CN111788223A - 抗IL-5Rα的单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程领域,并且提供了与IL‑5Rα特异性结合的抗体。本发明还涉及编码所述抗体的DNA、相应的表达载体和生产方法,以及使用所述抗体的治疗方法。
Description
发明领域
本发明涉及生物技术,特别涉及抗体或其抗原结合片段,及其用途。更具体而言,本发明涉及特异性结合IL-5Rα(白细胞介素5受体α链)的单克隆抗体。本发明还涉及编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸、表达载体、用于制备所述抗体的方法,以及所述抗体在与IL-5Rα相关的疾病或病症的治疗中的用途。
发明背景
白细胞介素5(IL-5),一种促炎细胞因子,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子组,是四螺旋蛋白。白细胞介素5一般由Th2细胞和肥大细胞生成。IL-5刺激活化的B淋巴细胞的增殖和分化,诱导免疫球蛋白合成转换为IgA。嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的许多功能由白细胞介素5(IL-5)的作用介导。已知IL-5促进嗜酸性粒细胞的分化和活化,并且还通过抑制细胞凋亡来增加其生存力[Lotvall J.,Pullertis T. Treating asthma with Anti-IgE orAnti IL-5. Curr Pharm Des. 1999;5:757–70,以及Kolbeck R.,Kozhich A.,Koike M.等人Medi-563,a humanized anti-IL-5 receptor alpha mAb with enhanced antibody-dependent cell mediated cytotoxicity function. J Allergy Clin Immunol. 2010;125(1):1344–53]。
IL-5通过在人嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞前体和成熟嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞上表达的特异性受体(IL-5R)起作用。IL-5R由独特的α链(IL-5Ra/CD125,细胞外结构域)和IL-3/GM-CSF受体共同的β链(bc/CD131)组成,其本身并不结合配体,但增加IL-5对同义受体的亲和力,并且直接参与信号转导[Tetsuya A.,Rafeul A. The mechanism of IL-5 signal transduction American Journal of Physiology - Cell Physiology,1998年9月1日出版,第275卷,第3期,C623-C633]。
嗜酸性粒细胞增多症的发展与早期骨髓嗜酸性粒细胞前体细胞上IL-5R的选择性表达有关。因此,抑制IL-5与其细胞受体之间的相互作用似乎对于压制嗜酸性粒细胞增多症是最优选的。
嗜酸性粒细胞增多症压制的治疗意义是由于许多病理过程中高水平的嗜酸性颗粒细胞。因此,支气管哮喘患者的呼吸道中以及嗜酸性粒细胞性食管炎患者的食管上皮中的嗜酸性粒细胞计数的增加是所述疾病的病理生理学的基础。嗜酸性粒细胞释放促炎介质,例如嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)和白三烯。
单克隆抗体贝那利珠单抗是根据现有技术已知的,其结合IL-5Rα并且从而抑制受体与配体的相互作用。所述单克隆抗体显著消耗血液和肺组织中的嗜酸性粒细胞。贝那利珠单抗是人源化单克隆抗体(IgG1/k),其衍生自使用杂交瘤技术产生的鼠抗体[Koike M.,Nakamura K.等人Establishment of humanized anti-interleukin-5 receptor alphachain monoclonal antibodies having a potent neutralizing activity. HumAntibodies 2009,18(1-2):17-27]。所述抗体以高亲和力(KD = 11 pm)与IL-5Rα结合,并且抑制IL-5依赖性细胞增殖(IC50 = 0.3 nm)[Kolbeck R.,Kozhich A等人MEDI-563,ahumanized anti-interleukin 5 receptor-alpha monoclonal antibody,with enhancedantibody-dependent cell-mediated cytotoxicity function. J Allergy ClinImmunol 2010,125(6):1344-53.e2]。贝那利珠单抗在无岩藻糖基化的细胞系中产生,并且这样实现了寡糖核中岩藻糖的不存在,导致与可溶性人FcγRIIIa的结合中的5-10倍改善,并且从而增加抗体依赖性细胞毒性[Shinkawa T.,Nakamura K.等人The absence offucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine ofhuman IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancingantibody-dependent cellular cytotoxicity. J Biol Chem 2003,278(5):3466-73]。所述抗体处于3期临床试验中。抗体贝那利珠单抗已在国际申请WO9710354(A1)中进行描述。
与IL-5R和人CD3e结合的双特异性抗体(ND003)也是现有技术中已知的。所述抗体处于临床前研究阶段,并且在国际申请WO2015172800和WO2015058861中进行描述。
由上文可知,有效结合IL-5Rα并抑制IL-5Rα介导的激活的新抗体的产生是重要的。
我们已开发了全人单克隆抗体mAb(BCD-133),其以与贝那利珠单抗可比较的亲和力结合人IL-5Rα,并且抑制IL-5Rα介导的活化。与贝那利珠单抗的情况一样,BCD-133具有增强的抗体依赖性细胞毒性,因此允许激活针对具有IL-5受体的细胞的免疫应答。抗体BCD-133与IL-5Rα选择性结合,并且是IL-5Rα介导的免疫能力细胞的活化和相关特异性炎症的有效抑制剂。细胞测试显示抗体BCD-133活性超过贝那珠单抗的作用。此外,BCD-133是从头获得的全人抗体;这一事实允许减少免疫原性风险,并且不需要针对与人蛋白的亲和力的增加的进一步遗传转化,其可以导致结合亲和力的丧失。
发明概述
本发明涉及结合分子,例如针对与IL-5Rα结合的抗体。此类抗体可以用于治疗由IL-5和其细胞受体的相互作用介导的疾病或病症。
在一个方面,本发明涉及单克隆抗体或其抗原结合片段,其特异性结合IL-5Rα,并且包含重链可变结构域和轻链可变结构域,所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:3的序列至少80%同源的氨基酸序列,所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:8的序列至少80%同源的氨基酸序列,即SEQ ID NO:3和8的氨基酸序列可以包含1或2个氨基酸的氨基酸取代。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域,其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域,其包含与SEQ ID NO:1-3的序列至少80%同源的氨基酸序列,即SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列可以包含1或2个氨基酸的氨基酸取代。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域,其包含由SEQ ID NO:1-3表示的氨基酸序列。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域,其包含与SEQ ID NO:6-8的序列至少80%同源的氨基酸序列,即SEQ ID NO:6-8的氨基酸序列可以包含1或2个氨基酸取代。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域,其包含由SEQ ID NO:6-8表示的氨基酸序列。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域,所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:1-3的序列至少80%同源的氨基酸序列,所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:6-8的序列至少80%同源的氨基酸序列,即SEQ IDNO:1-3和6-8的氨基酸序列可以包含1或2个氨基酸取代。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包括重链可变结构域和轻链可变结构域,所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列,所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:6-8的氨基酸序列。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域,其包含与选自SEQ ID NO:4-5的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域,其包含选自SEQ ID NO:4-5的氨基酸序列。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域,其包含与选自SEQ ID NO:9-10的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域,其包含选自SEQ ID NO:9-10的氨基酸序列。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域,所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:4-5的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列,所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:9-10的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域,所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO:4-5的氨基酸序列,所述轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO:9-10的氨基酸序列。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链,所述重链包含与选自SEQ ID NO:11-12的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列,所述轻链包含与选自SEQ ID NO:13-14的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列。
在一个实施方案中,单克隆抗体或其抗原结合片段包括:重链和轻链,所述重链包含选自SEQ ID NO:11-12的氨基酸序列,所述轻链包含选自SEQ ID NO:13-14的氨基酸序列。
在一个实施方案中,IL-5Rα特异性抗体是全长IgG抗体。
在一个实施方案中,IL-5Rα特异性全长IgG单克隆抗体具有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
在一个实施方案中,IL-5Rα特异性全长IgG单克隆抗体具有人IgG1同种型。
在一个方面,本发明涉及编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。
在一个实施方案中,核酸是DNA。
在一个实施方案中,核酸包含编码抗体的重链且与选自SEQ ID NO:15-16的序列至少90%同源的核苷酸序列、和/或编码抗体的轻链且与选自SEQ ID NO:17-18的序列至少90%同源的核苷酸序列。
在一个实施方案中,核酸包含编码抗体的重链的核苷酸序列,所述重链选自SEQID NO:15-16,和/或编码抗体的轻链、选自SEQ ID NO:17-18的核苷酸序列。
在一个方面,本发明涉及包含所述核酸的表达载体。
在一个方面,本发明涉及用于产生宿主细胞的方法,所述宿主细胞用于产生所述抗体或其抗原结合片段,所述方法包括用所述载体转化细胞。
在一个方面,本发明涉及用于制备所述抗体或其抗原结合片段,并且包含所述核酸的宿主细胞。
在一个方面,本发明涉及用于产生所述抗体或其抗原结合片段的方法,并且包括在足以产生所述抗体的条件下,在生长培养基中培养所述宿主细胞,必要时,随后为所获得抗体的分离和纯化。
在一个方面,本发明涉及用于预防或治疗由IL-5Rα介导的疾病或病症的药物组合物,其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的所述抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中,药物组合物预期用于预防或治疗由IL-5Rα介导的疾病或病症,所述疾病或病症选自哮喘,例如嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘),例如重度嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘);COPD(慢性阻塞性肺疾病);Churg-Strauss综合征;嗜酸性粒细胞性食管炎;嗜酸性粒细胞性胃肠炎。
在一个方面,本发明涉及预期用于预防或治疗由IL-5Rα介导的疾病或病症的药物组合,所述药物组合包含所述抗体或其抗原结合片段和至少一种不同的治疗活性化合物。
在一个实施方案中,药物组合预期用于预防或治疗由IL-5Rα介导的疾病或病症,所述疾病或病症选自哮喘,例如嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘),例如重度嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘);COPD(慢性阻塞性肺疾病);Churg-Strauss综合征;嗜酸性粒细胞性食管炎;嗜酸性粒细胞性胃肠炎。
在一个实施方案中,药物组合包含选自小分子、抗体或类固醇激素例如皮质类固醇的治疗活性化合物。
在一个方面,本发明涉及用于抑制需要此类抑制的受试者中IL-5Rα的生物活性的方法,其包括施用有效量的所述抗体或其抗原结合片段。
在一个方面,本发明涉及用于治疗由IL-5Rα介导的疾病或病症的方法,其包括在需要此类治疗的受试者中施用以治疗有效量的所述抗体或其抗原结合片段或所述药物组合物。
在一个实施方案中,所述疾病或病症选自哮喘,例如嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘),例如重度嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘);COPD(慢性阻塞性肺疾病);Churg-Strauss综合征;嗜酸性粒细胞性食管炎;嗜酸性粒细胞性胃肠炎、高嗜酸性粒细胞综合征。
在一个方面,本发明涉及所述抗体或其抗原结合片段或所述药物组合物用于治疗需要此类治疗的受试者中由IL-5Rα介导的疾病或病症的用途。
在一个实施方案中,所述疾病或病症选自哮喘,例如嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘),例如重度嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘);COPD(慢性阻塞性肺疾病);Churg-Strauss综合征;嗜酸性粒细胞性食管炎;嗜酸性粒细胞性胃肠炎、高嗜酸性粒细胞综合征。
附图简述
图1. 用于瞬时生成具有Fc融合蛋白的抗原的质粒图谱。
图2. 用于瞬时生成具有C末端标签ЕРЕ A(FE)的抗原的质粒图谱。
图3. 用于瞬时生成具有His-b标签的抗原的质粒图谱。
图4. 抗原在还原条件10% SDS-PAGE下的电泳图谱。
图5. 抗原在还原条件10% SDS-PAGE下的电泳图谱。
图6. 抗原和抗体在非还原条件下(7.5% SDS-PAGE)的电泳图谱。
图7. 组合的首次用于实验的人文库的合成方案。
图8. 用于克隆Fab噬菌体展示文库的噬菌粒图谱。
图9. 用于Fab生产的表达质粒图谱。
图10. 选择后文库的多克隆噬菌体关于特异性和非特异性抗原的免疫酶分析。
图11. 在Octet RED 384装置(BCD 133-03-002)上,抗体与IL-5Ra相互作用的传感图。
图12. 在Octet RED 384装置(BCD 133-03-020)上,抗体与IL-5Ra相互作用的传感图。
图13. 在Octet RED 384装置(BCD133-03-021)上,抗体与IL-5Ra相互作用的传感图。
图14. 抗体依赖性细胞毒性对抗体浓度的依赖性。
图15. 在与抗体贝那利珠单抗的比较分析中的半数最大有效浓度(EC50)的值。
图16. 使用Octet RED 384装置(BCD133-03-002),抗体与猕猴IL-5Ra相互作用的传感图。
图17. 在Octet RED 384装置(BCD133-03-020)上,抗体与猕猴IL-5Ra相互作用的传感图。
图18. 在Octet RED 384装置(BCD133-03-021)上,抗体与猕猴IL-5Ra相互作用的传感图。
图19. BCD-133和IL-5Ra复合物的3D空间模型。
图20. BCD-133和IL-5Ra复合物的3D空间模型。
图21. 平均粒度(Z-平均值)相对于温度的图。
图22. 平均粒度(Z-平均值)相对于温度的图。
图23. 以缩小比例的BCD-133的组合层析图。蓝色 - 完整的,红色 - 在50°C下在20mM乙酸盐,pH = 5.0中温育72小时。波长是220 nm。
图24. 以放大比例的BCD-133的组合层析图。蓝色 - 完整的,红色 - 在50°C下在20mM乙酸盐,pH = 5.0中温育72小时。波长是220 nm。
发明公开内容
定义和一般方法
除非另有定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
进一步地,除非上下文另有要求,否则单数术语应包括复数,且复数术语应包括单数。通常,本文所述的细胞培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、有机合成化学、医学和药学化学、以及蛋白质和核酸的杂交和化学的分类和方法是众所周知的,并且由本领域技术人员广泛使用。酶反应和纯化方法根据制造商的说明书,如本领域中常见的或如本文所述的执行。
与抗体有关的定义
如本文使用的,术语IL-5R或“白细胞介素5受体”是结合白细胞介素5(IL-5)的蛋白质。白细胞介素5受体(IL-5R)的表达主要仅在嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞的表面上观察到。IL-5R由独特的α链(IL-5Ra/CD125,细胞外结构域)以及与IL-3和GM-CSF受体共享的β链(bc/CD131)组成,其本身并不结合配体,但增加IL-5对同义受体的亲和力,并且直接参与信号转导。
这种基因的扩增和/或其蛋白质的高表达已在许多自身免疫性疾病中发现,所述疾病包括哮喘,例如嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘),例如重度嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘);COPD(慢性阻塞性肺疾病);Churg-Strauss综合征;嗜酸性粒细胞性食管炎;嗜酸性粒细胞性胃肠炎或高嗜酸性粒细胞综合征。
术语“结合分子”包括抗体和免疫球蛋白。
如本文使用的,术语“抗体”或“免疫球蛋白”(Ig)包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。术语“抗体”指包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白,或抗原结合部分。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。已知的是由希腊字母表示的五种类型的哺乳动物Ig重链:α,δ,ε,γ和μ。存在的重链类型限定了抗体的种类;这些链分别在IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体中发现。不同的重链在大小和组成方面不同;α和γ含有大约450个氨基酸,而μ和ε具有大约550个氨基酸。每条重链具有两个区域,恒定区和可变区。恒定区在相同同种型的所有抗体中都是等同的,但在不同同种型的抗体中不同。重链γ、α和δ具有由三个恒定结构域CH1、СН2和CH3(成一条线)组成的恒定区,以及用于增加柔性的铰链区(Woof J.,Burton D.,Nat Rev Immunol4,2004,cc.89-99);重链μ和ε具有由四个恒定结构域CH1、СН2、CH3和CH4组成的恒定区。在哺乳动物中,已知的是由lambda(λ)和kappa(κ)表示的仅两种类型的轻链。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链的大约长度是211至217个氨基酸。优选地,轻链是kappa(κ)轻链,并且恒定结构域CL优选是C kappa(κ)。
根据本发明的“抗体”可以具有任何种类(例如,IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,优选IgG)、或亚类(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2,优选IgG1)。
VL和VH区可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区,其散布在称为构架区(FR)的更保守区域之间。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成,从氨基末端到羧基末端按下述次序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合,所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
如本文使用的,术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简单地“抗体部分”或“抗体片段”)指抗体的一个或多个片段,其保留与抗原特异性结合的能力。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。包括在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH 1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab')2片段,包含由在铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段;(v)由VH/VHH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546);以及(vi)提取的互补决定区(CDR)。另外,Fv片段的两个区域VL和VH由分别的基因编码,它们可以使用合成接头使用重组方法进行连接,所述合成接头致使其能够接受单条蛋白质链,在所述链中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv);参见例如,Bird等人(1988)Science 242:423-426;и Huston等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。假定此类单链分子也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段,并且以与完整抗体相同的方式筛选片段。
优选地,本发明的抗原结合部分或整个抗体抗原结合部分的CDR衍生自小鼠、美洲驼或人供体文库,或者基本上人起源的,其中某些氨基酸残基被改变,例如,被不同的氨基酸残基取代,以便优化特异性抗体的特性,例如KD、koff、IC50、EC50、ED50。优选地,本发明的抗体的构架区是人起源的或基本上人起源的(至少80、85、90、95、96、97、98或99%人起源的)。
在其它实施方案中,本发明的抗原结合部分可以衍生自其它非人物种,包括小鼠、美洲驼、兔、大鼠或仓鼠,但不限于此。可替代地,抗原结合区可以衍生自人物种。
术语“可变结构域”指可变结构域的某些部分在抗体中的序列方面极大不同的事实。V结构域介导抗原结合,并且决定每种特定抗体对于其特定抗原的特异性。然而,可变性在可变结构域的110个氨基酸跨度中并非均匀分布的。相反,V区由15-30个氨基酸的称为构架区(FR)的不变片段组成,所述不变片段由称为“高变区”或CDR的极度可变性的较短区域分开。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR,在很大程度上采用β-折叠构型,由三个高变区连接,所述三个高变区形成连接β-折叠结构,并且在一些情况下构成β-折叠结构的部分的环。每条链中的高变区通过FR紧密结合在一起,并且与另一条链中的高变区一起,促成抗体的抗原结合位点的形成。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合,而是显示出各种效应子功能,例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中的抗体参与。
如本文使用的,术语“高变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区一般包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基和/或来自“高变环”的那些残基。
在某些情况下,可能还期望改变一个或多个CDR氨基酸残基,以便改善与靶表位的结合亲和力。这称为“亲和力成熟”,并且可以任选地与人源化结合执行,例如在其中抗体的人源化导致减少的结合特异性或亲和力,并且不能通过单独的回复突变充分改善结合特异性或亲和力的情况下。各种亲和力成熟方法是本领域已知的,例如由Burks等人,Proc NatlAcad Sci USA,94:412–417(1997)描述的体外扫描饱和诱变方法,以及通过Wu等人,ProcNatl Acad Sci USA 95:6037 6042(1998)的逐步体外亲和力成熟方法。
“构架区”(FR)是除CDR残基外的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4的四个FR。如果CDR根据Kabat限定,则轻链FR残基大约位于残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)和98-107(LCFR4)处,而重链FR残基大约位于重链中的残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)和103-113(HCFR4)处。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基,则轻链FR残基大约位于轻链中的残基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)和97-107(LCFR4)处,而重链FR残基大约位于重链残基中的残基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)和102-113(HCFR4)处。在一些情况下,当CDR包含来自如由Kabat定义的CDR的氨基酸和高变环的氨基酸两者时,FR残基将相应地进行调整。例如,当CDRH1包括氨基酸H26-H35时,重链FR1残基在位置1-25处,而FR2残基在位置36-49处。
“结合”靶抗原的本发明的抗体指能够以足够的亲和力结合抗原的抗体,使得该抗体可以用作靶向表达所述抗原的蛋白质或细胞的诊断剂和/或治疗剂,并且与其它蛋白质轻微地交叉反应。根据分析方法:荧光激活细胞分选(FACS)、放射性免疫测定(RIA)或ELISA,在此类实施方案中,抗体与非靶蛋白结合的程度小于抗体与特异性靶蛋白结合的10%。关于抗体与靶分子的结合,术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异性针对”特定多肽或特定多肽靶上的表位,意指显著地(可测量地)不同于非特异性相互作用的结合(例如,在bH1-44或bH1-81的情况下,非特异性相互作用是与牛血清白蛋白、酪蛋白、胎牛血清或中性抗生物素蛋白的结合)。
特异性结合可以例如通过与对照分子的结合相比测定分子的结合来测量。例如,特异性结合可以通过与类似于靶的对照分子(例如过量的未标记靶)竞争来测定。在这种情况下,如果标记的靶与探针的结合被过量的未标记靶竞争性抑制,则指示特异性结合。如本文使用的,术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异性针对”特定多肽或特定多肽靶上的表位,可以通过对于靶具有以下Kd的分子进行描述:至少约200 nM、或至少约150 nM、或至少约100 nM、或至少约60 nM、或至少约50 nM、或至少约40 nM、或至少约30 nM、或至少约20 nM、或至少约10 nM、或至少约8 nM、或至少约6 nM、或至少约4 nM、或至少约2 nM、或至少约1 nM或更大。在一个实施方案中,术语“特异性结合”指其中分子结合特定多肽上的特定多肽或表位,而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位的结合。
如本文使用的,术语“Ka”预期指特定抗体-抗原相互作用的结合速率,而术语“Kd”预期指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。
“结合亲和力”一般指分子(例如,抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如,抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明,否则“结合亲和力”指固有的(特征性的、真实的)结合亲和力,其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对于其结合配偶体Y的亲和力一般可以由解离常数(Kd)表示。优选的Kd值是约200nM、150 nM、100 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、8 nM、6 nM、4 nM、2 nM、1 nM或更小。亲和力可以通过本领域已知的常见方法,包括本文所述的方法来测量。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原并且趋于容易解离,而高亲和力抗体一般更快地结合抗原并且趋于保持结合更久。测量结合亲和力的各种方法是本领域已知的,所述方法中的任一种均可以用于本发明的目的。
在一个实施方案中,通过使用表面等离振子共振测定,使用BIAcore™-2000或BIAcore™-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.),在25℃下,用以~10个应答单位(RU)的固定化抗原CM5芯片,来测量“Kd”或“Kd值”。简言之,根据制造商的说明书,用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来激活羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。抗原用10 mM乙酸钠pH 4.8稀释成5 μg/ml(~0.2 μM),然后以5 μl/分钟的流速注入,以达到大约10个应答单位(RU)的偶联蛋白。在抗原注入之后,注入1M乙醇胺溶液以封闭未反应的基团。对于动力学测量,将Fab的两倍连续稀释物(例如0.78 nM至500 nM)在25°C下以大约25 μl/分钟的流速注入具有0.05% Tween 20的PBS(PBST)中。通过同时拟合结合和解离传感图,使用简单的一对一兰米尔结合模型(BIAcore Evaluation Software版本3.2),来计算结合速率(kon)和离开速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比率koff/kon。参见例如,Chen,Y.等人,(1999)J. Mol. Biol. 293:865-881。如果结合速率通过上文的表面等离振子共振测定超过106 M−1 s−1,则可以使用荧光猝灭技术来测定结合速率,所述荧光猝灭技术测量在渐增浓度的抗原的存在下,在25℃下,在PBS,pH 7.2中的20 nM抗抗原抗体溶液(Fab形式)的荧光发射强度(激发 = 295 nm;发射 = 340 nm,16 nm带通)中的增加或降低,如在分光光度计中测量的,所述分光光度计例如具有搅拌比色杯的配备停流的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)。
术语“koff”指结合分子和抗原之间的特定相互作用的离开速率常数。离开速率常数koff可以使用生物层干涉测量法,例如使用Octet™系统进行测量。
还可以通过使用上文表面等离振子共振测定,使用BIAcore™-2000或BIAcore™-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.),在25℃下,用以~10个相对单位(应答单位,RU)的固定化抗原CM5芯片来测量根据本发明的“结合速率”或“Kon”。简言之,根据制造商的说明书,用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来激活羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。抗原用10 mM乙酸钠pH4.8稀释成5 μg/ml(~0.2 μM),然后以5 μl/分钟的流速注入,以达到大约10个应答单位(RU)的偶联蛋白。在抗原注入之后,注入1M乙醇胺溶液以封闭未反应的基团。
除非另有说明,否则关于本发明的多肽的术语“生物活性的”和“生物活性”和“生物特征”意指具有结合生物分子的能力。
术语“生物分子”指核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质及其组合。在一个实施方案中,生物分子存在于自然界中。
抗体片段,例如Fab和F(ab')2片段,可以使用常规技术,例如完整抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化,由完整抗体进行制备。此外,可以使用例如如本文所述的标准重组DNA技术,来制备抗体、其部分和免疫粘附分子。
术语“重组抗体”预期指在包含编码抗体的核苷酸序列的细胞或细胞系中表达的抗体,其中所述核苷酸序列与细胞并非天然结合的。
如本文使用的,术语“变体抗体”预期指这样的抗体,与亲本抗体的序列相比,借助于添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基,所述抗体具有的氨基酸序列不同于其“亲本”抗体的氨基酸序列。在一个优选实施方案中,与亲本抗体相比,变体抗体包含至少一个或多个(例如,一至十二,例如,二、三、四、五、六、七、八或九、十、十一或十二个;在一些实施方案中,变体抗体包含一至约十个)氨基酸的添加、缺失和/或取代。在一些实施方案中,在变体抗体的CDR中进行此类添加、缺失和/或取代。关于变体抗体的序列的同一性或同源性,在本文中定义为在比对序列,并且在必要时引入缺口,以达到序列同一性的最大百分比之后,变体抗体序列中与亲本抗体残基等同的氨基酸残基的百分比。变体抗体保留结合亲本抗体与之结合的相同抗原,且优选表位的能力;并且在一些实施方案中,至少一种特性或生物活性优于亲本抗体的那些。例如,与亲本抗体相比,变体抗体可以具有例如更强的结合亲和力、更长的半衰期、更低的IC50或增强的抑制抗原生物活性的能力。本文特别有利的变体抗体是与亲本抗体相比,展示生物活性中的至少2倍(优选至少5倍、10倍或20倍)增强的抗体。
术语“双特异性抗体”指具有抗原结合结构域的抗体,所述抗原结合结构域能够与单个生物分子上的两个不同表位特异性结合、或能够与两种不同生物分子上的表位特异性结合。双特异性抗体在本文中也被称为具有“双重特异性”或是“双重特异性”抗体。
在广义上,术语“嵌合抗体”预期指这样的抗体,其包含一种抗体的一个或多个区域、以及一种或几种其它抗体的一个或多个区域,通常是部分人和部分非人抗体,即部分衍生自非人动物,例如小鼠、大鼠等害虫,或骆驼科,例如美洲驼和羊驼。嵌合抗体一般优选超过非人抗体,以便减少人抗抗体免疫应答,例如在鼠抗体的情况下,人抗小鼠抗体免疫应答的风险。通常的嵌合抗体的实例是其中可变区序列是鼠序列,而恒定区序列是人的抗体。在嵌合抗体的情况下,非人部分可以经受进一步改变,以便使抗体人源化。
术语“人源化”预期指以下事实:当抗体具有完全或部分非人起源,例如,通过分别用目的抗原免疫小鼠或美洲驼获得的小鼠或美洲驼抗体,或是基于小鼠或美洲驼的此类抗体的嵌合抗体时,能够取代特别是在重链和轻链的构架区和恒定结构域中的某些氨基酸,以便避免或最小化在人中的免疫应答。抗体占优势地通过位于六个重链和轻链CDR中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此,在CDR内的氨基酸序列在各个抗体之间比CDR之外的氨基酸序列可变得多。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用,所以能够例如通过构建表达载体来表达重组抗体,所述表达载体表达来自特异性抗体的CDR序列和来自不同抗体的构架序列,所述重组抗体模拟特定天然存在的抗体、或更一般地具有所述氨基酸序列的任何特定抗体的特性。结果,能够使非人抗体“人源化”,并且在很大程度上,保存初始抗体的结合特异性和亲和力。尽管不可能精确地预测特定抗体的免疫原性以及由此的人抗抗体应答,但非人抗体通常比人抗体更具免疫原性。其中外源(例如害虫或骆驼科)恒定区已被人起源的序列取代的嵌合抗体,已显示比完全外来起源的那些一般更少的免疫原性,并且治疗性抗体中的趋势是朝向人源化或全人抗体。因此,可以使嵌合抗体或非人起源的其它抗体人源化,以减少人抗抗体应答的风险。
对于嵌合抗体,人源化通常涉及可变区序列的构架区的修饰。其为互补决定区(CDR)的部分的氨基酸残基最经常地不借助于人源化进行修饰,尽管在一些情况下,它可能是期望的,以便修饰CDR的各个氨基酸残基,例如以便缺失糖基化位点、脱酰胺位点、天冬氨酸异构化位点、或者不需要的半胱氨酸或甲硫氨酸残基。N连接的糖基化借助于将寡糖链附着到三肽序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr中的天冬酰胺残基来制备,其中X可以是除了Pro之外的任何氨基酸。N-糖基化位点的去除可以通过用不同的残基突变Asn或Ser/Thr残基来实现,优选通过保守取代的方式。天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺可以取决于此类因素如pH和表面暴露而发生。天冬酰胺残基尤其易受脱酰胺影响,主要是当存在于序列Asn-Gly中时,而在其它二肽序列如Asn-Ala中影响程度较小。如果CDR序列包含此类脱酰胺位点,特别是Asn-Gly,可能期望通常借助于保守取代缺失所牵涉的残基之一而去除这个位点。
用于抗体序列的人源化的众多方法是本领域已知的。一种常用的方法是CDR移植。CDR移植可以基于通过Kabat的CDR定义,尽管最新版本(Magdelaine-Beuzelin等人,CritRev.Oncol Hematol. 64:210 225(2007))提示IMGT®(国际ImMunoGeneTics信息系统®,www.imgt.org)的定义可以改善人源化结果(参见Lefranc等人,Dev. Comp Immunol. 27:55-77(2003))。在一些情况下,与由其获得CDR的亲本抗体相比,CDR移植可以减少CDR移植的非人抗体的结合特异性和亲和力,并且因此减少生物活性。可以在CDR移植抗体的选择位置(通常在构架区中)处引入回复突变(其有时被称为“构架区域修复”),以便恢复亲本抗体的结合特异性和亲和力。可以使用文献和抗体数据库中可获得的信息,来执行用于可能的回复突变的位置的鉴定。其为用于回复突变的候选物的氨基酸残基通常是位于抗体分子的表面上的氨基酸残基,而被掩埋的残基或具有较低程度的表面暴露的残基通常不改变。CDR移植和回复突变的另一种人源化技术是表面再造,其中非人起源的非表面暴露的残基得到保留,而表面残基改变为人残基。
可以使用两种技术生成全人抗体:使用体外收集的噬菌体文库或人源化动物(小鼠、大鼠等)的体内免疫。
组合噬菌体抗体文库的构建始于选择基因储库的来源,这取决于可以区分的几种抗体文库类型:天然、免疫和合成的。使用天然重构的基因构建首次用于实验的文库和免疫文库,其分别编码健康供体或用某种抗原免疫的供体的可变免疫球蛋白结构域。为此,从产生抗体的淋巴样细胞系中分离mRNA。主要使用外周血淋巴细胞,但也已使用了脾细胞[Sheets MD,Amersdorfer P,Finnern R,Sargent P,Lindquist E,Schier R等人Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library:theproduction of high-affinity human single-chain antibodies to proteinantigens. Proc Natl Acad Sci U S A 1998,95:6157-6162,以及de Haard HJ,van NeerN,Reurs A,Hufton SE,Roovers RC,Henderikx P等人A large non-immunized human Fabfragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis ofhigh affinity antibodies. J Biol Chem 1999,274:18218-18230.],клетки миндалин или лимфоциты костного мозга [Vaughan TJ,Williams AJ,Pritchard K,Osbourn JK,Pope AR,Earnshaw JC等人Human antibodies with sub-nanomolaraffinities isolated from a large non-immunized phage display library. NatBiotechnol 1996,14:309-314.]。然后在mRNA的基础上合成cDNA,并且可以使用寡核苷酸-dT引物和统计上设计的六核苷酸两者,其产生编码抗体可变结构域的基因的所有可能变体的cDNA拷贝[Ulitin AB,Kapralova MV,Laman AG,Shepelyakovskaya AO,Bulgakova EB,Fursova KK等人The library of human miniantibodies in the phage displayformat: Designing and testing DAN:Izd-vo "Nauka";2005.]。
目前在cDNA水平下,一种或几种引物可以同时用于将扩增基因的范围限制于一种或几种可变结构域基因家族或抗体同种型[Marks JD,Hoogenboom HR,Bonnert TP,McCafferty J,Griffiths AD,Winter G. Bypassing immunization. Human antibodiesfrom V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol 1991,222:581-597]。用于扩增编码免疫球蛋白的基因的引物与其最保守的区域互补。它们的序列选自组构成数据库的基因集合,例如Kabat或V BASE数据库。引物设计还提供了内部限制性位点,用于将PCR产物克隆到适当的载体内。
合成文库的构建基于用一组随机序列替换天然CDR。在这种情况下,能够生成各种各样的抗原结合位点。
噬菌体展示是用于搜索抗体的最有力且广泛使用的体外技术之一。在1985年,Smith发现可以将外源DNA序列克隆到丝状噬菌体M13内,并且此类克隆的序列可以作为融合蛋白在噬菌体颗粒的表面上表达(Smith GP:Filamentous fusion phage:novelexpression vectors that display cloned antigens on the virion surface.Science 1985,228:1315-1317.)。因此,能够基于其结合其它蛋白质的能力来选择目的融合蛋白。这个发现与PCR扩增方法相组合,这使得能够克隆免疫球蛋白基因的cDNA储库,以产生含有可变结构域的各种噬菌体文库,其可以用于快速搜索靶特异性单克隆抗体。噬菌体文库储库反映了其血液用于产生文库的每个人或每只动物的B细胞抗体储库。在1995年,两篇论文描述了能够表达全人抗体的基因改造小鼠的生产,所述全人抗体的储库与通过杂交瘤技术获得的那些可比较(Lonberg N,Taylor LD,Harding FA,Trounstine M,HigginsKM,Schramm SR,Kuo CC,Mashayekh R,Wymore K,McCabe JG等人:Antigen-specifichuman antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications.Nature 1994,368:856-859)。在这些动物中,有意破坏了其自身的内源性重链和k轻链免疫球蛋白基因,随后引入转基因,所述转基因是人重链和k轻链基因的区段。证明人基因储库可以被小鼠免疫系统用于产生针对更多种抗原的高特异性和高亲和力抗体。尽管转基因小鼠表达的B细胞受体实际上是小鼠和人组分(人免疫球蛋白、小鼠Igα、Igβ和其它信号分子)的杂合体,但它们的B细胞正常发育并成熟。
在某些情况下,可能还期望改变一个或多个CDR氨基酸残基,以便改善与靶表位的结合亲和力。这称为“亲和力成熟”,并且可以任选地与人源化结合执行,例如在其中抗体的人源化导致减少的结合特异性或亲和力,并且不能通过单独的回复突变充分改善结合特异性或亲和力的情况下。各种亲和力成熟方法是本领域已知的,例如由Burks等人,Proc NatlAcad Sci USA,94:412–417(1997)描述的体外扫描饱和诱变方法,以及通过Wu等人,ProcNatl Acad Sci USA 95:6037 6042(1998)的逐步体外亲和力成熟方法。
术语“单克隆抗体”或“mAb”指由分开的细胞克隆群体合成且分离的抗体。克隆群体可以是永生化细胞的克隆群体。在一些实施方案中,克隆群体中的永生化细胞是杂交细胞 - 杂交瘤 - 通常通过将来自免疫动物的各个B淋巴细胞与来自淋巴细胞瘤的各个体细胞融合而产生。杂交瘤是一类构建细胞,并且在自然界中不存在。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,其由两条等同的轻(L)链和两条等同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接,而二硫键合的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中变化。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一端处具有可变结构域(VH),随后为多个恒定结构域。每条轻链在一端处具有可变结构域(VL),并且在其另一端处具有恒定结构域。轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐,并且轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
在本说明书中用于描述各种抗体的术语“分离的”,指已从抗体在其中表达的细胞或细胞培养物中鉴定和分开和/或再生的抗体。来自其天然环境的杂质(污染物组分)是将干扰多肽的诊断或治疗用途的材料,并且可以包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中,将抗体纯化(1)到足以通过使用旋转杯测序仪(Edman sequenator)获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度,或(2)在非还原或还原条件下,使用考马斯亮蓝或优选地银染色,通过SDS-PAGE的同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体,因为不存在多肽的天然环境的至少一种组分。分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。
“分离的”核酸分子是从至少一个核酸分子-杂质中鉴定并且与之分开的核酸分子,前者在抗体核酸的天然来源中与所述杂质结合。分离的核酸分子不同于其中它在天然条件下发现的形式或集合。因此,分离的核酸分子不同于在天然条件下存在于细胞中的核酸分子。然而,分离的核酸分子包括位于其中正常表达抗体的细胞中的核酸分子,例如,如果该核酸分子具有与其在天然条件下在细胞中的定位不同的染色体定位。
如本文使用的,术语“表位”预期指与结合分子(例如,抗体或相关分子,例如双特异性结合分子)特异性结合的抗原的一部分(决定簇)。表位决定簇通常由分子的化学活性表面分组,例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成,并且通常包含特定的三维结构特征以及比电荷特征。表位可以是“线性的”或“构象的”。在线性表位中,蛋白质(例如抗原)和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点都沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性发生。在构象表位中,相互作用点跨越蛋白质上的氨基酸残基发生,所述氨基酸残基在一级氨基酸序列中彼此分开。一旦测定了所需的抗原表位,就能够使用本领域众所周知的技术生成针对该表位的抗体。另外,抗体或其它结合分子的生成和表征可以阐明关于所需表位的信息。根据该信息,随后能够竞争性地筛选与相同或等同表位结合的抗体,例如,通过进行竞争研究以发现彼此竞争结合抗原的结合分子。
如本文使用的,术语“肽接头”预期意指具有组合结构域的能力的任何肽,其长度取决于它与之彼此结合的结构域,并且包含任何氨基酸序列。优选地,肽接头具有多于5个氨基酸的长度,并且由选自G、A、S、P、E、T、D、K的任何氨基酸集合组成。
术语“在体外”指在人工条件下,在机体外部的生物实体、生物过程或生物反应。例如,在体外生长的细胞应理解为在机体外部的环境中,例如在试管、培养小瓶或微量滴定板中生长的细胞。
术语"IC50"(50%抑制浓度)指药物浓度,并且指示将生物过程抑制50%所需的抑制剂体积。IC50值可以使用适当的剂量应答曲线,使用用于曲线拟合的专门统计软件来计算。
术语"ED50"(EC50)(50%有效剂量/浓度)指产生50%生物效应(其可以包括细胞毒性)的药物浓度。
术语抗体“效应子功能”指可归于抗体的Fc区(天然Fc区序列或Fc区氨基酸变体)的生物活性,其随抗体同种型而变。抗体效应子功能的实例包括:Clq结合和补体依赖性细胞毒性;Fc受体结合;抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用;细胞表面受体(例如B细胞受体,BCR)的下调和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞毒性”或“ADCC”指具有免疫能力的效应细胞介导的(T杀伤、天然杀伤等)应答,其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体,并且随后引起靶细胞的裂解或吞噬作用。用于介导ADCC的主要细胞,NK细胞仅表达FcγRJII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达在Ravetch和Kinet,Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)的第464页上的表3中进行概括。为了评价目的分子的ADCC活性,可以执行体外ADCC测定,例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的那种。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地,可以在体内,例如在动物模型如Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998)公开的那种中,评价目的分子的ADCC活性。
“人效应细胞”是表达一种或多种Fc受体并执行效应功能的白细胞。优选地,细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞;其中PBMC和NK细胞是优选的。效应细胞可以从其天然来源分离,例如如本文所述的血液或PBMC中分离。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外,优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)的FcR,并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体,包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”),其具有主要在其细胞质结构域中不同的相似氨基酸序列。激活受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(参见Daëron,Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997)中的综述)。FcR在Ravetch和Kinet,Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)中进行综述。其它FcR,包括未来待鉴定的那些,由本文中的术语“FcR”涵盖。该术语还包括新生儿受体FcRn,其负责将母体IgG转移至胎儿。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指分子在补体的存在下裂解靶的能力。补体激活途径通过补体系统的第一组分(C1q)与分子(例如抗体)的结合而开始,所述分子与同源抗原复合。为了评价补体激活,可以执行CDC测定,例如,如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol. Methods 202:163(1996)中所述的。
术语“同一性”或“同源性”应解释为意指在比对序列,并且在需要时引入缺口,以达到关于整个序列的最大同一性百分比之后,并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的部分,在候选序列中等同于它与之比较的相应序列的残基的氨基酸残基的百分比。N末端或C末端的延伸或插入均不应解释为减少同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是本领域众所周知的。可以使用序列分析软件(例如,Sequence Analysis SoftwarePackage,Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Ave.,Madison,WI 53705)来测量序列同一性。这个软件通过对各种取代、缺失(消除)和其它修饰分配一定程度的同源性来匹配相似的序列。
关于抗体的多肽序列的术语“同源的”应该解释为相对于多肽序列,显示出至少70%、优选80%、更优选90%且最优选95%的序列同一性的抗体。关于核酸序列的术语应该解释为相对于核酸序列,显示出至少85%、优选90%、更优选95%且最优选97%的序列同一性的核苷酸序列。
提供了本文描述的抗体的氨基酸序列的修饰。例如,可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适当的核苷酸变化引入抗体核酸内,或通过肽合成,来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失、和/或插入和/或取代。制备缺失、插入和取代的任何组合以得到最终构建体,条件是最终构建体具有所需特征。氨基酸变化还可以改变抗体中的翻译后过程,例如改变糖基化位点的数目或位置。
使用氨基酸取代修饰抗体的氨基酸序列的变体。此类变体是用不同的残基取代抗体分子中的至少一个氨基酸残基。对于取代诱变最有利的位点包括高变区或CDR,但也考虑了FR或Fc改变。保守取代显示于表1中的“优选取代”下。如果此类取代引起生物活性的改变,则可以进行进一步的基本改变,其在表A中表示为“示例性取代”,或者在描述氨基酸类别时,在下文更详细地描述的变化,并且还可以执行产物筛选。
在本说明书中可互换使用的术语“核酸”、“核酸序列(nucleic sequence)”、“核酸序列(nucleic acid sequence)”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”,意指核苷酸的精确序列,修饰或未修饰,决定核酸的片段或区域,含有或不包含非天然核苷酸,并且是双链DNA或RNA、单链DNA或RNA、或所述DNA的转录产物。
此处还应该包括本发明并不涉及处于其天然染色体环境中,即处于天然状态的核苷酸序列。本发明的序列已进行分离和/或纯化,即,它们例如通过拷贝直接或间接地进行取样,其环境已被至少部分地修饰。因此,此处还应该提到通过重组遗传学,借助于例如宿主细胞获得的分离的核酸,或通过化学合成获得的分离的核酸。
除非另有说明,否则提及核苷酸序列涵盖其互补体。因此,提及具有特定序列的核酸应该理解为涵盖其互补链及其互补序列的核酸。
术语“控制序列”指在特定宿主生物中,对于表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子,任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸置于与另一种核酸序列的功能关系内时,它是“可操作地连接的”。例如,如果关于前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白,则它与关于多肽的DNA可操作地连接;如果启动子或增强子影响序列的转录,则它与编码序列可操作地连接;如果核糖体结合位点这样定位以便促进翻译,则它与编码序列可操作地连接。一般地,“可操作地连接”意指待连接的DNA序列是邻接的,并且在分泌前导区的情况下,是邻接的并且处于阅读相。然而,增强子不必是邻接的。
如本文使用的,术语“载体”指能够转运它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。在一些实施方案中,载体是质粒,即另外的DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA片。在一些实施方案中,载体是病毒载体,其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。在一些实施方案中,载体能够在它们引入其内的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制起源位点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在进一步的实施方案中,载体(例如,非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞内之后,整合到宿主细胞的基因组内,并且从而连同宿主基因一起复制。此外,某些载体能够指导它们与之可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。
如本文使用的,术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)预期指重组表达载体已引入其内的细胞。本发明涉及宿主细胞,其可以包括例如上文描述的根据本发明的载体。本发明还涉及宿主细胞,其包含例如编码本发明结合分子的第一结合结构域和/或第二结合结构域的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列、编码轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列或两者。应该理解,“重组宿主细胞”和“宿主细胞”不仅预期指特定的受试者细胞,而且还指此类细胞的后代。因为修饰可以由于突变或环境影响而在后续代中发生,因此,事实上,此类后代可能并不等同于亲代细胞,然而,此类细胞仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。
术语“赋形剂”在本文中用于描述除本发明的化合物外的任何成分。
“药物组合物”指包含本发明的抗体和选自以下的至少一种组分的组合物:药学上可接受的和药学上相容的填料、溶剂、稀释剂、载体、助剂、分配剂和传感剂、递送剂例如防腐剂、稳定剂、填料、崩解剂、湿润剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂、甜味剂、调味剂、芳化剂、抗菌剂、杀真菌剂、润滑剂和延长递送控制剂,其选择和合适的比例取决于施用的类型和方式以及剂量。合适的悬浮剂的实例是乙氧基化的异硬脂醇、聚氧化乙烯、山梨糖醇和山梨糖醇醚、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶以及其混合物。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来提供针对微生物作用的保护,所述抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、山梨酸和类似化合物。组合物还可以含有等渗剂,例如糖、多元醇、氯化钠等等。组合物的延长作用可以通过减慢活性成分的吸收的试剂,例如单硬脂酸铝和明胶来实现。合适的载体、溶剂、稀释剂和递送剂的实例包括水、乙醇、多元醇及其混合物、天然油(例如橄榄油)和用于注射的有机酯(例如油酸乙酯)。填料的实例是乳糖(lactose)、乳糖(milk-sugar)、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸钙等等。崩解剂和分配剂的实例是淀粉、海藻酸及其盐、硅酸盐。合适的润滑剂的实例是硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石和高分子量的聚乙二醇。单独或与另一种活性化合物组合,用于活性成分的口服、舌下、经皮、眼内、肌内、静脉内、皮下、局部或直肠施用的药物组合物,可以以标准施用形式,在具有常规药物载体的混合物中施用于人和动物。合适的标准施用形式包括口服形式,例如片剂、明胶胶囊、丸剂、粉末、颗粒、口香糖和口服溶液或悬浮液;舌下和经颊施用形式;气溶胶;植入物;局部、经皮、皮下、肌内、静脉内、鼻内或眼内形式和直肠施用形式。
“药剂” – 是以片剂、胶囊、溶液、软膏和其它现成形式的化合物(或作为药物组合物的化合物的混合物),其预期用于恢复、改善或改变人和动物中的生理功能,以及用于疾病的治疗和预防,用于诊断、麻醉、避孕、美容及其它。
术语“由IL-5与其细胞受体之间的相互作用介导的疾病或病症”指与IL-5和IL-5R直接或间接相关的任何疾病或病症,包括疾病或病症的病因、发展、进展、持续或病理学。“治疗(Treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指减轻或消除生物学病症和/或其伴随症状中的至少一种的方法。如本文使用的,“减轻”疾病、病症或状况意指减少疾病、病症或状况的症状的严重性和/或发生频率。进一步地,本文对“治疗”的提及包括对治愈性、姑息性和预防性治疗的提及。
在一个方面,治疗的受试者或患者是哺乳动物,优选人受试者。所述受试者可以是任何年龄的男性或女性。
术语“病症”意指将从用本发明化合物的治疗中受益的任何状况。这包括慢性和急性病症或疾病,包括使哺乳动物易患所讨论的病症的那些病理状况。本文待治疗的优选病症是自身免疫性疾病。
术语“免疫应答”、“自身免疫应答”和“自身免疫炎症”指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由所述细胞或肝细胞产生的可溶性大分子(包括由于侵入病原体、由病原体感染的细胞或组织、癌细胞、或者在自身免疫或病理性炎症的情况下来自人体的正常细胞或组织的选择性损害、破坏或消除而产生的抗体、细胞因子和补体)的作用。
如本文使用的,术语“自身免疫性疾病”指起于且针对个体自身的(自身)抗原和/或组织的非恶性疾病或病症。
该术语涵盖但不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、化脓性关节炎、莱姆骨关节炎、牛皮癣关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、系统性红斑狼疮、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、糖尿病、甲状腺炎、哮喘、过敏性疾病、牛皮癣、特应性皮炎、硬皮病、“移植物抗宿主”反应、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫疾病、结节病、川崎病、格雷夫斯病、肾病综合征、慢性疲劳综合征、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜、显微镜下肾血管炎、慢性活动性肝炎、uvenita、败血性休克、中毒性休克综合征、脓毒症综合征、恶病质、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、成人(急性)呼吸窘迫综合征、脱发、斑秃、血清阴性性关节病、关节病、莱特氏病、与溃疡性结肠炎关节病相关的牛皮癣关节病、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常型天疱疮、片状天疱疮、类天疱疮疾病、线性IgA、自身免疫性溶血性贫血、库姆斯阳性溶血性贫血、恶性贫血、幼年性恶性贫血、关节炎、原发性硬化性甲型肝炎、隐源性自身免疫性肝炎、纤维化肺病、隐源性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、感染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、I型自身免疫性肝炎(经典的自身免疫性肝炎或狼疮样)、II型自身免疫性肝炎、骨关节炎、原发性硬化性胆管炎、I型牛皮癣、II型牛皮癣、特发性白细胞减少症、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、肾NOS病、肾小球肾炎、显微镜下肾血管炎、盘状红斑狼疮、特发性或NOS男性不育、对精子的自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发性肺动脉高压、古德帕斯丘综合征、结节性多关节炎的肺部表现、急性风湿热、类风湿性脊柱炎、强直性脊柱炎、斯蒂尔氏病、系统性硬化、干燥综合征、高安氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺功能亢进、甲状腺肿自身免疫性甲状腺功能减退(桥本氏病)、自身免疫性萎缩性甲状腺功能减退、原发性粘液水肿、晶状体源性葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风、急性肝病、慢性肝病、变态反应、哮喘、精神病症(包括抑郁症和精神分裂症)、Th2型/Th1型介导的疾病、结膜炎、变应性接触性皮炎、变应性鼻炎、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、肌萎缩侧索硬化、贫血、囊性纤维化、与细胞因子疗法相关的病症、脱髓鞘疾病、皮炎、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血再灌注损伤、缺血性中风、幼年型类风湿性关节炎、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴组织增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢早衰和睑缘炎。该抗体还可以治疗上述病症的任何组合。
“治疗有效量”预期指待施用的治疗剂的量,所述量在某种程度上减轻待治疗病症的一种或多种症状。
术语“长期”使用指与急性(短期)施用途径相反,试剂的持续(不间断)使用,以便长时间段维持初始疗效(活性)。
“间歇性”使用指不能无间断地连续进行的,而是本质上是周期性的治疗。
如本文使用的,词语“包含(comprise)”、“具有(have)”、“包括(include)”,或者变化例如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”或“包括(including)”,以及其所有语法变化应理解为暗示包括所述整数或整数组,但不排除任何其它整数或整数组。
发明详述
抗体
本发明涉及与IL-5Rα特异性结合的抗体或抗原结合片段。
在一个实施方案中,本发明涉及分离的抗体或其抗原结合片段,其与IL-5Rα特异性结合,并且包含:
(a)包含CDR3的重链可变区,所述CDR3包含与序列DYATNYGVPYFGS(SEQ ID NO:3)至少80%、85%或92%同源或等同的氨基酸序列,即CDR3是序列DYATNYGVPYFGS(SEQ ID NO:3)、或者具有1或2个取代的序列DYATNYGVPYFGS(SEQ ID NO:3),以及
(b)包含CDR3的轻链可变区,所述CDR3包含与序列QSYDSSLSGHVV(SEQ ID NO:8)至少80%、83%或91%同源或等同的氨基酸序列,即CDR3是序列QSYDSSLSGHVV(SEQ ID NO:8)、或者具有1或2个取代的序列QSYDSSLSGHVV(SEQ ID NO:8)。
在一个实施方案中,本发明涉及分离的抗体或其抗原结合片段,其与IL-5Rα特异性结合,并且包含重链可变区,所述重链可变区包含含有氨基酸序列DYATNYGVPYFGS(SEQID NO:3)的CDR3。
在一个实施方案中,本发明涉及分离的抗体或其抗原结合片段,其与IL-5Rα特异性结合,并且包含轻链可变区,所述轻链可变区包含含有氨基酸序列QSYDSSLSGHVV(SEQ IDNO:8)的CDR3。
在一个实施方案中,本发明涉及分离的抗体或其抗原结合片段,其与IL-5Rα特异性结合,并且包含:
(a)重链可变区,其包含含有氨基酸序列DYATNYGVPYFGS(SEQ ID NO:3)的CDR3,和
(b)轻链可变区,其包含含有氨基酸序列QSYDSSLSGHVV(SEQ ID NO:8)的CDR3。
在一个实施方案中,本发明涉及分离的抗体或其抗原结合片段,其与IL-5Rα特异性结合,并且包含:
(a)重链可变区,其包括:
(i)包含与序列NYAMS(SEQ ID NO:1)至少80%同源或等同的氨基酸序列的CDR1,即CDR1是序列NYAMS(SEQ ID NO:1)、或具有1个取代的序列NYAMS(SEQ ID NO:1);
(ii)包含与序列AINSGGKSTNYADSVKG(SEQ ID NO:2)至少80%、88%或94%同源或等同的氨基酸序列的CDR2,即CDR2是序列AINSGGKSTNYADSVKG(SEQ ID NO:2)、或者具有1或2个取代的序列AINSGGKSTNYADSVKG(SEQ ID NO:2);
(iii)包含与序列DYATNYGVPYFGS(SEQ ID NO:3)至少80%、85%或92%同源或等同的氨基酸序列的CDR3,即CDR3是序列DYATNYGVPYFGS(SEQ ID NO:3)、或者具有1或2个取代的序列DYATNYGVPYFGS(SEQ ID NO:3);
和/或
(b)轻链可变区,其包括:
(i)包含与序列SGSRSNIGSGYDVH(SEQ ID NO:6)至少80%、85%或92%同源或等同的氨基酸序列的CDR1,即CDR1是序列SGSRSNIGSGYDVH(SEQ ID NO:6)、或者具有1或2个取代的序列SGSRSNIGSGYDVH(SEQ ID NO:6);
(ii)包含与序列DDNNRPS(SEQ ID NO:7)至少80%或85%同源或等同的氨基酸序列的CDR2,即CDR2是序列DNDNRPS(SEQ ID NO:7)、或具有1个取代的序列DDNNRPS(SEQ ID NO:7);
(iii)包含与序列QSYDSSLSGHVV(SEQ ID NO:8)至少80%、83%或91%同源或等同的氨基酸序列的CDR3,即CDR3是序列QSYDSSLSGHVV(SEQ ID NO:8)、或者具有1或2个取代的序列QSYDSSLSGHVV(SEQ ID NO:8)。
在一个实施方案中,本发明涉及分离的抗体或其抗原结合片段,其与IL-5Rα特异性结合,并且包含:
(a)重链可变区,其包括:
(i)包含氨基酸序列NYAMS(SEQ ID NO:1)的CDR1,
(ii)包含氨基酸序列AINSGGKSTNYADSVKG(SEQ ID NO:2)的CDR2,
(iii)包含氨基酸序列DYATNYGVPYFGS(SEQ ID NO:3)的CDR3,和/或
(b)轻链可变区,其包括:
(i)包含氨基酸序列SGSRSNIGSGYDVH(SEQ ID NO:6)的CDR1,
(ii)包含氨基酸序列DDNNRPS(SEQ ID NO:7)的CDR2,
(iii)包含氨基酸序列QSYDSSLSGHVV(SEQ ID NO:8)的CDR3。
在一个实施方案中,本发明涉及分离的抗体或其抗原结合片段,其与IL-5Rα特异性结合,并且包含:
(a)重链可变区,其包含与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源或等同的氨基酸序列:QVTLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:4)或QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:5),和/或
(b)轻链可变区,其包含与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源或等同的氨基酸序列:QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQVPGTAPKLLIFDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVL(SEQ IDNO:9)或QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:10)。
在一个实施方案中,本发明涉及分离的抗体或其抗原结合片段,其与IL-5Rα特异性结合,并且包含:
(a)重链可变区,其包含选自以下的氨基酸序列:
QVTLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:4)或QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:5),和/或
(b)轻链可变区,其包含选自以下的氨基酸序列:
QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQVPGTAPKLLIFDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:9)或QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:10)。
在一个实施方案中,本发明涉及分离的抗体或其抗原结合片段,其与IL-5Rα特异性结合,并且包含:
(a)重链,其包含与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源或等同的氨基酸序列:QVTLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:11)或QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:12),
和/或
(b)轻链,其包含与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源或等同的氨基酸序列:QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQVPGTAPKLLIFDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:13)或QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:14)。
在一个实施方案中,本发明涉及分离的抗体或其抗原结合片段,其与IL-5Rα特异性结合,并且包含:
(a)重链,其包含选自以下的氨基酸序列:QVTLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:11)或QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:12),
和/或
(b)轻链,其包含氨基酸序列QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQVPGTAPKLLIFDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:13)或QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:14)。
在一个实施方案中,与IL-5Rα特异性结合的分离的抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中,与IL-5Rα特异性结合的单克隆抗体是全长IgG抗体。
在一个实施方案中,与IL-5Rα特异性结合的全长IgG抗体具有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
在一个实施方案中,与IL-5Rα特异性结合的全长IgG抗体具有人IgG1同种型。
在一个实施方案中,分离的抗体是抗体BCD133-03-002,其与IL-5Rα特异性结合,并且包括包含氨基酸序列QVTLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTTVTVSS的重链可变片段、以及包含氨基酸序列QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQVPGTAPKLLIFDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVL的轻链可变片段。
在一个实施方案中,分离的抗体是抗体BCD133-03-020,其与IL-5Rα特异性结合,并且包括包含氨基酸序列QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSS的重链可变片段、以及包含氨基酸序列QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQVPGTAPKLLIFDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVL的轻链可变片段。
在一个实施方案中,分离的抗体是抗体BCD133-03-021,其与IL-5Rα特异性结合,并且包括包含氨基酸序列QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSS的重链可变片段、以及包含氨基酸序列QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVL的轻链可变片段。
在一个实施方案中,分离的抗体是抗体BCD133-03-002,其与IL-5Rα特异性结合,并且包括包含氨基酸序列QVTLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK的重链可变片段、以及包含氨基酸序列QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQVPGTAPKLLIFDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC的轻链可变片段。
在一个实施方案中,分离的抗体是抗体BCD133-03-020,其与IL-5Rα特异性结合,并且包括包含氨基酸序列QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK的重链、以及包含氨基酸序列QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQVPGTAPKLLIFDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC的轻链。
在一个实施方案中,分离的抗体是抗体BCD133-03-021,其与IL-5Rα特异性结合,并且包括包含氨基酸序列QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK的重链、以及包含氨基酸序列QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC的轻链。
核酸分子
本发明还涉及核酸分子,特别是编码本发明的针对IL-5Rα(白细胞介素5受体α链)的抗体或其任何片段及其各种组合(其在本文中进行描述,任选地包括与其连接的任何肽接头序列)的序列。
除非另有说明,否则提及核苷酸序列涵盖其互补体。因此,提及具有特定序列的核酸应该理解为涵盖其互补链及其互补序列的核酸。如本文使用的,术语“多核苷酸”意指长度为至少10个碱基的核苷酸、或核糖核苷酸、或脱氧核糖核苷酸、或任一类型核苷酸的修饰形式的聚合形式。该术语包括单链和双链形式。
本发明还涉及与一个或多个所述核苷酸序列、或编码选自SEQ ID NO:1-3、6-8的氨基酸序列的核苷酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同源或等同的核苷酸序列。在某些实施方案中,核苷酸序列与编码SEQ ID NO:4-5、9-10的氨基酸序列的核苷酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源或等同。本发明还涉及与一个或多个所述核苷酸序列、或编码选自SEQ ID NO:11-14的氨基酸序列的核苷酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%等同的核苷酸序列。
在一个方面,本发明涉及核酸分子,其包含编码选自SEQ ID NO:1-14的氨基酸序列的核苷酸序列。核酸分子还可以包含所述核苷酸序列的任何组合。在一个实施方案中,核酸分子包含编码SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在另一个实施方案中,核酸分子包含编码SEQID NO:8的核苷酸序列。在一个实施方案中,核酸分子包含编码SEQ ID NO:1-3的核苷酸序列。在另一个实施方案中,核酸分子包含编码SEQ ID NO:6-8的核苷酸序列。在另一个实施方案中,核酸分子包含编码SEQ ID NO:4或5的核苷酸序列。在另一个实施方案中,核酸分子包含编码SEQ ID NO:9或10的核苷酸序列。在另一个实施方案中,核酸分子包含编码SEQ IDNO:4或5的核苷酸序列、以及编码SEQ ID NO:9或10的核苷酸序列。在另一个实施方案中,核酸分子包含编码SEQ ID NO:11或12的核苷酸序列。在另一个实施方案中,核酸分子包含编码SEQ ID NO:13或14的核苷酸序列。在另一个实施方案中,核酸分子包含编码SEQ ID NO:11或12的核苷酸序列、以及编码SEQ ID NO:13或14的核苷酸序列。
在一个方面,本发明涉及核酸分子,其编码重链并且包含与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源或等同的核苷酸序列:CAAGTAACCCTAAAGGAAAGTGGAGGAGGACTTGTCCAACCCGGCGGCAGTTTAAGACTTAGCTGTGCTGCTTCTGGCTTTACTTTTAGCAACTATGCTATGTCGTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGAAAGGGCCTAGAATGGGTGAGCGCTATCAATAGCGGCGGAAAAAGCACTAACTACGCGGACAGCGTGAAAGGCCGCTTCACTATAAGTCGGGACAATGCTAAAAACACACTGTACCTCCAGATGAACTCCCTAAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTACTACTGCGCTGATTATGCGACTAACTATGGAGTGCCATACTTCGGAAGCTGGGGCCAGGGAACGACCGTAACTGTGAGTAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAAAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA(SEQ ID NO:15)或
CAAGTACAACTACAGGAAAGTGGAGGAGGACTTGTCCAACCCGGCGGCAGTTTAAGACTTAGCTGTGCTGCTTCTGGCTTTACTTTTAGCAACTATGCTATGTCGTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGAAAGGGCCTAGAATGGGTGAGCGCTATCAATAGCGGCGGAAAAAGCACTAACTACGCGGACAGCGTGAAAGGCCGCTTCACTATAAGTCGGGACAATGCTAAAAACACACTGTACCTCCAGATGAACTCCCTAAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTACTACTGCGCTGATTATGCGACTAACTATGGAGTGCCATACTTCGGAAGCTGGGGCCAGGGAACGATGGTAACTGTGAGTAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAAAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA(SEQ ID NO:16)。
在一个方面,本发明涉及核酸分子,其编码重链并且包含选自以下的核苷酸序列:CAAGTAACCCTAAAGGAAAGTGGAGGAGGACTTGTCCAACCCGGCGGCAGTTTAAGACTTAGCTGTGCTGCTTCTGGCTTTACTTTTAGCAACTATGCTATGTCGTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGAAAGGGCCTAGAATGGGTGAGCGCTATCAATAGCGGCGGAAAAAGCACTAACTACGCGGACAGCGTGAAAGGCCGCTTCACTATAAGTCGGGACAATGCTAAAAACACACTGTACCTCCAGATGAACTCCCTAAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTACTACTGCGCTGATTATGCGACTAACTATGGAGTGCCATACTTCGGAAGCTGGGGCCAGGGAACGACCGTAACTGTGAGTAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAAAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA(SEQ ID NO:15)或
CAAGTACAACTACAGGAAAGTGGAGGAGGACTTGTCCAACCCGGCGGCAGTTTAAGACTTAGCTGTGCTGCTTCTGGCTTTACTTTTAGCAACTATGCTATGTCGTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGAAAGGGCCTAGAATGGGTGAGCGCTATCAATAGCGGCGGAAAAAGCACTAACTACGCGGACAGCGTGAAAGGCCGCTTCACTATAAGTCGGGACAATGCTAAAAACACACTGTACCTCCAGATGAACTCCCTAAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTACTACTGCGCTGATTATGCGACTAACTATGGAGTGCCATACTTCGGAAGCTGGGGCCAGGGAACGATGGTAACTGTGAGTAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAAAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA(SEQ ID NO:16)。
在一个方面,本发明涉及核酸分子,其编码轻链并且包含与选自以下的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源或等同的核苷酸序列:
CAGGCTGGACTGACGCAACCGCCATCTGTGAGTGCGGCTCCAGGACAACGGGTGACTATAAGCTGCAGCGGAAGCAGAAGCAACATAGGCAGTGGATACGACGTACATTGGTACCAACAAGTACCGGGGACGGCTCCGAAACTACTGATATTTGACGATAATAATAGACCGAGCGGCGTACCAGACCGTTTTAGCGGAAGCAAAAGTGGAACGAGTGCCTCTTTAGCCATAACTGGCCTGCAAGCTGAAGATGAAGCTGATTATTACTGTCAGAGCTACGACAGCAGTCTGAGTGGACACGTAGTGTTTGGAGGAGGAACGAAGCTGACGGTATTACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(SEQ ID NO:17)或
CAGAGTGTGCTGACGCAACCGCCATCTGTGAGTGCGGCTCCAGGACAACGGGTGACTATAAGCTGCAGCGGAAGCAGAAGCAACATAGGCAGTGGATACGACGTACATTGGTACCAACAACTACCGGGGACGGCTCCGAAACTACTGATATACGACGATAATAATAGACCGAGCGGCGTACCAGACCGTTTTAGCGGAAGCAAAAGTGGAACGAGTGCCTCTTTAGCCATAACTGGCCTGCAAGCTGAAGATGAAGCTGATTATTACTGTCAGAGCTACGACAGCAGTCTGAGTGGACACGTAGTGTTTGGAGGAGGAACGAAGCTGACGGTATTACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(SEQ ID NO:18)。
在一个方面,本发明涉及核酸分子,其编码轻链并且包含选自以下的核苷酸序列:
CAGGCTGGACTGACGCAACCGCCATCTGTGAGTGCGGCTCCAGGACAACGGGTGACTATAAGCTGCAGCGGAAGCAGAAGCAACATAGGCAGTGGATACGACGTACATTGGTACCAACAAGTACCGGGGACGGCTCCGAAACTACTGATATTTGACGATAATAATAGACCGAGCGGCGTACCAGACCGTTTTAGCGGAAGCAAAAGTGGAACGAGTGCCTCTTTAGCCATAACTGGCCTGCAAGCTGAAGATGAAGCTGATTATTACTGTCAGAGCTACGACAGCAGTCTGAGTGGACACGTAGTGTTTGGAGGAGGAACGAAGCTGACGGTATTACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(SEQ ID NO:17)或
CAGAGTGTGCTGACGCAACCGCCATCTGTGAGTGCGGCTCCAGGACAACGGGTGACTATAAGCTGCAGCGGAAGCAGAAGCAACATAGGCAGTGGATACGACGTACATTGGTACCAACAACTACCGGGGACGGCTCCGAAACTACTGATATACGACGATAATAATAGACCGAGCGGCGTACCAGACCGTTTTAGCGGAAGCAAAAGTGGAACGAGTGCCTCTTTAGCCATAACTGGCCTGCAAGCTGAAGATGAAGCTGATTATTACTGTCAGAGCTACGACAGCAGTCTGAGTGGACACGTAGTGTTTGGAGGAGGAACGAAGCTGACGGTATTACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(SEQ ID NO:18)。
在一个方面,本发明涉及包含上述核酸序列的任何组合的核酸分子。
在任何上述实施方案中,核酸分子可以是分离的。
本发明的核酸分子可以从产生抗IL-5Rα抗体或其一部分的任何来源中分离。在某些实施方案中,本发明的核酸分子可以是合成的而不是分离的。
在一些实施方案中,本发明的核酸分子可以包含编码来自本发明抗体的第一结构域或第二结构域的VH结构域的核苷酸序列,其在框内连接至编码来自任何来源的重链恒定结构域的核苷酸序列。类似地,本发明的核酸分子可以包含编码来自本发明抗体的第一区域或第二区域的VL结构域的核苷酸序列,其在框内连接至编码来自任何来源的轻链恒定结构域的核苷酸序列。
在本发明的一个进一步方面,编码第一结合结构域或第二结合结构域的重(VH)和/或轻(VL)链的可变结构域的核酸分子可以在抗体基因的整个长度上进行“转换”。在一个实施方案中,借助于分别插入已经编码重链恒定(CH)或轻链恒定(CL)结构域的表达载体内,将编码VH或VL结构域的核酸分子在整个长度上转换为抗体基因,使得VH区段可操作地连接至载体内的CH区段,和/或VL区段可操作地连接至载体内的CL区段。在另一个实施方案中,使用标准分子生物学技术,借助于将编码VH和/或VL结构域的核酸分子连接(例如结合)至编码CH和/或CL结构域的核酸分子,将编码VH和/或VL结构域的核酸分子在整个长度上转换成抗体基因。然后可以由它们已引入其内的细胞表达编码全长的重链和/或轻链的核酸分子。
核酸分子可以用于表达大数量的重组抗IL-5Rα抗体。如本文所述,核酸分子还可以用于产生人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、免疫粘附素、双抗体、突变抗体和抗体衍生物。
载体
在另一个方面,本发明涉及适合于表达本文描述的任何核苷酸序列的载体。
如本文所述,本发明涉及包含核酸分子的载体,所述核酸分子编码抗IL-5Rα抗体或其一部分的任何氨基酸序列(例如,第一结合结构域的重链和/或轻链序列、和/或第二结合结构域的重链和/或轻链序列)。本发明进一步提供了包含核酸分子的载体,所述核酸分子编码融合蛋白、修饰的抗体、抗体片段。
在另一个实施方案中,核酸分子和载体可以用于制备突变的抗IL-5Rα抗体。抗体可以在第一结合结构域的重链和/或轻链、和/或第二结合结构域的重链和/或轻链的可变结构域中突变,例如,以改变抗IL-5Rα抗体的结合特性。例如,可以在一个或多个CDR中制备突变,以增加或降低抗体的KD、增加或降低koff、或改变抗体关于IL-5Rα的结合特异性。在另一个实施方案中,在本发明的抗IL-5Rα抗体的第一结合结构域或第二结合结构域中的氨基酸残基处制备一个或多个突变。此类突变可以在可变结构域的CDR或构架区、或恒定结构域中制备。在一个优选实施方案中,在可变结构域中制备突变。在另一个实施方案中,在与本发明抗体的可变结构域的CDR或构架区中的种系相比,已知改变的氨基酸残基处制备一个或多个突变。
在一些实施方案中,本发明的抗IL-5Rα抗体通过在表达载体中插入如上所述获得的DNA进行表达,所述DNA部分或完全编码第一结合结构域或第二结合结构域的序列(例如,轻链和重链序列,其中结合结构域包含轻链和重链序列),使得基因可操作地连接至必需的表达控制序列,例如转录和翻译控制序列。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、植物病毒、例如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、YAC、EBV衍生的附加体等等。可以将DNA分子连接到载体中,使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其预期的调节DNA转录和翻译的功能。表达载体和表达控制序列可以选择为与所使用的表达宿主细胞相容。可以将部分或完全编码第一结合结构域和第二结合结构域的序列(例如,重链和轻链序列,其中结合结构域包含重链和轻链序列)的DNA分子引入各个载体内。在一个实施方案中,将所述DNA分子的任何组合引入相同的表达载体内。可以通过标准方法(例如,抗体基因片段和载体上的互补限制性位点的连接,或者如果不存在限制性位点,则平端连接),将DNA分子引入表达载体内。
合适的载体是编码功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列的载体,具有适当的限制性位点改造,使得如上所述,任何VH或VL序列都可以容易地插入且表达。此类载体中编码HC和LC的基因可以包含内含子序列,所述内含子序列可以通过稳定相应的mRNA导致增强的总抗体蛋白产率。内含子序列的侧翼为剪接供体和剪接受体位点,其决定了RNA剪接在何处发生。当使用多重内含子时,内含子序列的位置可以在抗体链的可变区或恒定区中、或者在可变区和恒定区两者中。聚腺苷酸化和转录终止可以在编码区下游的天然染色体位点处发生。重组表达载体还可以编码信号肽,其促进抗体链从宿主细胞中的分泌。可以将抗体链基因克隆到载体内,使得信号肽在框内连接至免疫球蛋白链的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即,来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除抗体链基因之外,本发明的重组载体表达还可以携带调节序列,所述调节序列控制抗体链基因在宿主细胞中的表达。本领域技术人员将理解,表达载体的设计,包括调节序列的选择,可以取决于此类因素如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等等。用于在哺乳动物中表达宿主细胞的优选控制序列包括确保在哺乳动物细胞中高水平的蛋白质表达的病毒元件,例如衍生自以下的启动子和/或增强子:逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如主要晚期启动子腺病毒(AdMLP))、多瘤病毒和强哺乳动物启动子,例如天然免疫球蛋白启动子或肌动蛋白启动子。关于病毒控制元件及其序列的进一步描述,参见例如,美国专利号5,168,062、4,510,245和4,968,615。用于在植物中表达结合分子例如抗体的方法,包括启动子和载体的描述以及植物的转化,是本领域已知的。参见例如,美国专利号6,517,529。用于在细菌细胞或真菌细胞,例如酵母细胞中表达多肽的方法也是本领域众所周知的。
除抗体链基因和调节序列之外,本发明的重组表达载体还可以携带另外的序列,例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因促进载体已引入其内的宿主细胞的选择(参见例如,美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如,通常,可选择标记物基因对载体已引入其内的宿主细胞赋予针对医学试剂,例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。例如,可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在氨甲蝶呤选择/扩增期间在dhfr宿主细胞中使用)、neo基因(用于G418选择)和谷氨酸合成酶基因。
如本文使用的,术语“表达控制序列”预期指这样的多核苷酸序列,其是影响它们与之连接的编码序列的表达和加工所必需的。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列;有效的RNA加工信号,例如剪接和聚腺苷酸化信号;稳定细胞质mRNA的序列;增强翻译效率的序列(即,Kozak共有序列);增强蛋白质稳定性的序列;以及在需要时,增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质取决于宿主生物而不同;在原核生物中,此类控制序列一般包括核糖体结合位点的启动子和转录终止序列;在真核生物中,通常,此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”预期至少包括其存在对于表达和加工是必要的所有组分,并且还可以包括其存在是有利的另外组分,例如前导序列和融合配偶体序列。
宿主细胞
本发明的一个进一步方面涉及用于产生本发明的抗IL-5Rα抗体的方法。本发明的一个实施方案涉及用于产生如本文定义的抗体的方法,其包括引入/制备能够表达抗体的重组宿主细胞,在适合于抗体表达/产生的条件下培养所述宿主细胞,并且分离获得的抗体。通过在此类重组宿主细胞中的此类表达产生的抗IL-5Rα抗体在本文中被称为“重组抗IL-5Rα抗体”。本发明还涉及来自此类宿主细胞的细胞后代和类似地获得的抗IL-5Rα抗体。
编码本发明抗IL-5Rα抗体的核酸分子和包含这些核酸分子的载体可以用于转染合适的哺乳动物或其细胞、植物或其细胞、细菌或酵母宿主细胞。转化可以通过用于将多核苷酸引入宿主细胞内的任何已知技术。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞内的方法是本领域众所周知的,包括葡聚糖介导的转染、阳离子聚合物-核酸复合物转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、多核苷酸包封在脂质体中、以及DNA直接显微注射到核内。另外,可以通过病毒载体将核酸分子引入哺乳动物细胞内。用于转染细胞的方法是本领域众所周知的。参见例如,美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。用于转化植物细胞的方法是本领域众所周知的,包括例如农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、生物弹道转化、直接注射、电穿孔和病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也是本领域众所周知的。
用作用于转化的宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的,并且包括多个可用的永生化细胞系。这些包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、FreeStyle 293细胞(Invitrogen)、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞和许多其它细胞系。通过测定哪些细胞系具有高表达水平,并且提供产生的蛋白质的必需特征来选择细胞系。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系,例如Sf9或Sf21细胞。当将编码抗IL-5R抗体的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时,通过将宿主细胞培养一段时间来产生抗体,所述时间段足以允许抗体在宿主细胞中表达,或更优选地,抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内。可以使用标准蛋白质纯化技术,从培养基中重构抗IL-5Rα抗体。植物宿主细胞包括例如烟草属(Nicotiana)、拟南芥属(Arabidopsis)、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括埃希氏菌属(Escherichia)和链霉菌属(Streptomyces)物种。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
此外,可以使用多种已知技术来增强来自生产细胞系的本发明的抗IL-5Rα抗体的生产水平。例如,谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些条件下用于增强表达的常见方法。GS系统整体或部分与ЕР号0216846、0256055、0323997和0338841结合进行讨论。
与彼此相比,由不同细胞系或在转基因动物中表达的抗IL-5Rα抗体很可能具有不同的糖基化谱。然而,由本文所述的核酸分子编码、或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗IL-5Rα抗体都是本发明的部分,而与结合分子的糖基化无关,并且一般而言,与翻译后修饰的存在或不存在无关。
抗体的制备
本发明还涉及用于产生抗IL-5Rα抗体及其抗原结合片段的方法和过程。
单克隆抗体
可以使用首先由Kohler等人Nature 256,1975,第495页描述的杂交瘤方法,或可以使用重组DNA方法(US 4816567)来制备单克隆抗体。
在杂交瘤方法中,根据上文方法免疫小鼠或其它适当的宿主动物,例如仓鼠,以引发产生抗体或能够产生抗体的淋巴细胞,所述抗体与用于免疫的蛋白质特异性结合。根据另一个实施方案,可以通过体外免疫产生淋巴细胞。在免疫后,使用合适的融合剂例如聚乙二醇,将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合,以产生杂交瘤细胞。
以上文方式产生的杂交瘤细胞可以在合适的培养基中培养,所述培养基优选含有一种或多种物质,其抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活。例如,如果亲代骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT),则用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基),即阻止HGPRT缺陷细胞生长的物质。
用作用于骨髓瘤细胞融合的组分的优选细胞是这样的细胞,其有效地融合,支持抗体通过所选抗体产生细胞的稳定高水平产生,并且对在其中选择未融合的亲代细胞的培养基敏感。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系,例如可得自Salk Institute CellDistribution Center,San Diego,California,USA的衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些,以及可得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection),Rockville,Maryland,USA的SP-2或X63-Ag8-653细胞。还已描述了用于产生单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(Kozbor,J. Immunol.,133,1984,第3001页)。
优选地,通过免疫沉淀或通过体外结合测定,例如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过在Munson等人,Anal. Biochem.,107:220(1980)中描述的斯卡查德分析(Scatchard analysis)来测定。
一旦鉴定了产生所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞,克隆就可以通过有限稀释程序进行亚克隆,并且通过标准方法生长。用于这个目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外,杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水肿瘤在体内生长,例如通过将细胞腹膜内(i.p.)注射到小鼠内。
可以通过常规抗体纯化技术,例如亲和层析(例如,使用蛋白A-或蛋白G-Sepharose)或离子交换层析、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析等,将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清分开。
编码单克隆抗体的DNA使用常规程序(例如,通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离且测序。杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。分离后,可以将DNA置于表达载体内,然后将所述表达载体转染到宿主细胞内,以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成,所述宿主细胞例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞,所述细胞如果没有转染就不产生抗体蛋白。
在一个进一步实施方案中,可以从使用McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)中描述的技术生成的抗体噬菌体文库分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等人,Nature,352:624-628(1991),以及Marks等人,J. Mol. Biol.,222:581-597(1991),分别描述了使用噬菌体文库的鼠和人抗体分离。后续出版物描述了通过链改组的高亲和力(nM范围)人抗体的产生(Marks等人,Bio/Technology,10:779-783(1992),以及组合感染和体内重组作为用于构建非常大型的噬菌体文库的策略(Waterhouse等人,Nucl. Acids. Res.21:2265-2266(1993)。因此,这些技术是用于分离单克隆抗体的常规单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
例如通过用重链和轻链(CH和CL)恒定区序列取代同源鼠序列(US 4816567和Morrison等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA:81:6851(1984),或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的全部或部分编码序列共价融合,可以修饰编码抗体的DNA,例如以便产生嵌合或融合抗体多肽。非免疫球蛋白多肽序列可以取代抗体的恒定区,或者它们可以取代抗体的一个抗原结合中心的可变结构域,以产生包含对于抗原具有特异性的一个抗原结合位点、以及对于不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点的嵌合二价抗体。
人源化抗体
用于产生“人源化”非人动物抗体的方法是本领域众所周知的。优选地,人源化抗体具有从其为非人的来源引入其内的一个或多个整合的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常被称为“输入”残基,因为它们通常取自“输入”可变区。可以通过用高变区序列取代人抗体的相应序列,基本上遵循Winter和合著者的方法(Jones等人,Nature,321:522-525(1986))来执行人源化。相应地,此类“人源化”抗体是嵌合抗体(US 4816567),其中基本上小于完整人可变区的区域已被来自非人物种的相应序列取代。实际上,人源化抗体通常是人抗体,其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿类动物抗体中的类似区域的残基取代。
当抗体预期用于人的治疗用途时,待用于产生人源化抗体的人可变区(轻和重两者)的选择,对于减少抗原性和HAMA应答(人抗小鼠抗体)是非常重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法,针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿类动物抗体的可变区的序列。鉴定最接近于啮齿类动物的人V结构域序列,并且选择在其内的人构架区(FR),其适用于人源化抗体中(Sims等人,J. Immunol. 151:2296(1993)。另一种方法使用衍生自所有人抗体的轻链或重链的特定亚组的共有序列的特定构架区。相同构架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA:89:4285(1992)。
待人源化的抗体保留对于抗原的高结合亲和力和其它重要的生物学特性也很重要。为此,根据优选的方法,通过使用亲本和人源化序列的概念性三维模型分析亲本序列和各种人源化产物,来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可获得的,并且是本领域技术人员所熟悉的。计算机程序是可获得的,其说明并展示了所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。这些图像的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用,即,分析影响候选免疫球蛋白结合抗原的能力的残基。以这种方式,可以选择FR残基,并且与受体和输入序列组合,以获得所需的抗体特征,例如对于靶抗原的亲和力增加。一般而言,高变区残基直接且最基本地涉及影响抗原结合。
人源化抗体可以是抗体片段,例如Fab,其任选地与一种或多种细胞毒性剂缀合,以生成免疫缀合物。可替代地,人源化抗体可以是全长抗体,例如全长IgG1抗体。
基于噬菌体展示文库的人抗体和方法
作为人源化的替代方案,可以生成人抗体。例如,目前能够产生转基因动物(例如小鼠),其能够在免疫后产生全范围的人抗体,而无内源性免疫球蛋白产生。例如,已描述了在嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链连接区(JH)基因的纯合性缺失,导致内源抗体产生的完全抑制。人种系免疫球蛋白基因阵列转移到此类种系突变小鼠内,导致在抗原攻击后人抗体的产生(US 5545806、5569825、5591669(全部为GenPharm);5545807;和WO 97/17852)。
可替代地,噬菌体展示技术(McCafferty等人,Nature,348:552-553(1990),可以用于从来自免疫供体机体的免疫球蛋白可变(V)区基因储库,在体外产生人抗体和抗体片段。根据这种技术,抗体V区基因与丝状噬菌体(例如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因一起在框内克隆,并且在噬菌体颗粒的表面上作为功能性抗体片段展示。因为丝状噬菌体含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝,所以基于抗体的功能特性的选择也导致选择编码显示出所述特性的抗体的基因,因此,噬菌体模拟一些B细胞特性。噬菌体展示可以以各种形式执行。V基因区段的几个来源可以用于噬菌体展示。Clackson等人,Nature,352:624-628(1991),从衍生自免疫小鼠的脾的V基因的小型随机组合文库中,分离了抗噁唑酮抗体的各种阵列。可以构建来自未免疫的人供体的V基因储库,并且可以基本上遵循由Marks等人,J.Mol. Biol. 222:581-597(1991)描述的技术,分离针对抗原(包括自身抗原)的不同阵列的抗体。
如上所述,人抗体也可以由体外活化的B细胞生成(参见US 5567610和5229275)。
抗体片段
在某些情况下,可建议使用抗体片段而不是完整抗体。片段的小尺寸促成其快速清除,并且可以促成更好地穿透到致密肿瘤内。
已开发了用于产生抗体片段的各种技术。常规地,这些片段经由完整抗体的蛋白酶解消化而衍生。然而,这些片段目前可以直接由重组宿主细胞产生。Fab、Fv和ScFv抗体片段可以在大肠杆菌中表达且由其分泌,因此允许促进大量这些片段的产生。可以从上文描述的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。根据另一个实施方案,Fab'-SH片段可以直接从大肠杆菌中分离,并且化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992)。根据另一种方法,可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab')2片段。在US5869046中描述了具有增加的体内半衰期、保留表位结合受体残基的Fab和F(ab')2片段。用于产生抗体片段的其它技术对于本领域技术人员将是显而易见的。在其它实施方案中,选择的抗体是单链Fv片段(scFv)(参见WO 93/16185;US 5571894和US 5587458)。Fv和scFv是具有完整结合位点的唯一种类,其缺乏恒定区;结果,它们适合于在体内使用过程中减少非特异性结合。可以构建scFv融合蛋白,以在scFv的N末端或C末端处产生效应蛋白的融合。抗体片段也可以是例如如美国专利5641870中所述的“线性抗体”。此类线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
双特异性抗体
双特异性抗体是对于至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。例如,双特异性抗体可以结合抗IL-5Rα抗体蛋白的两个不同表位。其它双特异性抗体可以组合与关于另一种蛋白质的结合位点组合的抗IL-5Rα抗体结合位点。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段(例如,双特异性抗体的F(ab')2)。
用于产生双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的常规生产是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达,其中两条链具有不同的特异性。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配,这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物,其中仅一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析在几个步骤中完成的正确分子的纯化是相当麻烦的,并且产物产率很低。WO 93/08829中公开了类似的程序。
根据不同的方法,将具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体的抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选地,融合用Ig重链恒定区进行,所述Ig重链恒定区包括铰链、CH2和CH3区的至少一部分。优选地,在至少一个融合物中存在含有对于轻链结合所必要的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和(需要时)免疫球蛋白轻链的DNA插入各种表达载体内,并且共转染到合适的宿主细胞内。当在构建中使用三条多肽链的不相等比率以提供最佳产率时,在实施方案中,这在选择三个多肽片段的相互比例方面提供了更大的灵活性。然而,当至少两条多肽链以相等比率的表达导致高产率时,或者当比率没有明显影响时,能够将编码序列插入单个表达载体中的两条或全部三条多肽链内。
在该方法的一个优选实施方案中,双特异性抗体是在第一臂中提供第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链、以及在第二臂中的杂交免疫球蛋白重链/轻链对(提供第二结合特异性)。已发现这种不对称结构促进了所需的双特异性分子与不需要的免疫球蛋白链组合的分开,因为免疫球蛋白轻链在双特异性分子的仅一半中的存在促进分开。这种方法公开于WO 94/04690中。有关产生双特异性抗体的更多细节,参见例如Suresh等人,Methodsin Enzymology 121:210(1986)。
根据US 5731168中描述的另一种方法,一对抗体分子之间的界面可以构建为最大化得自重组细胞培养物的异二聚体的百分比。优选的界面包含CH3区的至少一部分。根据这种方法,将具有来自第一抗体分子的界面的侧链的一个或多个小氨基酸替换为较大的侧链(例如,酪氨酸或色氨酸)。通过将含有大侧链的氨基酸替换为含有较小侧链的氨基酸(例如丙氨酸或苏氨酸),在第二抗体分子的界面上产生了与大侧链等同或相似大小的补偿“腔”。与其它不需要的终产物相比,这提供了用于增加异二聚体产率的机制。
双特异性抗体包括交联的或“异源缀合物”抗体。例如,异源缀合物中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶联,而另一种与生物素偶联。此类抗体可以例如用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(US 4676980),以及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。异源缀合物抗体可以使用任何方便的交联方法制备。合适的交联剂是本领域众所周知的,并且连同各种交联技术一起公开于US 4676980中。
用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术也已在文献中描述。例如,可以使用化学结合来制备双特异性抗体。Brennan等人,Science 229:81(1985)已描述了一种程序,根据其将完整抗体蛋白酶解切割,以产生F(ab')2。这些片段在二硫醇络合剂(如亚砷酸钠)的存在下被还原,以稳定邻位二硫醇并且防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab'片段转换为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将一种Fab'-TNB衍生物再转换为Fab'-硫醇,并且与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合,以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可以用作用于选择性固定酶的试剂。
最近的进展已促进了从大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段,所述片段可以化学偶联,以产生双特异性抗体。Shalaby等人,J. Exp. Med. 175:217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体分子的F(ab')2的产生。每个Fab'分别由大肠杆菌分泌,并且在体外经受直接化学偶联,以形成双特异性抗体。
用于直接从重组细胞培养物生产且分离双特异性抗体片段的各种技术也已得到描述。例如,已使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体(Kostelny等人,J. Immunol. 148(5):1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'连接。抗体同二聚体在铰链区处还原以形成单体,然后再氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可以用于抗体同二聚体的生产。由Hollinger等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术是用于产生双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头与VL区连接的VH区,所述接头太短而不允许相同链上的两个结构域之间的配对。相应地,一个片段的VH和VL区必须与另一个片段的互补VL和VH区配对,从而形成两个抗原结合位点。使用单链(Fv)-(sFv)二聚体,用于产生双特异性抗体片段的另一种策略也已得到描述(参见Gruber等人,J. Immunol.,152:5368(1994)。
本发明还提供了具有多于两个效价的抗体。例如,可以产生三特异性或四特异性抗体。
多价抗体
多价抗体可以比二价抗体更快速地被细胞内化(和/或分解代谢),所述细胞表达抗体与之结合的抗原。本文提议的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(其不同于IgM类别的抗体)(例如四价抗体),其可以通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而容易地产生。多价抗体可以包含二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚结构域包含Fc片段或铰链区(或由其组成)。在此类情况下,该抗体将包含Fc片段和在该Fc片段的N末端处的三个或更多个抗原结合位点。本文优选的多价抗体包含3至约8个,但优选4个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链),其中所述多肽链包含两个或更多个可变区。例如,所述多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc,其中VD1指第一可变区,VD2指第二可变区,Fc指Fc片段的一条多肽链,X1和X2指氨基酸或多肽,并且n为0或1。例如,多肽链可以包含下述链:VH-CH 1-柔性接头-VH-CH1-Fc片段;或VH-CH1-VH-CH1-Fc片段。在本文中的多价抗体优选进一步包含至少2个(且优选4个)轻链可变区多肽。在本文中的多价抗体可以例如包含约2至约8个轻链可变区多肽。在本发明的上下文中,轻链可变区多肽包含轻链可变区,并且任选地进一步包含CL区。
药物组合物
在另一个方面,本发明提供了药物组合物,其包含IL-5Rα特异性抗体作为活性成分(或作为唯一的活性成分)。如本文所述,药物组合物可以包括对于IL-5Rα特异性的至少一种抗体,和/或靶向一种或多种相应表面受体的一种或多种另外的结合分子(例如,抗体)。在一些实施方案中,该组合物预期改善、预防或治疗可以起因于IL-5与其细胞受体的相互作用的病症。
“药物组合物”意指组合物,其包含本发明的抗IL-5Rα抗体以及选自药学上可接受的和药学上相容的赋形剂的至少一种组分,例如填料、溶剂、稀释剂、载体、助剂、分配剂、递送剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂、延递送控制剂,其选择和比例取决于施用的类型和途径以及剂量。本发明的药物组合物及其制备方法对于本领域技术人员无疑是显而易见的。药物组合物应该优选遵照GMP(良好生产规范)要求进行制造。该组合物可以包含缓冲剂组合物、张度剂、稳定剂和增溶剂。组合物的延长作用可以通过减慢活性药物成分的吸收的试剂,例如单硬脂酸铝和明胶来实现。合适的载体、溶剂、稀释剂和递送剂的实例包括水、乙醇、多元醇及其混合物、油和用于注射的有机酯。
“药剂(药物)” – 是以片剂、胶囊、粉末、冻干制剂、注射剂、输液剂、软膏和其它现成形式的化合物(或作为药物组合物的化合物的混合物),其预期用于恢复、改善或改变人和动物中的生理功能,以及用于疾病的治疗和预防,用于诊断、麻醉、避孕、美容及其它。本领域公认的用于施用肽、蛋白质或抗体的任何方法都可以适当地用于本发明的抗IL-5Rα抗体。
术语“药学上可接受的”指适合于在哺乳动物,优选人中施用的一种或多种相容的液体或固体组分。
术语“赋形剂”在本文中用于描述除本发明的上述成分外的任何成分。这些是无机或有机性质的物质,其用于药物制造中,以便给予药物产品必要的物理化学特性。
如本文使用的,“缓冲液”、“缓冲液组合物”,“缓冲剂”指这样的溶液,其能够通过其酸碱共轭组分的作用而抵抗pH中的变化,并且允许抗IL-5Rα抗体药物抵抗pH中的变化。一般地,药物组合物优选具有在4.0至8.0范围内的pH。所使用的缓冲液的实例包括但不限于乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐等缓冲溶液。
如本文使用的,术语“张度剂(tonic agent)”、“渗透物”或“渗透剂”指可以增加液体抗体制剂的渗透压的赋形剂。“等渗”药物是具有与人血相当的渗透压的药物。等渗药物通常具有约250至350 mOsm/kg的渗透压。使用的等渗剂包括但不限于多元醇、糖和蔗糖、氨基酸、金属盐例如氯化钠等。
“稳定剂”指提供活性剂的物理和/或化学稳定性的赋形剂、或者两种或更多种赋形剂的混合物。稳定剂包括氨基酸,例如但不限于精氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸;表面活性剂,例如但不限于聚山梨醇酯20(商品名称:Tween 20)、聚山梨醇酯80(商品名称:Tween 80)、聚乙烯-聚丙二醇及其共聚物(商品名称:泊洛沙姆、普流尼克、十二烷基硫酸钠(SDS);抗氧化剂,例如但不限于甲硫氨酸、乙酰半胱氨酸、抗坏血酸、单硫代甘油、亚硫酸盐等;螯合剂例如但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、柠檬酸钠等。
如果在指定的贮存温度例如2–8°C下,在指定的贮存期限过程中,活性剂保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性,则药物组合物是“稳定的”。优选地,活性剂保留物理和化学稳定性两者、以及生物活性。基于在加速或天然老化条件下的稳定性测试结果,来调整贮存期限。
本发明的药物组合物可以以现成制剂形式的单一单位剂量或多个单一单位剂量的形式制造,包装或广泛销售。如本文使用的,术语“单一单位剂量”指离散数量的含有预定数量的活性成分的药物组合物。活性成分的数量通常等于待在受试者中施用的活性成分的剂量,或此类剂量的方便部分,例如此类剂量的一半或三分之一。
根据本发明的药物组合物通常适合于作为无菌制剂肠胃外施用,其预期借助于注射、输注和植入绕过胃肠道,通过皮肤和粘膜屏障中的破裂而在人体中施用。例如,肠胃外施用尤其包括皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、滑膜内、经皮注射或输注;和肾透析输液技术。还提供了区域灌注。优选的实施方案包括静脉内和皮下途径。本领域公认的用于施用肽或蛋白质的任何方法都可以适当地用于本发明的抗IL-5Rα抗体。
可注射制剂可以以单位剂量形式(而无限制)制备、包装或销售,例如在安瓿瓶、小瓶、塑料容器、预填充注射器、自动注射装置中。用于肠胃外施用的制剂尤其包括悬浮液、溶液、在油性或水性基质中的乳剂、糊剂等等。
在另一个实施方案中,本发明提供了用于肠胃外施用的组合物,其包含以干燥(即粉末或颗粒)形式提供的药物组合物,用于在施用前由合适的基质(例如灭菌无热原水)重构。此类制剂可以通过例如冻干过程进行制备,所述冻干过程在本领域中称为冷冻干燥,并且涉及将产物冷冻,随后为从冷冻材料中去除溶剂。
本发明的抗IL-5Rα抗体还可以单独或作为具有合适的药学上可接受的赋形剂的混合物,鼻内施用或通过从吸入器(例如加压气溶胶容器、泵、喷射器、喷雾器或雾化器)吸入施用,其中使用或不使用合适的推进剂,或者作为滴鼻剂或喷雾剂施用。
用于肠胃外施用的剂型可以配制为立即释放或修饰释放。修饰释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、受控释放、靶向释放和程序释放。
本发明的抗IL-5Rα抗体的治疗用途
在一个方面,本发明的抗IL-5Rα抗体可用于治疗与IL-5活性相关的病症。
在一个方面,本发明的抗IL-5Rα抗体可用于治疗疾病或病症,其中所述疾病或病症选自:哮喘,例如嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘),例如重度嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘);COPD(慢性阻塞性肺疾病);Churg-Strauss综合征;嗜酸性粒细胞性食管炎;嗜酸性粒细胞性胃肠炎,高嗜酸性粒细胞综合征。
在一个方面,治疗受试者或患者是哺乳动物,优选人受试者。所述受试者可以是任何年龄的男性或女性。
如本文使用的,提及抗IL-5Rα抗体和一种或多种其它治疗剂的术语“共施用”、“共施用的”和“与……组合”,预期意指下述、提及下述或包括下述:
1)本发明的抗IL-5Rα抗体和治疗剂的此类组合同时施用于需要治疗的患者,此时此类组分一起配制成单一剂型,所述单一剂型在基本上相同的时间将所述组分释放给所述患者,
2)本发明的抗IL-5Rα抗体和治疗剂的此类组合基本上同时施用于需要治疗的患者,此时此类组分彼此分开配制成分开的剂型,所述分开的剂型在基本上相同的时间由所述患者服用,随即所述组分在基本上相同的时间释放给所述患者,
3)本发明的抗IL-5Rα抗体和治疗剂的此类组合序贯施用于需要治疗的患者,此时此类组分彼此分开配制成分开的剂型,所述分开的剂型在连续的时间由所述患者服用,其中在每次施用之间具有显著的时间间隔,随即所述组分在基本上不同的时间释放给所述患者;和
4)本发明的抗IL-5Rα抗体和治疗剂的此类组合序贯施用于需要治疗的患者,此时此类组分一起配制成单一剂型,所述单个剂型以受控方式释放所述组分,随即它们在相同和/或不同的时间同时、连续或联合释放给所述患者,其中每个部分可以通过相同或不同途径施用。
本发明的抗IL-5Rα抗体可以无需进一步治疗性处理,即作为独立疗法进行施用。此外,通过本发明的抗IL-5Rα抗体的治疗可以包括至少一种另外的治疗性处理(组合疗法)。在一些实施方案中,抗IL-5Rα抗体可以与不同的药剂/自身免疫性疾病药物一起或组合进行施用。
在上述自身免疫性疾病或相关的自身免疫性状况的治疗中,与不同治疗剂组合的本文提议的抗IL-5Rα抗体可以使用多药方案在患者中施用。抗IL-5Rα抗体可以与免疫压制剂同时、序贯、序贯或交替施用,或者在显示对不同疗法的抗性之后施用。与本领域中使用的那些相比,可以使用相同或更低的免疫压制剂剂量。当选择优选的免疫压制剂时,应该考虑许多因素,包括待治疗的疾病类型和患者的病历。
如本文使用的,在附加疗法中使用的术语“治疗剂”指直接压制或掩蔽患者的免疫系统的物质,例如小分子、抗体或类固醇激素,例如皮质类固醇。此类试剂可以是抑制细胞因子产生,下调或压制自身抗原表达或掩蔽主要组织相容性复合物(MHC)抗原的物质。此类试剂的实例包括类固醇,例如糖皮质激素,例如泼尼松、甲泼尼龙和地塞米松;2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见US 4665077),硫唑嘌呤(或在针对硫唑嘌呤的不良反应的情况下,环磷酰胺);溴隐亭;戊二醛(如US 4120649中所述,其掩蔽MHC抗原);针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体;环孢霉素A;细胞因子和细胞因子受体拮抗剂,包括干扰素-γ、-β或-α抗体;抗肿瘤坏死因子抗体;抗白细胞介素2抗体和抗IL-2受体抗体;抗L3T4抗体,异源抗淋巴细胞球蛋白,泛T抗体,优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体;含有LFA-3结合结构域的可溶性肽(WO 90/08187,1990年6月26日公开);链激酶;TGF-p;链道酶;宿主DNA/RNA;FK506;RS-61443;脱氧精胍菌素;雷帕霉素;T细胞受体(US 5114721);T细胞受体片段(Offner等人,Science 251:430-432(1991);WO 90/11294;和WO 91/01133);和T细胞受体抗体(ЕР340109),例如T10B9。
本发明的抗IL-5Rα抗体意欲可以用于如上所述的治疗方法中,可以用于如上所述的治疗中,和/或可以用于如上所述的治疗的药剂的制造中。
剂量和施用途径
本发明的抗IL-5Rα抗体将以有效治疗所讨论的状况的量施用,即以达到所需结果所需要的剂量和时间段过程中。治疗有效量可以根据因素而变,所述因素例如待治疗的具体状况,患者的年龄、性别和重量,以及抗IL-5Rα抗体是单独施用、还是与一种或多种另外的抗自身免疫或抗炎治疗技术组合施用。
可以调整剂量方案以提供最佳应答。例如,可以施用单次推注,可以随着时间过去施用几个分份剂量,或者可以如由治疗情况的紧急程度指示的,按比例减少或增加剂量。以单位剂型配制肠胃外组合物是尤其有利的,用于施用的容易性和剂量的均匀性。如本文使用的,单位剂型预期指适于作为用于待治疗的患者/受试者的单位剂量的物理上离散的单位;每个单位含有预定数量的活性化合物,所述预定数量计算为与所需药物载体结合产生所需疗效。关于本发明的单位剂型的规格通常由以下因素决定,并直接取决于以下:(a)化学治疗剂的独特特征和待实现的特定治疗或预防效应,以及(b)配制用于治疗受试者中的敏感性的此类活性化合物的领域中固有的局限性。
因此,基于本文提供的公开内容,技术人员将了解,根据治疗领域中众所周知的方法来调整剂量和剂量方案。即,可以容易地测定最大可耐受剂量,并且还可以测定向患者提供可检测的疗效的有效量,以及可以施用每种试剂以向患者提供可检测的疗效的时间要求。因此,尽管本文例示了某些剂量和施用方案,但这些实例绝不限制在实践本发明的实施方案中可以提供给患者的剂量和施用方案。
应注意,剂量值可以随着待缓解的状况的类型和严重性而变,并且可以包括单一剂量或多重剂量。此外,应理解,对于任何特定受试者,应该根据个体需要和施用或监督组合物施用的医学专业人员的判断,随着时间过去调整具体的剂量方案,并且本文阐述的剂量范围仅是示例性的,并不预期限制请求保护的组合物的范围或实践。此外,关于本发明组合物的施用方案可以基于各种因素,包括疾病的类型,患者的年龄、重量、性别、医学状况,状况的严重性,施用途径,以及采用的特定抗IL-5Rα抗体。因此,剂量方案可以广泛改变,但可以使用标准方法照常规测定。例如,可以基于药代动力学或药效学参数来调整剂量,所述药代动力学或药效学参数可以包括临床效应,例如毒性效应和/或实验室值。因此,本发明涵盖由本领域技术人员测定的患者内剂量递增。用于测定适当剂量和方案的方法是本领域众所周知的,并且一旦提供了本文公开的构想,本领域技术人员就会理解。
上文提供了合适的施用方法的实例。
认为本发明的抗IL-5Rα抗体的合适剂量将在0.1-200 mg/kg的范围内,优选0.1-100 mg/kg,包括约0.5-50 mg/kg,例如约1-20 mg/kg。抗IL-5Rα抗体可以例如以至少0.25mg/kg的剂量施用,例如至少0.5 mg/kg,包括至少1 mg/kg,例如至少1.5 mg/kg,例如至少2mg/kg,例如至少3 mg/kg,包括至少4 mg/kg,例如至少5 mg/kg;以及例如直到最多50 mg/kg,包括直到最多30 mg/kg,例如直到最多20 mg/kg,包括直到最多15 mg/kg。通常以适当的时间间隔重复施用,例如每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次,以及与由负责的医生认为适当的一样久,在一些情况下,所述医生可以在必要时增加或减少剂量。
制造物品(产品)和试剂盒
根据另一个实施方案,本发明提供了制造物品,其包括预期用于治疗自身免疫性疾病和相关状况的产品,所述自身免疫性疾病和相关状况例如哮喘,例如嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘),例如重度嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘);COPD(慢性阻塞性肺疾病);Churg-Strauss综合征;嗜酸性粒细胞性食管炎;嗜酸性粒细胞性胃肠炎或高嗜酸性粒细胞综合征。该产品是具有标签和包装插页的容器,其可以在泡罩和/或包装中。合适的容器包括例如小瓶、安瓿、注射器等。容器可以由各种材料例如玻璃或聚合物材料制成。容器包含对于治疗某种状况有效的组合物,并且可以具有无菌进入口。组合物中的至少一种活性成分是根据本发明的抗IL-5Rα抗体。标签和包装插页指示该药物预期用于治疗某种状况。标签和/或包装插页另外含有用于在患者中施用抗体组合物的说明书,包括此类治疗产品的适应症、频率、剂量、施用途径、禁忌和/或警告。在一个实施方案中,包装插页指示该组合物预期用于治疗哮喘,例如嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘),例如重度嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘);COPD(慢性阻塞性肺疾病);Churg-Strauss综合征;嗜酸性粒细胞性食管炎;嗜酸性粒细胞性胃肠炎或高嗜酸性粒细胞综合征。
此外,制造物品可以包括但不限于对于商业目的或消费者必要的其它产品,例如溶剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
本发明还涉及试剂盒,其可以用于各种目的,例如,从细胞中纯化或免疫沉淀IL-5Rα,以分离携带IL-5Rα的细胞。用于分离和纯化抗IL-5Rα抗体或携带IL-5Rα的细胞的试剂盒。试剂盒可以包含与颗粒(例如琼脂糖凝胶颗粒或磁性颗粒)结合的抗IL-5Rα抗体。试剂盒含有容器、标签和包装插页。
诊断用途和组合物
本发明的抗IL-5Rα抗体也用于诊断过程中(例如在体外、离体)。例如,抗IL-5Rα抗体可以用于检测或测量得自患者的样品(例如组织样品或体液样品,例如炎性渗出物、血液、血清、肠液、唾液或尿)中的IL-5Rα水平。用于检测和测量的合适方法包括免疫测定,例如流式细胞术、酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光测定、放射性免疫测定和免疫组织学。本发明进一步包括试剂盒,例如,包含本文所述的抗IL-5Rα抗体的诊断试剂盒。
实施例
提供下述实施例用于更好地理解本发明。这些实施例仅出于说明目的,而不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文。尽管本发明已通过说明和实例的方式略微详细地进行描述用于清楚理解的目的,但根据本发明的教导,对于本领域的普通技术人员显而易见的是,可以对其进行某些改变和修改,而不背离所附实施方案的精神或范围。
材料和一般方法
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下中给出:Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。抗体链的氨基酸根据EU编号进行编号并提及(Edelman,G.M.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. Natl. Acad. Sci.USA 63(1969)78-85;Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,(1991)。
重组DNA技术
如Sambrook,J.等人,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述,使用标准方法来操纵DNA。分子生物学试剂根据制造商的说明书使用。
基因合成
从通过化学合成制备的寡核苷酸制备所需的基因区段。侧翼为单个限制性位点的300-4000 kb长的基因区段,通过退火和寡核苷酸的连接包括PCR扩增进行组装,并且随后经由所示的限制性位点进行克隆。通过DNA测序确认亚克隆基因片段的DNA序列。
DNA序列测定
通过桑格测序测定DNA序列。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
Infomax的Vector NT1 Advance套件版本8.0用于序列创建,映射,分析,注释和说明。
表达载体
对于所述抗体和抗原的表达,应用预期用于在原核细胞(大肠杆菌)中表达,在真核细胞中(例如在CHO细胞中)瞬时表达的表达质粒的变体。除了抗体表达盒以外,载体还含有:复制起点,其允许所述质粒在大肠杆菌中复制,在大肠杆菌中赋予对各种抗生素(例如,氨苄青霉素和卡那霉素)的抗性的基因。
如下文所述的包含所述抗体链的融合基因通过PCR和/或基因合成生成,并且用已知的重组方法和技术,通过连接相应的核酸区段,例如使用相应载体中的独特限制性位点进行组装。通过DNA测序验证亚克隆的核酸序列。对于瞬时转染,通过来自转化的大肠杆菌培养物的质粒制备物来制备较大数量的质粒。
实施例1
重组抗原和抗体在悬浮哺乳动物细胞培养中的生产
将编码人和动物IL-5Rα的细胞外结构域的序列克隆到质粒pEE内的SalI/NotI限制性位点处,所述质粒具有EPEA、FC和H6F标签,以产生蛋白质(图1、2、3)。所需数量的质粒在大肠杆菌细胞中产生,并且使用Qiagen试剂盒纯化。
根据公开的方案[Cytotechnology(2012)64:613-622],在得自中国仓鼠卵巢细胞(CHO-T细胞系)的建立细胞系的细胞中产生抗原,在CHO中产生抗体。使用补充有8 mM L-谷氨酰胺和1 g/l普流尼克68、来自HyCell TransFx-C的无血清培养基,在定轨振荡器上的烧瓶中进行悬浮培养。对于瞬时表达,借助于线性聚乙烯亚胺(PEI MAX,Polysciences)转染浓度为2-2,2*106 c/ml的细胞。DNA/PEI比为1:3/1:10。在转染后5-7天内,使细胞培养物在2000 g下离心20分钟,并且通过0.22 µm过滤器进行过滤。通过亲和HPLC从培养液中分离靶蛋白。
使用吸附剂CaptureSelect C-tag Affinity Matrix,分离在蛋白质的C末端处包含EPEA标签(谷氨酸-脯氨酸-谷氨酸-丙氨酸)的重组蛋白。使培养液通过预填充有5 ml C-tag吸附剂的层析柱,然后用25 ml PBS洗涤该柱,以去除任何非特异性结合的组分。在温和条件下,使用20 mM Tris,2 M MgCl2(pH 7.0-7.4)洗脱结合的抗原。然后使用半透性透析膜,将蛋白质透析到PBS(pH 7.4)内,过滤(0.22 µm),转移到管内,并且贮存于-70°C下。
使用吸附剂5 ml HiTrap rProtein A Sepharose FF(GE Healthcare),分离重组Fc蛋白。使柱平衡,然后用5体积的PBS洗涤,以去除非特异性结合的组分。用0.1 M甘氨酸缓冲液(pH 3)洗脱结合的抗原。收集首要的蛋白质洗脱峰,并且用1 M Tris缓冲液(pH 8)达到中性pH。所有阶段都在110 cm/小时流速下进行。然后使用SnakeSkin Dialysis Tubing技术,将蛋白质透析到PBS(pH 7.4)内,过滤(0.22 µm),转移到管内,并且贮存于-70°C下。
使用Ni-NTA(QIAGEN)柱分离加上His标签的重组蛋白,用平衡缓冲液(50 mMNaH2PO4、300 mM NaCl、10 mM咪唑(pH 8.0)),将吸附剂洗涤3次。将培养液pH调整至8.0,加入NiCl2至1 mM的最终浓度。将吸收剂转移到培养液内,在4°C下伴随搅拌温育2小时,并且用十柱体积的缓冲液(50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、10 mM咪唑)洗涤,用二十个柱体积(50mM NaH2PO4、1 M NaCl、20 mM咪唑)洗涤,用十个体积的PBS(pH 7.4)洗涤,用50 mMNaH2PO4、300 mM NaCl、250 mM咪唑(pH 8.0)洗脱。将蛋白质溶液转换到PBS(pH 7.4)内,并且在-70°C下冷冻。
通过还原和非还原SDS-PAGE,评估所获得的蛋白质溶液的纯度(图4、5、6)。
实施例2
首次用于实验的人Fab噬菌体文库MeganLibTM的改造
根据建议的方案,使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN),分离了来自一千多个个别人供体的血液样品的B淋巴细胞的总RNA。使用Nanovue试剂盒(GE Healthcare)执行RNA浓度测定;借助于1.5%琼脂糖凝胶电泳测试分离的RNA的质量。
根据推荐的方案,使用MMLV RT试剂盒(Evrogen),用MMuLV逆转录酶和随机六聚体寡核苷酸作为引物,来进行逆转录反应。
逆转录产物在两阶段聚合酶链反应中用作基质,以获得侧翼为限制性位点的可变结构域的基因;根据通过[J Biol Chem. 1999 Jun 25;274(26):18218-30]的方案,使用寡核苷酸试剂盒来执行反应。
用NheI/Eco91I限制性核酸内切酶处理所获得的DNA制备物VL-CK-VH(图3),并且连接到原始噬菌粒pH5内(图4)。将连接产物转化到根据方案[Methods Enzymol. 2000;328:333-63.]制备的SS320大肠杆菌电感受态细胞内。组合Fab噬菌体展示文库MeganLibTM的储库是1011个转化体。Fab噬菌体文库的制备根据较早描述的程序[J Mol Biol. 1991Dec 5;222(3):581-97]进行制备。
实施例3
通过噬菌体展示生产人抗IL-5Rα Fab
特异性的抗IL-5Rα人噬菌体Fab得自组合Fab噬菌体展示文库MeganLibTM。通过噬菌体展示[Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):309-14;J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581-97],对人IL-5Rα执行生物淘选,但使用磁珠和KingFisher Flex装置,由于该技术允许同时执行至多96种不同的方案和变体的事实。
将人生物素化的IL-5Rα抗原(Fc,EPEA)有目的地固定到链霉抗生物素蛋白磁珠(NEB)的表面上,其浓度对于第一轮为10 μg/ml,对于第二轮为2 μg/ml,对于第三轮和第四轮分别为0.4和0.2 μg/ml。使抗原与磁珠一起在室温下在旋转器上温育1小时。然后将珠用PBS(pH 7.4)洗涤,用2%脱脂乳或1% BSA/PBS(pH 7.4)溶液封闭珠表面1小时。将人噬菌体文库MeganLibTM在PBS(pH 7.4)中以2*1013个噬菌体颗粒/ml的浓度稀释,所述PBS具有2%脱脂乳和含有靶抗原标签的非靶抗原,并且通过在表面上不含抗原的磁珠进行预选,以便去除非特异性结合的噬菌体。然后使IL-5Rα包被的磁珠与MeganLibTM一起在室温下温育1-2小时。
通过用具有0.1% Tween 20的PBS(pH 7.4)溶液洗涤磁珠的几个循环来去除未结合的噬菌体。洗涤循环的次数逐轮增加(在第一轮中3个洗涤循环,在第二轮中9个洗涤循环,以及在第四轮中15个洗涤循环)。在搅拌的同时,用100 mM Gly-HCl溶液(pH 2.2)从珠中洗脱与磁珠的表面上的抗原结合的噬菌体15分钟,然后用1M Tris-HCl(pH 7.6)中和该溶液。大肠杆菌TG1细菌被噬菌体感染,在培养基中生长,并且用于下一个选择循环中。在三或四轮后,根据制造商的(Qiagen)方案,从大肠杆菌TG1培养物中分离噬菌粒DNA。多克隆噬菌体酶免疫测定(ELISA)用于富集针对靶抗原的文库、以及评价非特异性结合的噬菌体颗粒的存在。
实施例4
针对特异性和非特异性抗原的多克隆噬菌体的ELISA
将靶抗原IL-5Rα-Fc和具有Fc融合蛋白的非靶抗原固定到高吸收板(Greiner-Bio)上,以便执行ELISA。蛋白质在0.1 M NaHCO3(pH 9.0)中分别以1 μg/ml和5 μg/ml的浓度加入,并且以2至7个稀释度的增量进行滴定,然后使密封的板在4°C下温育过夜。使用高性能的基于自动化Tecan Freedom EVO 200的机器人平台(Tecan),根据标准ELISA方案,进行所有后续步骤。为了阻断非特异性结合,将包含在PBS(pH 7.4)中的2%脱脂乳或1% BSA的阻断缓冲液加入板孔中。使板在室温下温育1小时。在用含有Tween 20的磷酸盐-盐水缓冲液(PBST)的几个洗涤循环后,加入50 μl/孔的处于测试下的多克隆噬菌体。在洗涤后,用在PBST中的抗M13 HRP缀合的二抗(Pierce-ThermoScientific)(1:7500)包被(50 µl/孔)每个孔。在室温下温育50分钟后,将板用PBST洗涤三次。通过添加底物溶液(在CH3COONa pH 5.5中的H2O2-0.02%和TMB)10分钟获得比色信号;然后通过添加1%硫酸(20 μl)阻断显色。使用合适的Tecan-Sunrise板阅读器(Tecan),在450 nm处测量颜色信号。
在对靶抗原的第三轮和第四轮选择后,多克隆噬菌体制备物的ELISA显示了显著富集(图10)。选择文库用于再克隆和进一步筛选,其中在噬菌体文库的最小稀释度下,观察到信号超过非同源对照抗原5倍。
实施例5
将抗体可变结构域的基因再克隆到表达质粒内
使用限制性连接技术,根据标准方案,在成功轮次的选择后,进行抗体可变结构域的基因从噬菌粒载体再克隆到表达质粒内(图9)。
随后,将包含抗体片段的表达载体转化到大肠杆菌BL21-Gold菌株内,用于使用Mabnext Flow Chart平台,通过ELISA比较分析来自展示文库的可变抗体片段对抗原的亲和力。
实施例6
从选择后的文库中选择特异性结合人IL-5Rα的高亲和力克隆
根据标准技术生产Fab:用含有Fab基因的表达载体转化大肠杆菌BL21-Gold细菌细胞,随后添加触发lac操纵子转录的诱导剂,从而在培养所得到的转化体时,引起输出到周质空间内的Fab的表达。然后执行ELISA,以验证Fab与在0.1 M NaHCO3(pH 9.0)中、在板(来自Greiner bio one的中等结合)上浓度为0.2 μg/ml的固定底物的IL-5Rα-EPEA抗原的结合(抗原在4°C下固定过夜)。插入表达质粒pLL内的Fab贝那利珠单抗(Medimmune)序列用作阳性对照。使用基于机器人系统Genetix Qpix2xt(Molecular Devices)和Tecan FreedomEVO 200(Tecan)的高性能自动化平台,根据标准ELISA方案,在室温下进行所有进一步步骤。在每个步骤后执行洗涤,用300 μl/孔的1x PBST进行三次重复。用1x PBS中的1%脱脂乳封闭板上的非特异性结合位点,在洗涤后添加由大肠杆菌上清液代表的分析物(60 μl/孔的大肠杆菌上清液)。使用过氧化物酶缀合的山羊抗Fab抗体(Pierce-ThermoScientific)(1:7500)来检测免疫复合物。通过添加50 μl底物溶液(CH3COONa(pH 5.5)中的H2O2-0.02%和TMB),将底物显色混合物染色15分钟。使用25μl 1% H2SO4来终止反应。使用合适的Tecan-Sunrise板阅读器(Tecan),在450 nm处测量颜色信号。抗体结合与产生的信号成比例。通过ELISA针对非特异性结合测试其中颜色信号超过来自对照抗体的信号的克隆。
实施例7
所选Fab与不同抗原的非特异性结合的分析
ELISA也用于分析所讨论的Fab与不同抗原的非特异性结合。如上所述执行分析,但是将0.1 M NaHCO3(pH 9.0)中的IL6R-Fc,PCSK9-VG-FE用作用于固定的抗原(抗原在4℃下固定过夜)。将IL-5Rα-FE,IL-5Rα-Fc用作特异性结合对照(抗原在4℃下固定过夜)。使用基于机器人系统例如Genetix Qpix2xt(Molecular Devices)和Tecan Freedom EVO 200(Tecan)的高性能自动化平台,根据标准ELISA方案,进行所有进一步阶段。通过竞争性ELISA测试其中颜色信号不超过对照信号的克隆,以鉴定阻断受体-配体相互作用的Fab。
实施例8
阻断IL-5Rα与配体IL-5的相互作用的高亲和力Fab的选择
竞争性ELISA用于针对阻断IL-5Rα与配体IL-5的相互作用的能力测试先前选择的抗人特异性Fab(Sino Biological)。具有公开序列的Fab,贝那利珠单抗(Medimmune)用作阳性对照。
将50 µl/孔的IL-5(NaHCO3,pH 9.0中的1 µg/ml溶液)固定到ELISA孔板(中等结合,Greiner bio one)中,并且在4°C下温育过夜。使用基于机器人系统Genetix Qpix2xt(Molecular Devices)和Tecan Freedom EVO 200(Tecan)的高性能自动化平台,根据标准ELISA方案,在室温下执行所有进一步阶段。通过添加阻断缓冲液(200 µl在PBS中的1%脱脂乳)来阻断非特异性结合。
平行地,将包含测试Fab和IL-5Rα(在PBST中以1 μg/ml的最终浓度)的细胞上清液以1:1的比率在非吸收性板中混合,在室温下温育45分钟。
从阻断缓冲液中洗涤后,将预温育的混合物转移至板中。所有进一步步骤与实施例6中描述的步骤相似。将在对照Fab贝那利珠单抗的水平下显示阻断的克隆注明为阳性的,并且用于进一步的测定中。
在Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)上,根据标准方案,对阳性克隆的可变结构域的基因进行测序并进行分析。
实施例9
通过解离速率选择高亲和力Fab
使用Pall Forte Bio Octet Red 96执行Koff筛选。抗FABCH1生物传感器在包含10 mMPBS(pH 7.2-7.4)、0.1% Tween 20和0.1% BSA的工作缓冲液中再水化30分钟。将工作缓冲液加入大肠杆菌上清液的测试样品中,直至10%的最终浓度。然后将抗FABCH1生物传感器浸入含有候选抗体的Fab的大肠杆菌上清液中,并且在4°C下温育12小时。将具有表面固定的Fab的传感器转移到具有工作缓冲液的孔中,在其中记录基线(60秒)。然后将传感器与分析物溶液(IL-5Rα-Fc,30 µg/ml)一起转移到孔中,以实现抗原-抗体结合(300秒)。然后将传感器返回到含有工作缓冲液的孔内,用于进一步解离(600秒)。在每次测试后,使用过的传感器经历再生:将它们三次置于再生缓冲液(10 mM Gly-HCl,pH 1.7)内,然后用于进一步的实验中。使用Octet Data Analysis(版本9.0),根据标准程序,用1:1局部相互作用模型来分析获得的曲线。
实施例10
全长抗体的制备
通过标准技术执行克隆。将重链可变结构域序列克隆到载体pEE-Hc IgG1内的Sal1/Nhe1限制性位点处。将轻链可变结构域克隆到载体pEE-CK内的Sal1/BsiW1限制性位点处。转移所获得的基因构建体,用于蛋白质在CHO细胞系中的瞬时产生。如实施例1中所述,通过在细菌蛋白A上的亲和层析,根据标准方法分离且纯化蛋白质。电泳在补充有巯基乙醇的变性12% PAGE和非变性8% PAGE中执行(图6)。
实施例11
在Forte Bio Octert RED 384上测定全长抗体的亲和力
在Forte Bio Octert RED 384上,执行抗体与人IL-5Rα抗原的结合亲和力的实验研究。根据标准方案和制造商的说明书,将浓度为20 μg/ml的人IL-5Rα固定到AR2G传感器(ForteBio)的表面上。使用包含0.1% Tween 20和0.1% BSA的PBS作为工作缓冲液,在30°C下进行分析。在基线记录后,将传感器浸没到含有抗体溶液的孔内300秒钟,复合物在其中结合。然后检测在缓冲溶液中的复合物解离600秒。
在扣除参考信号后,使用Octet Data Analysis(版本9.0)软件,根据标准程序,并且使用1:1全局相互作用模型来分析结合曲线。抗IL-5Rα抗体以高亲和力与人抗原特异性结合。表A(图11、12、13)。
表A. BCD-133(03-002、03-020、03-021)解离常数。
实施例12
表达IL-5Rα的稳定细胞系的制备
在具有5% FBS的DMEM/F12培养基中培养CHO-K1细胞系。根据制造商的方案,使用TurboFect执行包含编码IL-5Rα的DNA的基因构建体的转染。
在转染后3天,通过将潮霉素B加入培养基中至250 μg/ml的最终浓度,选择转染的培养物14天。克隆在选择后获得的细胞群体。基于IL-5R表达水平/同质性的分析结果,考虑到生长速率、群体同质性和形态学变化的不存在来选择表达IL-5Rα的细胞克隆。
实施例13
在CHO-IL-5R细胞上,在ADCC测定中,比较对照可重现无岩藻糖基化的抗体和候选抗IL-5Rα抗体
稳定表达IL-5Rα的CHO-IL-5R细胞系、以及健康供体的外周血单核细胞(PBMC),用于ADCC测定中。在包含2 mM谷氨酰胺、5% FBS(胎牛血清)、0.05 mg/ml庆大霉素和0.4 mg/ml潮霉素B的DMEM/F12培养基中,在37°C与5% CO2下培养CHO-IL-5R细胞。细胞通过用胰蛋白酶处理从表面去除,在具有2 mM谷氨酰胺、10% FBS的RPMI-1640中洗涤两次。在用台盼蓝染色后,使用血细胞计数器评价生存力和细胞数目。在具有10% FBS的RPMI-1640培养基中制备浓度为4*105/ml的细胞悬浮液。
通过密度梯度分离,用Ficoll从健康供体的静脉血中分离外周血单核细胞(PBMC)。然后将细胞在DPBS中洗涤两次,并且以2*106/ml的密度重悬浮于具有2 mM谷氨酰胺、10% FBS的RPMI-1640培养基中。
将浓度为0.005 ng/ml至300 ng/ml的一系列50 μl抗体稀释物加入96孔板的孔中,以便进行ADCC测定。然后加入50 μl/孔的靶细胞悬浮液,使板在37°C和5% CO2下温育30分钟。加入50 μl/孔的效应细胞悬浮液。使板在37℃与5% CO2下温育16小时。在温育后,使用CytoTox96®Non-Radio Cytotoxicity Assay试剂盒执行细胞毒性测定。
ADCC功效使用下式进行计算:
ADCC =(实验数据 – 背景)/(完全裂解 – 背景)×100%
使用GraphPad Prism 6.0计算半数最大有效浓度(EC50)。根据实验,候选抗IL-5Rα抗体BCD-133-03-002、BCD-133-03-020、BCD-133-03-021的功效是抗体贝那利珠单抗(BCD-133-018-200617)的1.6倍。与贝那利珠单抗相比,候选物并未显示针对彼此在功效方面的显著差异。
结果显示于图14、15中。
实施例14
在Forte Bio Octet RED 384上,分析与食蟹猴/兔/小鼠IL-5Ra受体的相互作用
在Forte Bio Octert RED 384上,执行抗体与动物IL-5Rα抗原的结合亲和力的实验研究。按照标准方案和制造商的说明书,将浓度为20 μg/ml的抗体固定到AR2G传感器(ForteBio)的表面上。使用包含0.1% Tween 20和0.1% BSA的PBS作为工作缓冲液,在30°C下进行分析。在基线记录后,将传感器浸没到含有抗原溶液(动物IL-5Rα)的孔内300秒钟,复合物在其中结合。然后检测在缓冲溶液中的复合物解离600秒。
在扣除参考信号后,使用Octet Data Analysis(版本9.0)软件,根据标准程序,并且使用1:1全局相互作用模型来分析结合曲线。抗IL-5Ra抗体与食蟹猴抗原特异性结合。表B,图16、17、18。
表B. 表显示了抗体针对食蟹猴抗原(IL-5Rα)的解离常数。
抗体不与小鼠和兔IL-5Rα相互作用。
实施例15
稳定细胞系的生成、抗IL-5R抗体的生产和纯化
通过使用4D Nucleofector(Lonza)与电穿孔,用包含轻链和重链的最佳比率的载体构建体转染亲本悬浮CHO-K1-S细胞系,获得产生单克隆抗体BCD-133的稳定细胞系。使用ClonePix机器人平台(Molecular Devices),以及以不同培养形式使用抗生素的初步小型库选择步骤,获得高水平的克隆谱系(超过1000 mg/l)。使用Octet QK System(Pall LifeSciences)分析系统执行定量分析。在自动化系统Tecan Genesis Workstation RSP 200/8Automatic Liquid Handling System(Tecan)上选择基础培养基和培养方案,随后为在MODDE软件中的数学处理。使用无血清培养基和不含动物源性蛋白的进料来培养生产者。在HyClone一次性使用的生物反应器(Thermo Fisher Scientific)50 L发酵罐中,制备用于临床前研究的BCD-133。
在Millistak C0HC(Merck-Millipore)深层过滤器上澄清培养液。在蛋白A亲和吸附剂上执行来自澄清培养基的抗体的初步纯化。在酸性条件下,用甘氨酸缓冲液pH 3.3-3.8特异性洗脱靶蛋白。将收集的洗脱物暴露于酸性pH 30-60分钟,用于病毒灭活的目的,然后用1M Tris-OH溶液中和至pH 6.5-7.0。使用CaptoAdhere吸附剂(GE HealthCareLifeSciences),以流通模式执行最终层析纯化,以去除残留的DNA、生产者细胞蛋白、释放的亲和吸附剂的配体、聚集物和抗体片段。为此,使蛋白质溶液在低电导率(<3msec/cm2)下流过制备的吸附剂pH 6.5-7.0。然后使纯化的蛋白质经受使用Viresolve PRO过滤试剂盒(Millipore)的病毒去除过滤,然后针对含有乙酸盐缓冲液(pH 5.0-5.5)和海藻糖的最终缓冲液进行浓缩和渗滤。蛋白质浓度为50 mg/ml或更高。
实施例16
抗体BCD-133/人IL-5Rα复合物的计算机建模
为了产生特异性针对IL-5Rα的突变型抗体BCD-133,使用Schrodinger Suite版本2017-1(Schrodinger)软件执行3D结构分析。选择以ID码:3VA2保藏于蛋白质数据库(Protein Data Bank)中的结构作为靶晶体结构。使用来自Schrodinger Suite软件的PIPER工具执行对接。使用自由能估计值(MM-GBSA方法),以25纳秒的分子动力学间隔(通过D.E. Shaw Research的Desmond仪器)进行最佳位置的选择。使用Maestro(Schrodinger)工具来显现所获得的结构。图19、20显示了包括BCD-133的可变结构域的模型。
表C. 中间列显示了抗体BCD-133的氨基酸残基,其与人IL-5Rα形成相互作用。右侧列显示了IL-5Rα抗原的相应氨基酸残基,其与抗体BCD-133相互作用。
实施例17
对于人IL-5Rα特异性的突变型抗体BCD-133文库的构建
为了产生对于IL-5Rα特异性的突变型抗体BCD-133,使用Schrodinger Suite版本2017-1(Schrodinger)软件和IL-5Rα模型(PDB 3VA2),执行3D结构分析(还参见实施例16)。基于计算模型,产生了抗体/IL-5Rα复合物的3D结构集合,每个3D结构含有不多于6个氨基酸取代,用于修饰抗体亲和力和复合物稳定性。在下一步中,所得到的结构集合形成文库,包括其中取代导致复合物稳定性增加和抗体亲和力增加的变体。
在下表中,CDR使用Chothia Canonical Assignment进行测定,而不是使用更常见的Kabat分类法进行测定(如通过包含SEQ ID NO:1-3、6-8的序列的CDR所示),与其它变体相比,这个聚类算法更好地限定了抗体结构上的环(Chothia等人(1997)http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283697913541via%3Dihub)。因此,所述聚类方法,即,用于修饰抗体亲和力。
根据上文方案获得的抗体文库包括71个抗体序列。16个位置是取代的。16个中的9个是轻链CDR区,而另外7个位置是重链CDR区。独特取代的数目为60。表D显示了原始候选环的CDR序列,以及由71个突变序列各自显示的氨基酸取代集合。来自该文库的突变CDR环的序列可以概括如下:
表D. 原始候选/取代CDR环的序列
实施例18
使用动态光散射,通过蛋白质聚集点来测定胶体稳定性
为了通过动态光散射测定处于研究下的样品的聚集温度,使用DynaPro® PlateReader II(Wyatt Technology Corp.),伴随从40到85°C的逐渐加热,获得培养基中的颗粒大小对温度的依赖性。结果显示于表E中。图21和图22显示了在20mM乙酸盐,pH=5.0和20mM柠檬酸盐,pH=5.0的缓冲溶液中,关于处于研究下的抗体的聚集曲线概况。
表E. BCD-133聚集点
可以得出结论,分子BCD-133具有高热胶体稳定性(在20mM乙酸盐,pH=5.0和20mM柠檬酸盐,pH=5.0缓冲溶液中的聚集点> 65°)。
实施例19
在50°С下的热应力下的热稳定性测定
将测试样品置于恒温空气浴中,并且在50℃下恒温72小时。在加热后,通过具有UV检测器的尺寸排阻HPLC(SEC HPLC),并且通过在非还原条件下的电泳,分析完整和受应激的样品。在Tosoh TSK-Gel G3000SWXL层析柱上,在Agilent 1100 HPLC系统上执行层析,并且在220 nm的波长下执行检测。在Caliper Labchip GX II上执行电泳。使用HT ProteinExpress Reagent Kit,根据标准程序执行工作溶液的制备和芯片的制备。
表F中显示了在50°C下温育时关于BCD-133的稳定性所得到的数据,图23、24显示了组合层析图:蓝色—完整的;红色—在50°C下温育72小时。
*Δ是受应激样品的纯度与完整样品(输入对照)的纯度之间的差异,%。
表F. 通过BCD-133的尺寸排阻HPLC和电泳的单体含量的依赖性。
Claims (37)
1.一种与IL-5Rα特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述单克隆抗体包含:
1)重链可变结构域,其包含与SEQ ID NO:3的序列至少80%同源的氨基酸序列;
2)轻链可变结构域,其包含与SEQ ID NO:8的序列至少80%同源的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述重链可变结构域包含SEQID NO:3的氨基酸序列。
3.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变结构域包含SEQID NO:8的氨基酸序列。
4.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:1-3的序列至少80%同源的氨基酸序列。
5.根据权利要求4的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述重链可变结构域包含由SEQ ID NO:1-3表示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:6-8的序列至少80%同源的氨基酸序列。
7.根据权利要求6的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变结构域包含由SEQ ID NO:6-8表示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中
1)所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:1-3的序列至少80%同源的氨基酸序列;
2)所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:6-8的序列至少80%同源的氨基酸序列。
9.根据权利要求8的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中
1)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列;
2)所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:6-8的氨基酸序列。
10.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:4-5的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列。
11.根据权利要求10的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO:4-5的氨基酸序列。
12.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:9-10的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列。
13.根据权利要求12的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO:9-10的氨基酸序列。
14.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中
1)所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:4-5的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列;
2)所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:9-10的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列。
15.根据权利要求14的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中
1)所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO:4-5的氨基酸序列;
2)所述轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO:9-10的氨基酸序列。
16.根据权利要求1的单克隆抗体,其包含:
1)重链,其包含与选自SEQ ID NO:11-12的序列至少90%同源的氨基酸序列;
2)轻链,其包含与选自SEQ ID NO:13-14的序列至少90%同源的氨基酸序列。
17.根据权利要求16的单克隆抗体,其包含:
1)重链,其包含选自SEQ ID NO:11-12的氨基酸序列;
2)轻链,其包含选自SEQ ID NO:13-14的氨基酸序列。
18.根据权利要求1的单克隆抗体,其中所述IL-5Rα特异性抗体是完全的IgG抗体。
19.根据权利要求18的单克隆抗体,其中所述完全的IgG抗体具有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
20.根据权利要求19的单克隆抗体,其中所述完全的IgG抗体具有人IgG1同种型。
21.一种核酸,其编码根据权利要求1-20中任一项的抗体或其抗原结合片段。
22.根据权利要求21的核酸,其中所述核酸是DNA。
23.根据权利要求21的核酸,其包含:
a)编码根据权利要求1的抗体的重链,并且与选自SEQ ID NO:15-16的序列至少90%同源的核苷酸序列,和/或编码根据权利要求1的抗体的轻链,并且与选自SEQ ID NO:17-18的序列至少90%同源的核苷酸序列;或
b)选自SEQ ID NO:15-16的核苷酸序列,所述核苷酸序列编码根据权利要求1的抗体的重链,和/或选自SEQ ID NO:17-18的核苷酸序列,所述核苷酸序列编码根据权利要求1的抗体的轻链。
24.一种表达载体,其包含根据权利要求21-23中任一项的核酸。
25.一种用于产生宿主细胞的方法,所述宿主细胞用于制备根据权利要求1-20中任一项的抗体或其抗原结合片段,所述方法包括用根据权利要求24的载体转化细胞。
26.一种用于制备根据权利要求1-20中任一项的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞,所述宿主细胞包含根据权利要求21-23中任一项的核酸。
27.一种用于制备根据权利要求1-20中任一项的抗体或其抗原结合片段的方法,其包括在足以产生所述抗体的条件下,在生长培养基中培养根据权利要求26的宿主细胞,必要时,随后为所获得抗体的分离和纯化。
28.一种预期用于预防或治疗由IL-5Rα介导的疾病或病症的药物组合物,所述药物组合物包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的、根据权利要求1-20中任一项的抗体或其抗原结合片段。
29.根据权利要求28的药物组合物,其预期用于预防或治疗由IL-5Rα介导的疾病或病症,所述疾病或病症选自:哮喘,例如嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘),例如重度嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘);COPD(慢性阻塞性肺疾病);Churg-Strauss综合征;嗜酸性粒细胞性食管炎;嗜酸性粒细胞性胃肠炎。
30.一种预期用于预防或治疗由IL-5Rα介导的疾病或病症的药物组合,所述药物组合包含根据权利要求1-20中任一项的抗体或其抗原结合片段和至少一种不同的治疗活性化合物。
31.根据权利要求30的药物组合,其预期用于预防或治疗由IL-5Rα介导的疾病或病症,所述疾病或病症选自:哮喘,例如嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘),例如重度嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘);COPD(慢性阻塞性肺疾病);Churg-Strauss综合征;嗜酸性粒细胞性食管炎;嗜酸性粒细胞性胃肠炎。
32.根据权利要求30-31中任一项的药物组合,其中所述不同的治疗活性化合物选自小分子、抗体或类固醇激素例如皮质类固醇。
33.一种用于抑制需要此类抑制的受试者中IL-5Rα的生物活性的方法,其包括施用有效量的根据权利要求1-20中任一项的抗体或其抗原结合片段。
34.一种用于治疗由IL-5Rα介导的疾病或病症的方法,其包括在需要此类治疗的受试者中施用以治疗有效量的根据权利要求1-20中任一项的抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求28的药物组合物。
35.根据权利要求34的用于治疗疾病或病症的方法,其中所述疾病或病症选自:哮喘,例如嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘),例如重度嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘);COPD(慢性阻塞性肺疾病);Churg-Strauss综合征;嗜酸性粒细胞性食管炎;嗜酸性粒细胞性胃肠炎或高嗜酸性粒细胞综合征。
36.根据权利要求1-20中任一项的抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求28的药物组合物用于治疗需要此类治疗的受试者中由IL-5Rα介导的疾病或病症的用途。
37.根据权利要求36的用途,其中所述疾病或病症选自:哮喘,例如嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘),例如重度嗜酸性粒细胞性哮喘(特应性哮喘);COPD(慢性阻塞性肺疾病);Churg-Strauss综合征;嗜酸性粒细胞性食管炎;嗜酸性粒细胞性胃肠炎。
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