557、WO2002086083、WO2007005874、WO2010036959、WO2010077634およびWO2011066389より知られる。しかし、この経路をターゲティングする最適な療法剤はいまだ商業化されておらず、そしてこれは重大な充たされていない医学的必要性である。
CD47は、対応する細胞上のSIRPα(別名SHPS-1)およびSIRPγに結合する、細胞表面糖タンパク質である。この相互作用は、免疫細胞機能の負の制御を導くか、または細胞接着および遊走を仲介しうる。自己免疫障害の治療における生物学的剤としてのCD47の使用(WO1999/040940)が提唱されてきている。対照的に、同様の療法目的のための、CD47リガンド、例えばSIRPαのありうる使用に関するデータは非常にわずかしかない。1つの説明は、CD47が遍在性に発現されており、このため、潜在的な薬剤としてのCD47結合ポリペプチドの使用が妨害されうることである。Yuら(J Invest Dermatol, 126:797-807(2006))によって公表されたデータによって、免疫グロブリンFcドメインに融合されたSIRPαの細胞外ドメインからなる融合タンパク質が、マウスにおいて、皮膚由来樹状細胞(DC)から、流入領域リンパ節への遊走を防止し、そしてそれによってマウスにおいて接触過敏症反応を(少なくとも部分的に)減弱させうることが示唆される。DCの遊走および機能は、免疫または炎症反応に重要である。疼痛を起こす状態において、これらの悪化したDC反応は、疾患の維持を導きうる。病原性DCの組織からリンパ系臓器への遊走の妨害は、自己免疫または炎症性疾患を駆動する悪循環を止める魅力的な機会であろう。
CD47は、インテグリン会合タンパク質(IAP)、卵巣癌抗原OA3、Rh関連抗原およびMER6としても知られる、膜を数回貫通する膜貫通受容体であり、そして免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。CD47発現および/または活性は、いくつかの疾患および障害において観察されてきている。したがって、CD47をターゲティングする療法に関する必要性が存在する。さらに、血小板上のCD47の発現のため、被験体に投与した際に、重大なレベルの血小板枯渇、赤血球凝集、赤血球枯渇、および/または貧血を引き起こさない、CD47ターゲティング療法(例えば抗体)に関する必要性もまたある。
CD47およびSIRPαリガンドの間の相互作用を阻害する既知の抗体は、以下の情報源に記載されてきている:出願、WO2014123580、WO2013119714、WO2015191861、WO2011143624、WO/2014/093678、WO2017053423。
多重特異性抗体を記載する多様な情報源もまた知られ、例えば、WO/2014/087248は、CD47およびCD19に特異的な二重特異性抗体を記載し、そしてWO2016023001は、CD47およびPD1に特異的な二重特異性抗体を記載する。しかし、CD47およびPD-L1に特異的に結合する多重特異性抗体の産生および有効な使用の可能性は記載されてきていない。
WO2001014557 WO2002086083 WO2007005874 WO2010036959 WO2010077634 WO2011066389 WO1999/040940 WO2014123580 WO2013119714 WO2015191861 WO2011143624 WO/2014/093678 WO2017053423 WO/2014/087248 WO2016023001
Yuら(J Invest Dermatol, 126:797-807(2006)
上記に関連して、CD47およびPD-L1に有効に結合する新規抗体の生成が適切である。
本発明は、CD47およびPD-L1に結合するよう向けられた結合分子、例えば抗体に関する。こうした抗体を用いて、CD47およびPD-L1によって仲介される疾患または障害を治療してもよい。
1つの側面において、本発明は、CD47およびPD-L1に特異的に結合し、そしてCD47に対する1つの結合部位、およびPD-L1に対する少なくとも1つの結合部位を含む、モノクローナル抗体に関する。
いくつかの態様において、本発明の抗体は全長抗体またはその抗原結合断片である。
いくつかの態様において、本発明の抗体には、PD-L1に対する1つまたは2つの結合部位が含まれる。
いくつかの態様において、本発明の抗体のCD47に対する結合部位は、CD47受容体およびSIRPαリガンドの間の相互作用を阻害し、ならびに/あるいは、PD-L1に対する結合部位は、PD-L1とPD-1受容体の相互作用を阻害する。
いくつかの態様において、本発明の抗体のCD47に対する結合部位は、CDR1、CDR2、CDR3配列を含む重鎖可変ドメインを含み、ここでCDR1は、以下の配列番号1~4の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列であり、すなわちCDR1は、配列番号1~4を含む群より選択される配列、あるいは1つまたは2つの置換を含む配列番号1~4を含む群より選択される配列であり、CDR2は、以下の配列番号6~15の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列であり、すなわちCDR2は、配列番号6~15を含む群より選択される配列、あるいは1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの置換を含む配列番号6~15を含む群より選択される配列であり、CDR3は、以下の配列番号17~20の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列である、すなわちCDR3は、配列番号17~20を含む群より選択される配列、あるいは1つ、2つまたは3つの置換を含む配列番号17~20を含む群より選択される配列である。
いくつかの態様において、本発明の抗体のCD47結合部位は、CDR1、CDR2、CDR3配列を含む重鎖可変ドメインを含み、ここでCDR1は、以下の配列番号1~4の群より選択される配列であり、CDR2は、以下の配列番号6~15の群より選択される配列であり、CDR3は、以下の配列番号17~20の群より選択される配列である。
いくつかの態様において、本発明の抗体のCD47結合部位は、請求項4の重鎖可変ドメイン、およびCDR1、CDR2、CDR3配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、ここでCDR1は、以下の配列番号22~34の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列であり、すなわちCDR1は、配列番号22~34の群より選択される配列、あるいは1つまたは2つの置換を含む配列番号22~34の群より選択される配列であり、CDR2は、以下の配列番号36~48の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列であり、すなわちCDR2は、配列番号36~48を含む群より選択される配列、あるいは1つ、2つまたは3つの置換を含む配列番号36~48の群より選択される配列であり、CDR3は、以下の配列番号50~64の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列であり、すなわちCDR3は、配列番号50~64の配列、あるいは1つまたは2つの置換を含む配列番号50~64の群より選択される配列である。
いくつかの態様において、本発明の抗体のCD47に対する結合部位には、請求項4の重鎖可変ドメイン、およびCDR1、CDR2、CDR3配列を含む軽鎖可変ドメインが含まれ、ここでCDR1は、以下の配列番号22~34の群より選択される配列であり、CDR2は、以下の配列番号36~48の群より選択される配列であり、CDR3は、以下の配列番号50~64の群より選択される配列である。
いくつかの態様において、本発明の抗体のCD47に対する結合部位には、以下の配列番号66~88の群より選択される配列に少なくとも90%相同である配列を含む重鎖可変ドメイン、および以下の配列番号89~106の群より選択される配列に少なくとも90%相同である配列を含む軽鎖可変ドメインが含まれる。
いくつかの態様において、本発明の抗体のCD47に対する結合部位には、以下の配列番号66~88の群より選択される配列を含む重鎖可変ドメイン、および以下の配列番号89~106の群より選択される配列を含む軽鎖可変ドメインが含まれる。
いくつかの態様において、本発明の抗体のPD-L1に対する結合部位には、以下の配列:配列番号5、配列番号16および配列番号21と少なくとも80%相同である、すなわち配列番号5、16および21のアミノ酸配列を含むか、あるいは1つの置換を含む配列番号5、1つ、2つまたは3つの置換を含む配列番号16、1つ、2つまたは3つの置換を含む配列番号21のアミノ酸配列を含む、配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに以下の配列:配列番号35、配列番号49および配列番号65と少なくとも80%相同である、すなわち配列番号35、49および65のアミノ酸配列を含むか、あるいは1つ、2つまたは3つの置換を含む配列番号35、1つの置換を含む配列番号49、1つまたは2つの置換を含む配列番号65のアミノ酸配列を含む、配列を含む軽鎖可変ドメインが含まれる。
いくつかの態様において、本発明の抗体のPD-L1に対する結合部位には、以下の配列:配列番号5、配列番号16および配列番号21を含む重鎖可変ドメイン、ならびに以下の配列:配列番号35、配列番号49および配列番号65を含む軽鎖可変ドメインが含まれる。
いくつかの態様において、本発明の抗体のCD47に対する結合部位は、Fab、sc
Fv、scFab、あるいは単離されたVHまたはVHHモノドメインである。
いくつかの態様において、本発明の抗体のPD-L1に対する結合部位は、Fab、scFv、scFab、あるいは単離されたVHまたはVHHモノドメインである。
いくつかの態様において、本発明の抗体は、表面上にCD47および/またはPD-L1抗原を所持する細胞の割合で、抗体依存性細胞傷害性、マクロファージ仲介性食作用、および/またはT細胞仲介性細胞傷害性を刺激することで特徴づけられる。
いくつかの態様において、本発明の抗体は、突然変異または修飾を含まない同じ抗体と比較した際に、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性(ADCC)を増加させる、少なくとも1つの突然変異または修飾を含むFc部分を含むことで特徴づけられる。
いくつかの態様において、本発明の抗体は、癌治療のための医薬品として使用されるよう意図される。
1つの側面において、本発明は、上記抗体のいずれかをコードする核酸に関する。
いくつかの態様において、本発明の核酸はDNAである。
1つの側面において、本発明は、上記核酸を含む、発現ベクターに関する。
1つの側面において、本発明は、本発明のベクターでの細胞の形質転換を含む、上記抗体のいずれかを調製するための宿主細胞を得るための方法に関する。
1つの側面において、本発明は、上記核酸を含有する、上記抗体のいずれかを得るための宿主細胞に関する。
1つの側面において、本発明は、特定された(specified)抗体を得るために十分な条件下で、培地中、宿主細胞を培養し、必要であればその後、得た抗体を単離し、そして精製することからなる、上記抗体のいずれかを得るための方法に関する。
1つの側面において、本発明は、PD-L1およびCD47によって仲介される疾患または障害の防止または治療のための薬学的組成物であって、1つまたはいくつかの薬学的に許容されうる賦形剤と組み合わせた、上記抗体のいずれかを含む、前記組成物に関する。
いくつかの態様において、本発明の薬学的組成物は、(HNSCC)頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、TNBC(三重陰性乳癌)、CRC(結腸直腸癌)、肝細胞癌、黒色腫、NSCLC(非小細胞肺癌)、腎臓癌、卵巣癌、MSI CRC(マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌)、白血病(急性白血病または骨髄芽球性白血病)、リンパ腫、多発性骨髄腫、乳癌、前立腺癌、肉腫、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、TおよびB細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンB細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、膵臓癌、および高リスク骨髄異形成症候群の群より選択される、PD-L1およびCD47によって仲介される疾患または障害の防止または治療のために意図される。
1つの側面において、本発明は、PD-L1およびCD47によって仲介される疾患または障害を治療するための方法であって、こうした治療の必要がある被験体に、上記抗体または本発明の薬学的組成物のいずれかを、療法的に有効な量で投与する工程を含む、前記方法に関する。
本発明の治療のための方法のいくつかの態様において、疾患または障害は、(HNSCC)頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、TN
BC(三重陰性乳癌)、CRC(結腸直腸癌)、肝細胞癌、黒色腫、NSCLC(非小細胞肺癌)、腎臓癌、卵巣癌、MSI CRC(マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌)、白血病(急性白血病または骨髄芽球性白血病)、リンパ腫、多発性骨髄腫、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、肝細胞癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、TおよびB細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンB細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、膵臓癌、卵巣癌、および高リスク骨髄異形成症候群の群より選択される。
1つの側面において、本発明は、PD-L1および/またはCD47の生物学的活性の阻害が必要である被験体において、PD-L1および/またはCD47の生物学的活性を阻害するための方法であって、上記抗体のいずれかの有効量を投与する工程を含む、前記方法に関する。
1つの側面において、本発明は、PD-L1およびCD47によって仲介される疾患または障害の治療の必要がある被験体の、PD-L1およびCD47によって仲介される疾患または障害の治療のための、上記抗体または上記薬学的組成物のいずれかの使用に関する。
本発明の抗体の使用のいくつかの態様において、疾患または障害は、(HNSCC)頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、TNBC(三重陰性乳癌)、CRC(結腸直腸癌)、肝細胞癌、黒色腫、NSCLC(非小細胞肺癌)、腎臓癌、卵巣癌、MSI CRC(マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌)、白血病(急性白血病または骨髄芽球性白血病)、リンパ腫、多発性骨髄腫、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、肝細胞癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、TおよびB細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンB細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、膵臓癌、卵巣癌、および高リスク骨髄異形成症候群の群より選択される。
哺乳動物細胞のCHO-K1培養における、ヒトCD47-Fcの一過性産生のためのプラスミドマップ。 ヒトCD47-Fcの調製物の非還元条件におけるSDS-ゲル電気泳動。 対照抗CD47抗体B6H12産物の調製物の還元条件におけるSDS-ゲル電気泳動。 対照抗CD47抗体B6H12産物の調製物の非還元条件におけるSDS-ゲル電気泳動。 ヒトCD47抗原と特異的に相互作用するVHH抗体断片を所持するポリクローナルファージのELISAの図。 抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体のドメイン構造の模式図であって、Aは抗CD47 scFv断片に基づき、そしてBは抗CD47 VHH断片に基づく。同時に、PD-L1結合部分はFab断片によって示される。 抗CD47 scFv断片に基づく二重特異性抗体の抗PD-L1/抗CD47調製物の非還元条件におけるSDS-ゲル電気泳動。 抗CD47 VHH断片に基づく抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体の調製物の還元条件におけるSDS-ゲル電気泳動。 研究した抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体の濃度に対する細胞傷害性効果の依存性。 研究した抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体の濃度に対する細胞傷害性効果の依存性。 抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体の存在下でのヒトマクロファージによるMDA-MB-231細胞株の食作用の有効性。 抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体の濃度に対する蛍光のレベルの依存性。 抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体の濃度に対する蛍光のレベルの依存性。 抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体の濃度に対する蛍光のレベルの依存性。 抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体の濃度に対する蛍光のレベルの依存性。 抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体の抗PD-L1活性。垂直軸は、抗体の添加を伴わないウェルの発光に対して、試験したaHTH-CD47/PD-L1抗体を含むウェルの発光比を示す。 抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体の凝集均一性を評価するためのゲル濾過プロファイル。
定義および一般的な方法
本明細書に別に定義しない限り、本発明と関連して用いる科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するであろう。
さらに、背景によって別に要求されない限り、単数形の用語には複数形が含まれるものとし、そして複数形の用語には単数形が含まれるものとする。典型的には、細胞培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、有機合成化学、医学および薬学的化学の分類および方法、ならびに本明細書に記載するタンパク質および核酸のハイブリダイゼーションおよび化学は、当業者によって周知であり、そして広く用いられている。酵素反応および精製法は、当該技術分野において一般的であるように、または本明細書に記載するように、製造者の指示にしたがって実行される。
抗体に関連する定義
PD-L1(プログラム細胞死リガンド1)はまた、表面抗原分類274(CD274)またはB7相同体1(B7-H1)としても知られる、40kDaの1型膜貫通タンパク質である。PD-L1は、以下のような3つのドメインからなる:IgVおよびC型ドメインとして示される細胞外ドメイン(220)、膜貫通ドメイン(21)および細胞内ドメイン(31)。該分子は、妊娠中、外来(foreign)組織の移植中、および特定の疾患、例えば肝炎において、免疫系を抑制する際に重要な役割を果たす。正常条件下では、自己抗原に反応して、特定の量の抗原特異的CD8+ Tエフェクター細胞がリンパ節および脾臓に集積し、自己免疫プロセスを防止するため、PD-1/PD-L1またはB7-1/PD-L1複合体が形成され、リンパ節におけるこれらのCD8+ T細胞の増殖を減少させる阻害性シグナルの伝達を生じる。したがって、PD-1/PD-L1相互作用は、免疫寛容の発展における重要な要因の1つである。
CD47は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する多数回膜貫通受容体であり、マクロファージ上のSIRPα(シグナル制御タンパク質α)と相互作用し、それによって食作用を抑制する。この経路が活性である癌細胞は、食作用を回避する。したがって、CD47に対する療法効果が、多様な癌において広く用いられる。CD47に対する抗体は、CD47およびSIRPαの間の相互作用を遮断する能力を有しうるが、この能力を持たない可能性もある。
用語「結合分子」には、抗体および免疫グロブリンが含まれる。
用語「抗体」または「免疫グロブリン」または「モノクローナル抗体」または「二重特
異性抗体」または「多重特異性抗体」(Ig)には、本明細書において、完全/全長抗体および任意の抗原結合断片(すなわち「抗原結合部分」)が含まれる。さらに、例えば、用語「抗体」または「免疫グロブリン」または「モノクローナル抗体」には、1つまたはそれより多い価および1つまたはそれより多い特異性を有する抗原結合断片、ならびに免疫グロブリンの定常領域の任意の組み合わせが含まれ、そしてこうした用語は、用語「二重特異性抗体」または「多重特異性抗体」と類似の意味を有しうる。さらに、例えば、用語「抗体」または「免疫グロブリン」または「モノクローナル抗体」には、任意の性質の任意のポリペプチドに共有結合または非共有結合した、抗原結合断片および免疫グロブリンの定常領域の任意の組み合わせが含まれる。さらに、用語「抗体」は、例えば、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を含む糖タンパク質、または抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書においてVHと略される)および重鎖定常領域を含む。哺乳動物Ig重鎖には、ギリシャ文字:α、δ、ε、γおよびμで示される5つのタイプが知られる。存在する重鎖のタイプは、抗体クラスを定義する:これらの鎖は、それぞれ、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM抗体に見られる。異なる重鎖はサイズおよび組成が異なり;αおよびγはおよそ450アミノ酸を含有する一方、μおよびεはおよそ550アミノ酸からなる。各重鎖は2つの領域、すなわち定常領域および可変領域を含有する。定常領域は、同じアイソタイプのすべての抗体で同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。重鎖γ、αおよびδは、3つの定常ドメインCH1、CH2およびCH3(一列に)で構成される、定常領域、ならびに柔軟性を付加するためのヒンジ領域を含有し(Woof J.,
Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99);重鎖μおよびεは、4つの定常ドメイン、CH1、CH2、CH3およびCH4で構成される定常領域を有する。哺乳動物において、ラムダ(λ)およびカッパ(κ)によって示される2つのタイプの軽鎖のみが知られる。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書においてVLと略される)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖のおよその長さは211~217アミノ酸である。好ましくは、軽鎖はカッパ(κ)軽鎖であり、そして定常ドメインCLは好ましくはCカッパ(κ)である。
本発明の「抗体」は、任意のクラス(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、好ましくはIgG)またはサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2、好ましくはIgG1)であってもよい。
VLおよびVH領域を、より保存される、フレームワーク領域(FR)と称される領域の間に散在する、相補性決定領域(CDR)と称される超可変性領域にさらに分けてもよい。各VHおよびVLは、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で位置する、3つのCDRおよび4つのFRで構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の多様な細胞(例えばエフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(C1q)を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を仲介しうる。
用語、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」(あるいは単に「抗体部分」または「抗体断片」)は、本明細書において、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の1つまたはそれより多い断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実行可能であることが示されてきている。用語、抗体の「抗原結合部分」内に含まれる結合断片の例には、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFab断片一価断片;(ii)ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結される2つのFab断片を含む二価断片であるF(ab’)2断片;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFd断片;(iv)抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片;(v)VH/VHHドメインからなるdAb断片(Wardら(1989)Nature
341:544-546);および(vi)抽出された相補性決定領域(CDR)が含まれる。さらに、Fv断片の2つの領域、VLおよびVHは、異なる遺伝子によってコードされており、VLおよびVH領域が対形成して一価分子を形成し、単一のタンパク質鎖を受け入れることが可能であるようにする合成リンカーを用いた組換え法を用いて、これらを連結してもよい(一本鎖Fv(scFv)として知られる;例えば、Birdら(1988)Science 242:423-426;およびHustonら(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい)。こうした一本鎖分子もまた、用語、抗体の「抗原結合部分」内に含まれると仮定される。こうした抗体断片は、当業者に知られる慣用法を用いて得られ、そしてこれらの断片は、損なわれていない(intact)抗体と同じ方式でスクリーニングされる。
好ましくは、本発明の抗原結合領域のCDRまたは全長抗体抗原結合領域は、マウス、ラマまたはヒトドナーライブラリーに由来するか、あるいは本質的に起源はヒトであり、特定の抗体の特性、例えばKD、koff、IC50、EC50、ED50を最適化するため、特定のアミノ酸残基が改変されている、例えば異なるアミノ酸残基で置換されている。好ましくは、本発明の抗体のフレームワーク領域はヒト起源であるかまたは実質的にヒト起源である(少なくとも80、85、90、95、96、97、98または99%ヒト起源)。
他の態様において、本発明の抗原結合部分は、マウス、ラマ、ウサギ、ラットまたはハムスターを含むがこれらに限定されない、他の非ヒト種に由来してもよい。あるいは、抗原結合領域は、ヒト種に由来してもよい。
用語「可変ドメイン」は、可変ドメインの特定の領域で、抗体間で配列が非常に異なる事実を指す。Vドメインは、抗原結合を仲介し、そしてその特定の抗原に関する特定の抗体の特異性を決定する。しかし、可変性は110アミノ酸の可変ドメインの部位上に、不均等に分布している。その代わり、V領域は、「超可変領域」またはCDRと称される超可変性のより短い領域によって分離される、15~30アミノ酸のフレームワーク領域(FR)と称される不変断片からなる。天然重鎖および軽鎖の各可変ドメインは、各々、4つのFRを含み、これらは主にベータシート配置を取り、ベータシート構造を連結し、そしてある場合はその一部を形成するループを形成する、3つの超可変領域によって連結される。各鎖中の超可変領域は、FRによってごく近接してともに保持され、そしてもう一方の鎖に由来する超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接は関与しないが、多様なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性(ADCC)における抗体の関与を示す。
用語「超可変領域」は、本明細書において、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般的に、「相補性決定領域」または「CDR」由来のアミノ酸残基および/または「超可変ループ」由来の残基を含む。
特定の場合、ターゲットエピトープに対する結合アフィニティを改善するため、1つまたはそれより多いCDRアミノ酸残基を改変することが望ましい可能性もまたある。これは、「アフィニティ成熟」として知られ、そして随意に、例えば抗体のヒト化が結合特異性またはアフィニティの減少を導き、そして復帰突然変異のみによっては結合特異性またはアフィニティを十分に改善することが不可能である状況において、ヒト化と関連して実行してもよい。多様なアフィニティ成熟法が当該技術分野に知られ、例えばBurksら, Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-17(1997)によって記載されるin vitroスキャニング飽和突然変異誘発、およびWuら,
Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042(199
8)によって提唱される段階的in vitroアフィニティ成熟がある。
「フレームワーク領域」(FR)は、CDR残基とは異なる可変ドメインの残基である。各可変ドメインは、典型的には、FR1、FR2、FR3およびFR4と同定される4つのFRを有する。CDRをKabatにしたがって定義した際、FR軽鎖残基は、およそ、残基1~23(LCFR1)、35~49(LCFR2)、57~88(LCFR3)、および98~107(LCFR4)に位置し、そして重鎖のFR残基は、重鎖中、およそ、残基1~30(HCFR1)、36~49(HCFR2)、66~94(HCFR3)、および103~113(HCFR4)の領域に位置する。CDRが超可変ループ由来のアミノ酸残基を含む場合、FR軽鎖残基は、軽鎖中、およそ、残基1~25(LCFR1)、33~49(LCFR2)、53~90(LCFR3)、および97~107(LCFR4)に位置し、そして重鎖FR残基は、重鎖残基中、ほぼ残基1~25(HCFR1)、33~52(HCFR2)、56~95(HCFR3)、および102~113(HCFR4)に位置する。CDRがKabatによって定義されるCDRおよび超可変ループのものの両方に由来するアミノ酸を含むいくつかの場合、FR残基は適宜調節されるであろう。例えば、CDRH1にアミノ酸H26~H35が含まれる場合、重鎖のFR1残基は1~25位であり、そしてFR2残基は36~49位である。
ターゲット抗原に「結合する」本発明の抗体は、十分なアフィニティで抗原に結合する抗体であり、したがって、該抗体は、タンパク質または細胞、あるいは抗原を発現する組織をターゲティングする際の診断剤および/または療法剤として用いてもよく、そして他のタンパク質とわずかに交差反応する。分析法:蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)、ラジオイムノアッセイ(RIA)またはELISAにしたがって、こうした態様において、非ターゲットタンパク質に対する抗体結合の度合いは、特異的ターゲットタンパク質への抗体結合の10%未満である。ターゲット分子への抗体の結合に関して、用語、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチドターゲット上のエピトープに対する「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」は、非特異的相互作用とは顕著に(測定可能に)異なる結合を意味する(例えばbH1-44またはbH1-81の場合、非特異的相互作用は、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ウシ胎児血清またはニュートラアビジンに対する結合である)。
例えば、対照分子の結合に比較した、分子の結合を決定することによって、特異的結合を測定してもよい。例えば、ターゲットに類似の別の分子との競合によって、例えば過剰な非標識ターゲットを伴い、特異的結合を決定してもよい。この場合、プローブに対する標識ターゲットの結合が、過剰な非標識ターゲットによって競合的に阻害された場合、特異的結合が示される。本明細書において、用語、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチドターゲット上のエピトープに対する「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」は、少なくとも約200nM、または少なくとも約150nM、または少なくとも約100nM、または少なくとも約60nM、または少なくとも約50nM、または少なくとも約40nM、または少なくとも約30nM、または少なくとも約20nM、または少なくとも約10nM、または少なくとも約8nM、または少なくとも約6nM、または少なくとも約4nM、または少なくとも約2nM、または少なくとも約1nM、またはそれよりも大きい、ターゲットに対するKdを有する分子によって特徴づけられうる。1つの態様において、用語「特異的結合」は、任意の他のポリペプチドまたはポリペプチド上のエピトープへの実質的な結合を伴わずに、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに分子が結合する場合の結合を指す。
用語「Ka」は、本明細書において、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を指す一方、用語「Kd」は、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を指すよう意図される。
「結合アフィニティ」は、一般的に、分子(例えば抗体)およびその結合パートナー(
例えば抗原)の単一の結合部位の間の累積非共有相互作用の強度を指す。別に示さない限り、「結合アフィニティ」は、結合対のメンバー(例えば抗体および抗原)間の1:1相互作用を反映する、本質的な(特性的な、真の)結合アフィニティを指す。分子Xのその結合パートナーYに対するアフィニティは、通常、解離定数(Kd)によって示されうる。好ましくは、Kd値は、およそ200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM、またはそれ未満である。本明細書に記載するものを含めて、当該技術分野に知られる一般的な方法によって、アフィニティを測定してもよい。低アフィニティ抗体は、一般的に、抗原にゆっくりと結合し、そして容易に解離する傾向がある一方、高アフィニティ抗体は、一般的に、抗原により迅速に結合し、そしてより長く結合したままである傾向がある。結合アフィニティを測定する多様な方法が当該技術分野に知られ、本発明の目的のために、これらの方法のいずれを用いてもよい。
本発明の1つの態様において、「Kd」または「Kd値」は、25℃、~10反応単位(RU)で、固定されたチップCM5抗原を伴い、BIAcoreTM-2000またはBIAcore(登録商標)-3000(BIAcore, Inc.、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を用いた表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5、BIAcore,
Inc.)を、製造者の指示にしたがって、N-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化する。抗原を、10mM酢酸ナトリウム、pH4.8で、5μg/ml(~0.2μM)の濃度まで希釈し、そして次いで、5μl/分の流速で注入して、結合タンパク質のおよそ10相対単位(RU)を達成する。抗原投与後、1Mエタノールアミン溶液を注入して、未反応基をブロッキングする。動力学測定のため、Fabの二重連続希釈(例えば0.78nM~500nM)を0.05%Tween 20(PBST)中、25℃、およそ25μl/分の流速で注入する。会合および解離センサグラムを同時に適合させることによって、単純1対1ラングミュア結合モデル(BIAcore評価ソフトウェアバージョン3.2)を用いて、オン速度(kon)およびオフ速度(koff)を計算する。平衡解離定数(Kd)を比koff/konとして計算する。例えばChen, Y.ら(1999)J. Mol. Biol. 293:865-881を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴法にしたがって、解離速度が10-1-1を超える場合、25℃で蛍光放出(励起=295nm;放出(照射)=340nM、16nmバンド)の強度の増加または減少を測定する、蛍光消光によって、これを決定してもよい。増加する濃度の抗原の存在下、PBS、pH7.2中、20nMの濃度での抗体抗原溶液(Fab型)を、分光光度計、例えば停止流分光光度計(Aviv Instruments)または攪拌キュベットを伴う分光光度計SLM-Aminco(Thermo Spectronic)シリーズ8000を用いて測定した。
用語「koff」は、結合分子および抗原の特定の相互作用の解離速度定数を指す。例えばOctetTM系を用いて、バイオレイヤー干渉法によって、koff解離速度定数を測定してもよい。
また、25℃、~10相対単位(反応単位、RU)で、固定されたCM5抗原を含むチップを用い、BIAcoreTM-2000またはBIAcore(登録商標)-3000(BIAcore, Inc.、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を用いた上記の表面プラズモン共鳴アッセイを用いることによって、本発明の「会合速度」(「オン速度」)または「kon」を測定してもよい。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5、BIAcore, Inc.)を、製造者の指示にしたがって、N-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化する。抗原を10mM酢
酸ナトリウム、pH4.8で、5μg/ml(~0.2μM)の濃度まで希釈し、そして次いで、5μl/分の流速で注入して、およそ10相対単位(RU)の結合タンパク質を達成する。抗原投与後、1Mエタノールアミン溶液を注入して、未反応基をブロッキングする。
別に明記しない限り、本発明のポリペプチドに関する用語、「生物学的に活性な」および「生物学的活性」および「生物学的特性」は、生物学的分子に結合する能力を有することを意味する。
表現「生物学的分子」は、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、およびその組み合わせを指す。本発明の1つの態様において、生物学的分子は天然に存在する。
慣用法、例えば全抗体のパパインまたはペプシン加水分解を用いて、全抗体から、抗体断片、例えばFabおよびF(ab’)2断片を得てもよい。さらに、例えば本明細書に記載するような標準的組換えDNA法を用いて、抗体、抗体の部分および免疫接着分子を得てもよい。
用語「組換え抗体」は、抗体をコードするヌクレオチド配列(単数または複数)を含む細胞または細胞株で発現される抗体を指すよう意図され、前記ヌクレオチド配列(単数または複数)は、天然には該細胞と関連していない。
用語「変異体抗体」は、本明細書において、親抗体の配列と比較した際、1つまたはそれより多いアミノ酸残基の付加、欠失および/または置換のために、その「親」抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する抗体を指す。本発明の好ましい態様において、変異体抗体は、親抗体に比較した際、アミノ酸の少なくとも1つまたはそれより多い(例えば1~12、例えば2、3、4、5、6、7、8または9、10、11または12;いくつかの態様において、変異体抗体は1~約10の)付加、欠失、および/または置換を含む。いくつかの態様において、こうした付加、欠失および/または置換は、変異体抗体のCDRで作製される。変異体抗体の配列に関する同一性および相同性は、本明細書において、配列を整列させ、そして配列同一性の最大パーセントを達成するために必要であればギャップを導入した後、親抗体のものと同一である、変異体抗体配列におけるアミノ酸残基の割合と定義される。変異体抗体は、親抗体が結合する、同じ抗原に、そして好ましくは同じエピトープに結合する能力を保持し;そしていくつかの態様において、少なくとも1つの特性または生物学的活性が、親抗体のものより優れている。例えば、変異体抗体は、例えば、親抗体に比較した際に、より顕著な結合アフィニティ、より長い半減期、より低いIC50、または抗原生物学的活性を阻害する能力の増進を有してもよい。本文書において、特に関心が持たれるのは、親抗体の生物学的活性の少なくとも2倍(好ましくは少なくとも5倍、10倍または20倍)より高い生物学的活性を示す変異体抗体である。
用語「二重特異性抗体」は、1つの生物学的分子上の2つの異なるエピトープと特異的に結合することが可能であるか、または2つの異なる生物学的分子上のエピトープと特異的に結合することが可能である、抗原結合ドメイン(単数または複数)を含有する抗体を意味する。二重特異性抗体はまた、本明細書において、「二重特異性」を有するかまたは「二重特異性」抗体であると称される。
広い意味で、用語「キメラ抗体」は、1つの抗体の1つまたはそれより多い領域、および1つまたはいくつかの他の抗体の1つまたはそれより多い領域を含む抗体、典型的には部分的にヒトおよび部分的に非ヒトである抗体、すなわち部分的に非ヒト動物、例えばマウス、ラットもしくは同様の害獣(vermin)、またはラクダ科(Camelidae)、例えばラマおよびアルパカ由来である、抗体を指す。ヒト・アンチ抗体免疫反応、
例えばネズミ抗体の場合のヒト抗マウス抗体免疫反応のリスクを減少させるため、一般的に、非ヒト抗体よりもキメラ抗体が好ましい。典型的なキメラ抗体の例は、可変領域配列がネズミ配列である一方、定常領域配列がヒトであるものである。キメラ抗体の場合、非ヒト部分をさらに修飾して、抗体をヒト化してもよい。
用語「ヒト化」は、抗体が、完全にまたは部分的に非ヒト起源を有する、例えばそれぞれ、マウスまたはラマを関心対象の抗原で免疫することによって得たマウスまたはラマ抗体であるか、あるいはこうしたマウスまたはラマの抗体などに基づくキメラ抗体である場合、ヒトにおいて免疫反応を回避するかまたは最小限にするため、特定のアミノ酸、特に重鎖および軽鎖のフレームワーク領域および定常ドメイン中の特定のアミノ酸を置換することが可能である事実を指す。ターゲット抗原との抗体相互作用の特異性は、主に、6つの重鎖および軽鎖CDRに位置するアミノ酸残基を通じる。このため、CDR内のアミノ酸配列は、CDRの外のものよりも、個々の抗体間ではるかにより多様である。該部位のCDR配列は、抗体-抗原相互作用の大部分に関与するため、特異的天然抗体、またはより一般的には、所定のアミノ酸配列を含む特異的抗体の特性を模倣する組換え抗体を、例えば特異的抗体の区画(plots)のCDR配列、および別の抗体のフレームワーク配列を発現する発現ベクターを構築することによって、発現してもよい。その結果、非ヒト抗体を「ヒト化」し、そして大部分、最初の抗体の結合特異性およびアフィニティを保持することが可能である。免疫原性を、そしてしたがって特定の抗体のヒト・アンチ抗体反応を正確に予測することは不可能であるが、非ヒト抗体は、典型的にはヒト抗体よりもより免疫原性である。外来性(例えば害獣またはラクダ科)定常領域がヒト起源の配列で置換されているキメラ抗体は、一般的に、完全に外来性起源である抗体よりも、より低い免疫原性を示し、そして療法抗体においては、ヒト化または完全ヒト抗体を用いる傾向がある。したがって、非ヒト起源のキメラ抗体または他の抗体をヒト化して、ヒト・アンチ抗体反応のリスクを減少させてもよい。
キメラ抗体に関して、ヒト化は、典型的には、可変領域配列のフレームワーク領域の修飾を伴う。相補性決定領域(CDR)の一部であるアミノ酸残基は、ほとんどの場合、ヒト化のために修飾はされないが、いくつかの場合、CDRの個々のアミノ酸残基を修飾するため、例えばグリコシル化部位、脱アミド化部位、アスパラギン酸異性化部位、あるいは望ましくないシステインまたはメチオニン残基を除去するため、修飾が望ましい可能性もある。トリペプチド配列Asn-X-SerまたはAsn-X-Thr、式中、XはPro以外の任意のアミノ酸であってもよい、におけるアスパラギン残基にオリゴ糖鎖が付着することによって、N連結グリコシル化が起こる。AsnまたはSer/Thr残基のいずれかを別の残基で、好ましくは保存的置換によって、突然変異させることによって、N-グリコシル化部位の除去を達成してもよい。アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、pHおよび表面曝露などの要因に応じて起こりうる。アスパラギン残基は、特にAsn-Gly配列中に存在する場合、脱アミド化を特に受けやすく、そして他のジペプチド配列、例えばAsn-Ala中ではこの度合いがより低い。こうした脱アミド化領域、例えばCDR領域の配列中のAsn-Glyの存在下では、この領域を、概して、関与する残基の1つを除去する保存的置換によって、除去することが好ましい可能性もある。
抗体配列をヒト化するための多くの方法が当該技術分野に知られる。1つの一般的に用いられる方法は、CDR部位移植である。CDR移植は、Kabat CDR定義に基づいてもよいが、最終版(Magdelaine-Beuzelinら, Crit Rev.Oncol Hematol. 64:210 225 (2007))は、IMGT(登録商標)(international ImMunoGeneTics information system(登録商標)、www.imgt.org)定義が、ヒト化結果をより改善しうることを示唆する(Lefrancら, Dev. Comp
Immunol. 27:55-77 (2003)を参照されたい)。いくつかの場合、CDR移植は、CDRを得た親抗体に比較した際、CDR移植非ヒト抗体の結合特異性およびアフィニティを、そしてしたがって生物学的活性を減少させることが可能である。親抗体の結合特異性およびアフィニティを回復させるため、CDR移植抗体の選択される位置、典型的にはフレームワーク領域において、復帰突然変異(時に「フレームワーク領域修復」と称される)を用いてもよい。文献および抗体データベースにおいて入手可能な情報を用いて、ありうる復帰突然変異のための位置の決定を行ってもよい。復帰突然変異の候補であるアミノ酸残基は、通常、抗体分子の表面上に位置する一方、包埋されたまたは表面曝露の度合いが低い残基は、通常、改変されないであろう。CDR部位移植および復帰突然変異に代わるヒト化法は、非ヒト起源の曝露されない残基(remain)が保持される一方、表面上に曝露される残基がヒト残基に改変される表面変化である。
完全ヒト抗体を産生するための2つの技術がある:in vitro収集ファージライブラリーを用いるものまたはヒト化動物(マウス、ラット等)の免疫によるものである。
ファージディスプレイは、最初に用いられ、そして最も広く用いられているin vitro抗体検索技術である。1985年、Smithは、外来DNA配列を糸状バクテリオファージM13内にクローニングすることが可能であり、そしてこうしてクローニングされた配列を、融合タンパク質として、ファージ粒子表面上に発現させることが可能であることを見出した(Smith GP: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228:1315-1317.)。したがって、他のタンパク質に結合する能力に基づいて、関心対象の融合タンパク質を選択することが可能である。この発見は、PCR増幅法と組み合わされ、これによって、免疫グロブリン遺伝子のcDNAレパートリーをクローニングして、可変ドメインを含有する多様なファージライブラリーを生成することが可能となり、これを用いて、ターゲット特異的モノクローナル抗体を迅速に検索することが可能になった。ファージライブラリーレパートリーは、ライブラリーを生成するためにその血液を用いた各ヒトまたは動物のB細胞抗体のレパートリーを反映する。1995年、2つの論文が、ハイブリドーマ技術によって産生されたものに匹敵しうる、完全ヒト抗体レパートリーを発現する遺伝子操作マウスの生成を報告した(Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JGら: Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368:856-859)。これらの動物において、それ自体の内因性重鎖およびκ軽鎖免疫グロブリン鎖遺伝子は、意図的に破壊され、その後、ヒト重鎖およびκ軽鎖遺伝子のセグメントである導入遺伝子が導入された。マウス免疫系がヒト遺伝子レパートリーを用いて、より多様な抗原に対する、高特異性および高アフィニティ抗体を産生することが可能であることが分かった。トランスジェニックマウスは、マウスおよびヒト構成要素の本質的なハイブリッドである(ヒト免疫グロブリン、マウスIgα、Igβおよび他のシグナル伝達分子)B細胞受容体を発現したが、そのB細胞は正常に発生し、そして成熟する。
特定の場合、ターゲットエピトープに対する結合アフィニティを改善するため、1つまたはそれより多いCDRアミノ酸残基を改変することが好ましい可能性もまたある。これは、「アフィニティ成熟」として知られ、そして随意に、例えば抗体のヒト化が結合特異性またはアフィニティの減少を導き、そして復帰突然変異のみによっては結合特異性またはアフィニティを十分に改善することが不可能である状況において、ヒト化と関連して実行してもよい。多様なアフィニティ成熟法が当該技術分野に知られ、例えばBurksら
, Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-17(1997)によるin vitroスキャニング飽和突然変異誘発、およびWuら, Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042(1998)による段階的in vitroアフィニティ成熟がある。
用語「モノクローナル抗体」または「mAb」は、細胞の別個のクローン集団によって合成され、そして単離された抗体を指す。クローン集団は、不死化細胞のクローン集団であってもよい。いくつかの態様において、クローン集団中の不死化細胞は、典型的には免疫動物由来の個々のBリンパ球とリンパ球性腫瘍由来の個々の細胞との融合によって産生されるハイブリッド細胞、ハイブリドーマである。ハイブリドーマは構築された細胞のタイプであり、そして天然には存在しない。
「天然抗体」は、通常、2つの同一の軽(L)鎖および2つの同一の重(H)鎖からなる、およそ150,000ダルトンの分子量を持つヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、1つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結される一方、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間では、ジスルフィド連結の数が異なる。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔を空けた鎖間ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン(VH)を、その後、いくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(VL)を、そしてもう一端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと整列され、そして軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。
本明細書において多様な抗体を記載するために用いる用語、「単離された」は、抗体が発現された細胞または細胞培養から同定され、そして分離され、ならびに/あるいは、再生されている抗体を指す。天然環境由来の不純物(混入構成要素)は、ポリペプチドの診断的または療法的使用に干渉するであろう物質であり、そしてこれには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれうる。好ましい態様において、(1)スピニングカップ配列決定装置(Edman配列決定装置)の使用によって、N末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るために十分な度合いまで、あるいは(2)クーマシー・ブリリアント・ブルーまたは好ましくは銀染色を用い、非還元または還元条件下で、SDS-PAGEによって均質である度合いまで、抗体を精製する。ポリペプチドの天然環境の少なくとも1つの構成要素が存在しないであろうため、単離抗体には、組換え細胞内のin situの抗体が含まれる。単離ポリペプチドは、典型的には、少なくとも1つの精製工程によって得られる。
「単離」核酸分子は、抗体核酸の天然供給源において結合している、少なくとも1つの核酸分子不純物から同定されそして分離されているものである。単離核酸分子は、天然条件下で見出される型またはセットとは異なる。したがって、単離核酸分子は、天然条件下の細胞中に存在する核酸分子とは異なる。しかし、例えば核酸分子が天然条件下での細胞における位置とは異なる染色体局在を有する場合、単離核酸分子には、抗体が通常発現される細胞に位置する核酸が含まれる。
用語「エピトープ」は、本明細書において、結合分子(例えば抗体または関連分子、例えば二重特異性結合分子)に特異的に結合する抗原の部分(決定基)を指す。エピトープ決定基は、通常、分子の化学的に活性である表面群、例えばアミノ酸または炭水化物または糖側鎖からなり、そして典型的には、特定の三次元構造特性、ならびに特異的電荷特性を含む。エピトープは、「直鎖」または「コンホメーション性」のいずれかであってもよい。直鎖エピトープにおいては、タンパク質(例えば抗原)および相互作用分子(例えば抗体)の間の相互作用点のすべては、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線形に存在
する。コンホメーションエピトープにおいては、相互作用点は、一次アミノ酸配列において互いに分離されているタンパク質上のアミノ酸残基に渡って存在する。抗原の望ましいエピトープが決定されている場合、当該技術分野に周知の技術を用いて、このエピトープに対する抗体を生成してもよい。さらに、抗体または他の結合分子の生成および特徴づけは、望ましいエピトープに関する情報を解明しうる。この情報に基づいて、次いで、例えば抗原に対する結合に関して競合する結合分子を発見する競合研究を実行することによって、同じまたは類似のエピトープに結合する結合分子を競合的にスクリーニングしてもよい。
用語「ペプチドリンカー」は、本明細書において、互いに結合するドメインに応じた長さを持ち、そして任意のアミノ酸配列を含む、ドメインを連結する能力を有する任意のペプチドを意味するよう意図される。好ましくは、ペプチドリンカーは、5アミノ酸より多い長さを有し、そしてG、A、S、P、E、T、D、Kより選択されるアミノ酸の任意のセットからなる。
用語「in vitro」は、人工的な条件でモデリングされる、体の外での、生物学的物体、生物学的プロセス、または生物学的反応を指す。例えば、in vitroで増殖した細胞は、体の外の環境で、例えば試験管、培養バイアル、またはマイクロタイタープレート中で増殖した細胞と理解されるものとする。
用語「IC50」(50%阻害濃度)は、測定可能な活性または反応、例えば腫瘍細胞などの細胞の成長/増殖を、50%阻害する薬剤濃度を指す。適切な用量-反応曲線を用い、曲線適合のための特別な統計ソフトウェアを用いて、IC50値を計算してもよい。
用語GI 50(50%増殖阻害)は、腫瘍細胞などの細胞の増殖を50%阻害する薬剤濃度を指す。
用語「ED50」(EC50)(50%有効用量/濃度)は、50%の生物学的影響(細胞傷害性も含まれうる)を生じる薬剤濃度を指す。
用語、抗体の「エフェクター機能」は、抗体のFc領域(天然Fc領域配列またはFc領域アミノ酸変異体)に寄与しうる生物学的活性を指すか、または抗体アイソタイプで多様である。抗体エフェクター機能の例には:C1結合および補体依存性細胞傷害性;Fc受容体結合;抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性(ADCC);食作用;細胞表面受容体(例えばB細胞受容体、BCR)の下方制御およびB細胞活性化が含まれる。
「抗体依存性細胞傷害性」または「ADCC」は、Fc受容体(FcR)を発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)が、ターゲット細胞上に結合した抗体を認識し、そして続いてターゲット細胞の溶解を引き起こす、細胞仲介性反応を指す。ADCCを仲介する主な細胞、NK細胞は、FcγRIIIのみを発現する一方、単球は、FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcR発現は、RavetchおよびKinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92(1991)の464ページの表3に要約される。関心対象の分子のADCC活性を評価するため、in vitro ADCCアッセイ、例えば米国特許第5,500,362号または第5,821,337号に記載されるアッセイを実行してもよい。こうしたアッセイに適用可能なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。あるいはまたはさらに、関心対象の分子のADCC活性を、in vivoで、例えばClynesら PNAS(USA)95:652-656(1998)に開示されるものなどの動物モデルにおいて、評価してもよい。
「ヒトエフェクター細胞」は、1つまたはそれより多いFcRを発現し、そしてエフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、該細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、そしてADCCエフェクター機能を実行する。ADCCを仲介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞傷害性T細胞および好中球が含まれ;PBMCおよびNK細胞が好ましい。エフェクター細胞を、その天然供給源から、例えば本明細書に記載するように、血液またはPBMCから単離してもよい。
用語「Fc受容体」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体を記載するよう用いられる。好ましいFcRは、天然配列ヒトFcRである。さらに、好ましいFcRは、IgG抗体(ガンマ受容体)に結合するものであり、そしてこれには、FcγRI、FcγRII(FcγRIIaおよびFcγRIIb)、およびFcγRIII(FcγRIIIaおよびFcγRIIIb)サブクラスの受容体が含まれ、これらの受容体のアレル変異体および選択的スプライシング型が含まれる。FcγRIは、IgGに高アフィニティを示す一方、FcγRIIおよびFcγRIIIは低アフィニティを示す。FcγRIIaおよびFcγRIIIaは、それぞれ、単球/マクロファージおよび単球/マクロファージ/ナチュラルキラー細胞上に発現される、活性化FcγRであり、そしてヒトターゲット細胞の細胞傷害性を誘発可能である。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ(ITAM)を含有する。阻害性受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ(ITIM)を含有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)の概説を参照されたい)。FcRは、RavetchおよびKinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)に概説される。将来同定されるであろうものを含む他のFcRが、本明細書の用語「FcR」に含まれる。該用語にはまた、新生受容体FcRnが含まれ、該受容体は、胎児への母性IgGのトランスファーに関与する。
「補体依存性細胞傷害性」または「CDC」は、分子が、補体の存在下でターゲットを溶解させる能力を指す。補体活性化経路は、同族(cognate)抗原と複合体化した分子(例えば抗体)への補体系の第一成分(C1q)の結合によって開始される。補体活性化を評価するため、例えばGazzano-Santoroら, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)に記載されるようなCDCアッセイを実行してもよい。
用語「同一性」または「相同性」は、配列を整列させ、そして全配列に関する最大パーセント同一性を達成するために必要であればギャップを導入した後、そして配列同一性の一部として、いかなる保存的置換も考慮せずに、比較しようとする対応する配列の残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合を意味すると見なされる。NまたはC末端伸長または挿入はいずれも、同一性または相同性を減少させるとは見なされないであろう。整列のための方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野に周知である。配列分析ソフトウェア(例えば配列分析ソフトウェアパッケージ、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705)を用いて、配列同一性を測定してもよい。このソフトウェアは、多様な置換、欠失(除去)、および他の修飾に対して、ある度合いの相同性を割り当てることによって、類似の配列をマッチさせる。
抗体のポリペプチド配列に関する用語「相同」は、ポリペプチド配列に対して、少なくとも70%、好ましくは80%、より好ましくは90%、そして最も好ましくは95%の配列同一性を示す抗体と見なされなければならない。核酸配列に関する該用語は、核酸配
列に対して、少なくとも85%、好ましくは90%、より好ましくは95%そして最も好ましくは97%の配列同一性を示すヌクレオチド配列と見なされなければならない。
本刊行物に記載される抗体のアミノ酸配列の提唱される修飾(単数または複数)。例えば、抗体の結合アフィニティおよび/または他の生物学的特性を改善することが望ましい可能性もある。適切なヌクレオチド変化を抗体核酸内に導入することによって、またはペプチド合成によって、抗体のアミノ酸配列変異体を調製する。こうした修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および/または挿入および/または置換が含まれる。最終構築物が望ましい特性を所持するという条件で、欠失、挿入および置換の任意の組み合わせを行って、最終構築物に到達する。アミノ酸変化はまた、抗体の翻訳後プロセスを改変してもよく、例えばグリコシル化部位の数または位置を変えてもよい。
アミノ酸置換を用いた抗体のアミノ酸配列の修飾の変異体。こうした変異体は、抗体分子における少なくとも1つのアミノ酸残基の異なる残基での置換である。置換性突然変異誘発に関して最も関心が持たれる部位には、超可変領域またはCDRが含まれるが、FRまたはFc改変もまた意図される。保存的置換を表Aにおいて「好ましい置換」以下に示す。こうした置換が生物学的活性の変化を導くならば、表Aにおいて「例示的置換」と称される、さらなる有意な変化、またはアミノ酸のクラスを記載する際に以下にさらに記載する変化を導入してもよく、そして産物をスクリーニングしてもよい。
Figure 2023130455000001
用語「核酸」、「核配列(nucleic sequence)」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、本説明において交換可能に用いられ、修飾されているかまたはされていないヌクレオチドの正確な配列を意味し、核酸の断片または領域を決定し、非天然ヌクレオチドを含有するかまたは含有せず、そして二本鎖DNAまたはRNA、一本鎖DNAまたはRNA、あるいは前記DNAの転写産物のいずれかである。
本発明が天然染色体環境にある、すなわち天然状態にあるヌクレオチド配列と関連しないこともまた、本明細書に含まれなければならない。本発明の配列は、単離され、および/または精製されており、すなわちこれらは、例えばコピーによって、直接または間接的にサンプリングされ、その環境は少なくとも部分的に修飾されている。したがって、組換え遺伝学によって、例えば宿主細胞によって得られるか、または化学合成によって得られる単離核酸もまた、本明細書に言及されなければならない。
ヌクレオチド配列に対する言及は、別に明記しない限り、その相補体を含む。したがって、特定の配列を有する核酸への言及は、その相補配列とともに、その相補鎖を含むものと理解されなければならない。
表現「制御配列」は、特定の宿主生物における、機能的に関連するコード配列の発現のために必要なDNA配列を指す。原核生物に適切な制御配列には、例えば、プロモーター、随意にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られる。
核酸は、別の核酸配列と機能的関連に置かれた際、「機能可能であるように連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダー配列のDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されている場合、ポリペプチドに関するDNAに機能可能であるように連結されており;プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能可能であるように連結されており;リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に機能可能であるように連結されている。一般的に、「機能可能であるように連結されている」は、連結されているDNA配列が隣接しており、そして分泌リーダーの場合、隣接しそして読み枠中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。
用語「ベクター」は、本明細書において、連結されている別の核酸を輸送可能な核酸分子を意味する。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミド、すなわち、その中にさらなるDNAセグメントを連結可能なDNAの環状二本鎖片である。いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターであり、ここで、さらなるDNAセグメントをウイルスゲノム内に連結してもよい。いくつかの態様において、ベクターは、導入される宿主細胞において自律複製可能である(例えば複製の細菌起点部位を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。さらなる態様において、ベクター(例えば非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞内への導入に際して、宿主細胞のゲノム内に組み込まれてもよく、そしてそれによって宿主遺伝子とともに複製される。さらに、特定のベクターは、機能可能であるように連結されている遺伝子の発現を指示することが可能である。こうしたベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と称される。
用語「組換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)は、本明細書において、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指すよう意図される。本発明は、宿主細胞に関し、これには、例えば、上述の本発明のベクターが含まれうる。本発明はまた、例えば、本発明の結合分子の第一の結合ドメインおよび/または第二の結合ドメインの、重鎖をコードするヌクレオチド配列またはその抗原結合部分、あるいは軽鎖コードヌクレオチド配列またはその抗原結合部分、あるいはその両方を含む、宿主細胞にも関する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」が、特定の対象細胞だけでなく、こうした細胞の子孫もまた指すよう意図されることを理解しなければならない。突然変異または環境の影響のいずれかにより、続く世代で修飾が生じうるため、こうした子孫は、実際、親細胞と同一でない可能性もあるが、こうした細胞はなお、本明細書において、用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
用語「賦形剤」は、本明細書において、本発明の化合物(単数または複数)と異なる任意の成分を記載する。
「薬学的組成物」は、本発明の抗体、ならびに薬学的に許容されうるそして薬理学的に適合する充填剤、溶媒、希釈剤、キャリアー、補助剤、分配(distributing)剤および検出(sensing)剤、送達剤、例えば保存剤、安定化剤、充填剤、崩壊
剤、保湿剤(moistener)、乳化剤、懸濁剤、増粘剤、甘味料、フレーバー剤、芳香剤、抗細菌剤、殺真菌剤、潤滑剤、および持続送達制御剤を含む群より選択される構成要素の少なくとも1つを含む組成物を指し、これらの選択および適切な比率は、投与および投薬のタイプおよび方法に応じる。適切な懸濁剤の例は、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエテン、ソルビトールおよびソルビトールエーテル、結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム(aluminum metahydroxide)、ベントナイト、寒天およびトラガカントならびにまたその混合物である。多様な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、ソルビン酸、および類似の化合物によって、微生物の作用に対する防御を提供してもよい。組成物はまた、等張剤、例えば糖、ポリオール、塩化ナトリウム等も含有してもよい。活性成分の吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンによって、組成物作用の延長を達成してもよい。適切なキャリアー、溶媒、希釈剤および送達剤の例には、注射のための水、エタノール、ポリアルコールおよびその混合物、天然油(例えばオリーブ油)および有機エステル(例えばオレイン酸エチル)が含まれる。充填剤の例は、ラクトース、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等である。崩壊剤および分配剤の例は、デンプン、アルギン酸およびその塩、ケイ酸塩である。適切な潤滑剤の例は、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルクおよび高分子量のポリエチレングリコールである。活性成分の単独のまたは別の活性化合物と組み合わせた、経口、舌下、経皮、眼内、筋内、静脈内、皮下、局所または直腸投与のための薬学的組成物を、標準投与型で、伝統的な薬学的キャリアーと混合して、ヒトおよび動物に投与してもよい。適切な標準投与型には、経口型、例えば錠剤、ゼラチンカプセル、丸剤、粉末、顆粒、チューインガムおよび経口溶液または懸濁物;舌下およびバッカル経由(transbuccal)投与型;エアロゾル;移植物;局所、経皮、皮下、筋内、静脈内、鼻内または眼内型および直腸投与型が含まれる。
「医薬品」は、ヒトおよび動物における生理学的機能の回復、改善または修飾のために、そして疾患の治療および予防のために、診断、麻酔、避妊、美容術およびその他のために意図される錠剤、カプセル、溶液、軟膏および他の既製型(ready forms)の化合物(または薬学的組成物のような化合物の混合物)である。
用語「CD47およびPD-L1によって仲介される疾患または障害」は、疾患または障害の病因、発展、進行、持続または病理を含む、直接または間接的のいずれかでCD47およびPD-L1と関連するすべての疾患または障害を意味する。「治療する」、「治療している」および「治療」は、生物学的障害および/またはその付随する症状の少なくとも1つを軽減するかまたは無効にする方法を指す。本明細書において、疾患、障害または状態を「軽減する」ことは、疾患、障害、または状態の症状の重症度および/または発生頻度を減少させることを意味する。さらに、本明細書において、「治療」に対する言及には、根治的、緩和的および予防的治療に対する言及が含まれる。
1つの側面において、治療の被験体または患者は、哺乳動物、好ましくはヒト被験体である。前記被験体は、任意の年齢の男性または女性いずれであってもよい。
用語「障害」は、本発明の化合物での治療から利益を得るであろう任意の状態を意味する。この用語の定義には、慢性および急性障害または疾患が含まれ、この侵害の発生に対する哺乳動物の素因を引き起こす病的状態が含まれる。本発明にしたがって治療すべき好ましい障害は癌である。
用語「癌」および「癌性」は、典型的には細胞の制御されない成長/増殖によって特徴づけられる、哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは生理学的状態を記載する。該定義は、良性および悪性癌性疾患の両方を含む。癌性疾患の例には、限定されるわけではないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が含まれる。こうした癌性疾患のよ
り具体的な例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎癌、前立腺癌、膣癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、および多様な頭頸部癌が含まれる。
用語「免疫反応」、「自己免疫反応」および「自己免疫炎症」は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食作用細胞、顆粒球および前記細胞または肝細胞によって産生される可溶性巨大分子(侵襲性病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌細胞あるいは自己免疫または病的炎症の場合、人体由来の正常細胞または組織の選択的損傷、破壊または除去の結果産生される、抗体、サイトカインおよび補体を含む)の作用を指す。
「療法的有効量」は、ある程度の度合いまで、治療中の障害の症状の1つまたはそれより多くを軽減するであろう、投与される療法剤の量を指すよう意図される。
用語「慢性」使用は、長期間、最初の療法効果(活性)を維持するような、投与の急性(短期)経路とは対照的な、剤(単数または複数)の連続(連続)使用を指す。
「断続性」使用は、中断なしに持続しては実行されず、事実上、むしろ周期的である、治療を指す。
本明細書において、単語「含む(comprise)」、「有する(have)」、「含まれる(include)」または変形、例えば「含む(comprises)」、「含んでいる(comprising)」、「有する(has)」、「有している(having)」、「含まれる(includes)」または「含まれている(including)」およびそのすべての文法的変形は、言及する整数または整数群の包含を示すと理解されるが、いかなる他の整数または整数群の排除も意図しない。
発明の詳細な説明
抗体
本発明は、CD47およびPD-L1に結合する抗体に関する。
本発明の1つの態様において、抗体は全長抗体またはその抗原結合断片である。
本発明の1つの態様において、本発明の抗体には、PD-L1に対する1つまたは2つの結合部位が含まれる。
本発明の1つの態様において、CD47に対する結合部位は、CD47受容体およびSIRPαリガンドの間の相互作用を阻害し、ならびに/あるいは、PD-L1に対する結合部位は、PD-L1とPD-1受容体の相互作用を阻害する。
1つの態様において、本発明は、CD47およびPD-L1に結合し、そして:
(a)以下の配列番号1~4の群より選択される配列に少なくとも80%または90%相同であるかまたは同一である、すなわちCDR1が以下の配列番号1~4の群より選択される配列であるか、あるいは1つまたは2つの置換を伴う、以下の配列番号1~4の群より選択される配列である、アミノ酸配列を含むCDR1;
(b)以下の配列番号6~15の群より選択される配列に少なくとも80%、84%、86%、88%、92%または96%相同であるかまたは同一である、すなわちCDR2が配列番号6~15の配列であるか、あるいは1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの置換を伴う、以下の配列番号6~15の群より選択される配列である、アミノ酸配列を含むCDR2;
(c)以下の配列番号17~20の群より選択される配列に少なくとも80%、85%、86%、90%、93%または95%相同であるかまたは同一である、すなわちCDR
3が以下の配列番号17~20の群より選択される配列であるか、あるいは1つ、2つまたは3つの置換を伴う、以下の配列番号17~20の群より選択される配列である、アミノ酸配列を含むCDR3
を含有する、重鎖可変領域を含む、CD47に対する結合部位を含む、抗体に関する。
1つの態様において、本発明は、CD47およびPD-L1に結合し、そして:
(d)以下の配列番号1~4の群より選択される配列に同一であるアミノ酸配列を含むCDR1;
(e)以下の配列番号6~15の群より選択される配列に同一であるアミノ酸配列を含むCDR2;
(f)以下の配列番号17~20の群より選択される配列に同一であるアミノ酸配列を含むCDR3
を含有する、重鎖可変領域を含む、CD47に対する結合部位を含む、抗体に関する。
1つの態様において、本発明は、CD47およびPD-L1に結合し、そして:
(a)
(i)配列番号1~4の群より選択される配列に少なくとも80%または90%相同であるかまたは同一である、すなわちCDR1が配列番号1~4の群より選択される配列であるか、あるいは1つまたは2つの置換を伴う、配列番号1~4の群より選択される配列である、アミノ酸配列を含むCDR1;
(ii)配列番号6~15の群より選択される配列に少なくとも80%、84%、86%、88%、92%または96%相同であるかまたは同一である、すなわちCDR2が配列番号6~15の配列であるか、あるいは1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの置換を伴う、配列番号6~15の群より選択される配列である、アミノ酸配列を含むCDR2;
(iii)配列番号17~20の群より選択される配列に少なくとも80%、85%、86%、90%、93%または95%相同であるかまたは同一である、すなわちCDR3が配列番号17~20の群より選択される配列であるか、あるいは1つ、2つまたは3つの置換を伴う、配列番号17~20の群より選択される配列である、アミノ酸配列を含むCDR3
を含む重鎖可変領域;ならびに
(b)
(i)配列番号22~34の群より選択される配列に少なくとも80%または90%相同であるかまたは同一である、すなわちCDR1が配列番号22~34の群より選択される配列であるか、あるいは1つまたは2つの置換を伴う、配列番号22~34の群より選択される配列である、アミノ酸配列を含むCDR1;
(ii)配列番号36~48の群より選択される配列に少なくとも80%、87%または94%相同であるかまたは同一である、すなわちCDR2が配列番号36~48の群より選択される配列であるか、あるいは1つ、2つまたは3つの置換を伴う、配列番号36~48の群より選択される配列である、アミノ酸配列を含むCDR2;
(iii)配列番号50~64の群より選択される配列に少なくとも80%または90%相同であるかまたは同一である、すなわちCDR3が配列番号50~64の群より選択される配列であるか、あるいは1つまたは2つの置換を伴う、配列番号50~64の群より選択される配列である、アミノ酸配列を含むCDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、CD47に対する結合部位を含む、抗体に関する。
1つの態様において、本発明は、CD47およびPD-L1に結合し、そして:
(a)
(i)配列番号1~4の群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR1、
(ii)配列番号6~15の群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR2、
(iii)配列番号17~20の群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
(b)
(i)配列番号22~34の群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR1、
(ii)配列番号36~48の群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR2、
(iii)配列番号50~64の群より選択されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、CD47に対する結合部位を含む、抗体に関する。
1つの態様において、本発明は、CD47およびPD-L1に結合し、そして:
(a)配列番号66~88の群より選択される配列に、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%相同であるかまたは同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号89~106の群より選択される配列に、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%相同であるかまたは同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、CD47に対する結合部位を含む、抗体に関する。
1つの態様において、本発明は、CD47およびPD-L1に結合し、そして:
(a)配列番号66~88の群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号89~106の群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、CD47に対する結合部位を含む、抗体に関する。
1つの態様において、本発明は、CD47およびPD-L1に結合し、そして:
(a)
(i)配列番号5の配列に少なくとも80%相同であるかまたは同一である、すなわちCDR1が配列番号5の配列であるか、または1つの置換を伴う、配列番号5の配列である、アミノ酸配列を含むCDR1;
(ii)配列番号16の配列に少なくとも80%、86%、または92%相同であるかまたは同一である、すなわちCDR2が配列番号16の配列であるか、あるいは1つ、2つまたは3つの置換を伴う、配列番号16の配列である、アミノ酸配列を含むCDR2;
(iii)配列番号21の配列に少なくとも80%または90%相同であるかまたは同一である、すなわちCDR3が配列番号21の配列であるか、あるいは1つまたは2つの置換を伴う、配列番号21の配列である、アミノ酸配列を含むCDR3
を含む軽鎖可変領域、ならびに
(b)
(i)配列番号35の配列に少なくとも80%、86%、または83%相同であるかまたは同一である、すなわちCDR1が配列番号35の配列であるか、あるいは1つ、2つまたは3つの置換を伴う、配列番号35の配列である、アミノ酸配列を含むCDR1;
(ii)配列番号49の配列に少なくとも80%相同であるかまたは同一である、すなわちCDR2が配列番号49の配列であるか、または1つの置換を伴う、配列番号49の配列である、アミノ酸配列を含むCDR2;
(iii)配列番号65の配列に少なくとも80%または90%相同であるかまたは同一である、すなわちCDR3が配列番号65の配列であるか、あるいは1つまたは2つの置換を伴う、配列番号65の配列である、アミノ酸配列を含むCDR3
を含む可変領域
を含む、PD-L1に対する結合部位を含む、抗体に関する。
1つの態様において、本発明は、CD47およびPD-L1に結合し、そして:
(a)
(i)配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR1、
(ii)配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR2、
(iii)配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
(b)
(i)配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR1、
(ii)配列番号49のアミノ酸配列を含むCDR2、
(iii)配列番号65のアミノ酸配列を含むCDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、PD-L1に対する結合部位を含む、抗体に関する。
1つの態様において、本発明は、CD47およびPD-L1に結合し、そしてCD47に対する結合部位がFab、scFv、scFab、あるいは単離VHまたはVHHモノドメインであることで特徴づけられる、抗体に関する。
1つの態様において、本発明は、CD47およびPD-L1に結合し、そしてPD-L1に対する結合部位がFab、scFv、scFab、あるいは単離VHまたはVHHモノドメインであることで特徴づけられる、抗体に関する。
1つの態様において、本発明は、CD47およびPD-L1に結合し、そしてCD47および/またはPD-L1抗原で被覆されている細胞に対する、抗体依存性細胞傷害性、マクロファージ仲介性食作用、補体依存性細胞傷害性、および/またはT細胞仲介性細胞傷害性を刺激することで特徴づけられる、抗体に関する。
1つの態様において、本発明は、CD47およびPD-L1に結合し、そして突然変異または修飾を伴わない同じ抗体と比較して、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性(ADCC)および/または補体依存性細胞傷害性(CDC)が増加している、少なくとも1つの突然変異または修飾を含むFc断片を含むことで特徴づけられる、抗体に関する。
核酸分子
本発明はまた、本明細書に記載する本発明の抗CD47/PD-L1抗体をコードする核酸分子および配列にも関する。いくつかの態様において、多様な核酸分子が、抗CD47/PD-L1抗体のアミノ酸配列の第一のドメインおよび第二のドメインをコードする。第一のドメインおよび/または第二のドメインが、重鎖および軽鎖を含む、いくつかの態様において、異なる核酸が重鎖および軽鎖アミノ酸配列をコードする。他の態様において、同じ核酸分子が重鎖および軽鎖配列をコードする。特定の態様において、核酸分子は、第一および第二のドメインのアミノ酸配列(例えば重鎖および軽鎖配列)の任意の組み合わせをコードしてもよい。特定の態様において、核酸分子は、第一の結合ドメインのアミノ酸配列および第二の結合ドメインの軽鎖アミノ酸配列をコードしてもよく、随意に、これらを連結するペプチドリンカーの任意の配列を含んでもよい。ヌクレオチド配列への言及は、別に示さない限り、その相補体を含む。したがって、特異的配列を有する核酸への言及は、その相補配列とともにその相補鎖を含むものと理解されなければならない。用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、少なくとも長さ10塩基の、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型のいずれかのヌクレオチドのポリマー型を意味する。該用語には、一本鎖および二本鎖型が含まれる。
上記態様のいずれにおいても、核酸分子は単離されていてもよい。
抗CD47/PD-L1抗体を産生する任意の供給源から、本発明の核酸分子を単離し
てもよい。特定の態様において、本発明の核酸分子を、単離するのではなく、合成してもよい。
いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、任意の供給源由来の重鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された、本発明の抗体の第一または第二のドメイン由来のVHドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。同様に、本発明の核酸分子は、任意の供給源由来の軽鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された、本発明の抗体の第一または第二の領域由来のVLドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明のさらなる側面において、第一または第二の結合ドメインの重鎖(VH)および/または軽鎖(VL)の可変ドメインをコードする核酸を、抗体遺伝子の全長に渡って「変換」してもよい。1つの態様において、VHセグメントがベクター内のCHセグメント(単数または複数)に機能可能であるように連結され、ならびに/あるいは、VLセグメントがベクター内のCLセグメントに機能可能であるように連結されるように、それぞれ、重鎖定常(CH)または軽鎖定常(CL)ドメインをすでにコードする発現ベクター内への挿入によって、全長に渡って、VHまたはVLドメインをコードする核酸分子を、抗体遺伝子に変換する。別の態様において、標準的分子生物学的技術を用いて、CHおよび/またはCLドメインをコードする核酸分子に、VHおよび/またはVLドメインをコードする核酸分子を結びつける、例えば連結することによって、VHおよび/またはVLドメインをコードする核酸分子を、全長に渡る抗体遺伝子に変換する。次いで、全長に渡って、重鎖および/または軽鎖をコードする核酸分子が導入されている細胞において、これらを発現させてもよい。
核酸分子を用いて、多量の組換え抗CD47/PD-L1抗体を発現させてもよい。また、核酸分子を用いて、本明細書に記載するような、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、一本鎖抗体、イムノアドヘシン、ディアボディ、突然変異抗体および抗体誘導体を産生してもよい。
ベクター
別の側面において、本発明は、本明細書記載の任意のヌクレオチド配列の発現に適したベクターに関する。
本発明は、本明細書に記載するような、抗CD47/PD-L1抗体またはその部分(例えば第一の結合ドメインの重鎖配列ならびに/あるいは第二の結合ドメインの重鎖および/または軽鎖配列)の任意のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むベクターに関する。本発明は、さらに、融合タンパク質、修飾抗体、抗体断片をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。
別の態様において、核酸分子およびベクターを用いて、突然変異抗CD47/PD-L1抗体を作製してもよい。第一の結合ドメインの重鎖および/または軽鎖、ならびに/あるいは第二の結合ドメインの重鎖および/または軽鎖の可変ドメインにおいて、抗体を突然変異させて、例えば抗体の結合特性を改変してもよい。例えば、1つまたはそれより多いCDRにおいて突然変異を作製して、抗体のKを増加させるかまたは減少させてもよく、koffを増加させるかまたは減少させてもよく、あるいはFcRnに関する抗体の結合特異性を改変してもよい。別の態様において、本発明の抗CD47/PD-L1抗体の第一または第二の結合ドメインに対応する抗体中の生殖系列に比較して、変化することが知られるアミノ酸残基で、1つまたはそれより多い突然変異を作製する。こうした突然変異を、可変ドメインのCDRまたはフレームワーク領域において、あるいは定常ドメインにおいて作製してもよい。好ましい態様において、可変ドメインにおいて、突然変異を
作製する。別の態様において、本発明の抗体の可変ドメインのCDRまたはフレームワーク領域において、生殖系列に比較して、改変されていることが知られるアミノ酸残基で、1つまたはそれより多い突然変異を作製する。
いくつかの態様において、遺伝子が、必要な発現制御配列、例えば転写および翻訳制御配列に機能可能であるように連結されるように、発現ベクターにおいて、上述のように得た、第一または第二の結合ドメインの配列(例えば、結合ドメインが軽鎖および重鎖配列を含む場合の軽鎖および重鎖配列)を部分的にまたは完全にコードするDNAを挿入することによって、本発明の抗CD47/PD-L1抗体を発現する。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、植物ウイルス、例えばカリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、コスミド、YAC、EBV由来エピソーム等が含まれる。ベクター内の転写および翻訳制御配列が、DNAの転写および翻訳を制御する意図される機能を果たすように、DNA分子をベクター内に連結してもよい。用いる宿主細胞と適合するように、発現ベクターおよび発現制御配列を選択してもよい。第一および第二の結合ドメインの配列(例えば、結合ドメインが重鎖および軽鎖配列を含む場合の重鎖および軽鎖配列)を部分的にまたは完全にコードするDNA分子を個々のベクターに導入してもよい。1つの態様において、前記DNA分子の任意の組み合わせを同じ発現ベクター内に導入する。標準法(例えば抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位の連結、あるいは制限部位が存在しない場合、平滑端連結)によって、DNA分子を発現ベクター内に導入してもよい。
適切なベクターは、いかなるVHまたはVL配列も、上述のように容易に挿入されそして発現されうるように、適切な制限部位操作で、機能的に完全なヒトCHまたはCL免疫グロブリン配列をコードするものである。こうしたベクターにおけるHCおよびLCコード遺伝子は、対応するmRNAを安定化させることによって、全体の抗体タンパク質収量の増進を生じる、イントロン配列を含有してもよい。該イントロン配列には、RNAスプライシングがどこで起こるかを決定する、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位が隣接する。イントロン配列の位置は、抗体鎖の可変または定常領域のいずれにあってもよく、あるいは多数のイントロンを用いる場合、可変および定常領域の両方にあってもよい。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域下流の天然染色体部位で起こってもよい。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドもコードしてもよい。シグナルペプチドがインフレームで免疫グロブリン鎖のアミノ末端に連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングしてもよい。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド)であってもよい。
抗体の鎖遺伝子に加えて、本発明の組換えベクター発現は、宿主細胞における抗体の鎖遺伝子の発現を制御する、制御配列を所持してもよい。当業者には、制御配列の選択を含めて、発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等に依存しうることが理解されるであろう。哺乳動物における発現宿主細胞のための好ましい制御配列には、哺乳動物細胞において、高レベルのタンパク質発現を確実にするウイルス要素、例えばレトロウイルスLTR、サイトメガロウイルス(CMV)(例えばCMVプロモーター/エンハンサー)、シミアンウイルス40(SV40)(例えばSV40プロモーター/エンハンサー)、アデノウイルス(例えば主要後期プロモーターアデノウイルス(AdMLP))、ポリオーマウイルス由来のプロモーターおよび/またはエンハンサー、ならびに強力な哺乳動物プロモーター、例えば天然免疫グロブリンプロモーターまたはアクチンプロモーターが含まれる。ウイルス制御要素およびその配列のさらなる説明に関しては、例えば、米国特許第5,168,062号、第4,510,245号および第4,968,615号を参照されたい。結合分子、例えば抗体を植物において発現するための方法は、プロモーターおよびベクター、ならびに植物の形質転換の
説明を含めて、当該技術分野に知られる。例えば、米国特許第6,517,529号を参照されたい。細菌細胞または真菌細胞、例えば酵母細胞においてポリペプチドを発現するための方法もまた、当該技術分野に周知である。
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列(例えば複製起点)および選択可能マーカー遺伝子を所持してもよい。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする(例えば米国特許第4,399,216号、第4,634,665号および第5,179,017号を参照されたい)。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に対して、医薬品剤、例えばG418、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートに対する耐性を与える。例えば、選択可能マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子(メトトレキセート選択/増幅中、dhfr-宿主細胞において使用するため)、neo遺伝子(G418選択のため)、およびグルタミン酸シンテターゼ遺伝子が含まれる。
用語「発現制御配列」は、本明細書において、連結されているコード配列の発現およびプロセシングに影響を及ぼすために必要であるポリヌクレオチド配列を指すよう意図される。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列;効率的RNAプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル;細胞質mRNAを安定化させる配列;翻訳効率を増進させる配列(例えばコザック・コンセンサス配列);タンパク質安定性を増進させる配列;ならびに望ましい場合、タンパク質分泌を増進させる配列が含まれる。こうした制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なり;原核生物においては、こうした制御配列には、一般的に、リボソーム結合部位のプロモーター、および転写終結配列が含まれ;真核生物においては、こうした制御配列には、プロモーターおよび転写終結配列が含まれる。用語「制御配列」には、少なくとも、その存在が、発現およびプロセシングに必須であるすべての構成要素が含まれ、そしてまた、その存在が有益であるさらなる構成要素、例えばリーディング(leading)配列および融合細胞の配列も含まれてもよい。
宿主細胞
本発明のさらなる側面は、本発明のCD47およびPD-L1に対する抗体を産生するための方法に関する。本発明の1つの態様は、本明細書に定義するような抗体を産生するための方法であって、抗体を発現することが可能な組換え宿主細胞を導入し/調製し、抗体の発現/産生に適した条件下で前記宿主細胞を培養し、そして得た抗体を単離する工程を含む、前記方法に関する。こうした組換え宿主細胞におけるこうした発現によって得られた、CD47およびPD-L1に対する抗体は、本明細書において、「組換え抗体」と称される。本発明はまた、こうした宿主細胞由来の細胞の子孫、ならびに同様に得られたCD47およびPD-L1に対する抗体にも関する。
本発明の抗CD47/PD-L1抗体をコードする核酸分子およびこれらの核酸分子を含むベクターを、適切な哺乳動物またはその細胞、植物またはその細胞、細菌または酵母宿主細胞のトランスフェクションに用いてもよい。形質転換は、宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するための任意の既知の技術によってもよい。哺乳動物細胞内に異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、デキストラン仲介性トランスフェクション、陽イオン性ポリマー-核酸複合体トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム中のポリヌクレオチド(単数または複数)の被包、ならびに核内へのDNAの直接マイクロインジェクションが含まれる。さらに、ウイルスベクターによって、哺乳動物細胞内に核酸分子を導入してもよい。細胞をトランスフェクションするための方法は、当該技術分野に周知である。例えば、米国特許第4,399,216号、第4,
912,040号、第4,740,461号および第4,959,455号を参照されたい。植物細胞を形質転換するための方法が当該技術分野に周知であり、これには、例えばアグロバクテリウム仲介形質転換、微粒子銃形質転換、直接注入、エレクトロポレーションおよびウイルス形質転換が含まれる。細菌および酵母細胞を形質転換する方法もまた、当該技術分野に周知である。
形質転換のための宿主として用いる哺乳動物細胞株が当該技術分野に周知であり、そしてこれには、入手可能な多数の不死化細胞株が含まれる。これらには、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NS0細胞、SP2細胞、HEK-293T細胞、FreeStyle 293細胞(Invitrogen)、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えばHepG2)、A549細胞、および多くの他の細胞株が含まれる。どの細胞株が高発現レベルを有し、そして産生するタンパク質に必要な特性を提供するかを決定することによって、細胞株を選択する。使用可能な他の細胞株は、昆虫細胞株、例えばSf9またはSf21細胞である。CD47およびPD-L1に対する抗体をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞内に導入する際、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞を増殖させる培地内への抗体の分泌を可能にするために十分な期間、宿主細胞を培養することによって、抗体を産生する。標準的なタンパク質精製法を用いて、栄養培地から、CD47およびPD-L1に対する抗体を単離してもよい。植物宿主細胞には、例えばニコチアナ属(Nicotiana)、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)、ウキクサ(duckweed)、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ等が含まれる。細菌宿主細胞には、大腸菌(E. coli)およびストレプトミセス属(Streptomyces)種が含まれる。酵母宿主細胞には、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)が含まれる。
さらに、多くの既知の技術を用いて、産生細胞株からの本発明のCD47およびPD-L1に対する抗体の産生レベルを増進させてもよい。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系(GS系)は、特定の条件下で発現を増進させるための一般的なアプローチである。GS系は、EP第0216846号、第0256055号、第0323997号および第0338841号と関連して、全体にまたは部分的に論じられる。
異なる細胞株またはトランスジェニック動物によって発現される、CD47およびPD-L1に対する抗体は、互いに比較した際、異なるグリコシル化プロファイルを有する可能性が高い。しかし、本明細書記載の核酸分子によってコードされるかまたは本明細書に提供するアミノ酸配列を含む、CD47およびPD-L1に対するすべての抗体は、結合分子のグリコシル化に関わらず、そして一般的に翻訳後修飾の存在または非存在に関わらず、本発明の一部である。
抗体の調製
本発明はまた、CD47およびPD-L1に対する抗体、ならびにその抗原結合断片を産生するための方法およびプロセスにも関する。
モノクローナル抗体
Kohlerら Nature 256,1975, p. 495によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて、モノクローナル抗体を調製してもよいし、または組換えDNA法を用いてもよい(US 4816567)。
ハイブリドーマに基づく方法を用いる際、免疫に用いたタンパク質に特異的に結合可能
な抗体を産生するかまたは産生可能であるリンパ球の形成を引き起こすため、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターを、上述の方法にしたがって免疫する。別の態様にしたがって、in vitro免疫によって、リンパ球を産生してもよい。免疫後、適切な融合剤、例えば、ポリエチレングリコールを用いて、リンパ球を骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を産生する。
こうして得たハイブリドーマ細胞を適切な培地中で植え付け、そして増殖させ、これは好ましくは、非融合親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する1つまたはそれより多い物質を含有する。例えば、親骨髄腫細胞がヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を含有しない場合、ハイブリドーマ用の培地には、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン(HAT培地)、すなわちHGPRT欠損細胞の増殖を阻害する物質が含まれなければならない。
好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫細胞株、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center、米国カリフォルニア州サンディエゴより入手可能であるネズミ腫瘍細胞MORS-21およびMPC-11に基づくもの、ならびにAmerican Type Culture Collection、米国メリーランド州ロックビルより入手可能な細胞株SP-2またはX63-Ag8-653である。モノクローナル抗体を産生するためのヒト・マウス骨髄腫およびマウス-ヒト・ヘテロ骨髄腫細胞株の使用もまた記載されてきている(Kozbor, J. Immunol, 133, 1984, p. 3001)。
好ましくは、免疫沈降によって、あるいはin vitro結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)または酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)によって、ハイブリドーマ細胞から得られるモノクローナル抗体の結合特異性を決定する。
モノクローナル抗体の結合アフィニティを、例えば、Munsonら, Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載されるスキャッチャード分析によって決定してもよい。
所望の特異性、アフィニティ、および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈法を用いてクローンをサブクローニングし、そして標準法によって増殖させてもよい。この目的のための適切な培地には、例えばD-MEMまたはRPMI-1640培地が含まれる。さらに、例えば細胞をマウスに腹腔内(i.p.)注射することによって、ハイブリドーマ細胞を動物における腹水腫瘍として、in vivoで増殖させてもよい。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体を、培地、腹水、または血清から、慣用的抗体精製技術、例えばアフィニティクロマトグラフィ(例えばプロテインAまたはプロテインG-Sepharoseを用いて)またはイオン交換クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析等によって、分離してもよい。
モノクローナル抗体をコードするDNAは、慣用法(例えばネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)を用いて、容易に単離されそして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、こうしたDNAの好ましい供給源として利用される。ひとたび単離されたら、DNAを発現ベクター内に配置してもよく、これを次いで、宿主細胞、例えば大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはトランスフェクションされなければ抗体タンパク質を産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクションして、組換え宿
主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするDNAの細菌における組換え発現に関する概説。
さらなる態様において、モノクローナル抗体または抗体断片を、McCaffertyら, Nature, 348:552-554(1990)に記載される技術を用いて生成される抗体ファージライブラリーから単離してもよい。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)およびMarksら, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)は、それぞれ、ファージライブラリーを用いた、ネズミおよびヒト抗体の単離を記載する。続く刊行物は、鎖シャッフリングによる高アフィニティ(nM範囲)ヒト抗体の産生(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783 (1992))、ならびに非常に巨大なファージライブラリーを構築するための戦略として、コンビナトリアル感染およびin
vivo組換え(Waterhouseら, Nucl. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))を記載する。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する有望な代替法である。
例えばキメラまたは融合抗体ポリペプチドを産生するため、例えば重鎖および軽鎖(CHおよびCL)定常領域配列を相同ネズミ配列に関して置換することによって(US 4816567およびMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81:6851 (1984))、あるいは非免疫グロブリンポリペプチド(異種ポリペプチド)のコード配列のすべてまたは一部に、免疫グロブリンコード配列を共有連結することによって、抗体をコードするDNAを修飾してもよい。非免疫グロブリンポリペプチド配列を、抗体の定常領域に対して置換してもよいし、または抗体の抗原結合中心の可変ドメインに対してこれらを置換して、抗原に対する特異性を有する1つの抗原結合部位、および異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含む、キメラ二価抗体を生成してもよい。
ヒト化抗体
「ヒト化」非ヒト動物抗体を産生するための方法は、当該技術分野に周知である。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入される、1つまたはそれより多い組み込まれた(integral)アミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には「移入(import)」可変領域から採られるため、しばしば、「移入」残基と称される。本質的に、ヒト抗体の対応する配列と超可変領域配列を置換することによって、Winterおよび共著者ら(Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986))の方法にしたがって、ヒト化を実行してもよい。したがって、こうした「ヒト化」抗体は、実質的に損なわれていないヒト可変領域より少ない領域が、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている、キメラ抗体(US 4816567)である。事実上、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基およびあるいはいくつかのFR残基が、齧歯類抗体における類似の領域由来の残基によって置換されている、ヒト抗体である。
ヒト化抗体を産生する際に用いる軽鎖および重鎖両方のヒト可変領域の選択は、抗体をヒト療法使用に意図する場合、抗原性およびHAMA反応(ヒト抗マウス抗体)を減少させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法にしたがって、齧歯類抗体の可変領域の配列を、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。齧歯類のものと最も近いヒトVドメイン配列を同定し、そしてヒト化抗体で使用するために適した、その中のヒトフレームワーク領域(FR)を選択する(Simsら, J. Immunol. 151:2296 (1993))。別の方法では、すべてのヒト抗体の軽鎖または重鎖の特定の下位群のコンセンサス配列から得た、特異的フレ
ームワーク領域を用いる。いくつかの異なるヒト化抗体のために同じフレームワークを用いてもよい(Carterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 89:4285 (1992))。
抗原に対する高い結合アフィニティおよび他の重要な生物学的特性を保持したまま、抗体をヒト化することもまた重要である。この目的に向けて、好ましい方法にしたがって、親およびヒト化配列の概念的三次元モデルを用いて、親配列および多様なヒト化産物の分析によって、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、そして当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列のありうる三次元コンホメーション構造を例示し、そしてディスプレイする、コンピュータプログラムが利用可能である。これらの画像の検査によって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありうる役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンが抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。この方式で、FR残基を選択し、そしてレシピエントおよび移入配列と組み合わせて、所望の抗体特性、例えばターゲット抗原(単数または複数)に対するアフィニティの増加を達成してもよい。一般的に、超可変領域残基は、直接、そして最も実質的に、抗原結合への影響に関与する。
ヒト化抗体は、免疫コンジュゲートを生成するため、随意に、1つまたはそれより多い細胞傷害性剤(単数または複数)とコンジュゲート化される、Fabなどの抗体断片であってもよい。あるいは、ヒト化抗体は、全長抗体、例えば全長IgG1抗体であってもよい。
ファージディスプレイライブラリーに基づくヒト抗体および方法論
ヒト化に対する代替法として、ヒト抗体を生成してもよい。例えば、現在、免疫後に、内因性免疫グロブリン産生を伴わずに、ヒト抗体の全範囲を産生することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を産生することが可能である。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域(JH)遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されてきている。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイのこうした生殖系列突然変異マウス内へのトランスファーは、抗原曝露後にヒト抗体の産生を生じる(US 5545806、5569825、5591669(すべて、GenPharm); 5545807;およびWO 97/17852)。
あるいは、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature, 348:552-554 (1990))を用いて、免疫ドナーの身体由来の免疫グロブリン可変(V)領域遺伝子レパートリーから、ヒト抗体および抗体断片をin vitroで産生してもよい。この技術にしたがって、抗体V領域遺伝子を、糸状バクテリオファージ、例えばM13またはfdの主要または非主要いずれかのコートタンパク質遺伝子とインフレームでクローニングして、そしてファージ粒子表面上に機能性抗体断片としてディスプレイする。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含有するため、抗体の機能特性に基づく選択はまた、前記特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択も生じる。したがって、ファージは、B細胞特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイを多様な形式で実行してもよい。V遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイに用いてもよい。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)は、免疫マウスの脾臓に由来するV遺伝子の小規模ランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。本質的に、Marksら, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記載される技術にしたがって、免疫ヒトドナー由来のV遺伝子のレパートリーを構築して、そして抗原(自己抗原を含む)の多様なアレイに対する抗体を単離してもよい。
上述のように、また、in vitro活性化B細胞によって、ヒト抗体を生成してもよい(US 5567610および5229275を参照されたい)。
抗体断片
特定の状況において、全抗体よりも抗体断片を用いることが得策である。断片が小さいサイズであることは、その迅速なクリアランスに寄与し、そして高密度腫瘍内へのより優れた浸透に寄与しうる。
抗体断片の産生のために、多様な技術が開発されてきている。伝統的には、これらの断片は、損なわれていない抗体のタンパク質分解的消化を通じて得られた。しかし、現在、組換え宿主細胞によって直接これらの断片を得てもよい。Fab、FvおよびScFv抗体断片を大腸菌で発現させて該大腸菌から分泌させ、それによって、これらの断片の多量の産生を促進することを可能にしてもよい。上述の抗体ファージライブラリーから抗体断片を単離してもよい。別の態様にしたがって、Fab’-SH断片を大腸菌から直接単離し、そして化学的にカップリングして、F(ab’)断片を形成してもよい(Carterら,Bio/Technology 10:163-167 (1992))。別のアプローチにしたがって、F(ab’)断片を組換え宿主細胞培養から直接単離してもよい。エピトープ結合受容体残基を保持しながら、in vivo半減期が増加した、FabおよびF(ab’)が、US 5869046に記載される。抗体断片を得るための他の技術は、当業者には明らかであるはずである。他の態様において、選択される抗体は、一本鎖Fc断片(scFv)である(WO 93/16185; US 5571894およびUS 5587458を参照されたい)。FvおよびscFvのみが、定常領域を含まずに、損なわれていない結合部位を含む種であり;その結果、これらはin vivo使用中、非特異的結合を減少させるために適している。scFvを所持する融合タンパク質を設計して、scFvのNまたはC末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合を生じてもよい。抗体断片はまた、例えばU.S. 5641870に記載されるような「直鎖抗体」であってもよい。こうした直鎖抗体断片は、単一特異性または二重特異性であってもよい。
多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例えば、二重特異性抗体は、タンパク質の2つの異なるエピトープに結合してもよい。他の多重特異性抗体は、別のタンパク質に対する結合部位と組み合わせて、CD47およびPD-L1に対する結合部位を合わせていてもよい。全長抗体または抗体断片(例えば二重特異性抗体のF(ab’)断片)として、二重特異性抗体を得てもよい。
多重特異性抗体を産生するための方法が当該技術分野に知られる。例えば、全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、2つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づき、ここで、2つの鎖は異なる特異性を有する。免疫グロブリン重鎖および軽鎖がランダムな種類であるため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は、10の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、このうち1つのみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常、いくつかの工程のアフィニティクロマトグラフィによって行われ、これはかなり厄介であり、そして産物収量は低い。同様のプロセスが、WO 93/08829に記載される。
異なるアプローチにしたがって、所望の結合特異性を持つ抗体可変ドメイン(結合の抗原結合部位)を、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。好ましくは、融合は、Ig重鎖定常領域で行われ、ヒンジの少なくとも部分、C2、およびC3領域を含む。好ましくは、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域(C1)が、融合体の少なくとも1つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合体、および望ましい場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを、多様な発現ベクター内に挿入して、そして適切な
宿主細胞内に同時トランスフェクションする。これは、最適な収量を提供するために、構築において、等しくない比率の3つのポリペプチド鎖を用いる際の態様において、3つのポリペプチド断片の相互比率を選択する際に、より大きな柔軟性を提供する。しかし、等しい比率の少なくとも2つのポリペプチド鎖の発現が、高い収量を生じる場合、または比率が重要な影響を持たない場合、単一の発現ベクターにおいて、2つまたは3つすべてのポリペプチド鎖に、コード配列を挿入することが可能である。
このアプローチの好ましい態様において、二重特異性抗体は、第一のアームにおいて第一の結合特異性を提供するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および第二のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖/軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)である。この非対称的な構造によって、二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することにより分離が容易になるため、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせから、望ましい二重特異性分子の分離が容易になることが見出された。このアプローチは、WO94/04690に開示される。二重特異性抗体産生に関して、より詳細には、例えば、Sureshら, Methods in Enzymology 121:210 (1986)を参照されたい。
US 5731168に記載する別のアプローチにしたがって、抗体分子対間の界面を構築して、組換え細胞培養から得られるヘテロ二量体の割合を最大にしてもよい。好ましい界面は、C3領域の少なくとも部分を含む。この方法にしたがって、第一の抗体分子の界面から、側鎖を持つ1つまたはそれより多い小分子アミノ酸を、より大きな側鎖を持つもの(例えばチロシンまたはトリプトファン)に置換する。大きい側鎖を含有するアミノ酸を、より小さい側鎖を含有するアミノ酸(例えばアラニンまたはスレオニン)で置換することによって、第二の抗体分子の界面上に、大きい側鎖(単数または複数)と同一または類似のサイズの補償性「空洞」を生成する。これは、他の望ましくない最終産物に比較した際、ヘテロ二量体の収量を増加させるための機構を提供する。
二重特異性抗体には、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の一方をアビジンにカップリングさせ、そしてもう一方をビオチンにカップリングさせてもよい。例えば、こうした抗体を用いて、免疫系細胞を望ましくない細胞にターゲティングしてもよいし(US 46769809)、そしてHIV感染の治療に用いてもよい(WO 91/00360、WO 92/200373、およびEP 03089)。任意の慣用的な架橋法を用いて、ヘテロコンジュゲート抗体を作製してもよい。適切な架橋剤が当該技術分野に周知であり、そして多様な架橋技術とともに、US 4676980に開示される。
抗体断片から二重特異性抗体を得る方法はまた、文献にも記載されてきている。例えば、化学結合によって、二重特異性抗体を得てもよい。Brennanら, Science 229:81 (1985)は、それによって、損なわれていない抗体がタンパク質分解的に切断されて、F(ab’)を産生する方法を記載している。これらの断片を、ジチオール錯化剤、例えば亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、近接ジチオールを安定化させ、そして分子間ジスルフィド結合の形成を防止する。産生されたFab’断片を次いで、チオニトロベンゾエート(TNB)誘導体に変換する。Fab’-TNB誘導体の1つを、次いで、メルカプトエチルアミンでの還元によって、Fab’-チオールに再変換して、そして等モル量の別のFab’-TNB誘導体と混合して、二重特異性抗体を得る。産生した二重特異性抗体を、酵素の選択的固定のための剤として用いてもよい。
最近の進歩によって、大腸菌からのFab’-SH断片の直接回収が容易になっており、これを化学的にカップリングして二重特異性抗体を産生してもよい。Shalabyら, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)は、完全ヒト化
二重特異性抗体分子のF(ab’)の産生を記載する。各Fab’は、大腸菌から別個に分泌され、そしてin vitroで直接化学的カップリングに供されて、二重特異性抗体を形成した。こうして得た二重特異性抗体は、ErbB2受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトT細胞に結合可能であり、それとともに、ヒト乳房腫瘍ターゲットに対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発する。
組換え細胞培養から直接、二重特異性抗体断片を得て、そして単離するための多様な技術もまた記載されてきている。例えば、ロイシンジッパーを用いて、二重特異性抗体が産生されてきている(Kostelnyら, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992))。FosおよびJunタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって、2つの異なる抗体のFab’に連結された。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して、単量体を形成し、そして次いで、再酸化して、抗体ヘテロ二量体を得た。また、この方法を用いて、ホモ二量体抗体を得てもよい。Hollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)によって記載される「二重抗体」技術は、二重特異性抗体断片を産生するための代替機構である。断片は、同じ鎖上の2つのドメイン間で対形成を可能にするには短すぎるリンカーによって、VL領域に連結されたVH領域を含む。したがって、1つの断片のVHおよびVL領域は、別の断片の相補的VLおよびVH領域と対形成し、それによって、2つの抗原結合部位を形成するはずである。一本鎖(Fv)-(sFv)二量体を用いて二重特異性抗体断片を産生するための別の戦略もまた記載されてきている(Gruberら, J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい)。
本発明はまた、2より多い価の抗体も提供する。例えば、三重特異性抗体を産生してもよい。
多価抗体
多価抗体は、二価抗体よりも迅速に、抗体が結合する抗原を発現する細胞に内在化されうる(および/または異化されうる)。本発明の抗体は、3つまたはそれより多い抗原結合部位(例えば四価抗体)を持つ多価抗体(IgMクラス以外)であってもよく、該抗体は、抗体ポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に得られうる。多価抗体は、二量体化ドメインおよび3つまたはそれより多い抗原結合部位を含んでもよい。好ましい二量体化ドメインは、Fc断片またはヒンジ領域を含む(またはこれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体は、Fc断片およびFc断片のN末端の3つまたはそれより多い抗原結合部位を含むであろう。本明細書の好ましい多価抗体は、3つから約8つ、しかし好ましくは4つの抗原結合部位を含む(またはこれらからなる)。多価抗体は、少なくとも1つのポリペプチド鎖(および好ましくは2つのポリペプチド鎖)を含み、ここでポリペプチド鎖(単数または複数)は、2つまたはそれより多い可変領域を含む。例えば、ポリペプチド鎖(単数または複数)は、VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fcを含んでもよく、ここで、VD1は第一の可変領域を指し、VD2は第二の可変領域を指し、FcはFc断片の1つのポリペプチド鎖を指し、X1およびX2はアミノ酸またはポリペプチドを指し、そしてnは0または1である。例えば、ポリペプチド鎖(単数または複数)は、以下の鎖:VH-CH1-柔軟なリンカー-VH-CH1-Fc断片;またはVH-CH1-VH-CH1-Fc断片を含んでもよい。多価抗体は、本明細書において、好ましくは、少なくとも2つ(および好ましくは4つ)の軽鎖可変領域ポリペプチドをさらに含む。多価抗体は、本明細書において、例えば、約2つから約8つの軽鎖可変領域ポリペプチドを含んでもよい。本発明の背景において、軽鎖可変領域ポリペプチドは、軽鎖可変領域を含み、そして随意に、CL領域をさらに含む。
薬学的組成物
別の側面において、本発明は、活性成分として(または唯一の活性成分として)CD4
7/PD-L1特異的抗体を含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物には、本明細書に記載するように、CD47およびPD-L1に特異的な少なくとも1つの抗体、ならびに/あるいは1つまたはそれより多い対応する表面受容体をターゲティングする、1つまたはそれより多いさらなる結合分子(例えば抗体)が含まれてもよい。いくつかの態様において、組成物は、IgGによって仲介される障害を改善するか、防止するか、または治療するよう意図される。
「薬学的組成物」は、本発明の抗CD47/PD-L1抗体、ならびに薬学的に許容されうるそして薬理学的に適合する賦形剤、例えば充填剤、溶媒、希釈剤、キャリアー、補助剤、分配剤、送達剤、保存剤、安定化剤、乳化剤、懸濁剤、増粘剤、持続送達制御剤からなる群より選択される少なくとも1つの構成要素を含む組成物を意味し、これらの選択および比率は、投与および投薬のタイプおよび経路に応じる。本発明の薬学的組成物およびその調製法は、明確に、当業者に明らかであろう。薬学的組成物は、好ましくは、GMP(製造管理および品質管理に関する基準)要件に適合して製造されなければならない。組成物には、緩衝剤組成物、等張剤、安定化剤および可溶化剤が含まれてもよい。活性薬学的成分の吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンによって、組成物の作用の持続を達成してもよい。適切なキャリアー、溶媒、希釈剤および送達剤の例には、水、エタノール、ポリアルコールおよびその混合物、油、ならびに注射用の有機エステルが含まれる。
「医薬品(薬剤)」は、ヒトおよび動物において、生理学的機能の回復、改善または修飾のために、そして疾患の治療および防止のために、診断、麻酔、避妊、美容術等のために意図される、錠剤、カプセル、粉末、凍結乾燥物、注射剤、注入剤、軟膏および他の既製品型の薬学的組成物としての物質または物質の混合物である。当該技術分野において許容される、ペプチド、タンパク質または抗体を投与するための任意の方法を、本発明の抗CD47/PD-L1抗体に関して、適切に使用してもよい。
用語「薬学的に許容されうる」は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける投与に適した1つまたはそれより多い適合する液体または固体構成要素を指す。
用語「賦形剤」は、本明細書において、本発明の上記成分以外の任意の成分を記載する。これらは、薬剤産物に、必要な物理化学特性を与えるため、薬剤製造において用いられる無機または有機性の物質である。
本明細書において、「緩衝液」、「緩衝剤組成物」、「緩衝剤」は、その酸-塩基コンジュゲート構成要素の作用によって、pHの変化に抵抗することが可能であり、そして抗CD47/PD-L1抗体薬剤が、pHの変化に抵抗することを可能にする、溶液を指す。一般的に、薬学的組成物は、好ましくは、4.0~8.0の範囲のpHを有する。用いる緩衝剤の例には、限定されるわけではないが、酢酸、リン酸、クエン酸、ヒスチジン、コハク酸等の緩衝溶液が含まれる。
用語「等張剤」、「浸透圧調節物質」または「浸透圧調節剤」は、本明細書において、液体抗体配合物の浸透圧を増加させうる賦形剤を指す。「等張」薬剤は、ヒト血液のものと等しい浸透圧を有する薬剤である。等張薬剤は、典型的には、約250~350mOsm/kgの浸透圧を有する。用いられる等張剤には、限定されるわけではないが、ポリオール、糖類およびスクロース、アミノ酸、金属塩、例えば塩化ナトリウム等が含まれる。
「安定化剤」は、活性剤の物理的および/または化学的安定性を提供する、賦形剤、あるいは2つまたはそれより多い賦形剤の混合物を指す。安定化剤には、アミノ酸、例えば限定されるわけではないが、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、リジン、グルタミン、プロリン;界面活性剤、例えば限定されるわけではないが、ポリソルベート20(商品名
:Tween 20)、ポリソルベート80(商品名:Tween 80)、ポリエチレン-ポリプロピレングリコールおよびそのコポリマー(商品名:ポロキサマー)、プルロニック(登録商標)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS);酸化防止剤、例えば限定されるわけではないが、メチオニン、アセチルシステイン、アスコルビン酸、モノチオグリセロール、硫酸塩等;キレート剤、例えば限定されるわけではないが、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、クエン酸ナトリウム等が含まれる。
特定された(specified)保存可能期間中に、保存温度、例えば2~8℃で、活性剤が、その物理的安定性および/または化学的安定性および/または生物学的安定性を保持するならば、薬学的組成物は「安定」である。好ましくは、活性剤は、物理的および化学的安定性、ならびに生物学的活性の両方を保持する。加速されたまたは天然の経年変化(aging)状態において、安定性試験の結果に基づいて、保存期間を調節する。
既製配合物の形の、単一単位用量または複数の単一単位用量の形で、本発明の薬学的組成物を製造するか、パッケージングするか、または広く販売してもよい。用語「単一単位用量」は、本明細書において、活性成分のあらかじめ決定した量を含有する、別個の量の薬学的組成物を指す。活性成分の量は、通常、被験体に投与しようとする活性成分の投薬量、あるいはこうした投薬量の好適な部分、例えばその投薬量の半量または三分の一量と等しい。
本発明の薬学的組成物は、典型的には、注射、注入および移植により、胃腸管を迂回して、皮膚または粘膜障壁における割れ目(breach)を通じてヒト体内に投与されるよう意図された無菌配合物としての、非経口投与に適している。例えば、非経口投与には、とりわけ、皮下、腹腔内、筋内、胸骨内、静脈内、動脈内、クモ膜下腔内、心室内、尿道内、頭蓋内、滑膜内、経皮注射または注入;および腎臓透析注入技術が含まれる。局所灌流もまた提供される。好ましい態様には、静脈内および皮下経路が含まれる。当該技術分野に許容される、ペプチドまたはタンパク質を投与するための任意の方法を、本発明の抗CD47/PD-L1抗体に適切に使用してもよい。
限定なしに、投薬型で、例えばアンプル、バイアル中、プラスチック容器、あらかじめ充填したシリンジ、自動注射(autoinjection)デバイス中で、注射可能配合物を製造するか、パッケージングするか、または販売してもよい。非経口投与のための配合物には、とりわけ、懸濁物、溶液、油性または水性基剤中のエマルジョン、ペースト等が含まれる。
別の態様において、本発明は、投与前に適切な基剤(例えば無菌病原体不含水)で再構成するための乾燥(すなわち粉末または顆粒)型で提供される、薬学的組成物を含む、非経口投与のための組成物を提供する。こうした配合物を、例えば凍結乾燥プロセスによって得てもよく、該プロセスは、フリーズドライとして当該技術分野に知られ、そして産物を凍結し、その後、凍結した物質から溶媒を除去する工程を伴う。
また、本発明のCD47およびPD-L1に対する抗体を、鼻内または吸入によって、単独で、適切な賦形剤との混合物としてのいずれかで、吸入装置、例えば加圧エアロゾルコンテナ、ポンプ、スプレー、アトマイザーまたはネブライザーから、適切な噴霧剤を用いまたは用いず、あるいは点鼻剤として、またはスプレーで、投与してもよい。
非経口投与のための投薬型を、即時または修飾放出されるように、配合してもよい。修飾放出配合物には、遅延、持続、パルス、制御、ターゲティングおよびプログラム放出が含まれる。
本発明の抗CD47/PD-L1抗体の療法的使用
1つの側面において、本発明の抗CD47/PD-L1抗体を、CD47およびPD-L1によって仲介される障害、例えば:(HNSCC)頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、TNBC(三重陰性乳癌)、CRC(結腸直腸癌)、肝細胞癌、黒色腫、NSCLC(非小細胞肺癌)、腎臓癌、卵巣癌、ホジキンリンパ腫、MSI CRC(マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌)、白血病(急性白血病または骨髄芽球性白血病)、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群を含む群より選択される疾患または障害の治療に用いる。
1つの側面において、治療の被験体または患者は、哺乳動物、好ましくはヒト被験体である。上記被験体は、男性または女性であってもよく、そして任意の年齢であってもよい。
腫瘍(例えば癌)の場合、抗体またはその断片(例えば、CD47およびPD-L1に特異的に結合する抗体またはその断片)は、癌細胞数を減少させ;最初の腫瘍サイズを減少させ;末梢臓器内への癌細胞浸潤を阻害し(すなわちある程度遅延させ、そして好ましくは停止し);腫瘍転移を阻害し(すなわちある程度遅延させ、そして好ましくは停止し);腫瘍増殖をある程度阻害し;ならびに/あるいは、障害と関連する症状の1つまたはそれより多くをある程度軽減することも可能である。抗体またはその断片は、ある程度、癌細胞の増殖を防止し、ならびに/あるいは、存在する癌細胞を殺すことが可能であり、これは、細胞分裂停止性および/または細胞傷害性であってもよい。癌療法に関して、in vivo有効性は、例えば、全体の生存(OS)、腫瘍増殖までの時間(TTP)、治療に対する全体の腫瘍反応速度(ORR)、反応期間(DR)および/または生活の質を評価することによって測定可能である。
本明細書において、抗CD47/PD-L1抗体および1つまたはそれより多い異なる療法剤に言及する用語、「同時投与」、「同時投与された」および「と組み合わされた」は、以下を意味するか、以下を指すか、または以下を含むと予期される:
1)本発明の抗CD47/PD-L1抗体および療法剤のこうした組み合わせの、治療が必要な患者への同時投与であって、こうした構成要素が、前記構成要素を前記患者に実質的に同時に放出する、単一の投薬型内にともに配合されている場合の、前記投与、
2)本発明の抗CD47/PD-L1抗体および療法剤のこうした組み合わせの、治療が必要な患者への実質的な同時投与であって、こうした構成要素が異なる投薬型に別個に配合され、これらの構成要素が、特定された患者でほぼ同時に放出された後、その導入が、示す患者でほぼ同時に起こる場合の、前記投与、
3)本発明の抗CD47/PD-L1抗体および療法剤のこうした組み合わせの、治療が必要な患者への連続投与であって、こうした構成要素が互いに別個の投薬型に配合され、これらが、各投与の間の十分な時間間隔で、前記患者によって連続して摂取され、投与に際して、前記構成要素が前記患者に、実質的に異なる時点で放出される場合の、前記投与;および
4)本発明のCD47およびPD-L1に対する抗体ならびに療法剤のこうした組み合わせの、治療が必要な患者への連続投与であって、こうした構成要素が、単一の投薬型にともに配合され、該投薬型が、前記構成要素を制御された方式で放出し、放出に際して、前記患者に同じおよび/または異なる時点で、同時に、連続して、または合同で放出され、ここで各部分が、同じまたは異なる経路のいずれかによって、投与されうる場合の、前記投与。
本発明の抗CD47/PD-L1抗体を、さらなる療法的治療を伴わずに、すなわち独立療法として投与してもよい。さらに、本発明の抗体による治療は、少なくとも1つのさ
らなる療法的治療を伴ってもよい(併用療法)。本発明のいくつかの態様において、抗CD47/PD-L1抗体を、異なる癌医薬品/薬剤と組み合わせて投与するかまたはともに配合してもよい。
本明細書において、用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害するかまたは防止し、および/または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。該用語は、放射性同位体(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32およびLuの放射性同位体)、化学療法剤、ならびにその断片および/または変異体を含む、細菌、真菌、植物または動物起源の毒素、例えば小分子毒素または酵素的に活性である毒素を含むよう意図される。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標));スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン;アジリジン、例えばベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa);アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン(methylamelamine);アセトゲニン(例えばブラタシンおよびブラタシノン);ベータ-ラパコン;ラパコール;コルヒチン;ベツリン酸;カンプトテシン(合成類似体トポテカン(HYCAMTIN(登録商標))、CPT-11(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および9-アミノカンプトテシンを含む);ブリオスタチン;カリスタチン;CC-1065(そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む);ポドフィロトキシン;ポドフィリン酸;テニポシド;クリプトフィシン(例えばクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8);ドラスタチン;デュオカルマイシン(合成類似体KW-2189およびCB1-TM1を含む);エリュテロビン;パンクラチスタチン;サルコディクチン;スポンジスタチン;ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩(mechlorethamine oxide hydrochloride)、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード;ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン;抗生物質、例えばエンジイン抗生物質(例えばカリケアマイシン、例えばカリケアマイシン・ガンマIIおよびカリケアマイシン・オメガII(例えばAgnew, Chem. Intl. Ed. Engl.,
33: 183-186 (1994)を参照されたい));ダイネマイシン(dynemicin)Aを含むダイネマイシン;エスペラマイシン;ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンHClリポソーム注射剤(DOXOL(登録商標))、リポソームドキソルビシンTLC D-99(MYOCET(登録商標))、PEG化リポソームドキソルビシン(CAELYX(登録商標))、およびデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンC、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニ
グリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン;代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))、テガファー(UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(XELODA(登録商標))、エポチロン、および5-フルオロウラシル(5-FU);葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート;プリン類似体、例えばフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモファー、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン;抗副腎機能剤(anti-adrenals)、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補充剤、例えばフロリン酸;アセグラトン;アルドホスファミド配糖体;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキセート;デフォファミン(defofamine);デメコルチン;ジアジクオン;エルフォルニチン;酢酸エリプチニウム;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダイニン(lonidainine);メイタンシノイド、例えばメイタンシンおよびアンサミトシン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモール;ニトラエリン(nitraerine);ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products、オレゴン州ユージーン);ラゾキサン;リゾキシン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン;2,2’,2”-トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(例えばT-2毒素、ベラキュリンA、ロリジンAおよびアングイジン);ウレタン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara-C」);チオテパ;タキソイド、例えばパクリタキセル(Taxol(登録商標))、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子配合物(ABRAXANE(登録商標))、およびドセタキセル(TAXOTERE(登録商標));クロラムブシル;6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;白金剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン;ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))、ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))、ビンデシン(ELDISINE(登録商標))、FILDESIN(登録商標)、およびビノレルビン(NAVELBINE(登録商標))を含む、チューブリン重合が微小管を形成するのを防止するビンカ類;エトポシド(VP16);イホスファミド;ミトキサントロン;ロイコボリン;ノバントロン;エダトレキセート;ダウノマイシン;アミノプテリン;イバンドロネート;トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);ベキサロテン(TARGRETIN(登録商標))を含むレチノイド、例えばレチノール酸;ビスホスホネート、例えばアスクロドロネート(例えば、BONEFOS(登録商標)またはOSTAC(登録商標))、エチロドネート(DIDROCAL(登録商標))、NE-58095、ゾレドロン酸/ゾレドロネート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロネート(FOSAMAJX(登録商標))、パミドロネート(AREDIA(登録商標))、チルドロネート(SKELID(登録商標))、またはリセドロネート(ACTONEL(登録商標));トロキサシタビン(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体);アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子、例えば、PKC-アルファ、Raf、H-Ras、および上皮増殖因子受容体(EGF-R)の発現を阻害するもの;ワクチン、例えばTHERATOPE(登録商標)ワクチンおよび遺伝子治療ワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、およびVAXID(登録商標)ワクチン;トポイソメラーゼ1阻害剤(例えばLURTOTECAN(登録商標));rmRH(例えばABARELIX(登録商標));BAY439006(ソラフェニブ;Bayer);SU-11248(Pfizer);ペリフォシン、COX-2阻害剤(例えばセレコキシブまたはエトリコキシブ)、プロテオソーム阻害剤(例えばPS341);ボルテゾミブ(VELCADE(登録商標));CCI-779;ティピファルニブ(RI
1577);オラフェニブ、ABT510;Bcl-2阻害剤、例えばオブリメルセンナトリウム(GENASENSE(登録商標));ピキサントロン;EGFR阻害剤(以下の定義を参照されたい);チロシンキナーゼ阻害剤(以下の定義を参照されたい);ならびに上記いずれかの薬学的に許容されうる酸または誘導体;ならびに上記の2つまたはそれより多くの組み合わせ、例えばシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略語であるCHOP、ならびに5-FUおよびロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン(ELOXATINTM)での治療措置の略語であるFOLFOXが含まれる。
この定義にやはり含まれるのは、腫瘍に対するホルモン作用を制御するかまたは阻害するように作用する、抗ホルモン剤、例えば混合アゴニスト/アンタゴニストプロファイルを持つ抗エストロゲンであり、これには、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標))、4-ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン(FARESTON(登録商標))、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン(EVTSTA(登録商標))、トリオキシフェン、ケオキシフェン、および選択的エストロゲン受容体調節剤(SERM)、例えばSERM3;アゴニスト特性を含まない純粋抗エストロゲン、例えばフルベストラント(FASLODEX(登録商標))、およびEM800(こうした剤は、エストロゲン受容体(ER)二量体化を遮断し、DNA結合を阻害し、ER代謝回転を増加させ、および/またはERレベルを抑制することも可能である);ステロイド性アロマターゼ阻害剤、例えばフォルメスタンおよびエキセメスタン(AROMASIN(登録商標))、ならびに非ステロイド性アロマターゼ阻害剤、例えばアナストラゾール(AREVIIDEX(登録商標))、レトロゾール(FEMARA(登録商標))およびアミノグルテチミド、ならびにボロゾール(RIVISOR(登録商標))、酢酸メゲストロール(MEGASE(登録商標))、ファドロゾール、イミダゾールを含む他のアロマターゼ阻害剤を含む、アロマターゼ阻害剤;リュープロリド(LUPRON(登録商標)およびELIGARD(登録商標))、ゴセレリン、ブセレリン、およびトリプテレリンを含む、黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト;プロゲスチン、例えば酢酸メゲストロールおよび酢酸メドロキシプロゲステロン、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロールおよびプレマリン、ならびにアンドロゲン/レチノイド、例えばフロキシメステロン、オールトランスレチノイン酸およびフェンレチニドを含む性ステロイド;オナプリストン;抗プロゲステロン;エストロゲン受容体下方制御剤(ERD);抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミドおよびビカルタミド;テストラクトン;ならびに上記いずれかの薬学的に許容されうる塩、酸または誘導体;ならびに上記の2つまたはそれより多くの組み合わせである。
本発明の抗CD47/PD-L1抗体と組み合わせて用いてもよい他の療法剤は、増殖因子機能の阻害剤であってもよく、例えばこうした阻害剤には、増殖因子抗体および増殖因子受容体抗体(例えば抗erbB2抗体、トラスツズマブ[ハーセプチン]、抗EGFR抗体、パニツムマブ、抗erbB1抗体、セツキシマブ[エルビタックス、C225]、およびSternら Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, pp11-29によって開示される任意の増殖因子または増殖因子受容体抗体);抗血管形成剤、例えば血管内皮増殖因子の影響を阻害するもの、[例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体、ベバシズマブ(アバスチン)]、抗血管内皮増殖因子受容体抗体、例えば抗KDR抗体および抗flt1抗体;アンチセンスヌクレオチド、例えば上に列挙するターゲットに対して向けられるもの、例えばISIS 2503、抗rasアンチセンスまたはG3139(Genasense)、抗bcl2アンチセンス;例えば、異常な遺伝子、例えば異常なp53または異常なBRCA1またはBRCA2を置換するためのアプローチを含む、遺伝子治療アプローチ、GDEPT(遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法)、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌ニトロレダクターゼ酵素を用いるものなどのアプローチ、およ
び化学療法または放射線療法に対する患者耐性を増加させるアプローチ、例えば多剤耐性遺伝子治療;例えばアレムツズマブ(キャンパス-1H)、CD52に対して向けられるモノクローナル抗体での治療、またはCD22に向けられる抗体での治療、患者腫瘍細胞の免疫原性を増加させるためのex vivoおよびin vivoアプローチ、サイトカイン、例えばインターロイキン2、インターロイキン4または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子でのトランスフェクション、T細胞アネルギーを減少させるアプローチ、例えばCTLA-4機能を阻害するモノクローナル抗体での治療、トランスフェクションされた免疫細胞、例えばサイトカインでトランスフェクションされた樹状細胞を用いたアプローチ、サイトカインでトランスフェクションされた腫瘍細胞株を用いたアプローチおよび抗イディオタイプ抗体を用いたアプローチ、ex vivoで非特異的に活性化されたか、または関心対象の特定の抗原にターゲティングされているT細胞を用いた養子T細胞トランスファーを含む、免疫療法アプローチ;タンパク質分解の阻害剤、例えばプロテアソーム阻害剤、例えばベルケード(ボルテゾミド);生物療法的療法アプローチ、例えば受容体リガンドを隔離するか、受容体へのリガンド結合を遮断するか、または受容体シグナル伝達を減少させるかいずれかである(例えば受容体分解増進または発現レベル低下により)、ペプチドまたはタンパク質(例えば抗体または可溶性外部受容体ドメイン構築物)を用いるものが含まれる。
用量および投与経路
本発明の抗CD47/PD-L1抗体を、問題の状態の治療に有効な量で、すなわち望ましい結果を達成するために必要な用量で、そして必要な期間、投与しなければならない。療法的に有効な量は、治療中の特定の状態、患者の年齢、性別および体重、ならびに抗CD47/PD-L1抗体を、独立型治療として、あるいは1つまたはそれより多いさらなる治療との組み合わせで、投与するかいずれかなどの要因にしたがって、多様でありうる。
投薬措置を調節して、最適な反応を提供してもよい。例えば、単一ボーラスを投与してもよいし、いくつかの分割用量を長期に渡って投与してもよいし、あるいは療法状況の緊急事態によって示されるように、用量を比例して減少させるかまたは増加させてもよい。特に有用であるのは、投与の容易さおよび投薬の均一性のため、標準投薬型での非経口組成物の製造である。本明細書において、単位投薬型は、治療しようとする患者/被験体のための単位投薬として適した物理的に別個の単位を指すよう意図され;各単位は、所望の薬学的キャリアーと関連した、所望の療法効果を生じるよう計算された、あらかじめ決定された量の活性化合物を含有する。本発明の標準投薬型の詳述は、典型的には、(a)化学療法剤のユニークな特性、および達成しようとする特定の療法的または予防的効果、ならびに(b)被験体の治療のためのこうした活性化合物を化合する、当該技術分野に生得的な限界によって指示され、そしてこれらに直接依存する。
したがって、当業者は、本明細書の開示から、療法分野に周知の方法にしたがって、投薬量および投薬措置を調節することを認識するであろう。すなわち、最大許容用量は、容易に確立可能であり、そして患者に対して検出可能な療法効果を提供する有効な量もまた決定可能であり、患者に対して検出可能な療法効果を提供するために各剤を投与するための一時的な要件も同様である。したがって、本文書において、例としていくつかの用量および投薬措置を提供するが、これらの例は、本発明の実施において、患者に必要でありうる投薬量および投薬措置を、いかなる意味でも限定しない。
投薬値が、軽減しようとする状態のタイプおよび重症度に応じて多様である可能性があり、そしてこれには単一または多数の用量が含まれてもよいことが注目されるものとする。さらに、任意の特定の被験体に関して、個々の必要性、および組成物を投与するかまたは投与を監視する医学的専門家の判断にしたがって、特定の投薬措置を長期に渡って調節
すべきであり、そして本明細書に示す投薬範囲は例示のみであり、そして請求する組成物の範囲または実施を制限するとは意図されないことが理解されるものとする。さらに、本発明の組成物を含む投薬措置は、疾患のタイプ、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重症度、投与経路、および使用する特定の抗CD47/PD-L1抗体を含む、多様な要因に基づきうる。したがって、投薬措置は、広く多様である可能性もあるが、標準法を用いて、ルーチンに決定可能である。例えば、臨床効果、例えば毒性効果および/または実験室値を含んでもよい薬物動態学または薬力学的パラメータに基づいて、用量を調節してもよい。したがって、本発明は、当業者によって決定されるような、患者内用量増大を含む。適切な投薬量および措置を決定するための方法は、当該技術分野に周知であり、そして本明細書に開示するアイディアをひとたび提供されれば、当業者によって理解されるであろう。
適切な投薬法の例を上記に提供する。
本発明のCD47およびPD-L1に対する抗体の適切な用量は、0.1~200mg/kg、好ましくは0.1~100mg/kgの範囲であり、約0.5~50mg/kg、例えば約1~20mg/kgを含むであろう。例えば少なくとも0.25mg/kg、例えば少なくとも0.5mg/kg、少なくとも1mg/kgを含む、例えば少なくとも1.5mg/kg、例えば少なくとも2mg/kg、例えば少なくとも3mg/kg、少なくとも4mg/kgを含む、例えば少なくとも5mg/kg;そして例えば最大50mg/kg、最大30mg/kg、例えば最大20mg/kgを含む、最大15mg/kgを含む用量で、CD47およびPD-L1に対する抗体を投与してもよい。典型的には、適切な時間間隔で、例えば週1回、2週ごと、3週ごと、または4週ごと、そして責任者である医師によって適切と判断されるだけ長く反復され、該医師は、いくつかの場合、必要であれば、用量を増加させるかまたは減少させてもよい。
製造物品(製品)およびキット
本発明の以下の態様は、癌、例えば、HNSCC、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、TNBC、CRC、肝細胞癌、黒色腫、NSCLC、腎臓癌、卵巣癌、ホジキンリンパ腫、MSI CRC、白血病(急性白血病または骨髄芽球性白血病)、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群を治療するために用いられる製品を含有する製品である。製品は、パッケージ中のコンテナ、およびコンテナ上に配置されるかまたはコンテナ中に封入されるラベルまたは説明書挿入物である。適切なコンテナは、例えば缶、バイアル、シリンジ等である。コンテナは、多様な材料、例えばガラスまたはプラスチックから作製されてもよい。コンテナは、特定の状態の治療に有効な組成物を含有し、そして無菌入口チャネルを有してもよい(例えば、コンテナは、皮下注射針で穿刺可能な栓を持つ静脈注射溶液バッグまたはバイアルであってもよい)。組成物中の少なくとも1つの活性成分は、本発明にしたがった抗PD-L1抗体である。パッケージ中のラベルまたは説明書は、組成物を用いて、特定の状態を治療することを示す。パッケージ中のラベルまたはパッケージ説明書は、患者への抗体組成物の投与のための指示をさらに含有しなければならない。
パッケージ説明書は、上市される療法産物のパッケージ内に含まれる典型的な指示を含有し、これには、こうした療法産物に関する適応症、投与頻度、用量、投与経路、禁忌および/または注意に関するいくつかの情報が含まれる。1つの態様において、パッケージ挿入物は、該組成物が、癌、例えばHNSCC、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、TNBC、CRC、肝細胞癌、黒色腫、NSCLC、腎臓癌、卵巣癌、ホジキンリンパ腫、MSI CRC、白血病(急性白血病または骨髄芽球性白血病)、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群の治療のために用いられるよう意図されることを示す。
さらに物品は、薬学的に許容されうる緩衝液、例えば注射用の静菌水(BSVI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液を含む、第二のコンテナをさらに含んでもよい。さらに、物品には、商業的観点から、および消費者の観点から必要な他の産物、特に他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、注射針、およびシリンジも含まれてもよい。
本発明はまた、多様な目的のため、例えば哺乳動物の組織、細胞または体液におけるPD-L1の検出のために用いてもよいキットにも関する。こうしたキットは、PD-L1疾患に関連するスクリーニングに有用であろう。キットには、本発明の特異的結合剤または抗体、ならびに存在する場合、特定の結合剤または抗PD-L1抗体の反応を示すための手段が含まれる。1つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。1つの態様において、PD-L1に結合する抗体を標識する。別の態様において、抗体は未標識一次抗体であり、そしてキットは一次抗体を検出するための手段をさらに含む。1つの態様において、検出手段には、抗免疫グロブリンである標識二次抗体が含まれる。抗体を、蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透過性物質からなる群より選択されるマーカーで標識してもよい。キットは、例えばELISAまたはウェスタンブロッティングを実装することによって、PD-L1をin vitroで検出し、そして定量化するための抗体を含有するキットであってもよい。また、物品の場合のように、キットは、コンテナ、およびコンテナ上またはコンテナ内に位置する、ラベルまたはパッケージ挿入物を含む。コンテナは、本発明にしたがった、少なくとも1つの抗PD-L1抗体を含む組成物を保持する。さらなるコンテナは、例えば、希釈剤および緩衝剤、対照抗体を含んでもよい。パッケージ中のラベルまたはパッケージ説明書は、組成物の説明、ならびにin vitroでの、または診断目的のための、その使用に関する指示を含有してもよい。
診断使用および組成物
本発明の抗CD47/PD-L1抗体はまた、診断プロセス(例えばin vitro、ex vivo)でも用いられる。例えば、抗CD47/PD-L1抗体を、患者から得た試料(例えば組織試料または体液試料、例えば炎症性滲出物、血液、血清、間質液、唾液または尿)中のCD47および/またはPD-L1を検出するかまたはそのレベルを測定するために用いてもよい。検出および測定のために適した方法には、イムノアッセイ、例えばフローサイトメトリー、酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、および免疫組織学が含まれる。本発明にはさらに、キット、例えば本明細書記載の抗CD47/PD-L1抗体を含む診断キットが含まれる。
以下の実施例は、本発明をよりよく理解するために提供される。これらの実施例は、例示目的のみのためであり、そしていかなる方式でも、本発明の範囲を限定するとは見なされないものとする。
本明細書に引用される、すべての刊行物、特許および特許出願は、本明細書に援用される。前述の発明は、理解を明確にする目的のため、例示および例のために、ある程度詳細に記載されてきているが、当業者には、本発明に開示するアイディアに基づいて、付随する変形の本質および範囲から逸脱することなく、特定の変化および修飾を行ってもよいことがまったく明らかであろう。発明の実施。
実施例1. 哺乳動物細胞の懸濁培養における組換え抗原および抗体の産生。
ヒトCD47(Leu19~Val134)およびPD-L1(Phe19~Arg238)の細胞外ドメインの配列(配列番号107~108)を、哺乳動物細胞においてFcタグ化タンパク質を産生するためのプラスミド内に、SalI/NotI制限部位でクローニングした(図1)。大腸菌細胞において、必要量のプラスミドを産生し、そしてQ
iagenキットを用いて精製した。
哺乳動物細胞において、IgG1タンパク質を産生するためのプラスミド内に、抗CD47抗体(B6H12、Stanford University、US20130142786)の可変ドメインの配列をクローニングした。大腸菌細胞において、必要量のプラスミドを産生し、そしてQiagenキットを用いて精製した。
チャイニーズハムスター卵巣細胞から得た樹立細胞株(CHO-K1)において、抗体および抗原を生成した。血清不含培地(Life Technologies Corporation)を用い、そして製造者の指針にしたがって、軌道振盪装置上のフラスコ中で、懸濁培養を行った。一過性発現のため、直鎖ポリエチレンイミン(例えばPEI MAX、Polysciences)によって、210/mlの濃度の細胞をトランスフェクションした。DNA/PEI比は、1:3/1:10であった。トランスフェクションの5~7日後、2000g下で20分間、細胞培養を遠心分離し、そして0.22μmフィルターを通じて濾過した。アフィン(affine)HPLCによって、培養液から、ターゲットタンパク質を単離した。
アフィンHPLC用のプロテインAカラム上で、細胞培養から組換えFcタンパク質を単離し、そして精製した。清澄化した培養液を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)で平衡化した5ml HiTrap rプロテインA Sepharose FFカラム(GE Healthcare)に通過させた。次いで、カラムを5体積のPBSで洗浄して、非特異的結合構成要素を除去した。結合した抗原を0.1Mグリシン緩衝液(pH8)で溶出させた。主要タンパク質溶出ピークを収集し、そして1M Tris緩衝液(pH8)で中性pHにした。すべての段階を110cm/h流速下で行った。次いで、SnakeSkin透析チュービング技術を用いて、タンパク質をPBS(pH7.4)内に透析し、濾過し(0.22μm)、チューブ内にトランスファーし、そして-70℃で保存した。
非還元SDS-PAGE(12%ゲル)によって、得たタンパク質溶液の純度を評価した。図2。
実施例2. 全長抗体の調製。
標準技術によって、クローニングを行った。制限部位を含有するプライマーとともに、抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインの遺伝子を含むPCR産物を産生した。重鎖の可変ドメインを、Sal1/Nhe1制限部位で、ベクターpEE-Hc IgG1内にクローニングした。軽鎖可変ドメインを、Sal1/BsiW1制限部位で、ベクターpEE-CK内にクローニングした。得た遺伝子構築物を、CHO-T細胞株におけるタンパク質の一過性産生に用いた。実施例1に記載するように、細菌プロテインA上のアフィニティクロマトグラフィによって、標準法にしたがって、タンパク質を単離し、そして精製した。メルカプトエタノールを補充した12%変性PAGE(図3)、およびメルカプトエタノールを補充しない8%変性PAGE(図4)において、電気泳動を行った。
実施例3. 天然ヒトFabファージライブラリーMeganLibTMの操作
1000を超える個々のヒトドナーの血液試料由来のBリンパ球総RNAを、示唆されるプロトコルにしたがって、RNeasyミニキット(QIAGEN)を用いて単離した。Nanovueキット(GE Healthcare)を用いて、RNA濃度アッセイを行った;1.5%アガロースゲル電気泳動によって、単離RNAの品質を試験した。
MMuLV逆転写酵素およびプライマーとしてのランダム六量体オリゴヌクレオチドを用い、推奨されるプロトコルにしたがって、MMLV RTキット(Evrogen)を
用いて、逆転写反応を行った。
逆転写産物を2段階ポリメラーゼ連鎖反応のマトリックスとして用いて、制限部位に隣接する可変ドメインの遺伝子を得た;[J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274(26): 18218-30]によるプロトコルにしたがって、オリゴヌクレオチドキットを用いて、反応を行った。
得たDNA産物(VL-CK-VH)をNheI/Eco91I制限エンドヌクレアーゼで処理して、そして元来のファージミドpH5内に連結した。プロトコル[Methods Enzymol. 2000;328: 333-63.]にしたがって、連結産物を、SS320大腸菌エレクトロコンピテント細胞内に形質転換した。コンビナトリアルFabファージディスプレイライブラリーMeganLibTMのレパートリーは1011形質転換体であった。以前記載された方法[J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3): 581-97]にしたがって、Fabファージライブラリー産物を調製した。
実施例4. ヒトCD47抗原を用いたラマの免疫、およびラマ抗体断片のファージディスプレイライブラリーの生成
等体積の完全(最初の注射)または不完全(他の注射)フロイントアジュバントと混合した抗原材料を皮下投与することによって、動物ラマ(Lama Glama)を連続5回免疫した。実施例1の組換えヒトCD47タンパク質(1mg/注射)を抗原として用いた。抗原注射を以下の間隔:0、2、4、5、8週間間隔で行った。第3回から始めて、血液試料(50ml)を各注射後5回収集した。3.8%クエン酸ナトリウムを抗血液凝固剤として用いた(1:9)。血液を無菌生理食塩水溶液で2倍希釈した。次いで、30mlの希釈血液溶液を15mlのLymphoprepTM(Axis-Shield、ノルウェイ)培地(1.077g/mlの密度)上に上層し、そして800g下で20分間遠心分離した。単核細胞(リンパ球および単球)を血漿/Lymphoprep培地の相間ゾーンから選択し、そして無菌PBSで洗浄した。
CD47に対する血清免疫グロブリンの得た力価を標準プロトコルにしたがって評価すると、少なくとも1/100000であることがわかり、これは抗体のライブラリーを調製するために十分である。
プロトコル(QIAGEN)にしたがって、RNeasyミニキットを用いて、単核ラマ細胞由来の総RNAを単離した。Nanovue(GE Healthcare)を用いて、RNA濃度アッセイを行った;1.5%アガロースゲル電気泳動によって、単離RNAの品質を試験した。
MMuLV逆転写酵素およびランダム六量体プライマーを用い、推奨されるプロトコルにしたがって、MMLV RTキット(Evrogen)を用いて、逆転写反応を行った。
制限部位が隣接した、モノドメインVHH、scFvまたはFabの遺伝子を得るため、2段階ポリメラーゼ連鎖反応において、マトリックスとして逆転写産物を用いた;オリゴヌクレオチドキットおよび[FASEB J. 2007 Nov;21(13):3490-8]によるプロトコルを用いて、反応を行った。得たVHH遺伝子DNA産物を、NcoI/NotIリストリクターゼ(restrictase)で処理し、そして元来のファージミドpscFv内に連結し、これは、[FASEB J. 2007 Nov;21(13):3490-8]で用いられたpHEN2に組成が類似である。プロトコル[Methods Enzymol. 2000;328: 333-63.]にし
たがって調製したSS320エレクトロコンピテント細胞内に、連結産物を形質転換した。構築されたVHHに基づくライブラリーのレパートリーは0.5~210E+8の独立形質転換体であった。構築されたscFv/Fabに基づくライブラリーのレパートリーは、それぞれ、0.5~210E+9/1.2~2.510E+9の独立形質転換体であった。以前記載される方法[J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3): 581-97]にしたがって、ファージライブラリー産物を調製した。
実施例5. 抗体断片のファージディスプレイライブラリーの選択
[EMBO J. 1994 Jul 15;13(14):3245-60, Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):309-14; J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3): 581-97]に記載される慣用的な選択法によるが、KingFisher Flexデバイス技術は最大96の異なるスキームおよび変異体を同時に実行可能であるため、磁気ビーズおよびこの技術を用いて、ファージFab、VHH、またはscFvディスプレイライブラリー(実施例3、4)から、特異的抗CD47ファージ抗体を選択した。
第一ラウンドには10μg/ml、第二ラウンドには2μg/ml、第三ラウンドおよび第四ラウンドには、それぞれ、0.4および0.2μg/mlの濃度で、ストレプトアビジン磁気ビーズ(NEB)上に、ヒトビオチン化PD-L1/CD47抗原(Fc、EPEA)を意図的に固定した。回転装置上、室温で1時間、抗原をビーズとともにインキュベーションした。次いで、ビーズをPBS(pH7.4)で洗浄し、ビーズ表面を、PBS(pH7.4)中の2%脱脂乳または1%BSAの溶液で1時間ブロッキングした。ヒトファージライブラリーMeganLibTMを、2%脱脂乳およびターゲット抗原タグを含有する非ターゲット抗原を含むPBS(pH7.4)中、21013ファージ粒子/mlの濃度に希釈し、そして非特異的結合ファージを除去するため、表面上に抗原を含有しない磁気ビーズによってあらかじめ選択した。次いで、IL-5Rαコーティング磁気ビーズをMeganLibTMと室温で1~2時間インキュベーションした。
0.1% Tween-20を含有するPBS(pH7.4)の溶液で、磁気ビーズを数サイクル洗浄することによって、未結合ファージを除去した。洗浄サイクルの回数をラウンドごとに増加させた(第一ラウンドでは3洗浄サイクル、第二ラウンドでは9洗浄サイクル、そして第四周期では15洗浄サイクル)。磁気ビーズ表面上の抗原に結合したファージを攪拌下で15分間、100mM Gly-HCl溶液(pH2.2)でビーズから溶出させ、そして次いで、1M Tris-HCl(pH7.6)で中和した。大腸菌TG1細菌をファージに感染させ、培地中で増殖させ、そして次いで、次の選択サイクルに用いた。3または4ラウンド後、製造者(Qiagen)のプロトコルにしたがって、ファージミドDNAを大腸菌TG1培養から単離した。ターゲット抗原に対するライブラリーの濃縮および非特異的に結合しているファージ粒子の存在の評価のために、ポリクローナルファージ酵素イムノアッセイ(ELISA)を用いた。
実施例6. 特異的および非特異的抗原に対するポリクローナルファージのELISA。
ELISAを実行するため、ターゲット抗原(CD47/PD-L1)および非ターゲット抗原(Fc融合タンパク質を含む)を、高吸着プレート(Greiner-Bio)上に固定した。タンパク質を、0.1M NaHCO(pH9.0)中、それぞれ、1μg/mlおよび5μg/mlの濃度で添加し、そして2~7希釈の増分で力価決定し、次いで、密封したプレートを、4℃で一晩インキュベーションした。高性能自動化Tecan Freedom EVO 200に基づくロボットプラットホーム(Tecan)を用い、標準ELISAプロトコルにしたがって、すべての続く工程を行った。非特異的結合を遮断するため、プレートウェルに、PBS(pH7.4)中の2%脱脂乳または1
%BSAを含むブロッキング緩衝液を添加した。プレートを室温で1時間インキュベーションした。Tween 20(PBST)を含有するリン酸-生理食塩水緩衝液を用いた数回の洗浄サイクル後、50μl/ウェルの試験ポリクローナルファージを添加した。洗浄後、各ウェルを、PBST中の抗M13 HRPコンジュゲート化二次抗体(Pierce-ThermoScientific)(1:7500)でコーティングした(50μl/ウェル)。室温で50分間インキュベーションした後、プレートをPBSTで3回洗浄した。基質溶液(CHCOONa pH5.5中のH-0.02%およびTMB)を10分間添加することによって、比色シグナルを得た;次いで、1%硫酸(20μl)を添加することによって、発色をブロッキングした。適切なTecan-Sunriseプレート読み取り装置(Tecan)を用いて、色シグナルを450nmで測定した。
ポリクローナルファージ産物のELISAは、ターゲット抗原上での選択の第三および第四ラウンド後、有意な濃縮を示した。再クローニングおよびさらなるスクリーニングのため、ライブラリーを選択し、ここで、シグナルは、非相同対照抗原に対して、ファージライブラリーの最小希釈で、5倍を超えることが観察された。
実施例7
発現プラスミド内への抗体断片の遺伝子の再クローニング
選択の連続ラウンド後、制限連結技術を用い、標準プロトコルにしたがって、ファージミドベクターから発現プラスミド内への抗体可変ドメインの遺伝子の再クローニングを行った。
CD47に対して特異的であるVHHモノドメインまたはscFvが濃縮されたクローンの生じたプールを、VHHのC末端にmycおよびHis6タグ配列を所持する、T7プロモーターの制御下の発現プラスミドpET-22(Novagen)内に再クローニングした。CD47抗原に対する濃縮された配列を含むライブラリーのFab遺伝子を、lacプロモーターの制御下で、重鎖CH1ドメインのC末端にmycおよびHis6タグ配列をさらに含む、発現ベクターpLL4内に再クローニングした。
続いて、培地内に分泌し、そしてMabnextフローチャートプラットホームを用い、ELISAによって、抗原に対するディスプレイライブラリー由来の可変抗体断片のアフィニティの比較分析を行うことによって、抗体断片を生成するため、抗体断片を含む発現ベクターを大腸菌B121(DE3)Gold(Stratagene)内に形質転換した。
実施例8. ヒトCD47-Fcに対するscFvまたはVHHモノドメインの特異的結合の分析。
ELISAを用いて、ヒトCD47-Fcに対する実施例4の特異的試験抗体断片の結合を測定した。ELISAウェルプレート(Nunc ImmunoMaxisorp)を50μl/ウェルのヒトCD47-Fc(Biocad)(1Xコーティング炭酸緩衝液中の0.5μg/ml)で覆い、密封し、そして4℃で一晩インキュベーションした。GenetixQ-pix2xt(Molecular Devices)およびTecan Freedom EVO 200(Tecan)などのロボット系に基づく高性能自動化プラットホームで、標準ELISAプロトコルにしたがって、すべてのさらなる段階を実行した。ブロッキング緩衝液BB(200μl PBS中の0.5%脱脂乳)を添加することによって、非特異的結合をブロッキングした。プレートを、振盪装置上、室温で1時間インキュベーションした。PBS-Tweenで洗浄した後、各セル(cell)を、試験抗体断片を含有する細胞上清100μlでコーティングした。プレートを振盪装置上、室温で1時間インキュベーションし;さらに、各プレートウェルをPBS-Tw
een緩衝液で5回洗浄した。洗浄後、マウス抗MYC IgGクローン9E10(ThermoFisher Scientific)(50μl/ウェル)をPBS-Tweenに添加した(1:5000)。プレートを回転振盪装置中で振盪し(室温で50分間)、そして次いで上述のように、PBS-Tween緩衝液で5回洗浄した。洗浄後、抗マウスIgG HRPコンジュゲート(ThermoFisher Scientific)(50μl/ウェル)をPBS-Tweenに添加した(1:10000)。プレートを回転振盪装置中で振盪し(室温で50分間)、そして次いで上述のように、PBS-Tween緩衝液で5回洗浄した。飽和するまで(平均10~12分)、TMB(50μl/ウェル)を添加することによって、比色シグナルを得て;停止溶液(25μl/ウェル、1%硫酸)を添加することによって、さらなる発色をブロッキングした。適切なTecan-Sunriseプレート読み取り装置(Tecan)を用いて、450nmで色シグナルを測定した。抗体結合は、産生されるシグナルに比例した。色シグナルが、バックグラウンドシグナルの5倍を超えるクローンを、競合ELISAアッセイで試験して、[WO2016048188 A8]に記載されるものと同様の条件下で、そして試験抗体断片を含まない対照に比較して、4倍減少したシグナル下で、SIRP-Fcリガンド(BIOCAD)およびヒトCD47-Fc受容体の間の相互作用をブロッキングするアンタゴニスト性特異的抗体断片を同定した。
2400クローンのスクリーニングは、バックグラウンドよりも前記のように5倍を超えて高いシグナルを示す、265のscFvおよびVHHクローンを生じた。陽性クローンの前記パネルは、SIRP-Fcリガンド(BIOCAD)およびヒトCD47-Fc受容体の間の相互作用をブロッキング可能な、27のアンタゴニスト性クローンを生じた。3130xl Genetic分析装置(Applied Biosystems)上でのSanger配列決定によって、陽性クローン遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。少なくとも1つのアミノ酸で配列が異なるが、各々、他のものに少なくとも90%相同であるCDR領域を有する、6つの例示的なVHHモノドメインクローンが得られ、したがって、これらが、免疫されたラマにおいて、in vivo成熟により、1つの親クローンから派生したことを示した(表1)。
表1. ヒトCD47に対する、CD47特異的結合VHHモノドメインの配列。
Figure 2023130455000002
Figure 2023130455000003
Figure 2023130455000004
実施例9. ヒトCD47-Fcに対するFabの特異的結合の分析。
標準技術にしたがって、Fab産生を生じた:細菌細胞を、Fab遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換し、そして続いて、生じた形質転換体の培養中に、lacオペロンの転写を誘発する誘導因子を培地に添加して、Fabの発現を引き起こした。
次いで、ELISAを行って、ヒトCD47に結合するFabに関して検索した。
公表された配列を持つB6H12 Fab(実施例1を参照されたい)を陽性対照として用いた。特異的結合を試験するため、ELISAウェルプレート(培地結合、Greiner bio one)を50μl/ウェルのCD47 Fcラマ(1X炭酸緩衝液中の0.2μg/ml)で覆い、密封し、そして4℃で一晩インキュベーションした。Genetix Qpix2xt(Molecular Devices)およびTecan
Freedom EVO 200(Tecan)などのロボット系に基づく高性能自動化プラットホームで、標準ELISAプロトコルにしたがって、すべてのさらなる段階を実行した。ブロッキング緩衝液BB(200μl PBS中の0.5%脱脂乳)を添加することによって、非特異的結合をブロッキングした。プレートを、振盪装置上、室温で1時間インキュベーションした。PBS-Tweenで洗浄した後、各セル(cell)を、試験抗体断片を含有する細胞上清60μl/ウェルでコーティングした。プレートを、室温で1時間インキュベーションし;次いで、各プレートウェルをPBS-Tween緩衝液で3回洗浄した。洗浄後、PBS-Tween中の抗ヒトFab HRP-コンジュゲート化二次抗体(Pierce-ThermoScientific)(1:7500)で、各ウェルをコーティングした(50μl/ウェル)。プレートを室温で1時間インキュベーションし、そして上述のように、PBS-Tween緩衝液で3回洗浄した。飽和するまで(15分間)、TMB(50μl/ウェル)を添加することによって、さらなる比色シグナルを得て;停止溶液(25μl/ウェル、1%硫酸)を添加することによって、さらなる発色をブロッキングした。適切なTecan-Sunriseプレート読み取り装置(Tecan)を用いて、450nmで色シグナルを測定した。抗体結合は、産生されるシグナルに比例した。非特異的結合に対して、ELISAによって、色シグナルが対照抗体からのシグナルを超えるクローンを試験した。
実施例10. 多様なヒト抗原に対するFabの非特異的結合の分析。
二次スクリーニングは、全長CD47抗原と相互作用し、そして非特異的抗原と相互作用せず、そしてまた、SIRPaへの結合に関してリガンド(CD47)と競合する、Fab産生クローンの選択を目的とする。
ELISAを用いて、他の抗原に対する試験Fabの非特異的結合を分析した。分析を上述のように行ったが、3DHer3-H6E、INFα2b、PD-L1-Fc-ラマ(1x炭酸緩衝液中、2.5μg/ml)を固定のための抗原として用いた。CD47 FEおよびCD47 Fcラマ(1x炭酸緩衝液中、0.2μg/ml)を特異的結合対照として用いた。Genetix Qpix2xt(Molecular Device)およびTecan Freedom EVO 200(Tecan)などのロボット系に基づく高性能自動化プラットホームを用い、標準ELISAプロトコルにしたがって、すべてのさらなる工程を行った。
競合ELISAを用いて、SIRPa受容体との相互作用を遮断する能力に関して、あらかじめ選択した抗ヒトCD47特異的Fabを試験した。公表された配列を持つFab(実施例1を参照されたい)を、アンタゴニストの陽性対照として用いた。
ELISAウェルプレート(高結合、Greiner bio one)を50μl/ウェルのSIRPa(1X炭酸緩衝液中の0.5μg/ml)で覆い、そして4℃で一晩インキュベーションした。Genetix Qpix2xt(Molecular Devices)およびTecan Freedom EVO 200(Tecan)などのロボット系に基づく高性能自動化プラットホームで、標準ELISAプロトコルにしたがって、すべてのさらなる段階を実行した。ブロッキング緩衝液BB(200μl PBS中の0.5%脱脂乳)を添加することによって、非特異的結合をブロッキングした。プレ
ートを室温で1時間インキュベーションした。
平行して、試験FabおよびCD47 Fcラマ(PBS-Tween中の1μg/mlの最終濃度)を含む細胞上清を、非吸着プレート中、1:1の比で混合して、室温で45分間インキュベーションした。
SIRPa受容体含有プレートを洗浄して、BBを取り除いた後、FabおよびCD47 Fcラマの混合物をプレートにトランスファーし、室温で45分間インキュベーションした。次いで、各プレートウェルをPBS-Tween緩衝液で3回洗浄し、50μl/ウェルの抗ヒトFab HRP-コンジュゲート化二次抗体(Pierce-ThermoScientific)を、PBS-Tweenに添加した(1:7500)。プレートを室温で45分間インキュベーションし、そして上述のように、PBS-Tweenで3回洗浄した。飽和するまで(平均15分間)、TMB(50μl/ウェル)を添加することによって、比色シグナルを得て;停止溶液(25μl/ウェル、1%硫酸)を添加することによって、さらなる発色をブロッキングした。適切なTecan-Sunriseプレート読み取り装置(Tecan)を用いて、450nmで色シグナルを測定した。Fab結合は、産生される色シグナルに反比例した。対照Fabのレベルでブロッキングを示したクローンを陽性と見なし、そしてさらなるアッセイに用いた。Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer(Applied
Biosystems)上で、標準プロトコルにしたがって、陽性クローンの可変ドメインの遺伝子を配列決定し、そして分析した。
実施例11. 動力学解離定数koff(kdis)による抗CD47抗体断片の比較スクリーニング。
VHH抗体断片を測定して、CD47受容体に特異的に結合する抗体断片の相互作用の動力学パラメータの分析例を提供した。Octet Red 96およびARG2アミノ反応性バイオセンサー(Pall-ForteBio)を用いて、VHH断片に関する解離定数(kdis)に基づく比較スクリーニングを行った。試験溶液中の正確なタンパク質濃度に基づいてアフィニティ定数を計算してもよく、そして細胞増殖培地をタンパク質溶液として用い、そしてタンパク質濃度を測定しないため、その解離定数を用いることによって、候補を互いに比較した。バイオセンサーを水中で1時間、あらかじめ再水和した。バイオセンサーを活性化した後、酢酸緩衝液pH4中で10μg/mlの濃度のCD47-Fcを、バイオセンサー上に非特異的に(NH2基によって)固定した。次いで、センサーを、特異的VHH(培地1ml中の約1μgのVHHから)を含む細胞増殖培地を含有するウェルに浸し、ここで複合体を会合させた。次いで、センサーを緩衝溶液中に浸し、ここで複合体の解離の続く段階が起こった。10x作業緩衝液の体積の1/10を、抗CD47 VHH断片を含有する大腸菌増殖培地中で試験標本に添加した。1:1相互作用モデルを用いた標準法にしたがって、Octetデータ分析(バージョン7.0)を用いて、得た曲線を分析した。
抗CD47 VHH候補のkoffスクリーニングの結果を表2に示す。ヒトCD47へのすべてのVHH断片の特異的結合を示した:さらなる研究のため、顕著なkdisに基づいて、候補BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_C7_49をさらなる研究のために選択し、そして再クローニングして二重特異性抗体を得た。
表2. CD47-FcとVHHの動力学的解離定数
Figure 2023130455000005
実施例12. 非対称二重特異性抗CD47/PD-L1抗体の構築物の獲得および産生。
最適化されたscFv断片のすべての可変ドメインの配列、ならびに候補BCD106-02-VHH_C7_49(表3)の可変ドメインVHHの野生型および突然変異型の合成のための遺伝子、ならびに抗PD-L1抗体(BCD135、BIOCAD由来の元来のヒト抗体)の軽鎖および重鎖の可変ドメインの遺伝子の配列を、標準プロトコル[http://www.openwetware.org/wiki/DNA_Synthesis_from_Oligos]にしたがって、ASM-2000(Novosibirsk)合成装置上で得たオリゴヌクレオチドから、専有コンピュータアルゴリズムおよびPCR合成を用いた計算によって、新規に得た。一本鎖DNA分子から2工程PCR合成を用いることによって、VHおよびVL遺伝子から長鎖scFv遺伝子を得た。PCR合成後、アガロースゲル上で分画されたDNA断片を、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)カラム上で精製した。scFvおよびVHH遺伝子を、個々にプラスミドpEE-Fc(ノブ)内に連結する一方、aPD-L1特異的抗体の可変重鎖ドメインを、個々にプラスミドpEE-Fc(ホール)内に連結した。pEE-Fc(ノブ)は、突然変異S354C+T366Wを含むヒトIgG1 Fcを含有し、そしてpEE-Fc(ホール)は、突然変異Y349C+T366S+L368Aを含むヒトIgG1 Fcを含有し、最小限のホモ二量体化で、これらのFc部分の互いのヘテロ二量体化を提供し[Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81.]、これとともに、同様にpEE-Clambda内にクローニングしたaPD-L1軽鎖可変ドメインを、CHO-EBNA細胞中で同時一過性発現した。修飾LIC法[Aslanidis C, de Jong PJ. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 1990;18:6069-6074]による連結独立クローニング後、DNAを大腸菌内に形質転換した。正しい配列pEE-Fc(ノブ)-scFvまたはpEE-Fc(ノブ)-VHHを含む構築物を、pEE-BCD135-VH-299P-HC-ホールおよびpEE-BCD135-01 4LG VL hzau CLと同時トランスフェクションして、いわゆる非対称性二重特異性抗体
を得た(図6を参照されたい)。図は、非対称性二重特異性抗体、A-抗CD47 scFvおよび抗PD-L1 Fab結合断片に基づくもの、B-抗CD47 VHHおよび抗PD-L1 Fab結合断片に基づくものの模式的モデルを示す。実施例2にしたがって、CHO-T細胞株において、タンパク質を産生するために、生じた遺伝子構築物を用いた。精製後、抗体は組成において非常に均質であり、二重特異性抗体の産生収量は、60~260mg/ml培地の範囲であった。図7は、抗CD47 scFv断片に基づく精製二重特異性抗体の例を示す。図8は、抗CD47 VHH断片に基づく精製二重特異性抗体の例を示す。表3に示す配列VHH47Opt3を含有する抗体変異体は、非常に低い抗体収量を生じ、そしてさらなる試験から排除された。
表3. BCD106-02-VHH_C7_49クローン由来の抗CD47 VHHの野生型/突然変異体および抗PD-L1 BCD135の可変ドメインのアミノ酸配列。グレーは、野生型のもの以外の突然変異を含む抗CD47 VHH位を示す。
Figure 2023130455000006
実施例13. OctetRED96上での、ヒトPD-L1/CD47抗原と抗PD-L1/抗CD47 PD-L1二重特異性抗体の相互作用の分析。
ヒトPD-L1/CD47抗原と、PD-L1二重特異性抗体の相互作用の分析を、OctetRed96(Pall-ForteBio)上で行った。AR2GバイオセンサーをmQ中で1時間、あらかじめ再水和した。バイオセンサーを活性化した後、酢酸緩衝液pH4中で25μg/mlの濃度のPD-L1-FcまたはCD47-Fcを、バイオセンサー上に非特異的に(NH2基によって)固定した。次いで、センサーを、抗PD-L1/抗CD47抗体溶液(10μg/ml)を含有するウェル中に浸し、ここで抗体-抗原複合体を会合させた。次いで、続く解離工程のため、センサーを緩衝溶液中に浸した。参照シグナルを引いた後、標準法にしたがって、そして1:1相互作用モデルを用い、Octetデータ分析ソフトウェア(バージョン8.2)を用いて、結合曲線を分析した。
分析の結果を表4に示す。したがって、抗体は高アフィニティを有し、ここで、この形式の抗体におけるPD-L1抗原へのアフィニティはnM値を有する一方、CD47抗原に対するアフィニティはサブnM値を有する。こうした結合は、in vitroおよびin vivo療法活性の両方を続いて試験するために、抗体が、ターゲット細胞上の受容体と相互作用可能であるために十分と見なされる。
表4. 抗CD47/抗PD-L1二重特異性抗体の動力学的解離定数
Figure 2023130455000007
実施例14. Forte Bio Octet RED 384上での、抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体とカニクイザル(cynomolgus monkey)CD47およびPD-L1受容体の相互作用の分析。
動物CD47/PD-L1抗原に対する抗体アフィニティの実験的研究を、Forte
Bio Octert RED384上で行った。20μg/mlの濃度の抗体を、標準プロトコルおよび製造者の指示にしたがって、AR2Gセンサー(Forte Bio)上に固定した。作業緩衝液として、0.1% Tween 20および0.1% BSAを含むPBSを用いて、30℃で分析を行った。ベースライン記録後、センサーを、抗原溶液(動物CD47およびPD-L1)を含有するウェル内に300秒間浸し、ここで複合体を会合させた。次いで、緩衝溶液中の複合体解離を600秒間検出した。
参照シグナルを引いた後、標準法にしたがって、そして1:1 Global相互作用モデルを用い、Octetデータ分析(バージョン9.0)ソフトウェアを用いて、結合曲線を分析した。抗CD47抗体は、カニクイザル抗原CD47およびPD-L1に特異的に結合する。表5および表6。
表5. カニクイザル抗原(CD-47)に対する抗体の相互作用の動力学値。
Figure 2023130455000008
表6. カニクイザル抗原(PD-L1)に対する抗体の相互作用の動力学値。
Figure 2023130455000009
実施例15. Forte Bio Octet RED 384上での、抗原パネルに対する抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体の非特異的結合の分析。
非特異的hisタグ化抗原のパネルに対して、非特異的結合の実験的研究を行った。作業緩衝液として、0.1% Tween-20および0.1% BSAを含有するPBS中で10分間あらかじめ再水和した抗hIgG Fc捕捉(AHC)バイオセンサーを、測定に用いた。
30μg/mlの濃度の抗体を、抗hIgG Fc捕捉(AHC)センサー(Fort
e Bio)上に固定した。作業緩衝液として、0.1% Tween 20および0.1% BSAを含むPBSを用いて、30℃で分析を行った。ベースラインを緩衝溶液中で指示した(prescribe)後、センサーを、非特異的抗原溶液を含むウェル中に300秒間浸し、ここで複合体を会合させた。次いで、緩衝溶液中の複合体解離を600秒間検出した。
(参照シグナルを引いた後)標準法にしたがって、1:1 Global相互作用モデルを用い、Octetデータ分析(バージョン9.0)を用いて、結合曲線を分析した。抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体は、抗原パネルに非特異的に結合しない。
実施例16. Forte Bio Octet RED 384上での、FcγRIIIaパネルと抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体の相互作用の分析。
0.1% Tween-20および0.1% BSAを含有するPBS中で、30分間あらかじめ水和させたストレプトアビジン(SAX)バイオセンサーを用い、Forte
Bio Octert RED384上で、Fc結合タンパク質のパネルに対する抗体アフィニティの実験的研究を行った。
0.1% Tween-20および0.1% BSAを含有するFSB動力学緩衝液pH7.4中、5μg/mlの濃度のビオチン化Fc結合Aviタグ化タンパク質、FcγRIIIa-F158およびFcγRIIIa-V158を、0.4nmのシグナルレベルを達成するために必要な期間であるtRecLoadの固定で、ストレプトアビジン(SAX)センサー上に固定した。ベースライン記録後、センサーを、抗体溶液を含有するウェル内に60秒間浸し、ここで複合体を会合させた。次いで、緩衝溶液中の複合体解離を150秒間検出した。
(参照シグナルを引いた後)2:1 Global相互作用モデルを用いた標準法にしたがって、Octetデータ分析(バージョン9.0)を用いて、結合曲線を分析した。抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体は、Fc結合タンパク質FcγRIIIa-F158およびFcγRIIIa-V158に特異的に結合する。表7および表8。
表7. FcγRIIIa-F158に対する抗体BCD-106(02-001、03-006、02-013)の相互作用の動力学値。
Figure 2023130455000010
表8: FcγRIIIa-V158に対する抗体BCD-106(02-001、03-006、02-013)の相互作用の動力学値。
Figure 2023130455000011
実施例17. Forte Bio Octet RED 384上での、FcRnと抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体の相互作用の分析。
0.1% Tween-20および0.1% BSAを含有するPBS中で、30分間あらかじめ水和させたストレプトアビジン(SAX)バイオセンサーを用い、Forte
Bio Octert RED384上で、Fc結合タンパク質のパネルに対する抗体アフィニティの実験的研究を行った。
0.1% Tween-20を含有するPBS動力学緩衝液pH6中、5μg/mlの濃度のビオチン化Aviタグ化FcRnを、0.4nmのシグナルレベルを達成するために必要な期間であるtRecLoadの固定で、ストレプトアビジン(SAX)センサー上に固定した。緩衝溶液中でのベースライン記録後、センサーを、0.1% Tween-20を含有するPBS動力学緩衝液pH6中、抗体溶液を含有するウェル内に60秒間浸し、ここで複合体を会合させた。次いで、0.1% Tween-20および0.1%
BSAを含有するPBS動力学緩衝溶液、pH7.4中の複合体解離を150秒間検出した。
(参照シグナルを引いた後)2:1 Global相互作用モデルを用い、標準法にしたがって、Octetデータ分析(バージョン9.0)を用いて、結合曲線を分析した。抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体は、FcRnに特異的に結合する。表9。
表9. FcRnに対する抗体BCD-106(02-001、03-006、02-013)の相互作用の動力学値。
Figure 2023130455000012
実施例18. 抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体PD-L1が、PD-L1/
CD47陽性細胞に対して抗体依存性細胞傷害性を誘導する能力の分析。
ADCC(抗体依存性細胞傷害性)を実行するため、表面上にPD-L1/CD47受容体を発現するMDA-MB-231細胞株、および末梢血単核細胞(PBMC)を用いた。
末梢血単核細胞を得る
密度勾配中で、健康なドナー由来の静脈血細胞を分画することによって、PBMCを得た。単離後、2~5x10細胞/mlの濃度で、10%FBSを含有するRPMI-1640培地中、細胞を18~24時間、37℃および5%COで培養した。
ターゲット細胞の調製
MDA-MB-231細胞を、10%FBS(ウシ胎児血清)を含有するDMEM培地中、37℃および5%COで培養した。トリプシンを用いて、プラスチック表面から細胞を除去し、そして10%FBSを含有するDMEM中に再懸濁した。カルセインAMを5μMの濃度まで添加した。30分後、10%FBSを含有するDMEMで過剰なカルセインAMから細胞を2回洗浄した。10細胞/mlの濃度のターゲット細胞の懸濁物を、10%FBSを含有するDMEM中で調製した。
試験抗体の希釈の調製
すべての試験抗体を、10%FBSを含有するDMEM培地で、10μg/mlの濃度まで希釈した。5の増分での連続希釈シリーズを調製した。試験抗体の濃度は:10000;2000;400;80;16;3.2;0.64;0.128;0.0256;0(ng/ml)であった。
PBMCの調製
バイアルから単核リンパ球を収集し、そして200xg下で5分間、遠心分離した。5x10細胞/mlの濃度の細胞懸濁物を、10%FBSを含有するDMEM培地中で調製した。
ADCCアッセイの実行
50μl/ウェルの試験抗体を、96ウェルプレートのウェルに添加した。100μl/ウェルのターゲット細胞懸濁物を、抗体を含有するウェルに添加した。プレートを37℃および5%COで15~20分間インキュベーションした。50μl/ウェルのPBMC懸濁物を、抗体およびターゲット細胞を含有するウェルに添加した。10%FBSを含有するDMEM培地50μl/ウェル、100μlのターゲット細胞懸濁物および50μlのPBMC懸濁物を3つのウェルに添加した(最大溶解の対照、「KL」)。プレートを37℃および5%COで3.5~4時間インキュベーションした。インキュベーション終了の30分前に、溶解緩衝液をKLウェルに添加した。
インキュベーション後、200xg下で10分間プレートを遠心分離した。上清液を新規96ウェルプレートにトランスファーした。プレート蛍光測定装置を用いることによって、485/538nmの励起/放出波長で、相対蛍光で蛍光を測定した。
ADCC有効性を式:
Figure 2023130455000013
式中、
K-エフェクター細胞の存在下でのターゲット細胞の自発的溶解の対照(50μl/ウェルの10%FBSを含有するDMEM培地+100μl/ウェルのターゲット細胞+50μl/ウェルのPBMC)
KL-ターゲット細胞の最大溶解の対照(50μl/ウェルの10%FBSを含有するDMEM培地+100μl/ウェルのターゲット細胞+50μl/ウェルのPBMC+溶解緩衝液)
によって計算した。
結果を図9および10に示す。
得たデータにしたがって、すべての抗CD47/PD-L1抗体は、対照単一特異的抗CD47抗体(クローンB6H12)のものに匹敵するかまたはこれを超えるEC50値を示す。
実施例19. ヒトマクロファージ細胞による食作用の刺激に関する試験における、CD47/PD-L1に対する抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体の活性の比較
ADCP(抗体依存性細胞性食作用)を実行するため、表面上にPD-L1/CD47受容体を有するMDA-MB-231細胞株、およびヒトマクロファージ細胞を用いた。
ヒトマクロファージを得る
密度勾配分離によって、健康なドナーの静脈血から、末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。ヒトCD14陽性ヒト細胞の分画を単離するためのキット(Miltenyi Biotec)を用いて、ヒト血液単球を単離した。24ウェルプレートのウェルを用いて、10%FBS、100ng/mlのGM-CSF(Peprotech)を含有するRPMI-1640培地700μl中、350,000単球/ウェルを、37℃および5%COで3日間培養した。培養4日目、ウェルあたり、10%FBS、100ng/ml GM-CSF(Peprotech)、50ng/mlのIFNγ(Peprotech)および10ng/mlのLPS(Sigma)を含有するRPMI-1640 700μlを含有する新規培地で、培地を置き換え、細胞を37℃および5%COでさらに3日間培養した。
ターゲット細胞の調製
MDA-MB-231細胞を、10%FBS(ウシ胎児血清)を含有するDMEM培地中、37℃および5%COで培養した。トリプシンによって、プラスチック表面から細胞を除去し、そして10%FBSを含有するDMEM中に再懸濁した。カルセインAMを5μMの濃度まで添加した。30分後、10%FBSを含有するDMEMで過剰なカルセインAMから細胞を2回洗浄した。10細胞/mlの濃度のターゲット細胞の懸濁物を、10%FBSを含有するDMEM中で調製した。
ADCPアッセイの実行
マクロファージを含有するプレートウェルから培地を選択し、10%FBSおよび20μg/mlの試験抗体を含有するRPMI-1640培地500μlをウェルに添加した。500μl/ウェルのターゲット細胞懸濁物をウェルに添加した。プレートを37℃お
よび5%COで3時間インキュベーションした。次いで、培地を選択し、TrypLE
Express試薬によってプラスチック表面から細胞を除去し、そして蛍光標識した抗CD14抗体で染色した。染色細胞の懸濁物をフローサイトフルオロメーター上で分析した。
ADCP有効性を式:
Figure 2023130455000014
式中、カルセインCD14は、カルセイン色素を含有するCD14陽性細胞の数であり、CD14はすべてのCD14陽性細胞の数である
によって計算した。
結果を図11に示す。
得たデータにしたがって、抗CD47/PD-L1抗体の数は、ヒトマクロファージによるMDA-MB-231細胞株の食作用を刺激する際の有効性を示し、これは、対照単一特異的抗CD47抗体(クローンB6H12)のものに匹敵する。
実施例20. ヒト赤血球凝集に対する抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体候補の影響の比較
ヒト赤血球を用いて、抗体が赤血球凝集を引き起こす能力を分析した。
赤血球懸濁物の調製
健康なドナー静脈から真空ヘパリンチューブ内に血液試料を採取した。9mlの血液を50ml遠心管内に移した。血液を、Ca2+およびMg2+を含まないDPBSで、室温で30mlに希釈した。懸濁物を800g下で10分間遠心分離し、上清をデカントした。細胞洗浄処置を、Ca2+およびMg2+を含まないDPBS、ならびに遠心分離で2回反復した。次いで、300μlの細胞ペレットを30mlのDPBSに再懸濁し、1%赤血球懸濁物を生じた。
赤血球凝集アッセイの実行
試験抗体をDPBS中で20μg/mlの濃度に希釈した。100μlの抗体希釈物および赤血球懸濁物を96ウェル丸底プレート中で混合した。プレートをCO2インキュベーター中で、37℃で16時間インキュベーションした。恣意的な4+スケール(4 cross scale)を用いて、結果を視覚的に文書化した。有意な陽性結果は2+およびそれより上である。結果を表10に示す。
表10. 抗CD47/PD-L1抗体の存在下での赤血球凝集反応。「-」は、凝集の非存在を示す。
Figure 2023130455000015
得たデータにしたがって、抗CD47/PD-L1抗体はいずれも赤血球凝集を引き起こさない一方、参照抗CD47モノクローナル抗体(クローンB6H12)は、抗体の二価特性、そしてその結果としての異なる赤血球上に位置する2つのCD47分子と相互作用する能力によって、有意な凝集を引き起こす。
実施例21. 二重特異性抗CD47/PD-L1抗体の補体依存性細胞傷害性(CDC)の分析。
CDC分析(補体依存性細胞傷害性)を行うため、PD-L1およびCD47受容体を表面上に含有するMDA-MB-231細胞株をターゲット細胞として用いた。
ターゲット細胞の調製
MDA-MB-231培養を、10%ウシ胎児血清(FBS)を補充したDMEM培地中で培養した。
トリプシンによって、プラスチック表面から細胞を除去し、そして1x10細胞/mlの濃度で、0.1%BSAを含有するDMEM培地中に懸濁した。
試験抗体の希釈の調製
すべての試験抗CD47/PD-L1抗体を、0.1%BSAを含有するDMEM培地で、100μg/mlの濃度まで希釈した。8の増分の一連の連続希釈を調製した。試験抗体の濃度は:100000;12500;1562.5;195.3;24.4;3.05;0.38;0.04;0.005(ng/ml)であった。
CDC試験の実行
ヒト補体を融解し、そして0.1%BSAを含有するDMEM培地中、1:4に溶解した。
試験抗体の各希釈の50μl/ウェルを96ウェルプレートのウェルに添加し、各抗体標本に関して0.1%BSAを含有するDMEM培地を補充した培地50μl/ウェルを細胞対照とし、0.1%BSAを含有するDMEM培地150μl/ウェルを培地対照とした。
50μl/ウェルのMDA-MB-231細胞の懸濁物を、試験抗体および細胞対照を含有する各ウェルに添加した。
希釈した補体の50μl/ウェルを、試験抗体および細胞対照を含有するすべてのウェルに添加した。プレートを、軌道振盪装置上、室温で2~4分間振盪し、COインキュベーター中に37℃で2~3時間入れた。
15μlのAlamar Blue試薬を試験プレートのウェルに添加した。プレートを軌道振盪装置上、室温で10~20分間振盪した。プレートをCOインキュベーター中で18~24時間さらにインキュベーションした。
プレートを軌道振盪装置上、室温で10~20分間振盪した。
プレートフルオロメーターを用いることによって、544/590nmの励起/放出波長で、相対蛍光単位を用いて、蛍光を測定した。得た蛍光シグナルは生存細胞数に比例する。結果を図12~15に示す。
得たデータにしたがって、試験抗体は、MDA-MB-231細胞株の補体依存性細胞傷害性(CDC)を引き起こさない。
実施例22. PD-L1膜受容体を所持する細胞培養に対する抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体のアンタゴニスト活性の分析。
PD-L1受容体に対する抗PD-L1/抗CD47抗体のアンタゴニスト活性を分析するため、前記抗体が、PD-L1産生細胞との共培養中に、Jurkat-PD1-NFAT-Luc受容体細胞株におけるルシフェラーゼシグナルを再活性化する能力を評価
した。
PD-L1産生細胞の調製
MDA-MB-231培養を、10%ウシ胎児血清(FBS)を補充したDMEM培地中で培養した。
トリプシンによってプラスチック表面から細胞を除去し、そして10%FBSおよび20ng/mlのインターフェロンガンマを含有するDMEM培地中、110細胞/mlの濃度で懸濁した。次いで、200μl/ウェルの細胞懸濁物を、白色96ウェルプレートのウェルに添加し、そしてCOインキュベーター中、37℃および5%COで48時間インキュベーションした。
試験抗体の希釈の調製
試験した抗CD47/PD-L1抗体すべてを、10%FBSを含有するRPMI-1640培地で、5μg/mlの濃度まで希釈した。3の増分で、一連の連続希釈を調製した。試験抗体の濃度は:2500;833.3;277.7;92.5;30.8;10.2;3.4;1.1(ng/ml)であった。
・Jurkat-PD1-NFAT-Luc細胞の調製
・実験当日、10%FBSを含有するRPMI-1640培地中、2.510細胞/mlの濃度で、Jurkat-PD1-NFAT-Luc細胞の懸濁物を調製した。
・活性化抗体の溶液の調製
・実験当日、活性化抗体の10倍混合物を調製した(10%FBSを含有するRPMI-1640培地中、4μg/mlの抗CD3;4μg/mlの抗CD28;16μg/mlの抗マウス)。
・試験の実行
・MDA-MB-231細胞を含有するプレートから、増殖培地を除去した。40μl/ウェルの抗体希釈物を、細胞を含有するウェルに添加した。10%FBSを含有するRPMI 1640培地40μl/ウェルを対照ウェル(試験抗体を含まない細胞、試験および活性化抗体を含まない細胞)に添加し、そして室温で30分間インキュベーションした。
・次いで、40μl/ウェルのJurkat-PD1-NFAT-Luc細胞懸濁物をすべてのウェルに添加した。次いで、活性化抗体の10倍溶液10μl/ウェルを、対照ウェル「試験および活性化抗体を含まない細胞」を除く、すべてのウェルに添加した。細胞を、COインキュベーター中、37℃および5%COで6時間インキュベーションした。
・ルシフェラーゼ基質One-Gloルシフェラーゼアッセイ系「Promega」を、1:1の比ですべてのウェル内に導入した(90μl/ウェル)。5~10分後、プレート読み取り装置を用いて、発光レベルを測定した。
・得た結果にしたがって、試験抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体、ならびに対照抗PD-L1単一特異的抗体は、PD-L1依存性シグナル伝達経路のアンタゴニストであり、そしてしたがって、PD-L1受容体を所持する細胞に対して、T細胞依存性細胞傷害性を刺激することも可能である。
実施例25. 抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体産物の均一性の分析。
二重特異性抗体の均一性を、UV検出装置を備えたサイズ排除HPLC(SEC HPLC)によって分析した。粒子直径7μm、注文番号08543のプレカラムTosoh
TSKgel Guard SWXL、6.0mmx4.0cmとともに、カラムTosoh TSK-Gel G3000SWXL、7.8mmx30cm、注文番号08541上のHPLC系(Agilent)上でクロマトグラフィを行った。220および280nmの波長で検出を行った。図17は、VHH47Opt2に基づく、産物BCD106-02-013の例示的なHPLCプロファイルを示す(実施例12を参照されたい)。試験の結果にしたがって、分子BCD106-02-013は、単量体凝集組成物中、93%均質である産物を生成し、そしてこれはin vitroおよびin vivoの続く試験に適用可能である。
実施例25. 抗PD-L1/抗CD47二重特異性抗体産物の均一性の分析。
二重特異性抗体の均一性を、UV検出装置を備えたサイズ排除HPLC(SEC HPLC)によって分析した。粒子直径7μm、注文番号08543のプレカラムTosoh TSKgel Guard SWXL、6.0mmx4.0cmとともに、カラムTosoh TSK-Gel G3000SWXL、7.8mmx30cm、注文番号08541上のHPLC系(Agilent)上でクロマトグラフィを行った。220および280nmの波長で検出を行った。図17は、VHH47Opt2に基づく、産物BCD106-02-013の例示的なHPLCプロファイルを示す(実施例12を参照されたい)。試験の結果にしたがって、分子BCD106-02-013は、単量体凝集組成物中、93%均質である産物を生成し、そしてこれはin vitroおよびin vivoの続く試験に適用可能である。
非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
[態様1]
CD47およびPD-L1に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、CD47に対する1つの結合部位、およびPD-L1に対する少なくとも1つの結合部位を含む、前記抗体。
[態様2]
抗体が全長抗体であるかまたはその抗原結合断片であることで特徴づけられる、態様1記載の抗体。
[態様3]
抗体に、PD-L1に対する1つまたは2つの結合部位が含まれることで特徴づけられる、態様1記載の抗体。
[態様4]
CD47に対する結合部位が、CD47受容体およびSIRPαリガンドの間の相互作用を阻害し、ならびに/あるいは、PD-L1に対する結合部位が、PD-L1とPD-1受容体の相互作用を阻害することで特徴づけられる、態様1記載の抗体。
[態様5]
CD47に対する結合部位に、CDR1、CDR2、CDR3配列を含む重鎖可変ドメインが含まれ、ここでCDR1が、以下の配列番号1~4の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列であり、CDR2が、以下の配列番号6~15の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列であり、CDR3が、以下の配列番号17~20の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列である、態様1記載の抗体。
[態様6]
CD47に対する結合部位に、CDR1、CDR2、CDR3配列を含有する重鎖可変ドメインが含まれ、ここでCDR1が、以下の配列番号1~4の群より選択される配列であり、CDR2が、以下の配列番号6~15の群より選択される配列であり、CDR3が、以下の配列番号17~20の群より選択される配列である、態様1記載の抗体。
[態様7]
CD47に対する前記結合部位に、態様4記載の重鎖可変ドメイン、およびCDR1、CDR2、CDR3配列を含む軽鎖可変ドメインが含まれ、ここでCDR1が、以下の配列番号22~34の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列であり、CDR2が、以下の配列番号36~48の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列であり、CDR3が、以下の配列番号50~64の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列である、態様1記載の抗体。
[態様8]
CD47に対する結合部位に、態様4記載の重鎖可変ドメイン、およびCDR1、CDR2、CDR3配列を含む軽鎖可変ドメインが含まれ、ここでCDR1が、以下の配列番号22~34の群より選択される配列であり、CDR2が、以下の配列番号36~48の群より選択される配列であり、CDR3が、以下の配列番号50~64の群より選択される配列である、態様1記載の抗体。
[態様9]
CD47に対する結合部位に、以下の配列番号66~88の群より選択される配列に少なくとも90%相同である配列を含む重鎖可変ドメイン、および以下の配列番号89~106の群の配列に少なくとも90%相同である配列を含む軽鎖可変ドメインが含まれることで特徴づけられる、態様1記載の抗体。
[態様10]
CD47に対する結合部位に、以下の配列番号66~88の群より選択される配列を含む重鎖可変ドメイン、および以下の配列番号89~106の群より選択される配列を含む軽鎖可変ドメインが含まれることで特徴づけられる、態様1記載の抗体。
[態様11]
PD-L1に対する結合部位が、以下:配列番号5、配列番号16および配列番号21と少なくとも80%相同である配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに以下:配列番号35、配列番号49および配列番号65と少なくとも80%相同である配列を含む軽鎖可変ドメインを含むことで特徴づけられる、態様1記載の抗体。
[態様12]
PD-L1に対する結合部位が、以下の配列:配列番号5、配列番号16および配列番号21を含む重鎖可変ドメイン、ならびに以下の配列:配列番号35、配列番号49および配列番号65を含む軽鎖可変ドメインを含むことで特徴づけられる、態様1記載の抗体。
[態様13]
CD47に対する結合部位が、Fab、scFv、scFab、あるいは単離されたVHまたはVHHモノドメインであることで特徴づけられる、態様1記載の抗体。
[態様14]
PD-L1に対する結合部位が、Fab、scFv、scFab、あるいは単離されたVHまたはVHHモノドメインであることで特徴づけられる、態様1記載の抗体。
[態様15]
抗体依存性細胞傷害性、マクロファージ仲介性食作用、および/またはT細胞仲介性細胞傷害性を、表面上にCD47および/またはPD-L1抗原を所持する細胞の割合で引き起こすことで特徴づけられる、態様1記載の抗体。
[態様16]
突然変異または修飾を含まない同じ抗体と比較して、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性(ADCC)および/または補体依存性細胞傷害性(CDC)を増加させる、少なくとも1つの突然変異または修飾を含むFc断片を含むことで特徴づけられる、態様1記載の抗体。
[態様17]
癌治療のための医薬品として使用するための、態様1~16のいずれか記載の抗体。
[態様18]
態様1~16のいずれか記載の抗体をコードする、核酸。
[態様19]
核酸がDNAである、態様18記載の核酸。
[態様20]
態様18~19のいずれか記載の核酸を含む、発現ベクター。
[態様21]
態様20記載のベクターでの細胞の形質転換を含む、態様1~16のいずれか記載の抗体を産生するための宿主細胞を得る方法。
[態様22]
態様18~19のいずれか記載の核酸を含む、態様1~16のいずれか記載の抗体を得る宿主細胞。
[態様23]
特定された抗体を得るために十分な条件下で、培地中、態様22記載の宿主細胞を培養し、必要であればその後、得た抗体を単離し、そして精製することからなる、態様1~16のいずれか記載の抗体を得る方法。
[態様24]
PD-L1およびCD47によって仲介される疾患または障害の防止または治療のための薬学的組成物であって、1つまたはいくつかの薬学的に許容されうる賦形剤と組み合わせた、態様1~16のいずれか記載の抗体を含む、前記薬学的組成物。
[態様25]
(HNSCC)頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、TNBC(三重陰性乳癌)、CRC(結腸直腸癌)、肝細胞癌、黒色腫、NSCLC(非小細胞肺癌)、腎臓癌、卵巣癌、MSI CRC(マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌)、白血病(急性白血病または骨髄芽球性白血病)、リンパ腫、多発性骨髄腫、乳癌、前立腺癌、肉腫、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、TおよびB細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンB細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、膵臓癌、および高リスク骨髄異形成症候群からなる群より選択される、PD-L1およびCD47によって仲介される疾患または障害の防止または治療のために意図される、態様24記載の薬学的組成物。
[態様26]
PD-L1およびCD47によって仲介される疾患または障害を治療する方法であって、こうした治療の必要がある被験体に、態様1~16のいずれか記載の抗体、または態様24記載の薬学的組成物を、療法的に有効な量で投与する工程を含む、前記方法。
[態様27]
疾患または障害が、(HNSCC)頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、TNBC(三重陰性乳癌)、CRC(結腸直腸癌)、肝細胞癌、黒色腫、NSCLC(非小細胞肺癌)、腎臓癌、卵巣癌、MSI CRC(マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌)、白血病(急性白血病または骨髄芽球性白血病)、リンパ腫、多発性骨髄腫、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、肝細胞癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、TおよびB細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンB細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、膵臓癌、卵巣癌、急性骨髄芽球性白血病および高リスク骨髄異形成症候群からなる群より選択される、態様26記載の治療法。
[態様28]
PD-L1および/またはCD47の生物学的活性の阻害が必要である被験体において、PD-L1および/またはCD47の生物学的活性を阻害するための方法であって、態様1~16のいずれか記載の抗体の有効量を被験体に投与する工程を含む、前記方法。
[態様29]
PD-L1およびCD47によって仲介される疾患または障害の治療の必要がある被験体の、PD-L1およびCD47によって仲介される疾患または障害の治療ための、態様1~16のいずれか記載の抗体または態様24記載の薬学的組成物の使用。
[態様30]
疾患または障害が、(HNSCC)頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、TNBC(三重陰性乳癌)、CRC(結腸直腸癌)、肝細胞癌、黒色腫、NSCLC(非小細胞肺癌)、腎臓癌、卵巣癌、MSI CRC(マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌)、白血病(急性白血病または骨髄芽球性白血病)、リンパ腫、多発性骨髄腫、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、肝細胞癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、TおよびB細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンB細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、膵臓癌、卵巣癌、急性骨髄芽球性白血病および高リスク骨髄異形成症候群からなる群より選択される、態様29記載の抗体の使用。

Claims (30)

  1. CD47およびPD-L1に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、CD47に対する1つの結合部位、およびPD-L1に対する少なくとも1つの結合部位を含む、前記抗体。
  2. 抗体が全長抗体であるかまたはその抗原結合断片であることで特徴づけられる、請求項1記載の抗体。
  3. 抗体に、PD-L1に対する1つまたは2つの結合部位が含まれることで特徴づけられる、請求項1記載の抗体。
  4. CD47に対する結合部位が、CD47受容体およびSIRPαリガンドの間の相互作用を阻害し、ならびに/あるいは、PD-L1に対する結合部位が、PD-L1とPD-1受容体の相互作用を阻害することで特徴づけられる、請求項1記載の抗体。
  5. CD47に対する結合部位に、CDR1、CDR2、CDR3配列を含む重鎖可変ドメインが含まれ、ここでCDR1が、以下の配列番号1~4の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列であり、CDR2が、以下の配列番号6~15の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列であり、CDR3が、以下の配列番号17~20の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列である、請求項1記載の抗体。
  6. CD47に対する結合部位に、CDR1、CDR2、CDR3配列を含有する重鎖可変ドメインが含まれ、ここでCDR1が、以下の配列番号1~4の群より選択される配列であり、CDR2が、以下の配列番号6~15の群より選択される配列であり、CDR3が、以下の配列番号17~20の群より選択される配列である、請求項1記載の抗体。
  7. CD47に対する前記結合部位に、請求項4記載の重鎖可変ドメイン、およびCDR1、CDR2、CDR3配列を含む軽鎖可変ドメインが含まれ、ここでCDR1が、以下の配列番号22~34の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列であり、CDR2が、以下の配列番号36~48の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列であり、CDR3が、以下の配列番号50~64の群より選択される配列に少なくとも80%相同である配列である、請求項1記載の抗体。
  8. CD47に対する結合部位に、請求項4記載の重鎖可変ドメイン、およびCDR1、CDR2、CDR3配列を含む軽鎖可変ドメインが含まれ、ここでCDR1が、以下の配列番号22~34の群より選択される配列であり、CDR2が、以下の配列番号36~48の群より選択される配列であり、CDR3が、以下の配列番号50~64の群より選択される配列である、請求項1記載の抗体。
  9. CD47に対する結合部位に、以下の配列番号66~88の群より選択される配列に少なくとも90%相同である配列を含む重鎖可変ドメイン、および以下の配列番号89~106の群の配列に少なくとも90%相同である配列を含む軽鎖可変ドメインが含まれることで特徴づけられる、請求項1記載の抗体。
  10. CD47に対する結合部位に、以下の配列番号66~88の群より選択される配列を含む重鎖可変ドメイン、および以下の配列番号89~106の群より選択される配列を含む軽鎖可変ドメインが含まれることで特徴づけられる、請求項1記載の抗体。
  11. PD-L1に対する結合部位が、以下:配列番号5、配列番号16および配列番号21と少なくとも80%相同である配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに以下:配列番号35、配列番号49および配列番号65と少なくとも80%相同である配列を含む軽鎖可変ドメインを含むことで特徴づけられる、請求項1記載の抗体。
  12. PD-L1に対する結合部位が、以下の配列:配列番号5、配列番号16および配列番号21を含む重鎖可変ドメイン、ならびに以下の配列:配列番号35、配列番号49および配列番号65を含む軽鎖可変ドメインを含むことで特徴づけられる、請求項1記載の抗体。
  13. CD47に対する結合部位が、Fab、scFv、scFab、あるいは単離されたVHまたはVHHモノドメインであることで特徴づけられる、請求項1記載の抗体。
  14. PD-L1に対する結合部位が、Fab、scFv、scFab、あるいは単離されたVHまたはVHHモノドメインであることで特徴づけられる、請求項1記載の抗体。
  15. 抗体依存性細胞傷害性、マクロファージ仲介性食作用、および/またはT細胞仲介性細胞傷害性を、表面上にCD47および/またはPD-L1抗原を所持する細胞の割合で引き起こすことで特徴づけられる、請求項1記載の抗体。
  16. 突然変異または修飾を含まない同じ抗体と比較して、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性(ADCC)および/または補体依存性細胞傷害性(CDC)を増加させる、少なくとも1つの突然変異または修飾を含むFc断片を含むことで特徴づけられる、請求項1記載の抗体。
  17. 癌治療のための医薬品として使用するための、請求項1~16のいずれか記載の抗体。
  18. 請求項1~16のいずれか記載の抗体をコードする、核酸。
  19. 核酸がDNAである、請求項18記載の核酸。
  20. 請求項18~19のいずれか記載の核酸を含む、発現ベクター。
  21. 請求項20記載のベクターでの細胞の形質転換を含む、請求項1~16のいずれか記載の抗体を産生するための宿主細胞を得る方法。
  22. 請求項18~19のいずれか記載の核酸を含む、請求項1~16のいずれか記載の抗体を得る宿主細胞。
  23. 特定された抗体を得るために十分な条件下で、培地中、請求項22記載の宿主細胞を培養し、必要であればその後、得た抗体を単離し、そして精製することからなる、請求項1~16のいずれか記載の抗体を得る方法。
  24. PD-L1およびCD47によって仲介される疾患または障害の防止または治療のための薬学的組成物であって、1つまたはいくつかの薬学的に許容されうる賦形剤と組み合わせた、請求項1~16のいずれか記載の抗体を含む、前記薬学的組成物。
  25. (HNSCC)頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、TNBC(三重陰性乳癌)、CRC(結腸直腸癌)、肝細胞癌、黒色腫、NSCLC(非小細胞肺癌)、腎臓癌、卵巣癌、MSI CRC(マイクロサテライト不安定性
    を伴う結腸直腸癌)、白血病(急性白血病または骨髄芽球性白血病)、リンパ腫、多発性骨髄腫、乳癌、前立腺癌、肉腫、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、TおよびB細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンB細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、膵臓癌、および高リスク骨髄異形成症候群からなる群より選択される、PD-L1およびCD47によって仲介される疾患または障害の防止または治療のために意図される、請求項24記載の薬学的組成物。
  26. PD-L1およびCD47によって仲介される疾患または障害を治療する方法であって、こうした治療の必要がある被験体に、請求項1~16のいずれか記載の抗体、または請求項24記載の薬学的組成物を、療法的に有効な量で投与する工程を含む、前記方法。
  27. 疾患または障害が、(HNSCC)頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、TNBC(三重陰性乳癌)、CRC(結腸直腸癌)、肝細胞癌、黒色腫、NSCLC(非小細胞肺癌)、腎臓癌、卵巣癌、MSI CRC(マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌)、白血病(急性白血病または骨髄芽球性白血病)、リンパ腫、多発性骨髄腫、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、肝細胞癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、TおよびB細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンB細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、膵臓癌、卵巣癌、急性骨髄芽球性白血病および高リスク骨髄異形成症候群からなる群より選択される、請求項26記載の治療法。
  28. PD-L1および/またはCD47の生物学的活性の阻害が必要である被験体において、PD-L1および/またはCD47の生物学的活性を阻害するための方法であって、請求項1~16のいずれか記載の抗体の有効量を被験体に投与する工程を含む、前記方法。
  29. PD-L1およびCD47によって仲介される疾患または障害の治療の必要がある被験体の、PD-L1およびCD47によって仲介される疾患または障害の治療ための、請求項1~16のいずれか記載の抗体または請求項24記載の薬学的組成物の使用。
  30. 疾患または障害が、(HNSCC)頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、TNBC(三重陰性乳癌)、CRC(結腸直腸癌)、肝細胞癌、黒色腫、NSCLC(非小細胞肺癌)、腎臓癌、卵巣癌、MSI CRC(マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌)、白血病(急性白血病または骨髄芽球性白血病)、リンパ腫、多発性骨髄腫、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、肝細胞癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、TおよびB細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンB細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、膵臓癌、卵巣癌、急性骨髄芽球性白血病および高リスク骨髄異形成症候群からなる群より選択される、請求項29記載の抗体の使用。
JP2023112302A 2017-10-03 2023-07-07 Cd47およびpd-l1に特異的な抗体 Pending JP2023130455A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201791961A EA039662B1 (ru) 2017-10-03 2017-10-03 Антитела, специфичные к cd47 и pd-l1
EA201791961 2017-10-03
JP2020519341A JP2020535839A (ja) 2017-10-03 2018-10-03 Cd47およびpd−l1に特異的な抗体
PCT/EA2018/050001 WO2019068302A1 (ru) 2017-10-03 2018-10-03 Антитела, специфичные к cd47 и pd-l1

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020519341A Division JP2020535839A (ja) 2017-10-03 2018-10-03 Cd47およびpd−l1に特異的な抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023130455A true JP2023130455A (ja) 2023-09-20

Family

ID=65994976

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020519341A Pending JP2020535839A (ja) 2017-10-03 2018-10-03 Cd47およびpd−l1に特異的な抗体
JP2023112302A Pending JP2023130455A (ja) 2017-10-03 2023-07-07 Cd47およびpd-l1に特異的な抗体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020519341A Pending JP2020535839A (ja) 2017-10-03 2018-10-03 Cd47およびpd−l1に特異的な抗体

Country Status (21)

Country Link
US (1) US11840567B2 (ja)
EP (1) EP3693390A4 (ja)
JP (2) JP2020535839A (ja)
KR (1) KR20200058542A (ja)
CN (1) CN111801352A (ja)
AR (1) AR113342A1 (ja)
AU (1) AU2018345458A1 (ja)
BR (1) BR112020006706A2 (ja)
CA (1) CA3078413A1 (ja)
CL (1) CL2020000919A1 (ja)
CO (1) CO2020004199A2 (ja)
EA (1) EA039662B1 (ja)
EC (1) ECSP20024555A (ja)
JO (1) JOP20200078A1 (ja)
MA (1) MA49599B1 (ja)
MX (1) MX2020004027A (ja)
PE (1) PE20210460A1 (ja)
PH (1) PH12020550214A1 (ja)
TW (1) TWI768129B (ja)
WO (1) WO2019068302A1 (ja)
ZA (1) ZA202002047B (ja)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3035681A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Heterodimeric immunoglobulin constructs and preparation methods thereof
PE20191080A1 (es) 2016-11-18 2019-08-20 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo biespecifico heterodimerico estructural de anticuerpo natural anti-pd-1/anti-her2 y metodo para preparar el mismo
KR20200093639A (ko) 2017-12-04 2020-08-05 북경한미약품 유한공사 천연 항체 구조-유사 헤테로다이머 형태의 항 pd-l1/항 cd47 이중특이성 항체 및 이의 제조
CN109970860A (zh) * 2017-12-27 2019-07-05 信达生物制药(苏州)有限公司 三链抗体、其制备方法及其用途
EP3740507A4 (en) 2018-01-15 2022-08-24 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND VARIANTS THEREOF AGAINST PD-1
WO2019153200A1 (zh) 2018-02-08 2019-08-15 北京韩美药品有限公司 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备
EP3564263A1 (en) * 2018-05-03 2019-11-06 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Fusion proteins comprising a cell surface marker specific vhh
WO2020233539A1 (en) * 2019-05-17 2020-11-26 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Anti-cd47/anti-pd-l1 multiple antigen binding proteins and methods of use thereof
BR112021026414A2 (pt) * 2019-06-25 2022-04-12 Innovent Biologics Suzhou Co Ltd Formulação compreendendo o anticorpo biespecífico anti-cd47/pd-l1, método para preparo e uso do mesmo
EP3998287A4 (en) * 2019-07-08 2023-08-09 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. ANTI-CD47/ANTI-PD-1 BISPECIFIC ANTIBODY, METHOD FOR ITS PRODUCTION AND ITS USE
US20230340157A1 (en) * 2019-09-27 2023-10-26 Beijing Starmab Biomed Technology Ltd Monospecific and multi-specific antibodies
CN112745392B (zh) * 2019-10-30 2022-07-01 上海洛启生物医药技术有限公司 抗pd-l1/cd47双特异性抗体及其用途
WO2021124073A1 (en) * 2019-12-17 2021-06-24 Pfizer Inc. Antibodies specific for cd47, pd-l1, and uses thereof
JP7473248B2 (ja) * 2020-02-12 2024-04-23 上海詩健生物科技有限公司 ヒトcd47を標的化するシングルドメイン抗体及びその使用
WO2022057939A1 (en) * 2020-09-21 2022-03-24 I-Mab Biopharma Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising cd47 antibody and pd-1/pd-l1 inhibitor
WO2022095970A1 (zh) * 2020-11-06 2022-05-12 百奥泰生物制药股份有限公司 双特异抗体及其应用
EP4253415A4 (en) * 2020-11-12 2024-10-02 Mabwell Shanghai Bioscience Co Ltd ANTIBODIES AND MANUFACTURING METHODS THEREFOR
CN116964095A (zh) * 2021-02-19 2023-10-27 沙裴隆有限公司 针对cd47的单域抗体及其用途
EP4296284A1 (en) * 2021-02-19 2023-12-27 SHAPERON Inc. Bispecific single domain antibody to pd-l1 and cd47 and use thereof
CN116917321A (zh) * 2021-02-19 2023-10-20 沙裴隆有限公司 针对pd-l1的单域抗体及其用途
CA3219221A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Immuneoncia Therapeutics, Inc. Bispecific antibody specifically binding to cd47 and pd-l1
TW202306998A (zh) * 2021-06-21 2023-02-16 俄羅斯聯邦商拜奧卡德聯合股份公司 特異性結合cd47和pd-l1的分離的雙特異性抗體
CN115702931A (zh) * 2021-08-06 2023-02-17 百奥泰生物制药股份有限公司 抗pd-l1/cd47双特异抗体在治疗疾病中的应用
CN118076644A (zh) * 2021-09-30 2024-05-24 正大天晴药业集团股份有限公司 针对免疫检查点的双特异性抗体
AU2023219697A1 (en) * 2022-02-09 2024-08-22 Exelixis, Inc. Multispecific binding agents and uses thereof.
KR20230163305A (ko) * 2022-05-19 2023-11-30 (주)샤페론 Pd-l1 및 cd47에 대한 이중특이적 인간화 단일 도메인 항체 및 이의 용도
CN118804767A (zh) * 2022-07-28 2024-10-18 深圳康源久远生物技术有限公司 基于peg的抗cd47/抗-pd-l1双特异性抗体药物缀合物
CN118255894A (zh) * 2022-12-27 2024-06-28 广东菲鹏制药股份有限公司 一种双特异性结合分子及其应用
CN116063526A (zh) * 2022-12-31 2023-05-05 合肥天港免疫药物有限公司 抗pdl1的抗体及其用途
WO2024146539A1 (en) * 2023-01-04 2024-07-11 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Bispecific antibodies against pd-l1 and cd47, method for preparing the same, and use thereof

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
CA2086417C (en) 1990-06-29 1999-07-06 Biosource Technologies, Inc. Melanin production by transformed organisms
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
WO1994004690A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
CA2226962A1 (en) 1998-02-16 1999-08-16 Marie Sarfati Use of binding agents to cd47 and its ligands in the treatment or the prophylaxis of various inflammatory, autoimmune and allergic diseases and in the treatment of graft rejection
IL147972A0 (en) 1999-08-23 2002-09-12 Dana Farber Cancer Inst Inc Ge Pd-1, a receptor for b7-4 and uses therefor
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
JP2004535542A (ja) 2000-08-18 2004-11-25 リンデ アクチエンゲゼルシヤフト 空気分離設備の製造法
WO2002086083A2 (en) 2001-04-20 2002-10-31 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods of enhancing cell responsiveness
DK1907424T3 (en) 2005-07-01 2015-11-09 Squibb & Sons Llc HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO PROGRAMMED death ligand 1 (PD-L1)
US8168757B2 (en) * 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
CA2998281C (en) 2008-09-26 2022-08-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human anti-pd-1 antobodies and uses therefor
CN108997498A (zh) 2008-12-09 2018-12-14 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-pd-l1抗体及它们用于增强t细胞功能的用途
DK3279215T3 (da) 2009-11-24 2020-04-27 Medimmune Ltd Målrettede bindemidler mod b7-h1
PT2569013T (pt) 2010-05-14 2017-02-08 Univ Leland Stanford Junior Anticorpos monoclonais humanizados e quiméricos para cd47
ES2743203T3 (es) 2012-02-06 2020-02-18 Inhibrx Inc Anticuerpos CD47 y métodos de uso de los mismos
US11059910B2 (en) 2012-12-03 2021-07-13 Novimmune Sa Anti-CD47 antibodies and methods of use thereof
AU2013359167B2 (en) 2012-12-12 2018-08-23 Arch Oncology, Inc. Therapeutic CD47 antibodies
GB201300706D0 (en) 2013-01-15 2013-02-27 Cancer Rec Tech Ltd Antibody
EP2953643B1 (en) 2013-02-06 2023-02-22 Inhibrx, Inc. Non-platelet depleting and non-red blood cell depleting cd47 antibodies and methods of use thereof
WO2016023001A1 (en) * 2014-08-08 2016-02-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Multispecific high affinity pd-1 agents and methods of use
CR20170143A (es) * 2014-10-14 2017-06-19 Dana Farber Cancer Inst Inc Moléculas de anticuerpo que se unen a pd-l1 y usos de las mismas
AU2016326423A1 (en) 2015-09-21 2018-04-26 Erasmus University Medical Center Anti-CD47 antibodies and methods of use
RU2665790C1 (ru) * 2017-04-17 2018-09-04 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Моноклональное антитело к pd-l1

Also Published As

Publication number Publication date
JOP20200078A1 (ar) 2020-04-30
EP3693390A1 (en) 2020-08-12
PH12020550214A1 (en) 2021-02-15
RU2020115122A (ru) 2021-10-29
KR20200058542A (ko) 2020-05-27
MX2020004027A (es) 2020-08-13
BR112020006706A2 (pt) 2020-10-06
EA039662B1 (ru) 2022-02-24
MA49599A1 (fr) 2021-01-29
US20200270345A1 (en) 2020-08-27
TW201922781A (zh) 2019-06-16
MA49599B1 (fr) 2023-05-31
JP2020535839A (ja) 2020-12-10
CN111801352A (zh) 2020-10-20
CA3078413A1 (en) 2019-04-11
AR113342A1 (es) 2020-04-22
AU2018345458A1 (en) 2020-05-14
CO2020004199A2 (es) 2020-04-24
US11840567B2 (en) 2023-12-12
ZA202002047B (en) 2022-08-31
EA201791961A1 (ru) 2019-04-30
ECSP20024555A (es) 2020-06-30
WO2019068302A1 (ru) 2019-04-11
PE20210460A1 (es) 2021-03-08
AU2018345458A2 (en) 2020-05-21
TWI768129B (zh) 2022-06-21
EP3693390A4 (en) 2021-11-03
CL2020000919A1 (es) 2020-10-16
RU2020115122A3 (ja) 2021-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11840567B2 (en) Bispecific antibodies with specific binding to CD47 and PD-L1
EP3575318B1 (en) Anti-pd-1 antibody and use thereof
JP7212821B2 (ja) 抗lag-3抗体および組成物
KR102679554B1 (ko) Pd-l1에 대한 단일클론 항체
US20220002412A1 (en) Humanized Anti-PD-1 Antibody and The Use Thereof
TWI803718B (zh) 與gitr特異性結合的單株抗體
RU2779652C2 (ru) АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К CD47 и PD-L1
RU2751249C1 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с csf-1r
EA044786B1 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с gitr
EA041915B1 (ru) Моноклональное антитело к pd-l1
TW202003038A (zh) 特異性結合人her2的細胞外結構域的亞結構域iv和ii的雙特異性抗體

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230807

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230807

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240724