CN111801352A

CN111801352A - 对cd47和pd-l1特异性的抗体

Info

Publication number: CN111801352A
Application number: CN201880078338.5A
Authority: CN
Inventors: K.V.索洛维耶夫; A.B.乌里京; T.A.聂曼金; V.V.索洛维耶夫; D.V.莫罗佐夫
Original assignee: Biocard Jsc
Current assignee: Biocard Jsc; Biocad JSC
Priority date: 2017-10-03
Filing date: 2018-10-03
Publication date: 2020-10-20
Also published as: PH12020550214A1; CL2020000919A1; ZA202002047B; WO2019068302A1; AU2018345458A1; AR113342A1; MA49599A1; TW201922781A; AU2018345458A2; PE20210460A1; ECSP20024555A; EA201791961A1; EA039662B1; TWI768129B; EP3693390A4; US11840567B2; RU2020115122A; JP2023130455A; CA3078413A1; JP2020535839A

Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体地涉及抗体或其抗原结合片段及其用途。更具体地，本发明涉及与CD47和PD‑L1特异性结合的抗体。本发明还涉及编码给定抗体或其抗原结合片段的核酸，表达载体，产生抗体的方法，以及上述抗体和组合物在癌症治疗中的用途。

Description

对CD47和PD-L1特异性的抗体

发明领域

本发明涉及生物技术领域，特别是抗体或其抗原结合片段，及其用途。更具体地，本发明涉及与CD47和PD-L1特异性结合的抗体。本发明还涉及编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸，表达载体，用于获得抗体的方法，以及所述抗体和组合物在癌症治疗中的用途。

发明背景

向T细胞提供两种分开的信号是用抗原呈递细胞（APC）对其余T淋巴细胞进行的淋巴细胞活化的广泛模型。该模型完全提供了自身与非自身和免疫耐受的区分。在主要组织相容性复合物（MHC）的背景下呈递的外来抗原肽识别后，主要信号或抗原特异性信号通过T细胞受体（TCR）传递。第二信号或共刺激信号通过在抗原呈递细胞（APC）上表达的共刺激分子递送到T细胞，并且诱导T细胞刺激克隆扩增、细胞因子分泌和效应子功能。在不存在共刺激的情况下，T细胞可能变得对抗原刺激免疫，它们引起有效的免疫应答，并且这可以进一步导致对外来抗原的耗竭或抗性。

在双信号模型中，T细胞接受两种信号：正和负次级共刺激信号。这种正负信号的调节对于最大化宿主的保护性免疫应答，同时维持免疫耐受性和预防自身免疫是至关重要的。负次级信号似乎对于诱导T细胞耐受是必要的，而正信号刺激T细胞活化。尽管简单的两信号模型仍提供了关于幼稚淋巴细胞的有效解释，但免疫应答是动态过程，并且还可以提供对抗原暴露的T细胞的共刺激信号。从治疗的观点来看，共刺激的机制是感兴趣的，因为已显示操纵共刺激信号提供了增强或终止免疫应答的手段。最近，已发现T细胞功能障碍或无反应性与抑制性受体（多肽1程序性细胞死亡（PD-1））的诱导和持续表达同时发生。结果，PD-1以及通过与PD-1相互作用传递信号的其它分子例如程序性死亡配体1（PD-L1）或程序性死亡配体2（PD-L2））的治疗性靶向（是强烈感兴趣的领域。

PD-L1在多种恶性肿瘤中过表达，并且经常与预后不良相关。有趣的是，与正常组织中的T淋巴细胞和外周血T淋巴细胞形成对比，大多数肿瘤浸润性T淋巴细胞占优势地表达PD-1，指示在肿瘤反应性T细胞上的PD-1的正调节可以促成免疫应答受损。这可能是由于利用了由表达PD-L1并且与表达PD-1的T细胞相互作用的肿瘤细胞介导的PD-L1信号传导途径，伴随T细胞活化的总体减弱和免疫监视的逃避。因此，PD-L1/PD-1相互作用的抑制可以增强CD8+ T细胞介导的肿瘤杀死。

PD-1以及通过与PD-1相互作用传递信号的其它分子（例如PD-L1和PD-L2）的治疗性靶向是强烈感兴趣的领域。PD-L1信号的抑制已提出作为增加T细胞免疫性（例如抗肿瘤免疫性）用于治疗癌症和感染(包括急性和慢性感染两者)的手段。阻断PD-L1/PD-1相互作用的抑制剂尤其根据W02001014557、W02002086083、W02007005874、W02010036959、W02010077634和WO2011066389已知。然而，靶向这个途径的最佳治疗剂尚未商业化，并且这是显著的未满足的医学需求。

CD47是细胞表面糖蛋白，其与相应细胞上的SIRPα（别名SHPS-1）和SIRPγ结合。这种相互作用导致免疫细胞功能的负调节，或可以介导细胞粘附和迁移。已提议了在自身免疫性病症的治疗中使用CD47作为生物试剂（WO 1999/040940）。相比之下，关于CD47配体（例如SIRPα）用于类似治疗目的的可能用途的数据很少。一种解释是CD47的遍在表达，其可能干扰CD47结合多肽作为潜在药物的使用。由Yu等人（J Invest Dermatol，126:797-807（2006）公开的数据提示，由融合至免疫球蛋白Fc域的SIRPα的细胞外结构域组成的融合蛋白可以预防小鼠中从皮肤衍生的树突状细胞（DC）到引流淋巴结肿的迁移，并且从而（至少部分地）减弱小鼠中的接触超敏应答。DC的迁移和功能对于免疫或炎症应答很重要。在疼痛条件下，这些加剧的DC应答可以导致疾病的维持。干扰致病性DC从组织到淋巴器官的迁移是阻止驱动自身免疫性疾病或炎性疾病的恶性循环的吸引人的机会。

CD47，也称为整联蛋白相关蛋白（IAP）、卵巢癌抗原OA3、Rh相关抗原和MER6，是跨膜受体，其几次穿透膜并属于免疫球蛋白超家族。CD47的表达和/或活性已在许多疾病和病症中观察到。相应地，存在对靶向CD47的疗法的需要。另外，由于CD47在血小板上的表达，因此还需要靶向CD47的疗法（例如抗体），当施用于受试者时，所述疗法不引起显著水平的血小板耗竭、血凝、红血细胞耗竭和/或贫血。

抑制CD47和SIRPα配体之间的相互作用的已知抗体已在下述来源中进行描述：申请WO2014123580、WO2013119714、WO2015191861、WO2011143624、WO/2014/093678、WO2017053423。

还已知的是描述多特异性抗体的各种来源，例如，WO/2014/087248描述了对CD47和CD19特异性的双特异性抗体，而WO2016023001描述了对CD47和PD1特异性的双特异性抗体。然而，尚未描述特异性结合CD47和PD-L1的多特异性抗体的产生和有效使用的可能性。

与前述结合，与CD47和PD-L1有效结合的新抗体的产生是相关的。

发明概述

本发明涉及结合分子，例如涉及与CD47和PD-L1结合的抗体。此类抗体可以用于治疗CD47和PD-L1介导的疾病或病症。

在一个方面，本发明涉及单克隆抗体，其与CD47和PD-L1特异性结合，并且包含关于CD47的一个结合位点和关于PD-L1的至少一个结合位点。

在一些实施方案中，本发明的抗体是全长抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，本发明的抗体包括关于PD-L1的一个或两个结合位点。

在一些实施方案中，本发明的抗体关于CD47的结合位点抑制CD47受体与SIRPα配体之间的相互作用，和/或关于PD-L1的结合位点抑制PD-L1与PD-1受体的相互作用。

在一些实施方案中，本发明的抗体关于CD47的结合位点包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含CDR1、CDR2、CDR3序列，其中CDR1是与选自SEQ ID NO：1-4的序列至少80%同源的序列，即CDR1是选自SEQ ID NO：1-4的序列，或者选自具有1或2个取代的SEQID NO：1-4的序列，其中CDR2是与选自SEQ ID NO：6 - 15的序列至少80%同源的序列，即CDR2是选自SEQ ID NO：6 - 15的序列，或者选自具有1、2、3、4或5个取代的SEQ ID NO：6 -15的序列，其中CDR3是与选自SEQ ID NO：17 – 20的序列至少80%同源的序列，即CDR3是选自SEQ ID NO：17 – 20的序列，或者选自具有1、2或3个取代的SEQ ID NO：17 – 20的序列。

在一些实施方案中，本发明的抗体的CD47结合位点包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含CDR1、CDR2、CDR3序列，其中CDR1是选自SEQ ID NO：1 - 4的序列，其中CDR2是选自SEQ ID NO：6 - 15的序列，其中CDR3是选自SEQ ID NO：17 - 20的序列。

在一些实施方案中，本发明的抗体的CD47结合位点包含权利要求4的重链可变结构域，以及包含CDR1、CDR2、CDR3序列的轻链可变结构域，其中CDR1是与选自SEQ ID NO：22-34的序列至少80%同源的序列，即CDR1是选自SEQ ID NO：22 - 34的序列，或者选自具有1或2个取代的SEQ ID NO：22 - 34的序列，其中CDR2是与选自SEQ ID NO：36 - 48的序列至少80%同源的序列，即CDR2是选自SEQ ID NO：36 - 48的序列，或者选自具有1、2或3个取代的SEQ ID NO：36 - 48的序列，其中CDR3是与选自SEQ ID NO：50 – 64的序列至少80%同源的序列，即CDR3是SEQ ID NO：50 – 64的序列，或者选自具有1或2个取代的SEQ ID NO：50 –64的序列。

在一些实施方案中，本发明的抗体关于CD47的结合位点包括权利要求4的重链可变结构域，以及包含CDR1、CDR2、CDR3序列的轻链可变结构域，其中CDR1是选自SEQ ID NO：22 - 34的序列，CDR2是选自SEQ ID NO：36 - 48的序列，CDR3是选自SEQ ID NO：50 - 64的序列。

在一些实施方案中，本发明的抗体关于CD47的结合位点包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：66 - 88的序列至少90%同源的序列，所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：89 - 106的序列至少90%同源的序列。

在一些实施方案中，本发明的抗体关于CD47的结合位点包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO：66-88的序列，所述轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO：89 - 106的序列。

在一些实施方案中，本发明的抗体关于PD-L1的结合位点包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与下述序列至少80%同源的序列：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：21，即包含SEQ ID NO：5、16和21或者具有1个取代的SEQ IDNO：5、具有1、2或3个取代的SEQ ID NO：16、具有1、2或3个取代的SEQ ID NO：21的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与下述序列至少80%同源的序列：SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：65，即包含SEQ ID NO：35、49和65或者具有1、2或3个取代的SEQ ID NO：35、具有1个取代的SEQ ID NO：49、具有1或2个取代的SEQ ID NO：65的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的抗体针对PD-L1的结合位点包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含下述序列：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：16和SEQID NO：21，所述轻链可变结构域包含下述序列：SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：65。

在一些实施方案中，本发明的抗体针对CD47的结合位点是Fab、scFv、scFab或者分离的VH或VHH单结构域。

在一些实施方案中，本发明的抗体针对PD-L1的结合位点是Fab、scFv、scFab或者分离的VH或VHH单结构域。

在一些实施方案中，本发明的抗体的特征在于它刺激在表面上携带CD47和/或PD-L1抗原的细胞的抗体依赖性细胞毒性、巨噬细胞介导的吞噬作用和/或T细胞介导的细胞毒性、比率。

在一些实施方案中，本发明的抗体的特征在于它包括包含至少一个突变或修饰的Fc部分，与不含突变或修饰的相同抗体相比，所述突变或修饰增加了抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。

在一些实施方案中，本发明的抗体预期用作用于癌症治疗的药物。

在一个方面，本发明涉及编码任何上述抗体的核酸。

在一些实施方案中，本发明的核酸是DNA。

在一个方面，本发明涉及包含上述核酸的表达载体。

在一个方面，本发明涉及用于获得用于制备任何上述抗体的宿主细胞的方法，其包括用本发明的载体转化细胞。

在一个方面，本发明涉及用于获得任何上述抗体的宿主细胞，其含有上述核酸。

在一个方面，本发明涉及用于获得任何上述抗体的方法，其包括：在足以获得指定抗体的条件下，在培养基中培养宿主细胞，必要时，随后对所获得抗体进行分离和纯化。

在一个方面，本发明涉及用于预防或治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的药物组合物，其包含与一种或几种药学上可接受的赋形剂组合的任何上述抗体。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物预期用于预防或治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症，所述疾病或病症选自（HNSCC）头颈部鳞状细胞癌、子宫颈癌、原发灶不明癌、成胶质细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC（三阴性乳腺癌）、CRC（结肠直肠癌）、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC（非小细胞肺癌）、肾癌、卵巢癌、MSI CRC（具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌）、白血病（急性白血病或成髓细胞性白血病）、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、肉瘤、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、T细胞和B细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、急性成髓细胞性白血病、难治性非霍奇金B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胰腺癌和高危骨髓增生异常综合征。

在一个方面，本发明涉及用于治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的方法，其包括将任何上述抗体或本发明的药物组合物以治疗有效量施用于需要此类治疗的受试者。

在根据本发明的治疗方法的一些实施方案中，其中所述疾病或病症选自（HNSCC）头颈部鳞状细胞癌、子宫颈癌、原发灶不明癌、成胶质细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC（三阴性乳腺癌）、CRC（结肠直肠癌）、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC（非小细胞肺癌）、肾癌、卵巢癌、MSICRC（具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌）、白血病（急性白血病或成髓细胞性白血病）、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞和B细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、急性成髓细胞性白血病、难治性非霍奇金B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胰腺癌、卵巢癌和高危骨髓增生异常综合征。

在一个方面，本发明涉及用于抑制需要此类抑制的受试者中的PD-L1和/或CD47的生物活性的方法，其包括施用有效量的任何上述抗体。

在一个方面，本发明涉及任何上述抗体或上述药物组合物用于治疗具有由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的需要此类治疗的受试者的用途。

在根据本发明的抗体的用途的一些实施方案中，疾病或病症选自（HNSCC）头颈部鳞状细胞癌、子宫颈癌、原发灶不明癌、成胶质细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC（三阴性乳腺癌）、CRC（结肠直肠癌）、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC（非小细胞肺癌）、肾癌、卵巢癌、MSI CRC（具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌）、白血病（急性白血病或成髓细胞性白血病）、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞和B细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、急性成髓细胞性白血病、难治性非霍奇金B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胰腺癌、卵巢癌和高危骨髓增生异常综合征。

附图简述

图1. 用于在哺乳动物细胞的CHO-K1培养中瞬时产生人CD47-Fc的质粒图谱。

图2. 在制备人CD47-Fc的非还原条件下的SDS-凝胶电泳。

图3. 在制备对照抗CD47抗体B6H12产物的还原条件下的SDS-凝胶电泳。

图4. 在制备对照抗CD47抗体B6H12产物的非还原条件下的SDS-凝胶电泳。

图5. 携带与人CD47抗原特异性相互作用的VHH抗体片段的多克隆噬菌体的ELISA图解。

图6. 抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体的结构域结构的示意图，其中A基于抗CD47scFv片段，而B基于抗CD47 VHH片段。同时，PD-L1结合部分由Fab片段代表。

图7. 在基于抗CD47 scFv片段的双特异性抗体的抗PD-L1/抗CD47制备物的非还原条件下的SDS-凝胶电泳。

图8. 在基于抗CD47 VHH片段的抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体的制备物的还原条件下的SDS-凝胶电泳。

图9. 细胞毒性效应对所研究的抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体的浓度的依赖性。

图10. 细胞毒性效应对所研究的抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体的浓度的依赖性。

图11. 在抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体的存在下人巨噬细胞对MDA-MB-231细胞系的吞噬作用的功效。

图12. 荧光水平对于抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体的浓度的依赖性。

图13. 荧光水平对于抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体的浓度的依赖性。

图14. 荧光水平对于抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体的浓度的依赖性。

图15. 荧光水平对于抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体的浓度的依赖性。

图16. 抗PD-L1/CD47双特异性抗体的抗PD-L1活性。纵轴显示了针对不添加抗体的孔的发光，具有测试的aHTH-CD47/PD-L1抗体的孔的发光比。

图17. 用于评价抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体的聚集同质性的凝胶过滤概况。

发明公开内容

定义和一般方法

除非本文另有定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语具有由本领域技术人员通常理解的含义。

进一步地，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。通常，本文所述的细胞培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、有机合成化学、医学和药学化学以及蛋白质和核酸的杂交和化学的分类和方法是众所周知的，并且由本领域技术人员广泛使用。酶反应和纯化方法根据制造商的说明书，如本领域中常见地或如本文所述地执行。

与抗体有关的定义

PD-L1（程序性死亡配体1），也称为分化簇274（CD274）或B7同源物1（B7-H1），是40kDa的1型跨膜蛋白。PD-L1由如下的3个结构域组成：由Ig V型和C型结构域代表的细胞外结构域（220）、跨膜结构域（21）和细胞内结构域（31）。它在妊娠期间、在外来组织移植期间以及在某些疾病例如肝炎中压制免疫系统中起重要作用。在正常情况下，响应自身抗原，一定量的抗原特异性CD8+ T效应细胞在淋巴结和脾脏中积累，以便预防自身免疫过程，形成PD-1/PD-L1或B7-1/PD-L1复合物，导致抑制信号的传递，减少了这些CD8+ T细胞在淋巴结中的增殖。因此，PD-1/PD-L相互作用是免疫耐受的发展中的关键因素之一。

CD47是属于免疫球蛋白超家族的多次跨越跨膜受体，与巨噬细胞上的SIRPα（信号调节蛋白α）相互作用，从而压制吞噬作用。其中这种途径是活跃的癌细胞避免吞噬作用。因此，对CD47的治疗作用广泛用于各种癌症中。针对CD47抗体可以具有阻断CD47和SIRPα之间的相互作用的能力，但它们可能没有这种能力。

术语“结合分子”包括抗体和免疫球蛋白。

如本文使用的，术语“抗体”或“免疫球蛋白”或“单克隆抗体”或“双特异性抗体”或“多特异性抗体”（Ig）包括完整/全长抗体和任何抗原结合片段（即“抗原结合部分”）。此外，例如，术语“抗体”或“免疫球蛋白”或“单克隆抗体”包括具有一个或多个效价和一种或多种特异性的抗原结合片段与免疫球蛋白的恒定区的任何组合，并且可以具有与术语“双特异性抗体”或“多特异性抗体”类似的含义。此外，例如，术语“抗体”或“免疫球蛋白”或“单克隆抗体”包括抗原结合片段和免疫球蛋白恒定区的任何组合，其与任何性质的任何多肽共价或非共价结合。此外，例如，术语“抗体”指包含通过二硫键互连的至少两条重（H）链和两条轻（L）链的糖蛋白，或抗原结合部分。每条重链包含重链可变区（在本文中缩写为VH）和重链恒定区。已知的是由希腊字母表示的五种类型的哺乳动物Ig重链：α，δ，ε，γ和μ。存在的重链类型限定了抗体的种类；这些链分别在IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体中发现。不同的重链在大小和组成方面不同；α和γ含有大约450个氨基酸，而μ和ε由大约550个氨基酸组成。每条重链含有两个区域，即恒定区和可变区。恒定区在相同同种型的所有抗体中都是等同的，但在不同同种型的抗体中不同。重链γ、α和δ含有由三个恒定结构域CH1、CH2和CH3（成一条线）组成的恒定区，以及用于增加柔性的铰链区（Woof J.，Burton D.，Nat Rev Immunol 4，2004，cc.89-99）；重链μ和ε具有由四个恒定结构域CH1、CH2、CH3和CH4组成的恒定区。在哺乳动物中，已知的是由lambda（λ）和kappa（κ）表示的仅两种类型的轻链。每条轻链由轻链可变区（在本文中缩写为VL）和轻链恒定区组成。轻链的大约长度是211至217个氨基酸。优选地，轻链是kappa（κ）轻链，并且恒定结构域CL优选是C kappa（κ）。

根据本发明的“抗体”可以是任何种类（例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，优选IgG）或亚类（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，优选IgG1）。

VL和VH区可以进一步细分成称为互补决定区（CDR）的高变区，其散布在称为框架区（FR）的更保守区域之间。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按下述次序定位：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞（例如，效应细胞）和经典补体系统的第一组分（C1q）。

如本文使用的，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”（或简单地“抗体部分”或“抗体片段”）指抗体的一个或多个片段，其保留与抗原特异性结合的能力。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。包括在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括（i）Fab片段，由VL、VH、CL和CH 1结构域组成的单价片段；（ii）F(ab’)2片段，包含由在铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；（iii）由VH和CH1结构域组成的Fd片段；（iv）由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；（v）由VH/VHH结构域组成的dAb片段（Ward等人，（1989）Nature 341：544-546）；以及（vi）提取的互补决定区（CDR）。另外，Fv片段的两个区域VL和VH由不同的基因编码，它们可以使用合成接头使用重组方法进行连接，所述合成接头致使其能够接受单条蛋白质链，在所述链中VL和VH区配对以形成单价分子（称为单链Fv（scFv）；参见例如，Bird等人（1988）Science 242：423-426；和Huston等人（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883）。假定此类单链分子也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规方法获得此类抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选这些片段。

优选地，本发明的抗原结合区或整个抗体抗原结合区的CDR衍生自小鼠、美洲驼或人供体文库，或者在起源中是基本上人的，其中某些氨基酸残基被改变，例如，被不同的氨基酸残基取代，以便优化特异性抗体的特性，例如KD、koff、IC50、EC50、ED50。优选地，本发明的抗体的框架区具有人起源或基本上具有人起源（至少80、85、90、95、96、97、98或99%具有人起源）。

在其它实施方案中，本发明的抗原结合部分可以衍生自其它非人物种，包括小鼠、美洲驼、兔、大鼠或仓鼠，但不限于此。可替代地，抗原结合区可以衍生自人物种。

术语“可变结构域”指可变结构域的某些区域在抗体中在序列方面极大不同的事实。V结构域介导抗原结合，并且决定特定抗体对于其特定抗原的特异性。然而，可变性在110个氨基酸的可变结构域的位点上并非均匀分布的。相反，V区由15-30个氨基酸的称为框架区（FR）的不变片段组成，所述不变片段由称为“高变区”或CDR的极度可变性的较短区域分开。天然重链和轻链的每个可变结构域各自包含四个FR，主要采取β-折叠构型，由三个高变区连接，所述三个高变区形成连接β-折叠结构，并且在一些情况下构成β-折叠结构的部分的环。每条链中的高变区通过FR紧密结合在一起，并且与另一条链中的高变区一起，促成抗体的抗原结合位点的形成。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，而是显示出各种效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）中的抗体参与。

如本文使用的，术语“高变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区一般包含来自“互补决定区”或“ CDR”的氨基酸残基和/或来自“高变环”的那些残基。

在某些情况下，可能还期望改变一个或多个CDR氨基酸残基，以便改善与靶表位的结合亲和力。这称为“亲和力成熟”，并且可以任选地与人源化结合执行，例如在其中抗体的人源化导致减少的结合特异性或亲和力，并且不能通过单独的回复突变充分改善结合特异性或亲和力的情况下。各种亲和力成熟方法是本领域已知的，例如由Burks等人，Proc NatlAcad Sci USA，94：412–417（1997）描述的体外扫描饱和诱变方法，以及由Wu等人，ProcNatl Acad Sci USA 95：6037 6042（1998）提议的逐步体外亲和力成熟。

“框架区”（FR）是不同于CDR残基的可变结构域残基。每个可变结构域通常具有鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4的四个FR。如果CDR根据Kabat限定，则FR轻链残基大约位于残基1-23（LCFR1）、35-49（LCFR2）、57-88（LCFR3）和98-107（LCFR4）处，而重链FR残基大约位于重链中的残基1-30（HCFR1）、36-49（HCFR2）、66-94（HCFR3）和103-113（HCFR4）的区域中。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基，则FR轻链残基大约位于轻链中的残基1-25（LCFR1）、33-49（LCFR2）、53-90（LCFR3）和97-107（LCFR4）处，而重链FR残基大约位于重链残基中的残基1-25（HCFR1）、33-52（HCFR2）、56-95（HCFR3）和102-113（HCFR4）处。在一些情况下，当CDR包含来自如由Kabat定义的CDR的氨基酸和高变环的氨基酸两者时，FR残基将相应地进行调整。例如，当CDRH1包括氨基酸H26-H35时，重链FR1残基在位置1-25处，而FR2残基在位置36-49处。

“结合”靶抗原的本发明的抗体为以下抗体，其以足够的亲和力结合该抗原，使得当靶向表达抗原的蛋白质或细胞或组织时，该抗体可以用作诊断剂和/或治疗剂，并且与其它蛋白质轻微地交叉反应。根据分析方法：荧光激活细胞分选（FACS）、放射性免疫测定（RIA）或ELISA，在此类实施方案中，抗体与非靶蛋白结合的程度小于抗体与特异性靶蛋白结合的10%。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合至”特定多肽或特定多肽靶上的表位或者“对”特定多肽或特定多肽靶上的表位“特异性”，意指显著地（可测量地）不同于非特异性相互作用的结合（例如，在bH1-44或bH1-81的情况下，非特异性相互作用是与牛血清白蛋白、酪蛋白、胎牛血清或中性抗生物素蛋白的结合）。

特异性结合可以例如通过与对照分子的结合相比测定分子的结合来测量。例如，特异性结合可以通过与类似于靶的另一种分子（例如过量的未标记靶）竞争来测定。在这种情况下，如果标记的靶与探针的结合被过量的未标记靶竞争性抑制，则指示特异性结合。如本文使用的，术语“特异性结合”或“特异性结合至”特定多肽或特定多肽靶上的表位或者“对”特定多肽或特定多肽靶上的表位“特异性”，可以通过对于靶具有以下Kd的分子进行表征：至少约200 nM、或至少约150 nM、或至少约100 nM、或至少约60 nM、或至少约50 nM、或至少约40 nM、或至少约30 nM、或至少约20 nM、或至少约10 nM、或至少约8 nM、或至少约6nM、或至少约4 nM、或至少约2 nM、或至少约1 nM或更大。在一个实施方案中，术语“特异性结合”指其中分子结合特定多肽或特定多肽上的表位，而基本上不结合任何其它多肽或多肽上的表位的结合。

如本文使用的，术语“Ka”指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而术语“Kd”预期指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。

“结合亲和力”一般指分子（例如，抗体）的单个结合位点与其结合配偶体（例如，抗原）之间的累积非共价相互作用的强度。除非另有说明，否则“结合亲和力”指固有的（特征性的、真实的）结合亲和力，其反映了结合对的成员（例如抗体和抗原）之间的1：1相互作用。分子X对于其结合配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数（Kd）表示。优选地，Kd值是大约200nM、150 nM、100 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、8 nM、6 nM、4 nM、2 nM、1 nM或更小。亲和力可以通过本领域已知的常见方法(包括本文所述的方法)来测量。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原并且趋于容易解离，而高亲和力抗体一般更快地结合抗原并且趋于保持结合更久。测量结合亲和力的各种方法是本领域已知的，这些方法中的任一种均可以用于本发明的目的。

在本发明的一个实施方案中，通过表面等离振子共振测定，使用BIAcore™-2000或BIAcore®-3000（BIAcore，Inc.，Piscataway，N.J.）在25℃下以~10应答单位（RU）用固定化芯片CM5抗原来测量“Kd”或“Kd值”。简言之，根据制造商的说明书，用N-乙基-N'-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）来激活羧甲基化的右旋糖酐生物传感器芯片（CM5，BIAcore Inc.）。抗原用10 mM乙酸钠pH 4.8稀释至5 μg/ml（~0.2μM）的浓度，然后以5 μl/分钟的流速注入，以达到大约10个相对单位（RU）的结合蛋白。在抗原施用后，注入1M乙醇胺溶液以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将Fab的双倍连续稀释物（例如0.78 nM至500 nM）在25℃下以大约25 μl/分钟的流速注入具有0.05% Tween 20的PBS（PBST）中。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型（BIAcore Evaluation Software版本3.2），来计算结合速率（kon）和离开速率（koff）。平衡解离常数（Kd）计算为比率koff/kon。参见例如，Chen，Y.等人，（1999）J. Mol. Biol. 293：865-881。如果根据上文的表面等离振子共振方法，缔合速率超过10⁶ M⁻¹ s⁻¹，则它可以通过荧光猝灭进行测定，所述荧光猝灭测量在25℃下在荧光发射强度（激发 = 295 nm ；发射（辐射）= 340 nm，16 nm带）中的增加或降低。使用分光光度计测量在渐增浓度的抗原的存在下，在PBS，pH 7.2中浓度为20 nM的抗体抗原溶液（Fab形式），所述分光光度计例如停流分光光度计（Aviv Instr uments）或具有伴随搅拌的比色杯的分光光度计SLM-Aminco（Thermo Spectronic）Series 8000。

术语“koff”指结合分子和抗原的特定相互作用的解离速率常数。Koff解离速率常数可以通过生物层干涉测量法，例如使用Octet™系统进行测量。

还可以通过使用上文表面等离振子共振测定，使用BIAcore™-2000或BIAcore®-3000（BIAcore，Inc.，Piscataway，N.J.）在25℃下以~10相对单位（应答单位，RU）使用具有固定化CM5抗原的芯片，来测量根据本发明的“缔合速率”（“”结合速率”）或“kon”。简言之，根据制造商的说明书，用N-乙基-N'-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）来激活羧甲基化的右旋糖酐生物传感器芯片（CM5，BIAcore Inc.）。抗原用10 mM乙酸钠pH 4.8稀释为5 μg/ml（~0.2 μM）的浓度，然后以5 μl/分钟的流速注入，以达到大约10个相对单位（RU）的结合蛋白。在抗原施用后，注入1 M乙醇胺溶液以封闭未反应的基团。

除非另有说明，否则与本发明的多肽有关的术语“生物活性的”和“生物活性”和“生物特征”意指具有结合生物分子的能力。

表述“生物分子”指核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质及其组合。在本发明的一个实施方案中，生物分子存在于自然中。

抗体片段，例如Fab和F(ab’)2片段，可以使用常规方法，例如完整抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解，由完整抗体获得。此外，可以使用例如如本文所述的标准重组DNA方法，来获得抗体、抗体的部分和免疫粘附分子。

术语“重组抗体”预期指在包含编码抗体的核苷酸序列的细胞或细胞系中表达的抗体，其中所述核苷酸序列与细胞并非天然缔合的。

如本文使用的，术语“变体抗体”指这样的抗体，与亲本抗体的序列相比，借助于添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基，所述抗体具有的氨基酸序列不同于其“亲本”抗体的氨基酸序列。在本发明的一个优选实施方案中，与亲本抗体相比，变体抗体包含至少一个或多个（例如，一至十二，例如，二、三、四、五、六、七、八或九、十、十一或十二个；在一些实施方案中，变体抗体包含一至约十个）氨基酸的添加、缺失和/或取代。在一些实施方案中，在变体抗体的CDR中进行此类添加、缺失和/或取代。关于变体抗体的序列的同一性或同源性，在本文中定义为在比对序列，并且在必要时引入缺口，以达到序列同一性的最大百分比之后，变体抗体序列中与亲本抗体氨基酸残基等同的氨基酸残基的百分比。变体抗体保留结合亲本抗体所结合的相同抗原且优选表位的能力；并且在一些实施方案中，至少一种特性或生物活性优于亲本抗体的那些。例如，与亲本抗体相比，变体抗体可以具有例如更显著的结合亲和力、更长的半衰期、更低的IC50或增强的抑制抗原生物活性的能力。本文件中特别感兴趣的是显示的生物活性是亲本抗体的生物活性的至少2倍（优选至少5倍、10倍或20倍）的变体抗体。

术语“双特异性抗体”意指含有抗原结合结构域的抗体，所述抗原结合结构域能够与一种生物分子上的两个不同表位特异性结合或能够与两种不同生物分子上的表位特异性结合。双特异性抗体在本文中也被称为具有“双重特异性”或是“双重特异性”抗体。

在广义上，术语“嵌合抗体”指这样的抗体，其包含一种抗体的一个或多个区域以及一种或几种其它抗体的一个或多个区域，通常是部分人和部分非人抗体，即部分衍生自非人动物，例如小鼠、大鼠等害兽，或骆驼科，例如美洲驼和羊驼。嵌合抗体一般相对于非人抗体是优选的，以便减少人抗抗体免疫应答，例如在鼠抗体的情况下人抗小鼠抗体免疫应答的风险。通常的嵌合抗体的实例是其中可变区序列是鼠序列，而恒定区序列是人的抗体。在嵌合抗体的情况下，非人部分可以进一步进行修饰，以使抗体人源化。

术语“人源化”指以下事实：当抗体具有完全或部分非人起源，例如，通过分别用目的抗原免疫小鼠或美洲驼获得的小鼠或美洲驼抗体，或是基于小鼠或美洲驼的此类抗体的嵌合抗体时，有可能取代特别是在重链和轻链的框架区和恒定结构域中的某些氨基酸，以便避免或最小化在人中的免疫应答。抗体的特异性占优势地通过位于六个重链和轻链CDR中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，在CDR内的氨基酸序列在各个抗体之间比CDR之外的氨基酸序列可变得多。因为位点的CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以可以例如通过构建表达载体来表达重组抗体，所述表达载体表达标绘特异性抗体的CDR序列和另一种抗体的框架序列，所述重组抗体模拟特定天然抗体或更一般地具有给定氨基酸序列的特定抗体的特性。结果，有可能使非人抗体“人源化”，并且在很大程度上，保存初始抗体的结合特异性和亲和力。尽管不可能准确地预测特定抗体的免疫原性以及由此的人抗抗体应答，但非人抗体通常比人抗体更具免疫原性。其中外源（例如害兽或骆驼科(Camelidae)）恒定区已被人起源的序列取代的嵌合抗体，显示比完全外来起源的抗体一般更低的免疫原性，并且在治疗抗体中存在使用人源化或全人抗体的趋势。因此，可以使嵌合抗体或非人起源的其它抗体人源化，以减少人抗抗体应答的风险。

对于嵌合抗体，人源化通常涉及可变区序列的框架区的修饰。其为互补决定区（CDR）的部分的氨基酸残基最经常地不借助于人源化进行修饰，尽管在一些情况下，它可能是期望的，以便修饰CDR的各个氨基酸残基，例如以便去除糖基化位点、脱酰胺位点、天冬氨酸异构化位点或者不需要的半胱氨酸或甲硫氨酸残基。N联糖基化通过将寡糖链附着到三肽序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr中的天冬酰胺残基而发生，其中X可以是除Pro外的任何氨基酸。N-糖基化位点的去除可以通过用另一种残基突变Asn或Ser/Thr残基来实现，优选通过保守取代的方式。天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺可以取决于此类因素如pH和表面暴露而发生。天冬酰胺残基特别易受脱酰胺影响，尤其是当它们存在于Asn-Gly序列中时，而在其它二肽序列如Asn-Ala中影响程度较小。在CDR区域的序列中存在此类脱酰胺区域，例如Asn-Gly的情况下，通常可能优选通过保守替换去除所牵涉的残基之一而去除这个区域。

用于抗体序列的人源化的众多方法是本领域已知的。一种常用的方法是CDR位点移植。CDR移植可以基于Kabat CDR定义，尽管最新版本（Magdelaine-Beuzelin等人，CritRev.Oncol Hematol. 64：210 225（2007））提示IMGT®（国际ImMunoGeneTics信息系统®，www.imgt.org）的定义可以改善人源化结果（参见Lefranc等人，Dev. Comp Immunol. 27：55-77（2003））。在一些情况下，与由其获得CDR的亲本抗体相比，CDR移植可以减少CDR移植的非人抗体的结合特异性和亲和力，并且因此减少其生物活性。回复突变（其有时被称为“框架区修复”）可以用于CDR移植抗体的选择位置（通常在框架区中）中，以便恢复亲本抗体的结合特异性和亲和力。可以使用文献和抗体数据库中可获得的信息，来执行用于可能的回复突变的位置的确定。其为用于回复突变的候选物的氨基酸残基通常位于抗体分子的表面上，而通常不改变被掩埋的残基或具有较低程度的表面暴露的残基。作为CDR位点移植和回复突变的替代方案，人源化方法是表面改变，其中非人起源的非暴露的残基（remain）得到保留，而在表面上暴露的残基改变为人残基。

存在用于产生全人抗体的两种技术：使用体外收集的噬菌体文库或在体内通过免疫人源化动物（小鼠、大鼠等）。

噬菌体展示是首个且最广泛使用的体外抗体搜索技术。在1985年，Smith发现可以将外源DNA序列克隆到丝状噬菌体M13内，并且此类克隆的序列可以作为融合蛋白在噬菌体颗粒的表面上表达（Smith GP：Filamentous fusion phage：novel expression vectorsthat display cloned antigens on the virion surface. Science 1985，228：1315-1317.）。因此，有可能基于其结合其它蛋白质的能力来选择目的融合蛋白。这个发现与PCR扩增方法相组合，这使得有可能克隆免疫球蛋白基因的cDNA储库，以产生含有可变结构域的各种噬菌体文库，其可以用于快速搜索靶特异性单克隆抗体。噬菌体文库储库反映了其血液用于产生文库的每个人或每只动物的B细胞抗体储库。在1995年，两篇文章报道了表达全人抗体储库的基因改造小鼠的生产，所述全人抗体储库可以与通过杂交瘤技术产生的那些可比较（Lonberg N，Taylor LD，Harding FA，Trounstine M，Higgins KM，Schramm SR，Kuo CC，Mashayekh R，Wymore K，McCabe JG等人：Antigen-specific human antibodiesfrom mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994，368：856-859）。在这些动物中，有意破坏了其自身的内源性重链和k轻链免疫球蛋白基因，随后引入转基因，所述转基因是人重链和k轻链基因的区段。证明人基因储库可以被小鼠免疫系统用于产生针对更多种抗原的高特异性和高亲和力抗体。尽管转基因小鼠表达的B细胞受体本质上是小鼠和人组分（人免疫球蛋白、小鼠Igα、Igβ和其它信号传导分子）的杂合物，但它们的B细胞正常发育并成熟。

在某些情况下，可能还优选改变一个或多个CDR氨基酸残基，以便改善与靶表位的结合亲和力。这称为“亲和力成熟”，并且可以任选地与人源化结合执行，例如在其中抗体的人源化导致减少的结合特异性或亲和力，并且不能通过单独的回复突变充分改善结合特异性或亲和力的情况下。各种亲和力成熟方法是本领域已知的，例如由Burks等人，Proc NatlAcad Sci USA，94：412–417（1997）描述的体外扫描饱和诱变方法，以及Wu等人，Proc NatlAcad Sci USA 95：6037 6042（1998）的逐步体外亲和力成熟方法。

术语“单克隆抗体”或“mAb”指由分开的细胞克隆群体合成且分离的抗体。克隆群体可以是永生化细胞的克隆群体。在一些实施方案中，克隆群体中的永生化细胞是杂交细胞 - 杂交瘤 - 通常通过将来自免疫动物的各个B淋巴细胞与来自淋巴细胞瘤的各个细胞融合而产生。杂交瘤是一类构建细胞，并且在自然中不存在。

“天然抗体”通常是具有大约150,000道尔顿的分子量的异四聚体糖蛋白，其由两条等同的轻（L）链和两条等同的重（H）链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键合的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中变化。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一端处具有可变结构域（VH），随后为多个恒定结构域。每条轻链在一端处具有可变结构域（VL），并且在其另一端处具有恒定结构域。轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特异性氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。

在本说明书中用于描述各种抗体的术语“分离的”，指已从抗体在其中表达的细胞或细胞培养物中鉴定和分开和/或再生的抗体。来自天然环境的杂质（污染物组分）是将干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化（1）到足以通过使用旋转杯测序仪（Edman测序仪）获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或（2）到在非还原或还原条件下使用考马斯亮蓝或优选地银染色通过SDS-PAGE进行的同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为不存在多肽的天然环境的至少一种组分。分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来获得。

“分离的”核酸分子是从至少一个核酸分子-杂质中鉴定并且与之分开的核酸分子，后者在抗体核酸的天然来源中与所述杂质结合。分离的核酸分子不同于其中它在天然条件下发现的形式或集合。因此，分离的核酸分子不同于在天然条件下存在于细胞中的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括位于其中正常表达抗体的细胞中的核酸分子，例如，如果该核酸分子具有与其在天然条件下在细胞中的定位不同的染色体定位。

如本文使用的，术语“表位”指与结合分子（例如，抗体或相关分子，例如双特异性结合分子）特异性结合的抗原的一部分（决定簇）。表位决定簇通常由分子的化学活性表面分组，例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成，并且通常包含特定的三维结构特征以及比电荷特征。表位可以是“线性的”或“构象的”。在线性表位中，蛋白质（例如抗原）和相互作用分子（例如抗体）之间的所有相互作用点都沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性而存在。在构象表位中，相互作用点跨越蛋白质上的氨基酸残基而存在，所述氨基酸残基在一级氨基酸序列中彼此分开。当测定所需的抗原表位时，可以使用本领域众所周知的技术生成针对该表位的抗体。另外，抗体或其它结合分子的生成和表征可以阐明关于所需表位的信息。基于该信息，随后可以竞争性地筛选与相同或相似表位结合的结合分子，例如，通过进行竞争研究以发现竞争结合抗原的结合分子。

如本文使用的，术语“肽接头”预期意指具有连接结构域的能力的任何肽，其长度取决于它与之彼此结合的结构域，并且包含任何氨基酸序列。优选地，肽接头具有多于5个氨基酸的长度，并且由选自G、A、S、P、E、T、D、K的任何氨基酸集合组成。

术语“在体外”指在人工条件下建模的在机体外部的生物物体、生物过程或生物反应。例如，在体外生长的细胞应理解为在机体外部的环境中，例如在试管、培养小瓶或微量滴定板中生长的细胞。

术语"IC₅₀"（抑制浓度50%）指这样的药物浓度，在其下可测量的活性或应答，例如细胞如肿瘤细胞的生长/增殖被抑制50%。IC₅₀值可以使用适当的剂量应答曲线，使用用于曲线拟合的专门统计软件来计算。

术语GI 50（生长抑制50%）指在其下细胞例如肿瘤细胞的增殖被抑制50%的药物浓度。

术语"ED50"（EC50）（50%有效剂量/浓度）指产生50%生物效应（其可以包括细胞毒性）的药物浓度。

术语抗体“效应子功能”指可归于抗体的Fc区（天然Fc区序列或Fc区氨基酸变体），或随抗体同种型而变的生物活性。抗体效应子功能的实例包括：Cl_q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）；吞噬作用；细胞表面受体（例如B细胞受体，BCR）的下调和B细胞活化。

“抗体依赖性细胞毒性”或“ADCC”指细胞介导的应答，其中表达Fc受体（FcR）的非特异性细胞毒性细胞（例如天然杀伤（NK）细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞）识别靶细胞上的结合抗体，并且随后引起靶细胞的裂解。用于介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRJII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达在Ravetch和Kinet，Annu. Rev. Immunol 9：457-92（1991）的第464页上的表3中进行概括。为了评价目的分子的ADCC活性，可以执行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的那种。用于此类测定的可适用的效应细胞包括外周血单核细胞（PBMC）和天然杀伤（NK）细胞。可替代地或另外地，可以在体内，例如在动物模型如Clynes等人PNAS（USA）95：652-656（1998）公开的那种中，评价目的分子的ADCC活性。

“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。优选地，细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞（PBMC）、天然杀伤（NK）细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中PBMC和NK细胞是优选的。效应细胞可以从其天然来源分离，例如如本文所述从血液或PBMC中分离。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体（γ受体）的FcR，并且包括FcγRI、FcγRII（FcγRIIa和FcγRIIb）和FcγRIII（FcγRIIIa和FcγRIIIb）亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRI显示出对于IgG的高亲和力，而FcγRII和FcγRIII显示出低亲和力。FcγRIIa和FcγRIIIa是分别在单核细胞/巨噬细胞和单核细胞/巨噬细胞/天然杀伤细胞上表达的激活FcγR，并且能够触发人靶细胞的细胞毒性。激活受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序（ITAM）。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序（ITIM）（参见Daëron，Annu. Rev.Immunol. 15：203-234（1997）中的综述）。FcR在Ravetch和Kinet，Annu. Rev. Immunol 9：457-92（1991）中进行综述。其它FcR，包括未来待鉴定的那些，由本文中的术语“FcR”涵盖。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指分子在补体的存在下裂解靶的能力。补体激活途径通过补体系统的第一组分（C1q）与分子{例如抗体）的结合而开始，所述分子与同源抗原复合。为了评价补体激活，可以执行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol. Methods 202：163（1996）中所述的。

术语“同一性”或“同源性”应解释为意指在比对序列，并且在需要时引入缺口，以达到关于整个序列的最大同一性百分比之后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的部分，在候选序列中等同于它与之比较的相应序列的残基的氨基酸残基的百分比。N末端或C末端的延伸和插入均不应解释为减少同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是本领域众所周知的。可以使用序列分析软件（例如，Sequence Analysis SoftwarePackage，Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Ave.，Madison，WI 53705）来测量序列同一性。这个软件通过对各种取代、缺失（消除）和其它修饰分配一定程度的同源性来匹配相似的序列。

关于抗体的多肽序列的术语“同源的”应该解释为相对于多肽序列，显示出至少70%、优选80%、更优选90%且最优选95%的序列同一性的抗体。关于核酸序列的该术语应该解释为相对于核酸序列，显示出至少85%、优选90%、更优选95%且最优选97%的序列同一性的核苷酸序列。

在本公布中描述了抗体的氨基酸序列的提议修饰。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适当的核苷酸变化引入抗体核酸内，或通过肽合成，来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征。氨基酸变化还可以改变抗体中的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。

使用氨基酸取代进行抗体的氨基酸序列的修饰的变体。此类变体是用不同的残基取代抗体分子中的至少一个氨基酸残基。对于取代诱变最感兴趣的位点包括高变区或CDR，但也考虑了FR或Fc改变。保守取代显示于表A中的“优选取代”下。如果此类取代导致生物活性的改变，则可以引入另外的显著改变，在表A中称为“示例性取代”，或者在下文描述氨基酸的类别中进一步描述的改变，并且可以筛选产物。

在本说明书中可互换使用的术语“核酸”、“核酸序列（nucleic sequence）”、“核酸序列（nucleic acid sequence）”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”，意指核苷酸的精确序列，其为修饰或未修饰的，决定核酸的片段或区域，含有或不包含非天然核苷酸，并且是双链DNA或RNA、单链DNA或RNA或所述DNA的转录产物。

此处还应该包括本发明并不涉及处于其天然染色体环境中，即处于天然状态的核苷酸序列。本发明的序列已进行分离和/或纯化，即，它们直接或间接地(例如通过拷贝)进行取样，其环境已被至少部分地修饰。因此，此处还应该提到通过重组遗传学，借助于例如宿主细胞获得的分离的核酸，或通过化学合成获得的分离的核酸。

除非另有说明，否则提及核苷酸序列覆盖其互补体。因此，提及具有特定序列的核酸应该理解为涵盖具有其互补序列的互补链的核酸。

表述“控制序列”指在特定宿主生物中，对于表达功能上相关的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

当核酸置于与另一个核酸序列的功能关系内时，它是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作地连接；如果将核糖体结合位点定位以便促进翻译，则它与编码序列可操作地连接。一般地，“可操作地连接”意指连接的DNA序列是邻接的，并且在分泌前导的情况下，是邻接的并且处于阅读阶段。然而，增强子不必是邻接的。

如本文使用的，术语“载体”指能够转运它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体是质粒，即另外的DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA片。在一些实施方案中，载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。在一些实施方案中，载体能够在它们引入其内的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起源位点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。在进一步的实施方案中，载体（例如，非附加型哺乳动物载体）可以在引入宿主细胞内之后，整合到宿主细胞的基因组内，并且从而连同宿主基因一起复制。此外，某些载体能够指导它们与之可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”（或简称为“表达载体”）。

如本文使用的，术语“重组宿主细胞”（或简称为“宿主细胞”）预期指重组表达载体已引入其内的细胞。本发明涉及宿主细胞，其可以包括例如上文描述的根据本发明的载体。本发明还涉及宿主细胞，其包含例如编码本发明结合分子的第一结合结构域和/或第二结合结构域的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列、编码本发明结合分子的第一结合结构域和/或第二结合结构域的轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列或两者。应该理解，“重组宿主细胞”和“宿主细胞”预期不仅指特定的受试者细胞，而且还指此类细胞的后代。因为修饰可以由于突变或环境影响而在后续代中发生，因此，事实上，此类后代可能并不等同于亲代细胞，然而，此类细胞仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。

术语“赋形剂”在本文中用于描述不同于本发明的化合物的任何成分。

“药物组合物”指包含本发明的抗体和选自以下组的至少一种组分的组合物，所述组包括药学上可接受的和药理学上相容的填料、溶剂、稀释剂、载体、助剂、分配剂和传感剂、递送剂例如防腐剂、稳定剂、填料、崩解剂、湿润剂、乳化剂、助悬剂、增稠剂、甜味剂、调味剂、芳化剂、抗菌剂、杀真菌剂、润滑剂和延长递送控制剂，其选择和合适的比例取决于施用的类型和方式以及剂量。合适的助悬剂的实例是乙氧基化的异硬脂醇、聚氧化乙烯、山梨糖醇和山梨糖醇醚、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶以及其混合物。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来提供针对微生物作用的保护，所述抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、山梨酸和类似化合物。组合物还可以含有等渗剂，例如糖、多元醇、氯化钠等等。组合物的延长作用可以通过减慢活性成分的吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。合适的载体、溶剂、稀释剂和递送剂的实例包括水、乙醇、多元醇及其混合物、天然油（例如橄榄油）和用于注射的有机酯（例如油酸乙酯）。填料的实例是乳糖(lactose)、乳糖（milk-sugar）、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸钙等等。崩解剂和分配剂的实例是淀粉、海藻酸及其盐、硅酸盐。合适的润滑剂的实例是硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石和高分子量的聚乙二醇。单独或与另一种活性化合物组合，用于活性成分的口服、舌下、经皮、眼内、肌内、静脉内、皮下、局部或直肠施用的药物组合物，可以以标准施用形式，在具有常规药物载体的混合物中施用于人和动物。合适的标准施用形式包括口服形式，例如片剂、明胶胶囊、丸剂、粉末、颗粒、口香糖和口服溶液或悬浮液；舌下和经颊施用形式；气溶胶；植入物；局部、经皮、皮下、肌内、静脉内、鼻内或眼内形式和直肠施用形式。

“药剂” – 是以片剂、胶囊、溶液、软膏和其它现成形式的化合物（或作为药物组合物的化合物的混合物），其预期用于恢复、改善或改变人和动物中的生理功能，以及用于疾病的治疗和预防，用于诊断、麻醉、避孕、美容及其它。

术语“由CD47和PD-L1介导的疾病或病症”意指与CD47和PD-L1直接或间接相关的所有疾病或病症，包括疾病或病症的病因、发展、进展、持续或病理学。“治疗（Treat）”、“治疗（treating）”和“治疗（treatment）”指减轻或消除生物学病症和/或至少一种其伴随症状的方法。如本文使用的，“减轻”疾病、病症或疾况意指减少疾病、病症或疾况的症状的严重性和/或发生频率。进一步地，本文对“治疗”的提及包括对治愈性、姑息性和预防性治疗的提及。

在一个方面，治疗的受试者或患者是哺乳动物，优选人受试者。所述受试者可以是任何年龄的雄性或雌性。

术语“病症”意指将从用本发明化合物的治疗中受益的任何疾况。该术语的定义包括慢性和急性病症或疾病，包括促使哺乳动物倾向于这种侵犯发生的病理状况。待根据本发明治疗的优选病症是癌症。

术语“癌症”和“癌性”指生理状况或描述哺乳动物中的生理状况，其通常特征在于不受调节的细胞生长/增殖。该定义涵盖良性和恶性癌性疾病两者。癌性疾病的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌性疾病的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤和各种头颈癌。

术语“免疫应答”、“自身免疫应答”和“自身免疫炎症”指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由所述细胞或肝细胞产生的可溶性大分子（包括由于侵入病原体、由病原体感染的细胞或组织、癌细胞或者在自身免疫或病理性炎症的情况下来自人体的正常细胞或组织的选择性损害、破坏或消除而产生的抗体、细胞因子和补体）的作用。

“治疗有效量”预期指施用的治疗剂的量，所述量在某种程度上减轻所治疗病症的一种或多种症状。

术语“长期”使用指与急性（短期）施用途径相反，试剂的持续（持续）使用，以便长时间段维持初始疗效（活性）。

“间歇性”使用指非无间断地连续进行的，而是本质上是周期性的治疗。

如本文使用的，词语“包含（comprise）”、“具有（have）”、“包括（include）”或者变化例如“包含（comprises）”、“包含（comprising）”、“具有（has）”、“具有（having）”、“包括（includes）”或“包括（including）”，以及其所有语法变化应理解为暗示包括所述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。

发明详述

抗体

本发明涉及与CD47和PD-L1结合的抗体。

在本发明的一个实施方案中，该抗体是全长抗体或其抗原结合片段。

在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体包含针对PD-L1的一个或两个结合位点。

在本发明的一个实施方案中，针对CD47的结合位点抑制CD47受体和SIRPα配体的相互作用，和/或针对PD-L1的结合位点抑制PD-L1与PD-1受体的相互作用。

在一个实施方案中，本发明涉及结合CD47和PD-L1的抗体，以及针对CD47的结合位点包括重链可变区，其包含：

（a）包含与选自SEQ ID NO：1 - 4的序列至少80%或90%同源或同一的氨基酸序列的CDR1，即CDR1是选自SEQ ID NO：1 - 4的序列，或者选自具有1或2个取代的SEQ ID NO：1 -4的序列；

（b）包含与选自SEQ ID NO：6 - 15的序列至少80%、84%、86%、88%、92%或96%同源或同一的氨基酸序列的CDR2，即CDR2是SEQ ID NO：6 - 15的序列，或者选自具有1、2、3、4或5个取代的SEQ ID NO：6 - 15的序列；

（c）包含与选自SEQ ID NO：17 - 20的序列至少80%、85%、86%、90%、93%或95%同源或同一的氨基酸序列的CDR3，即CDR3是选自SEQ ID NO：17 - 20的序列，或者选自具有1、2或3个取代的SEQ ID NO：17 - 20的序列。

（d）包含与选自SEQ ID NO：1 - 4的序列同一的氨基酸序列的CDR1；

（e）包含与选自SEQ ID NO：6 - 15的序列同一的氨基酸序列的CDR2；

（f）包含与选自SEQ ID NO：17 - 20的序列同一的氨基酸序列的CDR3。

在一个实施方案中，本发明涉及结合CD47和PD-L1，并且包含针对CD47的结合位点的抗体，所述结合位点包含：

（a）重链可变区，其包括：

（i）包含与选自SEQ ID NO：1 - 4的序列至少80%或90%同源或同一的氨基酸序列的CDR1，即CDR1是选自SEQ ID NO：1 - 4的序列，或者选自具有1或2个取代的SEQ ID NO：1 -4的序列；

（ii）包含与选自SEQ ID NO：6 - 15的序列至少80%、84%、86%、88%、92%或96%同源或同一的氨基酸序列的CDR2，即CDR2是SEQ ID NO：6 - 15的序列，或者选自具有1、2、3、4或5个取代的SEQ ID NO：6 - 15的序列；

（iii）包含与选自SEQ ID NO：17 - 20的序列至少80%、85%、86%、90%、93%或95%同源或同一的氨基酸序列的CDR3，即CDR3是选自SEQ ID NO：17 - 20的序列，或者选自具有1、2或3个取代的SEQ ID NO：17 - 20的序列，和

（b）轻链可变区，其包括：

（i）包含与选自SEQ ID NO：22 - 34的序列至少80%或90%同源或同一的氨基酸序列的CDR1，即CDR1是选自SEQ ID NO：22 - 34的序列，或者选自具有1或2个取代的SEQ ID NO：22- 34的序列，

（ii）包含与选自SEQ ID NO：36 - 48的序列至少80%、87%或94%同源或同一的氨基酸序列的CDR2，即CDR2是选自SEQ ID NO：36 - 48的序列，或者选自具有1、2或3个取代的SEQ IDNO：36 - 48的序列，

（iii）包含与选自SEQ ID NO：50 - 64的序列至少80%或90%同源或同一的氨基酸序列的CDR3，即CDR3是选自SEQ ID NO：50 - 64的序列，或者选自具有1或2个取代的SEQ ID NO：50 - 64的序列。

（a）重链可变区，其包括：

（i）包含选自SEQ ID NO：1 - 4的氨基酸序列的CDR1，

（ii）包含选自SEQ ID NO：6 - 15的氨基酸序列的CDR2，

（iii）包含选自SEQ ID NO：17-20的氨基酸序列的CDR3，和

（b）轻链的可变区，其包括：

（i）包含选自SEQ ID NO：22 - 34的氨基酸序列的CDR1，

（ii）包含选自SEQ ID NO：36 - 48的氨基酸序列的CDR2，

（iii）包含选自SEQ ID NO：50 - 64的氨基酸序列的CDR3。

在一个实施方案中，本发明涉及结合CD47和PD-L1，并且包含关于CD47的结合位点的抗体，所述结合位点包含：

（a）重链可变区，其包含与选自SEQ ID NO：66 - 88的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源或同一的氨基酸序列，和

（b）轻链可变区，其包含与选自SEQ ID NO：89 - 106的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源或同一的氨基酸序列。

（a）包含选自SEQ ID NO：66 - 88的氨基酸序列的重链可变区，和

（b）包含选自SEQ ID NO：89 - 106的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明涉及结合CD47和PD-L1，并且包含关于PD-L1的结合位点的抗体，所述结合位点包含：

（a）轻链可变区，其包括：

（i）包含与SEQ ID NO：5的序列至少80%同源或同一的氨基酸序列的CDR1，即CDR1是SEQID NO：5的序列，或具有1个取代的SEQ ID NO：5的序列；

（ii）包含与SEQ ID NO：16的序列至少80%、86%或92%同源或同一的氨基酸序列的CDR2，即CDR2是SEQ ID NO：16的序列，或者具有1、2或3个取代的SEQ ID NO：16的序列；

（iii）包含与SEQ ID NO：21的序列至少80%或90%同源或同一的氨基酸序列的CDR3，即CDR3是SEQ ID NO：21的序列，或者具有1或2个取代的SEQ ID NO：21的序列，和

（b）可变区，其包括：

（i）包含与SEQ ID NO：35的序列至少80%、86%或83%同源或同一的氨基酸序列的CDR1，即CDR1是SEQ ID NO：35的序列，或者具有1、2或3个取代的SEQ ID NO：35的序列；

（ii）包含与SEQ ID NO：49的序列至少80%同源或同一的氨基酸序列的CDR2，即CDR2是SEQ ID NO：49的序列，或或具有1个取代的SEQ ID NO：49的序列；

（iii）包含与SEQ ID NO：65的序列至少80%或90%同源或同一的氨基酸序列的CDR3，即CDR3是SEQ ID NO：65的序列，或者具有1或2个取代的SEQ ID NO：65的序列。

（a）重链可变区，其包括：

（i）包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR1，

（ii）包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR2，

（iii）包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR3，和

（b）轻链可变区，其包括：

（i）包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的CDR1，

（ii）包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的CDR2，

（iii）包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的CDR3。

在一个实施方案中，本发明涉及抗体，所述抗体结合CD47和PD-L1，并且特征在于针对CD47的结合位点是Fab、scFv、scFab或者分离的VH或VHH单结构域。

在一个实施方案中，本发明涉及抗体，所述抗体结合CD47和PD-L1，并且特征在于针对PD-L1的结合位点是Fab、scFv、scFab或者分离的VH或VHH单结构域。

在一个实施方案中，本发明涉及抗体，所述抗体结合CD47和PD-L1，并且特征在于它刺激针对被CD47和/或PD-L1抗原覆盖的细胞的抗体依赖性细胞毒性、巨噬细胞介导的吞噬作用、补体依赖性细胞毒性和/或T细胞介导的细胞毒性。

在一个实施方案中，本发明涉及抗体，所述抗体结合CD47和PD-L1，并且特征在于它包含具有至少一个突变或修饰的Fc片段，与不含突变或修饰的相同抗体相比，所述突变或修饰增加了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和/或补体依赖性细胞毒性（CDC）。

核酸分子

本发明还涉及编码本文所述的本发明的抗CD47/PD-L1抗体的核酸分子和序列。在一些实施方案中，各种核酸分子编码抗CD47/PD-L1抗体的氨基酸序列的第一结构域和第二结构域。在其中第一结构域和/或第二结构域包含重链和轻链的一些实施方案中，不同的核酸编码重链和轻链氨基酸序列。在其它实施方案中，相同的核酸分子编码重链和轻链序列。在某些实施方案中，核酸分子可以编码第一结构域和第二结构域的氨基酸序列（例如，重链和轻链序列）的任何组合。在某些实施方案中，核酸分子可以编码第一结合结构域的氨基酸序列和第二结合结构域的轻链氨基酸序列，任选地包括连接其的肽接头的任何序列。除非另有说明，否则提及核苷酸序列涵盖其互补体。因此，提及具有特定序列的核酸应该理解为涵盖具有其互补序列的其互补链的核酸。如本文使用的，术语“多核苷酸”意指长度为至少10个碱基的核苷酸、或核糖核苷酸、或脱氧核糖核苷酸、或任一类型核苷酸的修饰形式的聚合形式。该术语包括单链和双链形式。

在任何上述实施方案中，核酸分子可以是分离的。

本发明的核酸分子可以从产生抗CD47/PD-L1抗体的任何来源中分离。在某些实施方案中，本发明的核酸分子可以是合成的而不是分离的。

在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以包含编码来自本发明抗体的第一结构域或第二结构域的VH结构域的核苷酸序列，其在框内连接至编码来自任何来源的重链恒定结构域的核苷酸序列。类似地，本发明的核酸分子可以包含编码来自本发明抗体的第一区域或第二区域的VL结构域的核苷酸序列，其在框内连接至编码来自任何来源的轻链恒定结构域的核苷酸序列。

在本发明的一个进一步方面，编码第一结合结构域或第二结合结构域的重（VH）和/或轻（VL）链的可变结构域的核酸分子可以在抗体基因的整个长度上进行“转换”。在一个实施方案中，借助于分别插入已经编码重链恒定（CH）或轻链恒定（CL）结构域的表达载体内，使得VH区段可操作地连接至载体内的CH区段和/或VL区段可操作地连接至载体内的CL区段，将编码VH或VL结构域的核酸分子在整个长度上转换为抗体基因。在另一个实施方案中，使用标准分子生物学技术，借助于将编码VH和/或VL结构域的核酸分子连接（例如接合）至编码CH和/或CL结构域的核酸分子，将编码VH和/或VL结构域的核酸分子在整个长度上转换成抗体基因。然后可以在它们已引入其内的细胞中表达编码全长的重链和/或轻链的核酸分子。

核酸分子可以用于表达大数量的重组抗CD47/PD-L1抗体。如本文所述，核酸分子还可以用于产生人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、免疫粘附素、双抗体、突变抗体和抗体衍生物。

载体

在另一个方面，本发明涉及适合于表达本文描述的任何核苷酸序列的载体。

本发明涉及包含核酸分子的载体，所述核酸分子编码如本文所述的抗CD47/PD-L1 抗体或其部分的任何氨基酸序列（例如，第一结合结构域的重链序列和/或第二结合结构域的重链和/或轻链序列）。本发明进一步提供了包含核酸分子的载体，所述核酸分子编码融合蛋白、修饰的抗体、抗体片段。

在另一个实施方案中，核酸分子和载体可以用于制备突变的抗CD47/PD-L1抗体。抗体可以在第一结合结构域的重链和/或轻链和/或第二结合结构域的重链和/或轻链的可变结构域中突变，例如，以改变抗体的结合特性。例如，可以在一个或多个CDR中进行突变，以增加或降低抗体的K_D、增加或降低k_off、或改变抗体关于FcRn的结合特异性。在另一个实施方案中，在与本发明的抗CD47/PD-L1抗体的第一结合结构域或第二结合结构域相对应的抗体中，与种系相比已知是改变的氨基酸残基处进行一个或多个突变。此类突变可以在可变结构域的CDR或框架区、或恒定结构域中进行。在一个优选实施方案中，在可变结构域中进行突变。在另一个实施方案中，在与本发明抗体的可变结构域的CDR或框架区中的种系相比，已知改变的氨基酸残基处进行一个或多个突变。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47/PD-L1抗体通过在表达载体中插入如上所述获得的DNA，使得基因可操作地连接至必需的表达控制序列例如转录和翻译控制序列而进行表达，所述DNA部分或完全编码第一结合结构域或第二结合结构域的序列（例如，轻链和重链序列，其中结合结构域包含轻链和重链序列）。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒（AAV）、植物病毒(例如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒)、粘粒、YAC、EBV衍生的附加体等等。可以将DNA分子连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其预期的调节DNA转录和翻译的功能。表达载体和表达控制序列可以选择为与所使用的表达宿主细胞相容。可以将部分或完全编码第一结合结构域和第二结合结构域的序列（例如，重链和轻链序列，其中结合结构域包含重链和轻链序列）的DNA分子引入各个载体内。在一个实施方案中，将所述DNA分子的任何组合引入相同的表达载体内。可以通过标准方法（例如，抗体基因片段和载体上的互补限制性位点的连接，或者如果不存在限制性位点，则平端连接），将DNA分子引入表达载体内。

合适的载体是以下载体，其编码功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列，具有经改造使得可以如上所述容易地插入且表达任何VH或VL序列的适当的限制性位点。此类载体中编码HC和LC的基因可以包含内含子序列，所述内含子序列通过稳定相应的mRNA导致增强的总抗体蛋白产率。内含子序列的侧翼为剪接供体和剪接受体位点，其决定了RNA剪接在何处发生。当使用多重内含子时，内含子序列的位置可以在抗体链的可变区或恒定区中、或者在可变区和恒定区两者中。聚腺苷酸化和转录终止可以在编码区下游的天然染色体位点处出现。重组表达载体还可以编码信号肽，其促进抗体链从宿主细胞中的分泌。可以将抗体链基因克隆到载体内，使得信号肽在框内连接至免疫球蛋白链的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽（即，来自非免疫球蛋白的信号肽）。

除抗体的链基因之外，本发明的重组载体表达还可以携带调节序列，所述调节序列控制抗体链的基因在宿主细胞中的表达。本领域技术人员将理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可以取决于此类因素如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等等。用于在哺乳动物中的表达宿主细胞的优选控制序列包括确保在哺乳动物细胞中高水平的蛋白质表达的病毒元件，例如衍生自以下的启动子和/或增强子：逆转录病毒LTR、巨细胞病毒（CMV）（例如CMV启动子/增强子）、猿猴病毒40（SV40）（例如SV40启动子/增强子）、腺病毒（例如主要晚期启动子腺病毒（AdMLP））、多瘤病毒和强哺乳动物启动子例如天然免疫球蛋白启动子或肌动蛋白启动子。关于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如，美国专利号5,168,062、4,510,245和4,968,615。用于在植物中表达结合分子例如抗体的方法，包括启动子和载体的描述以及植物的转化，是本领域已知的。参见例如美国专利号6,517,529。用于在细菌细胞或真菌细胞例如酵母细胞中表达多肽的方法也是本领域众所周知的。

除抗体链基因和调节序列之外，本发明的重组表达载体还可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列（例如复制起点）和选择标记基因。选择标记基因促进载体已引入其内的宿主细胞的选择（参见例如，美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017）。例如，通常，选择标记基因对载体已引入其内的宿主细胞赋予针对医学试剂例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。例如，选择标记基因包括二氢叶酸还原酶（DHFR）基因（用于在甲氨蝶呤选择/扩增期间在dhfr宿主细胞中使用）、neo基因（用于G418选择）和谷氨酸合成酶基因。

如本文使用的，术语“表达控制序列”预期指这样的多核苷酸序列，其是影响它们与之连接的编码序列的表达和加工所必需的。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列（即，Kozak共有序列）；增强蛋白质稳定性的序列；以及在需要时，增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质取决于宿主生物而不同；在原核生物中，此类控制序列一般包括核糖体结合位点的启动子和转录终止序列；在真核生物中，通常，此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”包括其存在对于表达和加工是必要的至少所有组分，并且还可以包括其存在是有益的另外组分，例如前导序列和融合细胞的序列。

宿主细胞

本发明的一个进一步方面涉及用于产生本发明的针对CD47和PD-L1的抗体的方法。本发明的一个实施方案涉及用于产生如本文定义的抗体的方法，其包括引入/制备能够表达抗体的重组宿主细胞，在适合于抗体表达/产生的条件下培养所述宿主细胞，并且分离获得的抗体。通过在此类重组宿主细胞中的此类表达获得的针对CD47和PD-L1的抗体在本文中被称为“重组抗体”。本发明还涉及来自此类宿主细胞的细胞后代和类似地获得的针对CD47和PD-L1的抗体。

编码本发明抗CD47/PD-L1抗体的核酸分子和包含这些核酸分子的载体可以用于转染合适的哺乳动物或其细胞，植物或其细胞，细菌或酵母宿主细胞。转化可以通过用于将多核苷酸引入宿主细胞内的任何已知技术进行。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞内的方法是本领域众所周知的，包括右旋糖酐介导的转染、阳离子聚合物-核酸复合物转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、多核苷酸包封在脂质体中以及DNA直接显微注射到核内。另外，可以通过病毒载体将核酸分子引入哺乳动物细胞内。用于转染细胞的方法是本领域众所周知的。参见例如，美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。用于转化植物细胞的方法是本领域众所周知的，包括例如农杆菌属（Agrobacterium）介导的转化、生物弹道转化、直接注射、电穿孔和病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也是本领域众所周知的。

用作用于转化的宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，并且包括多个可用的永生化细胞系。这些包括例如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、FreeStyle 293细胞（Invitrogen）、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾（BHK）细胞、非洲绿猴肾细胞（COS）、人肝细胞癌细胞（例如Hep G2）、A549细胞和许多其它细胞系。通过测定哪些细胞系具有高表达水平，并且提供产生的蛋白质的必需特征来选择细胞系。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系，例如Sf9或Sf21细胞。当将编码针对CD47和PD-L1的抗体的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，通过将宿主细胞培养一段时间来产生抗体，所述时间段足以允许抗体在宿主细胞中表达，或更优选地，抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内。可以使用标准蛋白质纯化方法，从营养培养基中分离针对CD47和PD-L1的抗体。植物宿主细胞包括例如烟草属（Nicotiana）、拟南芥属（Arabidopsis）、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括大肠杆菌和链霉菌属（Streptomyces）物种。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）。

此外，可以使用多种已知技术来增强来自生产细胞系的本发明的针对CD47和PD-L1的抗体的生产水平。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统（GS系统）是在某些条件下用于增强表达的常见方法。GS系统整体或部分与ЕР号0216846、0256055、0323997和0338841结合进行讨论。

与彼此相比，由不同细胞系或在转基因动物中表达的针对CD47和PD-L1的抗体很可能具有不同的糖基化谱。然而，由本文所述的核酸分子编码或包含本文提供的氨基酸序列的所有针对CD47和PD-L1的抗体都是本发明的部分，而不论与结合分子的糖基化，并且一般而言，不论与翻译后修饰的存在或不存在。

抗体的制备

本发明还涉及用于产生针对CD47和PD-L1的抗体及其抗原结合片段的方法和过程。

单克隆抗体

可以使用首先由Kohler等人Nature 256,1975，第495页描述的杂交瘤方法，或可以使用重组DNA方法（US 4816567）来制备单克隆抗体。

当使用基于杂交瘤的方法时，根据上述方法免疫小鼠或其它合适的宿主动物，例如仓鼠，以便引起产生或可以产生抗体的淋巴细胞的形成，所述抗体能够与用于免疫的蛋白质特异性结合。根据另一个实施方案，可以通过体外免疫产生淋巴细胞。在免疫后，使用合适的融合剂例如聚乙二醇，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合，以产生杂交瘤细胞。

将如此获得的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种且生长，所述培养基优选含有一种或多种物质，其抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活。例如，如果亲代骨髓瘤细胞不含有酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT或HPRT），则用于杂交瘤的培养基通常应该包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷（HAT培养基），即抑制HGPRT缺陷细胞的生长的物质。

优选的骨髓瘤细胞系是小鼠骨髓瘤系，例如基于鼠肿瘤细胞系MORS-21和MPC-11(其可以得自Salk Institite Cell Disrtibution Center，San Diego，pc. California，USA)以及系SP-2或X63-Ag8-653(其可以得自美国典型培养物保藏中心（American TypeCulture Collection），Rockville，ea. Maryland，USA)的那些。还已描述了用于产生单克隆抗体的人小鼠骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系的使用（Kozbor，J. Immunol.，133，1984，第3001页）。

优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合测定，例如放射性免疫测定（RIA）或酶联免疫吸附测定（ELISA），来测定由杂交瘤细胞获得的单克隆抗体的结合特异性。

单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过在Munson等人，Anal. Biochem.，107：220（1980）中描述的斯卡查德分析（Scatchard analysis）来测定。

在鉴定了产生所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，克隆就可以使用有限稀释方法进行亚克隆，并且通过标准方法生长。用于这个目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水肿瘤在体内生长，例如通过将细胞腹膜内（i.p.）注射到小鼠内。

可以通过常规抗体纯化技术，例如亲和层析（例如，使用蛋白A-或蛋白G-Sepharose）或离子交换层析、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析等，将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清分开。

编码单克隆抗体的DNA使用常规程序（例如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针）容易地分离且测序。杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。一旦分离，可以将DNA置于表达载体内，然后将所述表达载体转染到宿主细胞内，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成，所述宿主细胞例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞或骨髓瘤细胞，所述细胞在没有转染的情况下不产生抗体蛋白。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的文章综述。

在一个进一步实施方案中，可以从使用McCafferty等人，Nature，348：552-554（1990）中描述的技术生成的抗体噬菌体文库分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等人，Nature，352：624-628（1991），以及Marks等人，J. Mol. Biol.，222：581-597（1991），分别描述了使用噬菌体文库进行的鼠和人抗体分离。后续出版物描述了通过链改组（Marks等人，Bio/Technology，10：779-783（1992））以及组合感染和体内重组作为用于构建非常大型的噬菌体文库的策略（Waterhouse等人，Nucl. Acids. Res. 21：2265-2266（1993）进行的高亲和力（nM范围）人抗体的产生。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的常规单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。

例如通过用重链和轻链（CH和CL）恒定区序列取代同源鼠序列（US 4816567和Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA：81：6851（1984）），或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽（异源多肽）的全部或部分编码序列共价连接，可以修饰编码抗体的DNA，例如以便产生嵌合或融合抗体多肽。非免疫球蛋白多肽序列可以取代抗体的恒定区，或者它们可以取代抗体的抗原结合中心的可变结构域，以产生包含对于抗原具有特异性的一个抗原结合位点以及对于不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点的嵌合二价抗体。

人源化抗体

用于产生“人源化”非人动物抗体的方法是本领域众所周知的。优选地，人源化抗体具有从非人的来源引入其内的一个或多个整合的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常被称为“输入”残基，因为它们通常取自“输入”可变区。可以通过用人抗体的相应序列替换高变区序列，基本上遵循Winter和合著者的方法（Jones等人，Nature，321：522-525（1986））来执行人源化。相应地，此类“人源化”抗体是嵌合抗体（US 4816567），其中基本上小于完整人可变区的区域已被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿类动物抗体中的类似区域的残基取代。

当抗体预期用于人的治疗用途时，待用于产生人源化抗体的人可变区（轻和重两者）的选择，对于减少抗原性和HAMA应答（人抗小鼠抗体）是非常重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿类动物抗体的可变区的序列。鉴定最接近于啮齿类动物的V结构域序列的人V结构域序列，并且选择在其内的人框架区（FR），其适用于人源化抗体中（Sims等人，J. Immunol. 151：2296（1993））。在另一种方法中，使用得自所有人抗体的轻链或重链的某些亚组的共有序列的特定框架区。相同框架可以用于几种不同的人源化抗体（Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA：89：4285（1992））。

人源化的抗体保留对于抗原的高结合亲和力和其它重要的生物学特性也很重要。为此，根据优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的概念性三维模型分析亲本序列和各种人源化产物，来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可获得的，并且是本领域技术人员所熟悉的。计算机程序是可获得的，其说明并展示了所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。这些图像的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合抗原的能力的残基。以这种方式，可以选择FR残基，并且与受体和输入序列组合，以获得所需的抗体特征，例如对于靶抗原的亲和力增加。一般而言，高变区残基直接且最基本地涉及影响抗原结合。

人源化抗体可以是抗体片段，例如Fab，其任选地与一种或多种细胞毒性剂缀合，以生成免疫缀合物。可替代地，人源化抗体可以是全长抗体，例如全长IgG1抗体。

基于噬菌体展示文库的人抗体和方法

作为人源化的替代方案，可以生成人抗体。例如，目前有可能产生转基因动物（例如小鼠），其能够在免疫后产生全范围的人抗体，而无内源性免疫球蛋白产生。例如，已描述了在嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链连接区（JH）基因的纯合性缺失导致内源抗体产生的完全抑制。人种系免疫球蛋白基因阵列转移到此类种系突变小鼠内导致在抗原攻击后人抗体的产生（US 5545806、5569825、5591669（全部为GenPharm的）；5545807；和WO 97/17852）。

可替代地，噬菌体展示技术（McCafferty等人，Nature，348：552-554（1990）），可以用于从来自免疫供体机体的免疫球蛋白可变（V）区基因储库，在体外产生人抗体和抗体片段。根据这种技术，抗体V区基因与丝状噬菌体（例如M13或fd）的主要或次要外壳蛋白基因一起在框内克隆，并且在噬菌体颗粒的表面上作为功能性抗体片段展示。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能特性的选择也导致选择编码显示出所述特性的抗体的基因，因此，噬菌体模拟一些B细胞特性。噬菌体展示可以以各种形式执行。V基因区段的几个来源可以用于噬菌体展示。Clackson等人，Nature，352：624-628（1991）从衍生自免疫小鼠的脾的V基因的小型随机组合文库中，分离了抗噁唑酮抗体的各种阵列。可以构建来自未免疫的人供体的V基因储库，并且可以基本上遵循由Marks等人，J.Mol. Biol. 222：581-597（1991）描述的技术，分离针对抗原（包括自身抗原）的不同阵列的抗体。

如上所述，人抗体也可以由体外活化的B细胞生成（参见US 5567610和5229275）。

抗体片段

在某些情况下，可建议使用抗体片段而不是完整抗体。片段的小尺寸促成其快速清除，并且可以促成更好地穿透到致密肿瘤内。

已开发了用于产生抗体片段的各种技术。常规地，这些片段经由完整抗体的蛋白水解消化而衍生。然而，这些片段目前可以直接由重组宿主细胞获得。Fab、Fv和ScFv抗体片段可以在大肠杆菌中表达且由其分泌，因此允许促进大量这些片段的产生。可以从上文描述的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。根据另一个实施方案，Fab'-SH片段可以直接从大肠杆菌中分离，并且化学偶联以形成F(ab’)₂片段（Carter等人，Bio/Technology 10：163-167（1992）。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab’)₂片段。在US5869046中描述了具有增加的体内半衰期、保留表位结合受体残基的Fab和F(ab’)₂。用于获得抗体片段的其它技术对于本领域技术人员应该是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段（scFv）（参见WO 93/16185；US 5571894和US 5587458）。Fv和scFv是具有完整结合位点的唯一种类，其缺乏恒定区；结果，它们适合于在体内使用过程中减少非特异性结合。携带scFv的融合蛋白可以设计为在scFv的N末端或C末端处产生效应蛋白的融合。抗体片段也可以是例如如U.S. 5641870中所述的“线性抗体”。此类线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。

多特异性抗体

多特异性抗体是对于至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。例如，双特异性抗体可以结合蛋白质的两个不同表位。其它多特异性抗体可以组合关于CD47和PD-L1的结合位点与关于另一种蛋白质的结合位点。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段（例如，双特异性抗体的F(ab’)₂片段）获得。

用于产生多特异性抗体的方法是本领域已知的。例如，全长双特异性抗体的常规生产基于两条免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤（四源杂交瘤）产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析在几个步骤中完成的正确分子的纯化是相当麻烦的，并且产物产率很低。WO 93/08829中描述了类似的方法。

根据不同的方法，将具有所需结合特异性的抗体可变结构域（结合的抗原结合位点）与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选地，融合用Ig重链恒定区进行，所述Ig重链恒定区包括铰链、C_H2和C_H3区的至少一部分。优选地，在至少一个融合物中存在含有对于轻链结合所必要的位点的第一重链恒定区（C_H1）。将编码免疫球蛋白重链融合物和（需要时）免疫球蛋白轻链的DNA插入各种表达载体内，并且共转染到合适的宿主细胞内。当在构建中使用三条多肽链的不相等比率以提供最佳产率时，在实施方案中，这在选择三个多肽片段的相互比例方面提供了更大的灵活性。然而，当至少两条多肽链以相等比率的表达导致高产率时，或者当比率没有明显影响时，有可能将编码序列插入单个表达载体中的两条或全部三条多肽链内。

在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体是在第一臂中提供第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链以及在第二臂中的杂合免疫球蛋白重链/轻链对（提供第二结合特异性）。已发现这种不对称结构促进了所需的双特异性分子与不需要的免疫球蛋白链组合的分开，因为免疫球蛋白轻链在双特异性分子的仅一半中的存在促进分开。这种方法公开于WO 94/04690中。有关产生双特异性抗体的更多细节，参见例如Suresh等人，Methodsin Enzymology 121：210（1986）。

根据US 5731168中描述的另一种方法，一对抗体分子之间的界面可以构建为最大化得自重组细胞培养物的异二聚体的百分比。优选的界面包含C_H3区的至少一部分。根据这种方法，将具有来自第一抗体分子的界面的侧链的一个或多个小氨基酸替换为较大的侧链（例如，酪氨酸或色氨酸）。通过将含有大侧链的氨基酸替换为含有较小侧链的氨基酸（例如丙氨酸或苏氨酸），在第二抗体分子的界面上产生了与大侧链等同或相似大小的补偿“腔”。与其它不需要的终产物相比，这提供了用于增加异二聚体产率的机制。

双特异性抗体包括交联的或“异源缀合物”抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶联，而另一种与生物素偶联。此类抗体可以例如用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞（US 4676980），以及用于治疗HIV感染（WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089）。异源缀合物抗体可以使用任何方便的交联方法制备。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同各种交联技术一起公开于US 4676980中。

从抗体片段获得双特异性抗体的技术也已在文献中描述。例如，可以通过化学结合来获得双特异性抗体。Brennan等人，Science 229：81（1985）已描述了一种程序，根据其将完整抗体蛋白水解切割，以产生F(ab’)₂。这些片段在二硫醇络合剂（如亚砷酸钠）的存在下被还原，以稳定邻位二硫醇并且防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab'片段转换为硫代硝基苯甲酸酯（TNB）衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将一种Fab'-TNB衍生物再转换为Fab'-硫醇，并且与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以获得双特异性抗体。产生的双特异性抗体可以用作用于选择性固定酶的试剂。

最近的进展已促进了从大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段，可以将所述片段化学偶联，以产生双特异性抗体。Shalaby等人，J. Exp. Med. 175：217-225（1992）描述了完全人源化的双特异性抗体分子的F(ab’)₂的产生。每个Fab'分别由大肠杆菌分泌，并且在体外经受直接化学偶联，以形成双特异性抗体。因此获得的双特异性抗体能够与过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶的裂解活性。

用于直接从重组细胞培养物获得且分离双特异性抗体片段的各种技术也已得到描述。例如，已使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体（Kostelny等人，J. Immunol. 148（5）：1547-1553（1992）。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'连接。将抗体同二聚体在铰链区处还原以形成单体，然后再氧化以获得抗体异二聚体。这种方法也可以用于获得同二聚体抗体。由Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90：6444-6448（1993）描述的“双重抗体”技术是用于产生双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头与VL区连接的VH区，所述接头太短而不允许相同链上的两个结构域之间的配对。相应地，一个片段的VH和VL区应该与另一个片段的互补VL和VH区配对，从而形成两个抗原结合位点。使用单链（Fv）-（sFv）二聚体产生双特异性抗体片段的另一种策略也已得到描述（参见Gruber等人，J. Immunol.，152：5368（1994））。

本发明还提供了具有多于两个效价的抗体。例如，可以产生三特异性抗体。

多价抗体

多价抗体可以比二价抗体更快速地被细胞内化（和/或分解代谢），所述细胞表达抗体与之结合的抗原。本发明的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体（除IgM类别外）（例如四价抗体），其可以通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而容易地获得。多价抗体可以包含二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚结构域包含Fc片段或铰链区（或由其组成）。在此类情况下，该抗体将包含Fc片段和在该Fc片段的N末端处的三个或更多个抗原结合位点。本文优选的多价抗体包含3至约8个，但优选4个抗原结合位点（或由其组成）。多价抗体包含至少一条多肽链（且优选两条多肽链），其中所述多肽链包含两个或更多个可变区。例如，所述多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1指第一可变区，VD2指第二可变区，Fc指Fc片段的一条多肽链，X1和X2指氨基酸或多肽，并且n为0或1。例如，多肽链可以包含下述链：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc片段；或VH-CH1-VH-CH1-Fc片段。在本文中的多价抗体优选进一步包含至少2个（且优选4个）轻链可变区多肽。在本文中的多价抗体可以例如包含约2至约8个轻链可变区多肽。在本发明的上下文中，轻链可变区多肽包含轻链可变区，并且任选地进一步包含CL区。

药物组合物

在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含CD47/PD-L1特异性抗体作为活性成分（或作为唯一的活性成分）。如本文所述，药物组合物可以包括对于CD47和PD-L1特异性的至少一种抗体和/或靶向一种或多种相应表面受体的一种或多种另外的结合分子（例如，抗体）。在一些实施方案中，该组合物预期改善、预防或治疗由IgG介导的病症。

“药物组合物”意指组合物，其包含本发明的抗CD47/PD-L1抗体以及至少一种选自药学上可接受的和药理学上相容的赋形剂的组分，所述药学上可接受的和药理学上相容的赋形剂例如填料、溶剂、稀释剂、载体、助剂、分配剂、递送剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、助悬剂、增稠剂、延长递送控制剂，其选择和比例取决于施用的类型和途径以及剂量。本发明的药物组合物及其制备方法对于本领域技术人员无疑是显而易见的。药物组合物应该优选遵照GMP（良好生产规范）要求进行制造。该组合物可以包括缓冲剂组合物、张度剂、稳定剂和增溶剂。组合物的延长作用可以通过减慢活性药物成分的吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。合适的载体、溶剂、稀释剂和递送剂的实例包括水、乙醇、多元醇及其混合物、油和用于注射的有机酯。

“药剂（药物）”是呈片剂、胶囊、粉末、冻干制剂、注射剂、输注剂、软膏和其它现成形式的形式的物质或作为药物组合物的物质的混合物，其预期用于恢复、改善或改变人和动物中的生理功能，以及用于疾病的治疗和预防，用于诊断、麻醉、避孕、美容及其它。本领域认可的用于施用肽、蛋白质或抗体的任何方法都可以适当地用于本发明的抗CD47/PD-L1抗体。

术语“药学上可接受的”指适合于在哺乳动物，优选人中施用的一种或多种相容的液体或固体组分。

术语“赋形剂”在本文中用于描述除本发明的上述成分外的任何成分。这些是无机或有机性质的物质，其用于药物制造中，以便给予药物产品必要的物理化学特性。

如本文使用的，“缓冲液”、“缓冲液组合物”、“缓冲剂”指这样的溶液，其能够通过其酸碱共轭组分的作用而抵抗pH中的变化，并且允许抗CD47/PD-L1抗体药物抵抗pH中的变化。一般地，药物组合物优选具有在4.0至8.0范围内的pH。所使用的缓冲液的实例包括但不限于乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐等缓冲溶液。

如本文使用的，术语“张度剂（tonic agent）”、“渗透物”或“渗透剂”指可以增加液体抗体制剂的渗透压的赋形剂。“等渗”药物是具有与人血相当的渗透压的药物。等渗药物通常具有约250至350 mOsm/kg的渗透压。使用的等渗剂包括但不限于多元醇、糖和蔗糖、氨基酸、金属盐例如氯化钠等。

“稳定剂”指提供活性剂的物理和/或化学稳定性的赋形剂或者两种或更多种赋形剂的混合物。稳定剂包括氨基酸，例如但不限于精氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸；表面活性剂，例如但不限于聚山梨醇酯20（商品名称：Tween 20）、聚山梨醇酯80（商品名称：Tween 80）、聚乙二醇-聚丙二醇及其共聚物（商品名称：泊洛沙姆、Pluronic）、十二烷基硫酸钠（SDS）；抗氧化剂，例如但不限于甲硫氨酸、乙酰半胱氨酸、抗坏血酸、单硫代甘油、亚硫酸盐等；螯合剂例如但不限于乙二胺四乙酸（EDTA）、二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）、柠檬酸钠等。

如果在贮存温度例如2–8℃下，在指定的贮存期限过程中，活性剂保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性，则药物组合物是“稳定的”。优选地，活性剂保留物理和化学稳定性两者以及生物活性。基于在加速或天然老化条件下的稳定性测试结果来调整贮存期限。

本发明的药物组合物可以以现成制剂形式的单一单位剂量或多个单一单位剂量的形式制造、包装或广泛销售。如本文使用的，术语“单一单位剂量”指离散数量的含有预定数量的活性成分的药物组合物。活性成分的量通常等于待施用于受试者的活性成分的剂量，或此类剂量的方便部分，例如该剂量的一半或三分之一。

根据本发明的药物组合物通常适合于作为无菌制剂肠胃外施用，其预期借助于注射、输注和植入绕过胃肠道，通过皮肤和粘膜屏障中的破裂而在人体中施用。例如，肠胃外施用尤其包括皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、滑膜内、经皮注射或输注；和肾透析输注技术。还提供了区域灌注。优选的实施方案包括静脉内和皮下途径。本领域认可的用于施用肽或蛋白质的任何方法都可以适当地用于本发明的抗CD47/PD-L1抗体。

可注射制剂可以以单位剂型（而无限制）制造、包装或销售，例如在安瓿瓶、小瓶、塑料容器、预填充注射器、自动注射装置中。用于肠胃外施用的制剂尤其包括悬浮液、溶液、在油性或水性基质中的乳剂、糊剂等等。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于肠胃外施用的组合物，其包含以干燥（即粉末或颗粒）形式提供以在施用前用合适的基质（例如无菌无热原水）重构的药物组合物。此类制剂可以通过例如冻干过程来获得，所述冻干过程在本领域中称为冷冻干燥，并且涉及将产物冷冻，随后为从冷冻材料中去除溶剂。

本发明的针对CD47和PD-L1的抗体还可以单独或作为具有合适的药学上可接受的赋形剂的混合物从吸入器（例如加压气溶胶容器、泵、喷射器、喷雾器或雾化器）(其中使用或不使用合适的推进剂)，或者作为滴鼻剂或喷雾剂，鼻内施用或通过吸入施用。

用于肠胃外施用的剂型可以配制为立即释放或修饰释放。修饰释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、受控释放、靶向释放和程序释放。

本发明的抗CD47/PD-L1抗体的治疗用途

在一个方面，本发明的抗CD47/PD-L1抗体用于治疗由CD47和PD-L1介导的病症，例如选自以下的疾病或病症：（HNSCC）头颈部鳞状细胞癌、子宫颈癌、原发灶不明癌、成胶质细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC（三阴性乳腺癌）、CRC（结肠直肠癌）、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC（非小细胞肺癌）、肾癌、卵巢癌、霍奇金淋巴瘤、MSI CRC（具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌）、白血病（急性白血病或成髓细胞性白血病）、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征。

在一个方面，治疗受试者或患者是哺乳动物，优选人受试者。上述受试者可以是雄性或雌性，并且可以具有任何年龄。

在肿瘤（例如癌症）的情况下，治疗有效量的抗体或其片段（例如与CD47和PD-L1特异性结合的抗体或其片段）可以减少癌细胞的数量；减少初始肿瘤的大小；抑制（即，在一定程度上减慢并优选停止）癌细胞浸润到周围器官内；抑制（即，在一定程度上减慢并优选停止）肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与病症相关的一种或多种症状。抗体或其片段可以在一定程度上阻止生长和/或杀死现有的癌细胞，它可以是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，例如，可以通过评价总体存活（OS）、至肿瘤进展的时间（TTP）、对治疗的总体肿瘤应答率（ORR）、应答持续时间（DR）和/或生活质量来测量体内功效。

如本文使用的，提及抗CD47/PD-L1抗体和一种或多种不同治疗剂的术语“共施用”、“共施用的”和“与……组合”预期意指下述、提及下述或包括下述：

1）当此类组分一起配制成单一剂型时，本发明的抗CD47/PD-L1抗体和治疗剂的此类组合同时施用于需要治疗的患者，所述单一剂型在基本上相同的时间将所述组分释放给所述患者，

2）当此类组分以不同的剂型分开配制时，本发明的抗CD47/PD-L1抗体和治疗剂的此类组合基本上同时施用于需要治疗的患者，所述不同的剂型的引入在几乎相同的时间对所示患者发生，这之后这些组分几乎同时释放给指定患者，

3）当此类组分彼此分开配制成分开的剂型时，本发明的抗CD47/PD-L1抗体和治疗剂的此类组合序贯施用于需要治疗的患者，所述分开的剂型在连续的时间由所述患者服用，其中在每次施用之间具有显著的时间间隔，于是所述组分在基本上不同的时间释放给所述患者；和

4）当此类组分一起配制成单一剂型时，根据本发明的针对CD47和PD-L1的抗体和治疗剂的此类组合序贯施用于需要治疗的患者，所述单一剂型以受控方式释放所述组分，于是它们在相同和/或不同的时间同时、连续或联合释放给所述患者，其中每个部分可以通过相同或不同途径施用。

本发明的抗CD47/PD-L1抗体可以在无需进一步治疗性治疗的情况下进行施用，即作为独立疗法。此外，通过本发明的抗体进行的治疗可以包括至少一种另外的治疗性治疗（组合疗法）。在本发明的一些实施方案中，抗CD47/PD-L1抗体可以与不同的癌症药剂/药物组合进行施用或者与不同的癌症药剂/药物一起配制。

如本文使用的，术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。预期该术语包括放射性同位素（例如，At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素）、化学治疗剂和毒素，例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体。

“化学治疗剂”是可用于癌症治疗中的化学化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺（CYTOXAN^®）；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯并多巴、卡波醌、美妥替哌（meturedopa）和脲多巴（uredopa）；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；乙酸原化合物（acetogenin）（例如，布拉他辛和布拉他辛酮）；β-拉帕酮；拉帕醇；秋水仙碱；白桦脂酸；喜树碱（包括合成类似物拓扑替康（HYCAMTIN^®）、CPT-11（伊立替康、CAMPTOSAR^®）、乙酰喜树碱、东茛菪素（scopolectin）和9-氨基喜树碱）；苔藓抑素；海绵多聚乙酰(callystatin)；CC-1065（包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物）；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；念珠藻素（例如念珠藻素1和念珠藻素8）；多拉司他汀；多卡米星（包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素（eleutherobin）；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氯乙胺、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫斯汀、尼莫斯汀和雷莫斯汀；抗生素，例如烯二炔抗生素（例如加利车霉素，例如加利车霉素γ II和加利车霉素ω II（参见例如，Agnew，Chem. Intl. Ed.Engl.，33: 183-186（1994））；达内霉素，包括达内霉素A；埃波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团）、阿克拉霉素、放线菌素D、氨茴霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星（包括ADRIAMYCIN^®吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯代-多柔比星、多柔比星HCl脂质体注射剂（DOXOL^®）、多柔比星脂质体TLC D-99（MYOCETCA^®）和聚乙二醇化（peglylated）多柔比星脂质体（CAELYX^®）和脱氧多柔比星）、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素（potfiromycin）、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤、吉西他滨（GEMZAR^®）、替加氟（UFTORAL^®）、卡培他滨（XELODA^®）、埃博霉素和5-氟尿嘧啶（5-FU）；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟鸟苷、依诺他滨、氟尿苷；抗肾上腺素，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸（frolinic acid）；乙酰葡醛酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；倍曲布西(bestrabucil)；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK^®多糖复合物（JHSNatural Products，Eugene，OR）；雷佐生；根霉素；西索菲兰；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯（例如T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇形菌素）；尿烷；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷（"Ara-C"）；噻替哌；类紫杉烷，例如紫杉醇（TAXOL^®）、白蛋白改造的紫杉醇纳米颗粒制剂（ABRAXANE^®）和多西他赛（TAXOTERE^®）；苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂试剂，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花素，其防止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱（VELBAN^®）、长春新碱（ONCOVIN^®）、长春地辛（ELDISINE^®）、FILDESIN^®）和长春瑞滨（NAVELBINE^®）；依托泊苷（VP16）；异环磷酰胺；米托蒽醌；甲酰四氢叶酸；诺肖林；依达曲沙；道诺霉素；甲氨蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸（DMFO）；类视黄醇，例如视黄酸，包括贝沙罗汀（TARGRETIN^®）；双膦酸盐，例如氯膦酸盐（例如BONEFOS^®或OSTAC^®）、依替膦酸盐（DIDROCAL^®）、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐（ZOMETA^®）、阿仑膦酸盐（FOSAMAJX^®）、帕米膦酸盐（AREDIA^®）、替鲁膦酸盐（SKELID^®）或利塞膦酸盐（ACTONEL^®）；曲沙他滨（1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物）；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的那些，例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体（EGF-R）；疫苗，例如THERATOPE^®疫苗和基因治疗疫苗，例如ALLOVECTIN^®疫苗、LEUVECTIN^®疫苗和VAXID^®疫苗；拓扑异构酶1抑制剂（例如LURTOTECAN®）；rmRH（例如ABARELIX^®）；BAY439006（索拉非尼；Bayer）；SU-11248（Pfizer）；哌立福新、COX-2抑制剂（例如塞来昔布或依托昔布）、蛋白体抑制剂（例如PS341）；硼替佐米（VELCADE^®）；CCI-779；替匹法尼（Rl 1577）；orafenib、ABT510；Bcl-2抑制剂，例如奥利默森钠（GENASENSE^®）；匹克生琼；EGFR抑制剂（参见下文定义）；酪氨酸激酶抑制剂（参见下文定义）；以及上述任何的药学上可接受的酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合，例如CHOP，即关于环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的组合疗法的缩写，以及FOLFOX，即关于用与5-FU和甲酰四氢叶酸组合的奥沙利铂（ELOXATINTM）进行的治疗方案的缩写。

这个定义中还包括的是抗激素剂，其作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用，例如具有混合的激动剂/拮抗剂概况的抗雌激素，包括他莫昔芬（NOLVADEX^®）、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬（FARESTON^®）、艾多昔芬、屈洛昔芬、雷洛昔芬（EVTSTA^®）、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)和选择性雌激素受体调节剂（SERM），例如SERM3；没有激动剂特性的纯抗雌激素，例如氟维司群（FASLODEX^®）和EM800（此类试剂可以阻断雌激素受体（ER）二聚化，抑制DNA结合，增加ER转换率，和/或压制ER水平）；芳香酶抑制剂，包括甾体芳香酶抑制剂，例如福美坦和依西美坦（AROMASIN^®），以及非甾体芳香酶抑制剂，例如阿那曲唑（AREVIIDEX^®）、来曲唑（FEMARA^®）和氨鲁米特），以及其它芳香酶抑制剂包括伏氯唑（RIVISOR^®）、乙酸甲地孕酮（MEGASE^®）、法曲唑、咪唑；促黄体生成激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林（LUPRON^®和ELIGARD^®）、戈舍瑞林、布舍瑞林和曲普瑞林；性类固醇，包括孕激素，例如乙酸甲地孕酮和乙酸甲羟孕酮；雌激素，例如己烯雌酚和普力马；以及雄激素/类视黄醇，例如氟甲睾酮；全反式视黄酸和芬维A胺；奥那斯酮；抗孕激素；雌激素受体下调剂（ERD）；抗雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；睾内酯；以及上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合。

可以与本发明的抗CD47/PD-L1抗体组合使用的其它治疗剂可以是生长因子功能的抑制剂，例如，此类抑制剂包括生长因子抗体和生长因子受体抗体（例如抗erbB2抗体曲妥珠单抗[赫赛汀]、抗EGFR抗体帕尼单抗、抗erbB1抗体西妥昔单抗[Erbitux、C225]以及通过Stern等人 Critical reviews in oncology/haematology，2005，第54卷，第11-29页公开的任何生长因子或生长因子受体抗体）；抗血管生成剂，例如抑制血管内皮生长因子的效应的那些[例如，抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐珠单抗（阿瓦斯汀）]，抗血管内皮生长因子受体抗体，例如抗KDR抗体和抗flt1抗体；反义核苷酸，例如针对上文所列出的靶的那些，例如ISIS 2503，抗ras反义物或G3139（Genasense），抗bcl2反义物；基因治疗方法，包括例如替换异常基因（例如异常p53或异常BRCA1或BRCA2）的方法，GDEPT（基因定向酶前药治疗），方法例如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的方法，以及增加患者对化学疗法或放射疗法的耐受性的方法，例如多药抗性基因治疗；免疫治疗方法，包括例如用阿仑珠单抗（campath-1H）、针对CD52的单克隆抗体治疗、或用针对CD22的抗体的治疗，离体和体内方法以增加患者肿瘤细胞的免疫原性，用细胞因子（例如白介素2、白介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）转染，降低T细胞无反应性的方法，例如用抑制CTLA-4功能的单克隆抗体的治疗，使用转染的免疫细胞的方法，例如细胞因子转染的树突状细胞，使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法和使用抗独特型抗体的方法，使用T细胞的过继性T细胞转移，所述T细胞已被离体非特异性激活或靶向目的特定抗原；蛋白质降解的抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂，例如万珂(Velcade)（硼替佐米）；生物治疗方法，例如使用肽或蛋白质（例如抗体或可溶性外部受体结构域构造）的那些，其隔离受体配体，阻断配体与受体的结合或降低受体信号传导（例如，由于增强的受体降解或降低的表达水平）。

剂量和施用途径

本发明的抗CD47/PD-L1抗体应该以有效治疗所讨论的病况的量施用，即以达到所需结果所需要的剂量和时间段过程中施用。治疗有效量可以根据因素而变，所述因素例如所治疗的具体病况，患者的年龄、性别和重量，以及抗CD47/PD-L1抗体是作为单独治疗施用还是与一种或多种另外的治疗组合施用。

可以调整剂量方案以提供最佳应答。例如，可以施用单次推注，可以随着时间过去施用几个分剂量，或者可以如由治疗情况的紧急程度指示的，按比例减少或增加剂量。特别有用的是以标准剂型制造肠胃外组合物，用于施用的容易性和给药的均匀性。如本文使用的，单位剂型预期指适于作为用于待治疗的患者/受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算以产生所需疗效的预定数量的活性化合物以及所需药物载体。关于本发明的标准剂型的规格通常由以下因素决定，并直接取决于以下因素：（a）化学治疗剂的独特特征和待实现的具体治疗或预防效果，以及（b）配制用于治疗受试者的此类活性化合物的领域中固有的局限性。

因此，本领域技术人员根据本文公开内容将认识到，根据治疗领域中众所周知的方法来调整剂量和剂量方案。换言之，可以容易地确立最大可耐受剂量，并且还可以测定向患者提供可检测的疗效的有效量，以及可以测定施用每种试剂以向患者提供可检测的疗效的时间要求。因此，尽管在本文件中给出一些剂量和剂量方案作为实例，但这些实例绝不限制在实践本发明时对于患者可能必要的剂量和剂量方案。

应注意，剂量值可以随着待缓解的病况的类型和严重性而变，并且可以包括单一剂量或多重剂量。此外，应理解，对于任何特定受试者，应该根据个体需要和施用组合物或监督组合物施用的医学专业人员的判断，随着时间过去调整具体的剂量方案，并且本文阐述的剂量范围仅是示例性的，并不预期限制请求保护的组合物的范围或实践。此外，关于本发明组合物的剂量方案可以基于各种因素，包括疾病的类型，患者的年龄、重量、性别、医学状况，病况的严重性，施用途径，以及采用的特定抗CD47/PD-L1抗体。因此，剂量方案可以广泛改变，但可以使用标准方法照常规测定。例如，可以基于药代动力学或药效学参数来调整剂量，所述药代动力学或药效学参数可以包括临床效应，例如毒性效应和/或实验室值。因此，本发明涵盖由本领域技术人员测定的患者内剂量递增。用于测定适当剂量和方案的方法是本领域众所周知的，并且一旦提供了本文公开的理念，技术人员就会理解。

上文提供了合适的施用方法的实例。

认为根据本发明的针对CD47和PD-L1的抗体的合适剂量将在0.1-200 mg/kg的范围内，优选0.1-100 mg/kg，包括约0.5-50 mg/kg，例如约1-20 mg/kg。针对CD47和PD-L1的抗体可以例如以至少0.25 mg/kg的剂量施用，例如至少0.5mg/kg，包括至少1 mg/kg，例如至少1.5 mg/kg，例如至少2 mg/kg，例如至少3 mg/kg，包括至少4 mg/kg，例如至少5 mg/kg；以及例如直到最多50 mg/kg，包括直到最多30 mg/kg，例如直到最多20 mg/kg，包括直到最多15 mg/kg。通常以适当的时间间隔例如每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次重复施用，并且持续与由负责的医生认为适当的一样久，在一些情况下，所述医生可以在必要时增加或减少剂量。

制品（产品）和试剂盒

本发明的下述实施方案是含有用于治疗癌症的产品的产品，所述癌症例如HNSCC、子宫颈癌、原发灶不明癌、成胶质细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC、CRC、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC、肾癌、卵巢癌、霍奇金淋巴瘤、MSI CRC、白血病（急性白血病或成髓细胞性白血病）、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症。产品是容器以及在包装中的标签或传单插页，其置于容器上或封闭在其中。合适的容器是例如罐、小瓶、注射器等。容器可以由各种材料例如玻璃或塑料制成。容器含有对于治疗特定病况有效的组合物，并且可以具有无菌入口通道（例如，容器可以是具有塞子的静脉内溶液袋或小瓶，所述塞子可以用皮下注射针刺穿）。组合物中的至少一种活性成分是根据本发明的抗PD-L1抗体。包装中的标签或传单指示该组合物用于治疗特定病况。包装中的标签或包装传单应该另外含有关于将抗体组合物施用于患者的说明书。

包装传单含有通常的说明书，其包括到即将上市的治疗产品的包装内，包括关于此类治疗产品的适应症、施用频率、剂量、途径、禁忌和/或注意事项的一些信息。在一个实施方案中，包装插页指示该组合物预期用于治疗癌症，例如HNSCC、子宫颈癌、原发灶不明癌、成胶质细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC、CRC、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC、肾癌、卵巢癌、霍奇金淋巴瘤、MSI CRC、白血病（急性白血病或成髓细胞性白血病）、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症。

此外，制品可以进一步包括第二容器，其具有药学上可接受的缓冲液，例如抑菌注射用水（BSVI）、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。此外，制品可以包括从商业角度和从消费者的角度来看必要的其它产品，特别是其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。

本发明还涉及试剂盒，其可以用于各种目的，例如，用于检测哺乳动物的组织、细胞或体液中的PD-L1。此类试剂盒可用于与PD-L1疾病相关的筛选。试剂盒包括本发明的特定结合剂或抗体，以及当存在时，用于指示特定结合剂或抗PD-L1抗体的反应的手段。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，结合PD-L1的抗体是标记的。在另一个实施方案中，抗体是未标记的第一抗体，并且试剂盒进一步包括用于检测第一抗体的手段。在一个实施方案中，检测手段包括标记的第二抗体，其是抗免疫球蛋白。可以用选自荧光染料、酶、放射性核素和不透射线的材料的标记物来标记抗体。试剂盒可以是含有抗体以在体外检测且定量PD-L1的试剂盒，例如通过实施ELISA或蛋白质印迹。另外，如在制品的情况下，试剂盒包括容器以及位于容器上或内部的标签或包装插页。容器容纳包含至少一种根据本发明的抗PD-L1抗体的组合物。另外的容器可以包括例如稀释剂和缓冲液、对照抗体。包装中的标签或包装传单可以含有组合物的描述，以及其在体外使用或用于诊断目的的说明书。

诊断用途和组合物

本发明的抗CD47/PD-L1抗体也用于诊断过程中（例如在体外、离体）。例如，抗CD47/PD-L1抗体可以用于检测或测量得自患者的样品（例如组织样品或体液样品，例如炎性渗出物、血液、血清、肠液、唾液或尿）中的CD47和/或PD-L1水平。用于检测和测量的合适方法包括免疫测定，例如流式细胞术、酶联免疫吸附测定（ELISA）、化学发光测定、放射性免疫测定和免疫组织学。本发明进一步包括试剂盒，例如，包含本文所述的抗CD47/PD-L1抗体的诊断试剂盒。

实施例

提供下述实施例用于更好地理解本发明。这些实施例仅出于说明目的，而不应解释为以任何方式限制本发明的范围。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文。尽管已通过说明和实例的方式稍为详细地描述前述发明用于清楚理解的目的，但基于本发明公开的理念，对于本领域技术人员非常明确的是，可以进行某些改变和修改，而不背离本发明的所附变化实施的本质和范围。

实施例1. 重组抗原和抗体在哺乳动物细胞的悬浮培养中的生产。

将人CD47（Leu19-Val134）和PD-L1（Phe19-Arg238）的细胞外结构域序列（SEQ IDNO：107-108）在SalI/NotI限制性位点处克隆到质粒内，用于在哺乳动物细胞中产生加上Fc标签的蛋白质（图1）。所需数量的质粒在大肠杆菌细胞中产生，并且使用Qiagen试剂盒纯化。

将抗CD47抗体（B6H12，Stanford University，US20130142786）的可变结构域的序列克隆到质粒内，用于在哺乳动物细胞中产生IgG1蛋白。所需数量的质粒在大肠杆菌细胞中产生，并且使用Qiagen试剂盒纯化。

在得自中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）的建立细胞系中生成抗体和抗原。使用无血清培养基（Life Technologies Corporation），并且按照制造商的指导，在定轨振荡器上的烧瓶中进行悬浮培养。对于瞬时表达，借助于线性聚乙烯亚胺（例如，PEI MAX，Polysciences）转染浓度为2*10⁶/ml的细胞。DNA/PEI比为1：3/1：10。在转染后5-7天内，使细胞培养物在2000 g下离心20分钟，并且通过0.22 µm过滤器进行过滤。通过亲和HPLC从培养液中分离靶蛋白。

在用于亲和HPLC的蛋白A柱上从细胞培养物中分离并纯化重组Fc蛋白。使澄清的培养液通过用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）平衡的5 ml HiTrap rProtein A SepharoseFF柱（GE Healthcare）。然后用5体积的PBS洗涤柱，以去除非特异性结合的组分。用0.1 M甘氨酸缓冲液（pH 8）洗脱结合的抗原。收集主要的蛋白质洗脱峰，并且用1 M Tris缓冲液（pH8）达到中性pH。所有阶段都在110 cm/小时流速下进行。然后使用SnakeSkin DialysisTubing技术，将蛋白质透析到PBS（pH 7.4）内，过滤（0.22 µm），转移到管内，并且贮存于-70℃下。

通过非还原SDS-PAGE（12%凝胶）评估所获得的蛋白质溶液的纯度(图2)。

实施例2. 全长抗体的制备。

通过标准技术执行克隆。用含有限制位点的引物产生了包含抗体的重链和轻链的可变结构域基因的PCR产物。将重链的可变结构域在Sal1/Nhe1限制性位点处克隆到载体pEE-Hc IgG1内。将轻链的可变结构域在Sal1/BsiW1限制性位点处克隆到载体pEE-CK内。获得的基因构建体用于在CHO-T细胞系中瞬时产生蛋白质。如实施例1所述，根据标准方法，通过在细菌蛋白A上的亲和层析，分离且纯化蛋白。在补充有巯基乙醇的12%变性PAGE（图3）和未补充有巯基乙醇的8%变性PAGE（图4）中执行电泳。

实施例3. 首次用于实验的人Fab噬菌体文库MeganLibTM的改造

根据建议的方案，使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN），分离了来自多于一千个个别人供体的血液样品的B淋巴细胞的总RNA。使用Nanovue试剂盒（GE Healthcare）执行RNA浓度测定；借助于1.5%琼脂糖凝胶电泳测试分离的RNA的质量。

根据推荐的方案，使用MMLV RT试剂盒（Evrogen），用MMuLV逆转录酶和随机六聚体寡核苷酸作为引物，来进行逆转录反应。

逆转录产物在两阶段聚合酶链反应中用作基质，以获得侧翼为限制性位点的可变结构域的基因；根据[J Biol Chem. 1999 Jun 25；274（26）：18218-30]的方案，使用寡核苷酸试剂盒来执行反应。

用NheI/Eco91I限制性核酸内切酶处理所获得的DNA产物(VL-CK-VH)，并且连接到原始的噬菌粒pH5内。将连接产物转化到根据方案[Methods Enzymol. 2000；328：333-63.]制备的SS320大肠杆菌电感受态细胞内。组合Fab噬菌体展示文库MeganLibTM的储库是10¹¹个转化体。Fab噬菌体文库产物根据较早描述的程序[J Mol Biol. 1991 Dec 5；222（3）：581-97]进行制备。

实施例4. 用人CD47抗原免疫美洲驼，并且生成美洲驼抗体片段的噬菌体展示文库。

借助于与等体积的完全（第一次注射）或不完全（其它注射）弗氏佐剂混合的抗原材料的皮下注射，将动物大羊驼（Lama Glama）连续免疫5次。实施例1的重组人CD47蛋白（1mg/注射）用作抗原。抗原注射按以下间隔执行：0、2、4、5、8周。从第三次注射开始，每次注射后5收集血样（50 ml）。使用3.8%的柠檬酸钠作为抗凝剂（1：9）。用无菌盐水溶液将血液稀释2倍。然后将30 ml稀释的血液溶液铺在15 ml Lymphoprep™（Axis-Shield，挪威）培养基（密度为1.077 g/ml）上，并且在800g下离心20分钟。从血浆/Lymphoprep培养基相间区带中选择单核细胞（淋巴细胞和单核细胞），并且用无菌PBS洗涤。

根据标准方案评估所获得的血清免疫球蛋白针对CD47的滴度，证明为至少为1/100000，其足以制备抗体文库。

使用RNeasy Mini Kit，根据方案（QIAGEN），分离来自单核美洲驼细胞的总RNA。使用Nanovue（GE Healthcare）执行RNA浓度测定；借助于1.5%琼脂糖凝胶电泳测试分离的RNA的质量。

根据推荐的方案，使用MMLV RT试剂盒（Evrogen），用MMuLV逆转录酶和随机六聚体引物来进行逆转录反应。

逆转录产物在两阶段聚合酶链反应中用作基质，以获得侧翼为限制性位点的单结构域VHH、scFv或Fab的基因；使用寡核苷酸试剂盒和[FASEB J. 2007 Nov；21（13）:3490-8]的方案来执行反应。用NcoI/NotI限制性酶处理所获得的VHH基因DNA产物，并且连接到原始噬菌粒pscFv内，所述pscFv在组成方面类似于[FASEB J. 2007 Nov；21（13）: 3490-8]中使用的pHEN2。将连接产物转化到根据方案[Methods Enzymol. 2000；328：333-63.]制备的SS320电感受态细胞内。构建的基于VHH的文库的储库是0,5-2*10E+8个独立转化体。构建的基于scFv/Fab的文库的储库分别为0,5-2*10E+9/1,2-2,5*10E+9。噬菌体文库产物根据较早描述的程序[J Mol Biol. 1991 Dec 5；222（3）：581-97]进行制备。

实施例5. 抗体片段的噬菌体展示文库的选择

通过[EMBO J. 1994 Jul 15；13（14）:3245-60，Nat Biotechnol. 1996 Mar；14（3）:309-14；J Mol Biol.1991 Dec 5；222（3）: 581-97]中描述的常规选择程序，但使用磁珠和KingFisher Flex装置，从噬菌体Fab、VHH或scFv展示文库（实施例3、4）中选择特异性抗CD47噬菌体抗体，因为该技术允许同时执行至多96种不同的方案和变体。

将人生物素化的PD-L1/CD47抗原（Fc，EPEA）有目的地固定到链霉抗生物素蛋白磁珠（NEB）上，其浓度对于第一轮为10 μg/ml，对于第二轮为2 μg/ml，对于第三轮和第四轮分别为0.4和0.2 μg/ml。使抗原与珠一起在室温下在旋转器上温育1小时。然后将珠用PBS（pH7.4）洗涤，用2%的脱脂乳或1% BSA的PBS（pH 7.4）溶液封闭珠表面1小时。将人噬菌体文库MeganLibTM在具有2%脱脂乳和含有靶抗原标签的非靶抗原的PBS（pH 7.4）中以2*10¹³个噬菌体颗粒/ml的浓度稀释，并且通过在表面上不含抗原的磁珠进行预选，以便去除非特异性结合的噬菌体。然后使IL-5Rα包被的磁珠与MeganLibTM一起在室温下温育1-2小时。

通过用含有0.1% Tween 20的PBS（pH 7.4）溶液洗涤磁珠的几个循环来去除未结合的噬菌体。洗涤循环的次数逐轮增加（在第一轮中3个洗涤循环，在第二轮中9个洗涤循环，以及在第四轮中15个洗涤循环）。在搅拌下的15分钟过程中，用100 mM Gly-HCl溶液（pH2.2）从珠中洗脱与磁珠的表面上的抗原结合的噬菌体，然后用1M Tris-HCl（pH 7.6）中和。大肠杆菌TG1细菌被噬菌体感染，在培养基中生长，并且随后用于下一个选择循环中。在三或四轮后，根据制造商（Qiagen）方案，从大肠杆菌TG1培养物中分离噬菌粒DNA。多克隆噬菌体酶免疫测定（ELISA）用于富集针对靶抗原的文库以及评价非特异性结合的噬菌体颗粒的存在。

实施例6. 针对特异性和非特异性抗原的多克隆噬菌体的ELISA。

将靶抗原（CD47/PD-L1）和非靶抗原（具有Fc融合蛋白）固定到高吸收板（Greiner-Bio）上，以便执行ELISA。蛋白质在0.1 M NaHCO₃（pH 9.0）中分别以1 μg/ml和5 μg/ml的浓度加入，并且以2至7个稀释度的增量进行滴定，然后使密封的板在4℃下温育过夜。使用高性能的基于自动化Tecan Freedom EVO 200的机器人平台（Tecan），根据标准ELISA方案进行所有后续步骤。为了阻断非特异性结合，将包含在PBS（pH 7.4）中的2%脱脂乳或1% BSA的封闭缓冲液加入板孔中。使板在室温下温育1小时。在用含有Tween 20的磷酸盐-盐水缓冲液（PBST）的几个洗涤循环后，加入50 μl/孔的测试多克隆噬菌体。在洗涤后，用在PBST中的抗M13 HRP缀合的第二抗体（Pierce-ThermoScientific）（1：7500）包被（50 µl/孔）每个孔。在室温下温育50分钟后，将板用PBST洗涤三次。通过添加底物溶液（在CH₃COONa pH 5.5中的H₂O₂-0.02%和TMB）10分钟获得比色信号；然后通过添加1%硫酸（20 μl）阻断显色。使用合适的Tecan-Sunrise板阅读器（Tecan），在450 nm处测量颜色信号。

在对靶抗原的第三轮和第四轮选择后，多克隆噬菌体产物的ELISA显示显著富集。选择文库用于再克隆和进一步筛选，其中在噬菌体文库的最小稀释度下，观察到信号超过非同源对照抗原的5倍。

实施例7

将抗体片段的基因再克隆到表达质粒内

使用限制性连接技术，根据标准方案，在成功轮次的选择后，进行抗体可变结构域的基因从噬菌粒载体再克隆到表达质粒内。

在T7启动子的控制下，将所得到的富含特异性针对CD47的VHH单结构域或scFv的克隆库再克隆到表达质粒pET-22（Novagen）内，所述表达质粒pET-22携带在VHH的C末端处的myc-和His6-标签序列。在lac启动子的控制下，将包含针对CD47抗原的富集序列的文库的Fab基因再克隆到表达载体pLL4内，所述表达载体pLL4进一步包含在重链CH1结构域的C末端处的myc-和His6-标签序列。

随后，将包含抗体片段的表达载体转化到大肠杆菌Bl21（DE3）Gold（Stratagene）内，用于通过分泌到培养基内来生成抗体片段，并且使用Mabnext Flow Chart平台，通过ELISA进行来自展示文库的可变抗体片段对抗原的亲和力的比较分析。

实施例8. scFv或VHH单结构域与人CD47-Fc的特异性结合的分析。

ELISA用于测量实施例4的特异性测试抗体片段与人CD47-Fc的结合。ELISA孔板（Nunc ImmunoMaxisorp）用50 µl/孔的人CD47-Fc（Biocad）（在1X包被碳酸盐缓冲液中的0.5 µg/ml）覆盖，密封并且在4℃下温育过夜。使用基于机器人系统例如GenetixQ-pix2xt（Molecular Devices）和Tecan Freedom EVO 200（Tecan）的高性能自动化平台，根据标准ELISA方案，执行所有进一步阶段。通过添加封闭缓冲液BB（200 µl在PBS中的0.5%脱脂乳）来阻断非特异性结合。使板在振荡器上在室温下温育1小时。在用PBS-Tween洗涤后，每个细胞用100 μl含有测试抗体片段的细胞上清液进行包被。使板在振荡器上在室温下温育1小时；进一步地，每个板孔用PBS-Tween缓冲液洗涤5次。在洗涤后，将小鼠抗MYC IgG克隆9E10（ThermoFisher Scientific）（50 µl/孔）加入PBS-Tween（1：5000）中。将板在旋转振荡器中振荡（在室温下50分钟），然后如上所述用PBS-Tween缓冲液洗涤5次。在洗涤后，将抗小鼠IgG HRP缀合物（ThermoFisher Scientific）（50 µl/孔）加入PBS-Tween（1：10000）中。将板在旋转振荡器中振荡（在室温下50分钟），然后如上所述用PBS-Tween缓冲液洗涤5次。通过添加ТМВ（50 µl/孔）直至饱和（平均10-12分钟），获得比色信号；通过添加终止溶液（25µl/孔，1%硫酸）阻断进一步的显色。使用合适的Tecan-Sunrise板阅读器（Tecan），在450 nm处测量颜色信号。抗体结合与产生的信号成比例。在竞争性ELISA测定中测试其中颜色信号超过背景信号多于5倍的克隆，以鉴定在与[WO2016048188 A8]中所述那些类似的条件下，并且在与不包含测试抗体片段的对照相比减少4倍的信号下，阻断SIRP-Fc配体（BIOCAD）和人CD47-Fc受体之间的相互作用的拮抗性特异性抗体片段。

2400个克隆的筛选导致265个scFv和VHH克隆，证实在信号上超过背景的5倍。所述阳性克隆组产生了能够阻断SIRP-Fc配体（BIOCAD）和人CD47-Fc受体之间的相互作用的27个拮抗性克隆。通过在3130xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems）上的Sanger测序，来测定阳性克隆基因的核苷酸序列。获得了六个示例性VHH单结构域克隆，其序列相差至少1个氨基酸，但具有各自彼此至少90%同源的CDR区，因此指示它们借助于免疫美洲驼中的体内成熟而源于一个亲本克隆（表1）。

表1. 针对人CD47的CD47特异性结合VHH单结构域的序列

实施例9. Fab与人CD47-Fc的特异性结合的分析。

根据标准技术进行Fab生产：用含有Fab基因的表达载体转化细菌细胞，然后在培养所得到的转化体的过程中，在培养基中添加引发lac操纵子转录的诱导剂，引起Fab的表达。

然后进行ELISA以寻找结合人CD47的Fab。

具有公开序列的B6H12 Fab（参见实施例1）用作阳性对照。为了测试特异性结合，ELISA孔板（中等结合，Greiner bio one）用50 μl/孔的CD47 Fc美洲驼（在1X碳酸盐缓冲液中的0.2 μg/ml）覆盖，密封并且在4℃下温育过夜。使用基于机器人系统例如GenetixQpix2xt（Molecular Devices）和Tecan Freedom EVO 200（Tecan）的高性能自动化平台，根据标准ELISA方案，执行所有进一步阶段。通过添加封闭缓冲液BB（200 µl PBS中的0.5%脱脂乳）来阻断非特异性结合。使板在室温下温育1小时。在用PBS-Tween洗涤后，每个细胞用60 μl/孔含有测试Fab的细胞上清液进行包被。使板在室温下温育1小时；每个板孔随后用PBS-Tween缓冲液洗涤3次。在洗涤后，每个孔用在PBS-Tween中的抗人Fab HRP缀合的第二抗体（Pierce-ThermoScientific）（1：7500）进行包被（50 µl/孔）。如上所述，使板在室温下温育1小时，并且用PBS-Tween缓冲液洗涤3次。通过添加ТМВ（50 µl/孔）直至饱和（15分钟），获得比色信号；通过添加终止溶液（25 µl/孔，1%硫酸）阻断进一步的显色。使用合适的Tecan-Sunrise板阅读器（Tecan），在450 nm处测量颜色信号。抗体结合与产生的信号成比例。通过ELISA针对非特异性结合测试其中颜色信号超过来自对照抗体的信号的克隆。

实施例10. Fab与各种人抗原的非特异性结合的分析。

二次筛选旨在选择Fab生产克隆，其与全长CD47抗原相互作用，并且不与非特异性抗原相互作用，并且还与配体（CD47）竞争与SIRPa的结合。

ELISA用于分析测试Fab与其它抗原的非特异性结合。分析如上所述执行，但使用3DHer3-H6E、INFα2b、PD-L1-Fc-美洲驼（在1×碳酸盐缓冲液中的2.5 μg/ml）作为用于固定的抗原。CD47 FE和CD47 Fc美洲驼（在1×碳酸盐缓冲液中的0.2 μg/ml）用作特异性结合对照。使用基于机器人系统例如Genetix Qpix2xt（Molecular Device）和Tecan Freedom EVO200（Tecan）的高性能自动化平台，根据标准ELISA方案，进行所有进一步阶段。

竞争性ELISA用于测试预选的抗人CD47特异性Fabs阻断与SIRPa受体相互作用的能力。具有公开序列的Fab（参见实施例1）用作拮抗剂的阳性对照。

ELISA孔板（高结合，Greiner bio one）用50 µl/孔的SIRPa（在1X碳酸盐缓冲液中的0.5 µg/ml）覆盖，并且在4℃下温育过夜。使用基于例如机器人系统Genetix Qpix2xt（Molecular Devices）和Tecan Freedom EVO 200（Tecan）的高性能自动化平台，根据标准ELISA方案，执行所有进一步阶段。通过添加封闭缓冲液BB（200 µl 在PBS中的0.5%脱脂乳），来阻断非特异性结合。使板在室温下温育1小时。

平行地，将包含测试Fab和CD47 Fc美洲驼（在PBS-Tween中以1 μg/ml的最终浓度）的细胞上清液以1：1的比率在非吸收性板中混合，在室温下温育45分钟。

在洗涤含有SIRPa受体的板以去除BB后，将Fab和CD47 Fc美洲驼的混合物转移至板，在室温下温育45分钟。每个板孔随后用PBS-Tween缓冲液洗涤3次，将50 μl/孔的抗人Fab HRP缀合的第二抗体（Pierce-ThermoScientific）加入PBS-Tween（1：7500）中。如上所述，使板在室温下温育45分钟，并且用PBS-Tween洗涤3次。通过添加ТМВ（50 µl/孔）直至饱和（平均15分钟），获得比色信号；通过添加终止溶液（25 µl/孔，1%硫酸）阻断进一步的显色。使用合适的Tecan-Sunrise板阅读器（Tecan），在450 nm处测量颜色信号。Fab结合与产生的颜色信号成反比。将在对照Fab的水平下显示阻断的克隆注明为阳性的，并且用于进一步的测定中。在Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）上，根据标准方案，对阳性克隆的可变结构域的基因进行测序并进行分析。

实施例11. 通过动力学解离常数koff（kdis）比较筛选抗CD47抗体片段。

测量了VHH抗体片段，以提供分析抗体片段的相互作用的动力学参数的实例，所述抗体片段与CD47受体特异性结合。使用Octet Red 96和ARG2氨基反应性生物传感器（Pall-ForteBio），执行关于VHH片段的基于解离常数（k_dis）的比较筛选。亲和常数可以基于测试溶液中的确切蛋白质浓度来计算，并且由于细胞生长培养基用作蛋白质溶液并且未测量蛋白质浓度，因此通过使用其解离常数，将候选物针对彼此进行比较。生物传感器在水中预水合1小时。在激活生物传感器后，将在乙酸盐缓冲液pH4中浓度为10 µg/ml的CD47-Fc非特异性地（通过NH2基团）固定到生物传感器上。然后将传感器浸没到含有细胞生长培养基的孔内，所述细胞生长培养基具有特异性VHH（来自1 ml培养基中的约1 μg VHH），复合物在其中缔合。然后将传感器浸没到缓冲溶液中，复合物的后续解离阶段在其中发生。将1/10体积的10x工作缓冲液加入在含有抗CD47 VHH片段的大肠杆菌生长培养基中的测试样本中。使用OctetDataAnalysis（版本7.0），根据标准程序，用1：1相互作用模型来分析获得的曲线。

抗CD47 VHH候选物的koff筛选结果显示于表2。证实所有VHH片段都与人CD47特异性结合；基于占优势的kdis选择候选物BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_C7_49，用于进一步研究和再克隆，以获得双特异性抗体。

表2. VHH与CD47-Fc的动力学解离常数

编号	克隆名称	kdis（1/s）
			1	BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_B9_64	8.00E-03
2	BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_C7_49	5.00E-03
			3	BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_F10_76	1.00E-02
4	BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_G5_37	6.00E-03
			5	BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_G7_53	8.00E-03
6	BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_H10_78	6.00E-03
			7	BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_B9_64	8.00E-03

实施例12. 获得构建体和不对称双特异性抗CD47/PD-L1抗体的产生。

通过使用专有计算机算法的计算，以及根据标准方案[http://www.openwetware.org/wiki/DNA_Synthesis_from_Oligos]自在ASM-2000（Novosibirsk）合成仪上获得的寡核苷酸进行的PCR合成，从头获得优化的scFv片段的所有可变结构域的序列以及用于合成候选物BCD106-02-VHH_C7_49（表3）的可变结构域VHH的野生型和突变型变体的基因序列以及抗PD-L1抗体（BCD135，来自BIOCAD的原始人抗体）的轻链和重链的可变结构域的基因。通过使用来自单链DNA分子的两步PCR合成，从VH和VL基因衍生出长scFv基因。在PCR合成后，在QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）柱上纯化在琼脂糖凝胶上分级的DNA片段。将scFv和VHH基因个别地连接到质粒pEE-Fc（结(knob)）内，而将aPD-L1特异性抗体的可变重链结构域个别地连接到质粒pEE-Fc（洞(hole)）内。pEE-Fc（结）含有具有突变S354C+T366W的人IgG1 Fc，而pEE-Fc（洞）含有具有突变Y349C+T366S+L368A的人IgG1Fc，在最低限度的同二聚化程度下，提供这些Fc部分与彼此的异二聚化[Nat Biotechnol.1998 Jul；16（7）:677-81.]，伴随与类似地克隆到pEE-Cλ内的aPD-L1轻链可变结构域一起，在CHO-EBNA细胞中的共瞬时表达。在通过修改的LIC方法[Aslanidis C，de Jong PJ.Ligation-independent cloning of PCR products（LIC-PCR）. Nucleic Acids Res.1990；18:6069–6074]）的连接非依赖性克隆后，将DNA转化到大肠杆菌内。将具有正确序列的构建体pEE-Fc(结)-scFv或pEE-Fc(结)-VHH与pEE-BCD135-VH-299P-HC-洞和pEE-BCD135-01 4LG VL hzau CL共转染，以获得所谓的不对称双特异性抗体（参见图6）。该图显示了不对称双特异性抗体的示意性模型，A-基于抗CD47 scFv和抗PD-L1 Fab结合片段，B-基于抗CD47 VHH和抗PD-L1 Fab结合片段。根据实施例2，所得到的遗传构建体用于在CHO-T细胞系中产生蛋白质。在纯化后，抗体在组成方面是高度同质的，双特异性抗体的生产产率范围为60至260 mg/ml培养基。图7显示了基于抗CD47 scFv片段的纯化的双特异性抗体的实例。图8显示了基于抗CD47 VHH片段的纯化的双特异性抗体的实例。表3中所示的含有序列VHH47Opt3的抗体变体生成极低的抗体产率，并且从进一步的测试中排除。

表3. 来自BCD106-02-VHH_C7_49克隆的抗CD47 VHH和抗PD-L1 BCD135的可变结构域的野生型/突变型变体的氨基酸序列。灰色指示具有不同于野生型的那些的突变的抗CD47 VHH位置。

实施例13. 在OctetRED96上，分析抗PD-L1/抗CD47 PD-L1-双特异性抗体与人PD-L1/CD47抗原的相互作用。

在OctetRed 96（Pall-ForteBio）上，执行PD-L1-双特异性抗体与人PD-L1/CD47抗原的相互作用分析。AR2G生物传感器在mQ中预水合1小时。在激活生物传感器后，将在乙酸盐缓冲液pH4中浓度为25 µg/ml的PD-L1-Fc或CD47-Fc非特异性地（通过NH2基团）固定到生物传感器上。然后将传感器浸没到含有抗PD-L1/抗CD47抗体溶液（10 μg/ml）的孔中，抗体-抗原复合物在其中缔合。然后将传感器浸没到缓冲溶液中，用于后续的解离步骤。在扣除参考信号后，使用Octet Data Analysis软件（版本8.2），根据标准程序并且使用1：1相互作用模型来分析结合曲线。

分析结果显示于表4中。因此，可以得出结论，该抗体具有高亲和力，其中这种形式的抗体对PD-L1抗原的亲和力具有nM值，而对CD47抗原的亲和力具有亚nM值。此类结合被视为足以使抗体能够与靶细胞上的受体相互作用，用于随后测试在体外和体内的治疗活性。

表4. 抗CD47/抗PD-L1双特异性抗体的动力学解离常数。

实施例14. 在Forte Bio Octet RED 384上，分析抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体与食蟹猴CD47和PD-L1受体的相互作用。

在Forte Bio Octert RED 384上，执行对动物CD47/PD-L1抗原的抗体亲和力的实验研究。根据标准方案和制造商的说明书，将浓度为20 μg/ml的抗体固定到AR2G传感器（Forte Bio）上。使用包含0.1% Tween 20和0.1% BSA的PBS作为工作缓冲液，在30℃下进行分析。在基线记录后，将传感器浸没到含有抗原溶液（动物CD47和PD-L1）的孔内300秒，复合物在其中缔合。然后检测在缓冲溶液中的复合物解离600秒。

在扣除参考信号后，使用Octet Data Analysis（版本9.0）软件，根据标准程序并且使用1：1全局相互作用模型来分析结合曲线。抗CD47抗体与食蟹猴抗原CD47和PD-L1特异性结合。表5和表6。

表5. 抗体针对食蟹猴抗原（CD-47）的相互作用的动力学值。

名称

KD(M)

KD误差

kon(1/Ms)

kon误差

kdis(1/s)

kdis误差

BCD106-02-001

6.32E-09

3.69E-11

1.88E+05

9.64E+02

1.18E-03

3.28E-06

BCD106-02-006

6.99E-10

3.99E-12

8.64E+05

3.61E+03

6.04E-04

2.34E-06

BCD106-02-013

3.06E-10

3.56E-11

5.31E+04

1.60E+02

1.63E-05

1.89E-06

表6. 抗体与食蟹猴抗原（PD-L1）的相互作用的动力学值。

名称

KD(M)

KD误差

kon(1/Ms)

kon误差

kdis(1/s)

kdis误差

BCD106-02-001

8.75E-10

6.01E-12

1.67E+06

1.07E+04

1.46E-03

3.55E-06

BCD106-02-006

7.27E-10

6.40E-12

1.73E+06

1.34E+04

1.26E-03

5.25E-06

BCD106-02-013

1.34E-09

1.02E-11

1.65E+06

1.19E+04

2.21E-03

5.66E-06

实施例15. 在Forte Bio Octet RED 384上，分析抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体与抗原组的非特异性结合。

对非特异性的加上组氨酸标签的抗原组，执行非特异性结合的实验研究。在作为工作缓冲液、含有0.1% Tween-20和0.1% BSA的PBS中预水合10分钟的Anti-hIgG FcCapture（AHC）生物传感器用于测量。

将浓度为30 μg/ml的抗体固定到Anti-hIgG Fc Capture（AHC）传感器（ForteBio）上。使用包含0.1% Tween 20和0.1% BSA的PBS作为工作缓冲液，在30℃下进行分析。在缓冲溶液中规定了基线后，将传感器浸没到具有非特异性抗原的溶液的孔中300秒，复合物在其中缔合。然后检测在缓冲溶液中复合物的解离600秒。

使用OctetDataAnalysis（版本9.0），根据标准程序使用1：1全局相互作用模型来分析结合曲线（在扣除参考信号后）。抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体不与抗原组非特异性结合。

实施例16. 在Forte Bio Octet RED 384上，分析抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体与FcγRIIIa组的相互作用。

使用在含有0.1% Tween-20和0.1% BSA的PBS中预水合30分钟的链霉抗生物素蛋白（SAX）生物传感器，在Forte Bio Octert RED 384上执行对Fc结合蛋白的组的抗体亲和力的实验研究。

将在含有0.1% Tween-20和0.1% BSA pH 7.4的FSB动力学缓冲液中浓度为5 μg/ml的生物素化的Fc结合的加上Avi标签的蛋白质FcγRIIIa-F158和FcγRIIIa-V158，固定到链霉抗生物素蛋白（SAX）传感器上，具有达到0.4 nm的信号水平所需的t _RecLoad时间的固定。在基线记录后，将传感器浸没到含有抗体溶液的孔内60秒，复合物在其中缔合。然后检测在缓冲溶液中的复合物解离150秒。

使用OctetDataAnalysis（版本9.0），根据标准程序，使用2：1全局相互作用模型，来分析结合曲线（在扣除参考信号后）。抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体与Fc结合蛋白FcγRIIIa-F158和FcγRIIIa-V158特异性结合。表7和表8。

表7. 抗体BCD-106（02-001、03-006、02-013）针对FcγRIIIa-F158的相互作用的动力学值。

名称

KD(M)

KD误差

kdis(1/s)

kdis误差

kon(1/Ms)

kon误差

BCD106-02-001

1.61E-06

9.86E-07

6.27E-08

1.04E-07

1.73E+05

1.19E+04

BCD106-02-006

1.47E-06

1.73E-07

6.03E-08

8.40E-08

1.35E+05

1.67E+04

BCD106-02-013

1.30E-06

2.00E-06

3.79E-08

1.88E-07

2.22E+05

1.55E+04

表8：抗体BCD-106(02-001、03-006、02-013)针对FcγRIIIa-V158的相互作用的动力学值。

名称

KD(M)

KD误差

kdis(1/s)

kdis误差

kon(1/Ms)

kon误差

BCD106-02-001

9.32E-07

1.62E-07

2.86E-08

1.86E-08

2.33E+05

5.72E+04

BCD106-02-006

4.63E-06

<1.0E-12

1.07E-06

5.25E-07

4.75E+04

8.58E+03

BCD106-02-013

3.73E-07

1.45E-07

1.83E-09

1.07E-08

6.10E+05

5.77E+04

实施例17. 在Forte Bio Octet RED 384上，分析抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体与FcRn的相互作用。

将在含有0.1% Tween-20 pH 6的PBS动力学缓冲液中浓度为5 μg/ml的生物素化的加上Avi标签的FcRn，固定到链霉抗生物素蛋白（SAX）传感器上，具有达到0.4 nm的信号水平所需的t _RecLoad时间的固定。在缓冲溶液中的基线记录后，将传感器浸没到含有在PBS动力学缓冲液中的抗体溶液的孔内60秒，所述PBS动力学缓冲液含有0.1% Tween-20 pH 6，复合物在其中缔合。然后检测在含有0.1% Tween-20和0.1% BSA pH 7.4的PBS动力学缓冲液中复合物的解离150秒。

使用OctetDataAnalysis（版本9.0），根据标准程序使用2：1全局相互作用模型来分析结合曲线（在扣除参考信号后）。抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体与FcRn特异性结合。表9。

表9. 抗体BCD-106（02-001、03-006、02-013）针对FcRn的相互作用的动力学值。

名称

KD(M)

KD误差

kdis(1/s)

kdis误差

kon(1/Ms)

kon误差

BCD106-02-001

1.61E-06

9.86E-07

6.27E-08

1.04E-07

1.73E+05

1.19E+04

BCD106-02-006

1.47E-06

1.73E-07

6.03E-08

8.40E-08

1.35E+05

1.67E+04

BCD106-02-013

1.30E-06

2.00E-06

3.79E-08

1.88E-07

2.22E+05

1.55E+04

实施例18. 抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体PD-L1对PD-L1/CD47阳性细胞诱导抗体依赖性细胞毒性的能力的分析。

为了执行ADCC（抗体依赖性细胞毒性），使用了在其表面表达PD-L1/CD47受体的MDA-MB-231细胞系以及外周血单核细胞（PBMC）。

获得外周血单核细胞

通过以密度梯度分级来自健康供体的静脉血细胞获得PBMC。在分离后，细胞在含有10%FBS的RPMI-1640培养基中以2-5×10⁶个细胞/ml的浓度在37℃和5% CO₂下培养18-24小时。

靶细胞的制备

MDA-MB-231细胞在含有10% FBS（胎牛血清）的DMEM培养基中在37℃和5% CO₂下培养。细胞使用胰蛋白酶从塑料表面取下，并且重悬浮于含有10% FBS的DMEM中。加入钙黄绿素AM至5 μM的浓度。在30分钟后，细胞用含有10% FBS的DMEM洗掉过量的钙黄绿素AM两次。在含有10% FBS的DMEM中制备浓度为10⁵个细胞/ml的靶细胞悬浮液。

测试抗体稀释物的制备

所有测试抗体都用含有10% FBS的DMEM培养基稀释至10 μg/ml的浓度。以5倍的增量制备了一系列连续稀释物。测试抗体的浓度为（ng/ml）：10000；2000；400；80；16；3,2；0,64；0,128；0,0256；0。

PBMC的制备

单核淋巴细胞从小瓶中收集，并且在200×g下离心5分钟。在含有10% FBS的DMEM培养基中制备浓度为5×10⁶个细胞/ml的细胞悬浮液。

进行ADCC测定

将50 μl/孔的测试抗体加入96孔板的孔中。将100 μl/孔的靶细胞悬浮液加入含有抗体的孔中。使板在37℃和5% CO₂下温育15-20分钟。将50 μl/孔的PBMC悬浮液加入含有抗体和靶细胞的孔中。将50 μl/孔的含有10% FBS的DMEM培养基、100 μl靶细胞悬浮液和50 μlPBMC悬浮液加入三个孔（最大裂解的对照，“KL”）。使板在37℃和5% CO₂下温育3.5-4小时。在温育结束前30分钟，将裂解缓冲液加入KL孔中。

在温育后，将板在200×g下离心10分钟。将上清液流体转移到新的96孔板。通过使用板式荧光计，在485/538 nm的激发/发射波长下，以相对荧光单位测量荧光。

ADCC功效通过下式进行计算：

，其中

K - 在效应细胞的存在下靶细胞的自发裂解的对照（50 μl/孔的含有10% FBS的DMEM培养基 + 100 μl/孔的靶细胞 + 50 μl/孔的PBMC）

KL - 靶细胞的最大裂解的对照（50 μl/孔的含有10% FBS的DMEM培养基 + 100 μl/孔的靶细胞 + 50 μl/孔的PBMC + 裂解缓冲液）。

结果显示于图9和10中。

根据获得的数据，所有抗CD47/PD-L1抗体都显示了与对照单特异性抗CD47抗体（克隆B6H12）可比较或更高的EC50值。

实施例19. 在关于通过人巨噬细胞的吞噬作用刺激的测试中，抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体针对CD47/PD-L1的活性的比较

为了执行ADCP（抗体依赖性细胞吞噬作用），使用了在其表面上具有PD-L1/CD47受体的MDA-MB-231细胞系和人巨噬细胞。

获得人巨噬细胞

通过密度梯度分离，从健康供体的静脉血中分离外周血单核细胞（PBMC）。使用用于分离人CD14阳性人细胞级分的试剂盒（Miltenyi Biotec），分离人血单核细胞。24孔板的孔用于在700 μl含有10% FBS、100 ng/ml GM-CSF（Peprotech）的RPMI-1640中，在37℃和5% CO₂下培养350,000个单核细胞/孔3天。在培养的第4天时，将培养基更换为每孔含有700 μlRPMI-1640的新培养基，所述RPMI-1640含有10% FBS、100 ng/ml GM-CSF（Peprotech）、50ng/ml IFNγ（Peprotech）和10 ng/ml LPS（Sigma），将细胞在37℃和5% CO₂下培养另外3天。

靶细胞的制备

MDA-MB-231细胞在含有10% FBS（胎牛血清）的DMEM培养基中在37℃和5% CO₂下培养。细胞通过胰蛋白酶从塑料表面取下，并且重悬浮于含有10% FBS的DMEM中。加入钙黄绿素AM至5 μM的浓度。在30分钟后，细胞用含有10% FBS的DMEM洗掉过量的钙黄绿素AM两次。在含有10% FBS的DMEM中制备浓度为10⁵个细胞/ml的靶细胞悬浮液。

进行ADCP测定

从含有巨噬细胞的板孔中选择培养基，将500 μl含有10% FBS和20 μg/ml测试抗体的RPMI-1640培养基加入孔中。将500 μl/孔的靶细胞悬浮液加入孔中。使板在37℃和5% CO₂下温育3小时。然后选择培养基，通过TrypLE Express试剂从塑料表面取下细胞，并且用荧光标记的抗CD14抗体染色。在流式细胞仪上分析染色细胞的悬浮液。

ADCP功效通过下式进行计算：

，其中

钙黄绿素⁺CD14⁺是含有钙黄绿素染料的CD14阳性细胞的数目。

CD14⁺是所有CD14阳性细胞的数目

结果显示于图11中。

根据获得的数据，许多抗CD47/PD-L1抗体显示在刺激人巨噬细胞对MDA-MB-231细胞系的吞噬作用方面的功效，其与对照单特异性抗CD47抗体（克隆B6H12）的功效可比较。

实施例20. 抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体候选物对人红细胞血凝的影响的比较

人红细胞用于分析抗体引起血凝的能力。

红细胞悬浮液的制备

血液样品从健康供体的静脉中抽取到真空肝素管内。将9 ml血液转移到50 ml离心管内。在室温下，用不含Ca2+和Mg2+的DPBS，将血液稀释至30 ml。将悬浮液在800g下离心10分钟，倾析上清液。用不含Ca2+和Mg2+的DPBS和离心，将细胞洗涤程序重复两次。然后将300 μl细胞沉淀重悬浮于30 ml DPBS中，得到1%的红细胞悬浮液。

进行血凝测定

将测试抗体在DPBS中稀释至20 µg/ml的浓度。将100 μl抗体稀释物和红细胞悬浮液在96孔圆底板中混合。使板在CO2温育箱中在37℃下温育16小时。使用任意4加号标度视觉上记录结果。显著阳性的结果是2个加号及更多个。结果显示于表10。

表10. 在抗CD47/PD-L1抗体的存在下的血凝反应。“–”指示不存在凝集。

根据获得的数据，抗CD47/PD-L1抗体无一引起血凝，而参考抗CD47单克隆抗体（克隆B6H12）引起显著凝集，这是由于该抗体的二价性质，以及因而与位于不同红细胞上的两个CD47分子相互作用的能力所致。

实施例21. 双特异性抗CD47/PD-L1抗体的补体依赖性细胞毒性（CDC）的分析。

为了执行CDC分析（补体依赖性细胞毒性），在其表面上含有PD-L1和CD47受体的MDA-MB-231细胞系用作靶细胞。

靶细胞的制备

在补充有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养MDA-MB-231培养物。

细胞通过胰蛋白酶从塑料表面取下，并且以1×10⁶个细胞/ml的浓度悬浮于含有0.1% BSA的DMEM培养基中。

测试抗体稀释物的制备

所有测试的抗CD47/PD-L1抗体都用含有0.1% BSA的DMEM培养基稀释至100 μg/ml的浓度。以8倍的增量制备了一系列连续稀释物。测试抗体的浓度为（ng/ml）：100000；12500；1562,5；195,3；24,4；3,05；0,38；0,04；0,005。

进行CDC测试

将人补体解冻并且1：4溶解于含有0.1% BSA的DMEM培养基中。

将50 μl/孔的测试抗体的每种稀释物加入96孔板的孔中，对于每个抗体样本，加入50 μl/孔的补充有0.1% BSA的培养基——细胞对照，加入150 μl/孔的含有0.1% BSA的DMEM培养基——培养基对照。

将50 μl/孔的MDA-MB-231细胞的悬浮液加入含有测试抗体和细胞对照的每个孔中。

将50 μl/孔的稀释补体倒入含有测试抗体和细胞对照的所有孔中。将板在定轨振荡器上在室温下振荡2-4分钟，在37ºC下在CO₂温育箱中放置2-3小时。

将15 µl Alamar Blue试剂加入测试板的孔中。将板在室温下在定轨振荡器上振荡10–20分钟。使板在CO₂温育箱中进一步温育18-24小时。

将板在室温下在定轨振荡器上振荡10–20分钟。

通过使用板式荧光计，在544/590 nm的激发/发射波长下，使用相对荧光单位测量荧光。所获得的荧光信号与活细胞的数目成比例。结果显示于图12-15中。

根据获得的数据，测试抗体不引起MDA-MB-231细胞系的补体依赖性细胞毒性（CDC）。

实施例22. 抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体针对携带PD-L1膜受体的细胞培养物的拮抗活性的分析。

为了分析抗PD-L1/CD47抗体针对PD-L1受体的拮抗活性，评估了在与PD-L1生产细胞的共培养期间，所述抗体重新激活Jurkat-PD1-NFAT-Luc报道细胞系中的萤光素酶信号的能力。

PD-L1生产细胞的制备

细胞通过胰蛋白酶从塑料表面取下，并且以1*10⁵个细胞/ml的浓度悬浮于含有10% FBS和20 ng/ml干扰素γ的DMEM培养基中。然后将200 μl/孔的细胞悬浮液加入白色96孔板的孔中，并且在CO₂温育箱中在37℃和5% CO₂下温育48小时。

测试抗体稀释物的制备

所有测试的抗CD47/PD-L1抗体都用含有10% FBS的RPMI-1640培养基稀释至5 μg/ml的浓度。制备了以3倍的增量的一系列连续稀释物。测试抗体的浓度为（ng/ml）：2500；833,3；277,7；92,5；30,8；10,2；3,4；1,1。

● Jurkat-PD1-NFAT-Luc细胞的制备

● 在实验当天，制备在含有10% FBS的RPMI-1640培养基中浓度为2.5*10⁶个细胞/ml的Jurkat-PD1-NFAT-Luc细胞的悬浮液。

●激活抗体溶液的制备

● 在实验当天，制备了激活抗体的10倍混合物（在含有10% FBS 的RPMI-1640培养基中，4 μg/ml的抗CD3；4 μg/ml的抗CD28；16 μg/ml的抗小鼠）。

●进行测试

● 从含有MDA-MB-231细胞的板中去除生长培养基。将40 μl/孔的抗体稀释物加入含有细胞的孔中。将40 μl/孔的含有10% FBS的RPMI 1640培养基加入对照孔（不含测试抗体的细胞、不含测试抗体和激活抗体的细胞）中，并且在室温下温育30分钟。

● 然后将40 μl/孔的Jurkat-PD1-NFAT-Luc细胞悬浮液加入所有孔中。然后，将10 μl/孔的激活抗体的10倍溶液加入所有孔中，除了对照孔“不含测试抗体和激活抗体的细胞”之外。使细胞在CO₂温育箱中在37℃和5% CO₂下温育6小时。

● 将萤光素酶底物One-Glo Luciferase Assay System “Promega”以1：1的比率引入所有孔内（90 μl/孔）。在5-10分钟后，使用板阅读器测量发光水平。

● 根据获得的数据，测试抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体以及对照抗PD-L1单特异性抗体，是PD-L1依赖性信号传导途径的拮抗剂，并且因此，可以刺激针对携带PD-L1受体的细胞的T细胞依赖性细胞毒性。

实施例23. 抗PD-L1/抗CD47双特异性抗体产物的同质性分析。

通过具有UV检测器的尺寸排阻HPLC（SEC HPLC）分析双特异性抗体的同质性。层析在HPLC系统（Agilent）上，在柱Tosoh TSK-Gel G3000SWXL (7.8 mm x 30 cm，订货号08541)和预柱Tosoh TSKgel Guard SWXL (6.0 mm x 4.0 cm，具有7 μm的粒径，订货号08543)上执行。检测在220和280 nm的波长下执行。图17显示了基于VHH47Opt2（参见实施例12）的产物BCD106-02-013的示例性HPLC谱。根据测试结果，可以得出结论，分子BCD106-02-013生成的产物在单体的聚集组成上为93%同质的，并且可应用于后续的体外和体内测试。

Claims

1.一种单克隆抗体，其与CD47和PD-L1特异性结合，包含针对CD47的一个结合位点以及针对PD-L1的至少一个结合位点。

2.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述抗体是全长抗体或其抗原结合片段。

3.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述抗体包括针对PD-L1的一个或两个结合位点。

4.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述针对CD47的结合位点抑制所述CD47受体和SIRPα配体的相互作用，和/或针对PD-L1的结合位点抑制PD-L1与PD-1受体的相互作用。

5.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述针对CD47的结合位点包括重链可变结构域，所述重链可变结构域包含CDR1、CDR2、CDR3序列，其中CDR1是与选自SEQ ID NO：1-4的序列至少80%同源的序列，其中CDR2是与选自SEQ ID NO：6-15的序列至少80%同源的序列，其中CDR3是与选自SEQ ID NO：17-20的序列至少80%同源的序列。

6.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述针对CD47的结合位点包括重链可变结构域，所述重链可变结构域含有CDR1、CDR2、CDR3序列，其中CDR1是选自SEQ ID NO：1 - 4的序列，其中CDR2是选自SEQ ID NO：6 - 15的序列，其中CDR3是选自SEQ ID NO：17 - 20的序列。

7.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述针对CD47的结合位点包括根据权利要求4的重链可变结构域，以及包含CDR1、CDR2、CDR3序列的轻链可变结构域，其中CDR1是与选自SEQID NO：22 - 34的序列至少80%同源的序列，其中CDR2是与选自SEQ ID NO：36 - 48的序列至少80%同源的序列，其中CDR3是与选自SEQ ID NO：50 – 64的序列至少80%同源的序列。

8.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述针对CD47的结合位点包括根据权利要求4的重链可变结构域，以及包含CDR1、CDR2、CDR3序列的轻链可变结构域，其中CDR1是选自SEQID NO：22 - 34的序列，CDR2是选自SEQ ID NO：36 - 48的序列，CDR3是选自SEQ ID NO：50- 64的序列。

9.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述针对CD47的结合位点包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：66 - 88的序列至少90%同源的序列，所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：89 - 106的序列至少90%同源的序列。

10.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述针对CD47的结合位点包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO：66-88的序列，所述轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO：89 - 106的序列。

11.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述针对PD-L1的结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与如下的序列至少80%同源的序列：SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：21，所述轻链可变结构域包含与如下的序列至少80%同源的序列：SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：65。

12.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述针对PD-L1的结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含下述序列：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：21，所述轻链可变结构域包含下述序列：SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：49和SEQ IDNO：65。

13.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述针对CD47的结合位点是Fab、scFv、scFab或者分离的VH或VHH单结构域。

14.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述针对PD-L1的结合位点是Fab、scFv、scFab或者分离的VH或VHH单结构域。

15.根据权利要求1的抗体，其特征在于它引起对在表面上携带CD47和/或PD-L1抗原的细胞的抗体依赖性细胞毒性、巨噬细胞介导的吞噬作用和/或T细胞介导的细胞毒性、比率。

16.根据权利要求1的抗体，其特征在于它包括包含至少一个突变或修饰的Fc片段，与不含突变或修饰的相同抗体相比，所述突变或修饰增加了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和/或补体依赖性细胞毒性（CDC）。

17.根据权利要求1-16中任一项的抗体，其用作用于癌症治疗的药物。

18.一种核酸，其编码根据权利要求1-16中任一项的抗体。

19.根据权利要求18的核酸，其中所述核酸是DNA。

20.一种表达载体，其包含根据权利要求18-19中任一项的核酸。

21.一种获得宿主细胞以产生根据权利要求1-16中任一项的抗体的方法，其包括用根据权利要求20的载体转化所述细胞。

22.一种获得根据权利要求1-16中任一项的抗体的宿主细胞，其包含根据权利要求18-19中任一项的核酸。

23.获得根据权利要求1-16中任一项的抗体的方法，其包括：在足以获得指定抗体的条件下，在培养基中培养根据权利要求22的宿主细胞，必要时，随后对所获得抗体进行分离和纯化。

24.一种用于预防或治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的药物组合物，其包含与一种或几种药学上可接受的赋形剂组合的根据权利要求1-16中任一项的抗体。

25.根据权利要求24的药物组合物，其预期用于预防或治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症，所述疾病或病症选自（HNSCC）头颈部鳞状细胞癌、子宫颈癌、原发灶不明癌、成胶质细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC（三阴性乳腺癌）、CRC（结肠直肠癌）、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC（非小细胞肺癌）、肾癌、卵巢癌、MSI CRC（具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌）、白血病（急性白血病或成髓细胞性白血病）、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、肉瘤、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、T细胞和B细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、急性成髓细胞性白血病、难治性非霍奇金B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胰腺癌和高危骨髓增生异常综合征。

26.一种治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的方法，其包括将根据权利要求1-16中任一项的抗体或根据权利要求24的药物组合物以治疗有效量施用于需要此类治疗的受试者。

27.根据权利要求26的治疗方法，其中所述疾病或病症选自（HNSCC）头颈部鳞状细胞癌、子宫颈癌、原发灶不明癌、成胶质细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC（三阴性乳腺癌）、CRC（结肠直肠癌）、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC（非小细胞肺癌）、肾癌、卵巢癌、MSI CRC（具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌）、白血病（急性白血病或成髓细胞性白血病）、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞和B细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、急性成髓细胞性白血病、难治性非霍奇金B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、急性成髓细胞性白血病和高危骨髓增生异常综合征。

28.一种用于抑制需要此类抑制的受试者中的PD-L1和/或CD47的生物活性的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-16中任一项的抗体。

29.根据权利要求1-16中任一项的抗体或根据权利要求24的药物组合物用于针对由PD-L1和CD47介导的疾病或病症治疗需要此类治疗的受试者的用途。

30.根据权利要求29的抗体的用途，其中所述疾病或病症选自（HNSCC）头颈部鳞状细胞癌、子宫颈癌、原发灶不明癌、成胶质细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC（三阴性乳腺癌）、CRC（结肠直肠癌）、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC（非小细胞肺癌）、肾癌、卵巢癌、MSI CRC（具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌）、白血病（急性白血病或成髓细胞性白血病）、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞和B细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、急性成髓细胞性白血病、难治性非霍奇金B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、急性成髓细胞性白血病和高危骨髓增生异常综合征。