KR20200058537A - IL-5Rα에 대한 단일클론 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생물공학 분야에 관한 것이며, IL-5Rα에 특이적으로 결합하는 항체를 제시한다. 본 발명은 또한 상기한 항체를 코딩하는 DNA, 대응되는 발현 벡터 및 제조 방법과 항체를 이용한 치료 방법에 관한 것이다.

Description

IL-5Rα에 대한 단일클론 항체
본 발명은 생물공학 분야, 특히 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 IL-5Rα (인터루킨 5 수용체 α-쇄)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 발현 벡터, 항체의 제조 방법 및 IL-5Rα와 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 항체의 용도에 관한 것이다.
인터루킨 5 (IL-5), 전염증성 사이토카인, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 군은 4중-나선 단백질이다. 인터루킨 5는 일반적으로 Th2 세포 및 비만 세포에 의해 생산된다. IL-5는 활성화된 B-림프구의 증폭 및 분화를 자극하고, 면역글로불린의 IgA로의 변환을 유도한다. 호산구 및 호염구의 다수 기능들이 인터루킨-5 (IL-5)의 작용에 의해 매개된다. IL-5가 호산구의 분화 및 활성화를 촉진하고, 또한 세포자살을 저해함으로써 이의 생존성을 높인다 [Lotvall J., Pullertis T. Treating 천식 with Anti-IgE or Anti IL-5. Curr Pharm Des. 1999; 5:757-70, 및 Kolbeck R., Kozhich A., Koike M. et al. Medi-563, a humanized anti-IL-5 receptor alpha mAb with enhanced antibody-dependent cell mediated cytotoxicity function. J Allergy Clin Immunol. 2010;125(1):1344-53].
IL-5는 인간 호산구/호염구 전구체 및 성숙한 호산구/호염구 상에 발현된 특이적인 수용체 (IL-5R)를 통해 작용한다. IL-5R은 고유한 α-쇄 (IL-5Rα/CD125, 세포외 도메인)와 IL-3/GM-CSF 수용체 공통 β-쇄 (bc/CD131)로 이루어지며, 자체적으로 리간드에 결합하진 않지만, 동의 (homonymous) 수용체에 대한 IL-5의 친화성을 증가시키며, 신호 전이에 직접 관여한다 [Tetsuya A., Rafeul A. The mechanism of IL-5 signal transduction American Journal of Physiology - Cell Physiology Published 1 September 1998 Vol. 275 no. 3, C623-C633].
호산구의 발생은 초기 골수 호산구 전구체 세포 상에서의 선택적인 IL-5R 발현과 관련있다. 따라서, IL-5와 이의 세포 수용체 간의 상호작용은 호산구 증가증 (eosinophilia)을 억제하는데 가장 바람직한 것으로 보인다.
호산구 증가증 억제에 대한 치료학적 유의성은 다수의 병리학적 과정에서 높은 수준의 호산구 과립구로 인한 것이다. 즉, 기관지 천식 환자에서 호흡기와 호산구성 식도염 환자에서 식도 상피에서 호산구 수치 증가가 이들 질환의 병리생리학적 근간이다. 호산구는 호산구 양이온성 단백질 (ECP) 및 루코트리엔과 같은 전염증성 매개인자를 방출한다.
단일클론 항체 벤랄리주맵 (benralizumab)은 선행 기술 분야에 공지되어 있으며, 이는 IL-5Rα에 결합하여 수용체와 리간드 간의 상호작용을 저해한다. 이 단일클론 항체는 혈액 및 폐 조직에서 호산구를 현저하게 고갈시킨다. 벤랄리주맵은 하이브리도마 기법으로 제조된 뮤라인 항체로부터 유래되는 인간화된 단일클론 항체 (IgG1/k)이다 [Koike M., Nakamura K. et.al. Establishment of humanized anti-interleukin-5 receptor alpha chain monoclonal antibodies having a potent neutralizing activity. Hum Antibodies 2009, 18(1-2):17-27]. 이 항체는 IL-5Rα에 고 친화성 (KD = 11 pm)으로 결합하여, IL-5 의존적인 세포 증식을 저해한다 (IC50 = 0.3 nm) [Kolbeck R., Kozhich A et.al. MEDI-563, a humanized anti-interleukin 5 receptor-alpha monoclonal antibody, with enhanced antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity function. J Allergy Clin Immunol 2010, 125(6): 1344-53.e2]. 벤랄리주맵은 비-푸코실화 (afucosylated) 세포주에서 생산되며, 이로써 달성되는 올리고사카라이드 핵내 푸코스의 부재로 용해성 인간 FcγRIIIa에 대한 결합성은 5-10배 증가하고, 따라서 항체-의존적인 세포성 세포독성이 증가한다 [Shinkawa T., Nakamura K. et al. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Biol Chem 2003, 278(5):3466-73]. 이 항체는 3상 임상 실험 중에 있다. 항체 벤랄리주맵은 국제 출원 WO9710354 (A1)에 기술되어 있다.
IL-5R 및 인간 CD3e (ND003)에 결합하는 2중 특이성 항체 역시 선행 기술 분야에 공지되어 있다. 이 항체는 전임상 연구 단계에 있으며, 국제 출원 WO2015172800 및 WO2015058861에 기술되어 있다.
전술한 내용에 비추어, IL-5Rα에 효과적으로 결합하여 IL-5Rα-매개 활성화를 저해하는 새로운 항체를 구축하는 것이 중요하다.
본 발명자들은, 벤랄리주맵과 비슷한 친화성으로 인간 IL-5Rα에 결합하여 IL-5Rα-매개 활성화를 저해하는 완전 인간 단일클론 항체 mAb (BCD-133)를 개발하게 되었다. 벤랄리주맵의 경우에서와 같이, BCD-133은 강화된 항체-의존적인 세포독성을 가지며, 따라서 IL-5 수용체를 가진 세포에 대해 면역반응을 활성화할 수 있다. 항체 BCD-133은 IL-5Rα에 선택적으로 결합하며, 면역 컴피턴트 세포 (immune competent cell) 및 이와 관련된 특이적인 염증의 IL-5Rα-매개 활성화를 저해하는 효과적인 저해제이다. 세포 검사에서 벤랄리주맵의 활성을 능가하는 항체 BCD-133의 활성이 검증되었다. 또한, BCD-133은 데 노보 합성된 완전 인간 항체로서; 면역원성 위험을 줄일 수 있으며, 결합 친화성 저하로 이어질 수 있는 인간 단백질에 대한 친화성을 증가시키기 위한 추가적인 유전자 변환이 필요하지 않다.
본 발명은 결합 분자, 예를 들어 IL-5Rα에 결합하도록 지시된 항체 (antibodies directed to binding to IL-5Rα)에 관한 것이다. 이 항체는 IL-5 및 이의 세포성 수용체 간의 상호작용에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는데 사용할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은, 서열번호 3의 서열과 80% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인과, 서열번호 8의 서열과 80% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하며, 즉 서열번호 3 및 8의 아미노산 서열이 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함할 수 있는, IL-5Rα에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 1-3의 서열과 80% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함하며, 즉, 서열번호 1-3의 아미노산 서열은 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1-3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 6-8의 서열과 80% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하며, 즉 서열번호 6-8의 아미노산 서열은 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 6-8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1-3의 서열과 80% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인과, 서열번호 6-8의 서열과 80% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하며, 즉, 서열번호 1-3 및 6-8의 아미노산 서열은 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1-3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인과, 서열번호 6-8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4-5를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4-5를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9-10을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9-10을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4-5를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인과, 서열번호 9-10을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4-5를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인과, 서열번호 9-10을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 11-12를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와, 서열번호 13-14를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 11-12를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와, 서열번호 13-14를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, IL-5Rα-특이적인 항체는 전장 (full length) IgG 항체이다.
일 구현예에서, IL-5Rα-특이적인 전장 IgG 단일클론 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형 항체이다.
일 구현예에서, IL-5Rα-특이적인 전장 IgG 단일클론 항체는 인간 IgG1 이소형의 항체이다.
일 측면에서, 본 발명은 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
일 구현예에서, 핵산은 DNA이다.
일 구현예에서, 핵산은 항쇄의 중쇄를 코딩하며 서열번호 15-16을 포함하는 군으로부터 선택되는 서열과 90% 이상 상동적인 뉴클레오티드 서열, 및/또는 항쇄의 경쇄를 코딩하며 서열번호 17-18을 포함하는 군으로부터 선택되는 서열과 90% 이상 상동적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 핵산은 중쇄가 서열번호 15-16을 포함하는 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 경쇄가 서열번호 17-18을 포함하는 군으로부터 선택되는 항체의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 상기한 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 세포를 상기 벡터로 형질전환하는 것을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포의 제조 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하기 위해 사용되며 상기한 핵산을 포함하는, 숙주 세포에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 상기 숙주 세포를 항체를 생산하기에 충분한 조건에서 배양 배지에서 배양하고, 필요에 따라 수득되는 항체를 단리 및 정제하는 것을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함하는, IL-5Rα에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위해 사용되는 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은, 천식, 예를 들어, 호산구성 천식 (아토피성 천식), 예를 들어, 중증 호산구성 천식 (아토피성 천식); COPD (만성 폐쇄성 폐 질환); 척-스트라우스 증후군; 호산구성 식도염; 호산구성 위장염으로부터 선택되는, IL-5Rα에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위해 사용되는 것으로 의도된다.
일 측면에서, 본 발명은, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 하나 이상의 다른 치료학적 활성 화합물을 포함하는, IL-5Rα에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는데 사용하도록 의도된 약학적 조합물 (pharmaceutical combination)에 관한 것이다.
일 구현예에서, 약학적 조합물은 천식, 예를 들어, 호산구성 천식 (아토피성 천식), 예를 들어, 중증 호산구성 천식 (아토피성 천식); COPD (만성 폐쇄성 폐 질환); 척-스트라우스 증후군; 호산구성 식도염; 호산구성 위장염으로부터 선택되는, IL-5Rα에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 예방 또는 치료에 사용되도록 의도된다.
일 구현예에서, 약학적 조합물은 소분자, 항체 또는 스테로이드 호르몬, 예를 들어 코르티코스테로이드로부터 선택되는 치료학적 활성 화합물을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 저해가 필요한 개체에서 IL-5Rα의 생물학적 활성을 저해하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 IL-5Rα에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 질환 또는 장애는 천식, 예를 들어, 호산구성 천식 (아토피성 천식), 예를 들어, 중증 호산구성 천식 (아토피성 천식); COPD (만성 폐쇄성 폐 질환); 척-스트라우스 증후군; 호산구성 식도염; 호산구성 위장염, 호산구과다 증후군 (hypereosinophilic syndrome)으로부터 선택된다.
일 측면에서, 본 발명은 IL-5Rα에 의해 매개되는 질환 또는 장애의, 치료가 필요한 개체를 치료하기 위한, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
일 구현예에서, 질환 또는 장애는 천식, 예를 들어, 호산구성 천식 (아토피성 천식), 예를 들어, 중증 호산구성 천식 (아토피성 천식); COPD (만성 폐쇄성 폐 질환); 척-스트라우스 증후군; 호산구성 식도염; 호산구성 위장염, 호산구과다 증후군으로부터 선택된다.
도 1. Fc 융합 단백질을 가진 항원을 일시적으로 발현시키기 위한 플라스미드 맵.
도 2. C-말단 태그 EPEA (FE)를 가진 항원을 일시적으로 발현시키기 위한 플라스미드 맵.
도 3. PHis-b 태그를 가진 항원을 일시적으로 발현시키기 위한 플라스미드 맵.
도 4. 항원의 환원 조건에서의 10% SDS-PAGE 전기영동사진.
도 5. 항원의 환원 조건에서의 10% SDS-PAGE 전기영동사진.
도 6. 항체 및 항원의 비-환원 조건에서의 (7.5% SDS-PAGE) 전기영동사진.
도 7. 나이브 인간 조합 라이브러리의 합성 계략도.
도 8. Fab 파지 디스플레이 라이브러리 클로닝용 파지미드 맵.
도 9. Fab 생산용 발현 플라스미드 맵.
도 10. 특이 및 비-특이 항원에 대한 선별-후 라이브러리 (post-selection library).
도 11. Octet RED 384 디바이스에서의 항체와 IL-5Rα의 상호작용 센소그램 (BCD 133-03-002).
도 12. Octet RED 384 디바이스에서의 항체와 IL-5Rα의 상호작용 센소그램 (BCD 133-03-020).
도 13. Octet RED 384 디바이스에서의 항체와 IL-5Rα의 상호작용 센소그램 (BCD 133-03-021).
도 14. 항체 농도에 따른 항체-의존적인 세포성 세포독성 의존성.
도 15. 항체 벤랄리주맵과의 비교 분석에서 최대 유효 농도의 2/1 (EC50) 값.
도 16. Octet RED 384 디바이스를 이용한 항체와 마카크 IL-5Rα의 상호작용 센소그램 (BCD133-03-002).
도 17. Octet RED 384 디바이스를 이용한 항체와 마카크 IL-5Rα의 상호작용 센소그램 (BCD133-03-020).
도 18. Octet RED 384 디바이스를 이용한 항체와 마카크 IL-5Rα의 상호작용 센소그램 (BCD133-03-021).
도 19. BCD-133과 IL-5Rα의 복합체의 3D 입체 구조 모델.
도 20. BCD-133과 IL-5Rα의 복합체의 3D 입체 구조 모델.
도 21. 평균 입자 크기 (Z-축) 대 온도 그래프.
도 22. 평균 입자 크기 (Z-축) 대 온도 그래프.
도 23. 축소된 크기의 BCD-133 조합 크로마토그램. 청색 - 온전한, 적색 - 20mM 아세테이트 pH = 5.0 중에서 50℃에서 72시간 인큐베이션, 파장은 220 nm이다.
도 24. 확대된 크기의 BCD-133 조합 크로마토그램. 청색 - 온전한, 적색 - 20mM 아세테이트 rGH = 5.0 중에서 50℃에서 72시간 인큐베이션, 파장은 220 nm이다.
정의 및 일반적인 방법
달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용되는 모든 과학 용어 및 기술 용어는 당해 기술 분야의 당업자들에게 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가질 것이다.
나아가, 문맥상 달리 요구되지 않은 한, 단수형 용어들은 복수를 포함할 것이며, 복수형 용어들은 단수를 포함할 것이다. 전형적으로, 세포 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석화학, 유기 합성 화학, 의학 및 제약 화학의 분류 및 방법뿐 아니라 본원에 기술된 단백질 및 핵산의 혼성화 및 화학은 잘 알려져 있으며, 당해 기술 분야의 당업자에 의해 광범위하게 사용된다. 효소 반응 및 정제 방법들은 당해 기술 분야에 통상적이거나 또는 본원에 기술된 바와 같이, 제조사의 지침에 따라 수행된다.
항체 관련 정의
본원에서, 용어 IL-5R 또는 "인터루킨 5 수용체"는 인터루킨 5 (IL-5)에 결합하는 단백질이다. 인터루킨-5 수용체 (IL-5R) 발현은 주로 호산구, 호염구 및 비만 세포의 표면 상에서만 관찰된다. IL-5R은 IL-3와 공유된 고유한 α-쇄 (IL-5Rα/CD125, 세포외 도메인)와 GM-CSF 수용체 β-쇄 (bc/CD131)로 구성되며, 자체적으로는 리간드에 결합하진 않지만, 동의 수용체에 대한 IL-5의 친화성을 증가시키며, 신호 전이에 직접 관여한다.
이 유전자의 증폭 및/또는 이의 단백질의 과다발현은, 천식, 예를 들어, 호산구성 천식 (아토피성 천식), 예를 들어, 중증 호산구성 천식 (아토피성 천식); COPD (만성 폐쇄성 폐 질환); 척-스트라우스 증후군; 호산구성 식도염; 호산구성 위장염 또는 호산구과다 증후군 등의 다수 자가면역 질환들에서 발견된다.
용어 "결합 분자"는 항체 및 면역글로불린을 포함한다.
본원에서, 용어 "항체" 또는 "면역글로불린" (Ig)은 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 영역") 또는 단쇄를 포함한다. 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질, 또는 항원-결합 영역을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변부 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변부를 포함한다. 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시되는 5가지 타입의 포유류 Ig 중쇄가 공지되어 있다. 존재하는 중쇄의 타입이 항체 클래스를 정의하며; 이들 쇄들은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 항체 각각에서 발견된다. 구분되는 중쇄들은 크기 및 구성 측면에서 다양하다; α 및 γ는 대략 450개의 아미노산을 포함하지만, μ 및 ε는 대략 550개의 아미노산을 포함한다. 각각의 중쇄는 2가지 영역, 즉 불변부 및 가변부를 포함한다. 불변부는 동일한 이소형의 항체들 모두에서 동일하지만, 서로 다른 이소형 항체에서는 상이하다. 중쇄 γ, α 및 δ는 3개의 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3 (일렬로)로 구성된 불변부와, 유연성 (flexibility) 부가를 위한 힌지부를 포함하며 (Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99); 중쇄 μ 및 ε는 4개의 불변 도메인 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 구성된 불변부를 가진다. 포유류에서는, 람다 (λ) 및 카파 (κ)로 언급되는 오직 2가지 타입의 경쇄만 공지되어 있다. 각 경쇄는 경쇄 가변부 (본원에서 VL로 약칭됨)와 경쇄 불변부로 구성된다. 경쇄의 대략적인 길이는 아미노산 211개 내지 217개이다. 바람직하게는, 경쇄는 카파 (κ) 경쇄이고, 불변 도메인 CL은 바람직하게는 C 카파 (κ)이다.
본 발명에서 "항체"는 임의 클래스 (예, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 바람직하게는 IgG) 또는 서브클래스 (예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2, 바람직하게는 IgG1)에 속하는 것일 수 있다.
VL 영역 및 VH 영역은 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 보존성이 높은 영역과 이들 사이에 배치된 상보성 결정부 (CDR)로 지칭되는 과-가변성 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 CDR 3개와 FR 4개로 구성되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 다음과 같은 순서로 정렬된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 가변부와 경쇄 가변부는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변부는 면역계의 다양한 세포 (예, 작동자 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (Clq) 등의, 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서, 항체의 "항원-결합 영역" 또는 "항원 결합 단편" (또는 간단히 "항체 영역" 또는 "항체 단편")이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 입증된 바 있다. 항체의 "항원-결합 영역"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지부에서 이황화 결합에 의해 2개의 Fab 단편들이 연결된 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd-단편; (iv) 항체의 싱글 암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv-단편, (v) VH/VHH 도메인으로 구성된 dAb-단편 (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정부 (CDR) 등이 있다. 또한, Fv 단편의 2개의 영역, 즉 VL와 VH는 개별 유전자들에 의해 코딩되지만, VL 및 VH 영역들이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 싱글 단백질 쇄를 만들 수 있는 합성 링커에 의한 재조합 방법으로 연결될 수 있다 (단쇄 Fv (scFv)로 알려져 있음; 예로, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883을 참조함). 이러한 단일-가닥 분자는 또한 항체의 "항원-결합 영역"이라는 용어에 포함되는 것으로 추정된다. 이러한 항체 단편은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 통상적인 기법을 이용해 수득되며, 이들 단편은 온전한 항체 (intact antibody)와 동일한 방식으로 스크리닝된다.
바람직하게는, 본 발명의 항원-결합 영역의 CDR 또는 전체 항체 항원 결합 영역은 마우스, 라마 또는 인간 도너 라이브러리로부터 유래되거나, 또는 일부 아미노산 잔기가 변형된, 예를 들어 특정 항체 특성, 예를 들어, KD, koff, IC50, EC50, ED50을 최적화하기 위해 다른 아미노산 잔기로 치환된, 실질적으로 인간 기원의 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체의 프래임워크 영역은 인간 기원의 것이거나 또는 실질적으로 인간 기원의 것이다 (인간 기원의 비율이 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%임).
다른 구현예들에서, 본 발명의 항원 결합 영역은, 비-제한적인 예로, 마우스, 라마, 토끼, 랫 또는 햄스터 등의, 인간을 제외한 다른 종으로부터 유래될 수 있다. 다른 예로, 항원-결합 영역은 인간 종으로부터 유래될 수 있다.
용어 "가변성 도메인"은 가변성 도메인의 일정 부분이 항체들에서 서열상 상당히 상이하다는 것을 의미한다. V 도메인은 각 특정 항체의 이의 특정 항원에 대한 항원 결합을 매개하고 특이성을 결정한다. 그러나, 가변성이 가변성 도메인의 110개의 아미노산 전체에 균등하게 분산되어 있진 않다. 대신, V 영역은 "과가변부" 또는 CDR로 지칭되는 극도의 가변성을 가진 더 짧은 가닥에 의해 이격된 아미노산 15-30개로 된 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 불변성 단편들로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 각 가변성 도메인은 FR 4개를 포함하며, 연결성 루프, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는, 과가변부 3개에 의해 연결된, β-시트 배열을 주로 취한다. 각 체인에서 과가변부들은 FR에 의해 서로 인접하게 유지되며, 다른 체인으로부터 유래된 과가변부와 함께 항체의 항원-결합부를 형성하는데 기여한다. 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는데 직접 참여하진 않지만, 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)에 항체 참여 등의 여러가지 작동자 기능을 발휘한다.
본원에서, 용어 "과가변부"는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 통상적으로, 과가변부는 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터 유래된 아미노산 잔기 및/또는 "과가변성 루프"로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 경우에, 타겟 에피토프에 대한 결합 친화성을 높이기 위해 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 "친화성 성숙화"라고 하며, 선택적으로, 예를 들어, 항체의 인간화로 결합 특이성 또는 친화성의 저하가 발생하고 역 돌연변이 (inverse mutation) 단독에 의해 결합 특이성 또는 친화성을 충분히 개선하는 것은 가능하지 않을 경우, 인간화와 더불어 수행될 수 있다. 다양한 친화성 돌연변이 방법들, 예를 들어, Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)에 언급된 시험관내 스캐닝 포화 돌연변이 유발 방법 및 Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998)에 제시된 단계별 시험관내 친화성 성숙화 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
"프래임워크 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변성 도메인 잔기이다. 각각의 가변성 도메인은 전형적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 식별되는 FR 4개를 가지고 있다. CDR이 Kabat에 따라 정의되는 경우, 경쇄 FR 잔기들은 대략적으로 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) 및 98-107 (LCFR4)번 위치에 위치하고, 중쇄 FR 잔기들은 대략적으로 중쇄에서 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) 및 103-113 (HCFR4)번 위치에 위치한다. CDR이 과가변성 루프로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 경쇄 FR 잔기는 대략적으로 경쇄에서 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) 및 97-107 (LCFR4)번 위치에 존재하며, 중쇄 FR 잔기는 대략적으로 중쇄 잔기에서 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) 및 102-113 (HCFR4)번 위치에 존재한다. CDR이 Kabat에 의해 정의되는 양쪽 CDR 및 과가변성 루프로부터 유래된 아미노산을 포함하는 일부 경우에, FR 잔기들은 그에 따라 조정될 것이다. 예를 들어, CDRH1이 아미노산 H26-H35를 포함할 경우, 중쇄 FR1 잔기는 1-25번 위치에 위치하고, FR2 잔기는 36-49번 위치에 위치한다.
타겟 항원에 "결합하는" 본 발명의 항체는, 항체가 단백질 또는 항원을 발현하는 세포를 타겟팅하는 치료학적 물질 및/또는 진단 물질로서 사용될 수 있도록 충분한 친화성으로 항원에 결합하며, 다른 단백질과는 일부 교차 반응하는 항체이다. 분석 방법에 따라: 형광-활성화된 세포 분류 (FACS), 방사성면역분석 (RIA) 또는 ELISA, 이러한 구현예에서, 비-타겟 단백질에 항체가 결합하는 수준은 특이적인 타겟 단백질에 결합하는 항체의 10% 미만이다. 항체가 타겟 분자에 결합하는 것과 관련하여, 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프에 "특이적인 결합" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적"이라는 용어는, 비-특이적인 상호작용과는 검출가능하게 (측정가능하게) 상이한 결합을 의미한다 (예, bH1-44 또는 bH1-81의 경우, 비-특이적인 상호작용은 소 혈청 알부민, 카세인, 소 태아 혈청 또는 뉴트라비딘에의 결합이다).
특이적인 결합은 예를 들어 분자의 결합을 대조군 분자의 결합과 비교 측정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적인 결합은 타겟과 비슷한 다른 분자, 예를 들어 과량의 비-표지 타겟을 이용한 경쟁적인 반응에 의해 결정할 수 있다. 이 경우, 표지된 타겟과 프로브의 결합이 과량의 비-표지된 타겟에 의해 경쟁적으로 저해된다면, 이는 특이적인 결합이다. 본원에서, 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 타겟 상의 에피토프에 "특이적인 결합" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적"이다라는 표현은, 타겟에 대한 Kd가 적어도 약 200 nM 또는 적어도 약 150 nM 또는 적어도 약 100 nM 또는 적어도 약 60 nM 또는 적어도 약 50 nM 또는 적어도 약 40 nM 또는 적어도 약 30 nM 또는 적어도 약 20 nM 또는 적어도 약 10 nM 또는 적어도 약 8 nM 또는 적어도 약 6 nM 또는 적어도 약 4 nM 또는 적어도 약 2 nM 또는 적어도 약 1 nM 또는 그 이상인 분자로 설명될 수 있다. 일 구현예에서, 용어 "특이적인 결합"은 분자가 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프에만 결합하고 임의의 다른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 상의 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도를 의미하고, 용어 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 의미한다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자 (예, 항체)의 단일 결합부와 이의 결합 파트너 (예, 항원) 간의 비-공유성 상호작용들 전체의 세기를 의미한다. 달리 언급되지 않은 한, "결합 친화성"은 결합 쌍의 멤버들 (예, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 나타내는 고유한 (특징적인, 참된) 결합 친화성을 의미한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 바람직한 Kd 값은 약 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM 또는 그 미만이다. 친화성은 본원에 기술된 방법 등의 당해 기술 분야에 공지된 일반적인 방법으로 측정할 수 있다. 저-친화성 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하며, 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화성 항체는 일반적으로 항원에 더 빠르게 결합하고, 결합된 채 더 길게 유지되는 경향이 있다. 결합 친화성을 측정하는 다양한 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 이중 임의의 방법을 본 발명의 목적에 따라 사용할 수 있다.
일 구현예에서, "Kd" 또는 "Kd 값"은 ~10 반응 단위 (RU)로 고정된 칩 CM5 항원을 사용해 25℃에서 BIAcore™-2000 or BIAcore®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)을 이용해 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정한다. 간략하게는, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)을 제조사의 지침에 따라 N-에틸-N'-다이메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)를 사용해 활성화한다. 항원을 10 mM 소듐 아세테이트, pH 4.8을 사용해 5 ㎍/ml (~0.2 μM) 농도로 희석한 다음, 결합된 단백질 약 10 반응 단위 (RU)가 되도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원을 주입한 후, 1M 에탄올아민 용액을 주입하여 비-반응성 기들을 차단한다. 카이네틱스를 측정하기 위해, Fab 2배 연속 희석물 (예, 0.78 nM 내지 500 nM)을 0.05% Tween 20 첨가된 PBS (PBST) 중에 25℃에서 약 25 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 결합 및 해리 센소그램을 동시적으로 피팅함으로써, 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 간단한 원 투 원 랭뮤어 결합 모델 (BIAcore 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용해 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon 비율로 계산한다. 예를 들어, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881을 참조한다. 상기한 표면 플라스몬 공명 분석에 따라 결합 속도가 106 M- 1 s-1을 초과한다면, 이는, 정지 흐름 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 (Thermo Spectronie)와 같은 분광기에서 큐벳을 교반하면서 사용해 측정하는 바와 같이, 항원 농도 증가 조건에서, PBS, pH 7.2의 20 nM 항-항원 항체 용액을 25℃에서 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 (조사) = 340 nm, 16 nm 대역 (band))의 증가 또는 감소를 측정하는, 형광 퀀칭에 의해 결정할 수 있다.
용어 "koff"는 결합 분자와 항원 간의 특별한 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. koff 해리 속도 상수는 예를 들어 Octet™ 시스템을 사용해 바이오레이어 간섭계법 (biolayer interferometry)에 의해 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 "결합 속도" ("on-rate") 또는 "kon"은 또한 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)에서 ~10 상대적인 단위 (반응 단위, RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용해 25℃에서, 전술한 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정할 수 있다. 간략하게는, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)을 제조사의 지침에 따라 N-에틸-N'-다이메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)를 사용해 활성화한다. 항원을 10 mM 소듐 아세테이트, pH 4.8을 사용해 5 ㎍/ml (~0.2 μM) 농도로 희석한 다음 결합된 단백질 약 10 반응 단위 (RU)가 되도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원을 주입한 후, 1M 에탄올아민 용액을 주입하여 미-반응성 기들을 차단한다.
달리 명시되지 않은 한, 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 "생물학적으로 활성인" 및" 생물학적 활성" 및 "생물학적 특징"은 생물학적 분자에 결합하는 능력을 가진 것을 의미한다.
용어 "생물학적 분자"는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질 및 이들의 조합을 지칭한다. 일 구현예에서, 생물학적 분자는 자연계에 존재한다.
Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 단편은 전체 항체 (whole antibody)의 펩신 또는 파파인 분해와 같은 통상적인 방법을 이용해 전체 항체로부터 수득할 수 있다. 또한, 항체, 항체의 일부 및 면역어드헤신 (mmunoadhesion) 분자는 본원에 기술된 바와 같이 표준적인 재조합 DNA 기법을 이용해 수득할 수 있다.
용어 "재조합 항체"는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 세포 또는 세포주에서 발현된 항체를 지칭하며, 이때 뉴클레오티드 서열(들)은 세포와 천연적으로 조합되어 있지 않다.
본원에서, 용어 "변이체 항체"는, 모 항체의 서열과 비교해, 하나 이상의 아미노산 잔기를 부가, 결손 및/또는 치환함으로써 이의 "모" 항체의 아미노산 서열과 상이한, 아미노산 서열을 가진 항체를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 변이체 항체는 모 항체와 비교해 적어도 하나 이상의 (예, 1-12, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개, 일부 구현예에서, 변이체 항체는 1 내지 약 10개의) 아미노산의 부가, 결손 및/또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 부가, 결손 및/또는 치환은 변이체 항체의 CDR 내에 이루어진다. 변이체 항체의 서열에 대한 동일성 또는 상동성은, 서열을 정렬하고, 필요에 따라 최대 서열 동일성 %를 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 변이체 항체 서열에서 모 항체 잔기와 동일한 아미노산 잔기들의 %로서 본원에서 정의된다. 변이체 항체는, 모 항체에 결합하는, 동일한 항원, 바람직하게는 에피토프에 결합하는 능력을 가지고 있으며, 일부 구현예에서 하나 이상의 특성 또는 생활성은 모 항체보다 우수하다. 예를 들어, 변이체 항체는 모 항체와 비교해 예를 들어 더 높은 결합 친화성을 가질 수 있거나, 반감기가 더 길 수 있거나, IC50이 더 낮거나 또는 항원의 생물학적 활성을 저해하는 능력이 강화될 수 있다. 본원에서는, 모 항체와 비교해, 생물학적 활성이 적어도 2배 이상인 (바람직하게는 5배 이상, 10배 이상 또는 20배 이상) 변이체 항체에 특히 주목한다.
용어 "2중 특이성 항체"는 2개의 서로 다른 생물학적 분자의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 하나의 생물학적 분자의 서로 다른 2개의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인(들)을 가진 항체를 의미한다. 이중 특이성 항체는 또한 "듀얼 특이성"을 가진 것으로 또는 "듀얼 특이성" 항체인 것으로서 본원에서 지칭된다.
넓은 의미에서, 용어 "키메라 항체"는 하나의 항체의 하나 이상의 영역과, 하나 또는 수개의 다른 항체의 하나 이상의 영역, 전형적으로 부분적으로 인간 및 부분적으로 비-인간 항체, 즉 마우스, 랫 또는 유사 야생 동물과 같은 비-인간 동물 또는 라마 및 알파카 등의 낙타과로부터 일부 유래된 항체의 하나 이상의 영역을 포함하는, 항체를 지칭한다. 키메라 항체는 일반적으로 인간 항-항체 면역 반응, 예를 들어 뮤라인 항체의 경우 인간 항-마우스 항체 면역 반응의 위험성을 낮추기 위해, 비-인간 항체보다 선호된다. 전형적인 키메라 항체의 예는 가변성 영역의 서열이 뮤라인 서열이고 불변부 서열이 인간 서열인, 항체이다. 키메라 항체의 경우, 비-인간 영역은 항체를 인간화하기 위해 추가적으로 변형될 수 있다.
용어 "인간화 (humanization)"는, 항체가 완전 또는 부분적으로 비-인간 기원, 예를 들어, 대상 항원으로 마우스 또는 라마를 각각 면역화함으로써 수득한 마우스 또는 라마 항체이거나, 또는 이러한 마우스 또는 라마 항체에 기반한 키메라 항체일 경우, 인간에서 면역 반응을 회피하거나 또는 최소화하기 위해, 일부 아미노산, 특히 중쇄 및 경쇄의 프래임워크 영역 및 불변 도메인의 일부 아미노산을 치환할 수 있다는 것을 의미한다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 CDR 영역들에 위치한 아미노산 잔기를 통해 타겟 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 영역내 아미노산 서열은 CDR 영역 바깥쪽 서열에 비해 개별 항체들에서 훨씬 더 가변적이다. CDR 서열들이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하므로, 특이적인 천연 형성 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키거나, 또는 보다 일반적으로는, 예를 들어, 특이 항체로부터 유래된 CDR 서열과 다른 항체로부터 유래된 프래임워크 서열을 발현하는 발현 벡터를 구축함으로써, 아미노산 서열을 가진 임의의 특이 항체를 발현시키는 것이 가능하다. 이로써, 비-인간 항체를 "인간화"하고, 초기 항체의 결합 특이성 및 친화성을 상당히 보존하는 것이 가능하다. 면역원성, 즉 특정 항체에 대한 인간 항-항체 반응을 정확하게 예측하기는 불가능하지만, 비-인간 항체는 전형적으로 인간 항체보다 면역원성이 더 높다. 외래 (예, 야생 동물 또는 낙타과) 불변부가 인간 기원의 서열로 치환된 키메라 항체는, 일반적으로, 완전 외래 기원의 항체보다 면역원성이 더 낮아, 치료 항체는 완전 인간 항체 또는 인간화된 항체를 사용하는 경향이 있다. 따라서, 키메라 항체 또는 비-인간 기원의 기타 항체는 따라서 인간 항-항체 반응의 위험성을 낮추기 위해 인간화될 수 있다.
키메라 항체의 경우, 인간화는 전형적으로 가변부 서열의 프래임워크 영역의 변형을 수반한다. 상보성 결정부 (CDR 영역)의 일부 아미노산 잔기는, 대부분 인간화에 의해 변형될 가능성이 거의 없지만, 일부 경우에는, 예를 들어, 당화 부위, 탈아미드화 부위, 아스파르테이트 이성질화 부위 또는 부적절한 시스테인 또는 메티오닌 잔기를 제거하기 위해, CDR의 개별 아미노산 잔기들을 변형하는 것이 바람직할 수 있다. N-연결된 당화는 트리펩타이드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr에서 아스파라긴 잔기에 올리고당 쇄를 부착시켜 이루어지며, 서열에서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. N-당화 부위의 제거는 Asn 또는 Ser/Thr 잔기를 다른 잔기로 돌연변이함으로써, 바람직하게는 보존적인 치환에 의해 달성될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화는 pH 및 표면 노출과 같은 인자에 따라 이루어질 수 있다. 특히, 아스파라긴 잔기는, 주로 Asn-Gly 서열에 존재하는 경우에는 탈아미드화되기 쉬우며, Asn-Ala과 같은 다른 다이펩타이드 서열에서는 정도가 약하다. CDR이 이러한 탈아미드화 부위, 특히 Asn-Gly을 포함하는 한, 전형적으로 관련 잔기들 중 하나를 제거하기 위한 보존적인 치환에 의해 이 영역을 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
항체 서열을 인간화하는 다수의 방법들이 당해 기술 분야에 알려져 있다. 가장 일반적으로 사용되는 방법들 중 한가지는 CDR 그래프팅 (CDR grafting)이다. CDR 그래프팅은 Kabat에 의한 CDR 정의를 기초로 할 수 있지만, 최종 편집판 (Magdelaine-Beuzelin et al, Crit Rev. Oncol Hematol. 64:210-225 (2007))에서는 IMGT® (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) 정의가 인간화 결과를 개선할 수 있는 것으로 시사되어 있다 (Lefranc et al, Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)). 일부 경우에, CDR 그래프팅은 CDR이 수득되는 모 항체 CDR 영역과 비교해 결합 특이성과 친화성을 낮출 수 있으며, 따라서, CDR 그래프팅된 비-인간 항체의 생물학적 활성을 낮출 수 있다. 역 돌연변이 (때때로, "프래임워크 영역 수리 (framework region reparation)"라고도 함)를, CDR 그래프팅된 항체의 선택 위치에, 통상적으로 프래임워크 영역에 도입하여, 모 항체의 결합 친화성과 특이성을 회복시킬 수 있다. 잠재적인 역 돌연변이를 위한 위치 결정은 문헌 및 항체 데이터베이스에서 이용가능한 정보를 이용해 수행할 수 있다. 역 돌연변이하기 위한 후보 잔기인 아미노산 잔기는 일반적으로 항체 분자의 표면 상에 위치하는데 반해, 표면 노출 정도가 낮거나 또는 묻히는 잔기는 일반적으로 변형되지 않을 것이다. CDR 그래프팅 및 역 돌연변이에 대한 대안적인 인간화 방법은, 비-인간 기원의 비-노출 잔기들은 유지하면서 표면 잔기는 인간 잔기로 바꾸는, 재표면화 (resurfacing)이다.
완전 인간 항체는 2가지 기법을 이용해 제조할 수 있다: 시험관내 구축된 파지 라이브러리 (in vitro collected phage libraries)를 이용한 기법, 또는 인간화된 동물 (마우스, 랫 등)의 생체내 면역화 기법.
파지 항체 조합 라이브러리의 구축은, 구분할 수 있는 수종의 항체 라이브러리 타입들: 나이브, 면역 및 합성에 따라, 유전자 레퍼토리의 소스 선택으로 시작된다. 나이브 라이브러리 및 면역 라이브러리는, 건강한 공여자 또는 특정 항원으로 면역화된 공여자 각각의 가변성 면역글로불린 도메인을 코딩하는, 천연 인지 유전자를 이용해 구축된다. 이러한 목적으로 항체-생산 림프구성 세포주로부터 mRNA를 단리한다. 말초혈 림프구가 주로 사용되지만, 비장세포 [Sheets MD, Amersdorfer P, Finnern R, Sargent P, Lindquist E, Schier R, et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proc Natl Acad Sci U S A 1998,95:6157-6162 and de Haard HJ, van Neer N, Reurs A, Hufton SE, Roovers RC, Henderikx P, et al. A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies. J Biol Chem 1999,274:18218-18230], 편도세포 및 골수 림프구 [Vaughan TJ, Williams AJ, Pritchard K, Osbourn JK, Pope AR, Earnshaw JC, et al. Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. Nat Biotechnol 1996,14:309-314.]도 물론 사용된 바 있다. 이후, mRNA를 기초로 cDNA를 합성하고, 올리고-dT 프라이머 및 통계학적으로 고안된 헥사뉴클레오티드를 사용해, 항체의 가변성 도메인을 코딩하는 가능한 모든 유전자 변이체의 cDNA 카피를 제작할 수 있다 [Ulitin AB, Kapralova MV, Laman AG, Shepelyakovskaya AO, Bulgakova EB, Fursova KK, et al. The library of human miniantibodies in the phage display format: Designing and testing DAN: Izd-vo "Nauka"; 2005].
cDNA 수준에서 하나 또는 수개의 가변성 도메인 유전자 패밀리 또는 항체 이소형에 대한 증폭된 유전자의 범위를 제한하기 위해 하나 또는 수개의 프라이머를 동시에 사용할 수 있다 [Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G. Bypassing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol 1991,222:581-597]. 면역글로불린을 코딩하는 유전자를 증폭하기 위해 사용되는 프라이머는 가장 보존적인 영역에 상보적이다. 이의 서열은 Kabat 또는 V BASE 데이터베이스와 같은 데이터베이스를 구성하는 유전자 콜렉션으로부터 선택된다. 또한, 프라이머 설계는 PCR-산물을 적절한 벡터에 클로닝하기 위한 내부 제한효소 부위를 제공한다.
합성 라이브러리 구축은 천연 CDR을 랜덤 서열 세트로 치환하는 것을 토대로 한다. 이 경우, 매우 다양한 항원-결합부를 제작할 수 있다.
파지 디스플레이는 가장 강력하고 널리 사용되는 시험관내 항체 검색 기법이다. 1985년에, 스미스는 외래 DNA 서열을 필라멘트형의 박테리오파지 M13에 클로닝하고, 클로닝한 서열을 융합 단백질로서 파지 입자의 표면에 발현시킬 수 있음을 알게 되었다 (Smith GP: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228:1315-1317). 따라서, 다른 단백질에 결합하는 능력을 토대로 대상 융합 단백질을 선별할 수 있다. 이러한 발견은 PCR 증폭 기법과 조합되었으며, 면역글로불린 유전자의 cDNA 레파토리를 클로닝하여, 타겟-특이적인 단일클론 항체를 신속하게 검색하기 위해 사용될 수 있는, 가변성 도메인을 포함하는 다양한 파지 라이브러리들을 구축할 수 있었다. 파지 라이브러리 레파토리는, 라이브러리 구축에 사용된 혈액의 기원이 되는 각 인간 또는 동물의 B-세포 항체의 레파토리를 반영한다. 1995년에, 하이브리도마 기법으로 제조된 것과 비슷할 수 있는 완전 인간 항체 레파토리를 발현하는 유전자 조작 마우스를 구축한 것에 대한 논문 2개가 발표되었다 (Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al.: Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368:856-859). 이들 동물에서, 자신의 내인성 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 유전자를 의도적으로 파괴한 다음, 인간 중쇄 및 κ 경쇄 유전자의 세그먼트인 전이유전자를 도입하였다. 인간 유전자 레파토리를 마우스 면역계에 사용하여, 매우 다양한 항원들에 대해 고 특이성 및 고 친화성의 항체가 생산되는 것으로 밝혀졌다. 형질전환 마우스는 기본적으로 마우스 및 인간 성분의 하이브리드 (인간 면역글로불린, 마우스 Igα, Igβ 및 기타 신호전달 분자들)인 B-세포 수용체를 발현함에도 불구하고, 이의 B-세포는 정상적으로 발생 및 성숙한다.
일부 경우에, 타겟 에피토프에 대한 결합 친화성을 개선하기 위해 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기를 변형하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이를 "친화성 성숙화"라고 하며, 선택적으로, 예를 들어 항체의 인간화로 결합 특이성 또는 친화성의 감소가 발생하고, 역 돌연변이만으로는 결합 특이성 또는 친화성의 충분한 개선이 가능하지 않은 일부 경우에, 인간화와 함께 수행될 수 있다. 다양한 친화성 성숙화 방법들, 예를 들어, Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)에 언급된 시험관내 스캐닝 포화 돌연변이 유발 방법 및 Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998)의 단계별 시험관내 친화성 성숙화 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
용어 "단일클론 항체" 또는 "mAb"는 세포의 분리된 클론 집단에 의해 합성 및 단리된 항체를 지칭한다. 클론 집단은 불멸화 세포의 클론 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 클론 집단에서 불멸화 세포는 전형적으로 면역화된 동물 유래 개별 B 림프구를 림프성 종양 유래의 개별 세포와 융합하여 제조되는 하이브리드 세포, 즉 하이브리도마이다. 하이브리도마는 구축된 세포의 한 타입이며, 자연계에 존재하지 않는다.
"나이브 항체"는 통상적으로 동일한 2개의 경(L) 쇄와 동일한 2개의 중(H) 쇄로 구성된 약 150,000 달톤 분자량의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 이황화 공유 결합에 의해 중쇄와 연결되고, 이황화 결합의 개수는 여러가지 면역글로불린 이소형의 중쇄들에서 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 일정하게 이격된 체인내 이황화 결합을 가지고 있다. 각 중쇄는 한쪽 말단에 가변성 도메인 (VH)을 가지고 있으며, 그 뒤에 복수의 불변 도메인이 존재한다. 각 경쇄는 한쪽 말단에 가변성 도메인 (VL)을, 다른 말단에는 불변 도메인을 가지고 있다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변성 도메인은 중쇄의 가변성 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변성 도메인과 중쇄 가변성 도메인 사이에 계면(interface)을 형성하는 것으로 생각된다.
본원에서 다양한 항체를 기술하기 위해 사용된 용어 "단리된" ("isolated")은 항체가 발현되는 세포 또는 세포 배양물로부터 동정 및 분리 및/또는 재생된 항체를 지칭한다. 천연 환경으로부터의 불순물 (오염 물질)은 폴리펩타이드의 진단 또는 치료학적 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는, (1) 스피닝 컵 서열 분석 장치 (spinning cup sequenator) (Edman sequenator)의 사용에 의한 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (2) 코마시 브릴리언트 블루 또는 바람직하게는 은 염료를 이용한 환원성 또는 비-환원성 조건 하 SDS-PAGE에서의 동질성을 나타내는 수준으로 정제된다. 단리된 항체는, 폴리펩타이드의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않으므로, 재조합 세포 내부의 인 시추 항체를 포함한다. 전형적으로, 단리된 폴리펩타이드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조된다.
"단리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 소스에서 일반적으로 결합되어 있는 하나 이상의 핵산 분자-불순물로부터 동정 및 분리된 것이다. 단리된 핵산 분자는, 천연 환경에서 발견되는 형태 또는 세트와 구분된다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 환경에서 세포내 존재하는 핵산 분자와 구분된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는, 예를 들어, 핵산 분자가 천연 환경에서 세포내 위치화가 아닌 염색체 위치에 존재하는 경우에, 항체가 정상적으로 발현되는 세포내 위치된 핵산 분자를 포함한다.
본원에서, 용어 "에피토프"는 결합 분자 (예, 이중 특이성 결합 분자와 같이, 항체 또는 관련 분자)에 특이적으로 결합하는 항원의 영역 (결정부)을 지칭하는 것으로 의도된다. 에피토프 결정부는 통상적으로 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹핑들로 이루어지며, 전형적으로 특이적인 3차원 구조 특징뿐 아니라 특이적인 전하 특징을 가진다. 에피토프는 "선형" 또는 "입체 구조 (conformational)"일 수 있다. 선형 에피토프의 경우, 단백질 (예, 항원)과 상호작용 분자 (예, 항체) 간의 상호작용 지점들 모두 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형적으로 이루어진다. 입체 에피토프의 경우, 상호작용 지점들은 1차 아미노산 서열에서 서로 이격되어 있는 단백질의 아미노산 잔기들을 가로질러 형성된다. 바람직한 항원 에피토프가 동정되면, 이 에피토프에 대한 항체를 당해 기술 분야에 널리 공지된 기법으로 제작할 수 있다. 또한, 항체 또는 기타 결합 분자의 구축 및 특정화로 바람직한 에피토프에 대한 정보를 해명할 수 있다. 이러한 정보를 기반으로, 예를 들어, 항원에의 결합에 대해 경쟁하는 결합 분자를 탐색하기 위한 경쟁적인 실험들을 수행함으로써, 같은 또는 동일한 (identical) 에피토프에 결합하는 결합 분자를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다.
본원에서, 용어 "펩타이드 링커"는 도메인들을 조합할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 서로 결합하는 도메인에 따라 소정의 길이를 가지며, 임의의 아미노산 서열을 포함하는, 임의의 펩타이드를 의미하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 펩타이드 링커는 5개 이상의 아미노산 길이를 가지며, G, A, S, P, E, T, D, K로부터 선택되는 임의의 아미노산 세트로 구성된다.
용어 "시험관내"는 인공적인 조건에서 신체 외부에서의 생물학적 대상, 생물학적 공정 또는 생물학적 반응을 지칭한다. 예를 들어, 시험관내 배양된 세포는 신체 외부 환경, 예를 들어 시험관, 배양 바이얼 또는 마이크로타이터 플레이트에서 배양된 세포로서 이해된다.
용어 "IC50" (50% 저해 농도)은 생물학적 과정을 50%까지 저해하는데 필요한 약물 농도 및 전해제 부피를 의미한다. IC50 값은 커브 피팅 (curve fitting)을 위한 특수 통계 소프트웨어를 사용해 적절한 용량-반응 곡선을 적용해 계산할 수 있다.
용어 "ED50" (EC50) (50% 유효 용량/농도)은 50%의 (세포독성을 포함할 수 있는) 생물학적 효과를 발휘하는 약물의 농도를 지칭한다.
용어 항체 "작동자 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 Fc-영역 서열 또는 Fc-영역 아미노산 변이체)에 기인한 생물학적 활성을 지칭하며, 이는 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 작동자 기능의 예로는 Clq 결합 및 보체 의존적인 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적인 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예, B 세포 수용체, BCR)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화 등이 있다.
"항체-의존적인 세포성 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비-특이적인 세포독성 세포 (예, 자연 살상 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 타겟 세포 상에 결합된 항체를 인지한 후 타겟 세포의 세포용해 또는 식세포작용을 유발하는, 면역컴피턴트 (immunocompetent) 작동자 세포-매개 (T-킬러, 자연 살상 등) 반응을 의미한다. ADCC를 매개하는 일차 세포, 즉 NK 세포는 FcγRIII만 발현하지만, 단구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포의 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)의 464쪽 표 3에 요약 기술되어 있다. 대상 분자의 ADCC 활성을 분석하기 위해, 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기술된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 사용가능한 작동자 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살상 (NK) 세포이다. 다른 예로 또는 부가적으로, 대상 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998)에 기술된 바와 같이 동물 모델에서 분석할 수 있다.
"인간 작동자 세포"는 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하며 작동자 기능을 수행하는, 백혈구이다. 바람직하게는, 이 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하며, ADCC 작동자 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 자연 살상 (NK) 세포, 단구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있으며; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 작동자 세포는 이의 천연 소스로부터, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 혈액 또는 PBMC로부터 단리할 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 나타내기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 인간 FcR 서열이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것 (수용체 gamma)이며, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스를 포함하며, 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 얼터너티브 슬라이싱된 형태 (alternatively spliced form) 등을 포함한다. FcγRII 수용체는, 주로 세포질 도메인에 차이가 있는 비슷한 아미노산 서열을 가진, FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("저해 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프 (ITAM, immunoreceptor tyrosine-based activation motif)를 포함한다. 저해 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반의 저해 모티프 (ITIM)를 포함한다 (Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcR에 대한 리뷰는 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)에 제공된다. 향후 동정될 FcR 등의, 기타 FcR도 본원에서 용어 "FcR" 범위에 포함된다. 이 용어는 또한 모계 IgG를 태아에 전달하는 역할을 하는 신생아 (neonatal) 수용체 FcRn을 포함한다.
"보체-의존적인 세포독성" 또는 "CDC"는 분자가 보체의 존재시 타겟을 세포용해시킬 수 있는 능력을 의미한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템 (C1q)의 제1 성분이 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예, 항체)에 결합함으로써, 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)에 기술된 바와 같이, CDC 분석을 수행할 수 있다.
용어 "동일성" 또는 "상동성"은, 서열을 정렬하고, 필요에 따라 전체 서열에 대해 최대 동일성%를 달성하기 위해 갭을 도입하며, 임의의 보존적인 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않은 후, 후보 서열의 아미노산 잔기가 이와 비교되는 대응되는 서열의 잔기와 동일한 %를 의미하는 것으로 해석된다. N-말단 또는 C-말단 연장도 삽입도 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되진 않을 것이다. 정렬 방법 및 컴퓨터 프로그램들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어를 사용해 측정할 수 있다 (예, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705). 이 소프트웨어는 다양한 치환, 결손 (소거) 및 기타 변형에 대한 상동성 정도를 지정함으로써 유사한 서열들을 매칭시킨다.
항체의 폴리펩타이드 서열과 관련하여 용어 "상동성"은 항체가 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 더 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%의 서열 동일성을 나타내는 것으로 해석되어야 한다. 이 용어는, 핵산 서열과 관련하여, 뉴클레오티드 서열이 핵산 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 97%의 서열 동일성을 나타내는 것으로 해석되어야 한다.
본원에 기술된 항체의 아미노산 서열에 변형(들)이 제공된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산에 도입하거나 또는 펩타이드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형으로는, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결손, 및/또는 삽입, 및/또는 치환 등이 있다. 최종 구조체가 바람직한 특징을 가지는 한, 최종 구조체에 도달하기 위한 결손, 삽입 및 치환의 임의 조합이 행해진다. 또한, 아미노산 변형은 당화 부위의 개수 또는 위치의 변동 등의, 항체에서 번역 후 프로세스를 변형시킬 수 있다.
아미노산 치환을 이용한 항체의 아미노산 서열의 변형 변이체. 이러한 변이체는 항체 분자의 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 잔기로 치환한 것이다. 치환 돌연변이를 유발하기 위한 가장 주목되는 부위로는 과가변부 또는 CDR 등이 있지만, FR 또는 Fc 변형 역시 고려된다. 보존적인 치환은 표 1의 "바람직한 치환"에 나타낸다. 이러한 치환으로 생물학적 활성에 변화가 생긴다면, 표 A에서 "치환 예"로 언급된 추가적인 실질적인 변화가 도입될 수 있거나, 또는 아미노산의 클래스를 기술함에 있어 아래에 추가적으로 기술된 변화가 도입될 수 있으며, 산물 스크리닝 역시 수행할 수 있다.
표 1
오리지날 잔기 치환 예 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg(R) Lys; Gin; Asn Lys
Asn(N) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln(Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gin Asp
Gly(G) Ala Ala
His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르루신 Leu
Leu (L) 노르루신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe(F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp(W) Tyr; Phe Tyr
Tyr(Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르루신 Leu
용어 "핵산", "뉴클레익 서열 (nucleic sequence)", "핵산 서열", "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 핵산의 단편 또는 영역을 결정하고, 비-천연 뉴클레오티드를 함유하거나 또는 비-함유하고, 이중 가닥 DNA 또는 RNA 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA 또는 이들 DNA의 전사 산물인, 변형된 또는 비-변형된 정확한 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본 발명은 천연 염색체 환경, 즉 천연 상태의 뉴클레오티드 서열과 무관한 것으로 본원에 포함되어야 한다. 본 발명의 서열은 단리 및/또는 정제된 것이며, 즉, 예를 들어, 복사 (copy)에 의해 직접 또는 간접적으로 수집된 것이며, 이의 환경은 적어도 부분적으로 변형된다. 이에, 예를 들어, 숙주 세포의 재조합 유전학에 의해 수득되거나 또는 화학 합성에 의해 수득된 단리된 핵산 역시 본 발명에 언급되어야 한다.
뉴클레오티드 서열은 달리 언급되지 않은 한 이의 상보체를 포괄한다. 즉, 특정 서열을 가진 핵산은 이의 상보적인 서열을 가진 이의 상보적인 가닥을 포괄하는 것으로서 이해되어야 한다.
"조절 서열"이라는 표현은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현시키는데 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열로는, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합부 등이 있다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은, 다른 핵산 서열과 기능적인 관계로 배치되었을 때, "작동가능하게 연결"된 것이다. 예를 들어, 프리-서열 (pre-sequence) 또는 분비형 리더 서열의 DNA는, 폴리펩타이드 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현된다면, 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고; 프로모터 또는 인핸서가 서열 전사에 영향을 미친다면 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이고; 또는 리보솜 결합부가 번역을 용이하도록 배치된다면 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은, 연결된 DNA 서열들이 인접해 있으며, 분비형 리더의 경우에는 인접해 있으며 리딩 페이스 (in reading phase)인 것을 의미한다. 그러나, 인핸서가 인접하게 위치되어야 하는 것은 아니다.
본원에서, 용어 "벡터"는 이에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드이며, 즉 부가적인 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 조각이다. 일부 구현예에서, 벡터는 부가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 이것이 도입된 숙주 세포에서 자율적인 복제 (autonomous replication)를 수행할 수 있다 (예, 박테리아의 복제 오리진을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 추가적인 구현예들에서, 벡터 (예, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포 게놈에 병합될 수 있으며, 그래서 숙주 유전자와 함께 복제된다. 또한, 일부 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히 "발현 벡터")로서 언급된다.
본원에서, 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단하게 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 발명은 전술한 본 발명에 따른 벡터를 포함할 수 있는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 예를 들어, 본 발명의 결합 분자의 제1 결합 도메인 및/또는 제2 결합 도메인의, 중쇄 또는 이의 항원-결합 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 경쇄-코딩 뉴클레오티드 서열 또는 이의 항원-결합 영역, 또는 이 둘다를 포함하는, 숙주 세포에 관한 것이다. "재조합 숙주 세포" 및 "숙주 세포"는 특정 대상 세포뿐 아니라 물론 이 세포의 자손을 지칭하는 것으로 의도된다. 변형은 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 연속 세대들에서 발생할 수 있으므로, 이들 자손은 실제 모 세포와 동일하지 않을 순 있지만, 이들 세포는 여전히 본 발명의 "숙주 세포"라는 용어의 범위에 포함된다.
본원에서, 용어 "부형제"는 본 발명의 화합물(들) 이외의 다른 임의의 성분을 나타내기 위해 사용된다.
"약학적 조성물"은 본 발명의 항체와, 약제학적으로 허용가능하며 약리학적으로 혼용가능한 충전제, 용매, 희석제, 담체, 보조제, 분배 및 감지 물질 (dispensing and sensing agent), 전달제, 예를 들어, 보존제, 안정화제, 충전제, 붕해제 (disintegrator), 보습제, 유화제, 현탁화제, 증점제, 감미제, 향제 (flavouring agent), 방향제 (aromatizing agent), 항세균제, 살진균제, 윤활제 및 장기 전달 조절제 (prolonged delivery regulator)를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 조성물을 의미하며, 이들의 선택과 적절한 비율은 투여 타입과 방식 및 용량에 따라 결정된다. 적합한 현탁화제의 예로는 에톡시화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에텐, 소르비톨 및 소르비톨 에스테르, 미세결정 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트 및 이들의 혼합물이 있다. 미생물 작용을 방지하는 보호는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 소르브산 및 유사 화합물에 의해 제공될 수 있다. 또한, 조성물은 등장성 물질, 예를 들어, 당 (sugar), 폴리올, 염화나트륨 등을 포함할 수 있다. 조성물의 연장된 작용은 활성 성분의 흡수를 서행시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴에 의해 달성될 수 있다. 적절한 담체, 용매, 희석제 및 전달제의 예로는 물, 에탄올, 폴리알코올 및 이들의 혼합물, 천연 오일 (예, 올리브 오일) 및 주사용 유기 에스테르 (예, 에틸 올리에이트) 등이 있다. 충전제의 예로는 락토스, 유당 (milk sugar), 소듐 사이트레이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트 등이 있다. 붕해제 및 분배제의 예는 전분, 알긴산 및 이의 염, 실리케이트이다. 적절한 윤활제의 예는 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트, 탈크 및 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜이다. 활성 성분을 단독으로 또는 다른 화합물과 조합하여, 경구, 설하, 경피, 안내, 근육내, 정맥내, 피하, 국소 또는 직장 투여하기 위한 약학적 조성물은, 동물 및 인간에게 전통적인 약제학적 담체와의 혼합물로서 표준적인 투여 형태로 투여할 수 있다. 적절한 표준적인 투여 형태로는 경구 형태, 예를 들어, 정제, 젤라틴 캡슐제, 환제, 산제, 과립제, 츄잉 검 및 경구 용액 (peroral solution) 또는 현탁액; 설하 및 볼을 통한 (transbuccal) 투여 형태; 에어로졸; 임플란트; 국소, 경피, 피하, 근육내, 정맥내, 비강내 또는 안내 투여 형태, 및 직장 투여 형태 등이 있다.
"약제"는, 인간 및 동물에서 생리학적 기능을 복구, 개선 또는 수정하고 질환을 치료 및 예방하고, 진단, 마취, 피임, 미용 (cosmetology) 및 기타 용도로 의도된, 정제, 캡슐제, 용액, 연고 및 기타 레디 형태 (ready form)의 화합물 (또는 약학적 조성물로서 화합물들의 혼합물)이다.
용어 "IL-5 및 이의 세포 수용체 간의 상호작용에 의해 매개되는 질환 또는 장애"는, 질환 또는 장애의 병인, 발병, 진행, 지속 또는 병리를 포함하여, IL-5와 IL-5R 간의 직접 또는 간접적으로 연관된, 모든 질환 또는 장애를 의미한다. "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 생물학적 장애 및/또는 하나 이상의 이와 관련된 증상을 완화 또는 제거하는 방법을 의미한다. 본원에서, 질환, 장애 또는 병태를 "완화한다"는 것은 질환, 장애 또는 병태의 증상의 중증도 및/또는 발병 빈도의 감소를 의미한다. 또한, 본원에서 "치료"는 것은 근치적 (curative), 고식적 (palliative) 및 예방적 치료를 포괄한다.
일 측면에서, 치료 대상 또는 환자는 포유류이며, 바람직하게는 인간 개체이다. 개체는 임의 연령의 남성 또는 여성일 수 있다.
용어 "장애"는 본 발명의 화합물을 이용한 치료가 유익한 임의 병태를 의미한다. 이는 포유류가 대상 장애에 취약하게 만드는 병리학적 병태를 비롯해, 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료할 바람직한 장애는 자가면역 질환이다.
용어 "면역 반응", "자가면역 반응" 및 "자가면역 염증"은, 예를 들어, 림프구, 항원-제시 세포, 식세포, 과립구 및 이들 세포나 간세포에 의해 생산되는 용해성 거대분자 (soluble macromolecule) (침습성 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암 세포 또는 자가면역 또는 병원성 염증의 경우에는 인체로부터 유래된 정상 세포 또는 조직의 선택적인 손상, 파괴 또는 소거의 결과로 생기는, 항체, 사이토카인 및 보체)의 작용을 지칭한다.
본원에서, 용어 "자가면역 질환"은 개체 자신 (자가) 항원 및/또는 조직으로부터 생기며 이를 겨냥하는 비-악성 질환 또는 장애를 지칭한다.
이 용어는, 비-제한적으로, 류마티스 관절염, 골관절염, 소아 만성 관절염, 화농성 관절염, 라임 골관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 전신성 홍반성 루푸스, 크론질환, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 아토피성 피부염, 경피증, "이식 편대 숙주" 반응, 장기 이식 거부 반응, 장기 이식 관련 급성 또는 만성 면역 질환, 사르코이드증, 가와사키 질환, 그레이브스 질환, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노호-쉔라인 자반증, 현미경적 신장 혈관염 (microscopic renal vasculitis), 만성 활동성 간염, 포도막염 (uvenita), 패혈증 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척수염, 헌팅턴 무도명, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 성인 (급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모, 원형 탈모증, 혈청반응음성의 관절병증 (seronegative arthropathy), 관절병증, 라이터 질환, 궤양성 대장염 관절병증과 관련된 건선성 관절병증 (psoriatic arthropathy associated with ulcerative colitis arthropathy), 아토피성 알레르기, 자가면역성 수포 질환 (autoimmune bullous disease), 심상성 천포창, 시트형 천포창 (sheet-like pemphigus), 유천포창 질환, 선상 IgA, 자가면역 용혈성 빈혈, 콤스-양성의 용혈성 빈혈 (Coombs-positive hemolytic anemia), 악성 빈혈 (pernicious anemia), 소아 악성 빈혈, 관절염, 원발성 경화성 A형 간염 (primary sclerosing hepatitis A), 원인불명의 자가면역 간염, 섬유증 폐 질환, 원인불명의 섬유증 폐포염, 염증후 간질성 폐 질환 (post-inflammatory interstitial lung disease), 간질성 폐렴, 만성 호산성 폐렴, 감염후 간질성 폐 질환 (post-infectious interstitial lung disease), 통풍성 관절염, 자가면역 간염, I형 자가면역 간염 (고전적인 자가면역 간염 또는 루포이드), II형 자가면역 간염, 골관절염, 원발성 경화성 담관염, I형 건선, II형 건선, 특발성 백혈구 감소증, 자가면역 호중구 감소증, 신장 NOS-질환, 사구체신염, 현미경적 신장 혈관염 (microscopic renal vasculitis), 원판형 홍반성 루푸스, 특발성 또는 NOS-남성 불임, 정자에 대한 자가면역 (autoimmunity to sperm), 다발성 경화증 (모든 서브타입), 교감성 안염 (sympathetic ophthalmia), 결합 조직 질환으로 인한 폐 고혈압 (pulmonary hypertension secondary to connective tissue disease), 굿파스처 증후군, 결절성 다발관절염의 폐 증상 (pulmonary manifestations of polyarthritis nodosa), 급성 류마티스성 열, 류마티스 척추염, 강직성 척추염, 스틸 질환, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 타카야수 질환/동맥염, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능 항진증, 갑상선종 자가면역 갑상선 기능 저하증 (goiter autoimmune hypothyroidism) (하시모토 질환), 자가면역 위축성 갑상선 기능 저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염 (phacogenic uveitis), 원발성 혈관염, 백반증, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알레르기, 천식, 정신 질환 (psychiatric disorder) (우울증 및 정신분열증 등), 타입 Th2/타입 Th1-매개 질환, 결막염, 알레르기성 접촉성 피부염, 알레르기성 비염, 알파-1-항트립신 결핍증 (deficiency of alpha-1-antitrypsin), 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 낭포성 섬유증, 사이토카인 테라피 관련 장애 (disorders associated with cytokine therapy), 탈수초 질환, 피부염, 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 허혈증-재관류 손상, 허혈성 뇌졸중, 소아 류마티스 관절염, 자가면역성 장병증, 자가면역성 난청 (autoimmune hearing loss), 자가면역성 림프증식성 증후군, 자가면역성 심근염, 자가면역성 조기 난소 부전, 및 안검염을 포함한다. 항체는 또한 상기한 장애들의 임의 조합을 치료할 수 있다.
"치료학적 유효량"은 치료 중인 장애의 한가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시키는 투여 중인 치료학적 물질의 양을 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "만성적인 (chronic)" 투여는, 장기간 동안 초기 치료학적 효과 (활성)를 유지하기 위해, 급성 (단기간) 투여 방식과 반대되는, 물질(들)의 연속적인 (지속적인) 사용을 의미한다.
"간헐적" 투여는 중단없이 계속적으로 수행되는 것이 아니라 사실상 주기적인 치료를 의미한다.
본원에서, 용어 "들을 포함한다", "들을 가진다, "들을 함유한다" 또는 "을 포함한다", "포함하는", "을 가진다", "가지는", "을 함유한다" 또는 "포함하여"와 같은 변형어, 그리고 이의 모든 문법상 변형어들은, 언급된 정수 (integer) 또는 정수군을 포함하는 의미로 이해될 뿐만 아니라, 임의의 다른 정수 또는 정수군을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 상세한 설명
항체
본 발명은 IL-5Rα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은, IL-5Rα에 결합하며, 하기를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다:
(a) 서열 DYATNYGVPYFGS (서열번호 3)와 적어도 80%, 85% 또는 92% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는, 즉 CDR3가 서열 DYATNYGVPYFGS (서열번호 3)이거나 또는 서열 DYATNYGVPYFGS (서열번호 3)에 1 또는 2개의 치환을 가진 서열인, 중쇄 가변부, 및
(b) 서열 QSYDSSLSGHVV (서열번호 8)와 적어도 80%, 83% 또는 91% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는, 즉 CDR3가 서열 QSYDSSLSGHVV (서열번호 8)이거나 또는 서열 QSYDSSLSGHVV (서열번호 8)에 1 또는 2개의 치환을 가진 서열인, 경쇄 가변부.
일 구현예에서, 본 발명은, IL-5Rα에 특이적으로 결합하며; 아미노산 서열 DYATNYGVPYFGS (서열번호 3)를 포함하는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변부를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은, IL-5Rα에 특이적으로 결합하며; 아미노산 서열 QSYDSSLSGHVV (서열번호 8)를 포함하는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변부를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은, IL-5Rα에 특이적으로 결합하며; 하기를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다:
(a) 아미노산 서열 DYATNYGVPYFGS (서열번호 3)를 포함하는 CDR3를 포함하는, 중쇄 가변부, 및
(b) 아미노산 서열 QSYDSSLSGHVV (서열번호 8)를 포함하는 CDR3를 포함하는, 경쇄 가변부.
일 구현예에서, 본 발명은, IL-5Rα에 특이적으로 결합하며; 하기를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다:
(a) 하기를 포함하는, 중쇄 가변부:
(i) 서열 NYAMS (서열번호 1)와 적어도 80% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 즉 CDR1은 서열 NYAMS (서열번호 1)이거나, 또는 서열 NYAMS (서열번호 1)에 하나의 치환을 포함하는 서열임;
(ii) 서열 AINSGGKSTNYADSVKG (서열번호 2)와 적어도 80%, 88% 또는 94% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 즉 CDR2는 서열 DYATNYGVPYFGS (서열번호 2)이거나 또는 서열 AINSGGKSTNYADSVKG (서열번호 2)에 1 또는 2개의 치환을 포함하는 서열임;
(iii) 서열 DYATNYGVPYFGS (서열번호 3)와 적어도 80%, 85% 또는 92% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 즉 CDR3는 서열 DYATNYGVPYFGS (서열번호 3)이거나 또는 서열 DYATNYGVPYFGS (서열번호 3)에 1 또는 2개의 치환을 포함하는 서열임;
및/또는
(b) 하기를 포함하는 경쇄 가변부:
(i) 서열 SGSRSNIGSGYDVH (서열번호 6)와 적어도 80%, 85% 또는 92% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 즉 CDR1은 서열 SGSRSNIGSGYDVH (서열번호 6)이거나 또는 서열 SGSRSNIGSGYDVH (서열번호 6)에 1 또는 2개의 치환을 포함하는 서열임;
(ii) 서열 DDNNRPS (서열번호 7)와 적어도 80% 또는 85% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 즉 CDR2는 서열 DDNNRPS (서열번호 7)이거나 또는 서열 (서열번호 7)에 하나의 치환을 포함하는 서열임;
(iii) 서열 QSYDSSLSGHVV (서열번호 8)와 적어도 80%, 83% 또는 91% 이상 상동적인 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 즉 CDR3는 서열 QSYDSSLSGHVV (서열번호 8)이거나 또는 서열 QSYDSSLSGHVV (서열번호 8)에 1 또는 2개의 치환을 포함하는 서열임.
일 구현예에서, 본 발명은, IL-5Rα에 특이적으로 결합하며; 하기를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다:
(a) 하기를 포함하는 중쇄 가변부:
(i) 아미노산 서열 NYAMS (서열번호 1)를 포함하는 CDR1,
(ii) 아미노산 서열 AINSGGKSTNYADSVKG (서열번호 2)를 포함하는 CDR2,
(iii) 아미노산 서열 DYATNYGVPYFGS (서열번호 3)를 포함하는 CDR3, 및/또는
(b) 하기를 포함하는 경쇄 가변부:
(i) 아미노산 서열 SGSRSNIGSGYDVH (서열번호 6)를 포함하는 CDR1,
(ii) 아미노산 서열 DDNNRPS (서열번호 7)를 포함하는 CDR2,
(iii) 아미노산 서열 QSYDSSLSGHVV (서열번호 8)를 포함하는 CDR3.
일 구현예에서, 본 발명은, IL-5Rα에 특이적으로 결합하며; 하기를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다:
(a) QVTLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGR FTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTTVTVSS (서열번호 4) 또는 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSS (서열번호 5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 가변부,
및/또는
(b) QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQVPGTAPKLLIFDDNNRPSGVPDRFSG SKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVL (서열번호 9) 또는 QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVL (서열번호 10)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 가변부.
일 구현예에서, 본 발명은, IL-5Rα에 특이적으로 결합하며; 하기를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다:
(a) QVTLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVK G RFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTTVTVSS (서열번호 4) 또는 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSS (서열번호 5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 가변부, 및/또는
(b) QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQVPGTAPKLLIFDDNNRPSGVPDRFSG SKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVL (서열번호 9) 또는 QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVL (서열번호 10)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 가변부.
일 구현예에서, 본 발명은, IL-5Rα에 특이적으로 결합하며; 하기를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다:
(a) QVTLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKG RFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 11) 또는 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGG KSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 12)의 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄,
및/또는
(b) QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQVPGTAPKLLIFDDNNRPSGVPDRFSGS KSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 13) 또는 QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDDNNRP SGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 14)의 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 상동적인 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄.
일 구현예에서, 본 발명은, IL-5Rα에 특이적으로 결합하며; 하기를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다:
(a) QVTLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKG RFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 11) 또는 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKS TNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 12)의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄,
및/또는
(b) 아미노산 서열 QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQVPGTAPKLLIFD DNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 13) 또는 QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQLPG TAPKLLIYDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 14)을 포함하는, 경쇄.
일 구현예에서, IL-5Rα에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 단일클론 항체이다.
일 구현예에서, IL-5Rα에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 전장 IgG 항체이다.
일 구현예에서, IL-5Rα에 특이적으로 결합하는 전장 IgG 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형 항체이다.
일 구현예에서, IL-5Rα에 특이적으로 결합하는 전장 IgG 항체는 인간 IgG1 이소형 항체이다.
일 구현예에서, 단리된 항체는, IL-5Rα에 특이적으로 결합하며; 아미노산 서열 QVTLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTIS R DNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTTVTVSS를 포함하는 중쇄 가변성 단편 및 아미노산 서열 QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQVPGTAPKLLIFDDNNRP SGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVL을 포함하는 경쇄 가변성 단편을 포함하는, 항체 BCD133-03-002이다.
일 구현예에서, 단리된 항체는, IL-5Rα에 특이적으로 결합하며; 아미노산 서열 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFT ISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSS를 포함하는 중쇄 가변성 단편과 아미노산 서열 QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQVPGTAPKLLIFDDNNR PSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVL을 포함하는 경쇄 가변성 단편을 포함하는, 항체 BCD133-03-020이다.
일 구현예에서, 단리된 항체는, IL-5Rα에 특이적으로 결합하며; 아미노산 서열 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTIS RDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSS를 포함하는 중쇄 가변성 단편과, 아미노산 서열 QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYDDNN RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVL을 포함하는 경쇄 가변성 단편을 포함하는, 항체 BCD133-03-021이다.
일 구현예에서, 단리된 항체는, IL-5Rα에 특이적으로 결합하며; 아미노산 서열 QVTLKESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTIS RDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK를 포함하는 중쇄 가변성 단편과, 아미노산 서열 QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDV HWYQQVPGTAPKLLIFDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC를 포함하는 경쇄 가변성 단편을 포함하는, 항체 BCD133-03-002이다.
일 구현예에서, 단리된 항체는, IL-5Rα에 특이적으로 결합하며; 아미노산 서열 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTIS RDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK를 포함하는 중쇄 가변성 단편과, 아미노산 서열 QAGLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGY DVHWYQQVPGTAPKLLIFDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC를 포함하는 경쇄 가변성 단편을 포함하는, 항체 BCD133-03-020이다.
일 구현예에서, 단리된 항체는, IL-5Rα에 특이적으로 결합하며; 아미노산 서열 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINSGGKSTNYADSVKGRFTIS RDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCADYATNYGVPYFGSWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK를 포함하는 중쇄 가변성 단편과, 아미노산 서열 QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGSRSNIGSGYDVH WYQQLPGTAPKLLIYDDNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGHVVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC를 포함하는 경쇄 가변성 단편을 포함하는, 항체 BCD133-03-021이다.
핵산 분자
또한, 본 발명은, 본원에 기술된, 선택적으로 서로 연결하는 임의의 펩타이드 링커 서열을 포함하는, 핵산 분자, 특히 본 발명의 IL-5Rα (인터루킨 5 수용체 α-쇄)에 대한 항체 또는 이의 임의 단편을 코딩하는 서열, 및 이들의 다양한 조합에 관한 것이다.
뉴클레오티드 서열
뉴클레오티드 서열은 달리 언급되지 않은 한 이의 상보체를 포괄한다. 따라서, 특이적인 서열을 가진 핵산은 상보적인 서열을 가진 이의 상보적인 가닥을 포괄하는 것으로서 이해되어야 한다. 본원에서, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 염기 10개 이상의 길이의 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 임의 타입의 뉴클레오티드의 변형된 형태로 된 폴리머 형태를 의미한다. 이 용어는 이중 가닥 형태 및 단일 가닥 형태를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기한 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1-3, 6-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 상동적이거나 또는 동일한 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4-5, 9-10의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 상동적이거나 또는 동일하다. 또한, 본 발명은, 상기한 하나 이상의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 상동적이거나 또는 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 11-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기한 하나 이상의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 11-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1-14로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산 분자는 또한 이러한 뉴클레오티드 서열들의 임의 조합을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 8을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 1-3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 6-8을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 4 또는 5를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 9 또는 10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 4 또는 5를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 서열번호 9 또는 10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 11 또는 12를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 13 또는 14를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 11 또는 12를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 서열번호 13 또는 14를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은, 중쇄를 코딩하며; 하기 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 상동적이거나 또는 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 분자에 관한 것이다: CAAGTAACCCTAAAGGAAAGTGGAGGAGGACTTGTCCAACCCGGCGGCAGTTTAAGACTTAGCTGTGCTGCTTCTGGCTTTACTTTTAGCAACTATGCTATGTCGTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGAAAGGGCCTAGAATGGGTGAGCGCTATCAATAGCGGCGGAAAAAGCACTAACTACGCGGACAGCGTGAAAGGCCGCTTCACTATAAGTCGGGACAATGCTAAAAACACACTGTACCTCCAGATGAACTCCCTAAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTACTACTGCGCTGATTATGCGACTAACTATGGAGTGCCATACTTCGGAAGCTGGGGCCAGGGAACGACCGTAACTGTGAGTAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAAAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA (서열번호 15) 또는
CAAGTACAACTACAGGAAAGTGGAGGAGGACTTGTCCAACCCGGCGGCAGTTTAAGACTTAGCTGTGCTGCTTCTGGCTTTACTTTTAGCAACTATGCTATGTCGTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGAAAGGGCCTAGAATGGGTGAGCGCTATCAATAGCGGCGGAAAAAGCACTAACTACGCGGACAGCGTGAAAGGCCGCTTCACTATAAGTCGGGACAATGCTAAAAACACACTGTACCTCCAGATGAACTCCCTAAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTACTACTGCGCTGATTATGCGACTAACTATGGAGTGCCATACTTCGGAAGCTGGGGCCAGGGAACGATGGTAACTGTGAGTAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAAAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA (서열번호 16).
일 측면에서, 본 발명은, 중쇄를 코딩하며; 하기 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 분자에 관한 것이다: CAAGTAACCCTAAAGGAAAGTGGAGGAGGACTTGTCCAACCCGGCGGCAGTTTAAGACTTAGCTGTGCTGCTTCTGGCTTTACTTTTAGCAACTATGCTATGTCGTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGAAAGGGCCTAGAATGGGTGAGCGCTATCAATAGCGGCGGAAAAAGCACTAACTACGCGGACAGCGTGAAAGGCCGCTTCACTATAAGTCGGGACAATGCTAAAAACACACTGTACCTCCAGATGAACTCCCTAAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTACTACTGCGCTGATTATGCGACTAACTATGGAGTGCCATACTTCGGAAGCTGGGGCCAGGGAACGACCGTAACTGTGAGTAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAAAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA (서열번호 15) 또는
CAAGTACAACTACAGGAAAGTGGAGGAGGACTTGTCCAACCCGGCGGCAGTTTAAGACTTAGCTGTGCTGCTTCTGGCTTTACTTTTAGCAACTATGCTATGTCGTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGAAAGGGCCTAGAATGGGTGAGCGCTATCAATAGCGGCGGAAAAAGCACTAACTACGCGGACAGCGTGAAAGGCCGCTTCACTATAAGTCGGGACAATGCTAAAAACACACTGTACCTCCAGATGAACTCCCTAAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTACTACTGCGCTGATTATGCGACTAACTATGGAGTGCCATACTTCGGAAGCTGGGGCCAGGGAACGATGGTAACTGTGAGTAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAAAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA (서열번호 16).
일 측면에서, 본 발명은, 경쇄를 코딩하며; 하기 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 상동적인 또는 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 분자에 관한 것이다:
CAGGCTGGACTGACGCAACCGCCATCTGTGAGTGCGGCTCCAGGACAACGGGTGACTATAAGCTGCAGCGGAAGCAGAAGCAACATAGGCAGTGGATACGACGTACATTGGTACCAACAAGTACCGGGGACGGCTCCGAAACTACTGATATTTGACGATAATAATAGACCGAGCGGCGTACCAGACCGTTTTAGCGGAAGCAAAAGTGGAACGAGTGCCTCTTTAGCCATAACTGGCCTGCAAGCTGAAGATGAAGCTGATTATTACTGTCAGAGCTACGACAGCAGTCTGAGTGGACACGTAGTGTTTGGAGGAGGAACGAAGCTGACGGTATTACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (서열번호 17) 또는
CAGAGTGTGCTGACGCAACCGCCATCTGTGAGTGCGGCTCCAGGACAACGGGTGACTATAAGCTGCAGCGGAAGCAGAAGCAACATAGGCAGTGGATACGACGTACATTGGTACCAACAACTACCGGGGACGGCTCCGAAACTACTGATATACGACGATAATAATAGACCGAGCGGCGTACCAGACCGTTTTAGCGGAAGCAAAAGTGGAACGAGTGCCTCTTTAGCCATAACTGGCCTGCAAGCTGAAGATGAAGCTGATTATTACTGTCAGAGCTACGACAGCAGTCTGAGTGGACACGTAGTGTTTGGAGGAGGAACGAAGCTGACGGTATTACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (서열번호 18).
일 측면에서, 본 발명은, 경쇄를 코딩하며; 하기 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 분자에 관한 것이다:
CAGGCTGGACTGACGCAACCGCCATCTGTGAGTGCGGCTCCAGGACAACGGGTGACTATAAGCTGCAGCGGAAGCAGAAGCAACATAGGCAGTGGATACGACGTACATTGGTACCAACAAGTACCGGGGACGGCTCCGAAACTACTGATATTTGACGATAATAATAGACCGAGCGGCGTACCAGACCGTTTTAGCGGAAGCAAAAGTGGAACGAGTGCCTCTTTAGCCATAACTGGCCTGCAAGCTGAAGATGAAGCTGATTATTACTGTCAGAGCTACGACAGCAGTCTGAGTGGACACGTAGTGTTTGGAGGAGGAACGAAGCTGACGGTATTACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (서열번호 17) 또는
CAGAGTGTGCTGACGCAACCGCCATCTGTGAGTGCGGCTCCAGGACAACGGGTGACTATAAGCTGCAGCGGAAGCAGAAGCAACATAGGCAGTGGATACGACGTACATTGGTACCAACAACTACCGGGGACGGCTCCGAAACTACTGATATACGACGATAATAATAGACCGAGCGGCGTACCAGACCGTTTTAGCGGAAGCAAAAGTGGAACGAGTGCCTCTTTAGCCATAACTGGCCTGCAAGCTGAAGATGAAGCTGATTATTACTGTCAGAGCTACGACAGCAGTCTGAGTGGACACGTAGTGTTTGGAGGAGGAACGAAGCTGACGGTATTACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (서열번호 18).
일 측면에서, 본 발명은 상기한 핵산 서열들의 임의 조합을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
전술한 임의 구현예에서, 핵산 분자는 단리될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 항-IL-5Rα 항체 또는 이의 일부를 생산하는 임의 소스로부터 단리될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 단리되기 보다는 합성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는, 임의 소스의 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인-프래임으로 연결된, 본 발명의 항체의 제1 도메인 또는 제2 도메인 유래의 VH 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 핵산 분자는, 임의 소스의 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인-프래임으로 연결된, 본 발명의 항체의 제1 영역 또는 제2 영역 유래의 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 제1 또는 제2 결합 도메인의 중쇄 (VH) 및/또는 경쇄 (VL)의 가변성 도메인을 코딩하는 핵산 분자는 항체 유전자의 전체 길이에서 "변환"될 수 있다. 일 구현예에서, VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자는, VH 세그먼트가 벡터에서 CH 세그먼트(들)에 작동가능하게 연결되거나 및/또는 VL 세그먼트가 벡터에서 CH 세그먼트에 작동가능하게 연결되도록, 이미 중쇄 불변 (CH) 또는 경쇄 불변 (CL) 도메인을 코딩하는 발현 벡터에 각각 삽입함으로써, 전체 길이에서 항체 유전자로 변환된다. 다른 구현예에서, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자는, VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 CH 및/또는 CL 도메인을 코딩하는 핵산 분자에 표준 분자 생물학 기법을 이용해 연결, 예를 들어, 라이게이션함으로써, 전체 길이에서 항체 유전자로 변환된다. 전체 길이에서 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 이후 이것이 도입된 세포에서 발현될 수 있다.
핵산 분자를 사용해 재조합 항-IL-5Rα 항체를 다량 발현시킬 수 있다. 또한, 핵산 분자를 사용해, 본원에 기술된 바와 같이, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 2중 특이성 항체, 단쇄 항체, 면역어드헤신 (immunoadhesin), 다이아바디, 돌연변이 항체 및 항체 유도체를 제조할 수 있다.
벡터
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 뉴클레오티드 서열을 발현시키기에 적합한 벡터에 관한 것이다.
본 발명은, 본원에 기술된 바와 같이, 항-IL-5Rα 항체 또는 이의 일부의 임의 아미노산 서열 (예, 제1 결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄 서열 및/또는 제2 결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄 서열)을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 융합 단백질, 변형된 항체, 항체 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 추가적으로 제공한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자 및 벡터를 사용해 돌연변이된 항-IL-5Rα 항체를 만들 수 있다. 항체는, 예를 들어, 항-IL-5Rα 항체의 결합 특성을 변형시키기 위해, 제1 결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변성 도메인 및/또는 제2 결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄에서 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 항체의 KD를 높이거나 또는 낮추기 위해, 또는 koff를 높이거나 또는 낮추기 위해, 또는 항체의 IL-5Rα에 대한 결합 특이성을 변형시키기 위해, 하나 이상의 CDR에 행해질 수 있다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는, 본 발명의 항-IL-5Rα 항체의 제1 또는 제2 결합 도메인내 아미노산 잔기에 행해진다. 이러한 돌연변이는 가변성 도메인의 CDR 또는 프래임워크 영역에서, 또는 불변 도메인에서 행해질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 돌연변이는 가변성 도메인에서 이루어진다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는, 본 발명의 항체의 가변성 도메인의 CDR 또는 프래임워크 영역에서 생식계열과 비교해 변경되는 것으로 알려진 아미노산 잔기에 행해진다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-IL-5Rα 항체는, 유전자들이 전사 조절 서열 및 번역 조절 서열과 같은 필수 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록, 발현 벡터에서, 전술한 바와 같이 수득되는, 제1 또는 제2 결합 도메인의 서열 (예, 결합 도메인이 경쇄 및 중쇄 서열을 포함하는 경우 중쇄 및 경쇄 서열)을 일부 또는 전체 코딩하는 DNA를 삽입함으로써 발현된다. 발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스 (AAV), 식물 바이러스, 예를 들어 콜리플라워 모자익 바이러스, 토바코 모자익 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래 에피좀 등을 포함한다. DNA 분자는 벡터내 전사 및 번역 조절 서열이 DNA의 전사 및 번역을 조절하는 의도한 기능을 제공하도록, 벡터에 라이게이션될 수 있다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포에 적합하도록 선택될 수 있다. 제1 및 제2 결합 도메인의 서열 (예, 결합 도메인이 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 경우 중쇄 및 경쇄 서열)을 일부 또는 전체 코딩하는 DNA 서열이 각 벡터에 도입될 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 DNA 분자들의 임의 조합은 동일한 박현 벡터에 도입된다. DNA 분자는 표준 방법 (예, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적인 제한효소 부위의 라이게이션, 또는 제한효소 부위가 존재하지 않는다면 블런트 엔드 라이게이션)에 의해 발현 벡터에 도입될 수 있다.
적절한 벡터는, 임의의 VH 또는 VL 서열이 전술한 바와 같이 용이하게 삽입 및 발현될 수 있도록 적절한 제한효소 부위 조작을 가진, 기능적으로 완전한 (complete) 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 코딩하는 것이다. 이러한 벡터에서 HC- 및 LC-코딩 유전자는, 대응되는 mRNA를 안정화함으로써 항체 단백질의 전체 수율을 높이는, 인트론 서열을 함유할 수 있다. 인트론 서열 측면에는, RNA 스플라이싱이 발생할 위치를 결정하는 스플라이스 도너 부위와 스플라이스 어셉터 부위가 배치된다. 인트론 서열의 위치는 항체 쇄의 가변부 또는 불변부 중 어느 하나이거나, 또는 복수의 인트론이 사용된 경우에는 가변부 및 불변부 양쪽일 수 있다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 영역의 하류 천연 염색체 부위에서 발생할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩타이드를 코딩한다. 항체 쇄 유전자는, 신호 펩타이드가 면역글로불린 쇄의 아미노 말단에 인-프래임으로 연결되도록, 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종의 (heterologous) 신호 펩타이드 (즉, 비-면역글로불린 단백질 유래 신호 펩타이드)일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는, 항체 쇄 유전자 외에도, 숙주 세포에서 항체 쇄 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 함유 (caryying)할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 조절 서열의 선택 등의 발현 벡터의 설계가 형질전환할 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자들에 따라 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 포유류에서 발현 숙주 세포에 대해 바람직한 조절 서열로는, 레트로바이러스 LTR, 사이토메갈로바이러스 (CMV) (예, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40 (SV40) (예, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스, (예, 주요 후기 프로모터 아데노바이러스 (AdMLP)), 폴리오마 바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서 및 천연 면역글로불린 프로모터 또는 액틴 프로모터와 같은 강한 포유류 프로모터 등의, 포유류 세포에서 단백질의 높은 수준의 발현을 보장하는 바이러스 인자 등이 있다. 바이러스 조절 인자 및 이의 서열에 대한 추가적인 설명은, 예를 들어 미국 특허 5,168,062, 4,510,245 및 4,968,615를 참조한다. 프로모터 및 벡터뿐 아니라 식물의 형질전환에 대한 설명을 포함하여, 식물에서 항체와 같은 결합 분자를 발현시키는 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,517,529를 참조한다. 박테리아 세포 또는 진균 세포, 예를 들어 효모 세포에서 폴리펩타이드를 발현시키는 방법 역시 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는, 항체 쇄 유전자 및 조절 서열 외에도, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 규제하는 서열 (예, 복제 오리진) 및 선별가능한 마커 유전자 등의, 부가적인 서열을 함유할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선별가능하게 만든다 (예, 미국 특허 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017). 예를 들어, 전형적으로, 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약제 물질에 대한 내성을 부여한다. 예를 들어, 선별가능한 마커 유전자로는 다이하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭에 dhfr-숙주 세포를 사용하는 경우), neo 유전자 (G418 선별하는 경우), 및 글루타메이트 신테타제 유전자 등이 있다.
본원에서, 용어 "발현 조절 서열"은 이것이 라이게이션된 코딩 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 미치는데 필수적인 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭하는 것으로 의도된다. 발현 조절 서열로는 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호 등의 효율적인 RNA 프로세싱 신호; 세포질 mRNA를 안정시키는 서열; 번역 효율을 강화하는 서열 (즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 강화하는 서열; 및 적절한 경우, 단백질 분비를 강화하는 서열 등이 있다. 이러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 상이하며; 원핵생물의 경우, 이러한 조절 서열은 일반적으로 리보솜 결합부의 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하며; 진핵생물의 경우, 이러한 조절 서열은 전형적으로 프로모터 서열 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 발현 및 프로세싱에 필수적인 모든 구성 성분들을 적어도 포함하며, 존재할 경우 유익한 부가적인 구성성분, 예를 들어 리딩 서열 및 융합 파트너 서열을 또한 포함할 수 있다.
숙주 세포
본 발명의 추가적인 측면은 본 발명의 항-IL-5Rα 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예는, 항체를 발현할 수 있는 재조합 숙주 세포를 도입/제조하고, 이러한 숙주 세포를 항체의 발현/생산에 적합한 조건에서 배양하고, 수득된 항체를 분리하는 것을 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 재조합 숙주 세포에서의 발현에 의해 제조되는 항-IL-5Rα 항체는 본원에서 "재조합 항-IL-5Rα 항체"로서 지칭된다. 또한, 본 발명은 이러한 숙주 세포로부터 유래된 세포의 자손 및 이와 유사하게 수득되는 항-IL-5Rα 항체에 관한 것이다.
본 발명의 항-IL-5Rα 항체를 코딩하는 핵산 분자 및 이들 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적절한 포유류 또는 이의 세포, 식물 또는 이의 세포, 박테리아 또는 효모 숙주 세포를 형질전환하는데 사용할 수 있다. 형질전환은 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하는 임의의 공지된 기법일 수 있다. 이종의 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포에 도입하는 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 덱스트란-매개 형질감염, 양이온성 폴리머-핵산 복합체 형질감염, 칼슘 포스페이트 침강, 폴리브렌-매개 형질감염, 프로토플라스트 융합, 리포좀내 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화 및 DNA의 핵내 직접 미세주입법 등이 있다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유류에 도입될 수 있다. 세포의 형질감염 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 및 4,959,455를 참조한다. 식물 세포의 형질전환 방법도 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 아그로박테리움-매개 형질전환 (Agrobacterium-mediated transformation), 바이올리스틱 형질전환 (biolistic transformation), 직접 주입 (direct injection), 전기천공 (electroporation) 및 바이러스 형질전환 등이 있다. 박테리아 및 효모 세포의 형질전환 방법들 역시 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
형질전환의 숙주로 사용되는 포유류 세포주는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 이용가능한 복수의 불멸화 세포주들을 포함한다. 이러한 것으로는, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, FreeStyle 293 세포 (Invitrogen), NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포암 세포 (예, Hep G2), A549 세포, 및 복수의 기타 세포주 등이 있다. 발현 수준이 높고 생산되는 단백질의 필수 특징을 제공하는 세포주를 확인함으로써, 세포주를 선택한다. 사용될 수 있는 기타 세포주는 Sf9 또는 Sf21 세포 등의 곤충 세포주이다. 항-IL-5Rα 항체를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포에 도입되는 경우, 숙주 세포에서 항체의 발현 또는 더 바람직하게는 숙주 세포를 배양한 배양 배지로의 항체의 방출을 허용하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 제조한다. 항-IL-5Rα 항체는 표준 단백질 정제 기법을 이용하여 배양 배지로부터 단리할 수 있다. 식물 숙주 세포로는, 예를 들어, 니코티아나 (Nicotiana), 아라비돕시스 (Arabidopsis), 개구리밥 (duckweed), 옥수수, 밀, 감자 등이 있다. 박테리아 숙주 세포로는 E. coli 및 스트렙토마이세스 종 등이 있다. 효모 숙주 세포로는 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 등이 있다.
아울러, 생산 세포주로부터 본 발명의 항-IL-5Rα 항체의 생산 수준은 다수의 공지된 기법을 이용해 강화할 수 있다. 예를 들어, 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템 (GS 시스템)은 특정 조건에서 발현을 강화하기 위한 일반적인 방법이다. GS 시스템은 EP 0216846, 0256055, 0323997 및 0338841과 연계하여 전체 또는 일부 논의되어 있다.
여러가지 세포주에 의해 또는 형질전환 동물에서 발현된 항-IL-5Rα 항체가 서로 상이한 당화 프로파일을 가질 것임은 틀림없다. 그러나, 본원에 기술된 핵산 분자에 의해 코딩되거나 또는 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 항-IL-5Rα 항체들 모두, 결합 분자의 당화와 무관하게, 일반적으로 번역 후 수정 여부와 무관하게, 본 발명의 일부이다.
항체 제조
본 발명은 또한 항-IL-5Rα 항체 및 이의 항원 결합 단편의 제조 방법 및 공정에 관한 것이다.
단일클론 항체
단일클론 항체는 Kohler, et al. Nature 256,1975, p. 495에 최초로 언급된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조되거나, 또는 재조합 DNA 방법 (US 4816567)을 이용해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법의 경우, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터를, 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 유발하기 위해, 전술한 방법에 따라 면역화한다. 다른 구현예에서, 림프구는 시험관내 면역화에 의해 제조할 수 있다. 면역화 후, 림프구를 골수종 세포주와 적절한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용해 융합시켜, 하이브리도마 세포를 제조한다.
전술한 방식으로 생산된 하이브리도마 세포는, 바람직하게는 비-융합된 모 골수종 세포의 증식 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 포함하는, 적절한 배양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍되어 않는다면, 하이브리도마의 배양 배지는 전형적으로 하이토크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지), 즉 HGPRT-결핍 세포의 증식을 저해하는 물질을 함유할 것이다.
골수종 세포 융합의 구성 성분으로서 사용되는, 바람직한 골수종 세포는, 효율적으로 융합하며, 선택된 항체-생산 세포에 의한 안정적인 높은 수준의 항체 생산을 뒷받침하며, 비-융합된 모 세포를 선별하는 배지에 민감한 세포이다. 바람직한 골수종 세포주는 미국 캘리포니아 샌디에고 Salk Institite Cell Disrtibution Center에서 입수할 수 있는 뮤라인 종양 MORS-21 및 MPC-11, 그리고 미국 메릴랜드 록빌 American Type Culture Collection에서 입수할 수 있는 SP-2 또는 X63-Ag8-653 등의 뮤라인 골수종 세포주이다. 단일클론 항체를 제조하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주의 사용 역시 개시된 바 있다 (Kozbor, J. Immunol, 133, 1984, p. 3001).
바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침강 또는 시험관내 결합 분석에 의해, 예를 들어 방사성면역분석 (RIA) 또는 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 측정한다.
단일클론 항체의 결합 친화성은, 예를 들어, Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)에 기술된 스캐차드 분석 (Scatchard analysis)에 의해 측정할 수 있다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 가진 항체를 생산하는 하이브리도마를 동정한 후, 제한 희석 공정을 이용해 클론을 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 배양할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 예를 들어 마우스에 세포의 복막내 (i.p.) 주사에 의해 동물에서 복수 종양으로서 생체내 배양할 수 있다.
서브클론에 의해 방출되는 단일클론 항체는 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 통례적인 항체 정제 기법, 예를 들어 친화성 크로마토그래피 (예, 단백질 A- 또는 단백질 G-세파로스 이용) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 하이드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 분리할 수 있다.
단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 통례적인 공정 (예, 뮤라인 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)을 이용해 쉽게 단리 및 서열분석한다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 소스로서 사용된다. DNA는, 단리 후, 발현 벡터에 배치할 수 있으며, 이후 E. coli 세포, 시미안 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 형질감염되지 않은 항체 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체의 합성을 달성한다.
추가적인 구현예에서, 단일클론 항체 또는 항체 단편은 McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)에 기술된 기법을 이용해 구축한 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)에는 파지 라이브러리를 이용해 뮤라인 및 인간 항체를 각각 단리하는 방법이 기술되어 있다. 후속 간행물들은 매우 거대한 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 체인 셔플링 (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))뿐 아니라 조합 감염 및 생체내 재조합 (combinatorial infection and in vivo recombination)에 의한 고 친화성 (nM 범위) 인간 항체의 제조 방법을 개시한다 (Waterhouse et al., Nucl. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). 즉, 이러한 기법들은 단일클론 항체를 단리하기 위한 전통적인 단일클론 항체 하이브리도마 기법에 대한 실행가능한 대안이다.
항체를 코딩하는 DNA는, 예를 들어, 키메라 또는 융합 항체 폴리펩타이드를 제조하기 위해, 예를 들어, 중쇄 및 경쇄 (CH 및 CL) 불변부의 서열을 상동적인 뮤라인 서열로 치환함으로써 (US 4,816,567 및 Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81: 6851 (1984)), 또는 면역글로불린 코딩 서열을 비-면역글로불린 폴리펩타이드 (이종의 폴리펩타이드)의 코딩 서열 전체 또는 일부에 공유적으로 융합으로써, 변형할 수 있다. 비-면역글로불린 폴리펩타이드 서열이 항체의 불변부를 치환하거나, 또는 항체의 항원-결합 센터의 가변성 도메인을 치환하여, 항원에 대한 특이성을 가진 항원-결합부와 다른 항원에 대한 특이성을 가진 다른 항원-결합부를 포함하는 키메라 2가 항체를 구축할 수 있다.
인간화 항체 (humanized antibody)
비-인간 동물에서 "인간화 항체"를 생산하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비-인간 소스로부터 내부에 통합된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는, 전형적으로 "유입 (import)" 가변부로부터 입수되므로, 흔히 "유입" 잔기로 지칭된다. 인간화는 기본적으로 과가변성 영역의 서열을 인간 항체의 대응되는 서열로 치환함으로써, 윈터 및 동료 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986))의 방법에 따라 수행할 수 있다. 이에, "인간화" 항체는, 온전한 인간 가변부 보다 실질적으로 작은 영역이 비-인간 종 유래의 대응되는 서열로 치환된, 키메라 항체 (US 4,816,567)이다. 실제, 인간화 항체는 전형적으로 일부 과가변부 잔기 및 잠재적으로는 일부 FR 잔기가 설치류 항체에서 유사 영역의 잔기로 치환된, 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는데 사용될, 인간 가변부, 경쇄 및 중쇄 둘다의 선택은, 항체가 인간 치료용으로 의도된 경우, 항원성 및 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체)을 줄이는데 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏 (best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변부 서열은 공지된 인간 가변성 도메인 서열의 전체 라이브러리에서 스크리닝한다. 설치류와 가장 가까운 인간 V 도메인 서열을 동정하고, 인간화 항체에 사용하기 적합한 그 내부 인간 프래임워크 영역 (FR)을 선택한다 (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)). 다른 방법은, 모든 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 컨센서스 서열로부터 유래되는 특정 프래임워크 영역을 이용한다. 동일한 프래임워크를 수종의 여러가지 인간화 항체들에 사용할 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 89:4285 (1992)).
또한, 항체는 인간화되고 높은 항원 결합 친화성과 그외 유의한 생물학적 특성을 가지는 것이 중요하다. 이를 위해, 바람직한 방법에 따라, 모 서열 및 인간화된 서열의 개념적인 3차원 모델을 이용한 모 서열 및 다양한 인간화 산물의 분석에 의해, 인간화 항체를 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용가능하며, 당해 기술 분야의 당업자들에게 익숙하다. 선택한 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 예시 및 제시하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 이미지를 조사하여, 후보 면역글로불린 서열의 기능성에 있어 잔기의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉 후보 면역글로불린이 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기를 분석할 수 있다. 이런 방식으로, 타겟 항원(들)에 대한 친화성 증가와 같은 바람직한 항체 특징을 달성할 수 있도록, FR 잔기들을 선택하고 수용 (recipient) 서열 및 유입 (import) 서열과 조합하여, 타겟 항원(들)에 대한 친화성 증가와 같은 원하는 항체 특징을 달성할 수 있다. 일반적으로, 과가변부 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로, 가장 실질적으로 관여한다.
인간화 항체는, 선택적으로 면역접합체를 형성하기 위해 하나 이상의 세포독성 물질(들)이 접합된, Fab와 같은 항체 단편일 수 있다. 다른 예로, 인간화 항체는 전장 항체, 예를 들어, 전장 IgG1 항체일 수 있다.
인간 항체 및 파지 디스플레이 라이브러리에 기반한 기법
인간화의 대안으로서, 인간 항체를 구축할 수 있다. 예를 들어, 현재, 면역화 후, 내인성 면역글로불린 생산 없이 전 범위 (full spectrum)의 인간 항체를 생산할 수 있는, 형질전환 동물 (예, 마우스)을 생산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결손 (homozygous deletion)시, 내인성 항체 생산이 완전히 저해된다는 것이 개시된 바 있다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이러한 생식계열 돌연변이 마우스에 전이하면, 항원 챌린지시 인간 항체가 만들어진다 (US 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (모두 GenPharm); 5,545,807; 및 WO 97/17852).
다른 예로, 면역화된 공여체 유래 면역글로불린 가변 (V) 영역 유전자 레파토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 제조하기 위해, 파지 디스플레이 기법을 이용할 수 있다 (McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990)). 이 기법에 따라, 항체 V-영역 유전자를 M13 또는 fd와 같은 필라멘트형 박테리오파지의 메이저 또는 마이너 외막 단백질 유전자와 인-프래임으로 클로닝하고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로서 제시한다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 1 카피를 포함하므로, 항체의 기능적 특성에 기반한 선택으로 상기한 특성을 가진 항체를 코딩하는 유전자를 선별한다. 즉, 파지는 B-세포의 일부 특성을 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. 파지 디스플레이를 위해 여러가지 소스의 V-유전자 세그먼트를 사용할 수 있다. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)에서는, 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V-유전자의 소규모 랜덤 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체 세트를 단리하였다. 다양한 항원 세트 (자기-항원 포함)에 대해 비-면역화된 인간 공여체 유래의 V 유전자 레퍼토리를 기본적으로 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)에 기술된 기법에 따라 단리할 수 있다.
전술한 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 구축할 수 있다 (US 5,567,610 및 US 5,229,275).
항체 단편
특정 경우에, 전체 항체 보다는 항체 단편을 사용하는 것이 권고된다. 더 작은 크기의 단편이 이를 신속하게 제거하고, 밀집 종양 (dense tumor)에 더 잘 침투하게 할 수 있다.
항체 단편을 제조하기 위한 다양한 기법들이 개발되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질분해성 분해 (proteolytic digestion)를 통해 유래된다. 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 수득할 수 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 E. coli로부터 발현 및 분비시켜, 이들 단편의 다량 생산을 용이하게 할 수 있다. 항체 단편은 전술한 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 다른 구현예에서, Fab'-SH-단편을 E. coli에서 직접 단리하고, 화학적으로 커플링하여 F(ab')2-단편을 제조할 수 있다 (Carter et al, Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2-단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리할 수 있다. 에피토프 결합성 수용체 잔기를 보유한 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편들이 US 5,869,046에 기술되어 있다. 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 기법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이다. 다른 구현예들에서, 선택 항체는 단쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (WO 93/16185, US 5,571,894 및 US 5,587,458 참조). Fv 및 sFcv는 불변부가 결핍된 온전한 결합 부위를 가진 유일한 종이며; 그래서, 생체내 사용시 비-특이적인 결합을 줄이는데 적합하다. scFv 융합 단백질은 scFv의 N- 또는 C-말단에 작동자 단백질이 융합되게 설계될 수 있다. 또한, 항체 단편은, 예를 들어, US 5,641,870에 기술된 바와 같이 "선형 항체 (linear antibody)"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일 특이성 또는 2중 특이성일 수 있다.
2중 특이성 항체
2중 특이성 항체는 2 이상의 서로 다른 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다. 예를 들어, 2중 특이성 항체는 항-IL-5Rα 항체 단백질의 서로 다른 2개의 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 2중 특이성 항체는, 항-IL-5Rα 항체 결합부를 다른 단백질에 대한 결합부와 조합하여 겸비할 수 있다. 2중 특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예, 2중 특이성 항체의 F(ab')2)으로서 제조할 수 있다.
2중 특이성 항체의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 전장의 2중 특이성 항체의 전통적인 제조 방법은 양쪽 쇄가 서로 다른 특이성을 가진 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동-발현을 기반으로 한다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배분 (random assortment)으로, 이들 하이브리도마 (쿼드로마스 (quadromas))는 단 하나만 올바른 2중 특이성 구조를 가진 10종의 항체 분자들로 된 잠재적인 혼합을 생산한다. 여러 단계들에서 친화성 크로마토그래피에 의해 통상적으로 수행되는 올바른 분자 정제 공정은 다소 번거럽고, 생산 수율이 낮다. 비슷한 방법들은 WO 93/08829에 기술되어 있다.
다른 접근법으로, 바람직한 결합 특이성 (항체의 항원-결합부)을 가진 항체 가변성 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합한다. 융합은 바람직하게는 힌지 CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 Ig-중쇄 불변부를 이용해 이루어진다. 바람직하게는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 가진 제1 중쇄 불변부 (CH1)가 하나 이상의 융합체에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 및 적절할 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 다양한 발현 벡터에 삽입하여, 적합한 숙주 세포에 공동-형질감염시킨다. 이는, 최적의 수율을 제공하기 위해 구조체에 3개의 폴리펩타이드 체인을 비-균등한 비율로 사용하는 구현예에서, 이들 3개의 폴리펩타이드 단편의 상호 비율 (mutual proportion)을 선정하는데 상당한 유연성이 제공된다. 그러나, 폴리펩타이드 체인 2 이상을 균등한 비율로 고 수율로 발현시키거나 또는 이들 비율이 특별히 중요하지 않을 경우, 하나의 발현 벡터에 폴리펩타이드 체인 2개 또는 3개 모두를 코딩 서열을 삽입하는 것도 가능하다.
이러한 접근법에 대한 바람직한 구현예에서, 2중 특이성 항체는 제1 암에 제1 결합 특이성을 제공하는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 제2 암에 (제2 결합 특이성을 제공하는) 하이브리드 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍이다. 이러한 비-대칭적인 구조는, 2중 특이성 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 분리하기 용이하게 하므로, 원치않은 면역글로불린 체인 조합들로부터 바람직한 2중 특이성 분자를 쉽게 분리시키는 것으로, 확인되었다. 이러한 방식은 WO 94/04690에 기술되어 있다. 2중 특이성 항체의 제조와 관련한 보다 상세한 내용은, 예를 들어, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)을 참조한다.
US 5731168에 기술된 다른 방식에 따르면, 재조합 세포 배양물로부터 수득되는 헤테로다이머의 %를 최대화하도록 항체 분자 쌍 사이의 계면 (interface)을 구축할 수 있다. 바람직한 계면은 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 측쇄를 가진 하나 이상의 소형 아미노산을 더 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)로 치환한다. 큰 측쇄를 가진 아미노산을 더 작은 측쇄를 가진 아미노산 (예, 알라닌 또는 트레오닌)으로 치환함으로써, 제2 항체 분자의 계면 상에 큰 측쇄(들)와 동일한 또는 비슷한 크기의 보상적인 "캐비티" (compensatory cavity)를 형성시킨다. 이는 원치않은 기타 최종 산물과 비교해 헤테로다이머의 수율을 높이는 기전을 제공한다.
2중 특이성 항체는 가교된 또는 "헤테로접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로접합체에서 항체 하나는 아비딘과 커플링되고, 다른 항체는 바이오틴과 커플링될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어, 면역 시스템 세포를 원치않은 세포로 타겟팅하기 위해 (US 4,676,980), 그리고 HIV 감염을 치료하기 위해 사용할 수 있다 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089). 헤테로접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용해 만들 수도 있다. 적절한 가교제들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 다수의 가교 기법들과 더불어 US 4,676,980에 기술되어 있다.
항체 단편들로부터 2중 특이성 항체를 제조하는 기법들 역시 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 2중 특이성 항체는 화학적 결합을 이용해 제조할 수 있다. Brennan et al., Science 229:81 (1985)에는 온전한 항체를 단백질 분해에 의해 절단하여 F(ab')2를 제조하는 공정이 기술되어 있다. 이들 단편은 다이티올 착화제 (dithiol complexing agent), 예를 들어, 아비산나트륨의 존재 하에 환원 처리하여, 인접한 다이티올을 안정화하고, 분자간 이황화 결합 형성을 방지한다. 그런 후, 제조된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 변환한다. 이후, Fab'-TNB 유도체들 중 하나를 머캅토에틸아민을 이용한 환원에 의해 Fab'-티올로 다시 변환하고, 이를 동일 몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 2중 특이성 항체를 제조한다. 제조된 2중 특이성 항체는 선택적인 효소 고정화 (selective immobilization)를 위한 물질로 사용할 수 있다.
최근 진전으로, 화학적으로 커플링하여 2중 특이성 항체를 제조할 수 있는, Fab'-SH 단편을 E. coli로부터 직접 회수하는 것이 용이해졌다. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)에는 완전히 인간화된 2중 특이성 항체 분자의 F(ab')2의 제조 방법이 기술되어 있다. 각각의 Fab'을 E. coli로부터 각각 분리하고, 시험관내 직접 화학적 커플링을 수행하여, 2중 특이성 항체를 제조한다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 2중 특이성 항체 단편들을 제조 및 단리하는 다양한 기법들 역시 개시되어 있다. 예를 들어, 2중 특이성 항체는 루신 지퍼를 이용해 제조된 바 있다 (Kostelny et al, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터 유래된 루신 지퍼 펩타이드는 2개의 서로 다른 항체의 Fab'에 유전자 융합에 의해 연결된다. 항체 호모다이머는 힌지부에서 환원시켜 모노머를 제조한 다음, 이를 재-산화시켜 항체 헤테로다이머를 제조한다. 또한, 이 방법은 호모다이머 항체를 제조하는데에도 활용할 수 있다. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)에 의해 기술된 "다이아바디" 기법은 2중 특이성 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 기전이다. 단편은, 매우 짧아 동일한 체인 상에서 2개의 도메인 간에 쌍을 형성시킬 수 없는 링커에 의해 연결된 VL 영역과 VH 영역을 포함한다. 즉, 하나의 단편의 VH 영역과 VL 영역은 다른 단편의 상보적인 VH 및 VL 영역과 쌍을 형성하도록 하여야 하며, 따라서 2개의 항원-결합부가 형성된다. 단쇄 Fv-(sFv) 다이머를 이용하여 2중 특이성 항체 단편을 제조하는 또 다른 전략도 또한 개시되어 있다 (Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 참조).
또한, 본 발명은 2가 보다 높은 다가 항체를 제공한다. 예를 들어, 3중 특이성 또는 4중 특이성 항체를 제조할 수 있다.
다가 항체 (polyvalent antibody)
다가 항체는 2가 항체 보다 더 빨리 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 내재화 (및/또는 이화 (catabolize))될 수 있다. 본원에 제시된 항체는 항체의 폴리펩타이드 체인을 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 제조할 수 있는 항원 결합부를 3개 이상 가진 (예, 4가 항체) 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 것)일 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 (dimerization domain)과 3개 이상의 항원 결합부를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 단편 또는 힌지부를 포함한다 (또는 이들로 구성된다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 단편과 Fc 단편에 대해 N-말단 위치에 3개 이상의 항원 결합부를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 항원 결합부를 3 내지 약 8개 포함하며 (또는 이로 구성되며), 바람직하게는 항원 결합부를 4개 포함한다 (또는 이로 구성된다). 다가 항체는, 2 이상의 가변부를 포함하는, 하나 이상의 폴리펩타이드 체인 (바람직하게는, 2개의 폴리펩타이드 체인)을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 체인(들)은, VD1이 제1 가변부이고; VD2가 제2 가변부이고; Fc가 Fc 단편의 하나의 폴리펩타이드 체인이고; X1 및 X2가 아미노산 또는 폴리펩타이드이고; 및 n이 0 또는 1인, VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 체인(들)은 다음과 같은 체인을 포함할 수 있다: VH-CH1-플렉시블 링커-VH-CH1-Fc 단편; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 단편. 본원에서 다가 항체는 바람직하게는 경쇄 가변부 폴리펩타이드를 2개 이상 (바람직하게는 4개) 더 포함한다. 본원에서 다가 항체는 예를 들어 경쇄 가변부 폴리펩타이드를 약 2 내지 약 8개 포함할 수 있다. 본원의 맥락에서, 경쇄 가변부 폴리펩타이드는 경쇄 가변부를 포함하며, 선택적으로 CL 영역을 더 포함한다.
약학적 조성물
다른 측면에서, 본 발명은 활성 성분으로서 (또는 유일한 활성 성분으로서) IL-5Rα-특이 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은, 본원에 기술된 바와 같이, IL-5Rα에 특이적인 하나 이상의 항체, 및/또는 대응되는 하나 이상의 표면 수용체를 타겟팅하는 하나 이상의 부가적인 결합 분자 (예, 항체)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 IL-5 및 이의 세포성 수용체 간의 상호작용으로 발생할 수 있는 장애를 개선, 예방 또는 치료하기 위한 것이다.
"약학적 조성물"은 본 발명의 항-IL-5Rα 항체, 및 충전제, 용매, 희석제, 담체, 보조제, 분배제, 전달제, 보존제, 안정화제, 유화제, 현탁화제, 증점제, 장기 전달 조절제와 같은, 약제학적으로 허용가능하며 약리학적으로 적절한 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 조성물을 의미하며, 이들 물질의 선정 및 비율은 투여 타입과 경로 및 투여량에 따라 결정된다. 본 발명의 약학적 조성물 및 이의 제조 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게 의심의 여지없이 자명할 것이다. 약학적 조성물은 바람직하게는 GMP (우수 의약품제조 관리 기준) 요건을 준수하여 제조되어야 한다. 조성물은 완충제 조성물, 긴장성 물질 (tonicity agent), 안정화제 및 용해제를 포함할 수 있다. 조성물의 장기 작용은 약학적 활성 성분의 흡수를 서행시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴에 의해 달성될 수 있다. 적합한 담체, 용매, 희석제 및 전달제의 예로는 물, 에탄올, 폴리알코올 및 이들의 혼합물, 오일, 및 주사용 유기 에스테르 등이 있다.
"약제 (약물)"는, 인간 및 동물에서 생리학적 기능을 복구, 개선 또는 수정하고 질환을 치료 및 예방하고, 진단, 마취, 피임, 미용 (cosmetology) 및 기타 용도로 의도된, 정제, 캡슐제, 산제, 동결건조제, 주사제, 주입제, 연고 및 기타 레디 형태 (ready form)의 물질 또는 약학적 조성물로서 물질들의 혼합물이다. 당해 기술 분야에서 허용되는 펩타이드, 단백질 또는 항체를 투여하는 임의 방법이 본 발명의 항-IL-5Rα 항체에 적절하게 채택될 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 포유류, 바람직하게는 인간에 투여하기 적합한 하나 이상의 혼용가능한 (compatible) 액체 또는 고체 성분을 지칭한다.
본원에서, 용어 "부형제"는 본 발명의 전술한 성분 이외의 임의 성분을 기술하기 위해 사용된다. 이러한 성분은 약물 제품에 필요한 물리화학적 특성을 부여하기 위해 약제 제조에 사용되는 무기 또는 유기 성질의 물질이다.
본원에서, "완충제", "완충제 조성물", "완충화제 (buffering agent)"는 산-염기 공액 구성성분들의 작용에 의해 pH 변화를 견딜 수 있으며, 항-IL-5Rα 항체 약물이 pH 변화를 견딜 수 있게 하는, 용액을 지칭한다. 일반적으로, 약학적 조성물은 바람직하게는 4.0 내지 8.0 범위의 pH를 가진다. 사용되는 완충제의 예로는, 비-제한적으로, 아세테이트, 포스페이트, 사이트레이트, 히스티딘, 숙시네이트 등이 있다. 완충제 용액.
본원에서, 용어 "긴장성 물질", "삼투용질 (osmolyte)" 또는 "삼투압제 (osmotic agent)"는 액체 항체 제형의 삼투압을 높일 수 있는 부형제를 지칭한다. "등장성" 약물은 인간 혈액과 동일한 삼투압을 가진 약물이다. 등장성 약물은 전형적으로 약 250 내지 350 mOsm/kg의 삼투압을 가진다. 사용되는 등장제 (isotonic agent)로는, 비-제한적으로, 폴리올, 사카라이드 및 슈크로스, 아미노산, 금속염, 예를 들어, 소듐 클로라이드 등이 있다.
"안정화제"는 활성 물질의 물리적 및/또는 화학적 안정성을 제공하는 부형제 또는 2 이상의 부형제의 혼합물을 의미한다. 안정화제로는, 아미노산, 비-제한적인 예로, 아르기닌, 히스티딘, 글리신, 라이신, 글루타민, 프롤린; 계면활성제, 비-제한적인 예로, 폴리소르베이트 20 (상품명 Tween 20), 폴리소르베이트 80 (상품명 Tween 80), 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 및 이의 코폴리머 (상품명 Poloxamer), Pluronic, 소듐 도데실 설페이트 (SDS); 항산화제, 비-제한적인 예로, 메티오닌, 아세틸시스테인, 아스코르브산, 모노티오글리세롤, 아황산 염 등; 킬레이트제, 비-제한적인 예로, 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA), 다이에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 소듐 사이트레이트 등이 있다.
약학적 조성물은, 활성 물질이 보관 온도, 예를 들어 2-8℃의 보관 온도에서 지정된 유통 기한 (shelf life) 동안 그 물리적인 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 유지한다면, "안정적"이다. 바람직하게는, 활성 물질은 물리적 및 화학적 안정성뿐 아니라 생물학적 활성을 유지한다. 보관 기간은 가속 또는 자연 노화 조건에서의 안정성 검사 결과를 토대로 조정된다.
본 발명의 약학적 조성물은 레디 제형 (ready formulation) 형태의 단일 단위 용량 (single unit dose) 또는 복수개의 단일 단위 용량들로 제조, 포장 또는 널리 판매될 수 있다. 본원에서, 용어 "단일 단위 용량"은 활성 물질을 미리 정해진 양으로 포함하는 개별 약학적 조성물의 양을 의미한다. 활성 물질의 양은 일반적으로 환자에게 투여할 활성 물질의 투여량 또는 투여량의 편리한 일부 (convenient part), 예를 들어 그 투여량의 절반 또는 1/3과 같다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 전형적으로, 주사, 주입 및 이식 (implantation)에 의해 위장관을 우회하여, 피부 또는 점막 장벽에서의 브리치 (breach)를 통해 인체에 투여하기 위한 것으로 의도된 무균성 (sterile) 제형으로서 비경구 투여에 적합하다. 예를 들어, 비경구 투여는, 특히 피하, 복막내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 척추강내, 뇌실내, 요도내, 두개강내, 활액내, 경피 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기법 등이 있다. 또한, 국소 관류 (regional perfusion)도 제공된다. 바람직한 구현예는 정맥내 경로 및 피하 경로를 포함한다. 당해 기술 분야에서 허용되는, 펩타이드 또는 단백질의 임의 투여 방법이 본 발명의 항-IL-5Rα 항체에 적절히 채택될 수 있다.
주사가능한 제형은, 비-제한적으로, 예를 들어, 앰플, 바이얼, 플라스틱 용기, 사전 충전된 주사기, 자동주사 기구내 단위 투약 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 특히 현탁제, 용액제, 오일성 또는 수성 베이스 중의 에멀젼, 파스타제 (pastes) 등을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 투여하기 전에 적절한 베이스 (예, 무균성 발열원 제거 수)를 사용해 재구성하기 위한 건조된 형태 (즉, 분말 또는 과립)로 제공되는 약학적 조성물을 포함하는 비경구 투여용 조성물을 제공한다. 이러한 제형은, 예를 들어, 냉동 건조로서 당해 기술 분야에 공지되어 있으며 산물을 냉동시킨 다음 냉동된 물질로부터 용매를 제거하는 것을 수반하는, 동결건조 공정에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 항-IL-5Rα 항체는 또한 적절한 추진제가 사용되거나 또는 사용되지 않는, 가압 에어로졸 용기 (aerosol pressurized container), 펌프, 스프레이, 분무기 (atomizer) 또는 네블라이저와 같은 흡입기로부터 단독으로 또는 적절한 약제학적으로 허용가능한 부형제와의 혼합물로서 흡입에 의해 또는 비강내로, 또는 점비제로서 또는 스프레이제로서 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위한 투여 형태는 즉시 방출형으로 및/또는 변형된 방출형으로 제형화될 수 있다. 변형된 방출형 제형은 지연성, 지속성, 펄스형, 조절된, 타겟화된 및 프로그래밍된 방출을 포함한다.
본 발명의 항-IL-5Rα 항체의 치료학적 용도
일 측면에서, 본 발명의 항-IL-5Rα 항체는 IL-5 활성과 연관된 장애를 치료하는데 유용하다.
일 측면에서, 본 발명의 항-IL-5Rα 항체는 천식, 예를 들어, 호산구성 천식 (아토피성 천식), 예를 들어, 중증 호산구성 천식 (아토피성 천식); COPD (만성 폐쇄성 폐 질환); 척-스트라우스 증후군; 호산구성 식도염; 호산구성 위장염 또는 호산구과다 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애를 치료하는데 사용가능하다.
일 측면에서, 치료 대상 또는 환자는 포유류, 바람직하게는 인간 개체이다. 한 개체는 임의 연령의 남성 또는 여성일 수 있다.
본원에서, 항-IL-5Rα 항체 및 하나 이상의 다른 치료학적 물질과 관련하여 용어 "공동-투여 (co-administration)", "공동-투여된다" 및 "와 조합하여 (in combination with)"는,
1) 환자에게 구성 성분들을 실질적으로 동시에 방출하는 단일한 투약 형태로 구성 성분들이 제형화되는, 본 발명의 항-IL-5Rα 항체와 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 동시 투여하는 방식,
2) 구성 성분들이 서로 다른 투약 형태로 분리하여 제형화되고, 환자에게 실질적으로 동시에 섭취되어 이들 구성 성분들이 환자에서 실질적으로 동시에 방출되는 경우에, 본 발명의 항-IL-5Rα 항체 및 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 실질적으로 동시에 투여하는 방식,
3) 구성 성분들이 별개의 투약 형태로 서로 분리되어 제형화되고, 투약 형태들이 충분한 투여 간격으로 환자에게 연속적인 횟수로 섭취되어, 구성 성분들이 환자에서 실질적으로 다른 시기에 방출되는, 본 발명의 항-IL-5Rα 항체 및 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 순차적으로 투여하는 방식; 및
4) 환자에게 동시에, 연속적으로 또는 동일 시점에 및/또는 서로 다른 시점에 합동적으로 (jointly) 방출되는 조절된 방식으로 구성 성분들을 방출하는 단일한 투약 형태로 구성 성분들이 함께 제형화되고, 각각의 부분이 동일 경로에 의해 또는 서로 다른 경로에 의해 투여될 수 있는, 본 발명의 항-IL-5Rα 항체 및 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 순차적으로 투여하는 방식을 의미, 언급 또는 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명의 항-IL-5Rα 항체는 추가적인 치료학적 치료없이, 즉 독립적인 테라피 (independent therapy)로서 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항-IL-5Rα 항체에 의한 치료는 하나 이상의 부가적인 치료학적 치료를 포함할 수 있다 (병용 요법). 일부 구현예에서, 항-IL-5Rα 항체는 여러가지 약물/자가면역 질환 약물과 함께 또는 이와 조합하여 투여할 수 있다.
이러한 자가면역 질환 또는 관련 자가면역 병태의 치료에서, 여러가지 치료학적 물질과 조합하여 본원에 제시되는 항-IL-5Rα 항체는 다약물 용법을 이용해 환자에 투여할 수 있다. 항-IL-5Rα 항체는 면역억제제와 동시에, 순차적으로, 연속적으로 또는 교대로 투여될 수 있거나, 또는 다른 테라피에 대한 내성 발현 후 투여될 수 있다. 당해 기술 분야에서 사용되는 용량과 비교해 더 적거나 또는 동일한 용량의 면역억제제가 사용될 수 있다. 바람직한 면역억제제를 선정할 때, 치료할 질환의 타입과 환자의 병력 등의 다수 인자들이 고려되어야 한다.
본원에서, 부가적인 테라피 (add-on therapy)에 사용되는 용어 "치료학적 물질"은 환자의 면역 시스템을 억제 또는 은폐하도록 지정된 물질, 예를 들어 소분자, 항체 또는 스테로이드 호르몬, 예를 들어, 코르티코스테로이드를 지칭한다. 이들 물질은, 사이토카인 생산을 저해하거나, 자기-항원 발현을 하향-조절 또는 억제하거나 또는 주 조직적합성 복합체 (MHC) 항원을 은폐하는 물질일 수 있다. 이러한 물질의 예로는 스테로이드, 예를 들어 글루코코르티코이드, 예를 들어 프레드니손 (prednisone), 메틸프레드니솔론 (prednisolone) 및 덱사메타손; 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 (US 4665077 참조), 아자티오프린 (azathioprine) (또는 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide), 아자티오프린에 대한 유해 반응시); 브로모크립틴 (bromocryptine); 글루타르알데하이드 (US 4120649에 기술된 바와 같이 MHC 항원 은폐); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 (anti-idiotypic) 항체; 사이클로스포린 (cyclosporine) A; 사이토카인 및 사이토카인 수용체 길항제, 예로 인터페론-gamma, -beta 또는 -alpha 항체; 항-종양 괴사 인자 항체; 항-인터루킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체; 항-L3T4 항체, 이종의 항-림프구 글로불린 (heterologous anti-lymphocyte globulin), pan-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 함유한 용해성 펩타이드 (WO 90/08187, 1990년 6월 26일 공개; TGF-p; 스트렙토도마제 (streptodomase); host DNA/RNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린 (deoxyspergualin); 라파마이신 (rapamycin); T 세포 수용체 (US 5114721); T 세포 수용체 단편 (Offner et al, Science 251:430-432 (1991); WO 90/11294; 및 WO 91/01133); 및 T 세포 수용체 항체 (EP 340109), 예 T10B9 등이 있다.
본 발명의 항-IL-5Rα 항체는 전술한 치료 방법에 사용될 수 있거나, 전술한 치료에 사용될 수 있거나, 및/또는 전술한 치료 약제의 제조에 사용될 수 있는 것을 의미한다.
투여 용량 및 경로
본 발명의 항-IL-5Rα 항체는 대상 병태를 치료하는데 효과적인 양으로, 즉 바람직한 결과를 달성하는데 필요한 용량 및 시간 동안 투여될 것이다. 치료학적 유효량은 치료할 구체적인 병태, 환자의 나이, 성별 및 체중뿐 아니라 항-IL-5Rα 항체가 단독으로 또는 하나 이상의 부가적인 항-자가면역 또는 항-염증 치료 기법과 조합하여 투여되는 지의 여부와 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다.
투약 용법은 최적의 바람직한 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여하거나, 분할된 수개의 용량을 일정 기간 동안 투여하거나, 또는 용량을 치료학적 상황의 긴급성에 의해 지정되는 바와 같이 비례적으로 줄이거나 높일 수 있다. 투여 용이성 및 용량 단일성을 위해 단위 투약 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유익하다. 본원에서 단위 투약 형태는 치료할 환자/개체에게 단일한 용량 (unitary dosages)으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하는 것으로 의도되며; 각 단위는 바람직한 약제학적 담체와 조합하여 바람직한 치료학적 효과를 발휘하도록 계산된 기-결정된 함량으로 활성 화합물을 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 단위 투약 형태에 대한 사양 (specification)은, (a) 화학요법제의 고유한 특징 및 달성할 구체적인 치료학적 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체에서 민감도 치료를 위한 활성 화합물의 컴파운딩 기술 분야에서 고유한 한계에 의해 기술되며, 이에 의해 직접 결정된다.
따라서, 당해 기술 분야의 당업자는, 본원에 제공된 내용을 기초로, 용량 및 투여 용법이 치료 분야에서 잘 공지된 방법에 따라 조정됨을 알 것이다. 즉, 최대 허용량은 쉽게 확립할 수 있으며, 환자에게 검출가능한 치료학적 이점을 제공하는 유효량 역시 환자에게 검출가능한 치료학적 효과를 제공하기 위해 각 물질을 투여하는 시간적 요건처럼 결정할 수 있다. 따라서, 일부 용량 및 투여 용법이 본원에 예시되지만, 이들 예는 본 발명의 구현예 수행시 환자에게 제공될 수 있는 용량 및 투여 용법을 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다.
용량 값은 완화할 병태의 유형과 중증도에 따라 달라질 수 있으며, 1회 투여 또는 다중 투여를 포함할 수 있음에 유념하여야 한다. 또한, 임의 특정 환자의 경우, 구체적인 투여 용법은 개체 필요성에 따라, 그리고 조성물의 투여를 수행 또는 감독하는 의료 전문가의 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하며, 본원에 기술된 용량 범위는 단순 예이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 조성물을 이용한 투여 용법은 질환의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별, 의학적인 상태, 병태의 중증도, 투여 경로 및 사용되는 구체적인 항-IL-5Rα 항체 등의, 여러가지 인자들에 기초할 수 있다. 즉, 투여 용법은 광범위하게 달라질 수 있지만, 표준 방법을 이용해 일상적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 용량은 독성 효과 또는 실험 값과 같은 임상적인 효과를 포함할 수 있는 약동학 및 약력학 파라미터를 기반으로 조정될 수 있다. 이에, 본 발명은 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정되는 환자별 용량-증가 (dose-escalation)를 포함한다. 적정 용량 및 용법을 결정하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 본원에 기술된 아이디어가 제공된다면 당해 기술 분야의 당업자라면 이해할 것이다.
적합한 투여 방법의 예는 상기에 제공된다.
본 발명에 따른 항-IL-5Rα 항체의 적정 용량은 0.1-200 mg/kg, 바람직하게는 0.1-100 mg/kg, 예로, 약 0.5-50 mg/kg, 예를 들어, 약 1-20 mg/kg의 범위일 것으로 간주된다. 항-IL-5Rα 항체는, 예를 들어, 적어도 0.25 mg/kg, 예를 들어, 적어도 0.5 mg/kg, 예로, 적어도 1 mg/kg, 예를 들어, 적어도 1.5 mg/kg, 예를 들어, 적어도 2 mg/kg, 예를 들어, 적어도 3 mg/kg, 예로, 적어도 4 mg/kg, 예를 들어 적어도 5 mg/kg; 예를 들어, 최대 50 mg/kg, 예로, 최대 30 mg/kg, 예를 들어, 20 mg/kg, 예로, 최대 15 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 투여는 전형적으로 적절한 시간 간격으로, 예를 들어 주당 1회, 2주당 1회, 3주당 1회 또는 4주당 1회로, 그리고 주치의가 적절하다고 생각하는 동안 반복될 것이며, 일부 경우에 필요에 따라 용량을 늘리거나 또는 줄일 수 있다.
제조 물품 (제품) 및 키트
다른 구현예에서, 본 발명은 자가면역 질환 및 관련 병태, 예를 들어, 천식, 예로, 호산구성 천식 (아토피성 천식), 예를 들어, 중증 호산구성 천식 (아토피성 천식); COPD (만성 폐쇄성 폐 질환); 척-스트라우스 증후군; 호산구성 식도염, 호산구성 위장염 또는 호산구과다 증후군을 치료하는데 사용하고자 의도된 제품을 포함하는 제조 물품을 제공한다. 이 제품은, 블리스터 (blister) 및/또는 패키지 내에 존재할 수 있는, 라벨 (label) 및 패키지 인서트 (package insert)가 동봉된 용기이다. 적합한 용기는, 예를 들어, 바이얼, 앰플, 시린지 등이다. 용기는 유리 또는 폴리머 재료와 같은 다양한 재료로 제조될 수 있다. 용기는 특정 병태를 치료하는데 효과적인 조성물을 수용하며, 무균성 유입 채널 (sterile inlet channel)을 구비할 수 있다. 조성물 내 한가지 이상의 활성 물질이 본 발명에 따른 항-IL-5Rα 항체이다. 라벨 및 패키지 인서트는, 약물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용되는 것으로 의도됨을 표시한다. 라벨 및/또는 패키지 인서트는, 적응증, 투여 빈도, 투여 용량, 투여 경로, 금기 및/또는 각 치료학적 산물에 대한 예방책을 포함하여, 항체 조성물을 환자에게 투여하기 위한 설명을 부가적으로 포함한다. 일 구현예에서, 패키지 인서트는, 조성물이 천식, 예를 들어, 호산구성 천식 (아토피성 천식), 예를 들어, 중증 호산구성 천식 (아토피성 천식); COPD (만성 폐쇄성 폐 질환); 척-스트라우스 증후군; 호산구성 식도염; 호산구성 위장염 또는 호산구과다 증후군을 치료하기 위해 사용됨을 표시한다.
또한, 제조 물품 (article)은 비-제한적으로 상업적인 목적에서 필요하거나 또는 소비자 관점에서 필요한 기타 제품, 예를 들어 용매, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 다양한 목적으로, 예를 들어 세포로부터 IL-5Rα를 정제 또는 면역침강시키거나, IL-5Rα-탑재 세포를 단리하기 위해 사용될 수 있는 키트에 관한 것이다. 항-IL-5Rα 항체 또는 IL-5Rα-탑재 세포를 단리 및 정제하기 위한 키트. 키트는 과립제 (예, 세파로스 과립제 또는 자기 입자)가 부속된 항-IL-5Rα (associated) 항체를 포함할 수 있다. 키트는 용기, 라벨 및 패키지 인서트를 포함한다.
진단학적 용도 및 조성물
본 발명의 항-IL-5Rα 항체는 또한 진단 프로세스 (예, 시험관내, 생체외)에 사용된다. 예를 들어, 항-IL-5Rα 항체는 환자로부터 수득한 샘플 (예, 염증성 삼출액, 혈액, 혈청, 장액, 타액 또는 뇨와 같은 조직 샘플 또는 체액 샘플)에서 IL-5Rα의 농도를 검출 또는 측정하기 위해 사용할 수 있다. 적합한 검출 및 측정 방법으로는 유세포 측정, 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 화학발광 분석, 방사성 면역분석 및 면역조직학과 같은 면역분석 등이 있다. 본 발명은 본원에 기술된 항-IL-5Rα 항체를 포함하는 키트, 예를 들어 진단 키트를 더 포함한다.
실시예
본 발명을 더 잘 이해하기 위해, 하기 실시예들이 제공된다. 실시예들은 단지 예시적인 목적일 뿐이며 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 전술한 발명이 예시에 의해 그리고 이해를 명확하기 위한 목적으로 일부 상세히 기술되었지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 본원의 교시 내용에 비추어 첨부된 구현예들의 사상 또는 범위로부터 이탈하지 않으면서 일부 변동 및 수정이 본 발명에 행해질 수 있음이 매우 자명할 것이다.
재료 및 일반적인 방법
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반전인 정보는 Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에 제공된다. 항체 쇄의 아미노산은 EU 넘버링에 따라 번호가 지정되며, 참조된다 (Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991).
재조합 DNA 기법
Sambrook, J. et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989에 기술된 바와 같이 표준 방법을 이용해 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약들은 제조사의 지침에 따라 사용하였다.
유전자 합성
원하는 유전자 세그먼트를 화학 합성에 의해 제조한 올리고뉴클레오티드로부터 제조하였다. 단일 제한효소 부위가 측면에 위치한 300-4000 kb 길이의 유전자 세그먼트를 PCR 증폭 등의 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션에 의해 조립한 다음 지정된 제한효소 부위를 통해 클로닝하였다. 서브클로닝한 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 검증하였다.
DNA 서열 결정
DNA 서열을 생거 서열분석에 의해 결정하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
Infomax's Vector NT1 Advance suite version 8.0을 서열 구축, 맵핑, 분석, 주석 (annotation) 및 예시에 사용하였다.
발현 벡터
언급된 항체 및 항원을 발현시키기 위해, 원핵생물 세포 (E. coli)에서의 발현, 진핵생물 세포 (예, CHO 세포)에서의 일시적인 발현을 위해 의도된 발현 플라스미드 변이체를 이용하였다. 벡터에는, 항체 발현 카세트 외에도, E. coli에서 플라스미드의 복제를 허용하는 복제 오리진, E. coli에 다양한 항생제 (예, 암피실린 및 카나마이신)에 대한 내성을 부여하는 유전자가 포함된다.
후술한 바와 같이 언급된 항체 쇄를 포함하는 융합 유전자를 PCR 및/또는 유전자 합성에 의해 제작하고, 핵산 세그먼트를 예를 들어 해당 벡터내 고유한 제한효소 부위를 이용해 연결함으로써 공지된 재조합 방법 및 기법으로 조립하였다. 서브클로닝한 핵산 서열을 DNA 서열분석에 의해 검증하였다. 일시적인 형질감염을 위해, 다량의 플라스미드를 E. coli 형질전환된 배양물로부터 플라스미드 준비에 의해 준비하였다.
실시예 1
포유류 세포 현탁 배양으로 재조합 항원 및 항체 생산
인간 및 동물 IL-5Rα의 세포외 도메인을 코딩하는 서열로부터 단백질을 생산하기 위해, EPEA, FC 및 H6F 태그를 사용해 SalI/NotI 제한효소 부위에 플라스미드 pEE에 클로닝하였다 (도 1, 2, 3). E. coli에서 플라스미드를 필요한 양으로 생산하고, Qiagen 키트를 사용해 정제하였다.
중국 햄스터 난소 세포 (CHO-T 세포주)에서 수득한 확립된 세포주에서 항원을 생산하였으며, 항체는 공개된 프로토콜 [Cytotechnology (2012) 64:613-622]에 따라 CHO에서 생산하였다. 8 mM L-글루타민 및 1 g/l pluronic 68이 첨가된 HyCell TransFx-C 사의 무혈청성 배지를 사용해, 오르비탈 셰이커 상의 플라스크에서 현탁 배양을 수행하였다. 일시적인 발현을 위해, 2-2,2*106 c/ml 농도의 세포를 선형 폴리에틸렌이민 (PEI MAX, Polysciences)을 사용해 형질감염시켰다. DNA/PEI 비율은 1:3/1:10이었다. 형질감염 후 5-7일에, 세포 배양물을 20분간 2000 g에서 원심분리하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 타겟 단백질을 배양액으로부터 아핀 (affine) HPLC에 의해 분리하였다.
단백질의 C-말단에 EPEA-태그 (글루탐산-프롤린-글루탐산-알라닌)를 포함하는 재조합 단백질을 흡착제 CaptureSelect C-태그 친화성 매트릭스를 사용해 분리하였다. 배양액을 C-태그 흡착제 5 ml이 미리-충전된 크로마토그래피 컬럼을 통과시킨 다음 컬럼을 PBS 25 ml로 세척하여 임의의 비-특이적으로 결합된 성분들을 제거하였다. 결합된 항원은 20 mM Tris, 2 M MgCl2 (pH 7.0-7.4)를 사용해 마일드 조건에서 용출시켰다. 그런 후, 단백질을 반-투과성 투석 멤브레인을 사용해 PBS (pH 7.4)로 투석한 다음 시험관으로 옮겨 -70℃에서 보관하였다.
재조합 Fc 단백질을 5 ml HiTrap rProtein A Sepharose FF (GE Healthcare)를 사용해 분리하였다. 컬럼을 평형화한 다음 5 부피의 PBS로 세척하여 비-특이적으로 결합된 성분을 제거하였다. 결합된 항원은 0.1 M 글리신 완충제 (pH 3)로 용출시켰다. 주 단백질 용출 피크를 수집하였으며, 1 M Tris 완충제 (pH 8)로 중성 pH로 적정하였다. 모든 단계는 유속 110 cm/h로 수행하였다. 이후, 단백질을 SnakeSkin Dialysis Tubing 기법을 이용해 PBS (pH 7.4)로 투석하고, 여과 (0.22 ㎛)한 다음 시험관으로 옮겨 -70℃에서 보관하였다.
His-태그가 달리 재조합 단백질을 Ni-NTA (QIAGEN) 컬럼을 사용해 분리하고, 흡착제를 평형 완충제 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸 (pH 8.0)로 3회 세척하였다. 배양액의 pH를 8.0으로 적정한 다음 NiCl2를 최종 농도 1 mM로 첨가하였다. 흡착제를 배양액에 넣어, 4℃에서 2시간 동안 교반하면서 인큐베이션한 다음 10 컬럼 부피의 완충제 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸), 20 컬럼 부피의 용액 (50 mM Na2HPO4, 1 M NaCl, 20 mM 이미다졸) 및 10 부피의 PBS (pH 7.4)로 헹군 다음, 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸 (pH 8.0)로 용출시켰다. 단백질 용액을 PBS (pH 7.4)로 전환하여, -70℃에서 냉동하였다.
수득한 단백질 용액의 순도를 환원 및 비-환원 SDS-PAGE에 의해 평가하였다 (도 4, 5, 6).
실시예 2
나이브 인간 Fab 파지 라이브러리 MeganLibTM 조작
인간 공여자 1000명 이상으로부터 채집한 혈액 샘플로부터 수득한 B-림프구의 총 RNA를 RNeasy Mini Kit (QIAGEN)를 사용해 제안된 프로토콜에 따라 단리하였다. RNA 농도 분석은 Nanovue 키트 (GE Healthcare)를 사용해 수행하였으며, 단리된 RNA의 품질은 1.5% 아가로스 겔 전기영동에 의해 검사하였다.
MMuLV 역전사효소와 프라이머로서 랜덤 헥사머 올리고뉴클레오티드를 사용해, MMLV RT 키트 (Evrogen)로, 권고된 프로토콜에 따라, 역 전사 반응을 수행하였다.
역 전사 산물을 2-단계 중합효소 연쇄 반응의 매트릭스로서 사용해 제한효소 부위들이 측면에 위치된 가변성 도메인 유전자를 수득하였으며, 반응은 문헌 [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274(26): 18218-30]의 프로토콜에 따라 올리고뉴클레오티드 키트를 사용해 수행하였다.
수득된 DNA 조제물 VL-CK-VH (도 3)에 엔도뉴클레아제 제한효소 NheI/Eco91I을 처리하고, 이를 오리지날 파지미드 pH5에 라이게이션하였다 (도 4). 프로토콜 [Methods Enzymol. 2000;328: 333-63]에 따라 준비한 일렉트로컴피턴트 (electrocompetent) SS320 E. coli 세포에 라이게이션 산물을 형질전환하였다. 조합 Fab 파지 디스플레이 라이브러리 MeganLibTM의 레퍼토리는 형질전환체 1011종이었다. Fab 파지 라이브러리 조제물은 기존 공정 [J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3): 581-97]에 따라 제조하였다.
실시예 3
파지 디스플레이에 의한 인간 항-IL-5Rα Fab 제조
특이적인 항-IL-5Rα 인간 파지 Fab를 조합 Fab 파지 디스플레이 라이브러리 MeganLibTM으로부터 수득하였다. 파지 디스플레이에 의해 인간 IL-5Rα에 대해 바이오패닝 (biopanning)을 수행하였으며 [Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):309-14; J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581-97], 단 최대 96가지의 스킴 (scheme) 및 변이체를 동시에 수행할 수 있어 자기 비드 및 KingFisher Flex 장치를 사용하였다.
인간 바이오틴화된 IL-5Rα 항원 (Fc, EPEA)을 1차 라운드에서 농도 10 ㎍/ml로, 2차 라운드에서 2 ㎍/ml, 3차 라운드 및 4차 라운드에서 각각 0.4 및 0.2 ㎍/ml으로 스트렙타비딘 자기 비드 (NEB)의 표면에 의도적으로 고정하였다. 항원을 비드와 함께 회전기 (rotator) 상에서 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 그런 후, 비드를 PBS (pH 7.4)로 헹구고, 비드 표면을 2% 탈지 밀크 또는 1% BSA/PBS (pH 7.4) 용액으로 1시간 블록킹하였다. 인간 파지 라이브러리 MeganLibTM을, 2% 탈지 밀크 및 타겟 항원 태그를 포함하는 비-타겟 항원이 첨가된 PBS (pH 7.4) 중의 파지 입자 2*1013개/ml의 농도로 희석한 다음 표면 상에 항원이 없는 자기 비드를 사용해 예비 선별하여 비-특이적인 결합 파지를 제거하였다. IL-5Rα-코팅된 자기 비드를 MeganLibTM과 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다.
결합되지 않은 파지는, 자기 비드를 0.1% Tween-20 함유 PBS (pH 7.4) 용액으로 세척하는 수회 세척 사이클을 수행하여, 제거하였다. 세척 사이클의 횟수는 라운드에 따라 증가시켰다 (1차 라운드에서는 세척 사이클 3회, 2차 라운드에서는 세척 사이클 9회 및 4차 라운드에서는 세척 사이클 15회). 자기 비드 표면 상의 항원에 결합된 파지를, 15분간 교반하면서, 100 mM Gly-HCl 용액 (pH 2.2)을 사용해 비드로부터 용출시킨 다음 1M Tris-HCl (pH 7.6)로 중화하였다. E. coli TG1 박테리아에 파지를 감염시키고, 배양 배지에서 배양 후 다음 선별 사이클에 사용하였다. 3회 또는 4회 라운드 후, E. coli TG1 배양물로부터 제조사 (Qiagen)의 프로토콜에 따라 파지미드 DNA를 단리하였다. 타겟 항원에 대한 라이브러리 농화 및 비-특이적으로 결합하는 파지 입자의 존재 분석을 위해 다클론 파지 효소 면역분석 (ELISA)을 이용하였다.
실시예 4
특이 및 비-특이 항원에 대한 다클론 파지의 ELISA
ELISA를 수행하기 위해 고 흡착 플레이트 (Greiner-Bio) 상에 타겟 항원 IL-5Rα-Fc 및 비-타겟 항원 Fc-융합 단백질을 고정하였다. 단백질을 0.1 M NaHCO3 (pH 9.0) 중의 각각 1 ㎍/ml 및 5 ㎍/ml 농도로 첨가하고 2에서 7회 희석으로 증가시켜 타이트레이션하였으며, 이후 밀봉된 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이후의 모든 단계들은 표준 ELISA 프로토콜에 따라 고-성능 자동 Tecan Freedom EVO 200-기반의 로보트 플랫폼 (Tecan)을 사용해 수행하였다. 비-특이적인 결합을 차단하기 위해, PBS (pH 7.4) 중에 2% 탈지 밀크 또는 1% BSA를 포함하는 차단 완충제를 플레이트 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. Tween 20 (PBST)이 첨가된 포스페이트-염수 완충제로 수회 세척 사이클을 수행한 후, 시험중인 다클론 파지를 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 세척 후, 각각의 웰을 PBST 중의 항-M13 HRP-접합된 2차 항체 (Pierce-ThermoScientific) (1:7500)로 (50 ㎕/웰) 코팅하였다. 실온에서 50분 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 10분간 기질 용액 (H2O2-0.02% 및 TMB / CH3COONa pH 5.5)을 첨가하여 비색 신호 (colorimetric signal)를 입수하였으며; 이후 1% 황산 (20 ㎕)을 첨가하여 발색을 차단하였다. 색 신호는 적절한 Tecan-Sunrise 플레이트 리더 (Tecan)를 사용해 450 nm에서 측정하였다.
다클론 파지 조제물에 대한 ELISA에서 타겟 항원의 3차 및 4차 선별 라운드 후 현저하게 농화된 것으로 확인되었다 (도 10). 신호가 파지 라이브러리의 최소 희석시 비-상동적인 대조군 항원에 비해 5배 초과하는 것으로 관찰된 라이브러리를 재 클로닝 및 추가적인 스크리닝을 위해 선택하였다.
실시예 5
발현 플라스미드에 항체 가변성 도메인 유전자의 클로닝
연속적인 선별 라운드 후, 제한효소 라이게이션 기법을 이용한 표준 프로토콜에 따라, 항체 가변성 도메인 유전자를 파지미드 벡터에서 발현 플라스미드 (도 9)로 다시 클로닝하였다.
그런 후, Mabnext 플로우 차트 플랫폼을 이용한 ELISA에 의한 디스플레이 라이브러리 유래 가변성 항체 단편의 항원에 대한 친화성 비교 분석을 수행하기 위해, 항체 단편을 포함하는 발현 벡터를 E. coli Bl21(DE3) Gold에 형질전환하였다.
실시예 6
선별-후 라이브러리 (post-selection library)로부터 인간 IL-5Rα에 특이적으로 결합하는 고-친화성 클론 선별
표준 기법에 따라 Fab를 생산하였다: E. coli BL21-Gold 박테리아 세포에 Fab 유전자를 포함하는 발현 벡터를 형질전환하고, lac 오페론의 전사를 촉발하는 유도제를 첨가하였으며, 이로써 수득된 형질전환체 배양시 Fab의 발현이 유도되어 페리플라즘 공간으로 유출되었다. 이후, ELISA를 수행하여, 플레이트 (Greiner bio one 사의 배지 결합)에서 0.1 M NaHCO3 (pH 9.0) 중의 0.2 ㎍/ml 농도로 존재하는 기질-고정된 IL-5Rα-EPEA 항원에 대한 Fab의 결합을 검증하였다 (항원을 밤새 4℃에서 고정시킴). 발현 플라스미드 pLL에 삽입된 Fab 벤랄리주맵 (Benralizumab) (Medimmune) 서열을 양성 대조군으로 사용하였다. 추가적인 단계들 모두 Genetix Qpix2xt (Molecular Devices) 및 Tecan Freedom EVO 200 (Tecan)과 같은 로보트 시스템에 기반한 고-성능 자동 플랫폼을 사용해 표준 ELISA 프로토콜에 따라 실온에서 수행하였다. 각 단계 후, 300 ㎕/웰 1x PBST를 사용해 3세트로 세척을 수행하였다. 플레이트에서 비-특이적인 결합 사이트를 1% 탈지 밀크/1x PBS로 차단하고, 세척 후 E. coli 상층액으로 표시되는 분석물 (E. coli 상층액 60 ㎕/웰)을 첨가하였다. 면역 복합체를 퍼옥시다제-접합된 염소 항-Fab 항체 (Pierce-ThermoScientific) (1:7500)를 사용해 검출하였다. 기질 용액 (H2O2-0.02% 및 TMB / CH3COONa (pH 5.5)) 50 ㎕를 첨가하여 15분간 기질-발색 혼합물을 염색하였다. 1% H2SO4 25 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 색 신호를 적절한 Tecan-Sunrise 플레이트 리더 (Tecan)를 사용해 450 nm에서 측정하였다. 항체 결합은 발생된 신호에 비례하였다. 색 신호가 대조군 항체의 신호보다 강한 클론을 비-특이적인 결합에 대한 ELISA에 의해 검사하였다.
실시예 7
여러가지 항원에 대한 선별 Fab의 비-특이적인 결합 분석
또한, ELISA를 사용해, 여러가지 항원에 대한 대상 Fab의 비-특이적인 결합을 분석하였다. 분석은 상기와 같이 수행하였으며, 단 IL6R-Fc, PCSK9-VG-FE / 0.1 M NaHCO3 (pH 9.0)를 고정 항원으로 사용하였다 (항원은 4℃에서 밤새 고정함). IL-5Rα-FE, IL-5Rα-Fc를 특이적인 결합의 대조군으로 사용하였다 (항원은 4℃에서 밤새 고정함). 추가적인 단계들은 모두 Genetix Qpix2xt (Molecular Devices) 및 Tecan Freedom EVO 200 (Tecan)과 같은 로보트 시스템에 기반한 고-성능 자동 플랫폼을 사용해 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행하였다. 색 신호가 대조군 신호보다 강하지 않은 클론들을 경쟁적인 ELISA에 의해 검사하여, 수용체-리간드 상호작용을 차단하는 Fab를 동정하였다.
실시예 8
IL-5Rα와 리간드 IL-5 간의 상호작용을 차단하는 고-친화성 Fab 선별
경쟁적인 ELISA를 이용해, IL-5Rα와 리간드 IL-5 간의 상호작용을 차단하는 능력에 대해 이미 선별된 항-인간 특이적인 Fab를 검사하였다 (Sino Biological). 공개된 서열을 가진 Fab, 벤랄리주맵 (Medimmune)을 양성 대조군으로 사용하였다.
IL-5 (NaHCO3 중의 1 ㎍/ml 용액, pH 9.0)를 ELISA 웰 플레이트 (배지 결합, Greiner bio one)에 50 ㎕/웰로 고정하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 추가적인 단계들 모두 Genetix Qpix2xt (Molecular Devices) 및 Tecan Freedom EVO 200 (Tecan)과 같은 로보트 시스템에 기반한 고-성능 자동 플랫폼을 사용해 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행하였다. 차단 완충제 (200 ㎕ 1% 탈지 밀크/PBS)를 첨가하여 비-특이 결합을 차단하였다.
이와 병행하여, 검사 Fab 및 IL-5Rα (PBST 중의 최종 농도 1 ㎍/ml)를 포함하는 세포 상층액을 비-흡착 플레이트에서 1:1 비율로 혼합하여, 실온에서 45분간 인큐베이션하였다.
차단 완충제를 세척한 후, 예비-인큐베이션한 혼합물을 플레이트로 옮겼다. 추가적인 단계들 모두 실시예 6에 기술된 단계와 비슷하였다. 대조군 Fab 벤랄리주맵 수준에서 차단성을 나타내는 클론을 양성으로 표시하였으며, 이후 분석에 사용하였다.
양성 클론의 가변성 도메인의 유전자들을 Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)에서 표준 프로토콜에 따라 서열분석하고, 분석하였다.
실시예 9
해리 속도에 의한 고-친화성 Fab 선별
Pall Forte Bio Octet Red 96을 사용해 Koff 스크리닝을 수행하였다. 항-FABCH1 바이오센서를 10 mM PBS (pH 7.2-7.4), 0.1% Tween 20 및 0.1% BSA가 함유된 워킹 완충제에서 30분간 재수화하였다. 워킹 완충제를 E. coli 상층액 검사 샘플에 최종 농도 최대 10%로 첨가한 다음, 항-FABCH1 바이오센서를 후보 항체의 Fab가 함유된 E. coli 상층액에 침지하여, 4℃에서 12시간 인큐베이션하였다. 표면에 Fab가 고정된 센서를 워킹 완충제와 함께 웰로 옮겼으며, 이때 베이스라인을 기록하였다 (60초). 그런 후, 항원-항체 결합을 달성하기 위해 (300초), 센서를 분석물 용액 (IL-5Rα-Fc, 30 ㎍/ml)과 함께 웰로 이동시켰다. 그런 후, 추가적인 해리 (600초)를 위해, 센서를 다시 워킹 완충제가 든 웰로 다시 옮겼다. 사용 센서는 각 검사 후 재생하였으며, 이를 3번 재생 완충제 (10 mM Gly-HCl, pH 1.7)에 넣었으며, 이후 실험에 사용하였다. 수득된 곡선은, 1:1 로칼 상호작용 모델 (Local interaction model)을 사용해, Octet Data Analysis (Version 9.0)으로 분석하였다.
실시예 10
전장 항체 제조
표준 기법으로 클로닝을 수행하였다. 중쇄 가변성 도메인 서열을 벡터 pEE-Hc IgG1의 Sal1/Nhe1 제한효소 부위에 클로닝하였다. 경쇄 가변성 도메인은 벡터 pEE-CK의 Sal1/BsiW1 제한효소 부위에 클로닝하였다. 수득된 유전자 구조체는 CHO 세포주에서의 일시적인 단백질 생산을 위해 형질전환하였다. 단백질을 실시예 1에 기술된 바와 같이 박테리아 단백질 A에서의 친화성 크로마토그래피에 의한 표준 방법에 따라 분리 및 정제하였다. 머캅토에탄올이 첨가된 변성 12% PAGE 및 네이티브 8% PAGE에서 전기영동을 수행하였다 (도 6).
실시예 11
Forte Bio Octert RED 384에서 전장 항체에 대한 친화성 결정
인간 IL-5Rα 항원에 대한 항체의 결합 친화성 실험 연구를 Forte Bio Octert RED 384에서 수행하였다. AR2G 센서 (Forte Bio)의 표면에 표준 프로토콜 및 제조사의 지침에 따라 인간 IL-5Rα를 20 ㎍/ml 농도로 고정하였다. 분석은 워킹 완충제로서 0.1% Tween 20 및 0.1% BSA를 포함하는 PBS를 사용해 30℃에서 수행하였다. 베이스라인을 기록한 후, 센서를 항원 용액이 든 웰에 300초간 침지하였으며, 이때 복합체가 형성되었다. 그런 후, 완충액에서의 복합체의 해리를 600초간 검출하였다.
결합 그래프 (binding curves)를, 기준 신호 (reference signal)를 제한 후, Octet Data Analysis (Version 9.0) 소프트웨어를 표준 공정에 따라 1:1 글로벌 상호작용 모델을 사용해 분석하였다. 항-IL-5Rα 항체는 인간 항원에 고 친화성으로 특이적으로 결합하였다. 표 A (도 11, 12, 13)
명칭 KD (M) KD 오차
BCD133-03-002 5,27E-10 3,94E-12
BCD133-03-020 6,67E-10 6,03E-12
BCD133-03-021 2,24E-11 1,29E-12
표 A. BCD-133(03-002, 03-020, 03-021) 해리 상수.
실시예 12
IL-5Rα를 발현하는 안정적인 세포주 구축
CHO-K1 세포주를 5% FBS가 첨가된 DMEM/F12 배지에서 배양하였다. IL-5Rα 코딩 DNA를 포함하는 유전자 구조체를 제조사의 프로토콜에 따라 TurboFect를 사용해 형질전환하였다.
형질전환 후 3일째, 형질전환된 배양물을 히그로마이신 B를 배지에 최종 농도 250 ㎍/ml로 첨가하여 14일간 선별하였다. 선별 후 수득되는 세포 집단을 클로닝하였다. IL-5Rα를 발현하는 세포 클론을, 증식 속도, 집단 동질성 및 형태적 변화 부재를 고려한 IL-5R 발현 수준/동질성 분석의 결과를 기반으로 선별하였다.
실시예 13
CHO-IL-5R 세포에서의 ADCC 분석에 의한 대조군 재현가능한 비-푸코실화 항체 (reproducible afucosylated antibody)와 후보 항-IL-5Rα 항체의 비교.
IL-5Rα를 안정적으로 발현하는 CHO-IL-5R 세포주와 건강한 공여자의 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 ADCC 분석에 이용하였다. CHO-IL-5R 세포를 2 mM 글루타민, 5% FBS (소 태아 혈청), 0.05 mg/ml 겐타마이신 및 0.4 mg/ml 히그로마이신 B가 첨가된 DMEM/F12 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건하에 배양하였다. 트립신 처리에 의해 표면으로부터 세포를 회수하여, 2 mM 글루타민, 10% FBS이 첨가된 RPMI-1640로 2회 헹구었다. 세포를 트리판 블루로 염색한 후 혈구계를 사용해 세포수 및 생존성을 평가하였다. 4*105/ml 농도의 세포 현탁물을 10% FBS 첨가된 RPMI-1640 배지에서 준비하였다.
말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 건강한 공여자의 정맥혈로부터 밀도 구배 분리에 의해 Ficoll을 이용해 분리하였다. 그런 후, 세포를 DPBS로 2회 헹구고, 2 mM 글루타민, 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지에 2*106/ml 밀도로 재현탁하였다.
ADCC 분석을 수행하기 위해 0.005 ng/ml - 300 ng/ml 농도의 항체 연속 희석액 50 ㎕를 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 그런 후, 타겟 세포 현탁액을 50 ㎕/웰로 첨가하여, 플레이트를 30분간 37℃ 및 5% CO2 조건에서 인큐베이션하였다. 여기에 작동자 세포 현탁액을 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2 조건에서 16시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, CytoTox96®Non-Radio 세포독성 분석 키트를 사용해 세포독성 분석을 수행하였다.
ADCC 효율을 하기 식으로 계산하였다.
ADCC = (실험 데이터 - 백그라운드)/(완전 세포용해 - 백그라운드) x 100%
1/2 최대 유효 농도 (EC50)를 GraphPad Prism 6.0으로 계산하였다. 실험에 따르면, 항-IL-5Rα 후보 항체 BCD-133-03-002, BCD-133-03-020, BCD-133-03-021의 효율은 항체 벤랄리주맵 (BCD-133-018-200617)보다 1.6배 높다. 후보 항체들은 벤랄리주맵과 관련하여 서로 간에 유의한 효능 차이를 나타내지 않았다.
결과들을 도 14, 15에 나타낸다.
실시예 14
Forte Bio Octet RED 384에서의 시노몰구스 원숭이/토끼/마우스 IL-5Rα 수용체와의 상호작용 분석
동물 IL-5Rα 항원에 대한 항체의 결합 친화성 실험을 Forte Bio Octert RED 384에서 수행하였다. 항체를 20 ㎍/ml 농도로 AR2G 센서 (Forte Bio) 표면에 표준 프로토콜 및 제조사의 지침에 따라 고정하였다. 분석은 0.1% Tween 20 및 0.1% BSA를 포함하는 PBS를 워킹 완충제로 사용해 30℃에서 수행하였다. 베이스라인을 기록한 후, 센서를 항원 용액 (동물 IL-5Rα) 함유 웰에 300초간 침지하였으며, 여기서 복합체가 형성되었다. 이후, 완충액에서의 복합체 해리를 600초간 검출하였다.
결합 그래프를, 기준 신호를 제한 후, Octet Data Analysis (Version 9.0) 소프트웨어를 표준 공정에 따라 1:1 글로벌 상호작용 모델을 사용해 분석하였다. 항-IL-5Rα 항체는 시노몰구스 원숭이 항원에 특이적으로 결합하였다. 표 B. 도 16, 17,1 8.
명칭 KD (M) KD 오차
BCD133-03-002 5,53E-09 1,21E-10
BCD133-03-020 1,22E-08 2,30E-10
BCD133-03-021 1,68E-08 4,55E-10
표 B. 표는 시노몰구스 원숭이 항원 (IL-5Rα)에 대한 항체의 해리 상수를 나타낸다. 항체들은 마우스 및 토끼 IL-5Rα와 상호작용하지 않는다.
실시예 15
안정적인 세포주 구축, 항-IL-5R 항체 생산 및 정제
항체 경쇄 및 중쇄를 최적 비율로 포함하는 벡터 구조체로 현탁 CHO-K1-S 모 세포주를 4D Nucleofector (Lonza)를 사용한 전기천공에 의해 형질전환하여, 단일클론 항체 BCD-133을 생산하는 안정적인 세포주를 수득하였다. ClonePix 로보트 플랫폼 (Molecular Devices) 및 여러가지 배양 포맷으로 항생제를 이용한 예비 미니풀 선별 단계를 이용해, 다량의 클론 계열 (>1000 mg/l)을 입수하였다. 정량 분석을 Octet QK System (Pall Life Sciences) 분석 시스템을 사용해 수행하였다. 자동 시스템 Tecan Genesis Workstation RSP 200/8 Automatic Liquid Handling System (Tecan) 수행 및 이후 MODDE 소프트웨어에서 수학적 프로세싱에 의해, 기본 배지 및 배양 계획을 정하였다. 무혈청성 배지 및 동물-유래 단백질 비 함유 공급원 (feeding)을 이용해 생산주를 배양하였다. 전임상 실험을 위한 BCD-133을 HyClone 1회용 생물반응조 (Thermo Fisher Scientific) 50 L 발효기에서 준비하였다.
배양액을 Millistak C0HC (Merck-Millipore) 딥 필터를 사용해 청징 처리하였다. 단백질 A 친화성 흡착제에서 청징 처리된 배양 배지로부터 항체를 1차 정제하였다. 글리신 완충제 pH 3.3-3.8을 산성 조건에서 사용해 타겟 단백질을 특이적으로 용출시켰다. 용출물을 수집하여 바이러스 불활화를 위해 30-60분간 산성 pH에 노출시킨 다음, 1M Tris-OH 용액으로 pH 6.5-7.0으로 중화하였다. 잔류 DNA, 생산주 세포 단백질, 방출된 아핀 흡착제 리간드, 응집물 및 항체 단편을 제거하기 위한 최종 크로마토그래피 정제를 CaptoAdhere 흡착제 (GE HealthCare LifeSciences) 를 사용해 플로우-스루 (flow-through) 방식으로 수행하였다. 이를 위해, 단백질 용액을 저 전도성 (<3msec/cm2) 하 pH 6.5-7.0에서 준비한 흡착제를 통해 흘려주었다. 그런 후, 정제된 단백질에 대해 Viresolve PRO 필터 키트 (Millipore)를 이용한 바이러스-제거 여과를 수행하였으며, 농축한 다음 아세테이트 완충제 (pH 5.0-5.5) 및 트레할로스가 함유된 최종 완충제에 대해 정용여과하였다. 단백질 농도는 50 mg/ml 이상이었다.
실시예 16
항체 BCD-133/인간 IL-5Rα 복합체의 인 실리코 모델링 (in silico modeling)
IL-5Rα에 특이적인 돌연변이 항체 BCD-133을 구축하기 위해, Schrodinger Suite version 2017-1 (Schrodinger) 소프트웨어를 사용해 3D 구조 분석을 수행하였다. 단백질 데이터은행에 등재된 ID 코드: 3VA2의 구조를 타겟 결정 구조로 선택하였다. Schrodinger Suite 소프트웨어의 PIPER 툴을 사용해 도킹을 수행하였다. 최적의 위치 선택은 25나노초 분자 다이나믹스 인터벌 (Desmond instrument by D.E. Shaw Research)에서 자유 에너지 추정 (free energy estimate)(MM-GBSA 방법)으로 수행하였다. 수득된 구조는 Maestro (Schrodinger) 툴을 사용해 가시화하였다. 도 19, 20은 BCD-133의 가변성 도메인을 포함하는 모델을 보여준다.
Figure pct00001
표 C. 중앙 열은 인간 IL-5Rα와 상호작용을 형성하는 항체 BCD-133의 아미노산 잔기를 나타낸다. 우측 열은 항체 BCD-133과 상호작용하는 IL-5Rα 항원의 대응되는 아미노산 잔기를 나타낸다.
실시예 17
인간 IL-5Rα에 특이적인 돌연변이 항체 BCD-133 라이브러리 구축
IL-5Rα에 특이적인 돌연변이 항체 BCD-133을 구축하기 위해, 3D 구조 분석을 Schrodinger Suite version 2017-1 (Schrodinger) 소프트웨어 및 IL-5Rα 모델 (PDB 3VA2)을 사용해 수행하였다 (실시예 16 참조). 컴퓨터 계산 모델 (computational model)을 토대로, 항체/IL-5Rα 복합체의 3D 구조 세트를 구축하였으며, 각 3D 구조는 항체 친화성과 복합체 안정성을 변형시키기 위한 아미노산 치환을 7개 이상 포함하지 않는다. 다음 단계로, 구축된 구조 세트로부터 치환으로 복합체 안정성 증가 및 항체 친화성 증가가 달성되는 변이체를 포함하는 라이브러리를 생성하였다.
아래 표에서, 서열번호 1-3, 6-8의 서열들을 포함하는 CDR에 의해 표시되는 바와 같이, 보다 일반적인 카바트 분류 (Kabat classification)가 아닌 코티아 표준 지정 (Chothia Canonical Assignment)을 사용해 CDR을 결정하였으며, 이 클러스터링 알고리즘은 다른 변이체와 비교해 더 나은 항체 구조에서 루프를 정의한다 (Chothia et al. (1997) http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283697913541?via%3Dihub). 따라서, 이러한 클러스터링 방법을 항체 친화성 변형에 사용하였다.
상기한 프로토콜에 따라 수득한 항체 라이브러리는 71개의 항체 서열을 포함한다. 16개의 위치에서 치환되었다. 16개 중 9개는 경쇄 CDR 영역이고, 나머지 7개 위치는 중쇄 CDR 영역이다. 고유 치환 개수는 60이다. 표 D는 오리지날 후보 루프의 CDR 서열뿐 아니라 71개의 돌연변이 서열 각각으로 표시되는 아미노산 치환 세트를 나타낸다. 라이브러리로부터 돌연변이 CDR 루프의 서열을 아래 요약 개시할 수 있다:
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
표 D. 오리지날 후보/치환 CDR 루프의 서열
실시예 18
동적 광 산란을 이용한 단백질 응집점 (aggregation point)에 의한 콜로이드 안정성 결정
동적 광 산란 실험으로 샘플의 응집 온도를 확인하기 위해, 매질내 입자 크기의 온도 의존성을 DynaPro® Plate Reader II (Wyatt Technology Corp.)를 사용해 40에서 85℃로 점진적으로 승온하면서 확인하였다. 결과는 표 E에 나타낸다. 도 21 및 도 22는 20mM 아세테이트 pH=5.0 및 20mM 사이트레이트 pH=5.0 완충액에서의 시험 항체에 대한 응집 그래프 프로파일을 도시한다.
시험 시료 응집 포인트
BCD-133 20mM 아세테이트, pH=5,0 66,4℃ ±0,5℃
20mM 사이트레이트, pH=5,0 65,1℃ ±0,5℃
표 E. BCD-133 응집점
분자 BCD-133은 열-콜로이드 안정성 (thermo-colloid stability)이 높은 것으로 결론내릴 수 있다 (20mM 아세테이트 pH = 5.0 및 20mM 사이트레이트 pH = 5.0 완충액에서의 응집 포인트는 > 65℃임).
실시예 19
50℃ 열 스트레스 조건에서의 열 안정성 확인
시험 샘플을 온도조절되는 에어 조 (thermostated air bath) 안에 넣고, 72시간 동안 온도 50℃로 설정하였다. 가열 후, 비처리 (intact) 및 스트레스 처리된 샘플을 크기-배제 HPLC (SEC HPLC) 및 UV 검출기에 의해, 그리고 비-환원 조건에서의 전기영동에 의해 분석하였다. 크로마토그래피를 Agilent 1100 HPLC 시스템에서 Tosoh TSK-Gel G3000SWXL 컬럼을 사용해 수행하였으며, 파장 220 nm에서 검출하였다. 전기영동은 Caliper Labchip GX II에서 수행하였다. 워킹 용액 준비 및 칩 준비는 HT 단백질 익스프레스 시약 키트를 사용해 표준 공정에 따라 수행하였다.
50℃에서 인큐베이션하였을 때 BCD-133 안정성 수득 결과를 표 F에 나타내며, 도 23, 24에 크로마토그램을 조합하여 도시한다: 청색 - 비처리 (intact); 적색 - 50℃에서 72시간 인큐베이션.
완충액 시험 시료 온도 GF HPLC EP
응집물 함량, % 단량체 함량, % 단편 함량, % 주 분획, %
20mM 아세테이트, pH=5,0 인풋 대조군 1,09 97,37 1,54 88,4
72 h, 50℃ 1,54 96,59 1,87 87,6
Δ* 0,45 -0,78 0,33 -0,8
20mM 사이트레이트, pH=5,0 인풋 대조군 1,429 97,281 1,289 91,3
72 h, 50℃ 1,79 96,03 2,179 89,7
Δ* 0,361 -1,251 0,89 -1,6
* Δ은 스트레스 처리 샘플과 비처리 샘플 (인풋 대조군)의 순도 차이, %임.
표 F. BCD-133의 크기-배제 HPLC 및 전기영동에 의한 단량체 함량 의존성.
<110> JOINT STOCK COMPANY "BIOCAD" <120> MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST IL-5Ra <140> RU2017134413 <141> 2017-10-03 <160> 18 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 1 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 2 Ala Ile Asn Ser Gly Gly Lys Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 3 Asp Tyr Ala Thr Asn Tyr Gly Val Pro Tyr Phe Gly Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 4 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Lys Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asp Tyr Ala Thr Asn Tyr Gly Val Pro Tyr Phe Gly Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Lys Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asp Tyr Ala Thr Asn Tyr Gly Val Pro Tyr Phe Gly Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 6 Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Gly Tyr Asp Val His 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 7 Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 8 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly His Val Val 1 5 10 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 9 Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Phe Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 10 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 11 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 11 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Lys Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asp Tyr Ala Thr Asn Tyr Gly Val Pro Tyr Phe Gly Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 12 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 12 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Lys Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asp Tyr Ala Thr Asn Tyr Gly Val Pro Tyr Phe Gly Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 13 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 13 Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Phe Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 14 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 14 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 15 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 15 caagtaaccc taaaggaaag tggaggagga cttgtccaac ccggcggcag tttaagactt 60 agctgtgctg cttctggctt tacttttagc aactatgcta tgtcgtgggt gcgtcaagcg 120 ccaggaaagg gcctagaatg ggtgagcgct atcaatagcg gcggaaaaag cactaactac 180 gcggacagcg tgaaaggccg cttcactata agtcgggaca atgctaaaaa cacactgtac 240 ctccagatga actccctaag agctgaggac acggctgtgt actactgcgc tgattatgcg 300 actaactatg gagtgccata cttcggaagc tggggccagg gaacgaccgt aactgtgagt 360 agtgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaaa gcctctccct gtccccgggt aaa 1353 <210> 16 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 16 caagtacaac tacaggaaag tggaggagga cttgtccaac ccggcggcag tttaagactt 60 agctgtgctg cttctggctt tacttttagc aactatgcta tgtcgtgggt gcgtcaagcg 120 ccaggaaagg gcctagaatg ggtgagcgct atcaatagcg gcggaaaaag cactaactac 180 gcggacagcg tgaaaggccg cttcactata agtcgggaca atgctaaaaa cacactgtac 240 ctccagatga actccctaag agctgaggac acggctgtgt actactgcgc tgattatgcg 300 actaactatg gagtgccata cttcggaagc tggggccagg gaacgatggt aactgtgagt 360 agtgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1080 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaaa gcctctccct gtccccgggt aaa 1353 <210> 17 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 17 caggctggac tgacgcaacc gccatctgtg agtgcggctc caggacaacg ggtgactata 60 agctgcagcg gaagcagaag caacataggc agtggatacg acgtacattg gtaccaacaa 120 gtaccgggga cggctccgaa actactgata tttgacgata ataatagacc gagcggcgta 180 ccagaccgtt ttagcggaag caaaagtgga acgagtgcct ctttagccat aactggcctg 240 caagctgaag atgaagctga ttattactgt cagagctacg acagcagtct gagtggacac 300 gtagtgtttg gaggaggaac gaagctgacg gtattacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657 <210> 18 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 18 cagagtgtgc tgacgcaacc gccatctgtg agtgcggctc caggacaacg ggtgactata 60 agctgcagcg gaagcagaag caacataggc agtggatacg acgtacattg gtaccaacaa 120 ctaccgggga cggctccgaa actactgata tacgacgata ataatagacc gagcggcgta 180 ccagaccgtt ttagcggaag caaaagtgga acgagtgcct ctttagccat aactggcctg 240 caagctgaag atgaagctga ttattactgt cagagctacg acagcagtct gagtggacac 300 gtagtgtttg gaggaggaac gaagctgacg gtattacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657

Claims (37)

  1. IL-5Rα에 특이적으로 결합하며, 하기 중쇄 가변성 도메인과 경쇄 가변성 도메인을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    1) 서열번호 3의 서열과 80% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 가변성 도메인;
    2) 서열번호 8의 서열과 80% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 가변성 도메인.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 1-3의 서열과 80% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 1-3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 6-8의 서열과 80% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 6-8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서,
    1) 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 1-3의 서열과 80% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하고;
    2) 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 6-8의 서열과 80% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서,
    1) 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 1-3의 아미노산 서열을 포함하고;
    2) 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 6-8의 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 4-5를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 4-5를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 9-10을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 9-10을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제1항에 있어서,
    1) 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 4-5를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하고;
    2) 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 9-10을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제14항에 있어서,
    1) 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 4-5를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
    2) 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 9-10을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제1항에 있어서,
    1) 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 11-12를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하고;
    2) 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 13-14를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상 상동적인 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제16항에 있어서,
    1) 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 11-12를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
    2) 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 13-14를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제1항에 있어서,
    IL-5Rα-특이적인 항체가 전장 (full) IgG 항체인, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 전장 IgG 항체가 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 항체인, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 전장 IgG 항체가 인간 IgG1 이소형 항체인, 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 핵산이 DNA인, 핵산.
  23. 제21항에 있어서,
    a) 제1항에 따른 항체의 중쇄를 코딩하며 서열번호 15-16을 포함하는 군으로부터 선택되는 서열과 90% 이상 상동적인 뉴클레오티드 서열, 및/또는 제1항에 따른 항체의 경쇄를 코딩하며 서열번호 17-18을 포함하는 군으로부터 선택되는 서열과 90% 이상 상동적인 뉴클레오티드 서열; 또는
    b) 서열번호 15-16을 포함하는 군으로부터 선택되고 제1항에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 서열번호 17-18을 포함하는 군으로부터 선택되고 제1항에 따른 항체의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는, 발현 벡터.
  25. 세포를 제24항에 따른 벡터로 형질전환하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하기 위한 숙주 세포의 제조 방법.
  26. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하기 위한 숙주 세포.
  27. 제20항에 따른 숙주 세포를 항체를 생산하기에 충분한 조건에서 배양 배지에서 배양한 다음 필요에 따라 수득되는 항체를 분리 및 정제하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법.
  28. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함하는, IL-5Rα에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는데 사용되는 약학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애가 천식, 예를 들어, 호산구성 천식 (아토피성 천식), 예를 들어, 중증 호산구성 천식 (아토피성 천식); COPD (만성 폐쇄성 폐 질환); 척-스트라우스 증후군; 호산구성 식도염; 호산구성 위장염을 포함하는 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  30. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 하나 이상의 다른 치료학적 활성 화합물을 포함하는, IL-5Rα에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는데 사용되는 약학적 조합물 (pharmaceutical combination).
  31. 제30항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애가 천식, 예를 들어, 호산구성 천식 (아토피성 천식), 예를 들어, 중증 호산구성 천식 (아토피성 천식); COPD (만성 폐쇄성 폐 질환); 척-스트라우스 증후군; 호산구성 식도염; 호산구성 위장염을 포함하는 군으로부터 선택되는, 약학적 조합물.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서,
    상기 다른 치료학적 활성 화합물이 소분자, 항체 또는 코르티코스테로이드와 같은 스테로이드 호르몬으로부터 선택되는, 약학적 조합물.
  33. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, IL-5Rα의 생물학적 활성의 저해가 필요한 개체에서 IL-5Rα의 생물학적 활성을 저해하는 방법.
  34. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제28항에 따른 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, IL-5Rα에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애가 천식, 예를 들어, 호산구성 천식 (아토피성 천식), 예를 들어, 중증 호산구성 천식 (아토피성 천식); COPD (만성 폐쇄성 폐 질환); 척-스트라우스 증후군; 호산구성 식도염; 호산구성 위장염 또는 호산구과다 증후군을 포함하는 군으로부터 선택되는, 치료 방법.
  36. IL-5Rα에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료가 필요한 개체를 치료하기 위한, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제28항에 따른 약학적 조성물의, 용도.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애가 천식, 예를 들어, 호산구성 천식 (아토피성 천식), 예를 들어, 중증 호산구성 천식 (아토피성 천식); COPD (만성 폐쇄성 폐 질환); 척-스트라우스 증후군; 호산구성 식도염; 호산구성 위장염을 포함하는 군으로부터 선택되는 용도.
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