BR112020006706A2

BR112020006706A2 - anticorpos específicos para cd47 e pd-l1

Info

Publication number: BR112020006706A2
Application number: BR112020006706-7A
Authority: BR
Inventors: Kirill Vladimirovich Solovyev; Andrei Borisovich Ulitin; Timofey Aleksandrovich Nemankin; Valery Vladimirovich Solovyev; Dmitry Valentinovich Morozov
Original assignee: Joint Stock Company Biocad
Priority date: 2017-10-03
Filing date: 2018-10-03
Publication date: 2020-10-06
Also published as: PE20210460A1; AU2018345458A1; CN111801352A; MA49599B1; EA201791961A1; EP3693390A1; US11840567B2; ZA202002047B; CO2020004199A2; JOP20200078A1; ECSP20024555A; JP2023130455A; AU2018345458A2; EA039662B1; AR113342A1; PH12020550214A1; MA49599A1; US20200270345A1; JP2020535839A; RU2020115122A

Abstract

A presente invenção refere-se ao campo da bioengenharia, especificamente a anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno e ao uso deles. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam especificamente a CD47 e PD-L1. A invenção também se refere com um ácido nucleico que codifica para o dado anticorpo ou para o seu fragmento de ligação ao antígeno, para um vetor de expressão, a um método de produção do anticorpo e a um uso dos anticorpos e composições acima mencionados no tratamento de câncer.

Description

“ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA CD47 E PD-L1” Campo de invenção

[001] A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia, em particular a anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno e ao seu uso. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam especificamente a CD47 e PD-L1. A invenção também se refere a uma codificação de ácido nucleico do referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, um vetor de expressão, um método para obter o anticorpo, e o uso dos referidos anticorpos e composições em terapias contra o câncer. Antecedentes da invenção

[002] O fornecimento de dois sinais separados para células T é um modelo disseminado de ativação linfocítica dos linfócitos T restantes com células que apresentam antígeno (APC). Este modelo fornece plenamente a discriminação entre si mesmo e os demais e a tolerância imunológica. O sinal primário, ou sinal específico de antígeno, é transmitido através do receptor de célula T (TCR) após o reconhecimento do peptídeo de antígeno estranho apresentado no contexto do principal complexo de histocompatibilidade (MHC). O segundo sinal ou sinal co-estimulatório é entregue às células T por moléculas co-estimuladoras expressas em células que apresentam antígeno (APCs), e induz células T a estimular a expansão clonal, a secreção de citocinas e a função efetora. Na ausência de co-estimulação, as células T podem se tornar imunes à estimulação do antígeno, elas causam uma resposta imune efetiva e isso pode levar ainda ao esgotamento ou resistência a antígenos estranhos.

[003] No modelo de dois sinais, as células T recebem ambos os sinais: sinais secundários co- estimulatórios positivo e negativo. A regulação de tais sinais positivo e negativo é crítica para maximizar as respostas imunes protetoras do hospedeiro, enquanto mantém a tolerância imunológica e prevenindo a autoimunidade. Sinais secundários negativos parecem necessários para induzir a tolerância das células T, enquanto sinais positivos estimulam a ativação da célula T. Embora o modelo simples de dois sinais ainda forneça uma explicação válida para linfócitos ingênuos, a resposta imune é um processo dinâmico e sinais co- estimulatórios para células T expostas a antígenos também podem ser fornecidos. O mecanismo de co-estimulação é de interesse do ponto de vista terapêutico, uma vez que foi demonstrado que a manipulação dos sinais co-estimulatórios fornece um meio de melhorar ou terminar a resposta imune. Recentemente, se verificou que a disfunção da célula T ou anergia ocorre simultaneamente com a expressão induzida e persistente do receptor inibitório, a morte celular programada pelo polipeptídeo 1 (PD-1). Como resultado, o direcionamento terapêutico do PD-1 e de outras moléculas que transmitem um sinal através da interação com o PD-1, tal como o ligante de morte programada 1 (PD-L1) ou o ligante de morte programada 2 (PD-L2) é uma área de intenso interesse.

[004] O PD-L1 é superexpresso em uma pluralidade de malignidades e é frequentemente associado a um mau prognóstico. Curiosamente, a maioria dos linfócitos T infiltrados em tumores expressam predominantemente o PD-1, em contraste com os linfócitos T em tecidos normais e linfócitos T do sangue periférico, indicando que a regulação positiva do PD-1 em células T tumor-reativas pode contribuir para a resposta imune prejudicada. Isso pode ser devido à exploração da via de sinalização PD-L1 mediada por células tumorais expressando o PD-L1 e interagindo com células T expressando o PD-1, com um enfraquecimento total da ativação de células T e evasão da vigilância imunológica. Portanto, a inibição da interação PD- L1/PD-1 pode melhorar a morte de tumores mediada por células T CD8+.

[005] O direcionamento terapêutico do PD-1 e outras moléculas que transmitem um sinal através da interação com PD-1, tais como o PD-L1 e o PD-L2 é uma área de intenso interesse. A inibição dos sinais PD-L1 tem sido sugerida como um meio de aumentar a imunidade de células T (por exemplo, imunidade antitumoral) para o tratamento de câncer e infecção, incluindo infecção aguda e crônica. Os inibidores que bloqueiam a interação PD-L1/PD-1 são conhecidos, entre outros, de WO02001014557, WO02002086083, WO02007005874, WO02010036959, W02010077634 e W02011066389. No entanto, nenhum agente terapêutico ideal visando esse caminho ainda foi comercializado, e esta é uma significativa necessidade médica insatisfeita.

[006] O CD47 é uma glicoproteína da superfície celular que se liga ao SIRPa (também conhecido como SHPS-1) e ao SIRPy em células correspondentes. Essa interação leva à regulação negativa da função das células imunes ou pode mediar a adesão celular e a migração. O uso do CD47 como um agente biológico no tratamento de doenças autoimunes (WO 1999/040940) tem sido proposta. Em contraste, há muito poucos dados sobre o possível uso de ligantes CD47, tal como o SIRPa para fins terapêuticos semelhantes. Uma explicação é a expressão onipresente do CD47, que pode interferir com o uso de polipeptídeos de ligação ao CD47 como drogas potenciais. Dados publicados por Yu et al. (J) Invest Dermatol, 126:797- 807 (2006) sugerem que uma proteína de fusão consistindo dos domínios extracelulares de SIRPa fundidos a um domínio Fc de imunoglobulina pode impedir a migração de células dendríticas derivadas da pele (DCs) para drenar os linfonodos em camundongos e, assim atenuar (pelo menos parcialmente) a resposta de hipersensibilidade de contato em camundongos. A migração e a função de DCs são importantes para respostas imunológicas ou inflamatórias. Em uma condição dolorosa, essas respostas exacerbadas de DC podem levar à manutenção da doença. Interferir na migração de DCs patogênicos de tecidos para órgãos linfóides seria uma oportunidade atraente para deter o ciclo vicioso que conduz a doenças autoimunes ou inflamatórias.

[007] O CD47, também conhecido como proteína associada à integrina (IAP), antígeno do câncer de ovário OA3, antígeno relacionado ao Rh e MERG6, é um receptor de transmembranar que penetra a membrana várias vezes e pertence à superfamília da imunoglobulina. À expressão e/ou atividade do CD47 têm sido observadas em uma série de doenças e distúrbios. Assim, existe a necessidade de terapias que visam o CD47. Além disso, devido à expressão de CD47 em plaquetas, há também a necessidade de terapias direcionadas ao CD47 (por exemplo, anticorpos) que não causem níveis significativos de diminuição de plaquetas, hemaglutinação, diminuição de glóbulos vermelhos e/ou anemia quando administrados a um sujeito.

[008] Os anticorpos conhecidos que inibem a interação entre o CD47 e o ligante SIRPa foram descritos nas seguintes fontes: pedidos WO2014123580, WO2013119714, WO2015191861, WO2011143624, WO/2014/093678, WO2017053423.

[009] Também são conhecidas várias fontes que descrevem anticorpos multiespecíficos, por exemplo, W0/2014/087248 descreve um anticorpo biespecífico que é específico para CD47 e CD19 e WO2016023001 descreve um anticorpo biespecífico que é específico para CD47 e PD1. No entanto, nenhuma possibilidade de produção e uso eficiente de um anticorpo multiespecífico que se liga especificamente a CD47 e a PD-L1 foi descrita.

[010] Em conexão ao supracitado, a criação de novos anticorpos que efetivamente se ligam a CD47 e a PD-L1 é relevante. Breve resumo da invenção

[011] A presente invenção refere-se a molécula de ligação, por exemplo, anticorpos direcionados à ligação a CD47 e PD-L1. Tais anticorpos podem ser usados para tratar uma doença ou distúrbio mediado por CD47 e PD-L1.

[012] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a CD47 e PD-L1 e compreende um local de ligação para CD47, e pelo menos um local de ligação para PD-L1.

[013] Em algumas concretizações, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo de comprimento completo ou seu fragmento de ligação ao antígeno.

[014] Em algumas concretizações, um anticorpo da presente invenção inclui um ou dois locais de ligação para PD-L1.

[015] Em algumas concretizações, um local de ligação para CD47 de um anticorpo da presente invenção inibe a interação entre o receptor CD47 e o ligante SIRPa e/ou um local de ligação para PD-L1 inibe a interação de PD-L1 com o receptor PD-1.

[016] Em algumas concretizações, um local de ligação para CD47 de um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências CDR1, CDR2, CDR3, em que CDR1 é uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQID NOs: 1-4, isto é, CDR1 é uma sequência selecionada a partir do grupo compreendendo SEQ ID NOs: 1-4 ou uma sequência selecionada a partir do grupo compreendendo SEQ ID NOs: 1-4 com 1 ou 2 substituições, em que CDR2 é uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 6-15, isto é, CDR2 é uma sequência selecionada a partir do grupo compreendendo SEQ ID NOs: 6-15 ou uma sequência selecionada a partir do grupo compreendendo SEQ ID NOs: 6-15 com 1, 2, 3,4 ou 5 substituições, em que CDR3 é uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 17-20, isto é. CDR3 é uma sequência selecionada a partir do grupo compreendendo SEQ ID NOs: 17-20 ou uma sequência selecionada a partir do grupo compreendendo SEQ ID NOs: 17-20 com 1, 2 ou 3 substituições.

[017] Em algumas concretizações, o local de ligação a CD47 para um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências CDR1, CDR2, CDR3, em que CDR1 é uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 1-4, em que CDR2 é uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 6-15, em que CDR3 é uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 17-20.

[018] Em algumas concretizações, o local de ligação a CD47 de um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada da reivindicação 4 e um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências CDR1, CDR2, CDR3, em que CDR1 é uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 22-34, isto é, CDR1 é uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 22-34 ou uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 22-34 com 1 ou 2 substituições, em que CDR2 é uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQID NOs: 36-48, isto é, CDR2 é uma sequência selecionada a partir do grupo compreendendo SEQ ID NOs: 36-48 ou uma sequência selecionada do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 36-48 com 1, 2 ou 3 substituições, em que CDR3 é uma sequência que é pelo menos 80% homólogo à sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 50-64, isto é, CDR3 é a sequência de SEQ ID NOs: 50-64 ou uma sequência selecionada do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 50-64 com 1 ou 2 substituições.

[019] Em algumas concretizações, um local de ligação a CD47 de um anticorpo da presente invenção inclui um domínio variável de cadeia pesada da reivindicação 4 e um domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências CDR1, CDR2, CDR3, em que CDR1 é uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 22-34, CDR2 é uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 36-48, CDR3 é uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 50-64.

[020] Em algumas concretizações, um local de ligação a CD47 de um anticorpo da presente invenção inclui um domínio variável de cadeia pesada que compreende sequências que são pelo menos 90% homólogas às sequências selecionadas a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 66-88, e um domínio variável de cadeia leve que compreende sequências que são pelo menos 90% homólogas às sequências selecionadas a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 89-106.

[021] Em algumas concretizações, um local de ligação a CD47 de um anticorpo da presente invenção inclui um domínio variável de cadeia pesada que compreende sequências selecionadas a partir do seguinte grupo de SEQID NOs: 66-88 e um domínio variável de cadeia leve que compreende sequências selecionados a partir do seguinte grupo de SEQID NOs: 89-

106.

[022] Em algumas concretizações, um local de ligação a PD-L1 de um anticorpo da presente invenção inclui um domínio variável de cadeia pesada que compreende sequências que são pelo menos 80% homólogas das seguintes sequências: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 21, isto é, compreende sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 5, 16 e 21 ou SEQ ID NO: 5 com 1 substituição, SEQ ID NO: 16 com 1, 2 ou 3 substituições, SEQ ID NO: 21 com 1, 2 ou 3 substituições, e um domínio variável de cadeia leve que compreende sequências que são pelo menos 80% homólogas das seguintes sequências: SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 65, isto é, compreende sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 35, 49 e 65 ou SEQ ID NO: 35 com 1, 2 ou 3 substituições, SEQ ID NO: 49 com 1 substituição, SEQ ID NO: 65 com 1 ou 2 substituições.

[023] Em algumas concretizações, um local de ligação a PD-L1 de um anticorpo da presente invenção inclui um domínio variável de cadeia pesada que compreende as seguintes sequências: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 21, e um domínio variável de cadeia leve que compreende as seguintes sequências: SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO:

65.

[024] Em algumas concretizações, um local de ligação a CD47 de um anticorpo da presente invenção é Fab, scFv, scFab ou VH isolado ou mono-domínios VHH.

[025] Em algumas concretizações, um local de ligação a PD-L1 de um anticorpo da presente invenção é Fab, scFv, scFab ou VH isolado ou mono-domínios VHH.

[026] Em algumas concretizações, um anticorpo da presente invenção é caracterizado por estimular a citotoxicidade celular dependente de anticorpo, fagocitose mediada por macrófagos e/ou citotoxicidade mediada por células T, a proporção de células portando antígenos CD47 e/ou PD-L1 na superfície.

[027] Em algumas concretizações, um anticorpo da presente invenção é caracterizado na medida em que compreende uma porção Fc compreendendo pelo menos uma mutação ou modificação que aumenta a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), em comparação com o mesmo anticorpo sem mutação ou modificação.

[028] Em algumas concretizações, um anticorpo da presente invenção destina-se a ser usado como um medicamento para o tratamento de câncer.

[029] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos acima.

[030] Em algumas concretizações, um ácido nucleico da presente invenção é DNA.

[031] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor de expressão que compreende o ácido nucleico acima.

[032] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para obter uma célula hospedeira para preparar qualquer um dos anticorpos acima, que inclui a transformação da célula com o vetor da presente invenção.

[033] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira para obter qualquer um dos anticorpos acima, que contém o ácido nucleico descrito acima.

[034] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para obter qualquer um dos anticorpos acima, que consiste no cultivo da célula hospedeira em meio de cultura sob condições suficientes para obter o anticorpo especificado, se necessário, seguido por isolamento e purificação do anticorpo obtido.

[035] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de uma doença ou distúrbio mediada por PD-L1 e CDA47, compreendendo qualquer um dos anticorpos acima, em combinação com um ou vários excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[036] Em algumas concretizações, uma composição farmacêutica da invenção destina-se à prevenção ou tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por PD-L1 e CD47, selecionado a partir do grupo de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), câncer cervical, câncer de origem primária desconhecida , glioblastoma, câncer de esôfago, câncer de bexiga, TNBC (câncer de mama triplo negativo), CRC (câncer colorretal), carcinoma hepatocelular, melanoma, NSCLC (câncer de pulmão de células não-pequenas), câncer de rim, câncer de ovário, MSI CRC (câncer colorretal com instabilidade de microssatélites), leucemia (leucemia aguda ou leucemia mieloblástica), linfoma, mieloma múltiplo, câncer de mama, câncer de próstata, sarcoma, carcinoma hepatocelular, linfoma de Hodgkin, leucemia linfoblástica aguda de células T e B, câncer de pulmão de células pequenas, leucemia mieloblástica aguda, linfoma não Hodgkin de células B refratário, linfoma folicular, linfoma de células B de zona marginal, linfoma difuso de células B grandes, câncer de pâncreas e síndrome mielodisplásica de alto risco.

[037] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por PD-L1 e CD47, compreendendo a administração ao sujeito que necessita de tal tratamento qualquer um dos anticorpos acima, ou a composição farmacêutica da presente invenção para um sujeito que necessita de tal tratamento em uma quantidade terapeuticamente efetiva.

[038] Em algumas concretizações do método de tratamento de acordo com a presente invenção, onde a doença ou distúrbio é selecionada a partir do grupo de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), câncer cervical, câncer de origem primária desconhecida, glioblastoma, câncer de esôfago, câncer de bexiga, TNBC (câncer de mama triplo negativo), CRC (câncer colorretal), carcinoma hepatocelular, melanoma, NSCLC (câncer de pulmão de células não-pequenas), câncer de rim, câncer de ovário, MSI CRC (câncer colorretal com instabilidade de microssatélites), leucemia (leucemia aguda ou leucemia mieloblástica), linfoma, mieloma múltiplo, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de bexiga, sarcoma, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, linfoma de Hodgkin, leucemia linfoblástica aguda de células T e B, câncer de pulmão de células pequenas, leucemia mieloblástica aguda, linfoma não-Hodgkin de células B refratário, linfoma folicular, linfoma de células B de zona marginal, linfoma difuso de células B grandes, câncer de pâncreas, câncer de ovário e síndrome mielodisplásica de alto risco.

[039] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para inibir a atividade biológica de PD-L1 e/ou CD47 em um sujeito que necessita de tal inibição, que compreende administrar uma quantidade efetiva de qualquer um dos anticorpos acima.

[040] Em um aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de qualquer um dos anticorpos acima ou da composição farmacêutica acima para tratamento de um sujeito que necessita de tal tratamento, de uma doença ou distúrbio mediado por PD-L1 e CD47.

[041] Em algumas concretizações do uso de um anticorpo de acordo com a presente invenção, uma doença ou distúrbio é selecionado a partir do grupo de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), câncer cervical, câncer de origem primária desconhecida, glioblastoma, câncer de esôfago, câncer de bexiga, TNBC (câncer de mama triplo negativo), CRC (câncer colorretal), carcinoma hepatocelular, melanoma, NSCLC (câncer de pulmão de células não-pequenas), câncer de rim, câncer de ovário, MSI CRC (câncer colorretal com instabilidade de microssatélites), leucemia (leucemia aguda ou leucemia mieloblástica), linfoma, mieloma múltiplo, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de bexiga, sarcoma, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, linfoma de Hodgkin, leucemia linfoblástica aguda de células T e B, câncer de pulmão de células pequenas, leucemia mieloblástica aguda, linfoma não-Hodgkin de células B refratário, linfoma folicular, linfoma de células B de zona marginal, linfoma difuso de células B grandes, câncer de pâncreas, câncer de ovário e síndrome mielodisplásica de alto risco. Breve descrição dos desenhos

[042] Fig. 1. Mapa de plasmídeo para produção transitória de CD47-Fc humano em cultura CHO-K1 de células de mamífero.

[043] Fig.2. Eletroforese em gel SDS em condições não-redutoras da preparação de CD47- Fc humano.

[044] Fig.3. Eletroforese em gel SDS em condições redutoras da preparação do produto de controle de anticorpo anti-CD47 B6H12.

[045] Fig.4.Eletroforese em gel SDS em condições não-redutoras da preparação do produto de controle de anticorpo anti-CD47 B6H12.

[046] Fig.5. Diagrama de ELISA de fagos policlonais portando fragmentos de anticorpo VHH interagindo especificamente com antígeno CD47 humano.

[047] Fig. 6. Representação esquemática da estrutura do domínio de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47, onde A é baseado em fragmentos anti-CD47 scFv e B em fragmentos VHH anti-CD47. Ao mesmo tempo, a parte de ligação PD-L1 é representada pelo fragmento Fab.

[048] Fig.7. Eletroforese em gel SDS em condições não-redutoras de preparações anti-PD- L1/anti-CD47 de anticorpos biespecíficos baseados em fragmentos anti-CD47 scFv.

[049] Fig. 8. Eletroforese em gel SDS em condições redutoras de preparações anti-PD- L1/anti-CD47 de anticorpos biespecíficos baseados em fragmentos anti-CD47 VHH.

[050] Fig. 9. A dependência do efeito citotóxico na concentração dos anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47 estudados

[051] Fig.10. Dependência do efeito citotóxico na concentração de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47 estudados.

[052] Fig. 11. Eficácia da fagocitose de linhas celulares MDA-MB-231 por macrófagos humanos na presença de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47.

[053] Fig. 12. Dependência do nível de fluorescência na concentração de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47.

[054] Fig. 13. Dependência do nível de fluorescência na concentração de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47.

[055] Fig. 14. Dependência do nível de fluorescência na concentração de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47.

[056] Fig. 15. Dependência do nível de fluorescência na concentração de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47.

[057] Fig. 16. Atividade anti-PD-L1 dos anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/CD47. O eixo vertical mostra a proporção de luminescência dos poços com os anticorpos aHTH-CD47/PD- L1 testados contra a luminescência dos poços sem a adição de anticorpos.

[058] Fig. 17. Perfil de filtragem em gel para avaliar a homogeneidade de agregação de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47. Divulgação da Invenção Definições e métodos gerais

[059] A menos que definido diferentemente aqui, os termos científicos e técnicos usados em conexão com a presente invenção terão os significados comumente entendidos por aqueles versados na arte.

[060] Além disso, a menos que seja exigido pelo contexto, os termos no singular devem incluir pluralidades e termos no plural devem incluir o singular. Tipicamente, a classificação e métodos de cultura celular, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética, química analítica, química de síntese orgânica, química médica e farmacêutica, bem como hibridização e química de proteínas e ácidos nucleicos descritos aqui são bem conhecidos e amplamente usados por aqueles versados na arte. As reações enzimáticas e métodos de purificação são realizados de acordo com as instruções do fabricante, como é comum na arte, ou como descrito aqui. Definições relacionadas a anticorpos

[061] O PD-L1 (ligante de morte programada 1) também conhecido como cluster de diferenciação 274 (CD274) ou B7 homólogo 1 (B7-H1) é uma proteína transmembranar tipo 1 de 40kDa. O PD-L1 consiste em 3 domínios como segue: domínio extracelular, representado pelos domínios (220) Ig V e tipo C, domínio transmembranar (21) e domínio intracelular (31).

Desempenha um papel importante na supressão do sistema imunológico durante a gravidez, durante o transplante de tecido estranho e em certas doenças, tal como a hepatite. Sob condições normais, em resposta a auto-antígenos, uma certa quantidade de células efetoras T CD8+específicas de antígeno se acumulam nos linfonodos e baço, a fim de prevenir um processo autoimune, complexos PD-1/PD-L1 ou B7-1/PD-L1 são formados, resultando na transmissão de um sinal inibitório, reduzindo a proliferação dessas células T CD8+ nos linfonodos. Assim, a interação PD-1/PD-L é um dos fatores-chave no desenvolvimento da tolerância imunológica.

[062] O CD47 é um receptor transmembranar de abrangência múltipla pertencente à superfamília imunoglobulinas, interage com SIRPa (proteína reguladora de sinal a) em macrófagos, suprimindo assim a fagocitose. As células cancerígenas, nas quais este caminho está ativo, evitam a fagocitose. Portanto, um efeito terapêutico no CD47 é amplamente utilizado em vários cânceres. Os Anticorpos para CD47 podem ter a capacidade de bloquear a interação entre CD47 e SIRPa, mas podem não ter essa habilidade.

[063] Otermo "molécula de ligação" inclui anticorpos e imunoglobulinas.

[064] O termo "anticorpo" ou "imunoglobulina" ou "anticorpo monoclonal" ou "anticorpo biespecífico" ou "anticorpo multiespecífico" (Ig), como usado aqui, inclui um anticorpo inteiro/de comprimento completo e qualquer fragmento de ligação ao antígeno (isto é, "porção de ligação ao antígeno"). Além disso, por exemplo, os termos "anticorpo" ou "imunoglobulina" ou "anticorpo monoclonal" incluem qualquer combinação de fragmentos de ligação ao antígeno, tendo uma ou mais valências e uma ou mais especificidades, e regiões constantes de imunoglobulinas, e podem ter um significado análogo aos termos "anticorpo biespecífico" ou "anticorpo multiespecífico". Além disso, por exemplo, os termos "anticorpo" ou "imunoglobulina" ou "anticorpo monoclonal" incluem qualquer combinação de fragmentos de ligação ao antígenos e regiões constantes de imunoglobulinas, ligadas covalentemente ou não-covalentemente a qualquer polipeptídeo de qualquer natureza. Além disso, o termo "anticorpo", por exemplo, refere-se a uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações de dissulfeto, ou uma porção de ligação ao antígeno. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (abreviada referida aqui como VH) e a região constante da cadeia pesada. São conhecidos cinco tipos de cadeia pesada Ig de mamíferos denotados por letras gregas: a, 5, e, ye 1. O tipo de cadeia pesada presente define a classe de um anticorpo; essas cadeias são encontradas nos anticorpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente. Diferentes cadeias pesadas variam em tamanho e composição; a e y contêm aproximadamente 450 aminoácidos, enquanto 4 e € consistem aproximadamente 550 aminoácidos. Cada cadeia pesada contém duas regiões, isto é, região constante e região variável. A região constante é idêntica em todos os anticorpos do mesmo isótipo, mas difere em anticorpos de diferentes isótipos. As cadeias pesadas y, a e 5 contêm uma região constante composta por três domínios constantes CH1, CH2 e CH3 (em uma linha), e uma região dobradiça para maior flexibilidade (WoofJ., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89- 99); cadeias pesadas 1 e e têm uma região constante composta de quatro domínios constantes CH1, CH2, CH3 e CH4. Em mamíferos, são conhecidos apenas dois tipos de cadeia leve denotados por lambda (À) e kappa (K). Cada cadeia leve consiste em uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui referida como VL) e região constante da cadeia leve. O comprimento aproximado de uma cadeia leve é de 211 a 217 aminoácidos. Preferencialmente, a cadeia leve é uma cadeia leve kappa (K) e o domínio constante CL é preferencialmente um kappa C (x).

[065] "Anticorpos" de acordo com a invenção podem ser de qualquer classe (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IBG e IBM, preferencialmente IgG), ou subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IBGA4, IgA1 e IgA2, preferencialmente IgG1).

[066] As regiões VL e VH podem ser subdivididas em regiões de hiper-variabilidade chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), intercaladas entre regiões mais conservadas, denominadas regiões de armação (FR). Cada VH e VL é composto por três CDRs e quatro FRs, localizados oe amino-terminal ao carboxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clg) do sistema de complemento clássico.

[067] O termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo ou "fragmento de ligação ao antígeno" (ou simplesmente "porção de anticorpo" ou "fragmento de anticorpo"), como usado aqui, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Foi demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Exemplos de fragmentos de ligação incluídos no termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo incluem (i) fragmento Fab fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) fragmento F(ab') 2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região dobradiça; (ii) fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CH1; (iv) fragmento Fv consistindo dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (v) fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste de um domínio VH/VHH; e (vi) região determinante de complementaridade (CDR) extraída. Além disso, duas regiões do fragmento Fv, VL e VH, são codificadas por diferentes genes, elas podem ser unidas usando métodos recombinantes usando um ligante sintético que lhes permite receber uma única cadeia de proteínas na qual as regiões VL e VH estão emparelhadas para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Presume-se que tais moléculas de fita simples também estão incluídas no termo "porção de ligação ao antígenos" de um anticorpo. Tais fragmentos de anticorpos são obtidos usando métodos convencionais conhecidos por aqueles versados na arte, e esses fragmentos são rastreados da mesma maneira que os anticorpos intactos.

[068] Preferencialmente, o CDR da região de ligação ao antígenos ou toda a região de ligação ao antígeno do anticorpo da invenção é derivado da biblioteca de camundongo, lhama ou doadores humanos ou é essencialmente de origem humana com certos resíduos de aminoácidos alterados, por exemplo, substituídos por diferentes resíduos de aminoácidos a fim de otimizar as propriedades dos anticorpos específicos, por exemplo, Kd, koff, IC5O, EC50, ED50. Preferencialmente, as regiões de armação dos anticorpos da invenção são de origem humana ou substancialmente de origem humana (pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% da origem humana).

[069] Em outras concretizações, a porção de ligação ao antígeno da invenção pode ser derivada de outras espécies não-humanas, incluindo camundongo, lhama, coelho, rato ou hamster, mas não limitado a estes. Alternativamente, a região de ligação ao antígenos pode ser derivada da espécie humana.

[070] O termo "domínio variável" refere-se ao fato de que certas regiões dos domínios variáveis diferem muito em sequência entre anticorpos. O domínio V media a ligação ao antígeno e determina a especificidade de um anticorpo particular para seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade é desigualmente distribuída no local dos domínios variáveis de 110 aminoácidos. Em vez disso, as regiões V consistem em fragmentos invariantes chamados regiões de armação (FRs) de 15-30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade chamadas "regiões hipervariáveis" ou CDRs. Cada variável de cadeias pesadas e leves nativas cada uma compreende quatro FRs, tendo principalmente uma configuração de folha-beta, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam laços conectando e, em alguns casos, formando parte da estrutura da folha-beta. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas nas proximidades pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antígeno dos anticorpos. Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como a participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

[071] Otermo "região hipervariável" como usado aqui refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácido de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" e/ou aqueles resíduos de um "laço hipervariável".

[072] Em certos casos, também pode ser desejável alterar um ou mais resíduos de aminoácidos de CDR, a fim de melhorar a afinidade de ligação com o epítopo alvo. Isso é conhecido como "maturação de afinidade" e pode ser realizado opcionalmente em conexão com a humanização, por exemplo, em situações onde a humanização de um anticorpo leva à redução da especificidade ou afinidade de ligação e não é possível melhorar suficientemente a especificidade ou afinidade de ligação apenas por mutações reversas. Vários métodos de maturação de afinidade são conhecidos na arte, por exemplo, o método de mutagênese de saturação por varredura in vitro descrito por Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997) e o passo-a-passo da maturação de afinidade in vitro proposta por Wu et al., Proc Nat! Acad Sci USA 95:6037-6042 (1998).

[073] As"regiões de armação" (FR) são resíduos do domínio variável que são diferentes dos resíduos de CDR. Cada domínio variável tem tipicamente quatro FRs identificados como FR1, FR2, FR3 e FR4. Se os CDRs forem definidos de acordo com Kabat, os resíduos da cadeia leve FR estão localizados aproximadamente nos resíduos 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) e 98-107 (LCFR4) e os resíduos de cadeia pesada FR estão localizados aproximadamente na região dos resíduos 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) e 103- 113 (HCFR4) na cadeia pesada. Se os CDRs compreendem resíduos de aminoácidos de laços hipervariáveis, os resíduos da cadeia leve FR estão localizados aproximadamente nos resíduos 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) e 97-107 (LCFR 4) na cadeia leve e na cadeia pesada os resíduos FR estão posicionados em torno dos resíduos 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) e 102-113 (HCFR4) nos resíduos de cadeia pesada. Em alguns casos, quando o CDR compreende aminoácidos tanto de um CDR como definido por Kabat quanto os de um laço hipervariável, os resíduos FR serão ajustados de acordo. Por exemplo, quando o CDRH1 inclui aminoácidos H26-H35, os resíduos FR1 da cadeia pesada estão nas posições 1-25 e os resíduos FR2 estão nas posições 36-49.

[074] O anticorpo desta invenção, "que se liga" ao antígeno alvo, é um anticorpo que se liga ao antígeno com afinidade suficiente para que o anticorpo possa ser usado como um agente diagnóstico e/ou terapêutico ao direcionar uma proteína ou célula, ou tecido que expresse um antígeno, e reage levemente com outras proteínas. De acordo com métodos analíticos: classificação celular ativada por fluorescência (FACS), radioimunoensaio (RIA) ou ELISA, em tais concretizações, o grau de ligação do anticorpo a uma proteína não-alvo é inferior a 10 % do anticorpo a uma proteína alvo específica. No que diz respeito à ligação de um anticorpo a uma molécula alvo, o termo "ligação específica" ou "especificamente ligado a" ou é "específico para" um polipeptídeo particular ou um epítopo em um polipeptídeo alvo particular significa a ligação que é visivelmente (mensuravelmente) diferente de uma interação não-específica (por exemplo, no caso de bH1-44 ou bH1-81, uma interação não- específica está ligada à albumina sérica bovina, caseína, soro fetal bovino ou neutravidina.

[075] A ligação específica pode ser medida, por exemplo, determinando a ligação da molécula em comparação com a ligação da molécula de controle. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada pela competição com outra molécula semelhante ao alvo, por exemplo, com um excesso de alvo não-marcado. Neste caso, a ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado à sonda for competitivamente inibida pelo excesso de alvo não-marcado. Como usado aqui, o termo "ligação específica" ou "especificamente ligado a" ou é "específico para" um polipeptídeo particular ou um epítopo em um polipeptídeo alvo particular pode ser caracterizado por uma molécula tendo um Kd para o alvo de pelo menos cerca de 200 nM, ou pelo menos cerca de 150 nM, ou pelo menos cerca de 100 nM, ou pelo menos cerca de 60 nM, ou pelo menos cerca de 50 nM, ou pelo menos cerca de 40 nM, ou pelo menos cerca de 30 nM, ou pelo menos cerca de 20 nM, ou pelo menos cerca de 10 nM, ou pelo menos cerca de 8 nM, ou pelo menos cerca de 6 nM, ou pelo menos cerca de 4 nM, ou pelo menos cerca de 2 nM, ou pelo menos cerca de 1 nM, ou superior. Em uma concretização, o termo "ligação específica" refere-se à ligação onde uma molécula se liga a um polipeptídeo particular ou epítopo em um polipeptídeo particular sem ligação substancial com qualquer outro polipeptídeo ou epítopo em um polipeptídeo.

[076] O termo "Ka", como usado aqui, refere-se à taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno particular, enquanto o termo "Kd" pretende referir-se à taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular.

[077] A "afinidade de ligação" refere-se geralmente à força das interações não-covalentes cumulativas entre um único local de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado diferentemente, "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca (característica, verdadeira) que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade da molécula X por seu parceiro de ligação Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). Preferencialmente, o valor Kd é de aproximadamente 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM ou menos. A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na arte, incluindo os descritos aqui. Anticorpos de baixa afinidade geralmente ligam um antígeno lentamente e tendem a dissociar-se facilmente, enquanto anticorpos de alta afinidade geralmente ligam um antígeno mais rapidamente e tendem a permanecer ligados por mais tempo. Uma variedade de métodos de medição da afinidade de ligação são conhecidos na arte, qualquer um desses métodos pode ser usado para fins da presente invenção.

[078] Em uma concretização da invenção, o "Kd" ou "valor Kd" é medido por ensaios de ressonância plasmônica de superfície usando BIAcore""-2000 ou BlAcoreº-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, N.J.) a 25ºC com chips imobilizados CMS antígeno em -10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, os chips de biossensor de dextrano carboximetilado (CM5, BlAcore Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fabricante. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio de, pH 4,8, a uma concentração de 5 ug/ml (-0,2 uM) e daí injetado a uma vazão de 5 ul/minuto para alcançar aproximadamente 10 unidades relativas (RU) da proteína de ligação. Após a administração do antígeno, uma solução de etanolamina 1M é injetada para bloquear grupos que não reagiram. Para medições cinéticas, diluições seriais duplas de Fab (por exemplo, de 0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% de Tween 20 (PBST) a 25º C a uma vazão de aproximadamente 25 ul/min. As taxas ativadas (kon) e desativadas (koff) são calculadas usando um modelo de ligação um a um simples de Langmuir (BlAcore Evaluation Software versão 3.2) por ajuste simultâneo dos sensogramas de associação e de dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) é calculada como a razão koff/kon. Ver, por exemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881. Se, de acordo com o método de ressonância plasmônica de superfície acima, a taxa de associação exceder 10º M* sº , então pode ser determinada por extinção de fluorescência, que mede o aumento ou diminuição da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão (radiação) = 340 nm, banda de 16 nm) a 25ºC. Uma solução de anticorpo antígeno (forma Fab) com uma concentração de 20 nM em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno medidos usando um espectrômetro, tal como um espectrofotômetro de fluxo interrompido (Aviv Instruments) ou espectrômetro SLM-Aminco (Thermo Spectronie) Série 8000 com um cuvete com agitação.

[079] O termo "koff" refere-se à constante de taxa de dissociação de uma interação particular de uma molécula de ligação e um antígeno. A constante de taxa de dissociação koff pode ser medida por interferometria bio-layer, por exemplo, usando o sistema Octet"".

[080] A "taxa de associação" ("on-rate") ou "kon" de acordo com a presente invenção também pode ser medida usando os ensaios de ressonância plasmônica de superfície acima usando BlAcore""-2000 ou BIAcoreº-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, N.J.) a 25ºC, usando chips imobilizados CM5 antígeno a -10 unidades relativas (unidades de resposta, RU). Resumidamente, os chips de biossensor de dextrano carboximetilado (CM5, BlAcore Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N- hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fabricante. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio de, pH 4,8, a uma concentração de 5 ug/ml (-0,2 uM) e daí injetado a uma vazão de 5 ul/minuto para alcançar aproximadamente 10 unidades relativas (RU) da proteína de ligação. Após a administração do antígeno, uma solução de etanolamina 1M é injetada para bloquear grupos que não reagiram.

[081] A menos que especificado diferentemente, o termo "biologicamente ativo" e "atividade biológica" e "características biológicas" em relação ao polipeptídeo da presente invenção significa ter a capacidade de se ligar a uma molécula biológica.

[082] A expressão "molécula biológica" refere-se a um ácido nucleico, uma proteína, um carboidrato, um lipídio e combinações deles. Em uma concretização da invenção, a molécula biológica existe na natureza.

[083] Os fragmentos de anticorpo, tais como fragmentos de Fab e F(ab')2, podem ser obtidos a partir de anticorpos inteiros usando métodos convencionais, como hidrólise de papaína ou pepsina de anticorpos inteiros. Além disso, anticorpos, partes de anticorpos e moléculas de imunoadesão podem ser obtidos usando métodos de DNA recombinante padrão, por exemplo, como descrito aqui.

[084] Otermo "anticorpo recombinante" pretende se referir a um anticorpo que é expresso em uma célula ou linha celular que compreende uma(s) sequência(s) de nucleotídeos codificando anticorpos, em que aís) referida(s) sequência(s) de nucleotídeos não está naturalmente associada com a célula.

[085] O termo "anticorpo variante", como usado aqui, refere-se a um anticorpo tendo uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de seu anticorpo "parental" em virtude da adição, exclusão e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácido em comparação com a sequência de um anticorpo parental. Em uma concretização preferida da invenção, o anticorpo variante compreende pelo menos uma ou mais (por exemplo, de um a doze, por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove, dez, onze ou doze; em algumas concretizações, um anticorpo variante compreende de um a cerca de dez) adições, exclusões e/ou substituições de aminoácidos em comparação com um anticorpo parental. Em algumas concretizações, tais adições, exclusões e/ou substituições são feitas nos CDRs de um anticorpo variante. A identidade ou homologia em relação à sequência de um anticorpo variante é definida aqui como a porcentagem de resíduos de aminoácido na sequência do anticorpo variante que são idênticas àquelas do anticorpo parental, após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para alcançar a porcentagem máxima de identidade de sequência. Um anticorpo variante retém a capacidade de se ligar ao mesmo antígeno e preferencialmente a um epítopo, ao qual o anticorpo parental se liga; e em algumas concretizações, pelo menos uma propriedade ou atividade biológica são superiores àquelas de um anticorpo parental. Por exemplo, um anticorpo variante pode ter, por exemplo, uma afinidade de ligação mais pronunciada, meia- vida mais longa, IC5SO mais baixo ou capacidade melhorada de inibir a atividade biológica do antígeno em comparação com o anticorpo parental. De particular interesse neste documento é um anticorpo variante que mostra uma atividade biológica maior do que pelo menos 2 vezes (preferencialmente, pelo menos, 5 vezes, 10 vezes ou 20 vezes) a atividade biológica do anticorpo parental.

[086] O termo "anticorpo biespecífico" significa um anticorpo que continua um(s) domínio(s) de ligação ao antígeno que são capazes de ligação específica com dois epítopos diferentes em uma molécula biológica ou capazes de ligação específica com epítopos em duas moléculas biológicas diferentes. O anticorpo biespecífico também é referido aqui como tendo "dupla especificidade" ou como sendo um anticorpo de "dupla especificidade".

[087] Em um sentido amplo, o termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo que compreende uma ou mais regiões de um anticorpo, e uma ou mais regiões de um ou vários outros anticorpos, tipicamente, um anticorpo parcialmente humano e parcialmente não- humano, isto é, derivado parcialmente de um animal não-humano, tais como camundongos, ratos ou animais semelhantes, ou camelídeos, tais como lhama e alpaca. Os anticorpos quiméricos são geralmente preferidos sobre anticorpos não-humanos, a fim de reduzir o risco de uma resposta imune humana anti-anticorpo, por exemplo, uma resposta imune humana anti-anticorpo de camundongo no caso de um anticorpo murino. Um exemplo de um anticorpo quimérico típico é aquele em que as sequências de região variável são sequências murinas, enquanto as sequências da região constante são humanas. No caso de um anticorpo quimérico, as partes não-humanas podem ser ainda modificadas para humanizar o anticorpo.

[088] O termo "humanização" refere-se ao fato de que quando um anticorpo tem uma origem total ou parcialmente não-humana, por exemplo, um anticorpo de camundongo ou lhama obtido por imunização de camundongos ou lhamas, respectivamente, com um antígeno de interesse, ou é um anticorpo quimérico baseado em tal anticorpo de um camundongo ou lhama, é possível substituir certos aminoácidos, em particular nas regiões de armação e domínios constantes de cadeias pesada e leve, a fim de evitar ou minimizar a resposta imune em humanos. A especificidade da interação dos anticorpos com antígenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoácido que estão localizados nos seis CDRs de cadeia pesada e leve. Por essa razão, as sequências de aminoácidos dentro dos CDRs são muito mais variáveis entre anticorpos individuais do que aquelas fora dos CDRs. Uma vez que as sequências de CDR dos locais são responsáveis pela maioria das interações anticorpo- antígeno, anticorpos recombinantes podem ser expressos imitando as propriedades de um anticorpo natural específico, ou mais geralmente, um anticorpo específico com uma dada sequência de aminoácidos, por exemplo, construindo vetores de expressão que expressam sequências de CDR - trama de anticorpos específicos e sequências estruturais de outro anticorpo. Como resultado, é possível "humanizar" um anticorpo não-humano e, em grande parte, preservar a especificidade e a afinidade de ligação do anticorpo inicial. Embora não seja possível prever com precisão a imunogenicidade e, assim, a resposta humana anti- anticorpo de um anticorpo particular, anticorpos não-humanos são tipicamente mais imunogênicos do que anticorpos humanos. Os anticorpos quiméricos, onde as regiões constantes estrangeiras (por exemplo, vermes ou camelídeos) foram substituídas por sequências de origem humana mostraram uma imunogenicidade geralmente menor do que anticorpos de origem completamente estrangeira, e há uma tendência a usar anticorpos humanizados ou totalmente humanos em anticorpos terapêuticos. Portanto, anticorpos quiméricos ou outros anticorpos de origem não-humana podem ser humanizados para reduzir o risco de uma resposta humana anti-anticorpo.

[089] Para anticorpos quiméricos, a humanização envolve tipicamente a modificação das regiões de armação das sequências de região variável. Os resíduos de aminoácido que fazem parte das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) não serão modificados na maioria das vezes em virtude da humanização, embora em alguns casos possa ser desejável a fim de modificar resíduos de aminoácidos individuais de um CDR, por exemplo, a fim de remover um local de glicosilação, um local de desamidação, um local de isomerização aspartato ou resíduos indesejados de cisteína ou metionina. A glicosilação N-ligada ocorre pela anexação de uma cadeia de oligossacarídeos a um resíduo de asparagina na sequência de tripeptídeo Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido diferente de Pro. A remoção de um local de N-glicosilação pode ser obtida pela mutação do resíduo Asn ou Ser/Thr com outro resíduo, preferencialmente por substituição conservadora. A desamidação de resíduos de asparagina e glutamina pode ocorrer dependendo de tais fatores como pH e exposição da superfície. Os resíduos de asparagina são particularmente suscetíveis à desamidação, especialmente se estiverem presentes na sequência Asn-Gly e, em menor grau, em outras sequências de dipeptídeos, tal como Asn-Ala. Na presença de uma tal região desamidada, por exemplo, Asn-Gly na sequência de uma região CDR, pode ser preferível remover essa região, como regra, por uma substituição conservadora para remover um dos resíduos envolvidos.

[090] Inúmeros métodos de humanização de uma sequência de anticorpo são conhecidos na arte. Um método comumente usado é o transplante de local de CDR. O enxerto de CDR pode ser baseado nas definições de CDR Kabat, apesar da última edição (Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev.Oncol Hematol. 64: 210-225 (2007)) sugere que a definição do IMGTº (sistema internacional de informações ImMunoGeneTicsº, www.imgt.org): pode melhorar os resultados de humanização (ver Lefranc et al., Dev. Comp Immunol. 27: 55-77 (2003)). Em alguns casos, o enxerto de CDR pode reduzir a especificidade e afinidade de ligação e, portanto, a atividade biológica, de um anticorpo não-humano com CDR enxertado, em comparação com um anticorpo parental do qual os CDRs foram obtidos. Mutações reversas (que às vezes são referidas como "reparo de região de armação" podem ser usadas em posições selecionadas de um anticorpo com CDR enxertado, tipicamente em regiões de armação, a fim de restaurar a especificidade e a afinidade de ligação de um anticorpo parental. A determinação de posições para possíveis mutações reversas pode ser realizada usando informações disponíveis na literatura e em bases de dados de anticorpos. Os resíduos de aminoácido que são candidatos a mutações reversas estão geralmente localizados na superfície de uma molécula de anticorpo, enquanto resíduos que estão enterrados ou que têm um baixo grau de exposição superficial normalmente não serão alterados. O método de humanização, alternativa ao transplante de local de CDR e à mutação reversa, é uma mudança de superfície na qual restos não-expostos de origem não-humana são preservados, enquanto restos expostos na superfície mudam para restos humanos.

[091] Existem duas tecnologias para a produção de anticorpos totalmente humanos: usando, in vitro, bibliotecas de fagos coletados ou, in vivo, imunizando animais humanizados (camundongos, ratos, etc.).

[092] A exibição de fago é a primeira e mais amplamente usada tecnologia de busca de anticorpo in vitro. Em 1985, Smith descobriu que sequências de DNA estrangeiro poderiam ser clonadas em bacteriófago filamentoso M13 e que tal sequência clonada pode ser expressa na superfície de partículas de fago como proteínas de fusão (Smith GP: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228: 1315-1317). Assim, é possível selecionar as proteínas de fusão de interesse baseado em sua capacidade de ligar outras proteínas. Essa descoberta foi combinada com métodos de amplificação PCR, o que possibilitou clonar o repertório de cDNA de genes de imunoglobulina para criar uma variedade de bibliotecas de fagos contendo domínios variáveis que podem ser usados para procurar rapidamente anticorpos monoclonais de alvo específico. O repertório da biblioteca de fagos reflete o repertório de anticorpos de células B de cada pessoa ou animal cujo sangue foi usado para criar a biblioteca. Em 1995, dois artigos relataram a criação de camundongos geneticamente modificados que expressavam repertórios de anticorpos totalmente humanos que poderiam ser comparáveis aos produzidos pela tecnologia hibridoma (Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al.: Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368: 856-859). Nestes animais, seus próprios genes endógenos de cadeias de imunoglobulina pesada e k leve foram deliberadamente destruídos, seguidos pela introdução de transgenes, que são os segmentos de genes humanos de cadeia pesada e k leve. Descobriu-se que o repertório de genes humanos pode ser usado pelo sistema imunológico de camundongo para produzir anticorpos de alta especificidade e de alta afinidade contra uma maior variedade de antígenos. Embora camundongos transgênicos expressem receptores de células B que são essencialmente híbridos de componentes de camundongo e de humano (imunoglobulina humana, Iga, IgB de camundongo e outras moléculas de sinalização), suas células B se desenvolvem e amadurecem normalmente.

[093] Em certos casos, também pode ser preferível alterar um ou mais resíduos de aminoácidos de CDR, a fim de melhorar a afinidade de ligação com o epítopo alvo. Isso é conhecido como "maturação de afinidade" e pode ser realizado opcionalmente em conexão com a humanização, por exemplo, em situações onde a humanização de um anticorpo leva à redução da especificidade ou afinidade de ligação e não é possível melhorar suficientemente a especificidade ou afinidade de ligação apenas por mutações reversas. Vários métodos de maturação de afinidade são conhecidos na arte, por exemplo, o método mutagênese de saturação in vitro descrita por Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 412-417 (1997) e o método de maturação de afinidade passo a passo in vitro por Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 6037-6042 (1998).

[094] Otermo "anticorpo monoclonal" ou "mAb" refere-se a um anticorpo que é sintetizado e isolado por uma população clonal separada de células. A população clonal pode ser uma população clonal de células imortalizadas. Em algumas concretizações, as células imortalizadas em uma população clonal são células híbridas - hibridomas - tipicamente produzidas pela fusão de linfócitos B individuais de animais imunizados com células individuais de um tumor linfocítico. Os hibridomas são um tipo de células construídas e não existem na natureza.

[095] Os "anticorpos nativos" são geralmente glicoproteínas heterotetraméricas com um peso molecular de aproximadamente 150.000 daltons, consistindo em duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação covalente dissulfeto, enquanto o número de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isótipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes intracadeia de dissulfeto regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante em sua outra extremidade. O domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos específicos de aminoácido formem uma interface entre a cadeia leve e os domínios variáveis de cadeia pesada.

[096] O termo "isolado" usado para descrever os vários anticorpos nesta descrição refere- se a um anticorpo que foi identificado e separado e/ou regenerado a partir de uma célula ou de uma cultura de células, na qual o anticorpo é expresso. As impurezas (componentes contaminantes) do ambiente natural são materiais que interfeririam com usos diagnósticos ou terapêuticos do polipeptídeo, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não-proteicos. Em concretizações preferidas, o anticorpo é purificado (1) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequências de aminoácidos N-terminal ou interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório (sequenciador de Edman) ou (2) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições não-redutoras ou redutoras usando Azul de Coomassie ou, preferencialmente, coloração com prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ nas células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do polipeptídeo não estará presente. O polipeptídeo isolado é tipicamente obtido por pelo menos uma etapa de purificação.

[097] Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é aquela que é identificada e separada de pelo menos uma impureza da molécula de ácido nucleico, na qual a primeira está ligada na fonte natural de ácido nucleico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucleico isolada é diferente da forma ou conjunto em que é encontrada em condições naturais. Assim, a molécula de ácido nucleico isolada é diferente de uma molécula de ácido nucleico que existe em células sob condições naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico localizada nas células nas quais o anticorpo é normalmente expresso, por exemplo, se a molécula de ácido nucleico tem uma localização cromossômica que é diferente de sua localização em células sob condições naturais.

[098] Otermo "epítopo" aqui usado refere-se a uma porção (determinante) de um antígeno que se liga especificamente a uma molécula de ligação (por exemplo, um anticorpo ou uma molécula relacionada, tal como uma molécula de ligação biespecífica). Os determinantes do epítopo geralmente consistem em agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativa tais como aminoácidos ou carboidratos ou cadeias laterais de açúcar e tipicamente compreendem características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. O epítopo pode ser "linear" ou "conformacional". Em um epítopo linear, todos os pontos de interação entre uma proteína (por exemplo, um antígeno) e uma molécula de interação (tal como um anticorpo) ocorrem linearmente ao longo da sequência de aminoácidos primária da proteína. Em um epítopo conformacional, os pontos de interação ocorrem através de resíduos de aminoácido na proteína que são separados um do outro na sequência de aminoácidos primária. Quando o epítopo desejado de um antígeno é determinado, os anticorpos para este epítopo podem ser gerados usando técnicas bem conhecidas na arte. Além disso, a geração e caracterização de anticorpos ou outras moléculas de ligação podem elucidar informações sobre epítopos desejáveis. Com base nessas informações, pode-se então selecionar competitivamente moléculas de ligação para se ligar aos mesmos epítopos ou epítopos similares, por exemplo, conduzindo estudos de competição para encontrar moléculas de ligação que competem pela ligação a um antígeno.

[099] O termo "ligante peptídico", como usado aqui, pretende significar qualquer peptídeo que tenha a capacidade de conectar domínios, com um comprimento dependente dos domínios aos quais ele se liga entre si e compreende qualquer sequência de aminoácidos. Preferencialmente, o ligante peptídico tem um comprimento de mais de 5 aminoácidos e consiste em qualquer conjunto de aminoácidos selecionados a partir de G, A, S, P, E, T, D, K.

[100] O termo "in vitro" refere-se a um objeto biológico, um processo biológico ou uma reação biológica fora do corpo, modelado em condições artificiais. Por exemplo, uma célula cultivada in vitro deve ser entendida como uma célula cultivada em um ambiente fora do corpo, por exemplo, em um tubo de ensaio, um frasco de cultura ou uma placa de microtitulação.

[101] O termo "ICso"(concentração inibidora 50%) refere-se às concentrações de medicamento, nas quais uma atividade ou resposta mensuráveis, por exemplo, o crescimento/proliferação de células como células tumorais, é inibida em 50%. O valor ICso pode ser calculado usando curvas de dose-resposta apropriadas, usando software estatístico especial para ajuste de curvas.

[102] O termo GI 50 (inibição de crescimento 50%) refere-se às concentrações de medicamento, nas quais a proliferação de células, tais como células tumorais, é inibida em 50%.

[103] O termo "ED50" (EC50) (dose/concentração 50% efetiva) refere-se à concentração de medicamento para produzir um efeito biológico de 50% (que pode incluir citotoxicidade).

[104] O termo "função efetora" de anticorpo refere-se a atividades biológicas atribuíveis à região Fc (sequência de região Fc nativa ou variantes de aminoácidos de região Fc) de um anticorpo ou variam com o isótipo de anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação Clq e citotoxicidade dependente de complemento; ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B, BCR) e ativação de células B.

[105] A "citotoxicidade celular dependente de anticorpo" ou "ADCC" refere-se a uma resposta mediada por célula, na qual células citotóxicas não-específicas que expressam receptores Fc (FcR) (por exemplo, células exterminadoras naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado a uma célula alvo e, posteriormente, causam a lise da célula alvo. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam apenas FcyRJIl, enquanto os monócitos expressam FcyRl, FcyRIlI e FcyRIll. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Para avaliar a atividade do ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizado um ensaio de ADCC in vitro, como o descrito na patentes nº US

5.500.362 ou US 5.821.337. As células efetoras aplicáveis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células exterminadoras naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade do ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como divulgado em Clynes et al. PNAS (EUA) 95: 652-656 (1998).

[106] As "células efetoras humanas" são leucócitos que expressam uma ou mais FcRs e desempenham funções efetoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRill e desempenham a função efetora ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam o

ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células exterminadoras naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com células PBMCs e NK sendo preferidas. As células efetoras podem ser isoladas de sua fonte nativa, por exemplo, a partir do sangue ou PBMCs como descrito aqui.

[107] Os termos "receptor Fc" ou "FcR" são usados para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FCcyRIIl (FcyRila e FcyRIlb) e FcyRIll (FcyRilla e FcyRIllb), incluindo variantes alélicas e formas emendadas alternativamente desses receptores. O FcyRI exibe alta afinidade ao IgG, enquanto FcyRIl e FcyRIll exibem baixas afinidades. O FcyRlila e FcyRIlla estão ativando FcyRs que são expressos em monócitos/macrófagos e monócitos/macrófagos/células exterminadoras naturais, respectivamente, e são capazes de desencadear citotoxicidade das células alvo humanas. O receptor ativador FCyRIIA contém um motivo de ativação à base de tirosina imunorreceptora (ITAM) em seu domínio citoplasmático. O receptor inibidor FCyRIIB contém um motivo de inibição à base de tirosina imunorreceptora (ITIM) em seu domínio citoplasmático (ver revisão em Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Os FcRs são revisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobadas pelo termo "FcR" aqui. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto.

[108] A "citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se à capacidade de uma molécula de lisar um alvo na presença de complemento. A via de ativação do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1qg) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) complexada com um antígeno cognato. Para avaliar a ativação de complemento, um ensaio CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J|. Immunol. Methods 202: 163 (1996) pode ser realizado.

[109] O termo "identidade" ou "homologia" é interpretado como a porcentagem de resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos ao resíduo de uma sequência correspondente à qual é comparado, após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário para alcançar a máxima porcentagem de identidade para a sequência inteira, e não considerar quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade da sequência. Nem extensões N- ou C-terminal nem inserções serão interpretadas como reduzindo identidade ou homologia. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na arte. A identidade da sequência pode ser medida usando software de análise de sequência (por exemplo, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, Centro de Biotecnologia da Universidade de Wisconsin, 1710 University Ave., Madison, WI 53705). Este software combina sequências semelhantes, atribuindo um grau de homologia a várias substituições, exclusões (eliminações) e outras modificações.

[110] O termo "homólogo" em relação a uma sequência de polipeptídeos de um anticorpo deve ser interpretado como um anticorpo exibindo pelo menos 70%, preferencialmente 80%, mais preferencialmente 90% e o mais preferencialmente 95% de identidade de sequência em relação a uma sequência de polipeptídeos. O termo em relação a uma sequência de ácido nucleico deve ser interpretado como uma sequência de nucleotídeos exibindo pelo menos 85%, preferencialmente 90%, mais preferencialmente 95% e o mais preferencialmente 97% de identidade de sequência em relação a uma sequência de ácido nucleico.

[111] A(s) modificação(ões) proposta(s) das sequências de aminoácidos dos anticorpos descritos nesta publicação. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes de sequência de aminoácidos do anticorpo são preparadas introduzindo alterações adequadas de nucleotídeos no ácido nucleico do anticorpo, ou pela síntese de peptídeos. Tais modificações incluem, por exemplo, exclusões e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de exclusão, inserção e substituição é feita para chegar ao construto final, desde que o construto final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos também podem alterar processos pós-traduções no anticorpo, tais como alterar o número ou a posição dos locais de glicosilação.

[112] Uma variante de modificação de sequências de aminoácidos de anticorpos usando substituições de aminoácidos. Tal variante é a substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula do anticorpo por um resíduo diferente. Os locais de maior interesse para mutagênese substitucional incluem regiões hipervariáveis ou CDRs, mas alterações de

FR ou Fc também são contempladas. As substituições conservadoras são mostradas na Tabela A em "substituições preferidas". Se tais substituições levarem a uma mudança na atividade biológica, então podem ser introduzidas mudanças significativas adicionais, chamadas de "substituição de exemplos" na tabela A, ou mudanças, descritas abaixo em descrição de classes de aminoácidos, e podem ser produtos selecionados. Tabela À Resíduo original Substituições exemplares Substituições preferidas asp (0)

EO cinta an (o) eva) Ile (1) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe PR te Met (M) Leu; Phe; Ile rot Aa A ser) Tm Troiw) Tyr; Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina

[113] Os termos "ácido nucleico", "sequência nucleica", "sequência de ácido nucleico", "polinucleotídeo", "oligonucleotídeo", "sequência de polinucleotídeos" e "sequência de nucleotídeos", usados intercambiavelmente na presente descrição, significam uma sequência precisa de nucleotídeos, modificado ou não, determinando um fragmento ou uma região de um ácido nucleico, contendo nucleotídeos não-naturais ou não, e sendo um DNA ou RNA de dupla fita, um DNA ou um RNA de fita simples, ou produtos de transcrição dos referidos DNAs.

[1141] Também deve ser incluído aqui que a presente invenção não se relaciona com sequências de nucleotídeos em seu ambiente cromossômico natural, isto é, em um estado natural. As sequências da presente invenção foram isoladas e/ou purificadas, isto é, foram amostradas direta ou indiretamente, por exemplo, por uma cópia, tendo seu ambiente sido pelo menos parcialmente modificado. Assim, ácidos nucleicos isolados obtidos por genética recombinante, por meio, por exemplo, de células hospedeiras ou obtidos por síntese química também devem ser mencionados aqui.

[115] A referência à sequência de nucleotídeos abrange o complemento do mesmo, a menos que especificado diferentemente. Assim, uma referência a um ácido nucleico tendo uma sequência particular deve ser entendida como aquela que engloba a fita complementar do mesmo com a sua sequência complementar.

[116] A expressão "sequências de controle" refere-se a sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência de codificação funcionalmente relacionada em um organismo hospedeiro particular. As sequências de controle que são adequadas para procariontes, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência de operador e um local de ligação ao ribossomo. As células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilação e potenciadores.

[117] O ácido nucleico é "operativamente ligado" quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma pré- sequência ou sequência líder secretora é operativamente ligado ao DNA para um polipeptídeo se for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou potenciador é operativamente ligado a uma sequência de codificação se isso afetar a transcrição da sequência; um local de ligação ao ribossomo está operativamente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de DNA estando ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretor, contíguas e em fase de leitura. No entanto, os potenciadores não têm de ser contíguos.

[118] O termo "vetor" como usado aqui significa uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Em algumas concretizações, o vetor é um plasmídeo, isto é, um pedaço circular de fita dupla de DNA no qual segmentos adicionais de DNA podem ser ligados. Em algumas concretizações, o vetor é um vetor viral, em que segmentos adicionais de DNA podem ser ligados ao genoma viral. Em algumas concretizações, os vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo um local de origem bacteriana de replicação e vetores de mamíferos epissomais). Em outras concretizações, os vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não-epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução em uma célula hospedeira e, assim, são replicados juntamente com o gene hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinante" (ou simplesmente "vetores de expressão").

[119] O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") como usado aqui pretende se referir a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. A presente invenção refere-se a células hospedeiras, que podem incluir, por exemplo, um vetor de acordo com a invenção descrita acima. A presente invenção também se refere a células hospedeiras que compreendem, por exemplo, uma sequência de nucleotídeos codificando uma cadeia pesada ou porções de ligação ao antígeno, uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve ou porções de ligação ao antígeno da mesma, ou ambas, do primeiro domínio de ligação e/ou segundo domínio de ligação de uma molécula de ligação da invenção. Deve ser entendido que "célula hospedeira recombinante" e "célula hospedeira" pretendem se referir não apenas a uma célula particular em questão, mas também à descendência de tal célula. Uma vez que modificações podem ocorrer em gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, tal descendência pode não ser, de fato, idêntica a uma célula parental, no entanto, tais células ainda estão incluídas no escopo do termo "célula hospedeira" como usado aqui.

[120] O termo "excipiente" é usado aqui para descrever qualquer ingrediente que é diferente do composto(s) desta invenção.

[121] A "composição farmacêutica" refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo da presente invenção e pelo menos um dos componentes selecionados a partir do grupo compreendendo cargas, solventes, diluentes, transportadores, agentes auxiliares de distribuição e sensoriamento, agentes de entrega, tais como conservantes, estabilizadores, carga, desintegradores, umidificadores, emulsificantes, agentes de suspensão, espessantes, adoçantes, agentes flavorizantes, agentes aromatizantes, agentes antibacterianos, fungicidas, lubrificantes e controladores de entrega prolongados, farmaceuticamente aceitáveis e farmacologicamente compatíveis, a escolha e proporções adequadas dos quais dependem o tipo e a forma de administração e dosagem. Exemplos de agentes de suspensão adequados são álcool isoestearílico etoxilado, polioxietileno, sorbitol e éter sorbitol, celulose microcristalina, metahidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar e tragacante e suas misturas também. A proteção contra a ação de microrganismos pode ser fornecida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, tais como, por exemplo, parabenos, clorobutanol, ácido sórbico e compostos semelhantes. A composição também pode conter agentes isotônicos, tais como, por exemplo, açúcares, polióis, cloreto de sódio e similares. A ação prolongada da composição pode ser alcançada por agentes que retardam a absorção do ingrediente ativo, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina. Exemplos de transportadores adequados, solventes, diluentes e agentes de entrega incluem água, etanol, poliálcoois e suas misturas, óleos naturais (tais como azeite de oliva) e ésteres orgânicos (tais como oleato de etila) para injeções. Exemplos de cargas são lactose, açúcar de leite, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio e similares. Exemplos de desintegradores e distribuidores são amido, ácido algínico e seus sais, silicatos. Exemplos de lubrificantes adequados são estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio, talco e polietilenoglicol de alto peso molecular. A composição farmacêutica para administração peroral, sublingual, transdérmica, intraocular, intramuscular, intravenosa, subcutânea, local ou retal do ingrediente ativo, isoladamente ou em combinação com outro composto ativo pode ser administrada a humanos e animais em uma forma de administração padrão, em uma mistura com transportadores farmacêuticos tradicionais. As formas de administração padrão adequadas incluem formas perorais tais como comprimidos, cápsulas de gelatina, pílulas, pós, grânulos, chicletes e soluções ou suspensões perorais; formas de administração sublingual e transbucal; aerossóis; implantes; formas locais, transdérmica, subcutânea, intramusculares, intravenosas, intranasal ou intraocular e formas de administração retal.

[122] "Medicamento" — é um composto (ou uma mistura de compostos como composição farmacêutica) na forma de comprimidos, cápsulas, soluções, pomadas e outras formas prontas destinadas à restauração, melhoria ou modificação de funções fisiológicas em humanos e animais, e para tratamento e profilaxia de doenças, para diagnóstico, anestesia, contracepção, cosmetologia e outros.

[123] O termo "doença ou distúrbio mediado por CD47 e PD-L1" significa toda doença ou distúrbio que esteja diretamente ou indiretamente associado a CD47 e PD-L1, incluindo etiologia, desenvolvimento, progressão, persistência ou patologia de uma doença ou distúrbio. "Tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se a um método de aliviar ou revogar um distúrbio biológico e/ou pelo menos um de seus sintomas associados. Como usado aqui, "aliviar" uma doença, distúrbio ou condição significa reduzir a gravidade e/ou frequência de ocorrência dos sintomas de uma doença, distúrbio ou condição. Além disso, as referências aqui para "tratamento" incluem referências para tratamentos curativo, paliativo e profilático.

[124] Em um aspecto, o sujeito do tratamento, ou paciente, é um mamífero, de preferencialmente um sujeito humano. O referido sujeito pode ser macho ou fêmea, de qualquer idade.

[125] O termo "distúrbio" significa qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com o composto da presente invenção. A definição deste termo inclui doenças ou distúrbios crônicos e agudos, incluindo condições patológicas que causam a predisposição de um mamífero à ocorrência dessa violação. O distúrbio preferido a ser tratado de acordo com a invenção é o câncer.

[126] Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se a uma condição fisiológica ou descrevem uma condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento/proliferação não-regulado das células. A definição abrange doenças cancerígenas benignas e malignas. Exemplos de doenças cancerígenas incluem, mas não estão limitadas a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais particulares de tais doenças cancerígenas incluem câncer de células escamosas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não-pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer peritoneal, câncer hepatocelular, câncer de estômago, incluindo câncer gastrointestinal, câncer de pâncreas, glioblastoma, glioma, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer de rim ou renal, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireóide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, melanoma e vários cânceres de cabeça e pescoço.

[127] Os termos "resposta imune", "resposta autoimune" e "inflamação autoimune" referem-se, por exemplo, à ação de linfócitos, células que apresentam antígenos, células fagocíticas, granulócitos e macromoléculas solúveis produzidas pelas referidas células ou células hepáticas (incluindo anticorpos, citocinas e complementos produzidos no resultado de dano seletivo, destruição ou eliminação de patógenos invasivos, células ou tecidos infectados com patógenos, células cancerígenas ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células ou tecidos normais do corpo humano).

[128] Uma "quantidade terapeuticamente efetiva" pretende se referir àquela quantidade do agente terapêutico que está sendo administrado, que aliviará até certa extensão um ou mais dos sintomas do distúrbio em tratamento.

[129] O termo uso "crônico" refere-se ao uso contínuo (contínuo) do(s) agente(s) em oposição à via aguda (de curto prazo) de administração, de modo a manter o efeito terapêutico inicial (atividade) para um longo período de tempo.

[130] O uso "intermitente" refere-se a um tratamento que não é realizado consistentemente sem interrupções, mas que é de natureza bastante periódica.

[131] Como usado aqui, as palavras "compreende", "ter", "incluir" ou variações tais como "compreende", "compreendendo", "tem", "tendo", "inclui" ou "incluindo", e todas as suas variações gramaticais serão entendidas para implicar a inclusão de um número inteiro ou grupo de números inteiros declarados, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros. Descrição detalhada da invenção Anticorpo

[132] A presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam a CD47 e a PD-L1.

[133] Em uma concretização da presente invenção, o anticorpo é um anticorpo de comprimento completo ou seu fragmento de ligação ao antígeno.

[134] Em uma concretização da presente invenção, um anticorpo da presente invenção inclui um ou dois locais de ligação ao PD-L1.

[135] Em uma concretização da presente invenção, o local de ligação a CD47 inibe a interação do receptor CD47 e do ligante SIRPa, e/ou o local de ligação a PD-L1 inibe a interação de PD-L1 com receptor PD-1.

[136] Em uma das concretizações da presente invenção, refere-se a um anticorpo que se liga a CD47 e PD-L1 e ao local de ligação a CD47, que inclui a região variável da cadeia pesada, contendo: a. CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% ou 90% homóloga ou idêntica à sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 1-4, isto é, CDR1 é uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 1-4 ou uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 1-4 com 1 ou 2 substituições; b. CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 84%, 86%, 88%, 92% ou 96% homóloga ou idêntica a uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 6-15, isto é, CDRA é a sequência de SEQ ID NOs: 6-15 ou uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 6-15 com 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições; c. CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 86% 90%, 93% ou 95% homóloga ou idêntica a uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 17-20, isto é, CDR3 é uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 17-20 ou uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 17- com 1, 2 ou 3 substituições.

[137] Em uma das concretizações da presente invenção, refere-se a um anticorpo que se liga a CD47 e PD-L1 e o local de ligação a CD47, que inclui a região variável da cadeia pesada, contendo: a. CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é idêntica a uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 1-4; b. CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é idêntica a uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 6-15; c. CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é idêntica a uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 17-20.

[138] Em uma concretização, a presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga a CDA47 e PD-L1 e compreende um local de ligação a CD47 compreendendo: a. Uma região variável de cadeia pesada, compreendendo: i. CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% ou 90% homóloga ou idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 1-4, isto é, CDR1 é uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 1-4 ou uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 1-4 com 1 ou 2 substituições; ii. CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 84%, 86%, 88%, 92% ou 96% homóloga ou idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 6-15, isto é, CDR?2 é a sequência de SEQID NOs: 6-15 ou uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQID NOs: 6-15 com 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições, il. CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 86% 90%, 93% ou 95% homóloga ou idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 17-20, isto é, CDR3 é uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs:

17-20 ou uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 17-20 com 1, 2 ou 3 substituições, e b. Uma região variável de cadeia leve compreendendo: i. CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% ou 90% homóloga ou idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQID NOs: 22-34, isto é, CDR1 é uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 22-34 ou uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs : 22-34 com 1 ou 2 substituições, ii. CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 87% ou 94% homóloga ou idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQID NOs: 36-48, isto é, CDR2 é uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 36-48 ou uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 36-48 com 1, 2 ou 3substituições iii. CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% ou 90% homóloga ou idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQID NOs: 50-64, isto é, CDR3 é uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 50-64 ou uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs : 50-64 com 1 ou 2 substituições.

[139] Em uma concretização, a presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga a CD47 e PD-L1 e compreende um local de ligação a CD47 compreendendo: a. A região variável da cadeia pesada compreendendo: i. CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 1-4,

ii. CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 6-15, iii. CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 17-20, e b. A região variável da cadeia leve compreendendo: i. CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 22-34, ii. CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 36-48, iii. CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 50-64.

[140] Em uma concretização, a presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga a CDA47 e PD-L1 e compreende um local de ligação a CD47 compreendendo: a. Uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homóloga ou idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 66-88, e b. Uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homóloga ou idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 89-106.

[141] Em uma concretização, a presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga a CD47 e PD-L1 e compreende um local de ligação a CD47 compreendendo: a. Uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 66-88, e b. Uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo de SEQ ID NOs: 89-106.

[142] Em uma concretização, a presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga a CDA47 e PD-L1 e compreende um local de ligação a PD-L1 compreendendo: a. Aregião variável da cadeia leve compreendendo: i. CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga ou idêntica à sequência de SEQ ID NO: 5, isto é, CDR1 é a sequência de SEQ ID NO: 5 ou a sequência de SEQ ID NO: 5 com 1 substituição; ii. CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 86% ou 92% homóloga ou idêntica à sequência de SEQ ID NO: 16, isto é, CDR2 é a sequência de SEQ ID NO: 16 ou a sequência de SEQ ID NO: 16 com 1, 2 ou 3 substituições; lili. CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% ou 90% homóloga ou idêntica à sequência de SEQ ID NO: 21, isto é, CDR3 é a sequência de SEQ ID NO: 21 ou a sequência de SEQ ID NO: 21 com 1 ou 2 substituições, e b. Aregião variável compreendendo: i. CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 86% ou 83% homóloga ou idêntica à sequência de SEQ ID NO: 35, isto é, CDR1 é a sequência de SEQ ID NO: 35 ou a sequência de SEQ ID NO: 35 com 1, 2 ou 3 substituições; ii. CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga ou idêntica à sequência de SEQ ID NO: 49, isto é, CDR2 é a sequência de SEQ ID NO: 49 ou a sequência de SEQ ID NO: 49 com 1 substituição;

lili. CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% ou 90% homóloga ou idêntica à sequência de SEQ ID NO: 65, isto é, CDR3 é a sequência de SEQID NO: 65 ou a sequência de SEQ ID NO: 65 com 1 ou 2 substituições.

[143] Em uma concretização, a presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga a CD47 e PD-L1 e compreende um local de ligação a PD-L1 compreendendo: a. A região variável da cadeia pesada compreendendo: i. CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ii. CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, iii. CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e b. A região variável da cadeia leve compreendendo: i. CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, ii. CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, iii. CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65.

[144] Em uma concretização, a presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga a CD47 e PD-L1 e é caracterizada em que um local de ligação a CD47 é Fab, scFv, scFab, ou VH isolado ou mono-domínios VHH.

[145] Em uma concretização, a presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga a CDA47 e PD-L1 e é caracterizada em que um local de ligação a PD-L1 é Fab, scFv, scFab ou VH isolado ou mono-domínios VHH.

[146] Em uma concretização, a presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga a CD47 e PD-L1 e é caracterizada por estimular a citotoxicidade celular dependente de anticorpo, a fagocitose mediada por macrófago, a citotoxicidade dependente de complemento e/ou a citotoxicidade mediada por células T em direção às células cobertas com antígenos CD47 e/ou PD-L1.

[147] Em uma concretização, a presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga a CDA47 e PD-L1 e é caracterizada na medida que compreende um fragmento Fc com pelo menos uma mutação ou modificação que aumenta a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e/ou a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) em comparação com o mesmo anticorpo sem mutação ou modificação.

Moléculas de ácido nucleico

[148] A presente invenção também se refere a moléculas de ácido nucleico e sequências codificando um anticorpo anti-CD47/PD-L1 da invenção descrita aqui. Em algumas concretizações, várias moléculas de ácido nucleico codificam o primeiro domínio e o segundo domínio da sequência de aminoácidos de um anticorpo anti-CD47/PD-L1. Em algumas concretizações, em que um primeiro domínio e/ou segundo domínio compreende uma cadeia pesada e cadeia leve, diferentes ácidos nucleicos codificam uma cadeia pesada e sequências de aminoácidos de cadeia leve. Em outras concretizações, a mesma molécula de ácido nucleico codifica sequências de cadeia pesada e cadeia leve. Em certas concretizações, uma molécula de ácido nucleico pode codificar qualquer combinação de sequências de aminoácidos (por exemplo, sequências de cadeia pesada e leve) do primeiro e segundo domínios. Em certa concretização, uma molécula de ácido nucleico pode codificar a sequência de aminoácidos de um primeiro domínio de ligação e a sequência de aminoácidos de cadeia leve de um segundo domínio de ligação, incluindo opcionalmente qualquer sequência de um ligante peptídico conectando-os. A referência a uma sequência de nucleotídeos abrange o complemento do mesmo, a menos se indicado diferentemente. Assim, uma referência ao ácido nucleico tendo uma sequência específica deve ser entendida como aquela que engloba sua fita complementar com a sequência complementar da mesma. O termo "polinucleotídeo" como usado aqui significa uma forma polimérica de nucleotídeos que têm pelo menos 10 bases de comprimento, ou ribonucleotídeos, ou desoxirribonucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. O termo inclui formas de fitas simples e duplas.

[149] Em qualquer uma das concretizações acima, moléculas de ácido nucleico podem ser isoladas.

[150] Uma molécula de ácido nucleico da invenção pode ser isolada de qualquer fonte que produza um anticorpo anti-CD47/PD-L1. Em certas concretizações, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode ser sintetizada, em vez de isolada.

[151] Em algumas concretizações, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica um domínio VH a partir do primeiro ou segundo domínio de um anticorpo da invenção, juntado ao quadro uma sequência de nucleotídeos que codifica um domínio constante de cadeia pesada a partir de qualquer fonte. Da mesma forma, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica um domínio VL a partir da primeira ou segunda região de um anticorpo da invenção, juntado ao quadro uma sequência de nucleotídeos que codifica um domínio constante de cadeia leve a partir de qualquer fonte.

[152] Em um outro aspecto da presente invenção, moléculas de ácido nucleico que codificam o domínio variável de cadeias pesada (VH) e/ou leve (VL) de um primeiro ou segundo domínio de ligação podem ser "convertidas" ao longo do comprimento dos genes do anticorpo. Em uma concretização, moléculas de ácido nucleico que codificam domínios VH ou VL são convertidas em genes de anticorpos ao longo do comprimento em virtude da inserção em um vetor de expressão que já codifica domínios de constantes de cadeia pesada (CH) ou de cadeia leve (CL), respectivamente, de modo que o segmento VH é operativamente ligado ao segmento(s) CH dentro do vetor, e/ou o segmento VL é operativamente ligado ao segmento de CL dentro do vetor. Em outra concretização, as moléculas de ácido nucleico que codificam os domínios VH e/ou VL são convertidas em genes de anticorpos por todo o comprimento em virtude da ligação, por exemplo, ligando uma molécula de ácido nucleico que codifica domínios VH e/ou VL a uma molécula de ácido nucleico que codifica domínios CH e/ou CL usando técnicas de biologia molecular padrão. As moléculas de ácido nucleico que codificam cadeias pesada e/ou leve ao longo do comprimento podem então ser expressas em uma célula na qual foram introduzidas.

[153] As moléculas de ácido nucleico podem ser usadas para expressar grandes quantidades de anticorpos anti-CD47/PD-L1 recombinantes. As moléculas de ácido nucleico também podem ser usadas para produzir anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos de cadeia única, imunoadesinas, diabéticos, anticorpos mutados e derivados de anticorpos, como descrito aqui. Vetor

[154] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor adequado para a expressão de qualquer uma das sequências de nucleotídeos descritas aqui.

[155] A presente invenção refere-se a vetores compreendendo moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de anticorpos anti-CD47/PD-L1 ou partes deles (por exemplo, sequências de cadeia pesada de um primeiro domínio de ligação e/ou sequências de cadeia pesada e/ou leve de um segundo domínio de ligação), como descrito aqui. A invenção ainda fornece vetores compreendendo moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas de fusão, anticorpos modificados, fragmentos de anticorpos.

[156] Em outra concretização, as moléculas de ácido nucleico e vetores podem ser usados para fazer anticorpos anti-CD47/PD-L1 mutados. Os anticorpos podem ser mutados nos domínios variáveis das cadeias pesada e/ou leve de um primeiro domínio de ligação e/ou cadeias pesada e/ou leve de um segundo domínio de ligação, por exemplo, para alterar uma propriedade de ligação dos anticorpos. Por exemplo, uma mutação pode ser feita em um ou mais CDRs para aumentar ou diminuir o Kd de anticorpos, para aumentar ou diminuir koff, ou para alterar a especificidade de ligação de um anticorpo em relação ao FcRn. Em outra concretização, uma ou mais mutações são feitas em um resíduo de aminoácido que é conhecido por ser alterado em comparação com a linha germinal em um anticorpo correspondente ao primeiro ou segundo domínio de ligação de anticorpos anti-CD47/PD-L1 da invenção. Tais mutações podem ser feitas no CDR ou região de armação de um domínio variável, ou em um domínio constante. Em uma concretização preferida, as mutações são feitas em um domínio variável. Em outra concretização, uma ou mais mutações são feitas em um resíduo de aminoácido que é conhecido por ser alterado em comparação com a linha germinal no CDR ou região de armação de um domínio variável de um anticorpo da invenção.

[157] Em algumas concretizações, os anticorpos anti-CD47/PD-L1 da invenção são expressos inserindo um DNA parcialmente ou completamente a sequência de um primeiro ou segundo domínio de ligação (por exemplo, sequências de cadeia leve e pesada onde um domínio de ligação compreende sequências de cadeias leve e pesada), obtidas como descrito acima, em vetores de expressão de modo que os genes são operativamente ligados a sequências de controle de expressão necessárias, tal como sequências de controle de transcrição e tradução. Os vetores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, adenovírus, vírus adeno- associados (AAV), vírus de plantas, tais como vírus de mosaico de couve-flor, vírus de mosaico de tabaco, cosmídeos, YACs, epissomas derivados de EBV e similares. As moléculas de DNA podem ser ligadas a um vetor de tal modo que sequências de controle de transcrição e tradução dentro do vetor sirvam à sua função pretendida de regular a transcrição e tradução do DNA. Um vetor de expressão e sequências de controle de expressão podem ser escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. As moléculas de DNA que codificam parcialmente ou completamente as sequências do primeiro e do segundo domínios de ligação (por exemplo, sequências de cadeia pesada e leve onde um domínio de ligação compreende uma sequência de cadeia pesada e leve) podem ser introduzidas em vetores individuais. EM uma concretização, qualquer combinação das referidas moléculas de DNA é introduzida no mesmo vetor de expressão. As moléculas de DNA podem ser introduzidas em um vetor de expressão por métodos padrão (por exemplo, ligação de locais de restrição complementar em um fragmento e vetor de gene de anticorpo, ou ligação final sem corte se não houver locais de restrição).

[158] Um vetor adequado é aquele que codifica sequências de imunoglobulina humana CH ou CL funcionalmente completas, com engenharia apropriada no local de restrição para que qualquer sequência VH ou VL possa ser facilmente inserida e expressa, como descrito acima. Os genes que codificam HC e LC em tais vetores podem conter sequências de íntrons que resultam em rendimentos globais de proteína de anticorpos melhorados estabilizando o mMRNA correspondente. As sequências de íntrons são flanqueadas por locais de doador e aceitador de emenda, que determinam onde a emenda do RNA ocorrerá. A localização de sequências de íntrons pode estar em regiões variáveis ou constantes de cadeias de anticorpos, ou em regiões variáveis e constantes quando múltiplos íntrons são usados. À poliadenilação e a terminação da transcrição pode ocorrer em um local cromossômico nativo a jusante das regiões de codificação. O vetor de expressão recombinante também pode codificar um peptídeo de sinal que facilita a secreção de uma cadeia de anticorpos a partir de uma célula hospedeira. O gene da cadeia de anticorpos pode ser clonado em um vetor de modo que o peptídeo de sinal está ligado no quadro ao terminal amino de uma cadeia de imunoglobulina. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína não- imunoglobulina).

[159] Além dos genes de cadeia de anticorpos, o vetor de expressão recombinante da invenção pode transportar sequências reguladoras que controlam a expressão de genes de cadeia de anticorpos em uma célula hospedeira. Será entendido por aqueles versados na arte que o desenho de um vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências reguladoras, pode depender de fatores tais como a escolha de uma célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de uma proteína desejada, e assim por diante. Sequências de controle preferidas para uma célula hospedeira de expressão em mamíferos incluem elementos virais que garantem altos níveis de expressão de proteínas em células de mamíferos, tais como promotores e/ou potenciadores derivados de um retroviral LTR, citomegalovírus (CMV) (como um promotor/potenciador CMV), vírus de símio 40 (SV40) (como um promotor/potenciador SV40), adenovírus, (por exemplo, o maior promotor adenovírus tardio (AdMLP), poliomavírus e promotores fortes de mamíferos, tal como o promotor de imunoglobulina nativo ou promotor de actina. Para descrição mais detalhada dos elementos reguladores virais e sequências dos mesmos, ver, por exemplo, as patentes nº US 5.168.062, US 4.510.245 e US 4.968.615. Os métodos para expressar moléculas de ligação, tais como anticorpos em plantas, incluindo uma descrição de promotores e vetores, bem como a transformação de plantas são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, patente nº US 6.517.529. Os métodos para expressar polipeptídeos em células bacterianas ou células fúngicas, por exemplo, células de levedura, também são bem conhecidos na arte.

[160] Além dos genes da cadeia de anticorpos e sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem transportar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação de um vetor em células hospedeiras (por exemplo,

origens da replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais um vetor foi introduzido (por exemplo, patentes nº US 4.399.216, US 4.634.665 e US 5.179.017). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a agentes medicinais, tal como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual um vetor foi introduzido. Por exemplo, genes marcadores selecionáveis incluem um gene dihidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr durante a seleção/amplificação de metotrexato), um gene neo (para seleção G418) e um gene de glutamato de sintetase.

[161] Otermo "sequência de controle de expressão" como usado aqui pretende se referir a sequências de polinucleotídeos que são necessárias para influenciar a expressão e o processamento das sequências de codificação às quais estão ligadas. As sequências de controle de expressão incluem sequências apropriadas de iniciação, terminação, promotor e potenciador de transcrição; sinais eficientes de processamento de RNA, tais como sinais de emenda e poliadenilação; sequências que estabilizam o mMRNA citoplasmático; sequências que aumentam a eficiência da tradução (isto é, sequência de consenso de Kozak); sequências que aumentam a estabilidade das proteínas e, quando desejado, sequências que aumentam a secreção de proteína. A natureza de tais sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro; em procariontes, tais sequências de controle geralmente incluem o promotor do local de ligação a ribossomo e sequências de terminação de transcrição; em eucariontes, tipicamente, tais sequências de controle incluem promotores e sequências de terminação de transcrição. O termo "sequências de controle" inclui pelo menos todos os componentes, cuja presença é essencial para a expressão e processamento e também pode incluir componentes adicionais cuja presença é benéfica, por exemplo, as sequências principais e a sequência de células fundidas. Células hospedeiras

[162] Um outro aspecto da invenção refere-se a métodos para produção de anticorpos para CDA47 e PD-L1 da invenção. Uma concretização da invenção refere-se a um método para produção de anticorpos como definido aqui, compreendendo a introdução/preparação de uma célula hospedeira recombinante capaz de expressar anticorpos, cultivar as referidas células hospedeiras sob condições adequadas à expressão/produção dos anticorpos e isolar o anticorpo obtido. Os anticorpos para CD47 e PD-L1 obtidos por tal expressão em tais células hospedeiras recombinantes é referido aqui como "anticorpos recombinantes". A invenção também se refere à descendência de células de tais células hospedeiras e anticorpos para CDA47 e PD-L1 obtidos analogamente.

[163] As moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos anti-CD47/PD-L1 da invenção e vetores compreendendo essas moléculas de ácido nucleico podem ser usados para transfecção de um mamífero adequado ou célula do mesmo, planta ou célula da mesma, célula hospedeira bacteriana ou de levedura. A transformação pode ser por qualquer técnica conhecida para introduzir polinucleotídeos em uma célula hospedeira. Os métodos para introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamíferos são bem conhecidos na arte e incluem transfecção mediada por dextrano, transfecção catiônica de complexo de polímero-ácido nucleico, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polybrene, fusão de protoplastos, encapsulamento de polinucleotídeo(s) em lipomossomos, e microinjeção direta de DNA em núcleos. Além disso, as moléculas de ácido nucleico podem ser introduzidas em células de mamíferos por vetores virais. Os métodos para transfecção de células são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, patentes nº US 4.399.216, US

4.912.040, US 4.740.461 e US 4.959.455. Os métodos de transformação de células vegetais são bem conhecidos na arte, incluindo, por exemplo, transformação mediada por Agrobacterium, transformação biolística, injeção direta, eletroporação e transformação viral. Os métodos de transformação de células bacterianas e de levedura também são bem conhecidos na arte.

[164] As linhas celulares de mamíferos usados como hospedeiros para a transformação são bem conhecidas na arte e incluem uma pluralidade de linhas celulares imortalizadas disponíveis. Estes incluem, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO), células NSO, células SP2, células HEK-2937T, células FreeStyle 293 (Invitrogen), células NIH-3T3, células HelLa, células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco verde africano (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), células A5S49 e um número de outras linhas celulares. As linhas celulares são selecionadas determinando quais linhas celulares têm altos níveis de expressão e fornecem características necessárias da proteína produzida. Outras linhas celulares que podem ser usadas são linhas de células de insetos, tais como células Sf9 ou Sf21. Quando vetores de expressão recombinantes que codificam anticorpos para CD47 e PD-L1 são introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos por cultura das células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão dos anticorpos em células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção dos anticorpos no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos para CD47 e PD-L1 podem ser isolados do meio nutriente usando métodos padrão de purificação de proteínas. As células hospedeiras vegetais incluem, por exemplo, Nicotiana, Arabidopsis, duckweed, milho, trigo, batata, etc. As células hospedeiras bacterianas incluem as espécies E. coli e Streptomyces. As células hospedeiras de levedura incluem Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris.

[165] Além disso, o nível de produção de anticorpos para CD47 e PD-L1 da invenção a partir de linhas celulares de produção pode ser aprimorado usando uma série de técnicas conhecidas. Por exemplo, o sistema de expressão de gene glutamina sintetase (o sistema GS) é uma abordagem comum para aprimorar a expressão sob certas condições. O sistema GS é discutido no todo ou em parte em conexão com EP nº 0216846, 0256055, 0323997 e 0338841.

[166] É provável que os anticorpos para CD47 e PD-L1 expressos por diferentes linhas celulares ou em animais transgênicos tenham um perfil de glicosilação diferente em comparação um com o outro. No entanto, todos os anticorpos para CD47 e PD-L1 codificados pelas moléculas de ácido nucleico descritas aqui ou compreendendo as sequências de aminoácidos fornecidas aqui fazem parte da presente invenção, independentemente da glicosilação das moléculas de ligação, e, em geral, independentemente da presença ou ausência de modificações pós-traduções. Preparação de anticorpos

[167] A invenção também se refere a métodos e processos para produção de anticorpos para CD47 e PD-L1 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Anticorpos monoclonais

[168] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando o método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler, et al. Nature 256, 1975, p. 495, ou podem usar métodos de DNA recombinante (US 4816567).

[169] Ao usar um método baseado em hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro adequado, tal como um hamster, é imunizado de acordo com o método descrito acima, a fim de causar a formação de linfócitos que produzem ou podem produzir anticorpos que sejam capazes de se ligar especificamente à proteína usada para a imunização. De acordo com outra concretização, os linfócitos podem ser produzidos por imunização in vitro. Após a imunização, os linfócitos são fundidos com uma linha celular de mieloma usando um agente de fusão adequado, como o polietilenoglicol, para produzir uma célula de hibridoma.

[170] As células de hibridoma assim obtidas são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado, que preferencialmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência de células de mieloma parental não-fundidas. Por exemplo, se as células parentais de mieloma não contêm a enzima guanina fosforibosil transferase hipoxantante (HGPRT ou HPRT), então o meio de cultura para hibridomas deve geralmente incluir hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), isto é, substâncias que inibem o crescimento de células deficientes em HGPRT.

[171] As linhas celulares de mieloma preferidas são as linhas de mieloma de camundongo, tais como as baseadas em linhas celulares de tumor murino MORS-21 e MPC-11, que podem ser obtidas a partir do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, pc. Califórnia, EUA, e linhas SP-2 ou X63-Ag8-653, que podem ser obtidas a partir de American Type Culture Collection, Rockville, ea. Maryland, EUA. O uso humano de linhas celulares de mieloma de camundongo e heteromieloma camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais também foi descrito (Kozbor, J. Immunol, 133, 1984, p. 3001).

[172] Preferencialmente, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais obtidos por células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA).

[173] A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise de Scatchard descrita em Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

[174] Após identificar células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados usando o método de diluição limitante e cultivados por métodos padrão. Os meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, o meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascites em um animal, por exemplo, por injeção intraperitoneal (i.p.) das células em camundongos.

[175] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro por técnicas convencionais de purificação de anticorpos, tais como, por exemplo, cromatografia de afinidade (por exemplo, usando proteína A ou proteína G-Sepharose) ou cromatografia de troca de íons, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, etc.

[176] O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas oligonucleotídicas capazes de ligação específica a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos murinos). As células de hibridoma servem como fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras, tais como células E. coli, células de símios COS, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem proteína de anticorpos sem serem transfectadas, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Uma revisão de artigos sobre expressão recombinante em bactérias de DNA que codificam o anticorpo.

[177] Em outra concretização, anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo podem ser isolados de bibliotecas de fagos de anticorpos gerados usando as técnicas descritas em MccCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. As publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa nM) por embaralhamento de cadeia (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), bem como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nucl. Acids. Res. 21: 2265-2266 (1993). Assim,

essas técnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpo monoclonal para isolamento de anticorpos monoclonais.

[178] O DNA que codifica o anticorpo pode ser modificado, por exemplo, de modo a produzir polipeptídeos de anticorpo quimérico ou de fusão, por exemplo, substituindo sequências de região constantes de cadeia pesada e cadeia leve (CH e CL) pelas sequências murinas homólogas (US 4816567 e Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81: 6851 (1984) ou ligando covalentemente a sequência de codificação de imunoglobulina a toda ou parte da sequência de codificação de um polipeptídeo não-imunoglobulínico (polipeptídeo heterólogo). As sequências de polipeptídeos não-imunoglobulínicos podem ser substituídas pelas regiões constantes de um anticorpo ou podem ser substituídas pelos domínios variáveis do centro de ligação ao antígeno de um anticorpo para criar um anticorpo quimérico bivalente compreendendo por um local de ligação ao antígeno tendo especificidade para um antígeno e outro local de ligação ao antígeno tendo especificidade para um antígeno diferente. Anticorpos humanizados

[179] Os métodos para produzir anticorpos de animais não-humanos "humanizados" são bem conhecidos na arte. Preferencialmente, o anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido integrais introduzidos nele a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácido não-humanos são frequentemente referidos como resíduos "importados" porque são tipicamente retirados de uma região variável "importada". À humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e co-autores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986), substituindo as sequências de região hipervariável pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Assim, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (US 4816567) nos quais uma região, que é substancialmente menor que uma região variável humana intacta, foi substituída pela sequência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de região hipervariável e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de regiões análogas em anticorpos de roedores.

[180] A escolha de regiões variáveis humanas, leve e pesada, para serem usadas na produção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade e a resposta HAMA (anticorpo humano anti-camundongo) quando o anticorpo é destinado ao uso terapêutico humano. De acordo com o chamado método "melhor ajuste", a sequência da região variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra toda a biblioteca de sequências de domínio de variável humanas conhecidas. A sequência de domínio V humano que é a mais próxima da do roedor é identificada e a região de armação humana (FR) dentro dele é selecionada, o que é adequado para uso no anticorpo humanizado (Sims et al., J. Inmunol. 151: 2296 (1993). Em outro método, é usada uma região de armação específica, obtida a partir de uma sequência de consenso de um determinado subgrupo de cadeias leve ou pesada de todos os anticorpos humanos. A mesma armação pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 4285 (1992).

[181] Também é importante que os anticorpos sejam humanizados com a retenção de alta afinidade de ligação ao antígeno e outras propriedades biológicas significativas. Para este fim, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados pela análise das sequências parentais e de vários produtos humanizados usando modelos tridimensionais conceituais das sequências parental e humanizada. Os modelos tridimensionais de imunoglobulina estão comumente disponíveis e são familiares aos versados na arte. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem possíveis estruturas conformacionais tridimensionais de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção dessas imagens permite a análise do possível papel dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar ao antígeno. Dessa maneira, os resíduos FR podem ser selecionados e combinados com sequências receptora e de importação para atingir as características desejadas do anticorpo, como afinidade aumentada com o(s) antígeno(s) alvo(s). Em geral, os resíduos da região hipervariável estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antígeno.

[182] O anticorpo humanizado pode ser um fragmento de anticorpo, como Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agentes citotóxicos, a fim de gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado pode ser um anticorpo de comprimento completo, tal como um anticorpo IgG1 de comprimento completo.

Anticorpos humanos e metodologia baseada na biblioteca de exibição de phage

[183] Como alternativa à humanização, anticorpos humanos podem ser gerados. Por exemplo, agora é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, após imunização, de produzir uma gama completa de anticorpos humanos sem produção endógena de imunoglobulina. Por exemplo, foi descrito que a exclusão homozigótica do gene da região de junção de cadeia pesada (JH) do anticorpo em camundongos mutantes quiméricos e de linha germinativa resulta em inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência da matriz de genes de imunoglobulina da linha germinativa humana para tais camundongos mutantes de linha germinativa resulta na produção de anticorpos humanos após o desafio ao antígeno (US 5545806, 5569825, 5591669 (todos de GenPharm); 5545807; e WO 97/17852).

[184] Alternativamente, a tecnologia de exibição de fagos (McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro a partir do repertório de genes da região variável da imunoglobulina (V) de corpos de doadores imunizados. De acordo com esta técnica, os genes da região V do anticorpo são clonados no quadro com um gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos como fragmentos de anticorpo funcional na superfície de uma partícula de fágica. Uma vez que a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita simples do genoma do fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção de um gene que codifica um anticorpo exibindo as referidas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades das células B. A exibição do fago pode ser realizado em uma variedade de formatos. Várias fontes de segmentos de gene V podem ser usadas para exibição de fago. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) isolou várias matrizes de anticorpos anti- oxazolona de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados do baço de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos contra uma matriz diversificada de antígenos (incluindo auto-antígenos) podem ser isolados essencialmente seguindo as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991).

[185] Como descrito acima, os anticorpos humanos também podem ser gerados por células B ativadas in vitro (ver US 5567610 e 5229275). Fragmentos de anticorpos

[186] Em certas circunstâncias, é aconselhável usar fragmentos de anticorpos em vez de anticorpos inteiros. Os pequenos tamanhos dos fragmentos contribuem para a rápida depuração dos mesmos e podem contribuir para uma melhor penetração em tumores densos.

[187] Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, esses fragmentos eram derivados via digestão proteolítica de anticorpos intactos. No entanto, esses fragmentos agora podem ser obtidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpo Fab, Fv e scFv podem ser expressos e secretados a partir de E. coli, permitindo assim facilitar a produção de grandes quantidades desses fragmentos. Os fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fagos de anticorpos descritas acima. De acordo com outra concretização, os fragmentos de Fab'-SH podem ser isolados diretamente de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab'), (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992). De acordo com outra abordagem, os fragmentos F(ab'); podem ser isolados diretamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Fab e F(ab'), com resíduos de receptor de ligação a epítopo de retenção de meia-vida in vivo aumentados são descritos em US 5869046. Outras técnicas para a obtenção de fragmentos de anticorpo deve ser aparente para aqueles versados na arte. Em outras concretizações, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia única (scFv) (ver WO 93/16185; US 5571894 e US 5587458). Fv e scFv são as únicas espécies com locais de ligação intactos que são desprovidas de regiões constantes; como resultado, são adequados para ligação inespecífica reduzida durante o uso in vivo. As proteínas de fusão que transportam scFv podem ser projetadas para produzir a fusão da proteína efetora no N- ou no C-terminal do scFv. O fragmento de anticorpo também pode ser um "anticorpo linear", por exemplo, como descrito em US 5641870. Tais fragmentos de anticorpo linear podem ser monoespecíficos ou biespecíficos. Anticorpos multiespecíficos

[188] Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos que têm especificidade de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epítopos diferentes de proteína. Outros anticorpos multiespecíficos podem combinar um local de ligação para CD47 e PD-L1 em combinação com um local de ligação para outra proteína. Os anticorpos biespecíficos podem ser obtidos como anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos F(ab'),: de anticorpos biespecíficos).

[189] Os métodos de produção de anticorpos multiespecíficos são conhecidos na arte. Por exemplo, a produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento completo é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm especificidades diferentes. Devido à variedade aleatória de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que geralmente é feita por cromatografia de afinidade em várias etapas, é bastante complicada e o rendimento do produto é baixo. Processos semelhantes são descritos em WO 93/08829.

[190] De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpo com a especificidade de ligação desejada (locais de ligação ao antígeno de uma ligação) são fundidos a sequências de domínio constante de imunoglobulina. Preferencialmente, a fusão é feita com uma região constante de cadeia pesada lg, compreendendo pelo menos uma porção das regiões dobradiça, CH2 e CH3. Preferencialmente, a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o local necessário para a ligação da cadeia leve está presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vários vetores de expressão e são co-transfectados em uma célula hospedeira adequada. Isso fornece maior flexibilidade na seleção de proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeos em concretizações quando proporções desiguais das três cadeias de polipeptídeos são usadas na construção para fornecer rendimentos ótimos. É, no entanto, possível inserir as sequências de codificação em duas ou todas as três cadeias de polipeptídeos em um único vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeos em proporções iguais resulta em altos rendimentos ou quando as proporções não têm nenhum efeito significativo.

[191] Em uma concretização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida que fornece uma primeira especificidade de ligação em um primeiro braço, e um par cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina híbrida (fornecendo uma segunda especificidade de ligação) em um segundo braço. Verificou-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação da molécula biespecífica desejada das combinações indesejadas de cadeia de imunoglobulina, pois a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica facilita a separação. Esta abordagem está divulgada em WO 94/04690. Para obter mais detalhes sobre a produção de anticorpos biespecíficos, ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986).

[192] De acordo com outra abordagem descrita em US 5731168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser construída para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são obtidos a partir de cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma porção da região CH3. De acordo com este método, um ou mais aminoácidos pequenos com cadeias laterais da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídos por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). As “cavidades” compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo, substituindo aminoácidos contendo cadeias laterais grandes por aminoácidos contendo cadeias laterais menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero em comparação com outros produtos finais indesejados.

[193] Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina e o outro à biotina. Tais anticorpos podem, por exemplo, ser usados para direcionar células do sistema imunológico para células indesejadas (US 4676980), e para o tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser feitos usando quaisquer métodos convenientes de reticulação. Agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na arte e estão divulgados em US 4676980, juntamente com várias técnicas de reticulação.

[1941] Métodos de obtenção de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritos na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser obtidos por ligação química. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) descreveram um procedimento, segundo o qual anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para produzir F(ab')2. Esses fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante ditiol, como o arsenito de sódio, para estabilizar os ditióis vicinais e impedir a formação de ligações intermoleculares de dissulfeto. Os fragmentos Fab' produzidos são então convertidos em derivado de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então reconvertido para Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar de outro derivado Fab'-TNB para obter o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

[195] O progresso recente facilitou a recuperação direta de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que podem ser quimicamente acoplados para produzir anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de F(ab'); de uma molécula de anticorpo biespecífica completamente humanizada. Cada Fab' foi secretado separadamente a partir de E. coli e sujeito a acoplamento químico direto in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim obtido foi capaz de se ligar a células que superexpressam o receptor ErbB2 e células Thumanas normais, bem como desencadear a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumores de mama humanos.

[196] Várias técnicas para obter e isolar fragmentos de anticorpo biespecífico diretamente a partir da cultura células recombinantes também foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando zíperes de leucina (Kostelny et al, J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados ao Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de genes. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região dobradiça para formar monômeros e, então, re-oxidados para obter os heterodímeros de anticorpo. Este método também pode ser usado para obter anticorpos homodiméricos. A tecnologia de "duplo anticorpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA. 90: 6444-6448 (1993) é um mecanismo alternativo para a produção de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem uma região VH conectada a uma região VL por um ligante que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Assim, as regiões VH e VL de um fragmento devem emparelhar-se com as regiões complementares de VL e VH de outro fragmento, formando assim dois locais de ligação ao antígeno. Outra estratégia para a produção de fragmentos de anticorpos biespecíficos usando dímeros de cadeia simples (Fv)-(sFv) também foi descrita (ver Gruber et al., J. Imnmunol., 152: 5368 (1994).

[197] A invenção também fornece anticorpos com mais de duas valências. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser produzidos. Anticorpos polivalentes

[198] Um anticorpo polivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) por uma célula que expressa um antígeno, ao qual o anticorpo se liga, mais rapidamente que um anticorpo bivalente. Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos multivalentes (exceto a classe IgM) com três ou mais locais de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpos tetravalentes) que podem ser facilmente obtidos pela expressão recombinante de um ácido nucleico que codifica cadeias de polipeptídeos de anticorpo. O anticorpo polivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais locais de ligação ao antígeno. O domínio de dimerização preferido compreende (ou consiste em) um fragmento Fc ou uma região dobradiça. Neste cenário, o anticorpo compreenderá um fragmento Fc e três ou mais locais de ligação ao antígeno no N-terminal para o fragmento Fc. O anticorpo polivalente preferido aqui compreende (ou consiste em) 3 a cerca de 8, mas preferencialmente 4, locais de ligação ao antígeno. O anticorpo polivalente compreende pelo menos uma cadeia de polipeptídeos (e preferencialmente duas cadeias de polipeptídeos), que a(s) cadeia(s) de polipeptídeos compreende(m) duas ou mais regiões variáveis. Por exemplo, a(s) cadeia(s) de polipeptídeos pode(m) compreender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 se refere a uma primeira região variável, VD2 se refere a uma segunda região variável, Fc se refere a uma cadeia de polipeptídeos de um fragmento Fc, X1 e X2 se referem a um aminoácido ou polipeptídeo, e n é O ou 1. Por exemplo, a(s) cadeia(s) de polipeptídeos pode(m) compreender a seguinte cadeia: VH-CH1-ligante flexível -VH-CH1-fragmento Fc ou VH-CH1-VH-CH1-

fragmento Fc. O anticorpo polivalente aqui, preferencialmente, compreende ainda pelo menos 2 (e preferencialmente 4) polipeptídeos de região variável de cadeia leve. O anticorpo polivalente aqui pode, por exemplo, compreender de cerca de 2 a cerca de 8 polipeptídeos de região variável da cadeia leve. No contexto da presente invenção, os polipeptídeos de região variável da cadeia leve compreendem uma região variável de cadeia leve e, opcionalmente, compreendem ainda mais uma região CL. Composições farmacêuticas

[199] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo específico para CD47/PD-L1 como ingrediente ativo (ou como o único ingrediente ativo). A composição farmacêutica pode incluir pelo menos um anticorpo que é específico para CD47 e PD-L1 e/ou uma ou mais moléculas de ligação adicional (por exemplo, anticorpos) que têm como alvo um ou mais dos receptores de superfície correspondentes, como descrito aqui. Em algumas concretizações, as composições pretendem melhorar, prevenir ou tratar distúrbios que são mediados por IgG.

[200] "Composição farmacêutica" significa uma composição compreendendo um anticorpo anti-CD47/PD-L1 da presente invenção e pelo menos um dos componentes selecionados a partir do grupo que consiste em excipientes farmaceuticamente aceitáveis e farmacologicamente compatíveis, tais como cargas, solventes, diluentes, transportadores, auxiliares, agentes de distribuição, agentes de entrega, conservantes, estabilizadores, emulsificantes, agentes de suspensão, espessantes, controladores de entrega prolongada, a escolha e proporções das quais dependem do tipo e via de administração e dosagem. As composições farmacêuticas da presente invenção e os métodos de preparação das mesmas serão, sem dúvida, aparentes para aqueles versados na arte. As composições farmacêuticas devem ser preferencialmente fabricadas em conformidade com os requisitos de GMP (Good Manufacturing Practice (Boas Práticas de Fabricação)). A composição pode incluir uma composição tampão, agentes de tonicidade, estabilizadores e solubilizadores. A ação prolongada da composição pode ser alcançada por agentes que retardam a absorção do ingrediente farmacêutico ativo, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina. Exemplos de transportadores, solventes, diluentes e agentes de entrega adequados incluem água, etanol, poliálcoois e suas misturas, óleos e ésteres orgânicos para injeções.

[201] "Medicamento (droga)" — é uma substância ou uma mistura de substância como uma composição farmacêutica na forma de comprimidos, cápsulas, pós, liofilizados, injeções, infusão, pomadas e outras formas prontas destinadas à restauração, melhoria ou modificação de funções fisiológicas em humanos e animais, e para tratamento e prevenção de doenças, para diagnósticos, anestesia, contracepção, cosmetologia e outros. Qualquer método para administrar peptídeos, proteínas ou anticorpos que são aceitos na arte pode ser adequadamente empregado para um anticorpo anti-CD47/PD-L1 da invenção.

[202] Otermo "farmaceuticamente aceitável" refere-se a um ou mais componentes líquidos ou sólidos compatíveis que são adequados para administração em um mamífero, preferencialmente um humano.

[203] O termo "excipiente" é usado aqui para descrever qualquer ingrediente que não seja os ingredientes acima da invenção. Estas são substâncias de natureza inorgânica ou orgânica que são usadas na fabricação farmacêutica, a fim de dar aos medicamentos as propriedades físico-químicas necessárias.

[204] Como usados aqui, "tampão", "composição tampão", "agente tampão" referem-se a uma solução que é capaz de resistir a mudanças no pH pela ação de seus componentes conjugados ácido-base, e que permite à droga de anticorpo anti-CD47/PD-L1 resista às mudanças no pH. Geralmente, a composição farmacêutica tem preferencialmente um pH na faixa de 4,0 a 8,0. Exemplos de tampões usados incluem, mas não estão limitados a, soluções tampão de acetato, fosfato, citrato, histidina, succinato, etc.

[205] Os termos "agente tônico", "osmólito" ou "agente osmótico", como usados aqui, referem-se a um excipiente que pode aumentar a pressão osmótica de uma formulação de anticorpo líquido. A droga "isotônica" é uma droga que tem uma pressão osmótica equivalente à do sangue humano. As drogas isotônicas normalmente têm uma pressão osmótica de cerca de 250 a 350 mOsm/Kkg. Os agentes isotônicos usados incluem, mas não estão limitados a, polióis, sacarídeos e sacarose, aminoácidos, sais metálicos, por exemplo, cloreto de sódio, etc.

[206] "Estabilizador" se refere a um excipiente ou uma mistura de dois ou mais excipientes que fornece a estabilidade física e/ou química do agente ativo. Os estabilizadores incluem aminoácidos, por exemplo, mas não estão limitados a, arginina, histidina, glicina, lisina, glutamina, prolina; surfactantes, por exemplo, mas não estão limitados a, polissorbato 20 (nome comercial: Tween 20), polissorbato 80 (nome comercial: Tween 80), polietileno- polipropileno glicol e seus copolímeros (nomes comerciais: Poloxamer, Pluronic, dodecilsulfato de (SDS)); antioxidantes, por exemplo, mas não estão limitados a, metionina, acetilcisteína, ácido ascórbico, monotioglicol, sais de ácido sulfuroso, etc.; agentes quelantes, por exemplo, mas não estão limitados a, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA), citrato de sódio, etc.

[207] Uma composição farmacêutica é "estável" se o agente ativo mantiver a estabilidade física e/ou estabilidade química e/ou atividade biológica durante a vida útil especificada à temperatura de armazenamento, por exemplo, de 2 a 8 ºC. Preferencialmente, o agente ativo mantém estabilidade física e química, bem como atividade biológica. O período de armazenamento é ajustado com base nos resultados do teste de estabilidade em condições de envelhecimento acelerado ou natural.

[208] Uma composição farmacêutica da invenção pode ser fabricada, embalada ou amplamente vendida na forma de uma dose unitária simples ou uma pluralidade de doses unitárias simples na forma de uma formulação pronta. O termo "dose unitária simples", como usado aqui, refere-se à quantidade discreta de uma composição farmacêutica contendo uma quantidade predeterminada de um ingrediente ativo. A quantidade de ingrediente ativo é geralmente igual à dosagem do ingrediente ativo a ser administrada ao sujeito, ou uma parte conveniente de tal dosagem, por exemplo, metade ou um terço dessa dosagem.

[209] As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são tipicamente adequadas para a administração parenteral como formulações estéreis destinadas à administração em um corpo humano através de brecha nas barreiras cutâneas ou mucosas, contornando o trato gastrointestinal em virtude de injeção, infusão e implantação. Por exemplo, a administração parenteral inclui, entre outros, injeções ou infusões subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, intraesternal, intravenosa, intra-arterial, intratecal, intraventricular, intrauretral, intracraniana, intrassinovial, transdérmica; e técnicas de infusão dialítica renal. A perfusão regional também é fornecida. As concretizações preferidas incluem vias intravenosas e subcutâneas. Qualquer método para administração de peptídeos ou proteínas, que é aceito na arte, pode ser adequadamente empregado para um anticorpo anti- CDA47/PD-L1 da invenção.

[210] As formulações injetáveis podem ser fabricadas, embaladas ou vendidas, sem limitação, em forma de dosagem unitária, tal como em ampolas, frascos, em recipientes plástico, seringas pré-cheias, dispositivos de autoinjeção. As formulações para administração parenteral incluem, entre outros, suspensões, soluções, emulsões em bases oleosas ou aquosas, pastas e similares.

[211] Em outra concretização, a invenção fornece uma composição para administração parenteral compreendendo uma composição farmacêutica que é fornecida em forma seca (por exemplo, em pó ou granular) para reconstituição com uma base adequada (por exemplo, água estéril e livre pirogênio ) antes da administração. Tal formulação pode ser obtida por, por exemplo, processo de liofilização, que é conhecido na arte como congelamento a seco, e que envolve o congelamento de um produto seguido pela remoção de solvente do material congelado.

[212] O anticorpo para CD47 e PD-L1 da invenção também pode ser administrado por via intranasal ou por inalação, isoladamente, como uma mistura com um excipiente farmaceuticamente aceitável adequado de um inalador, como um recipiente de aerossol pressurizado, bomba, spray, atomizador ou nebulizador, em que um propelente adequado é usado ou não é usado, ou como gotas nasais ou spray.

[213] As formas de dosagem para administração parenteral podem ser formuladas para serem de liberação imediata ou modificada. As formulações de liberação modificada incluem liberação retardada, sustentada, pulsada, controlada, direcionada e programada. Uso terapêutico de anticorpo anti-CD47/PD-L1 da invenção

[214] Em um aspecto, um anticorpo anti-CD47/PD-L1 da invenção é usado para tratar distúrbios mediados por CD47 e PD-L1, por exemplo, uma doença ou distúrbio selecionado a partir do grupo que compreende: (HNSCC) carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer cervical, câncer de origem primária desconhecida, glioblastoma, câncer de esôfago, câncer de bexiga, TNBC (câncer de mama triplo negativo), CRC (câncer colorretal),

carcinoma hepatocelular, melanoma, NSCLC (câncer de pulmão de células não-pequenas), câncer de rim, câncer de ovário, linfoma de Hodgkin, MSI CRC (câncer colorretal com instabilidade de microssatélites), leucemia (leucemia aguda ou leucemia mieloblástica), linfoma não-Hodgkin, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica.

[215] Em um aspecto, o sujeito do tratamento, ou paciente, é um mamífero, preferencialmente um sujeito humano. O sujeito acima pode ser masculino ou feminino e de qualquer idade.

[216] No caso de um tumor (por exemplo, câncer), a quantidade terapeuticamente efetiva do anticorpo ou fragmento do mesmo (por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a CD47 e PD-L1) pode reduzir o número de células cancerígenas; reduzir o tamanho inicial do tumor; inibir (isto é, retardar até certo ponto e, preferencialmente, parar) a infiltração de células cancerígenas em órgãos periféricos; inibir (isto é, retardar até certo ponto e, preferencialmente, parar) a metástase tumoral; inibir, até certo ponto, o crescimento tumoral; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados ao distúrbio. O anticorpo ou fragmento do mesmo pode, até certo ponto, impedir o crescimento e/ou matar as células cancerígenas existentes, podendo ser citostático e/ou citotóxico. Para a terapia do câncer, a eficácia in vivo pode, por exemplo, ser medida pela avaliação da sobrevida geral (OS), tempo para progressão do tumor (TTP), taxa geral de resposta do tumor ao tratamento (ORR), duração da resposta (DR) e/ou qualidade de vida.

[217] Como usados aqui, os termos "coadministração", "coadministrado" e "em combinação com", referindo-se a um anticorpo anti-CD47/PD-L1 e um ou mais agentes terapêuticos diferentes, devem significar, referem-se a ou incluir o seguinte: a. administração simultânea de tal combinação de um anticorpo anti-CD47/PD- L1 da invenção e agente terapêutico para um paciente que necessita de tratamento, quando tais componentes são formulados juntos em uma forma de dosagem simples que libera os referidos componentes substancialmente ao mesmo tempo para o referido paciente, b. administração substancialmente simultânea de tal combinação de um anticorpo anti-CD47/PD-L1 da invenção e agente terapêutico a um paciente que necessita de tratamento, quando tais componentes são formulados separadamente em diferentes formas de dosagem, cuja introdução ocorre quase ao mesmo tempo ao paciente indicado, após o que esses componentes são liberados quase simultaneamente ao paciente especificado, c. administração sequencial de tal combinação de um anticorpo anti-CD47/PD- L1 da invenção e agente terapêutico para um paciente que necessita de tratamento, quando tais componentes são formulados separadamente uns dos outros em formas de dosagem separadas que são tomadas em tempos consecutivos pelo referido paciente com um intervalo de tempo significativo entre cada administração, ao qual os referidos componentes são liberados em momentos substancialmente diferentes para o referido paciente; e d. administração sequencial de tal combinação de anticorpos a CD47 e PD-L1 de acordo com esta invenção e agente terapêutico para um paciente que necessita de tratamento, quando tais componentes são formulados juntos em uma forma de dosagem simples que libera os referidos componentes de forma controlada, ao qual são liberados simultaneamente, consecutivamente ou conjuntamente nos mesmos e/ou diferentes tempos para o referido paciente, onde cada porção pode ser administrada pela mesma ou diferentes vias.

[218] Um anticorpo anti-CD47/PD-L1 da invenção pode ser administrado sem tratamento terapêutico adicional, isto é, como uma terapia independente. Além disso, o tratamento por um anticorpo da invenção pode compreender pelo menos um tratamento terapêutico adicional (terapia de combinação). Em algumas concretizações da invenção, o anticorpo anti- CD47/PD-L1 pode ser administrado em combinação com ou ser formulado com um medicamento/droga para câncer diferente.

[219] O termo "agente citotóxico", como usado aqui, refere-se a uma substância que inibe ou impede a função das células e/ou causa a destruição das células. O termo pretende incluir isótopos radioativos (por exemplo, At2!1, [131, [125, yo, Rel86, Rel88, sm153, Bj2!2, p3? e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos e toxinas tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos.

[220] Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tratamento do câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes como tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXANº); alquilsulfonatos, tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina, trietilenofosforamida, trietiletenofosforamida e trimetilolImelamina; acetogeninas (por exemplo, bullatacin e bullatacinone); beta-lapacona; lapachol; colchicina; ácido betulínico; camptotecina (incluindo o topotecano análogo sintético (HYCAMTINº), CPT-11 (irinotecano, CAMPTOSARº), acetilcamptotecina, escopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina; calestatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposido; criptoficinas (por exemplo, criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1- TM!1); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictina; espongistatina; mostardas nitrogenadas, tais como cloroambucil, clornafazinay colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda uracil; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimustina; antibióticos tais como os antibióticos enedininos (por exemplo, caliqueamicina, por exemplo, caliqueamicina gama || e caliqueamicina ômega Il (ver, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183- 186 (1994)); dinemicina incluindo dinemicina A; uma esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos relacionados à cromoproteína enedina), aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, ccomomicina, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6- diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluindo ADRIAMYCINº morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, injeção de lipossomas com doxorrubicina HCI (DOXOLº), doxorrubicina lipossômica TLC D-99 (MYOCETº), doxorrubicina lipossômica pegilada (CAELYXº) e desoxidoxorrubicina, epirrubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicina, tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, — peplomicina, — potfiromicina, —puramicina, quelamicinay rodorubicina,

estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti- metabólitos tais como metotrexato, gencitabina (GEMZARº), tegafur (UFTORALº), capecitabina (XELODAº), uma epotilona e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato pteropterina, trimetrexato; análogos de purina como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; anti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico, tais como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamideglicósido; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de elíptinio; etoglucido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinóides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrone; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSKº (JHS Natural,Produtos Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (por exemplo, toxina T-2, verracurina A ,roridina A e anguidina); uretano; dacarbazina; manomomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); tiotepa; taxóide, por exemplo, paclitaxel (TAXOLº), formulação de nanopartículas com albumina manipulada de paclitaxel (ABRAXANEº) e docetaxel (TAXOTERES); clorambucil; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platina tais como cisplatina, oxaliplatina e carboplatina; vincas, que impedem a polimerização da tubulina de formar microtúbulos, incluindo vinblastina (VELBANº), vincristina (ONCOVINº), vindesina (ELDISINE)º ), (FILDESINº), e vinorelbina (NAVELBINEº); etoposídeo (VP16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometlilornitina (DMFO); retinóides, tais como ácido retinóico, incluindo bexaroteno (TARGRETINº); bifosfonatos, tais como clodronato (por exemplo, BONEFOSº ou OSTACº), etidronato (DIDROCALº), NE- 58095, ácido zoledrônico/zoledronato (ZOMETASº), alendronato (FOSAMAJXº), pamidronato (AREDIAº), tiludronato (SKELIDº), ou risedronato (ACTONELº); troxacitabina (análogo de 1,3-dioxolano nucleosídeo citosina); oligonucleotídeos antisentido, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes em vias de sinalização implicadas na proliferação de células aberrantes, tais como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras e receptor de fator de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas tais como a vacina THERATOPEº e vacinas de terapia genética, por exemplo, vacina ALLOVECTINº, vacina LEUVECTINº e vacina VAXIDº; inibidor de topoisomerase 1 (por exemplo, LURTOTECANº); rmRH (por exemplo, ABARELIXº); BAY439006 (sorafenibe; Bayer); SU-11248 (Pfizer); perifosina, inibidor de COX-2 (por exemplo, celecoxib ou etoricoxib), inibidor de proteossomo (por exemplo, PS341); bortezomibe (VELCADEº); CCI-779; tipifarnib (RI 1577); orafenib, ABTS10; inibidor de bcl-2, tais como oblimersen sódico (GENASENSEº); pixantrona; inibidores de EGFR (ver definição abaixo); inibidores da tirosina quinase (ver definição abaixo); e ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima; bem como combinações de dois ou mais dos acima, tais como CHOP, uma abreviação para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisolona e FOLFOX, uma abreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATINTM) combinado com 5-FU e leucovovina.

[221] Também estão incluídos nesta definição agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação hormonal em tumores, tais como antiestrogênicos com perfil agonista/antagonista misto, incluindo tamoxifeno (NOLVADEXº), 4-hidroxitamoxifeno, toremifeno (FARESTONº), idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVTSTAS), trioxifeno, keoxifeno e moduladores seletivos de receptor de estrogênio (SERMs), tais como SERM3; antiestrogênicos puros sem propriedades agonistas, tais como fulvestranto (FASLODEXº) e EMBO0O (tais agentes podem bloquear a dimerização do receptor de estrogênio (ER), inibir a ligação ao DNA, aumentar a renovação de ER e/ou suprimir os níveis de ER); inibidores de aromatase, incluindo inibidores de aromatase esteroidal, tais como formestano e exemestano (AROMASINº) e inibidores de aromatase não-esteroidal, tais como anastrazol (AREVIIDEXº), letrozol (FEMARAº) e aminoglutotimida, e outros inibidores de aromatase, incluindo vorozol (RIVISORº), acetato de megestrol (MEGASEº), fadrozol, imidazol, agonistas de hormônios liberadores de hormônios lutenizantes, incluindo leuprolide (LUPRONº e ELIGARDº), goserelina, buserelina e tripterelina; esteróides sexuais, incluindo progestinos, tais como acetato de megestrol e acetato de medroxiprogesterona, estrogênios, tais como dietilestilbestrol e premarin e andrógenos/retinóides, tais como fluoximesterona, todo ácido transretiônico e fenretinida; onapristona; anti-progesteronas; reguladores negativos do receptor de estrogênio (ERDs); antiandrógenos, tais como flutamida, nilutamida e bicalutamida; testolactona; e sais, ácidos ou derivados farmaceticamente aceitáveis de qualquer um dos acima; bem como combinações de dois ou mais dos acima.

[222] Outros agentes terapêuticos que podem ser usados em combinação com anticorpos anti-CD47/PD-L1 da invenção podem ser inibidores da função do fator de crescimento, por exemplo, tais inibidores incluem anticorpos do fator de crescimento e anticorpos receptores do fator de crescimento (por exemplo, o anticorpo anti-erbB2 trastuzumabe [Herceptin], o anticorpo anti-EGFR panitumumabe, o anticorpo anti-erbB1 cetuximabe [Erbitux, C225] e qualquer fator de crescimento ou anticorpos receptores do fator de crescimento divulgado por Stern et al.

Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, pp11-29); agentes antiangiogênicos, tais como aqueles que inibem os efeitos endoteliais vasculares do fator de crescimento [por exemplo, o anticorpo anti-fator de crescimento celular endotelial vascular bevacizumabe (Avastin)], anticorpos anti-receptor do fator de crescimento endotelial vascular, tais como anticorpos anti-KDR e anticorpos anti-flt1; nucleotídeos antisentido, por exemplo, aqueles que são direcionados aos alvos listados acima, tais como o ISIS 2503, um antisentido anti-RAS ou G3139 (Genasense), um antisentido anti-bcl2; abordagens de terapia genética, incluindo, por exemplo, abordagens para substituir genes aberrantes, tais como p53 aberrante ou BRCA1 ou BRCA?2 aberrantes, GDEPT (terapia enzimática dirigida a genes pró- drogas), abordagens tais como aquelas que usam citosina desaminase, timidina quinase ou uma enzima nitroredutase bacteriana e abordagens para aumentar a tolerância do paciente à quimioterapia ou radioterapia, tais como terapia genética de resistência a múltiplas drogas; abordagens de imunoterapia, incluindo, por exemplo, tratamento com alemtuzumabe (campath-1H), um anticorpo monoclonal direcionado a CD52 ou tratamento com anticorpos direcionados a CD22, abordagens ex vivo e in vivo para aumentar a imunogenicidade das células tumorais do paciente, transfecção com citocinas como interleucina 2, interleucina 4 ou fator estimulante de colônia de macrófagos de granulócitos, abordagens para diminuir a anergia das células T, como o tratamento com anticorpos monoclonais que inibem a função CTLA-4, abordagens usando células imunes transfectadas, tais como células dendríticas transfectadas por citocinas, abordagens usando linhas de células tumorais transfectadas por citocinas e abordagens usando anticorpos anti-idiotípicos, transferência de células T adotivas usando células T que não foram especificamente ativadas ou direcionadas a um antígeno específico de interesse ex vivo; inibidores da degradação de proteína, tais como inibidor de proteassoma, tais como Velcade (bortezomid); abordagens terapêuticas bioterapêuticas, por exemplo, aquelas que usam peptídeos ou proteínas (tais como anticorpos ou construções de domínio de receptores externos solúveis), que sequestra ligantes de receptores, bloqueiam a ligação do ligante ao receptor ou diminuem a sinalização do receptor (por exemplo, devido à degradação aumentada do receptor ou níveis de expressão reduzidos). Doses e rotas de administração

[223] O anticorpo anti-CD47/PD-L1 da invenção deve ser administrado em quantidade que seja efetiva no tratamento da condição em questão, isto é, em doses e durante os períodos de tempo necessários para alcançar o resultado desejado. Uma quantidade terapeuticamente efetiva pode variar de acordo com fatores como a condição específica que está sendo tratada, a idade, sexo e peso do paciente, e se o anticorpo anti-CD47/PD-L1 está sendo administrado como um tratamento autônomo ou em combinação com um ou mais tratamentos adicionais.

[224] Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta ótima. Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. Particularmente útil é a fabricação de composições parenterais em uma forma de dosagem padrão para facilitar a administração e uniformidade da dosagem. Uma forma de dosagem unitária como usada aqui pretende se referir a unidades fisicamente discretas adequadas como doses unitárias para pacientes/sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico desejado. A especificação para as formas de dosagem padrão da invenção é tipicamente ditada por e diretamente dependente de (a) as características únicas de um agente quimioterápico e do efeito específico terapêutico ou profilático a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes à arte de compor tal composto ativo para o tratamento dos sujeitos.

[225] Assim, os versados na arte reconhecerão a partir desta divulgação que as dosagens e regimes de dosagem são ajustados de acordo com métodos bem conhecidos no campo terapêutico. Ou seja, a dose máxima tolerável pode ser facilmente estabelecida e a quantidade efetiva que fornece um efeito terapêutico detectável para um paciente também pode ser determinada, assim como os requisitos temporais para administrar cada agente para fornecer um efeito terapêutico detectável a um paciente. Assim, embora algumas doses e regimes de dosagem sejam dados como exemplos neste documento, esses exemplos não limitam de forma alguma as dosagens e regimes de dosagem que podem ser necessários para o paciente na prática da presente invenção.

[226] Deve-se notar que os valores de dosagem podem variar de acordo com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada e podem incluir doses simples ou múltiplas. Além disso, deve ser entendido que, para qualquer sujeito particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento de um profissional médico que administra ou supervisiona a administração das composições, e que as faixas de dosagem aqui estabelecidas são apenas exemplares e não pretendem limitar o escopo ou a prática das composições reivindicadas. Além disso, o regime de dosagem com as composições desta invenção pode ser baseado em uma variedade de fatores, incluindo o tipo de doença, idade, peso, sexo, condição médica do paciente, gravidade da condição, via de administração e o anticorpo anti-CD47/PD-L1 particular empregado. Assim, o regime de dosagem pode variar amplamente, mas pode ser determinado rotineiramente usando métodos padrão. Por exemplo, as doses podem ser ajustadas com base em parâmetros farmacocinéticos ou farmacodinâmicos, que podem incluir efeitos clínicos, como efeitos tóxicos e/ou valores laboratoriais. Assim, a presente invenção abrange o escalonamento da dose intra-paciente como determinado pela pessoa versada na arte. Os métodos para determinar as dosagens e regimes apropriados são bem conhecidos na arte e seriam entendidos por um técnico habilidoso uma vez fornecidas as ideias aqui divulgadas.

[227] Exemplos de métodos de administração adequados são fornecidos acima

[228] Acredita-se que uma dose adequada de anticorpos para CD47 e PD-L1 de acordo com esta invenção estará na faixa de 0,1-200 mg/kg, preferencialmente 0,1-100 mg/kg, incluindo cerca de 0,5-50 mg/kg, por exemplo cerca de 1-20 mg/kg. O anticorpo para CD47 e PD-L1 pode ser administrado, por exemplo, em uma dose de pelo menos 0,25 mg/kg, tal como pelo menos 0,5 mg/kg, incluindo pelo menos 1 mg/kg, por exemplo, pelo menos 1,5 mg/kg, tal como pelo menos 2 mg/kg, por exemplo, pelo menos 3 mg/kg, incluindo pelo menos 4 mg/kg, por exemplo, pelo menos 5 mg/kg; e, por exemplo, até um máximo de 50 mg/kg, incluindo até um máximo de 30 mg/kg, por exemplo, até um máximo de 20 mg/kg , incluindo até um máximo de 15 mg/kg. A administração normalmente será repetida em intervalos de tempo apropriados, como uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas ou uma vez a cada quatro semanas, e pelo tempo que for considerado apropriado por um médico responsável, que pode, em alguns casos, aumentar ou reduzir a dose, se necessário. Artigo de fabricação (produtos) e kits

[229] A seguinte concretização da invenção é um produto que contém produtos usados para tratar o câncer, por exemplo, HNSCC, câncer cervical, câncer de primário desconhecido, glioblastoma, câncer de esôfago, câncer de bexiga, TNBC, CRC, carcinoma hepatocelular, melanoma, NSCLC, câncer de rim, câncer de ovário, linfoma de Hodgkin, MSI CRC, leucemia (leucemia aguda ou leucemia mieloblástica), linfoma não-Hodgkin, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica. O produto é um recipiente e um rótulo ou folheto inserido na embalagem, que são colocados no recipiente ou fechados com ele. Recipientes adequados são, por exemplo, latas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser feitos de vários materiais, como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é efetiva para o tratamento de uma condição particular e pode ter um canal de entrada estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou frasco com uma rolha que pode ser perfurado com uma agulha hipodérmica). Pelo menos um ingrediente ativo na composição é um anticorpo anti-PD-L1 de acordo com a invenção. O rótulo ou folheto na embalagem indica que a composição é usada para tratar uma condição particular. O rótulo ou folheto da embalagem deve conter adicionalmente instruções para administrar a composição do anticorpo ao paciente.

[230] O folheto da embalagem contém instruções típicas que estão incluídas nas embalagens de produtos terapêuticos que chegam ao mercado, incluindo algumas informações sobre indicações, frequência, dose, via de administração, contraindicações e/ou precauções para tais produtos terapêuticos. Em uma concretização, a inserção da embalagem indica que a composição se destina a ser usada para o tratamento de câncer, por exemplo, HNSCC, câncer cervical, câncer de primário desconhecido, glioblastoma, câncer de esôfago, câncer de bexiga, TNBC, CRC, carcinoma hepatocelular, melanoma, NSCLC, câncer de rim,

câncer de ovário, linfoma de Hodgkin, MSI CRC, leucemia (leucemia aguda ou leucemia mieloblástica), linfoma não-Hodgkin, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica.

[231] Além disso, o artigo pode ainda compreender um segundo recipiente com um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BSVI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Além disso, o artigo pode incluir outros produtos necessários do ponto de vista comercial e do ponto de vista do consumidor, em particular, outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[232] Ainvenção também se refere a kits que podem ser usados para vários propósitos, por exemplo, para detecção de PD-L1 em tecidos, células ou fluidos corporais de um mamífero. Tal kit seria útil para a triagem associada com doenças PD-L1. O kit inclui um agente de ligação específico ou anticorpo da invenção e meios para indicar a reação do agente de ligação específico ou anticorpo anti-PD-L1, quando presente. Em uma concretização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em uma concretização, o anticorpo que liga PD-L1, é marcado. Em outra concretização, o anticorpo é um anticorpo primário não-marcado e o kit ainda compreende meios para detectar o anticorpo primário. Em uma concretização, os meios de detecção incluem um segundo anticorpo marcado que é uma anti-imunoglobulina. O anticorpo pode ser marcado com um marcador selecionado a partir do grupo consistindo de um fluorocromo, uma enzima, um radionuclídeo e um material radiopaco. O kit pode ser um kit que contém anticorpos para detectar e quantificar PD-L1 in vitro, por exemplo, implementando ELISA ou western blotting. Além disso, como no caso de artigos, o kit compreende um recipiente e uma etiqueta ou inserção de embalagem, localizados sobre ou dentro do recipiente. O recipiente contém uma composição que compreende pelo menos um anticorpo anti-PD-L1, de acordo com a invenção. Recipientes adicionais podem compreender, por exemplo, diluentes e tampões, anticorpos de controle. O rótulo ou folheto da embalagem na embalagem pode conter uma descrição da composição, bem como instruções para seu uso in vitro ou para fins de diagnóstico. Uso diagnóstico e composições

[233] Oanticorpo anti-CD47/PD-L1 da invenção também é usado em processos diagnósticos (por exemplo, in vitro, ex vivo). Por exemplo, o anticorpo anti-CD47/PD-L1 pode ser usado para detectar ou medir o nível de CD47 e/ou PD-L1 em amostras obtidas de um paciente (por exemplo, amostra de tecido ou uma amostra de fluido corporal, tais como exsudato inflamatório, sangue, soro, fluido intestinal, saliva ou urina). Os métodos adequados para detecção e medição incluem imunoensaios, tais como citometria de fluxo, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), ensaio quimioluminescente, radioimunoensaio e imunohistologia. A invenção inclui ainda kits, por exemplo, kits de diagnóstico compreendendo anticorpos anti-CD47/PD-L1 descritos aqui. Exemplos

[234] Os exemplos a seguir são fornecidos para melhor compreensão da invenção. Esses exemplos são apenas para fins de ilustração e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção de qualquer maneira.

[235] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados nesta especificação são incorporados aqui por referência. Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum detalhe a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será bastante claro para aqueles versados na arte com base nas ideias divulgadas nesta invenção, que certas mudanças e modificações podem ser feitas sem se desviar da essência e do escopo das variações anexadas. Exemplo 1. Produção de antígenos recombinantes e anticorpos na cultura de suspensão de células de mamíferos

[236] As sequências de domínios extracelulares de CD47 humano (Leu19-Val134) e PD-L1 (Phe19-Arg238) (SEQ ID NOs: 107-108) foram clonadas em um plasmídeo para a produção de proteína Fc marcada em células de mamíferos (Fig. 1) nos locais de restrição Sall/Notl. As quantidades requeridas de plasmídeos foram produzidas em células E. Coli e purificadas usando o kit Qiagen.

[237] As sequências de domínios variáveis de anticorpo anti-CD47 (B6H12, Stanford University, US 20130142786) foram clonadas em plasmídeos para a produção de proteína IBgG1 em células de mamíferos. As quantidades requeridas dos plasmídeos foram produzidas em células E. Coli e purificadas usando o kit Qiagen.

[238] Anticorpos e antígenos foram gerados em linha celular estabelecida obtida a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO-K1). A cultura de suspensão foi conduzida em frascos de agitador orbital usando meio sem soro (Life Technologies Corporation) e de acordo com as diretrizes do fabricante. Para expressão transitória, as células em uma concentração de 2*106/ml foram transfectadas por meio de polietilenoimina linear (por exemplo, PEI MAX, Polysciences). A razão DNA/PEI foi de 1:3/1:10. Em 5-7 dias após a transfecção, a cultura de células foi centrifugada sob 2000 g por 20 min e filtrada através de filtro de 0,22 um. As proteínas-alvo foram isoladas do líquido da cultura por HPLC afim.

[239] As proteínas Fc recombinantes foram isoladas e purificadas a partir de cultura de células na coluna Proteína A para HPLC afim. O líquido de cultura limpo foi passado através de 5 ml de coluna HiTrap rProtein A Sepharose FF (GE Healthcare) equilibrada com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4). Em seguida, a coluna foi lavada com 5 volumes de PBS para remover componentes ligados não-específicos. O antígeno ligado foi eluido com tampão de glicina 0,1 M (pH 8). O pico de eluição da proteína principal foi coletado e levado para pH neutro com tampão Tris 1 M (pH 8). Todas as etapas foram conduzidas sob vazão de 110 cm/h. A proteína foi então dialisada em PBS (pH 7,4) usando a técnica SnakeSkin de tubulação de diálise, filtrada (0,22 um), transferida para tubos e armazenada a -70ºC.

[240] A pureza da solução de proteína obtida foi avaliada por SDS-PAGE não-redutora (gel 12%) Fig. 2. Exemplo 2. Preparação de anticorpos de comprimento completo

[241] A clonagem foi realizada pela técnica padrão. Os produtos PCR compreendendo os genes foram produzidos os domínios variáveis das cadeias pesada e leve de anticorpos com iniciadores contendo locais de restrição. O domínio variável de cadeia pesada foi clonado no vetor pEE-Hc IgG1 nos locais de restrição Sal1/Nhe1. O domínio variável de cadeia leve foi clonado no vetor pEE-CK nos locais de restrição Sal1/BsiW1. As construções genéticas obtidas foram usadas para produção transitória de proteínas na linha celular CHO-T. As proteínas foram isoladas e purificadas de acordo com os métodos padrão por cromatografia de afinidade na proteína A bacteriana, como descrito no Exemplo 1. A eletroforese foi realizada em 12% de PAGE desnaturante suplementado com mercaptoetanol (Fig. 3) e 8% de PAGE desnaturante não-suplementado com mercaptoetano!l (Fig. 4). Exemplo 3. Engenharia de uma biblioteca de fagos Fab humanos ingênuos MeganLibTM

[242] ORNA total de linfócitos B de amostras de sangue de mais de mil doadores humanos individuais foi isolado usando o Mini Kit RNeasy (QIAGEN) de acordo com o protocolo sugerido. O ensaio de concentração de RNA foi realizado usando o kit Nanovue (GE Healthcare); a qualidade do RNA isolado foi testada por meio de eletroforese em gel de agarose de 1,5%.

[243] A reação de transcrição reversa foi conduzida usando o kit MMLV RT (Evrogen) de acordo com o protocolo recomendado com transcriptase reversa MMuLV e oligonucleotídeos hexâmeros aleatórios como iniciadores.

[244] Os produtos de transcrição reversa foram usados como matriz em uma reação em cadeia de polimerase em dois estágios para obter os genes de domínios variáveis ladeados com locais de restrição; reação foi realizada usando o kit oligonucleotídeo de acordo com os protocolos por [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274(26): 18218-30].

[245] O produto de DNA obtido (VL-CK-VH) foi tratado com endonucleases de restrição Nhel/Eco911 e ligado ao fagomídeo original pH 5. Os produtos de ligação foram transformados em células eletrocompetentes SS320 E. coli preparadas de acordo com os protocolos [Methods Enzymol. 2000; 328: 333-63]. O repertório da biblioteca combinatória Fab phage display MeganLibTM foi de 1011 transformantes. Os produtos da biblioteca de fagos Fab foram preparados de acordo com o procedimento descrito anteriormente [] Mol Biol. 1991 Dez 5; 222(3): 581-97]. Exemplo 4. Imunização de lhama com antígeno CD47 humano e geração de uma biblioteca de exibição de fagos de fragmentos de anticorpo de lhama

[246] O animal Lama Glama foi imunizado 5 vezes em sucessão por meio de administração subcutânea de material de antígeno misturado com um volume igual de adjuvante de Freund completo (primeira injeção) ou incompleto (outras injeções). A proteína CD47 humana recombinante do Exemplo 1 (1 mg/injeção) foi usada como antígeno. As injeções de antígeno foram realizadas nos seguintes intervalos: O, 2, 4, 5, 8 semanas. Amostras de sangue (50 ml) foram coletadas 5 após cada injeção a partir da terceira. Foi usado citrato de sódio 3,8% como anticoagulante (1:9). O sangue foi diluído duas vezes com uma solução salina estéril. 30 ml de solução de sangue diluído foram então postos em camadas sobre 15 ml de médio (densidade de 1,077 g/ml) Lymphoprep"" (Axis-Shield, Noruega) e centrifugado por 20 min sob 800g. As células mononucleares (linfócitos e monócitos) foram selecionadas a partir da zona interfase do plasma/meio Lymphoprep e lavadas com PBS estéril.

[247] O título obtido de imunoglobulina sérica contra CD47, avaliado de acordo com o protocolo padrão, revelou-se pelo menos 1/100000, o que é suficiente para preparar uma biblioteca de anticorpos.

[248] O RNA total de células mononucleares de lhama foi isolado usando o Mini Kit RNeasy de acordo com o protocolo (QIAGEN). O ensaio de concentração de RNA foi realizado usando Nanovue (GE Healthcare); a qualidade do RNA isolado foi testada por meio de eletroforese em gel de agarose de 1,5%.

[249] A reação de transcrição reversa foi realizada usando o kit MMLV RT (Evrogen) de acordo com o protocolo recomendado com transcriptase reversa MMulLV e iniciadores hexâmeros aleatórios.

[250] Os produtos de transcrição reversa foram usados como matriz em uma reação em cadeia de polimerase de dois estágios para obter os genes dos mono-domínios VHH, scFv ou Fab ladeados com locais de restrição; a reação foi realizada usando kit oligonucleotídeo e protocolos por [FASEB J. 2007 Nov; 21(13): 3490-8]. O produto de DNA do gene VHH obtido foi tratado com restritases Ncol/Notl e ligado fagomídeo original pscFv, que é de composição análoga ao pHEN2 usado em [FASEB J. 2007 Nov; 21 (13): 3490-8]. Os produtos de ligação foram transformados em células eletrocompetentes SS320 preparadas de acordo com os protocolos [Methods Enzymol. 2000; 328: 333-63.]. Os repertórios de bibliotecas construídas com base em VHH foram 0,5-2*10E+8 transformantes independentes. Os repertórios das bibliotecas construídas com base em scFv/Fab foram 0,5-2*10E+9/1,2-2,5*10E+9, respectivamente. O produto da biblioteca de fagos foi preparado de acordo com o procedimento descrito anteriormente [] Mol Biol. 1991 Dez 5; 222(3): 581-97].

Exemplo 5. Seleção de bibliotecas de exibição de fagos de fragmentos de anticorpo

[251] Os anticorpos específicos para fagos anti-CD47 foram selecionados a partir de uma biblioteca de exposição de fagos Fab, VHH ou scFv (Exemplos 3, 4) por procedimentos de seleção convencionais descritos em [EMBO J. 1994 Jul 15; 13(14): 3245-60, Nat Biotechnol. 1996 Mar; 14(3): 309-14; J Mol Biol. 1991 Dez 5; 222(3): 581-97], mas usando contas magnéticas e dispositivo KingFisher Flex, porque esta técnica permite realizar até 96 diferentes esquemas e variantes simultaneamente.

[252] O antígeno PD-L1/CD47 humano biotinilado (Fc, EPEA) foi propositalmente imobilizado em contas magnéticas de estreptavidina (NEB) em uma concentração de 10 pg/ml para a primeira rodada, 2 ug/ml para a segunda rodada, 0,4 e 0,2 ug/ml para a terceira rodada e quarta rodada, respectivamente. O antígeno foi incubado com as contas por 1 hora à temperatura ambiente em um rotador. As contas foram então lavadas com PBS (pH 7,4), a superfície de contas foi bloqueada com uma solução de 2% de leite sem gordura ou 1% de BSA em PBS (pH 7,4) por 1 hora. A biblioteca de fagos humanos MeganLibTM foi diluída em uma concentração de 2*10*? partículas de fago/ml em PBS (pH 7,4) com 2% de leite sem gordura e antígeno não-alvo contendo um marcador de antígeno alvo, e pré-selecionada por contas magnéticas que não contêm antígeno na superfície, a fim de remover fagos de ligação não-específicos. As contas magnéticas revestidas de IL-SRa foram então incubadas com MeganLibTM por 1-2 horas à temperatura ambiente.

[253] Os fagos não-ligados foram removidos por vários ciclos de lavagem de contas magnéticas com uma solução de PBS (pH 7,4) contendo 0,1% de Tween-20. O número de ciclos de lavagem foi aumentado de rodada para rodada (3 ciclos de lavagem na primeira rodada, 9 ciclos de lavagem na segunda rodada e 15 ciclos de lavagem na quarta rodada). Os fagos ligados a antígeno na superfície das contas magnéticas foram eluidos das contas com solução GIly-HCI 100 mM (pH 2,2) durante 15 min sob agitação e então neutralizados com Tris- HCI 1M (pH 7,6). As bactérias E. coli TG1 foram infectadas com fagos, cultivadas em meio de cultura e então usadas no próximo ciclo de seleção. Após três ou quatro rodadas, o DNA do fagomídeo foi isolado da cultura de E. coli TG1 de acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen). O imunoensaio de enzima de fago policlonal (ELISA) foi usado para enriquecimento da biblioteca contra antígenos alvo e avaliação da presença de partículas de fago de ligação não-especifíca. Exemplo 6. ELISA de fago policlonal contra antígenos específicos e não-específicos

[254] O antígeno alvo (CD47/PD-L1) e o não-alvo (com proteína de fusão Fc) foram imobilizados em placas de alta absorção (Greiner-Bio) para realizar o ELISA. A proteína foi adicionada a uma concentração de 1 pg/ml e 5 ug/ml, respectivamente, em NaHCO; 0,1 M (pH 9,0) e titulada com um incremento de 2 a 7 diluições, as placas seladas foram então incubadas durante a noite a 4ºC. Todas as etapas subsequentes foram conduzidas de acordo com o protocolo ELISA padrão, usando uma plataforma robótica automatizada Tecan Freedom EVO 200 (Tecan). Para bloquear a ligação não-específica, foi adicionado o tampão de bloqueio que compreende 2% de leite sem gordura ou 1% de BSA em PBS (pH 7,4) aos poços de placa. As placas foram incubadas por 1h à temperatura ambiente. Após vários ciclos de lavagem com tampão fosfato-salino contendo Tween 20 (PBST), 50 ul/poço de fago policlonal de teste foi adicionado. Após a lavagem, cada poço foi revestido (50 ul/poço) com anticorpo secundário conjugado anti-M13 HRP (Pierce-ThermoScientific) em PBST (1:7500). Após 50 minutos de incubação à temperatura ambiente, as placas foram lavadas três vezes com PBST. O sinal colorimétrico foi obtido adicionando solução de substrato (H202-0,02% e TMB em CH3COONa pH 5,5) por 10 minutos; o desenvolvimento de cor foi então bloqueado adicionando 1% de ácido sulfúrico (20 ul). O sinal de cor foi medido a 450 nm usando um leitor de placa Tecan-Sunrise adequado (Tecan).

[255] O ELISA do produto de fago policloal mostrou enriquecimento significativo após a terceira e quarta rodadas de seleção em antígeno alvo. As bibliotecas foram selecionadas para reclonagem e triagem posterior, na qual o sinal foi observado para exceder 5 vezes em diluição mínima de bibliotecas de fagos para antígenos de controle não-homólogos. Exemplo 7. Reclonagem de genes de fragmentos de anticorpo em plasmídeo de expressão

[256] A reclonagem de genes de domínios variáveis de anticorpos em um plasmídeo de expressão a partir do vetor fagomídeo após rodadas de seleção bem-sucedidas foi realizada de acordo com um protocolo padrão usando técnica de ligação de restrição.

[257] O conjunto de clones resultante, enriquecido com mono-domínios VHH ou scFv, específico contra CD47 foi reclonado no plasmídeo de expressão pET-22 (Novagen) sob controle do promotor T7, que transforma sequências de marcadores myc e His6 no C-terminal de VHH. Os genes Fab para bibliotecas compreendendo sequências enriquecidas contra antígeno CD47 foram reclonados no vetor de expressão pLL4, sob controle do promotor lac, compreendendo ainda sequências de marcadores myc e His6 no C-terminal do domínio de cadeia pesada CH1.

[258] Posteriormente, os vetores de expressão compreendendo fragmentos de anticorpos foram transformados em E. coli BI21 (DE3) Gold (Stratagene) para geração de fragmentos de anticorpos por secreção no meio de cultura e realização de análise comparativa de afinidade de fragmentos de anticorpos variáveis a partir de bibliotecas de exibição a antígenos por ELISA usando a plataforma Mabnext Flow Chart.

Exemplo 8. Análise da ligação específica de scFv ou mono-domínio VHH ao CD47-Fc humano

[259] O ELISA foi usado para medir a ligação de fragmentos de anticorpo de teste específico do Exemplo 4 ao CD47-Fc humano. As placas de poço ELISA (Nunc ImmunoMaxisorp) foram cobertas com 50 ul/poço de CD47-Fc humano (Biocad) (0,5 ug/ml em 1X tampão de carbonato de revestimento), selados e incubados durante a noite a 4ºC. Todas as etapas posteriores foram realizadas de acordo com os protocolos ELISA padrão com uma plataforma automatizada de alto desempenho baseada em sistemas robóticos tais como GenetixQ-pix2xt (Dispositivos Moleculares) e Tecan Freedom EVO 200 (Tecan). A ligação não-específica foi bloqueada pela adição de um tampão de bloqueio BB (200 ul 0,5% leite sem gordura em PBS). As placas foram incubadas em um agitador por 1h à temperatura ambiente. Após a lavagem com PBS-Tween, cada célula foi revestida com 100 ul de sobrenadante celular contendo o fragmento de anticorpo de teste. As placas foram incubadas em um agitador por 1 hora à temperatura ambiente; além disso, cada poço de placa foi lavado 5 vezes com tampão PBS- Tween. Após a lavagem, o anti-MYC IgG de camundongo clone 9E10 (ThermofFisher Scientific) (50 ul/poço) foi adicionado ao PBS-Tween (1:5000). As placas foram agitadas em agitador de rotação (50 min à temperatura ambiente) e, então, lavada 5 vezes com tampão PBS-Tween como descrito acima. Após a lavagem, o anti-conjugado IgG HRP de camundongo (ThermorFisher Scientific) (50 ul/poço) foi adicionado ao PBS-Tween (1:10000). As placas foram agitadas em agitador de rotação (50 min à temperatura ambiente) e, então, lavada 5 vezes com tampão PBS-Tween como descrito acima. O sinal colorimétrico foi obtido pela adição de TMB (50 ul/poço) até a saturação (média de 10-12 min); o desenvolvimento de cores posterior foi bloqueado pela adição de uma solução de parada (25 ul/poço, ácido sulfúrico1%). O sinal de cor foi medido em 450 nm usando um leitor de placa Tecan-Sunrise (Tecan) adequado. A ligação de anticorpo foi proporcional ao sinal produzido. Os clones nos quais o sinal de cor excedeu o sinal de fundo mais de 5 vezes foram testados em um ensaio ELISA competitivo para identificar fragmentos de anticorpo antagonista específico, bloqueando a interação entre o ligante SIRP-Fc (BIOCAD) e o receptor CD47-Fc humano sob condições análogas àquelas descritas em [WO2016048188 A8] e sob um sinal 4 vezes menor em comparação a um controle que não compreende os fragmentos de anticorpo de teste.

[260] A triagem de 2400 clones resultou em 265 clones scFv e VHH demonstrando que o referido excesso de 5 vezes do sinal em relação ao sinal de fundo. O referido painel de clones positivos produziu 27 clones antagonistas capazes de bloquear a interação entre o ligante SIRP-Fc (BIOCAD) e o receptor CD47-Fc humano. A sequência nucleotídica dos genes do clone positivo foi determinada pelo sequenciamento de Sanger 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Seis clones de mono-domínio VHH exemplares foram obtidos diferindo em sequência por pelo menos 1 aminoácido, mas tendo regiões de CDR, cada uma com pelo menos 90% de homólogas às outras, assim indicando que se originaram de um clone parental em virtude de maturação in vivo em uma lhama imunizada (Tabela 1). Tabela 1. Sequências de mono-domínios VHH de ligação específica a CD47 para CD47 humano Unidades de Unidades OD, Unidades OD, Nome do) Sequência de | OD, triagem ligação em CD47 | triagem clone aminoácidos inicial para proprietário competitiva a CD47-Fc SIRP-Fc BCD106- QVKLEESGGGLVOPGG |04 0,448 0,095 02 L.Alecto | SLRLSCAASRSISSINAM .VHHSel2 NWYRQAPGKRREWVA MP1 H10 | QITGEGITNYRDSVKGR 78 FTITSDNAKNTMYLQM

NSLKPEDTAVYYCNAFVI

HTTSEVYWGOGTLVTV Ss AVOLVDSGGGLVQOPGG | 0,166 0,426 0,143

SLRLSCAASRSIFSINAM BCD106-

NWYROAPGNRREWVA 02 L.Alecto

QITDEGITNYVDSVKGR .VHHSel2-

FTITRDONAKNTMYLOM MP1 G5 3

NSLKPEDTAVYYCNAFVI 7

TTTSEIYWGOGTTVTVS Ss QVKLEESGGGLVQPGG | 0,319 0,498 0,088

SLTLSCAASGIISSINAM BCD106-

NWYROAPGKRREWVA 02 L.Alecto

QITGEGITNCRDSWKGR VHHSel2-

FSITSDSANNTMYLOQM MP1 G7 5

NNLKPDDTDVYYCNAF 3

VIHTTSEIYWGLGTTVTV Ss DVQLVESGGGLVOPGG | 0,213 0,312 0,114

SLRLSCAASRNIFSINAM BCD106-

NWYRQAPGKRREWVA 02 L.Alecto

QITSEGITNYVDSVKGRF .VHHSel2-

TITRDONAKNTMYLQMN MP1 F10 7

SLKPEDTAVYYCNAFVIT 6

ASSEVYWGOGTTVTVS Ss BCD106- AVOLVDSGGGLVOPGG | 0,127 0,379 0,14 02 L.Alecto | SLRLSCAASRSIFSINAM .VHHSel2 NWYRQAPGNRREWVA MP1 C7 49 | QITDEGITNYVDSVKGR

FTITRDONAKNTMYLOM NSLKPEDTAVYYCNAFVI

TTTSEIYWGOGTTVTVS Ss DVQLVESGGGLVQOPGG | 0,129 0,24 0,188

SLTLSCAASRNIFRINAM BCD106-

NWYRQOAPGKRREWVA 02 L.Alecto

PITSEGITNYVDSVKGRF VHHSel2-

TITRDNAKNTMYLQMN MP1. B9 64

SLKPEDTAVYYCNACLIT Antígeno de 0,021 0,024 0,481 controle negativo + conjugado Exemplo 9. Análise de ligação específica de Fabs ao CD47-Fc humano

[261] A produção de Fab foi produzida de acordo com a técnica padrão: as células bacterianas foram transformadas com vetores de expressão contendo genes Fab e subsequente adição de indutor, que desencadeia a transcrição do operon lac, no meio, durante o cultivo que resulta em transformantes, causa a expressão de Fabs.

[262] O ELISA foi então conduzido para procurar Fabs que se liga ao CD47 humano.

[263] B6H12 Fabcom uma sequência publicada (ver Exemplo 1) foi usado como um controle positivo. Para testar a ligação específica, as placas de poço ELISA (ligação média, Greiner bio one) foram cobertas com 50 ul/poço de CD47 Fc lama (0,2 pg/ml em 1X tampão de carbonato), seladas e incubadas durante a noite a 4ºC. Todas as etapas posteriores foram realizadas de acordo com os protocolos ELISA padrão, com uma plataforma automatizada de alto desempenho baseada em sistemas robóticos, tais como Genetix Qpix2xt (Dispositivos Moleculares) e Tecan Freedom EVO 200 (Tecan). A ligação não-específica foi bloqueada pela adição de um tampão de bloqueio BB (200 ul 0,5% leite sem gordura em PBS). As placas foram incubadas por 1h à temperatura ambiente. Após a lavagem com PBS-Tween, cada célula foi revestida com 60 ul/poço de sobrenadante celular contendo o teste Fab. As placas foram incubadas por 1 hora à temperatura ambiente; cada poço da placa foi então lavado 3 vezes com tampão PBS-Tween. Após a lavagem, cada poço foi revestido (50 ul/poço) com anticorpo secundário anti-humano conjugado com Fab HRP (Pierce-ThermoScientific) em PBS-Tween (1:7500). As placas foram incubadas por 1 hora à temperatura ambiente e lavadas três vezes com tampão PBS-Tween, como descrito acima. O sinal colorimétrico foi obtido pela adição TMB (50 ul/poço) até a saturação (15 min); o desenvolvimento de cores posterior foi bloqueado pela adição de uma solução de parada (25 ul/poço, 1% ácido sulfúrico). O sinal de cor foi medido em 450 nm usando um leitor de placa Tecan-Sunrise (Tecan) adequado. À ligação de anticorpo foi proporcional ao sinal produzido. Os clones nos quais um sinal de cor excedeu o sinal do anticorpo de controle foram testados por ELISA contra uma ligação não- específica. Exemplo 10. Análise da ligação não-específica de Fabs a vários antígenos humanos

[264] A triagem secundária visa selecionar clones produtores de Fab que interagem com o antígeno CD47 de comprimento completo e não interagem com antígenos não-específicos, e também competem com o ligante (CD47) para ligação a SIRPa.

[265] O ELISA foi usado para analisar a ligação não-específica dos Fabs de teste a outros antígenos. A análise foi realizada como descrito acima, mas 3DHer3-H6E, INFa2b, PD-L1-Fc- lama (2,5 ug/ml em 1X tampão de carbonato) foram usados como antígenos para imobilização. CD47 FE e CD47 Fc lama (0,2 ug/ml em 1X tampão de carbonato) foram usados como controles de ligação específicos. Todas as etapas posteriores foram conduzidas de acordo com o protocolo ELISA padrão com uma plataforma automatizada de alto desempenho baseada em sistemas robóticos, tais como Genetix Qpix2xt (Dispositivo Molecular) e Tecan Freedom EVO 200 (Tecan).

[266] O ELISA competitivo foi usado para testar Fabs específicos para CD47 anti-humano pré-selecionados sobre a capacidade de bloquear a interação com o receptor SIRPa. O Fab com uma sequência publicada (ver Exemplo 1) foi usado como um controle positivo do antagonista.

[267] As placas de poço ELISA (ligação alta, Greiner bio one) foram cobertas com 50 ul/poço de SIRPa (0,5 ug/ml em 1X tampão de carbonato) e incubadas durante a noite a 4ºC. Todas as etapas posteriores foram realizadas de acordo com os protocolos ELISA padrão com uma plataforma automatizada de alto desempenho baseada em sistemas robóticos, tais como Genetix Qpix2xt (Dispositivos Moleculares) e Tecan Freedom EVO 200 (Tecan). A ligação não- específica foi bloqueada pela adição de um tampão de bloqueio BB (200 ul 0,5% leite sem gordura em PBS). As placas foram incubadas por 1h à temperatura ambiente.

[268] Paralelamente, o sobrenadante celular compreendendo o teste Fab e CD47 Fc lama (a uma concentração final de 1 ug/ml em PBS-Tween) foi misturado a uma proporção 1:1 em placas não-absorventes, incubadas por 45 minutos à temperatura ambiente.

[269] Após a lavagem da placa contendo o receptor SIRPa para remover BB, uma mistura de Fab e CD47 Fc lama foi transferida para a placa, incubada por 45 minutos à temperatura ambiente. Cada poço de placa foi então lavado três vezes com tampão PBS-Tween, 50 ul/poço de anticorpo secundário anti-humano conjugado com Fab HRP (Pierce-ThermoScientific) foi adicionado ao PBS-Tween (1:7500). As placas foram incubadas por 45 min à temperatura ambiente e lavadas 3 vezes com PBS-Tween, como descrito acima. O sinal colorimétrico foi obtido pela adição de TMB (50 ul/poço) até a saturação (média de 15 min); o desenvolvimento de cores posterior foi bloqueado pela adição de uma solução de parada (25 ul/poço, 1% ácido sulfúrico). O sinal de cor foi medido em 450 nm usando um leitor de placa Tecan-Sunrise (Tecan) adequado. A ligação Fab foi inversamente proporcional ao sinal de cor produzido. Os clones que mostraram bloqueio ao nível do controle Fab foram anotados como positivos e usados em outros ensaios. Os genes dos domínios variáveis dos clones positivos foram sequenciados de acordo com protocolos padrão no Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) e analisados. Exemplo 11. Triagem comparativa de fragmentos de anticorpo anti-CD47 pela constante de dissociação cinética koff (kdis).

[270] Os fragmentos de anticorpo VHH foram medidos para fornecer um exemplo de análise de parâmetros cinéticos de interação de fragmentos de anticorpo que se ligam especificamente ao receptor CD47. A triagem comparativa baseada na constante de dissociação (kdis) para fragmentos de VHH foi realizada usando biossensores amino-reativos Octet Red 96 e ARG2 (Pall-ForteBio). As constantes de afinidade podem ser calculadas com base na concentração exata de proteína na solução de teste e, uma vez que o meio de crescimento celular foi usado como solução de proteína e as concentrações de proteínas não foram medidas, os candidatos foram comparados entre si usando a constante de dissociação. Os biossensores foram pré-reidratados por uma hora na água. Após a ativação dos biossensores, o CD47-Fc a uma concentração de 10 ug/ml em tampão de acetato pH4 foi imobilizado não-especificamente (por grupos NH2) no biossensor. Os sensores foram então imersos em poços contendo meio de crescimento celular com VHHs específicos (de cerca de 1 ug de VHH em 1 ml de meio), onde o complexo foi associado. Os sensores foram então imersos em uma solução tampão, onde ocorreu o estágio subsequente de dissociação do complexo. 1/10 do volume de tampão de trabalho de 10x foi adicionado às amostras de teste em meio de crescimento E. Coli contendo fragmentos de VHH anti-CD47. As curvas obtidas foram analisadas usando OctetDataAnalysis (versão 7.0) de acordo com o procedimento padrão com modelo de interação 1:1.

[271] Osresultados da triagem koff de candidatos a VHH anti-CD47 são mostrados na Tabela

2. Foi demonstrada a ligação específica de todos os fragmentos de VHH ao CD47 humano; o candidato BCD106-02 L.Alecto.VHHSel2 MP1 C7 49 foi selecionado com base em kdis predominantes para estudo posterior e reclonagem para obter anticorpos biespecíficos. Tabela 2. Constantes de dissociação cinética de VHH com CD47-Fc JR e posa eaEs amem E Rcc e

Exemplo 12. Obtenção de construções e produção de anticorpos biespecíficos assimétricos anti-CD47/PD-L1

[272] As sequências de todos os domínios variáveis de fragmentos scFv otimizados e as sequências de genes para a síntese de variantes de tipo selvagem e mutante do domínio variável VHH do candidato BCD106-02-VHH C7 49 (Tabela 3) e os genes de domínios variáveis de cadeias leve e pesada de anticorpo anti-PD-L1 (BCD135, anticorpo humano original do BIOCAD) foram obtidos de novo por cálculo usando algoritmos de computador proprietários e síntese de PCR a partir de oligonucleotídeos obtidos em sintetizadores ASM- 2000 (Novosibirsk) de acordo com o protocolo padrão [http://www.openwetware.org/wiki/DNA Synthesis from Oligos]. Os genes scFv longos foram derivados de genes VH e VL usando a síntese de PCR em duas etapas a partir de moléculas de DNA de fita simples. Após a síntese de PCR, os fragmentos de DNA fracionados em gel de agarose foram purificados em colunas QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Os genes scFv e VHH foram individualmente ligados ao plasmídeo pEE-Fc (botão), enquanto o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo específico de aPD-L1 foi ligado individualmente ao plasmídeo pEE-Fc (lacuna). O pEE-Fc (botão) contém IgG1 Fc humano com as mutações S354C+T366W e pEE-Fc (lacuna) contém IgG1 Fc humano com mutações Y349C+T366S+L368A fornecendo heterodimerização dessas porções Fc entre si, sob um grau mínimo de homodimerização [Nat Biotechnol. 1998 Jul; 16(7): 677-81.], com expressão co- transitória em células CHO-EBNA com o domínio variável de cadeia leve aPD-L1, analogamente clonada em pEE-C lambda. Após clonagem independente de ligante por um método LIC modificado [Aslanidis C, de Jong PJ. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 1990;18:6069-6074], o DNA foi transformado em E. coli. As construções com sequências corretas pEE-Fc (botão)-scFv ou pEE-Fc (botão)-VHH foram co- transfectadas com pEE-BCD135-VH-299P-HC-lacuna e pEE-BCD135-01-4LG-VL-hzau-CL para obter os chamados anticorpos biespecíficos assimétricos (ver Fig. 6). A figura mostra modelos esquemáticos de anticorpos biespecíficos assimétricos, A- baseados em fragmentos de ligação Fab anti-CD47 scFv e anti-PD-L1, B- baseados em fragmentos de ligação Fab anti-CD47 VHH e anti-PD-L1. As construções genéticas resultantes foram usadas para produzir proteínas na linha celular CHO-T, de acordo com o Exemplo 2. Após a purificação, os anticorpos eram altamente homogêneos na composição, os rendimentos de produção de anticorpos biespecíficos variaram de 60 a 260 mg/ml de meio de cultura. A Fig. 7 mostra exemplos de anticorpos biespecíficos purificados com base em fragmentos anti-CD47 scFv. A Fig. 8 mostra exemplos de anticorpos biespecíficos purificados com base em fragmentos de anti-CD47 VHH. A variante de anticorpo contendo a sequência VHH47Opt3 indicada na Tabela 3 gerou um rendimento de anticorpos extremamente baixo e foi excluída de outros testes. Tabela 3. Sequências de aminoácidos de variantes do tipo selvagem/mutante de anti-CD47 VHH do clone BCD106-02-VHH C7 49 e domínios variáveis de anti-PD-L1 BCD135. O cinza indica posições anti-CD47 VHH com outras mutações que não as do tipo selvagem. VHH47 AVOLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIFSINAMNWYRQPPGNRREWVAQITDEGIT Selvagem NYVDSVKGRFTITRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCNAFVITTTSEIYWGOGTTVT

VSS VHH470Opt1 AVOLVDSGGGLVOPGGSLRLSCAASRSIFSINAMNWYRQAPGKGTEWVAQITDEGIT

NYVDSVKGRFTITRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCNAFVITTTSEIYWGOGTTVT

VSS VHH470Opt2 QVQLVESGGGLVQOPGGSLRLSCAASRSIFSINAMNWYRQAPGKGTEWVAQITDEGIT

NYVDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNAFVITTTSEIYWGQOGTTVT

VSS VHH470Opt3 QVOQLVESDGGLVOPGGSLRLSCAASRFTFSINAMNWVROAPGKGLEWVSQITDEGIT

NYVDSVKGRFTISRDNAKNTLYLOQMNSLRAEDTAVYYCAAFVITTTSEIYWGOGTLVTV Ss o [eras crammisin droits — VH (BCD135) EVOLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKGLEWVSDISWSGS

NTNYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARAPLLLAMTFGVGSWG

OGTLVTVSS VL(BCD135) QTVVTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGTVTAINYPGWYQQTPGOAPRTLIYNTNTRHS [o VotomemanmoRTEnTCUMaaMA Exemplo 13. Análise da interação de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47 PD-L1 com antígenos PD-L1/CD47 humanos em OctetRED96

[273] A análise da interação dos anticorpos PD-L1-biespecíficos com antígenos PD-L1/CD47 humanos foi realizada em OctetRed 96 (Pall-ForteBio). Os biossensores AR2G foram pré- reidratados por uma hora em mQ. Após a ativação dos biossensores, PD-L1-Fc ou CD47-Fc a uma concentração de 25 pg/ml em tampão de acetato pH4 foram inespecificamente (por grupos NH2) imobilizados no biossensor. Os sensores foram então imersos em poços contendo soluções anticorpo anti-PD-L1/anti-CD47 (10 pg/ml), onde o complexo anticorpo- antígeno foi associado. Os sensores foram então imersos em uma solução tampão para uma etapa subsequente de dissociação. As curvas de ligação, após subtrair um sinal de referência, foram analisadas usando o software Octet Data Analysis (Versão 8.2) de acordo com o procedimento padrão e usando o modelo de interação 1:1.

[274] Os resultados das análises são apresentados na Tabela 4. Assim, pode-se concluir que os anticorpos têm alta afinidade, onde a afinidade com o antígeno PD-L1 em anticorpos desse formato tem valores nM, enquanto a afinidade com o antígeno CD47 tem valores sub nM. Tal ligação é considerada suficiente para que o anticorpo seja capaz de interagir com receptores em células-alvo, para testes subsequentes tanto na atividade terapêutica in vitro quanto in vivo. Tabela 4. Constantes de dissociação cinética de anticorpos biespecíficos anti-CD47/anti-PD- 1 kon(1/ , ; Respost | kD (M) kdis(1/ R k 1, M Nome do tao kD (M) | kon(1/M SE / 2 (PD- | (PD- a s) (PD- ; (CD47 |s) (CD47 Li-Fe |L1i-Fe L1-Fc candidato | (CD47 (CD47 Fc FcL) FcL) human | human human FcL) FcL) human o) o) o) o) BCD106- 1,45E- 1,43E- 1,35E- |3,24E+ |4,38E- 02-001 0,7313 9,88E+04 3,1828 09 o5 o4 BCD106- 4,59E- | 1,4100E+ | 6,424E- 1,24E- | 3,65E+ |4,52E- 0,412 R A. ? 3,0283 . ' ” BCD106- 2,90E- 4,77E- 1,21E- | 3,71E+ |4.50E-

BCD106- 3,09E- 4,93E- 1,30E- | 3,55E+ |4,61E- 02-004 0,4398 os 1,60E+05 3,0586 os os os BCD106- 1.77E- 2,70E- 1,31E- | 3,35E+ |4,40E- BCD106- 5,81E- 1,58E- 1,04E- |3,98E+ |4,14E- 02-006 1,2762 2,73E+05 2,9262 og os o4 BCD106- 5,88E- 6,62E- O,75E- |2,38E+ |4,16E 02-013 0,7682 1,13E+06 2,6744 09 os o4 PD-L1- VHH- 4,65E- 3,10E- 6,90E- | 1,17E+ |8,09E- VHH470p 0,0882 og 6,66E+04 o4 0,1621 10 o6 o4 t1 PD-L1- VHH- 3,65E- 2,93E- 7,64E- | 1,09E+ |8,36E- VHH470p 0,2332 09 8,02E+04 o4 0.175 10 o6 o4 t2 Exemplo 14. Análise das interações de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47 com receptores CD47 e PD-L1 de macaco cynomolgus em Forte Bio Octet RED 384

[275] O estudo experimental da afinidade de anticorpo com antígenos CD47/PD-L1 animal foi realizado no Forte Bio Octet RED 384. Os anticorpos com concentração de 20 ug/ml foram imobilizados nos sensores AR2G (Forte Bio) de acordo com o protocolo padrão e as instruções do fabricante. A análise foi realizada a 30ºC usando PBS compreendendo 0,1% Tween 20 e 0,1% BSA como um tampão de trabalho. Após o registro da linha de base, os sensores foram imersos em poços contendo solução de antígeno (CD47 animal e PD-L1) por 300 segundos, onde o complexo foi associado. A dissociação do complexo na solução tampão foi então detectada por 600 segundos.

[276] As curvas de ligação, após subtrair um sinal de referência, foram analisadas usando o software Octet Data Analysis (Versão 9.0) de acordo com o procedimento padrão e usando o modelo de interação global 1:1. Os anticorpos anti-CD47 se ligam especificamente ao antígeno CD47 e PD-L1 de macaco cynomolgus. Tabela 5 e Tabela 6.

Tabela 5. Valores cinéticos da interação de anticorpos contra antígeno do macaco cynomolgus (CD-47) kon ; | Nome [om Jemoro [MM [emoron fast jemoias AR o 6,32E-09 | 3,69E-11 | 1,88E+O5 | 9,64E+02| 1,18E-03 3,28E-06 BEDEDS oa 6,99E-10 | 3,99E-12 | 8,64E+O5| 3,61E+03| 6,04E-04| 2,34E-06 BEDaDS oa 3,06E-10 | 3,56E-11 | 5,31E+04 | 1,60E+02| 1,63E-05| 1,89E-O6 Tabela 6. Valores cinéticos da interação de anticorpos ao antígeno do macaco cynomolgus (PD-L1). BEDADE DA 8,75E-10 | 6,01E-12| 1,67E+06| 1,07E+04) 1,46E-03 3,55E-06 BED oa 7,27E-10 6,40E-12 | 1,73E+06 | 1,34E+04 1,26E-03 5,25E-06 BEDIDS OE 1,34E-09 1,02E-11 | 1,65E+06 | 1,19E+04 2,21E-03 5,66E-06 Exemplo 15. Análise da ligação não-específica de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti- CDA47 a um painel de antígeno no Forte Bio Octet RED 384

[277] O estudo experimental de ligação não-específica foi realizado em um painel de antígenos não-específicos marcados com his. Os biossensores anti-hlgG Fc Capture (AHC) pré- reidratados durante 10 minutos em PBS contendo 0,1% Tween-20 e 0,1% BSA como um tampão de trabalho para as medições.

[278] Os anticorpos com uma concentração de 30 ug/ml foram imobilizados nos sensores Anti-hlgG Fc Capture (AHC) (Forte Bio). A análise foi realizada a 30ºC utilizando PBS compreendendo 0,1% Tween 20 e 0,1% BSA como tampão de trabalho. Após a prescrição da linha de base na solução tampão, os sensores foram imersos nos poços com uma solução de antígenos não-específicos por 300 segundos, onde o complexo foi associado. Em seguida, a dissociação do complexo na solução tampão foi detectada por 600 segundos.

[279] As curvas de ligação (após subtrair um sinal de referência) foram analisadas usando OctetDataAnalysis (versão 9.0) de acordo com o procedimento padrão usando o modelo de interação global 1:1. Os anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47 não se ligam especificamente ao painel de antígenos. Exemplo 16. Análise da interação de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47 com um painel FcyRilla no Forte Bio Octet RED 384

[280] O estudo experimental da afinidade de anticorpo com o painel de proteínas de ligação Fc foi realizado no Forte Bio Octet RED 384 usando biossensores de estreptavidina (SAX) pré- hidratados por 30 minutos em PBS contendo 0,1% Tween-20 e 0,1% BSA.

[281] As proteínas FcyRllla-F158 e FcyRilla-V158 de ligação Fc biotiniladas marcadas com Avi, com uma concentração de 5 ug/ml em tampão cinético FSB contendo 0,1% Tween-20 e 0,1% BSA pH 7,4 foram imobilizados em sensores de estreptavidina (SAX), com fixação de tRecLoad - tempo necessário para atingir um nível de sinal de 0,4 nm. Após o registro da linha de base, os sensores foram imersos em poços contendo solução de anticorpo por 60 segundos, onde o complexo foi associado. A dissociação do complexo em solução tampão foi então detectada por 150 segundos.

[282] As curvas de ligação (após subtrair um sinal de referência) foram analisadas usando OctetDataAnalysis (versão 9.0) de acordo com o procedimento padrão usando o modelo de interação global 2:1. Os anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47 se ligam especificamente às proteínas de ligação Fc FcyRIlla-F158 e FcyRilla-V158. Tabela 7 e Tabela 8. Tabela 7. Valores cinéticos da interação de anticorpos BCD-106 (02-001, 03-006, 02-013) contra FcyRllla-F158 BCD106-02-001 | 1,61E-06 | 9,86E-07 6,27E-08 1,04E-07 1,73E+05 1,19E+04 BCD106-02-006 | 1,47E-06 1,73E-07 6,03E-08 8,40E-08 1,35E+05 1,67E+04 BCD106-02-013 | 1,30E-06 | 2,00E-06| 3,/79E-O8 1,88E-07 2,22E+05 | 1,55E+04

Tabela 8: Valores cinéticos da interação de anticorpos BCD-106 (02-001, 03-006, 02-013) contra FcyRlilla-V158 BCD106-02-001 | 9,32E-07 1,62E-07 2,86E-08 1,86E-08 2,33E+05 | 5,72E+04 BCD106-02-006 | 4,63E-06 | <1,0E-12 1,07E-06| 5,25E-07 8,58E+03 BCD106-02-013 1,83E-09 | 1,07E08| 6,10E+05 Exemplo 17. Análise da interação de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47 com um FcRn no Forte Bio Octet RED 384

[283] O estudo experimental da afinidade de anticorpo com o painel de proteínas de ligação Fc foi realizado no Forte Bio Octet RED 384 usando biossensores de estreptavidina (SAX) pré- hidratados por 30 minutos em PBS contendo 0,1% Tween-20 e 0,1% BSA.

[284] O FcRn marcado com Avi biotinilado em uma concentração de 5 pg/ml em tampão cinético PBS contendo 0,1% Tween-20 pH 6 foi imobilizado em sensores de estreptavidina (SAX), com fixação de tRecLoad - tempo necessário para atingir um nível de sinal de 0,4 nm. Após o registro da linha de base na solução tampão, os sensores foram imersos em poços contendo solução de anticorpo em tampão cinético PBS contendo 0,1% Tween-20 pH 6 por 60 segundos, onde o complexo foi associado. A dissociação do complexo no tampão cinético de PBS contendo 0,1% Tween-20 e 0,1% BSA pH 7,4 foi então detectada por 150 segundos.

[285] As curvas de ligação (após subtrair um sinal de referência) foram analisadas usando OctetDataAnalysis (versão 9.0) de acordo com o procedimento padrão usando o modelo de interação global 2:1. Os anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47 que se ligam especificamente ao FcRn. Tabela 9. Tabela 9. Valores cinéticos da interação de anticorpos BCD-106 (02-001, 03-006, 02-013) contra FcRn BCD106-02-001 | 1,61E-06 | 9,86E-07| 6,27E-08 1,73E+05 | 1,19E+04

BCD106-02-006 | 1,47E-06 1,73E-07 6,03E-08 8,40E-08 1,35E-05 1,67E-04 BCD106-02-013 | 1,30E-06 2,00E-06 3,79E-08 1,88E-07 2,22E+05 1,55E+04 Exemplo 18. Análise da capacidade dos anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47, PD- L1 para induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpo em células positivas PD- L1/CD47

[286] A fim de realizar o ADCC (citotoxicidade celular dependente de anticorpo), a linha celular MDA-MB-231 que expressam receptores PD-L1/CD47 em sua superfície e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram usadas. Obtenção de células mononucleares de sangue periférico

[287] Os PBMCs foram obtidos por fracionamento de células sanguíneas venosas de doadores saudáveis em um gradiente de densidade. Após isolamento, as células foram cultivadas no meio RPMI-1640 contendo 10% FBS em uma concentração de 2-5x10º células/ml por 18-24 horas a 37ºC e 5% CO. Preparação das células-alvo

[288] As células MDA-MB-231 foram cultivadas em meio DMEM contendo 10% FBS (soro fetal bovino) a 37ºC e 5% CO. As células foram removidas da superfície plástica usando tripsina e ressuspensas no DMEM contendo 10% FBS. A Calceína AM foi adicionado a uma concentração de 5 uM. Após 30 minutos, as células foram lavadas duas vezes a partir do excesso de Calceína AM com DMEM contendo 10% FBS. Uma suspensão das células alvo a uma concentração de 10º células/ml foi preparada no DMEM contendo 10% FBS. Preparação de diluições de anticorpos de teste

[289] Todos os anticorpos de teste foram diluídos com meio DMEM contendo 10% FBS até uma concentração de 10 ug/ml. Uma série de diluições seriais com um incremento de 5 foi preparada. As concentrações dos anticorpos de teste foram (ng/ml): 10000; 2000; 400; 80; 16; 3,2; 0,64; 0,128; 0,0256; O. Preparação do PBMC

[290] Os linfócitos mononucleares foram coletados de frascos e centrifugados sob 200xg por 5 minutos. Uma suspensão de células com uma concentração de 5x105 células/ml foi preparada em meio DMEM contendo 10% FBS. Realização do ensaio ADCC

[291] 50 ul/poço dos anticorpos de teste foram adicionados aos poços de uma placa de 96 poços. 100 ul/poço da suspensão de células alvo foram adicionados aos poços contendo os anticorpos. A placa foi incubada a 37ºC e 5% CO, por 15-20 minutos. 50 ul/poço de suspensão PBMC foram adicionados aos poços contendo os anticorpos e células-alvo. 50 ul/poço do meio DMEM contendo 10% FBS, 100 ul de suspensão de células alvo e 50 ul de suspensão PBMC foram adicionados a três poços (um controle de lise máxima, "KL"). A placa foi incubada a 37ºC e 5% CO, por 3,5-4 horas. 30 minutos antes do fim da incubação, o tampão de lise foi adicionado aos poços KL.

[292] Após a incubação, as placas foram centrifugadas sob 200xg por 10 minutos. O fluido sobrenadante foi transferido para novas placas de 96 poços. A fluorescência foi medida em unidades de fluorescência relativa em comprimento de onda de excitação/emissão de 485/538 nm usando um fluorímetro de placa.

[293] A eficácia do ADCC foi calculada pela fórmula: O valor de luminiscência na lacuna (RLU) — O valor médio K (RLU) ADCC(%) E A II go 100 Valor médio KL (RLU) — Valor médio K (RLU) Onde K - controle da lise espontânea das células alvo na presença de células efetoras (50 ul/poço do meio DMEM contendo 10% FBS + 100 ul/poço de células-alvo + 50 ul/poço de PBMC) KL - controle da lise máxima das células alvo (50 ul/poço do meio DMEM contendo 10% FBS + 100 ul/poço de células alvo + 50 ul/poço de PBMCs + tampão de lise).

[294] Os resultados são apresentados nas Fig. 9€ 10.

[295] De acordo com os dados obtidos, todos os anticorpos anti-CD47/PD-L1 mostram valores EC5O comparáveis ou superiores aos de um anticorpo anti-CD47 monoespecífico de controle (clone B6H12). Exemplo 19. Comparação da atividade de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47 contra CD47/PD-L1 em um teste sobre estimulação da fagocitose por células macrófagas humanas

[296] Afim de realizar a ADCP (Fagocitose Celular Dependente de Anticorpo), foram usadas células MDA-MB-231 com receptores PD-L1/CD47 em sua superfície, e células de macrófagos humanos foram usadas. Obtenção de macrófagos humanos

[297] As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas do sangue venoso de doadores saudáveis por separação por gradiente de densidade. Os monócitos de sangue humano foram isolados usando um kit para isolar uma fração de células humanas positivas para CD14 (Miltenyi Biotec). Os poços de uma placa de 24 poços foram usados para cultivar 350.000 monócitos/poço em 700 ul de RPMI-1640 contendo 10% FBS, 100 ng/ml de GM-CSF (Peprotech) a 37ºC e 5% CO, por 3 dias. No 4º dia de cultura, o meio foi substituído por um novo meio contendo 700 ul de RPMI-1640 contendo 10% FBS, 100 ng/ml de GM-CSF (Peprotech), 50 ng/ml de IFNy (Peprotech) e 10 ng/ml de LPS (Sigma) por poço, as células foram cultivadas a 37ºC e 5% CO, por mais 3 dias. Preparação de células-alvo

[298] As células MDA-MB-231 foram cultivadas em meio DMEM contendo 10% FBS (soro fetal bovino) a 37ºC e 5% CO. As células foram removidas da superfície plástica por tripsina, e ressuspensas em DMEM contendo 10% FBS. A Calceína AM foi adicionado em uma concentração de 5 uM. Após 30 minutos, as células foram lavadas duas vezes do excesso de Calceína AM com DMEM contendo 10% FBS. Uma suspensão de células-alvo com uma concentração de 10º células/ml foi preparada em DMEM contendo 10% FBS. Realização de ensaio ADCP

[299] O meio foi selecionado a partir de poços de placa contendo macrófagos, 500 ul de meio RPMI-1640 contendo 10% FBS e 20 ug/ml dos anticorpos de teste foram adicionados aos poços. 500 ul/poço da suspensão de células alvo foram adicionados aos poços. A placa foi incubada a 37ºC e 5% CO, por 3 horas. O meio foi então selecionado, as células foram removidas da superfície plástica pelo reagente TrypLE Express e manchadas com anticorpos anti-CD14 marcados com fluorescência. A suspensão das células manchadas foi analisada em um citofluorômetro de fluxo.

[300] A eficácia do ADCP foi calculada pela fórmula: Calceína* CD14* ADCPrficácia = EDIR 100% Onde Calceina*CD14* é o número de células CD14 positivas que contêm tingimento de calceína. CD14* é o número de todas as células CD14 positivas

[301] Os resultados são apresentados na Fig. 11.

[302] De acordo com os dados obtidos, vários anticorpos anti-CD47/PD-L1 mostram eficácia em estimular a fagocitose das linhas celulares MDA-MB-231 por macrófagos humanos, o que é comparável ao de um anticorpo anti-CD47 monoespecífico de controle (clone B6H12). Exemplo 20. Comparação da influência de candidatos a anticorpos biespecíficos anti-PD- L1/anti-CD47 na hemaglutinação de eritrócitos humanos

[303] Os eritrócitos humanos foram usados para analisar a capacidade dos anticorpos de causar hemaglutinação. Preparação da suspensão eritrócitos

[304] A amostra de sangue foi coletada da veia de um doador saudável em um tubo de heparina a vácuo. 9 ml de sangue foram transferidos para um tubo de centrífuga de 50 ml. O sangue foi diluído para 30 ml com DPBS sem Ca?** e Mg** à temperatura ambiente. A suspensão foi centrifugada sob de 800g por 10 minutos, o sobrenadante foi decantado. O procedimento de lavagem celular foi repetido duas vezes com DPBS sem Ca?** e Mg?** e centrifugação. 300 ul de pellet celular foi então ressuspensa em 30 ml de DPBS, resultando em uma suspensão de eritrócito de 1%. Realização de ensaio de hemaglutinação

[305] Os anticorpos de teste foram diluídos em DPBS para uma concentração de 20 pg/ml. 100 ul de diluições de anticorpos e suspensões de eritrócitos foram misturados em uma placa de 96 poços de fundo redondo. A placa foi incubada em uma incubadora de CO, por 16 horas a 37ºC. Os resultados foram documentados visualmente usando uma escala cruzada arbitrária de 4. O resultado significativamente positivo é de 2 cruzamentos e acima. Os resultados são apresentados na Tabela 10. Tabela 10. Reação de hemaglutinação na presença de anticorpos anti-CD47/PD-L1. "-" indica ausência de aglutinação Concentração de anticorpo, ng/ml |NdNa dd: Anticorpo Sl man s| 2) mm) o ns. .o renome cc renome = cc anti-CD47/PD-L1 BCD106-02-003 | — [Jess] |] [| anti-CD47/PD-L1 BCD106-02-004 | — [els |] [| rsrs [= === =A anti-CD47/PD-L1 BCD106-02-006 | — [eles |] [| [rage [= EmE=CE=AA [roma [| AEE=EAEAA ss FFFATAAA oo meme e

[306] De acordo com os dados obtidos, nenhum dos anticorpos anti-CD47/PD-L1 causa hemaglutinação, enquanto o anticorpo monoclonal anti-CD47 de referência (clone B6H12)

causa aglutinação significativa devido à natureza bivalente do anticorpo e, consequentemente, à capacidade de interagir com duas moléculas CD47 localizadas em diferentes eritrócitos. Exemplo 21. Análise da citotoxicidade dependente de complemento (CDC) de anticorpos biespecíficos anti-CD47/PD-L1

[307] Para a realização a análise do CDC (Citotoxicidade Dependente de Complemento), a linha celular MDA-MB-231 contendo receptores PD-L1 e CD47 em sua superfície foram usadas como células alvo. Preparação de células-alvo

[308] A cultura MDA-MB-231 foi cultivada no meio de cultura DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).

[309] As células foram removidas da superfície plástica por tripsina e suspensas em meio DMEM contendo 0,1% BSA em uma concentração de 1x105 células/ml. Preparação de diluições de anticorpos de teste

[310] Todos os anticorpos anti-CD47/PD-L1 foram diluídos com meio DMEM contendo 0,1% BSA a uma concentração de 100 ug/ml. Uma série de diluições seriais com um incremento de 8 foi preparada. As concentrações dos anticorpos de teste foram (ng/ml): 100000; 12500; 1562,5; 195,3; 24,4; 3,05; 0,38; 0,04; 0,005. Realização do teste CDC

[311] O complemento humano foi descongelado e dissolvido 1:4 no meio DMEM contendo 0,1% BSA.

[312] 50 ul/poço de cada diluição dos anticorpos de teste foram adicionados aos poços de uma placa de 96 poços, 50 ul/poço de meio suplementado com 0,1% BSA para cada amostra de anticorpos - controle celular, 150 ul/poço de meio DMEM contendo 0,1% BSA - controle médio.

[313] 50 ul/poço de uma suspensão de células MDA-MB-231 foi adicionado a cada poço contendo os anticorpos de teste e um controle celular.

[314] 50 ul/poço do complemento diluído foi derramado em todos os poços contendo os anticorpos de teste e um controle celular. A placa foi agitada por 2-4 minutos em um agitador orbital à temperatura ambiente, colocado em uma incubadora de CO, por 2-3 horas a 37ºC.

[315] 15 ul de reagente alamar blue foi adicionado aos poços da placa de teste. As placas foram agitadas por 10-20 minutos à temperatura ambiente em um agitador orbital. As placas foram incubadas em uma incubadora de CO, por 18-24 horas.

[316] As placas foram agitadas por 10-20 minutos à temperatura ambiente em um agitador orbital.

[317] A fluorescência foi medida usando unidades de fluorescência relativa em comprimento de onda de excitação/emissão de 544/590 nm, usando um fluorímetro de placa. O sinal de fluorescência obtido é proporcional ao número de células viáveis. Os resultados são apresentados nos Figs. 12-15.

[318] De acordo com os dados obtidos, os anticorpos de teste não causam citotoxicidade dependente de complemento (CDC) da linha celular MDA-MB-231. Exemplo 22. Análise da atividade antagonista de anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti- CDA47 para uma cultura de células portadoras de receptor de membrana PD-L1

[319] A fim de analisar a atividade antagonista dos anticorpos anti-PD-L1/CD47 contra o receptor PD-L1, a capacidade dos referidos anticorpos de reativar um sinal de luciferase na linha celular repórter Jurkat-PD1-NFAT-Luc durante a co-cultura com células produtoras de PD-L1 foi avaliada. Preparação de células produtoras de PD-L1

[320] A cultura MDA-MB-231 foi cultivada no meio de cultura DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).

[321] As células foram removidas da superfície plástica por tripsina e suspensas a uma concentração de 1*105 células/ml no meio DMEM contendo 10% FBS e 20 ng/ml de interferon gama. 200 ul/poço da suspensão de células foi então adicionado aos poços de uma placa branca de 96 poços e incubado por 48 horas em uma incubadora de CO, a 37ºC e 5% CO. Preparação de diluições de anticorpos de teste

[322] Todos os anticorpos anti-CD47/PD-L11 testados foram diluídos com o meio RPMI- 1640 contendo 10% FBS a uma concentração de 5 ug/ml. Uma série de diluições seriais com um incremento de 3 foi preparada. As concentrações dos anticorpos de teste foram (ng/ml): 2500; 833,3; 277,7; 92,5; 30,8; 10,2; 34; 1,1. Preparação de células Jurkat-PD1-NFAT-Luc

[323] No dia do experimento, uma suspensão das células Jurkat-PD1-NFAT-Luc a uma concentração de 2,5 * 106 células/ml no meio RPMI-1640 contendo 10% FBS foi preparada. Preparação de uma solução de ativação de anticorpos

[324] No dia do experimento, uma mistura de 10 vezes de anticorpos de ativação foi preparada (4 ug/ml de anti-CD3; 4 ug/ml de anti-CD28; 16 ug/ml de anti-camundongo no meio RPMI-1640 contendo 10% FBS). Realização de teste

[325] Omeio de crescimento foi removido de uma placa contendo células MDA-MB-231. 40 ul/poço de diluições de anticorpos foram adicionados aos poços que contêm as células. 40 ul/poço de meio RPMI 1640 contendo 10% FBS foi adicionado aos poços de controle (células sem anticorpos de teste, células sem teste e ativação de anticorpos) e incubados à temperatura ambiente por 30 minutos.

[326] 40 ul/poço de suspensão de células Jurkat-PD1-NFAT-Luc foi então adicionada a todos os poços. Em seguida, 10 ul/poço de uma solução de 10 vezes maior de anticorpos de ativação foi adicionado a todos os poços, exceto para os poços de controle "células sem teste e anticorpos de ativação". As células foram incubadas durante 6 horas em uma incubadora de CO, a 37ºC e 5% CO».

[327] O Substrate One-Glo Luciferase Assay System “Promega” de luciferase foi introduzido em todos os poços com uma proporção de 1:1 (90 ul/poço). Após 5-10 minutos, o nível de luminescência foi medido usando um leitor de placa.

[328] De acordo com os dados obtidos, os anticorpos biespecíficos anti-PD-L1/anti-CD47 de teste, bem como um anticorpo monoespecífico anti-PD-L1 de controle, são antagonistas da via de sinalização dependente do PD-L1 e, portanto, podem estimular a citotoxicidade dependente das células T em relação às células que transportam o receptor PD-L1. Exemplo 23. Análise da homogeneidade de produtos de anticorpos biespecíficos anti-PD- L1/anti-CD47

[329] Ahomogeneidade dos anticorpos biespecíficos foi analisada por HPLC de exclusão por tamanho (SEC HPLC) com detector UV. A cromatografia foi realizada em um sistema HPLC (Agilent) na coluna Tosoh TSK-Gel G3000SWXL, 7,8 mm x 30 cm, pedido nº 08541 com pré- coluna Tosoh TSKgel Guard SWXL, 6,0 mm x 4,0 cm, com diâmetro de partícula de 7 um, pedido nº 08543. A detecção foi realizada em comprimentos de onda de 220 e 280 nm. A Fig. 17 apresenta um perfil HPLC exemplar do produto BCD106-02-013, com base em VHH47Opt2 (ver Exemplo 12). De acordo com os resultados do teste, pode-se concluir que a molécula BCD106-02-013 gera um produto que é 93% homogêneo na composição de agregação de monômeros e é aplicável para testes subsequentes in vitro e in vivo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao CD47 e pD-L1, compreendendo um local de ligação a CD47 e, pelo menos, um local de ligação a PD-L1.

2. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de comprimento completo ou seu fragmento de ligação ao antígeno.

3. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inclui um ou dois locais de ligação ao PD-L 1.

4. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o local de ligação ao CD47 inibe a interação do receptor CD47 e do ligante SIRPa e/ou local de ligação ao PD-L1 inibe a interação do PD-L1 com o receptor PD-1.

5. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o local de ligação ao CD47 inclui o domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências CDR1, CDR2, CDR3, em que CDR1 é uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 1 - 4, em que CDR2 é uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 6 - 15, em que CDR3 é uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 17 - 20.

6. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o local de ligação ao CD47 inclui o domínio variável de cadeia pesada que contém as sequências CDR1, CDR2, CDR3, em que CDR1 é uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 1 - 4, em que CDR2 é uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 6 - 15, em que CDR3 é uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 17 - 20.

7. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido local de ligação ao CD47 inclui o domínio variável de cadeia pesada de acordo com a reivindicação 4, e o domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências CDR1, CDR2, CDR3, em que CDR1 é uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 22 - 34, em que CDR2 é uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 36 - 48, em que CDR3 é uma sequência que é pelo menos 80% homóloga à sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 50 - 64.

8. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que no local de ligação ao CD47 inclui o domínio variável de cadeia pesada de acordo com a reivindicação 4, e o domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências CDR1, CDR2, CDR3, em que CDR1 é uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 22 - 34, CDR2 é uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 36 - 48, CDR3 é uma sequência selecionada a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 50 - 64.

9 O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o local de ligação ao CD47 inclui o domínio variável de cadeia pesada que compreende sequências que são pelo menos 90% homólogas às sequências selecionadas a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 66 - 88, e o domínio variável de cadeia leve que compreende sequências que são pelo menos 90% homólogas às sequências selecionadas a partir do grupo de SEQ ID NOs: 89 - 106

10. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o local de ligação ao CD47 inclui o domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências selecionadas a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 66 - 88, e o domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências selecionadas a partir do seguinte grupo de SEQ ID NOs: 89 - 106.

11. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o local de ligação ao PD-L1 compreende o domínio variável de cadeia pesada que compreende as sequências que são pelo menos 80% homólogas como a seguir: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 21, e o domínio variável de cadeia leve que compreende as sequências que são pelo menos 80% homólogas como a seguir: SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 65.

12. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o local de ligação ao PD-L1 compreende o domínio variável de cadeia pesada que compreende as seguintes sequências: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16 e SEQID NO: 21, e o domínio variável de cadeia leve que compreende as seguintes sequências: SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 65.

13. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o local de ligação ao CD47 é Fab, scFv, scFab ou mono-domínios VH ou VHH isolados.

14. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o local de ligação ao PD-L1 é Fab, scFv, scFab ou mono-domínios VH ou VHH isolados.

15. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que causa citotoxicidade celular dependente de anticorpo, fagocitose mediada por macrófagos e/ou citotoxicidade mediada por células T, a proporção das células portando antígenos CD47 e/ou PD-L1 na superfície.

16. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento Fc compreende pelo menos uma mutação ou modificação que aumenta a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) em comparação com o mesmo anticorpo sem mutação ou modificação.

17. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16 caracterizado pelo fato de que é usado como medicamento para o tratamento de câncer.

18. Um ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16.

19. O ácido nucleico de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é DNA.

20. Um vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-19.

21. Um método para obter uma célula hospedeira caracterizado pelo fato de que produz o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, incluindo a transformação da célula com o vetor de acordo com a reivindicação 20.

22. Uma célula hospedeira para obter o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizada pelo fato de que compreendendo o ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-19.

23. O método para obter o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizado pelo fato de que consiste no cultivo da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 22 em meio de cultura sob condições suficientes para obter o anticorpo especificado, se necessário, seguido por isolamento e purificação do anticorpo obtido.

24. Uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizada pelo fato de que é mediado por PD-L1 e CDA47, compreendendo o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, em combinação com um ou vários excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

25. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 24 caracterizada pelo fato de que destina-se à prevenção ou tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por PD-L1 e CD47, selecionado do grupo de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), câncer cervical, câncer de origem primária desconhecida, glioblastoma, câncer de esôfago, câncer de bexiga, TNBC (câncer de mama triplo negativo), CRC (câncer colorretal), carcinoma hepatocelular, melanoma, NSCLC (câncer de pulmão de células não-pequenas), câncer de rim, câncer de ovário, MSI CRC (câncer colorretal com instabilidade de microssatélites), leucemia (leucemia aguda ou leucemia mieloblástica), linfoma, mieloma múltiplo, câncer de mama, câncer de próstata, sarcoma, carcinoma hepatocelular, linfoma de Hodgkin, leucemia linfoblástica aguda de células T e B, câncer de pulmão de células pequenas, leucemia mieloblástica aguda, linfoma não-Hodgkin de células B refratário, linfoma folicular,

linfoma de células B de zona marginal, linfoma difuso de células B grandes, câncer de pâncreas e síndrome mielodisplásica de alto risco.

26. Um método de tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por PD-L1 e CD47, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito que necessita de tal tratamento um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 24 em uma quantidade terapeuticamente efetiva.

27. O método de tratamento de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é selecionado do grupo de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), câncer cervical, câncer de origem primária desconhecida, glioblastoma, câncer de esôfago, câncer de bexiga, TNBC (câncer de mama triplo negativo), CRC (câncer colorretal), carcinoma hepatocelular, melanoma, NSCLC (câncer de pulmão de células não-pequenas), câncer de rim, câncer de ovário, MSI CRC (câncer colorretal com instabilidade de microssatélites), leucemia (leucemia aguda ou leucemia mieloblástica), linfoma, mieloma múltiplo, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer de bexiga, sarcoma, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, linfoma de Hodgkin, leucemia linfoblástica aguda de células T e B, câncer de pulmão de células pequenas, leucemia mieloblástica aguda, linfoma não-Hodgkin de células B refratário, linfoma folicular, linfoma de células B de zona marginal, linfoma difuso de células B grandes, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer de pâncreas, câncer de ovário, leucemia mieloblástica aguda e síndrome mielodisplásica de alto risco.

28. Um método caracterizado pelo fato de que inibe a atividade biológica de PD-L1 e/ou CD47 em um sujeito que necessita de tal inibição, que compreende administrar ao sujeito uma quantidade efetiva do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16.

29. O uso do anticorpo caracterizado pelo fato de que está de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 24 para tratamento de um sujeito que necessita de tal tratamento para uma doença ou distúrbio mediado por PD-L1 e CD47.

30. O uso do anticorpo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é selecionado do grupo de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC), câncer cervical, câncer de origem primária desconhecida, glioblastoma, câncer de esôfago, câncer de bexiga, TNBC (câncer de mama triplo negativo), CRC (câncer colorretal), carcinoma hepatocelular, melanoma, NSCLC (câncer de pulmão de células não pequenas), câncer de rim, câncer de ovário, MSI CRC (câncer colorretal com instabilidade de microssatélites), leucemia (leucemia aguda ou leucemia mieloblástica), linfoma, mieloma múltiplo, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer de bexiga, sarcoma, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, linfoma de Hodgkin, leucemia linfoblástica aguda de células T e B, câncer de pulmão de células pequenas, leucemia mieloblástica aguda, linfoma não-Hodgkin de células B refratário, linfoma folicular, linfoma de células B de zona marginal, linfoma difuso de células B grandes, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer de pâncreas, câncer de ovário, leucemia mieloblástica aguda e síndrome mielodisplásica de alto risco.