KR20220035656A - 인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220035656A
KR20220035656A KR1020200117668A KR20200117668A KR20220035656A KR 20220035656 A KR20220035656 A KR 20220035656A KR 1020200117668 A KR1020200117668 A KR 1020200117668A KR 20200117668 A KR20200117668 A KR 20200117668A KR 20220035656 A KR20220035656 A KR 20220035656A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
antibody
heavy chain
light chain
antigen
Prior art date
Application number
KR1020200117668A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102697770B1 (ko
Inventor
김용성
박해심
김정은
정근옥
이동현
Original Assignee
아주대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아주대학교산학협력단 filed Critical 아주대학교산학협력단
Priority to KR1020200117668A priority Critical patent/KR102697770B1/ko
Priority to PCT/KR2021/012345 priority patent/WO2022055300A1/ko
Priority to US18/025,833 priority patent/US20230416380A1/en
Priority to EP21867165.9A priority patent/EP4212551A4/en
Publication of KR20220035656A publication Critical patent/KR20220035656A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102697770B1 publication Critical patent/KR102697770B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/5409—IL-5
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G01N2333/7155—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7095—Inflammation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 인간 인터루킨-5 (interleukin-5, IL-5)의 수용체인 인간 IL-5 수용체 알파 서브유닛(IL-5Rα)에 결합하는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법, 이를 포함하는 접합체, 이를 포함하는 이중특이 또는 다중특이항체, 이를 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.

Description

인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 및 이의 용도 {Antibody Binding to human IL-5Rα and Uses Thereof}
본 발명은 인간 인터루킨-5 (interleukin-5, IL-5)의 수용체인 인간 IL-5 수용체 알파 서브유닛(IL-5Rα)에 결합하는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법, 이를 포함하는 접합체, 이를 포함하는 이중특이 또는 다중특이항체, 이를 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구 (eosinophil)의 증가로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
인간의 인터루킨 5 (이하, IL-5라 칭함)는, T-세포 (T-cell)나 비만세포 (mast cell) 등에 의해 분비되는 사이토카인 (cytokine)의 일종이다. 쥐 (mouse)에서의 IL-5는, B-세포 (B-cell) 및 호산구(eosinophil)의 분화 (differentiation) 및 증식 (proliferation) 인자로서 작용하는 것이 알려져 있다. 인체에 있어서는 주로 호산구의 분화 및 증식인자로서 작용하는 것이 알려져 있다. IL-5 수용체는 α 사슬 (이하, IL-5Rα 라 함)과 β 사슬 (이하, IL-5Rβ 또는 βc 수용체라 함)]에 의해 구성되는 것이 명확해지고 있다. 또한, IL-5Rα는 직접적인 IL-5의 결합에 관여하고 βc 수용체는 그 자체로는 IL-5에 대한 결합능을 나타내지 않지만, 세포내 신호전달을 담당한다. 또, βc 수용체는 인터루킨-3 (이하, IL-3 이라 칭함) 및 과립구 퍼지 콜로니 자극인자 (이하, GM-CSF라 칭함) 등의 수용체와 공통 수용체로 작용한다고 알려져 있다.
인간에서 IL-5 수용체는 체내의 호산구 (eosinophil), 호염기구 (basophil)의 체내에서 및 비만세포 (mast cell) 일부만이 발현한다고 있다. IL-5는 호산구 성숙, 증식 및 활성화에 중요하며 호염기구 분화를 향상시킬 수 있다. IL-5는 호산구가 다른 조직으로의 이동시 현관 부착 분자의 발현을 상향 조절하는 능력을 통해 호산구의 조직 축적을 촉진시킨다. 또한, IL-5는 호산구의 세포자멸사(apoptosis)를 차단함으로써 호산구 생존을 연장시킨다. IL-5의 주요 세포 공급원은 Th2 세포 (Type 2 helper T cells), ILC2 (type 2 innate lymphoid cells), 및 비만세포 (mast cells) 및 자연 살상 T 세포 (natural killer T cell)이다.
호산구(eosinophil)는 골수에서 생성되는 순환 과립구(granulocytes)이며 염증성 반응 부위로 모집되는 주요 세포 유형 중 하나이다. 만성기관지천식 등의 알레르기성 질환에서 환자들의 혈액 내에는 호산구의 수가 증가되어 있다고 알려져 있다. 호산구는 독성 과립 단백질(toxic granule proteins), 반응성 산소 종 (reactive oxygen species, ROS) 사이토카인 및 지질 매개체들을 방출하는 등의 기능을 한다. 따라서 호산구의 증가는 폐 조직에서 과민감성 반응과 관련된 알레르기 질병을 포함하는 다양한 염증성 질병의 발병에 관여한다고 알려져 있다 (Possa et al., 2013). 호산구와 IL-5 사이의 밀접한 연관성 때문에 IL-5 및 IL-5Rα에 직접 작용하여 호산구의 활성을 억제하고, 만성기관지천식 등의 알레르기성 질환의 치료를 위한 새로운 약물의 개발로 이어졌다.
메폴리주맙(mepolizumab)은 IL-5에 결합하여 IL-5Rα 와의 결합을 저해하는 N-글리코실화된 인간화 IgG1 항체이다. 메폴리주맙은 중증 천식, 아토피성 피부염 및 코 용종증을 포함한 여러 질병에서 테스트되었다. 천식 환자에서 메폴리주맙은 좋은 결과를 얻었기 때문에 2015년에 FDA의 승인을 받았다. 호산구 수는 메폴리주맙으로 처리된 대상에서 감소하지만, 혈청 IL-5 수준은 시간이 지남에 따라 증가하는 것으로 나타났다 (Pouliquen et al., 2015; Tsukamoto et al., 2016). 한 그룹은 치료 중 검출된 대부분의 IL-5가 면역 글로불린 (대부분 메폴리주맙)에 결합된 복합체의 일부이며, 복합체화 된 IL-5의 반감기가 연장된다는 가설을 세웠다. 이 복합체의 생물학적 중요성과 운명은 알려져 있지 않다.
레슬리주맙(reslizumab)은 높은 친화도로 IL-5에 결합하여 생물학적 기능을 차단하는 인간화 IgG4 항체이다. 미국과 유럽에서 심한 호산구 천식 환자에서 추가 유지 요법으로 사용하도록 승인되었다. 메폴리주맙과 마찬가지로, 레실리주맙은 호산구 과다증후군(hypereosinophilic syndrome, HES) 환자에서 치료 1개월 후 혈청 IL-5 수준을 증가시켰다. 하지만 이것이 자유 또는 복합 IL-5를 나타내는 지 여부는 여전히 알려져 있지 않다. 레실리주맙-치료 된 환자로부터의 배양 배지-함유 혈청은 시험관 내에서 호산구 생존을 연장시키는 것으로 나타났으며, 연구자들은 항-IL-5가 반감기를 연장시킬 뿐만 아니라 실제로 특정 조건에서 IL-5 활성을 강화시킬 수 있다는 가설을 세웠다 (Roufosse, 2018).
벤랄리주맙(benralizumab)은 탈푸코실화된(afucosylated) 인간화 IgG1 항체이며 IL-5Rα를 표적하기 때문에 항-IL-5 항체들과 다르게 2가지 메커니즘을 가지고 있다. 벤랄리주맙은 1) IL-5의 작용을 막아서 세포성장 저해할 뿐만 아니라 2) 자연살해세포 (natural killer cells) 및 대식세포 (macrophage)에 의한 항체 의존적 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 유도할 수 있다. 또한 탈푸코실화된 Fc로 인해 자연살해세포 (natural killer (NK) cells) 및 대식세포 (macrophage) 표면에 발현되는 FcγRIIIa에 대한 친화력이 높아져 더 강한 ADCC 효과를 나타낸다. 벤랄리주맙의 이러한 이중 작용기작은 메폴리주맙 및 레실리주맙과 같은 IL-5 경로를 표적으로 하는 다른 단일 클론 항체에 의해 유도된 것보다 훨씬 더 빠르고 높은 수준의 호산구의 고갈을 유도한다 (Davila Gonzalez et al., 2019). 따라서 호산구성 천식뿐만 아니라 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 호산구 증후군 및 만성 비염에서도 치료제로 제안되고 있다.
현재까지 보고된 연구에 따르면 IL-5 보다는 IL-5Rα를 표적하는 것이 IL-5의 반감기를 증가시키지 않으면서 호산구 수를 직접적으로 낮출 수 있다는 장점이 있다. 하지만 벤랄리주맙 외의 치료용 항-IL-5Rα 항체는 아직 승인된 바 없으며, 일부 환자에게서는 벤랄리주맙의 효과가 크게 나타나지 않았다. 또한 같은 치료제를 지속적이고 반복적으로 투여함에 따라 항-drug 항체(anti-drug antibody, ADA)가 생성되는 등 그 치료제에 대한 내성이 생길 수도 있다. 이에 따라 강력한 치료효과를 가지는 항-IL-5Rα 항체에 대한 기술 수요는 여전히 높은 상황이다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 같은 항원에 대한 항체라도 에피토프 (epitope)가 다르고 친화도 (affinity)가 더 높아, 우수한 효능을 보이는 IL-5Rα에 특이적인 인간화 항체를 개발하고자 하였다. 본 발명에서는 1) 기존 벤랄리주맙 항체보다 높은 친화도를 가지고 IL-5의 활성을 저해하는 항체를 개발하였다. 또한 세포막과 먼 도메인 (membrane-distal domain)에 에피토프를 가지는 벤랄리주맙과 다르게 세포막과 근접한 도메인 (membrane-proximal domain)에 에피토프를 타겟함으로써 더 높은 항체 의존적 세포 독성 (Antibody-dependent cell cytotoxicity, ADCC)을 가지는 항-IL-5Rα 인간화 항체를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 IL-5Rα에 대해 높은 친화도(affinity)와 특이성 (specificity)을 가지는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 IL-5Rα에 대해 항원 해리속도 (dissociation rate constant)가 느려져 길항 활성을 증가시킨 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 IL-5Rα의 항원에 대해 세포막(cell plasma membrane)에 근접한 도메인 (membrane-proximal domain)을 에피토프로 가지는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 IL-5Rα를 표적하여 IL-5Rα을 발현하는 호산구(eosinophil), 호염기구(basophil)의 IL-5에 의존적인 세포 증식을 억제하는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 IL-5Rα를 표적하여 IL-5Rα을 발현하는 호산구(eosinophil), 호염기구(basophil)에 결합하여 자연살해세포 (natural killer (NK) cells) 및 대식세포 (macrophage)에 의한 항체 의존적 세포독성 (ADCC)을 유도하는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 IL-5Rα에 대해 높은 친화도로 결합하고, 세포막(cell plasma membrane)에 근접한 도메인 (membrane-proximal domain)을 에피토프로 가져, IL-5Rα을 발현하는 호산구(eosinophil), 호염기구(basophil)에 대해 자연살해세포/대식세포에 의한 항체의존적 세포독성 (ADCC)을 강하게 유도하는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 접합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 19로 표시되는 인간 IL-5 수용체 알파 서브유닛(IL-5Rα)의 서열 중 도메인 3(domain 3, D3)에 해당하는 아미노산 잔기 221번 내지 322 위치로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 에피토프로 인식하는, 인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 4, 15 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR2, 서열번호 5, 27 내지 32 로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3를 포함하는, 인간 IL-5 수용체 알파 서브유닛(IL-5Rα)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산 및 이러한 핵산을 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 키메릭 항원 수용체 (Chimeric Antigen Receptor)로 발현하는 T 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편 및 약물을 포함하는 접합체에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항-IL-5Rα 인간화 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공하며 항체는 IL-5의 생물 활성을 저해하여 환자 유래 호산구의 증식을 억제하고 항체 의존적 세포 독성 (ADCC)을 통해 호산구를 제거할 수 있다.
이에 따라 본 발명에 따른 항-IL-5Rα 인간화 항체 또는 이의 항원 결합단편은 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있으며,
이러한 질환으로는 과호산구증후군(Hypereosinophilic syndrome, HES); 과호산구증가증(hypereosinophilia); 호산구성 천식 (eosinophilic asthma), 호산구성 기관지 천식 (eosinophilic bronchial asthma, ABA) 및 중증 호산 구성 기관지 천식 (severe eosinophilic bronchial asthma, ABA) 등의 천식; 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) ; Cherge-Strauss 증후군; 호산구성 식도염 (eosinophilic esophagitis); 호산구성 위장염 (eosinophilic gastroenteritis); 호산구성 위장관병(EGID); 아토피 피부염(Atopic Dermatitis) 등의 아토피 질환(atopic disease); 알레르기성 비염(allergic rhinitis) 등의 알레르기 질환(allergic disease); 면역글로불린(IgE)-매개 식품 알레르기; 염증성 장 질환, 알레르기성 대장염; 위식도 역류; 심내막심근 섬유증; 뢰플러 심장내막염; 데이비스병; 호산구증가증과 관련된 간헐 맥관부종; 호산구증 가증-근육통 증후군/스페인 독성 오일 증후군(Spanish Toxic Oil Syndrome); 간경변증; 피부염 농가진; 수포성 유천포창; 척-스트라우스 증후군; 급성 골수성 호산구성 백혈병; 급성 림프구성 호산구성 백혈병; 호산구증가증 동반의 전신성 비만세포병; 습진; 베그너 육이종증; 결절다발 동맥염; 호산구성 혈관염; 및 류마티스성 관절염 등이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1A는 IL-5Rα의 세포외 도메인(extracellular domain)인 서열번호 19로 표시되는 인간 IL-5 수용체 알파 서브유닛(IL-5Rα)의 서열 중 (sIL-5Rα라 칭함)을 항원 단백질을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. Pcmv는 프로모터, A는 아비 표지(Avi Tag), H는 Poly 6X Histidine (6XHis) Tag 이다.
도 1B는 HEK293F 세포에서 발현시킨 sIL-5Rα 항원 단백질을 확인하는 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. NR (non-reducing)은 비환원성 조건, R (reducing)은 환원성 조건, M은 단백질 마커 (marker)이다.
도 2A는 마우스 면역 (mouse immunization)을 통해 얻은 sIL-5Rα에 대한 마우스 항체들의 sIL-5Rα 항원 단백질에 대한 결합 친화력을 확인하기 위한 indirect ELISA 결과를 나타낸다.
도 2B는 TF-1 세포에 IL-5Rα를 과발현 시킨 세포주인 TF-1/IL-5Rα 세포를 이용하여 IL-5Rα에 대한 마우스 항체와 벤랄리주맙 유사체의 IL-5 의존적 세포 성장 (IL-5 dependent cell proliferation) 억제능을 평가한 결과를 나타낸다.
도 3A는 마우스 항체인 m2B7과 m2B7를 인간화하여 구축한 hu2B7 항체의 친화도를 분석한 binding isotherms를 나타낸 것이다.
도 3B는 인간화 항체인 hu2B7의 TF-1/IL-5Rα 세포에서의 IL-5 의존적 세포 성장 억제능을 마우스 (mouse) 항체인 mB7와 벤랄리주맙 유사체와 비교하여 평가한 결과를 나타낸다.
도 4는 sIL-5Rα에 대한 항체의 친화도 향상을 위해 hu2B7 기반으로 구축된 라이브러리의 구축 전략을 나타낸 모식도이다. 중쇄가변영역의 CDR 2부분에 NHB degenerate codon으로 라이브러리를 주었다.
도 5A는 선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체의 친화도를 분석한 binding isotherms를 나타낸 것이다.
도 5B는 선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 sIL-5Rα 항원 단백질에 대한 특이적 결합을 확인하기 위한 indirect ELISA 결과를 나타낸다.
도 5C는 IL-5-mFc 리간드 (ligand)를 정제한 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 5D는 선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체들과 IL-5-mFc 리간드가 sIL-5Rα에 대하여 결합 경쟁 ELISA를 수행한 결과이다. 항체들의 농도에 따라 IL-5-mFc와의 결합 경쟁을 확인하였고, 이는 항-IL-5Rα 항체들이 IL-5 결합부위와 중첩되는 부위에 결합함을 증명한다.
도 6A는 선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 TF-1/IL-5Rα 세포에서의 IL-5 의존적 세포 성장 억제능을 벤랄리주맙 유사체와 비교하여 평가한 결과를 나타낸다.
도 6B는 항-IL-5Rα 인간화 항체들 (5R65 와 5R86)의 중증 천식 환자 (Patients with severe eosinophilic asthma, SEA) 유래 호산구 (eosinophil)에서의 IL-5 의존적 세포 성장 억제능을 벤랄리주맙 유사체와 비교하여 평가한 결과를 나타낸다.
도 7A는 IL-5Rα의 세포외 도메인(extracellular domain)과 IL-5와의 구조 복합체를 나타낸다. (PDB ID : 3QT2)
도 7B는 효모 표면에 인간 IL-5 수용체 (IL-5Rα)와 마우스 IL-5 수용체 (mIL-5Rα), 인간/마우스 IL-5 수용체의 세포외 도메인을 혼합한 변형 수용체 (IL-5Rα variants) 3종을 발현시킨 모식도를 나타낸다.
도 7C는 벤랄리주맙 유사체와 5R65 항체가 인간 IL-5Rα의 어떤 도메인 (domain)에 결합하는지를 유세포 분석기 (flow cytometry)를 이용하여 확인하였다. 두 항체는 인간 IL-5Rα에는 결합하고 마우스 IL-5Rα에는 결합하지 않음을 확인하였다. 인간-마우스 변형 수용체들에 대한 결합력을 확인하였을 때 벤랄리주맙 유사체는 서열번호 19로 표시되는 인간 IL-5Rα의 서열 중 도메인 1 (domain 1, D1)에 해당하는 아미노산 잔기 Asp1 내지 Gly103번이 포함된 hIL-5Rα 또는 hD1-mD2-mD3 IL-5Rα에서 결합능을 보인다. 5R65는 서열번호 19로 표시되는 인간 IL-5Rα의 서열 중 도메인 3 (domain 3, D3)에 해당하는 아미노산 잔기 Pro221 내지 Trp322 번이 포함된 hIL-5Rα 또는 mD1-mD2-hD3 IL-5Rα에서 결합능을 보인다.
도 8A는 sIL-5Rα에 대한 항체의 친화도 향상을 위해 5R65 기반으로 구축된 라이브러리의 구축 전략을 나타낸 모식도이다. 중쇄가변영역의 CDR 3와 경쇄가변영역의 CDR 3부분에 5R65의 원래 아미노산을 각 잔기에서 50% 확률로 유지할 수 있는 스파이크드 올리고뉴클레오타이드 (spiked oligonucleotide)로 라이브러리를 주었다.
도 8B는 선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체의 친화도를 분석한 binding isotherms를 나타낸 것이다.
도 8C는 항- IL-5Rα 인간화 항체의 도메인 맵핑 (domain mapping)을 통해 벤랄리주맙 유사체와 다른 에피토프를 가진다는 것을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8D는 선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 TF-1/IL-5Rα 세포에서의 IL-5 의존적 세포 성장 억제능을 여러 항체 농도에서 벤랄리주맙 유사체와 비교하여 평가한 결과를 나타낸다.
도 9A는 건강한 기증자 (Healthy controls)의 말초혈액 (peripheral blood)에서 분리한 과립구 (granulocytes) 층 (호산구, 호중구가 포함됨)에서 호산구 (Siglec-8 발현 세포)의 IL-5Rα의 발현을 유세포 분석기를 통해 분석한 결과이다.
도 9B는 건강한 기증자의 말초혈액에서 분리한 과립구 (granulocytes) 층 (호산구, 호중구가 포함됨)에서 호중구 (Siglec-8 비발현 세포)의 IL-5Rα의 발현을 유세포 분석기를 통해 분석한 결과이다.
도 10A는 중증 천식 환자 (Patients with severe eosinophilic asthma, SEA)의 말초혈액에서 분리한 과립구 층 (호산구, 호중구가 포함됨)에서 호산구 (Siglec-8 발현 세포)의 IL-5Rα의 발현을 유세포 분석기를 통해 분석한 결과이다.
도 10B는 중증 천식 환자의 말초혈액에서 분리한 과립구 층 (호산구, 호중구가 포함됨)에서 호중구 (Siglec-8 비발현 세포)의 IL-5Rα의 발현을 유세포 분석기를 통해 분석한 결과이다.
도 11A는 건강한 기증자와 중증 천식 환자의 말초혈액에서 분리한 과립구 층 (호산구, 호중구가 포함됨)에서 호중구와 호산구의 비율을 나타낸 결과이다.
도 11B는 건강한 기증자와 중증 천식 환자의 말초혈액에서 분리한 과립구 층 (호산구, 호중구가 포함됨)에서 호중구와 호산구의 IL-5Rα의 발현 비율을 나타낸 결과이다.
도 11C는 건강한 기증자와 중증 천식 환자의 말초혈액에서 분리한 과립구 층 (호산구, 호중구가 포함됨)에서 호산구의 IL-5Rα의 발현 정도를 나타낸 결과이다.
도 12A는 건강한 기증자의 말초혈액에서 정제한 호산구를 이용하여 항-IL-5Rα 항체의 호산구 증식 억제능을 평가한 결과이다.
도 12B는 중증 천식 환자의 말초혈액에서 정제한 호산구를 이용하여 항-IL-5Rα 항체의 호산구 증식 억제능을 평가한 결과이다.
도 13A는 벤랄리주맙 유사체와 5R65.7의 에피토프에 따라 예상되는 항체 의존적세포 독성 (ADCC) 작용에 대한 모식도이다.
도 13B는 건강한 기증자의 말초혈액에서 정제한 호산구와 자연살해세포 (NK cell)를 이용하여 항-IL-5Rα 인간화 항체의 항체 의존적 세포 독성 (ADCC) 유도능을 평가한 결과이다.
도 13C는 중증 천식 환자의 말초혈액에서 정제한 호산구와 NK cell를 이용하여 항-IL-5Rα 인간화 항체의 항체 의존적 세포 독성 (ADCC) 유도능을 평가한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따르면 본 발명에서는 마우스 면역 (mouse immunization) 및 인간화를 수행하여 새로운 항-IL-5Rα 인간화 항체를 개발하였다.
또한, 본 발명의 실시예에서 βc 수용체를 발현하는 렌티 바이러스 시스템을 이용하여 안정적으로 IL-5Rα를 발현하는 TF-1/IL-5Rα 세포주를 구축하여 항-IL-5Rα 인간화 항체의 생물 활성을 평가하였다.
효모 발현 시스템을 이용한 항체의 친화도 성숙을 통하여 IL-5의 생물 활성 저해능을 향상시키는 방법을 제공하고 이에 4종의 항-IL-5Rα 인간화 항체를 제공하였다.
본 발명의 다른 실시예에서 항체의 결합 부위를 확인하기 위하여 효모 표면 발현 시스템 (yeast cell surface display system)을 이용하여 인간 IL-5Rα, 마우스 IL-5Rα, 인간-마우스 IL-5Rα 변형 수용체를 발현하는 효모를 구축하는 방법을 제공하고 이에 본 발명에서 제공하는 항- IL-5Rα 인간화 항체가 기 개발된 항체와 다른 에피토프 (epitope)를 가지는 것을 확인하였다.
항-IL-5Rα 인간화 항체의 길항 활성 (antagonistic activity)을 더 높은 수준으로 만들기 위하여 상기 기술한 효모 발현 시스템을 이용해 다시 친화도 성숙을 진행하였으며, 해리속도 (dissociation rate)가 느린 항체를 선별하고자 카이네틱 스크리닝 (kinetic screening)을 수행하였고, 이에 6종의 항-IL-5Rα 인간화 항체를 제공하였다.
친화도가 높아진 항체의 IL-5의 생물 활성 저해능 및 항체 의존적 세포 독성을 상기 기술한 TF-1/IL-5Rα 세포주 및 건강한 기증자와 천식 환자 유래 호산구를 이용하여 평가하였다.
이를 바탕으로, 본 발명자들은 친화도가 높고, IL-5의 생물 활성 저해능 및 항체 의존적 세포 독성 활성이 높아진 신규 항- IL-5Rα 인간화 항체를 제공한다.
이에 따라 본 발명은 서열번호 19로 표시되는 인간 IL-5 수용체 알파 서브유닛(IL-5Rα)의 서열 중 도메인 3(domain 3, D3)에 해당하는 아미노산 잔기 221번 내지 322 위치로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 에피토프로 인식하는, 인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 인간 인터루킨-5 (IL-5)와 IL-5Rα에 경쟁적으로 결합하며, 서열번호 19로 표시되는 인간 IL-5 수용체 알파 서브유닛(IL-5Rα)의 서열 중 도메인 3(domain 3, D3)에 해당하는 아미노산 잔기 221번 내지 322 위치로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
"에피토프(epitope)"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위(determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는 점에서 구별된다.
본 발명에 기술된 항체는 벤랄리주맙 유사체와 비교하여 IL-5Rα에 대해 높은 친화도를 가지며, 향상된 항체 의존적 세포 독성 (ADCC) 기능을 가지어 IL-5Rα를 발현하는 세포의 사멸을 매개하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 항체는 알레르기성 질환 등과 같은 IL-5 활성과 관련 있는 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 조성물은 인간 IL-5 수용체 (IL-5Rα)의 세포외 도메인에 에피토프를 인식하는 항체로, 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 상기 항체는 IL-5의 생물 활성을 저해하는 능력을 가지며 IL-5Rα를 발현하는 세포 (호산구 등)의 사멸을 유도한다. 따라서, 본 발명은 만성기관지천식, 아토피성피부염 등의 알레르기성 질환의 진단 및 치료에 이용할 수 있다.
본 발명은 서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 4, 15 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR2, 서열번호 5, 27 내지 32 로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3를 포함하는, 인간 IL-5 수용체 알파 서브유닛(IL-5Rα)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 IL-5Rα에 특이적으로 결합하는 항-IL-5Rα 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG의 아형(subtype)을 포함하며, 특히 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge-region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다.
Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각에 해당한다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용하거나 (예를 들어, 완전한 형태의 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2를 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 결합된 이량체이다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 Fab'단편 C-말단에 존재하는 힌지 영역의 시스테인에 의해 공유적으로 연결된 한 쌍의 Fab' 단편을 포함한다.
"단일쇄 Fv (scFv)" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 구조체이다. scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 변형 항체, scFv, Fab 단편, F(ab')2 단편, 다이설파이드-결합 Fvs (sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1 (IgG1), 감마 2 (IgG2), 감마 3 (IgG3) 또는 감마 4 (IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
예를 들어, 본 발명에서 유용한 단일클론항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 또한, 단일클론항체는 파지항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
용어 "친화도"는 항원의 특정부위를 특이적으로 인식하고 결합하는 능력으로, 항체의 항원에 대한 특이성과 함께 고도의 친화도는 면역 반응에서 중요한 요소이다. 상기 친화도 상수(KD)는 표면 플라스몬 공명(SPR), 예를 들어 BIAcore, bio-layer interferometry를 사용하여 결정될 수 있다. 표면 플라스몬 공명 데이터를 통해 1:1 랑뮈어 결합 모델 (동시에 kon, koff) 및 속도 상수 koff/kon의 비율에서 산출된 친화도 상수(KD)를 얻는다.
항-IL-5Rα 항체의 IL-5Rα에 대한 결합 친화성은 10-5M 내지 10-12 M 범위 내에 있다. 예를 들어, 결합 친화성은 10-6 M 내지 10-12 M, 10-7 M 내지 10-12 M, 10-8 M 내지 10-12 M, 10-9 M 내지 10-12 M, 10-5 M 내지 10-11 M, 10-6 M 내지 10-11 M, 10-7 M 내지 10-11 M, 10-8 M 내지 10-11 M, 10-9 M 내지 10-11 M, 10-10 M 내지 10-11 M, 10-5 M 내지 10-10 M, 10-6 M 내지 10-10 M, 10-7 M 내지 10-10 M, 10-8 M 내지 10-10 M, 10-9 M 내지 10-10 M, 10-5 M 내지 10-9 M, 10-6 M 내지 10-9 M, 10-7 M 내지 10-9 M, 10-8 M 내지 10-9 M, 10-5 M 내지 10-8 M, 10-6 M 내지 10-8 M, 10-7 M 내지 10-8 M, 10-5 M 내지 10-7 M, 10-6 M 내지 10-7 M 또는 10-5 M 내지 10-6 M이다.
본 발명의 실시예에서, IL-5Rα에 특이적으로 결합하는 항체 CDR 영역의 친화도 개량을 위해 라이브러리를 구축할 수 있으며, (1) 라이브러리 주형인 hu2B7 및 5R65 항체의 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)의 항원 결합에 관여하는 6 개의 상보성 결합 부위 (CDR) 중 IL-5Rα에 결합할 가능성이 높은 아미노산 자리를 선정하는 단계; (2) 상기 선정한 아미노산 자리에, 라이브러리에 포함되길 원하는 아미노산을 코딩할 수 있는 스파이크 올리고머 (spiked oligonucleotide) 및 디제너레이트 코돈(degenerated codon primer)를 디자인하는 단계; 및 (3) 상기 디자인한 중쇄가변영역과 경쇄가변영역 라이브러리를 효모표면발현 시스템을 이용하여 scFab 또는 Fab 형태로 발현하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 sIL-5Rα에 특이적으로 결합하는 항체 scFab의 분리 및/또는 친화도 개량을 위해 라이브러리를 이용하여 스크리닝할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 sIL-5Rα에 특이적으로 결합하는 항체 스크리닝 방법은 구체적으로,
(1) sIL-5Rα에 결합할 수 있는 항체 scFab 라이브러리를 효모표면발현 시스템을 이용하여 발현하는 단계;
(2) Hit Tag이 융합된 형태의 sIL-5Rα 벡터 구축 및 발현 단계;
(3) sIL-5Rα와 상기 라이브러리를 결합시키는 단계; 결합된 sIL-5Rα를 해리 시킬 수 있는 조건을 조성 후에도 sIL-5Rα와 결합하고 있는 효모를 선별하는 단계 (키네틱 스크리닝 (Kinetic screening)) 및
(4) 상기 sIL-5Rα 와 상기 라이브러리 결합의 친화도를 측정하는 단계; 를 포함하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 항-IL-5Rα 항체는 효모표면에 발현된 인간항체 Fab 라이브러리 (Human Fab Antibody Library on Yeast Cell Surface)에서 sIL-5Rα에 대한 항체를 선별하고, 추가적으로 친화도 향상을 위해 효모표면에 항체 scFab 라이브러리를 구축하고 키네틱 스크리닝 (Kinetic screening)을 통해 선별한, sIL-5Rα에 고친화도로 선택적으로 결합하는 항체이다.
라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이 시킴으로써 개선시킬 수 있다.
고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.
상기 "인간화" 형태의 비-인간(예: 마우스) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변영역으로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
본 발명에서 사용된 항체의 "가변영역"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉 CDR1, CDR2, 및 CDR3) 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 의미한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 의미한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 의미한다.
"상보성 결정 영역(complement determining region, CDR)"은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 의미한다. 각 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
본 발명에 있어, 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 4의 중쇄 CDR2, 서열번호 5의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 5의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 16의 중쇄 CDR2, 서열번호 5의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 17의 중쇄 CDR2, 서열번호 5의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 18의 중쇄 CDR2, 서열번호 5의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 27의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 28의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 29의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 30의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 31의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3; 또는
서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 32의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3를 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 항체는 표 1, 표 3, 표 6, 표 11에 기재된 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
"골격 영역(Framework Region, FR)"은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4의 4개의 FR을 갖는다.
상기 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1 내지 2, 11 내지 14 및 21 내지 26로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
또한, 상기 IL-5Rα의 세포외 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 6 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 다음을 포함할 수 있다:
서열번호 1의 중쇄 가변영역 및 서열번호 6의 경쇄 가변영역;
서열번호 2의 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 경쇄 가변영역;
서열번호 11의 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 경쇄 가변영역;
서열번호 12의 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 경쇄 가변영역;
서열번호 13의 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 경쇄 가변영역;
서열번호 14의 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 경쇄 가변영역;
서열번호 21의 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 경쇄 가변영역;
서열번호 22의 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 경쇄 가변영역;
서열번호 23의 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 경쇄 가변영역;
서열번호 24의 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 경쇄 가변영역;
서열번호 25의 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 26의 중쇄 가변영역 및 서열번호 7의 경쇄 가변영역.
구체적으로, 본 발명에 따른 항체는 표 2, 표 4, 표 7, 표 12에 기재된 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항-IL-5Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편에는 본 발명에 따른 항-IL5Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서, 보존적 치환을 통해 아미노산 서열의 일부가 치환된 항체 또는 이의 항원 결합 단편도 포함된다.
본 명세서에서 "보존적 치환"이란 1개 이상의 아미노산을 해당 폴리펩티드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 변형을 의미한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 규정되어 있으며, 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 본 발명의 항체가 보존적 아미노산 치환을 갖고 여전히 활성을 보유할 수 있음이 예상된다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 목적하는 기능을 유지하는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 즉, 앞서 본 바와 같이 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다.
"핵산"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 분자생물학적 수법을 사용하여 (예를 들어, 항체와 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성할 수 있으며, 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나(DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 벡터의 성분으로는 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 항생제 내성 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 전사 종결 서열. 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터 및 전사 종결 서열 등과 같이 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 따라 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤모글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터, 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Qiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 숙주세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis 및 바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas, 예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로는 본 발명에 따른 인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법은
(a) 본 발명에 따른 인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는 숙주 세포를 배양하여 본 발명에 따른 인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 숙주세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 통상의 기술자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편 및 펩타이드, 단백질, 소분자 약물, 핵산, 나노입자 및 리포좀으로 구성된 군으로부터 선택된 생체활성분자가 융합된 접합체에 관한 것이다.
상기 단백질은 항체, 항체의 단편, 면역 글로불린, 펩타이드, 효소, 성장인자 (growth factor), 사이토카인 (cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 또는 화학적으로 개질된 단백질 등일 수 있다.
상기 소분자 약물은 약 1000 달톤 미만의 분자량을 지니며 질병의 치료제로서 활성도를 지니는 유기 화합물, 무기 화합물 또는 유기금속 화합물을 나타내는 것으로 본원에서 광범위하게 사용된다. 본원에서 소분자 약물은 올리고펩티드 및 약 1000 달톤 미만의 분자량을 지니는 그 밖의 바이오분자(biomolecule)를 포함한다.
상기 나노입자는 직경 1 내지 1000 nm 크기를 갖는 물질들로 이루어진 입자를 의미하며, 상기 나노 입자는 금속 나노 입자, 금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 금속/금속 코어쉘 복합체, 금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 비금속 쉘로 구성되는 금속/비금속 코어쉘 또는 비금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 비금속/금속 코어쉘 복합체일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 금속은 금, 은, 구리, 알루미늄, 니켈, 팔라듐, 백금, 자성철 및 그의 산화물로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않으며, 상기 비금속은 실리카, 폴리스티렌, 라텍스 및 아크릴레이트 계열의 물질로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 리포좀은 자기 스스로 회합할 수 있는, 수성 내부 구획을 둘러싸는 하나 이상의 지질 이중층 막으로 구성된다. 리포좀은 막 타입 및 그 크기에 의하여 특정 수 있다. 작은 유니라멜라 소포(SUV)는 단일막을 갖고 20nm 내지 50nm의 직경을 가질 수 있다. 큰 유니라멜라 소포(LUV)는 50nm이상의 직경을 가질 수 있다. 올리고라멜라 큰 소포 및 멀티라멜라 큰 소포는 다중, 일반적으로 동심원, 막 층을 가지고 직경이 100nm 이상일 수 있다. 여러 비동심원 막을 가진 리포좀, 즉 더 큰 소포 내에서 포함된 여러 작은 소포는 멀티소포성 소포(multivesicular vesicle)라고 한다.
본 명세서에서 "융합"은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 상기 단백질, 소분자 약물, 나노입자 또는 리포좀에 상기 종양 침투성 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람직하게는 연결자 펩타이드에 의할 수 있으며, 이 연결자 펩타이드는 본 발명의 항체 경쇄 가변 영역, 항체, 또는 이의 절편의 다양한 위치에서 상기 생체 활성 분자와의 융합을 중계할 수 있다.
본 명세서에서 "이펙터 기능 (effector function)"은 항체의 Fc 영역 (Fc 영역의 야생형 서열 또는 Fc 영역의 아미노산 서열의 변이체)과 관련된 생물학적 활성의 유형을 말하며, 항체의 이소 타입에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q결합, 보체 의존적 세포 독성 (CDC); Fc 수용체 결합, 항체 의존적 세포-매개 세포 독성 (ADCC), 식균 작용 (phagocytosis), 세포 표면 수용체 (예를 들어, B- 세포 수용체, BCR)의 하향 조절 및 B- 세포 활성화가 있다.
"항체-의존적 세포 세포 독성" 또는 "ADCC"는 특정 항체에 의해 표지된 표적 세포를 이펙터 세포가 (예를 들어 T-cell, NK-cell) 용해시키는 반응을 지칭한다. ADCC는 또한 표적을 용해시키지만 다른 세포를 필요로 하지 않는 면역 보체 시스템과는 독립적이다. ADCC는 전형적으로 면역 글로불린 G (IgG) 항체와 상호 작용하는 자연 살해 (NK) 세포 인 것으로 알려진 이펙터 세포를 필요로 한다. 그러나 대식세포 (macrophages), 호중구 (neutrophils) 및 호산구 (eosinophils)는 ADCC를 매개할 수 있는데, 예를 들어 IgE 항체를 통해 기생충으로 알려진 특정 기생충 벌레를 죽이는 호산구와 같은 ADCC도 중재할 수 있다.
본 발명에 따른 항체에 접합될 수 있는 생체활성분자는 소분자 약물, 특히 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환, 예시적으로 과호산구증후군(Hypereosinophilic syndrome, HES); 과호산구증가증(hypereosinophilia); 호산구성 천식 (eosinophilic asthma), 호산구성 기관지 천식 (eosinophilic bronchial asthma, ABA) 및 중증 호산 구성 기관지 천식 (severe eosinophilic bronchial asthma, ABA) 등의 천식; 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) ; Cherge-Strauss 증후군; 호산구성 식도염 (eosinophilic esophagitis); 호산구성 위장염 (eosinophilic gastroenteritis); 호산구성 위장관병(EGID); 아토피 피부염(Atopic Dermatitis) 등의 아토피 질환(atopic disease); 알레르기성 비염(allergic rhinitis) 등의 알레르기 질환(allergic disease); 면역글로불린(IgE)-매개 식품 알레르기; 염증성 장 질환, 알레르기성 대장염; 위식도 역류; 심내막심근 섬유증; 뢰플러 심장내막염; 데이비스병; 호산구증가증과 관련된 간헐 맥관부종; 호산구증 가증-근육통 증후군/스페인 독성 오일 증후군(Spanish Toxic Oil Syndrome); 간경변증; 피부염 농가진; 수포성 유천포창; 척-스트라우스 증후군; 급성 골수성 호산구성 백혈병; 급성 림프구성 호산구성 백혈병; 호산구증가증 동반의 전신성 비만세포병; 습진; 베그너 육이종증; 결절다발 동맥염; 호산구성 혈관염; 및 류마티스성 관절염 등에 치료효과가 있는 약물이 바람직하며,
보다 바람직하게는 인다카테롤(indacaterol), 포르모테롤(formoterol), 비란테롤(vilanterol), 알부테롤(albuterol), 레바부테롤(levalbuterol), 티오필린(theophylline) 등의 베타 길항제(beta agonists); 이프라트로피움(ipratropium), 티오트로피움(tiotropium), 글리코피롤레이트(glycopyrrolate) 등의 항-콜린 제제(Anticholinergic agent); 몬테루카스트(montelukast), 자피루카스트(zafirlukast) 질루톤(zileuton) 등의 류코트리엔 조절자(Leukotriene modifiers) 등이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중특이항체 또는 다중특이항체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "이중특이항체"이란 서로 다른 두 종류의 항원(표적 단백질)에 결합할 수 있는 단백질을 의미한다. 구체적으로는 자연적으로는 존재하지 않으며, 유전공학 또는 임의의 방법에 의해 제조된 형태임이 바람직하다. 본 발명의 "이중특이항체"는 "이중표적항체", "이중 항체" 또는 "이중 항체 단백질" 등과 혼용될 수 있다.
상기 이중특이항체는 직접적으로 또는 링커 (linker)를 통해 항원 결합 부위가 연결되거나 정전기적 상호작용에 의해 이종이중체 (heterodimer)를 이룰 수 있는 분자를 지칭한다.
"결합가 (valent)"는 분자 내의 항원에 특이적인 명시된 숫자의 결합 부위의 존재를 지칭한다. 그렇기 때문에, 용어 "1가", "2가", "4가", 및 "6가"는 분자 내의 항원에 특이적인 각각 1개, 2개, 4개, 및 6개의 결합 부위의 존재를 지칭한다.
다중특이적 항체는 적어도 3 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 가지는 항체를 의미한다. 다중특이적(multi-specific) 항체는 삼중특이적(Tri-specific) 이상의 항체, 예를 들어 삼중특이적(Tri-specific) 항체, 사중특이적(Tetra-specific) 항체 또는 그 이상의 타겟을 표적하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체에 이중특이항체 또는 다중특이항체를 형성할 수 있는 항체는 본 발명에 따른 항-IL-5Rα 항체와 병용하여 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환, 예시적으로 과호산구증후군(Hypereosinophilic syndrome, HES); 과호산구증가증(hypereosinophilia); 호산구성 천식 (eosinophilic asthma), 호산구성 기관지 천식 (eosinophilic bronchial asthma, ABA) 및 중증 호산 구성 기관지 천식 (severe eosinophilic bronchial asthma, ABA) 등의 천식; 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) ; Cherge-Strauss 증후군; 호산구성 식도염 (eosinophilic esophagitis); 호산구성 위장염 (eosinophilic gastroenteritis); 호산구성 위장관병(EGID); 아토피 피부염(Atopic Dermatitis) 등의 아토피 질환(atopic disease); 알레르기성 비염(allergic rhinitis) 등의 알레르기 질환(allergic disease); 면역글로불린(IgE)-매개 식품 알레르기; 염증성 장 질환, 알레르기성 대장염; 위식도 역류; 심내막심근 섬유증; 뢰플러 심장내막염; 데이비스병; 호산구증가증과 관련된 간헐 맥관부종; 호산구증 가증-근육통 증후군/스페인 독성 오일 증후군(Spanish Toxic Oil Syndrome); 간경변증; 피부염 농가진; 수포성 유천포창; 척-스트라우스 증후군; 급성 골수성 호산구성 백혈병; 급성 림프구성 호산구성 백혈병; 호산구증가증 동반의 전신성 비만세포병; 습진; 베그너 육이종증; 결절다발 동맥염; 호산구성 혈관염; 및 류마티스성 관절염 등의 예방 또는 치료에 상승적 또는 상가적 치료효과를 낼 수 있는 항체라면 제한없이 사용가능하며,
예시적으로 항-IgE 항체인 오말리주맙(Omalizumab) 및 리겔리주맙(Ligelizumab), 항-인터루킨(interleukin) 또는 항-인터루킨 수용체(Interleukin receptor)에 대한 항체, 예들 들어 항-IL4R 항체 등이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환, 특히 호산구 증가증에 의한 질환 등의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체를 이용하여 치료가능한 질환의 예로는 과호산구증후군(Hypereosinophilic syndrome, HES); 과호산구증가증(hypereosinophilia); 호산구성 천식 (eosinophilic asthma), 호산구성 기관지 천식 (eosinophilic bronchial asthma, ABA) 및 중증 호산 구성 기관지 천식 (severe eosinophilic bronchial asthma, ABA) 등의 천식; 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) ; Cherge-Strauss 증후군; 호산구성 식도염 (eosinophilic esophagitis); 호산구성 위장염 (eosinophilic gastroenteritis); 호산구성 위장관병(EGID); 아토피 피부염(Atopic Dermatitis) 등의 아토피 질환(atopic disease); 알레르기성 비염(allergic rhinitis) 등의 알레르기 질환(allergic disease); 면역글로불린(IgE)-매개 식품 알레르기; 염증성 장 질환, 알레르기성 대장염; 위식도 역류; 심내막심근 섬유증; 뢰플러 심장내막염; 데이비스병; 호산구증가증과 관련된 간헐 맥관부종; 호산구증 가증-근육통 증후군/스페인 독성 오일 증후군(Spanish Toxic Oil Syndrome); 간경변증; 피부염 농가진; 수포성 유천포창; 척-스트라우스 증후군; 급성 골수성 호산구성 백혈병; 급성 림프구성 호산구성 백혈병; 호산구증가증 동반의 전신성 비만세포병; 습진; 베그너 육이종증; 결절다발 동맥염; 호산구성 혈관염; 및 류마티스성 관절염 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 (a) 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 대한 것이다.
본 발명은 또한, 환자에게 필요한 유효량으로 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편을 투여하는 단계를 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체는 IL-5 활성을 제거하거나 억제하거나 감소시킴으로써, IL-5 매개 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 본 발명에 따른 항체는 IL-5Rα에 결합하여 IL-5 활성과 관련된 질환의 치료에 사용된다. 예를 들어 호산구성 천식, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), Cherge-Strauss 증후군; 호산 구성 식도염; 호산구성 위장염 또는 중쇄구 증후군 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 자가 면역 질환 또는 관련자가 면역 상태를 치료하기 위해, 본 발명의 항-IL-5Rα 항체는 다약 요법을 사용하여 다른 치료제와 조합하여 환자에게 투여될 수 있다. 항-IL-5Rα 항체는 면역 억제제와 동시에, 순차적으로 또는 교대로, 또는 다른 요법에 대한 내성이 나타난 후에 투여될 수 있다. 면역 억제제는 당 업계에 사용된 것과 동일하거나 더 적은 용량으로 투여될 수 있다. 선호되는 면역 억제제의 선택은 치료해야 할 질병의 유형과 환자의 병력을 포함한 많은 요소에 따라 달라질 수 있다.
"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환 발전의 억제, 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 경감 등을 의미한다. 본 발명의 항체는 IL-5Rα-발현 세포와 관련된 적용의 경우에 시험관 내 및 생체 내 모두에서 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편; 또는 상기 접합체를 함유할 수 있으며, 상기 성분에 본 발명의 약학적 조성물의 투여를 위하여 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 약학적으로 허용가능한 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 완충식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 접합체를 이용한 치료 방법은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편; 또는 접합체를 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 통상의 기술자에게 자명한 것이다. 또한, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 조성물을 투여하는 개체는 인간을 포함한 포유동물을 제한 없이 포함한다.
본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경우 또는 비경우의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편은 단독 약물 또는 기존 치료제와의 병용치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 항체와 병용치료를 위해 사용될 수 있는 약물로는, 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환, 예시적으로 과호산구증후군(Hypereosinophilic syndrome, HES); 과호산구증가증(hypereosinophilia); 호산구성 천식 (eosinophilic asthma), 호산구성 기관지 천식 (eosinophilic bronchial asthma, ABA) 및 중증 호산 구성 기관지 천식 (severe eosinophilic bronchial asthma, ABA) 등의 천식; 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) ; Cherge-Strauss 증후군; 호산구성 식도염 (eosinophilic esophagitis); 호산구성 위장염 (eosinophilic gastroenteritis); 호산구성 위장관병(EGID); 아토피 피부염(Atopic Dermatitis) 등의 아토피 질환(atopic disease); 알레르기성 비염(allergic rhinitis) 등의 알레르기 질환(allergic disease); 면역글로불린(IgE)-매개 식품 알레르기; 염증성 장 질환, 알레르기성 대장염; 위식도 역류; 심내막심근 섬유증; 뢰플러 심장내막염; 데이비스병; 호산구증가증과 관련된 간헐 맥관부종; 호산구증 가증-근육통 증후군/스페인 독성 오일 증후군(Spanish Toxic Oil Syndrome); 간경변증; 피부염 농가진; 수포성 유천포창; 척-스트라우스 증후군; 급성 골수성 호산구성 백혈병; 급성 림프구성 호산구성 백혈병; 호산구증가증 동반의 전신성 비만세포병; 습진; 베그너 육이종증; 결절다발 동맥염; 호산구성 혈관염; 및 류마티스성 관절염 등의 치료를 위해 사용되는 약물이라면 제한없이 사용가능하며,
바람직하게는 인다카테롤(indacaterol), 포르모테롤(formoterol), 비란테롤(vilanterol), 알부테롤(albuterol), 레바부테롤(levalbuterol), 티오필린(theophylline) 등의 베타 길항제(beta agonists); 이프라트로피움(ipratropium), 티오트로피움(tiotropium), 글리코피롤레이트(glycopyrrolate) 등의 항-콜린 제제(Anticholinergic agent); 몬테루카스트(montelukast), 자피루카스트(zafirlukast) 질루톤(zileuton) 등의 류코트리엔 조절자(Leukotriene modifiers); 플루티카손 프로피오네이트(fluticasone propionate, 부데소나이드(budesonide), 서클소나이드(ciclesonide), 베틀로메타손(beclomethasone), 모메타손(mometasone), 플루티카손 퓨로에이트(fluticasone) 등의 흡입성 코르티코스테로이드(Inhaled corticosteroids); 오말리주맙(Omalizumab) 및 리겔리주맙(Ligelizumab 등의 항-IgE 항체 등이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항-IL5Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료를 요하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 질병의 치료방법에 대한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 진단용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 진단용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 발병 여부 및 경과를 확인하는 것이다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 사용한 진단 방법을 위해, 약물은 시험관 내 또는 생체 내에서 IL-5Rα 항원-발현 세포의 존재를 검출하는데 사용되는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 섬광조영술, 자기 공명 영상 또는 초음파를 사용하여 검출할 수 있는 표지와 같이, 생체내에서 검출할 수 있는 방사성 동위원소를 임상 진단 적용을 위해 사용할 수 있다. 유용한 섬광조영술 표지에는 양전자 방출기 및 γ-방출기가 포함된다. 마그네틱 공급원 영상화용으로 대표적인 조영제로는 상자성 또는 초상자성 이온(예를 들면, 철, 구리, 망간, 크롬, 에르븀, 유로퓸, 디스프로슘, 홀뮴 및 가돌리늄), 산화철 입자 및 수용성 조영제가 있다. 초음파 검출을 위해, 가스 또는 액체를 마이크로버블(microbubble) 조영제로서 방출되는 다공성 무기 입자속 안에 포획시킬 수 있다. 시험관내 검출에 유용한 검출 가능한 표지에는 형광발색단, 검출가능한 에피토프 또는 결합제 및 방사성 표지가 포함된다.
상기 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
일 실시예에서 상기 키트는 병, 바이알, 백, 주사기 또는 시린지를 포함할 수 있다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리, 플라스틱, 또는 금속으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기에 포함된 라벨은 사용 지침을 나타낼 수 있다. 추가로 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예컨대 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 등을 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 인간 인터루킨-5 리셉터α (IL-5Rα)의 발현
인간 인터루킨-5 리셉터α (IL-5Rα)에 특이적인 항체를 도출하기 위한 항원 단백질을 제조하였다. IL-5Rα는 세포막 당단백질 (cell membrane glycoprotein)이기 때문에, 서열번호 19로 표시되는 IL-5Rα의 서열 중 세포외 도메인(extracellular domain)인 아미노산 잔기 Asp1-Asn313 부분을 동물세포 발현 벡터에 도입하였다. 세포외 도메인(extracellular domain)인 아미노산 잔기 Asp1-Asn313 부분을 "sIL-5Rα"라 칭한다. sIL-5Rα (아미노산 잔기 Asp1-Asn313)는 동물발현 벡터(pSecTag2A)에 제한효소 NheI/BamHI을 사용하여 클로닝하여 C-말단에 아비 표지 (Avi tag, 아미노산 서열; GLNDIFEAQKIEWHE) 펩타이드와 6X 히스티딘 (6XHis) 표지 펩타이드가 융합되도록 pSecTag2A-sIL-5Rα를 구축하였다 (도 1A). 항원 단백질을 발현 및 정제를 위하여 HEK293F (Invitrogen) 세포에 일시적 트랜스펙션(transient transfection) 하였다. 진탕 플라스크(corning)에 100 mL 트랜스펙션 시, HEK293F 세포를 1.0X106 세포/ml의 밀도로 배지 90ml에 파종하여, 120 rpm, 8 % CO2, 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 구축된 플라스미드 125μg을 5ml 무혈청 Freestyle 293 발현 배지(Invitrogen)에 희석 및 필터하여 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) 375μg을 희석한 5ml 배지와 혼합한 뒤 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후 반응시킨 혼합 배지를 앞서 90ml로 파종한 세포에 넣어 120 rpm, 8% CO2에서 인큐베이션 (incubation) 후, 6일 동안 인큐베이션하였다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 인큐베이션 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 니켈 세파로오스 컬럼 (Ni Sepharose™ 6 Fast Flow, GE Healthcare)에 상등액을 적용하고 세척버퍼 (50mM phosphate, 300mM NaCl, 30mM imidazole pH 8.0)로 세척 후 용출버퍼 (50mM phosphate, 300mM NaCl, 250mM imidazole, pH8.0)을 이용하여 단백질을 용출하였다.
상기 용출된 단백질은 Vivaspin 10,000 MWCO (Satorius) 원심분리 농축기를 이용하여 저장버퍼 (PBS pH7.4)로 버퍼를 교환한 후 농축하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다.
상기 정제된 3μg의 sIL-5Rα 단백질을 SDS-PAGE 분석을 통해 순도를 확인하였다 (도 1B). 정제된 단백질들은 예측한 분자량(37 kDa)보다 큰 사이즈에서 다소 끌리는 듯한 밴드가 관찰되었다. 끌리는 듯한 밴드는 서로 다른 글리코실화(glycosylation) 패턴에 의한 것이다. IL-5Rα의 세포외 도메인에는 다이설파이드 결합 (disulfide bond)을 이루지 않고 있는 시스테인 (서열번호 19로 표시되는 IL-5Rα의 서열 중 66번 잔기)이 존재하여 non-reducing (NR) 조건에서 응집물 (aggregate)를 이룬 단백질의 관찰된다.
실시예 2: 마우스 면역을 통한 항-IL-5Rα 마우스 항체의 생산
마우스 면역 (mouse immunization)은 에이 프론티어 (A-Frontier, 서울, 한국) 사에서 진행하였다. 간략히, 위에서 얻은 단백질(항원) 100μg을 complete Freunds adjuvant와 혼합하여 암컷 Balb/c 마우스의 복강내에 주입하였다. 2주 후, 마우스 꼬리에서 혈청을 모아 ELISA를 이용하여 항체 농도를 측정하였다. 2차 부스팅을 위해 다시 100μg의 항원을 혼합하여 마우스에 주사를 하고 다시 1주일 후 100μg의 항원을 주사하여 final boosting을 진행하였다. 그 후에 마우스에서 세포를 추출하여 배양액으로 조직을 세척한 후 세포를 분리하였다. 골수종 세포 (Sp2/0Ag14)를 마우스로부터 분리 한 세포와 융합하고 PEG 1500 (Roche, 10 783 641 001)를 사용하여 융합시킨다. 1XHAT (sigma, H0262) 배양 배지를 사용하여 융합 세포를 배양하였다. ELISA 확인 후, 양성 웰에 있는 세포를 24 웰로 옮긴 후 배양한다. HT 배양 배지 (Gibco, 11067030)를 사용하여 세포를 96 웰 플레이트에 옮긴다. 37℃ CO2 배양기에서 배양한다. 융합 세포는 배지상으로 항-IL-5Rα 쥐 항체를 분비한다. 배지를 이용하여 IL-5Rα에 대한 결합능을 ELISA로 먼저 스크리닝하고 HEK293T에 일시적으로 IL-5Rα를 발현시켜 유세포 분석기를 통하여 이중 확인하였다. 최종 클론이 확인될 때까지 클로닝 과정을 반복하여 단일 클론 항체 4종을 도출하였다. 항체의 이소 타입은 Rapid ELISA mouse mAb isotyping kit(Pierce, 37503)를 이용하여 확인하였다. m2B7, m2H12은 IgG1 중쇄와 kappa 경쇄를 가지고 m9B8은 IgG2a 중쇄와 kappa 경쇄, m12F9은 IgG2b 중쇄와 kappa 경쇄를 가진다.
이후 제공받은 하이브리도마 세포는 RPMI 배지에서 배양하여 상등액을 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column)에 항체를 적용하고 PBS (12mM phosphate, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M Glycine, 0.5 M NaCl 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용출한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다.
상기 용출된 단백질은 PD-10 Desalting column (GE Healthcare)을 이용하여 저장버퍼 (PBS pH7.4)로 버퍼를 교환한 후 Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) 원심분리 농축기를 사용하여 농축하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다.
실시예 3: 항-IL-5Rα 쥐 항체의 결합능 확인
항체의 항원 결합능을 indirect ELISA를 이용하여 알아보았다. 2017년도에 FDA 승인을 받은 항-IL-5Rα 항체인 벤랄리주맙의 중쇄 가변부위와 경쇄가변부위 (DrugBank Accession No. DB12023)를 통상적으로 사용되는 항체인 IgG1의 중쇄 (CH1, CH2, CH3)와 경쇄 (CL)을 코딩하는 pcDNA3.4 벡터에 도입하였다. IgG1 불변영역(constant region)을 가지는 벤랄리주맙을 벤랄리주맙 유사체 (benralizumab analogue)로 명명하였다. 발현시킨 벤랄리주맙 유사체도 같이 결합능을 비교를 하였다. 시노 바이오 사에서 구매한 sIL-5Rα 항원 (sino bio, 10392-H08H) 단백질을 96-웰 플레이트에 각각 50ng/웰로 상온에서 1시간 동안 고정시키고, 2% 분말 우유를 포함하는 0.1% PBST (0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl) 로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 8, 40, 200 nM의 범위에서 순차 희석하여 각 항체를 블로킹 된 플레이트에 웰당 25 μl씩 첨가하고, 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 2차 항체로 항 인간 IgG-HRP 항체(1:8000) 또는 항-쥐 IgG-HRP 항체 (1:4000)를 웰당 25μl씩 첨가하고 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 PBST 로 3 번 세척한 후, TMB 용액을 웰당 25μl씩 첨가하여 상온에서 ~1분 동안 발색 반응시킨 뒤, 2N H2SO4로 반응을 중지시키고, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 2A의 결과에서 확인할 수 있듯이, 4종의 쥐 항체들과 벤랄리주맙 유사체는 sIL-5Rα에 대하여 다양한 범위의 친화력을 가지고 있는 것을 확인하였다.
실시예 5: IL-5Rα를 발현하는 TF-1 세포주 (TF-1/IL-5Rα 세포)의 구축.
4종의 항-IL-5Rα 쥐 항체들과 벤랄리주맙 유사체의 IL-5의 신호 전달 저해능을 비교하기 위하여 세포주를 먼저 구축하였다. IL-5는 IL-5Rα와 결합한 후 공통 β 수용체 (βc 수용체)에 의해 신호 전달이 매개된다. 따라서 βc 수용체가 발현되어 있는 TF-1 세포주에 안정적으로 IL-5Rα 과발현하는 세포주를 구축하였다. 구체적으로는, IL-5Rα을 코딩하는 DNA를 렌티 바이러스(Lenti virus) 벡터인 pLJM1(Addgene) 벡터에 SalI/EcoRI으로 클로닝하였다. 세포 배양 플레이트에 3 x 106 개의 HEK293T 세포를 10 % FBS가 포함된 배지 10 ml로 넣어 12시간 동안 5 % CO2, 37℃ 조건에서 배양했다. 세포가 안정화되면, 배지를 제거하고 플레이트를 DPBS (wellgene, LB001-04)을 이용하여 세척하였다. Opti-MEM media(Gibco) 600 μl에 Lipofectamine 3000 (Invitrogen, USA) 40 μl을 넣고, 구축한 렌티 바이러스 벡터와 바이러스 패키징 벡터인 pMDL, pRSV, pVSV-G(Addgene)을 조심스럽게 첨가하여 20분 동안 상온에서 반응시킨 후 접시에 첨가하였다. 추가적으로 항생제가 없는 DMEM media 9 ml을 넣고 6시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 10 ml 교환한 후, 48시간 동 안 배양하였다. 렌티 바이러스 벡터를 일시적 트랜스펙션 시킨 배지를 전부 필터하여 배지 속의 바이러스 입자들을 미리 준비해 둔 TF-1 세포가 있는 세포배양 접시에 첨가한다. 항생제 저항성은 퓨로마이신(puromycin) 저항성 유전자를 선택 마커로 사용하였다.
실시예 6: 항-IL-5Rα 쥐 항체의 세포주에서의 IL-5 의존성 증식 억제능 비교
IL-5Rα을 안정적으로 발현하는 형질 전환된 TF-1 세포 (TF-1/IL-5Rα cell) 2 x 104 개를 96-웰 플레이트에 100 μl씩 분주하였다. 동일한 날에 50 μl의 320 pM의 IL-5과 미리 80nM, 400nM, 2000 nM로 희석한 항-IL-5Rα 쥐 항체 용액 50 μl의를 첨가한 후, 96-웰 플레이트를 37℃ 및 5％ CO2에서 40시간 배양시켰다. 세포의 증식능을 측정하기 위하여, 각 웰로부터 100㎕의 세포현탁액을 회수한후 100㎕의 셀타이터-글로 (CellTiter-Gloㄾ) 프로메가사 제) 시료를 넣어주고 실온에서 20 분간 반응시켜 CytationTM 3 cell Imaging multi-mode reader로 분석하였다 (도 2B).
분석결과, 항- IL-5Rα 쥐 항체들은 벤랄리주맙 유사체보다는 낮은 IL-5 신호 차단 효과를 보였고, 그 중 m2B7가 높은 IL-5 신호 차단 효과를 보임을 확인하였다
실시예 6: 항-IL-5Rα 쥐 항체, m2B7의 인간화
m2B7의 인간화를 위해, m2B7의 항체 골격 (Framework Region, FR)과 인간 항체 골격들을 비교하여 최대 상동성을 갖는 인간 항체 골격을 선별하여 m2B7의 중쇄 및 경쇄 CDR (complementary determining regions)서열을 이식하는 방법이 많이 사용된다. 따라서 Ig Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 m2B7의 중쇄 가변영역 유전자와 가장 상동성이 높은 인간의 생식선 (germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, 중쇄 가변 영역은 인간 IGHV1-46*01 유전자가 아미노산 레벨에서 66.3%의 상동성을 가지고 경쇄 가변 영역은 인간 IGKV1-9*01이 65.3%의 상동성을 가짐을 확인하였다. 비교적 낮은 상동성을 보였으므로 37개의 임상 연구된 항체들의 CDR을 제외한 골격들과 비교하였을 때 m2B7은 daclizumab (항-IL-2Rα 항체)와 중쇄 및 경쇄 가변영역이 75.9%, 71.3%의 상동성을 보였다. 따라서 쥐 항체 m2B7의 Kabat numbering 31-35 (VH-CDR1), 50-65 (VH-CDR2), 95-102 (VH-CDR3)를 중쇄 가변 영역의 CDR로 정의하고, Kabat numbering 24-34 (VL-CDR1), 50-56 (VL-CDR2), 89-97 (VL-CDR3)을 경쇄 가변 영역의 CDR로 정의해 daclizumab의 골격에 도입하였다. 인간 항체 골격 수용체 서열에 직접적인 CDR 이식은 종종 표적 항원에 대한 친화도 및 특이성의 손실을 초래하는 것으로 알려져 있다. 이러한 가능성을 최소화하려면 CDR의 loop 구조를 형성하는데 중요하게 작용하는 잔기 (residue)를 보존해야 하며 이 위치를 Vernier zone이라고 지칭한다. 따라서 Vernier zone 인 중쇄 가변영역의 93번 (A→T) 아미노산은 원래 쥐 항체 m2B7의 아미노산 서열로 back-mutation 하였다. 경쇄 가변영역의 60번과 70번 잔기도 m2B7의 잔기인, Asp로 유지하였는데 이는 인간 germline 서열에서 Asp가 우선적으로 많이 발생하기 때문이다. 인간화된 항체는 hu2B7로 명명하였다.
표 1 및 2 각각은 항-IL-5Rα 쥐 항체인 m2B7의 중쇄 CDR 서열 및 중쇄가변영역 서열이며, 표 3 및 4 각각은 경쇄 CDR 서열 및 경쇄가변영역 서열이다.
[표 1]
[표 2]
[표 3]
[표 4]
hu2B7의 HC 및 LC를 암호화하는 플라스미드를 HEK293F 세포에 상기 일시적 트랜스펙션 방법에 따라 채취한 세포 인큐베이션 상등액을 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column)에 항체를 적용하고 PBS (12mM phosphate, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M Glycine, 0.5 M NaCl 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용출한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다.
상기 용출된 단백질은 PD-10 Desalting column (GE Healthcare)을 이용하여 저장버퍼 (PBS pH7.4)로 버퍼를 교환한 후 Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) 원심분리 농축기를 사용하여 농축하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다.
실시예 7: 항-IL-5Rα 항체들 (m2B7, hu2B7, 벤랄리주맙 유사체)의 결합능 분석
m2B7과 hu2B7, 벤랄리주맙 유사체에 대해서 IL-5Rα에 대한 결합력을 더 정량적으로 분석하기 위하여 Octet QKe (ForteBio, USA) 기기를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 의하여 측정하였다. 구체적으로는, 10x 카이네틱 버퍼 (ForteBio, 18-1105)를 PBS에 희석하여 1x 카이네틱 버퍼를 준비한다. 항체를 1x 카이네틱 버퍼에 1μg/ml의 농도로 희석하여 준비하고, <실시예 1>에서 정제한 IL-5Rα를 400, 200, 100, 12.5, 6.25 및 0nM의 농도로 1x 카이네틱 버퍼에 순차적으로 희석하여 각 200μl씩 빛이 통과하지 않는 불투명한 96-웰 플레이트에 넣어주었다. AHC (anti-human IgG Fc capture) 센서 칩이 1x 카이네틱 버퍼, 항체 희석 용액, 1x 카이네틱 버퍼, 항원 희석 용액, 1x 카이네틱 버퍼의 순서로 옮겨가면서 항체에 항원이 결합했다가 떨어질 때 발생하는 굴절률의 변화를 통해 항체의 항원 친화도 (affinity)을 분석하였다. 친화도는 1:1 결합 모델로 Octet Data Analysis software 11.0으로 계산하였다. 그 결과를 도 3A에 나타내었다.
표 5는 Octet QKe를 이용하여 IL-5Rα에 대한 항-IL-5Rα 항체들의 친화도 분석 결과를 나타낸다. IL-5Rα에 대한 m2B7의 친화도(KD)는 40.2nM로 나타났으며, hu2B7의 친화도는 47.8nM로 나타났다. 벤랄리주맙 유사체는 26.8 nM의 친화도를 나타내어 벤랄리주맙 유사체> m2B7> hu2B7 순으로 높은 친화도를 가지는 것을 확인하였다.
[표 5]
실시예 8: 항-IL-5Rα항체 (m2B7, hu2B7, 벤랄리주맙 유사체)의 세포주에서의 IL-5 의존성 증식 억제능 비교
IL-5Rα을 안정적으로 발현하는 형질 전환된 TF-1 세포 (TF-1/IL-5Rα cell) 2x104 개를 96-웰 플레이트에 100 μl씩 분주하였다. 동일한 날에 50 μl의 320 pM의 IL-5과 미리 80nM, 400nM, 2000 nM로 희석한 마우스 항-IL-5Rα 항체 용액 50 μl의를 첨가한 후, 96-웰 플레이트를 37℃ 및 5％ CO2에서 40시간 배양시켰다. 세포의 증식능을 측정하기 위하여, 각 웰로부터 100㎕의 세포현탁액을 회수한후 100μl의 셀타이터-글로 (CellTiter-Gloㄾ) 프로메가사 제) 시료를 넣어주고 실온에서 20 분간 반응시켜 CytationTM 3 cell Imaging multi-mode reader로 분석하였다 (도 3B).
분석결과, hu2B7의 IL-5 신호 차단 효과가 m2B7 보다는 낮아짐을 확인하였다. 친화도가 높은 순서와 마찬가지로 벤랄리주맙 유사체> m2B7> hu2B7 순으로 IL-5 저해능이 높았다. 따라서 본 발명자는 항-IL-5Rα 항체의 생물학적 효능을 높이기 위해 hu2B7을 기반으로 IL-5Rα에 대한 친화도를 높이고자 하였다.
실시예 9: hu2B7 기반 친화도 증가를 위한 효모 세포 표면 발현 라이브러리의 구축
먼저 효모 표면에 single chain Fab (scFab) 형태로 발현시키기 위하여 NheI/ApaI으로 제한효소 처리한 pYDS-H 벡터에 hu2B7 항체를 scFab 형태로 구축하여 pYDS hu2B7 scFab 벡터와 추가적인 한 개의 뉴클레오타이드 (nucleotide)를 도입하여 Open Reading Frame (ORF) 밀림 현상으로 스탑 코돈(stop codon)이 발생하는 pYDS-dummy 벡터를 클로닝하였다. pYDS-dummy 벡터를 사용함으로써 제한효소 처리가 안 된 벡터가 섞여 있다 하더라도 원하는 라이브러리 유전자가 들어간 벡터만이 효모 표면에 scFab을 발현할 수 있다.
NHB degenerate 코돈 (Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Tyr을 인코딩)을 사용하여 VH-CDR2 (잔기 53-58, 60-61, kabat numbering)에 다양화를 하였다. NHB degenrate 코돈은 항체가 비특이성을 가질 때 기여를 많이 한다고 알려진 Arg를 인코딩하지 않기 때문에 사용되었다 (도 4).
Overlapping PCR을 수행해 라이브러리 유전자를 12 μg 과, pYDS dummy 벡터에도 NheI/ApaI 제한 효소를 하여 4 μg 준비하였다. 만약 제한 효소 처리가 되지 않은 pYDS dummy 벡터가 남아있어 효모 균주에 형질 전환되더라도 스탑 코돈에 의하여 효모 표면에 발현되지 않는다. 두 유전자는 혼합하여 효모표면 발현용 효모 AWY101 (MATa, Trp-) 균주에 전기 청공법으로 형질 전환하여 상동성 접합 (homologous recombination)을 통해 구축하였다. AWY101 균주는 단백질 이황화 이성 질화 효소 (protein disulfide isomerase)가 과발현 되도록 하여 효모 표면에 단백질의 발현 효율이 좋아지도록 만든 균주이다. 이러한 과정을 12번 반복한 후 라이브러리 크기를 계단식 희석을 한 후 선택 배지 SD-CAA (20 g/L Glucose, 1.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate, 5g/L ammonium sulfate, 5.4 g/L Na2HPO4, 8.6 g/L NaH2PO4, 5 g/L casamino acids)에 자란 콜로니의 수를 측정하여 확인하였으며, 약 4X107 수준의 라이브러리가 제작되었다.
실시예 10: 효모 scFab 라이브러리의 IL-5Rα 항원 단백질에 대한 스크리닝 및 클론 도출
보다 높은 친화도의 클론을 선별하기 위하여 <실시예 1>에서 제조한 IL-5Rα 항원 단백질을 BirA 바이오틸화 키트 (BirA biotin-protein ligase standard reaction kit, AVIDITU, BIRA500)를 이용하여 제조사의 프로토콜대로 수행하여 바이오틴화된 sIL-5Rα (biotinylated sIL-5Rα)를 준비하였다. 구축된 라이브러리에서 바이오틴화된 sIL-5Rα에 특이적으로 결합하는 효모 클론을 스크리닝하였다.
구체적으로, 바이오틴화된 sIL-5Rα 와 scFab의 효모 발현량을 감지하기 위하여 c-Myc에 결합하는 마우스 항체인 9E10을 1:200을 1ml의 볼륨으로 준비하였다. 이 혼합물을 효모 세포에 발현된 scFab (1X108 scFab효모)와 상온에서 30분 동안 결합시킨 후, 결합되지 않은 항체들은 워싱하였다. PE가 접합된 streptavidin (Streptavidin-R-phycoerythrin conjugate (SA-PE), Thermo)과 Alexa 488이 접합된 항-마우스 IgG 항체(goat Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG antibody, Thermo)를 4 도에서 15 분 동안 결합시킨 후 FACS(fluorescence-activated cell sorting)를 이용하여 scFab의 발현량이 높고, 바이오틴화된 sIL-5 Rα와 결합력이 높은 클론을 선별하였다.
라이브러리를 바이오틴화된 sIL-5Rα에 대하여 농도를 낮춰가면서 Fab의 발현량이 높고 바이오틴화된 sIL-5Rα와 결합력이 높은 클론을 FACS 과정을 이용하여 선별하고 (0.5 μM in round 1, 50 nM in round 2, and 10 nM in round 3 and 4), 도출된 pool을 분석하는 과정을 반복하였다. 이 같은 과정을 4회 반복하였다.
최종적으로 sIL-5Rα에 특이적으로 결합하는 각각의 개별 클론을 발현하는 효모 세포로부터 DNA를 수득하고 서열을 분석하여 독자적인 염기서열 및 아미노산 서열이 확인된 4종의 항체를 선별하였다.
표 6 및 7 각각은 선별된 IL-5Rα에 결합능을 보이는 4개의 개별 클론의 중쇄 CDR 및 중쇄가변영역의 서열이다.
[표 6]
[표 7]
실시예 11: 선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 IgG 전환 및 동정
scFab 형태의 선별된 4종의 항체는 통상적으로 사용되는 항체인 IgG1의 형태로 변환시켰다. 선별된 항체의 가변영역(VH, VL)은 IgG1의 중쇄 (CH1, CH2, CH3)와 경쇄(CL)를 암호화하는 pcDNA3.4 벡터에 도입하였다. 각 항체들의 경쇄와 중쇄는 HEK293F 세포에 1:1 비율로 공통형질전환시켜 경쇄와 중쇄가 세포 안에서 함께 발현되도록 하였다.
상기 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제하였다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지에서 부유 성장하는 HEK293F 세포를 플라스미드 및 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크에 100 mL 트랜스펙션 시, HEK293F 세포를 1.0X106 세포/ml의 밀도로 배지 90ml에 파종하여, 120 rpm, 8 % CO2, 37℃에서 인큐베이션하였다. 플라스미드를 5 ml FreeStyle 293 발현 배지에 125 μg으로 희석 및 필터하여, PEI 375μg을 희석한 5ml의 배지와 혼합한 뒤 실온에서 10 분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 90 ml로 파종한 세포에 넣어 120 rpm, 8% CO2에서 6일동안 인큐베이션했다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 인큐베이션 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M Glycine, 0.5 M NaCl 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 상기 용출된 단백질은 Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) 원심분리 농축기를 이용하여 저장버퍼 (PBS pH7.4)로 버퍼를 교환한 후 농축하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다.
실시예 12: 선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 결합능 분석
선별된 항-IL-5Rα 항체들 (5R65, 5R68, 5R80, 5R86)에 대해서 IL-5Rα에 대한 결합력을 더 정량적으로 분석하기 위하여 Octet QKe (ForteBio, USA) 기기를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 의하여 측정하였다. 구체적으로는, 10x 카이네틱 버퍼 (ForteBio, 18-1105)를 PBS에 희석하여 1x 카이네틱 버퍼를 준비한다. 항체를 1x 카이네틱 버퍼에 1㎍/㎖의 농도로 희석하여 준비하고, <실시예 1>에서 정제한 IL-5Rα은 400, 200, 100, 12.5, 6.25 및 0nM의 농도로 1x 카이네틱 버퍼에 순차적으로 희석하여 각 200㎕씩 빛이 통과하지 않는 불투명한 96-웰 플레이트에 넣어주었다. AHC (anti-human IgG Fc capture) 센서 칩이 1x 카이네틱 버퍼, 항체 희석 용액, 1x 카이네틱 버퍼, 항원 희석 용액, 1x 카이네틱 버퍼의 순서로 옮겨가면서 항체에 항원이 결합했다가 떨어질 때 발생하는 굴절률의 변화를 통해 항체의 항원 친화도 (affinity)을 분석하였다. 친화도는 1:1 결합 모델로 Octet Data Analysis software 11.0으로 계산하였다. 그 결과를 도 5A에 나타내었다.
표 8는 Octet QKe를 이용하여 IL-5Rα에 대한 선별된 항-IL-5Rα 항체들의 친화도 분석 결과를 나타낸다. 선별된 클론들은 11.8-24.1 nM 수준의 친화도를 보이며 벤랄리주맙 유사체의 친화도인 26.8 nM 보다는 높은 친화도를 가지는 것을 확인하였다.
[표 8]
실시예 13: 선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 결합 특이성 분석
항체의 결합 특이성 (specificity)을 indirect ELISA를 이용하여 알아보았다. 4 개의 구조적으로 상이한 항원 이중 가닥 DNA (dsDNA), 인슐린, 거대 분자인 hemocyanin 및 막 구성 성분인 cardiolipin을 사용하여 다중 항원 ELISA를 수행하였다.
구체적으로, IL-5Rα 항원 단백질 (50ng/웰), dsDNA (25ng/월), 인슐린 (125ng/웰), hemocyanin (125ng/웰), cardiolipin (1250ng/웰) 단백질을 96-웰 플레이트에 넣고 상온에서 1시간 동안 고정시키고, 2% 분말 우유 (skim milk)를 포함하는 0.1% PBST PBST(0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl) 로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 100 nM이 되도록 항체를 희석하여 블로킹 된 플레이트에 웰당 25 μl씩 첨가하고, 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 2차 항체로 항 인간 IgG-HRP 항체 (1:4000)를 웰당 25μl씩 첨가하고 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 PBST 로 3 번 세척한 후, TMB 용액을 웰당 25μl씩 첨가하여 상온에서 ~2분 동안 발색 반응시킨 뒤, H2SO4 (2N)로 반응을 중지시키고, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 5B의 결과에서 확인할 수 있듯이, 항-IL-5Rα 인간화 항체들은 IL-5Rα외의 4종의 단백질에 대하여 결합능을 보이지 않아 IL-5Rα에 대하여 결합 특이성을 가지고 있는 것을 확인하였다.
실시예 14: 선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체들과 IL-5가 IL-5Rα에 대한 경쟁적으로 결합하는지 평가
생물학적 효능 평가에 앞서 항-IL-5Rα 인간화 항체들이 IL-5Rα의 IL-5 결합부위에 IL-5와의 경쟁적으로 결합하는지를 결합경쟁 ELISA를 수행하였다.
구체적으로 IL-5 (Uniprot code : P05113, Ile20-Ser134)를 G4S 링커와 마우스 IgG2a의 중쇄 불변 부위 (hinge-CH2-CH3)에 융합하여 상기 일시적 트렌스펙션 방법과 정제 방법을 통하여 정제하였다 (도 5C). 정제된 IL-5-mFc 단백질을 96-웰 플레이트에 100ng/웰 농도로 1시간 동안 상온에서 고정시키고, 2% 분말 우유 (skim milk)를 포함하는 0.1% PBST로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 항-IL-5α 항체 [2000nM에서 2배씩 희석]를 농도별로 섞은 혼합물을 생성하여 블로킹 된 플레이트에 웰당 25 μl씩 첨가하고, 이어서 100nM의 IL-5Rα를 웰당 25 μl씩 첨가하여 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 2차 항체로 항-his-HRP 항체(1:2000)를 웰당 50μl씩 첨가하고 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 PBST 로 3번 세척한 후, TMB 용액을 웰당 50μl씩 첨가하여 상온에서 ~2분 30초 동안 발색 반응시킨 뒤, H2SO4 (2N)로 반응을 중지시키고, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 항-IL-5Rα 인간화 항체들과 IL-5-mFc가 IL-5Rα에 대한 결합을 경쟁하는 것으로 확인하였고 그 중 5R65와 5R86 항체가 IC50를 각각 9.5nM, 14.1nM을 가지며 벤랄리주맙 유사체 (IC50=9.8nM)와 비슷한 IC50 값을 가지는 것을 확인하였다 (도 5D).
실시예 15: 선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 세포주에서의 IL-5 의존성 증식 억제능 비교
IL-5Rα을 안정적으로 발현하는 형질 전환된 TF-1 세포 (TF-1/IL-5Rα cell) 2 x 104 개를 96-웰 플레이트에 100 μl씩 분주하였다. 동일한 날에 50 μl의 640 pM의 IL-5과 미리 20nM, 100nM 로 희석한 항-IL-5Rα항체 용액 50 μl의를 첨가한 후, 96-웰 플레이트를 37℃ 및 5％ CO2에서 40시간 배양시켰다. 세포의 증식능을 측정하기 위하여, 각 웰로부터 100㎕의 세포현탁액을 회수한 후 100㎕의 셀타이터-글로 (CellTiter-Gloㄾ 프로메가사 제) 시료를 넣어주고 실온에서 20 분간 반응시켜 CytationTM 3 cell Imaging multi-mode reader로 분석하였다 (도 6A).
분석결과, competitive ELISA의 IC50 값 결과와 유사하게 5R65 항체가 가장 IL-5 신호 차단 효과가 높았다. 5R65와 5R86 항체는 인체 내에서 IL-5가 가장 주요하게 작용하는 세포인 호산구를 이용하여 생물활성 저해능을 평가하였다.
실시예 15: 선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 인체 호산구의 증식 억제능 평가
IL-5에 의하여 호산구는 분화, 증식, 이동 등의 활성을 나타낸다. 혈액 내의 호산구의 수는 천식 환자에게 증가되어 있기 때문에, 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 호산구 증식 (proliferation) 억제능을 평가하여 호산구 수의 감소에 기여할 수 있을지를 평가하였다.
구체적으로, 50㎖ 용량의 폴리프로필렌 원심관에 Ficoll-Paque solution (GE Healthcare, 17-5442-03)를 20㎖씩 분주하여 각각에 헤파린 처리를 한 환자 혈액 20㎖을 중층하였다. 이것을 879Xg, 실온에서 25 분간 원심분리하여 가장 아래층을 분리, 회수하였다. 2% 덱스트란 용액을 분주하여 적혈구(하층)과 과립구 층(상층)을 분리하고 그 중 과립구 층을 회수하여 거기에 혼재하는 적혈구를 제거할 목적으로 27㎖ 멸균시킨 물과 3㎖ 10x HBSS를 분주하였다. 300 X g, 4℃ 에서 10 분간 원심분리하여 적혈구를 제거한 농축된 과립구 (호산구, 호중구)를 분리, 회수하였다. 최종적으로 상업적으로 이용가능한 eosinophil Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec; 130-092-010)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 과립구에서 호산구만 정제하였다.
96 웰의 세포 배양용 플레이트에 5 x 104개/웰의 호산구를 분주하고, 최종농도 100pM의 인체 IL-5을 첨가하고 또한 최종농도 0.5μM, 1μM의 항-IL-5Rα 항체들을 각각 첨가하였다. 각 항체에 대하여 2웰 배양하고 각 웰의 용량은 최종적으로 200㎕로 되도록 조제하였다. CO2인큐베이터 37℃에서 2 일간 배양하고, 배양 종료후 각 웰로부터 100㎕의 세포현탁액을 회수한후 100㎕의 셀타이터-글로((CellTiter-Gloㄾ) 프로메가사 제) 시료를 넣어주고 실온에서 20 분간 인큐베이션한다. 마이크로플레이트 측정기로 발광을 측정하여 호산구의 증식능을 분석한다.
Isotype control 로 사용한 항체는 본 발명자들이 상기 <실시예 3>에 명시한 방법처럼 항-VEGF 항체인 아바스틴의 중쇄 가변부위와 경쇄가변부위 (DrugBank Accession No. DB00112)를 통상적으로 사용되는 항체인 IgG1의 중쇄 (CH1, CH2, CH3)와 경쇄 (CL)을 코딩하는 pcDNA3.4 벡터에 도입하여 IgG1 불변영역(constant region)을 가지는 아바스틴 유사체 (avastin analogue)를 정제하여 사용하였다.
도 6B의 결과에서 나타나듯이, 5R65 항체는 벤랄리주맙 유사체와 유사한 수준으로 호산구의 증식능을 억제하였다. 반면 5R86은 벤랄리주맙 유사체보다 유의미성은 없으나 낮은 호산구 증식 억제능을 보였다. 5R65와 5R86이 벤랄리주맙 유사체보다 높은 친화도를 가짐에도 불구하고 TF-1/IL-5Rα 세포주와 호산구에서 비슷하거나 낮은 IL-5 생물활성 저해능을 보였다. 항체의 길항 작용 (antagonistic activity)에 중요한 요소로는 친화도 외에 에피토프가 있다. IL-5는 IL-5Rα의 세포 외 도메인 전체에 감싸듯이 결합되기 때문에 어떤 도메인에 항체가 결합되는지를 확인하기 위해 도메인 맵핑 (domain mapping)을 수행하였다.
실시예 16: 5R65 항체의 도메인 맵핑 (domain Mapping)
IL-5와 IL-5Rα의 결합 구조는 PDB(Protein Database) ID: 3QT2에 나타나 있으며, IL-5Rα의 세포외 도메인은 3개의 도메인으로 구성되어 있고 렌치 (wrench) 모양처럼 구부러져 있어 IL-5가 3개의 도메인에 모두 접촉하고 있다 (도 7A). IL-5Rα에서의 서열번호 19번에서 표시되는 도메인 1(domain 1, D1)은 ASp1에서 Gly103을 나타내고, 도메인 2 (domain 2, D2)는 Ser104에서 Asn220을 나타내며, 도메인 3 (domain 3, D3)는 Pro221에서 Trp322를 나타낸다. 그 중에서도 세포막에서 먼 도메인 (membrane-distal domain)인 도메인 1 (D1)이 IL-5와이 결합에 가장 많이 기여하고 있다. 벤랄리주맙 아날로그는 IL-5Rα의 D1에 에피토프를 가지고 있다 (Kolbeck et al., 2010).
[표 9]
벤랄리주맙은 쥐 IL-5Rα (mouse IL-5Rα, mIL-5Rα)에는 결합하지 않는 점을 이용하여 쥐 IL-5Rα의 도메인과 인간 IL-5Rα (human IL-5Rα, IL-5Rα)의 도메인을 혼합하여 구축한 변형 IL-5Rα를 이용하여 도메인 맵핑을 진행하였다. 본 발명자들도 이러한 점을 이용하여 쥐 IL-5Rα의 도메인에 인간 IL-5Rα의 도메인에 상응하는 도메인을 하나씩 치환하여 3개의 변형 IL-5Rα를 효모 표면에 발현시켰다. mIL-5Rα에서의 서열번호 20번에서 표시되는 도메인 1 (domain 1, D1)은 ASp1에서 Gly103을 나타내고, 도메인 2 (domain 2, D2)는 Ser104에서 Asn220을 나타내며, 도메인 3 (domain 3, D3)는 Pro221에서 Trp321를 나타낸다. 도 7B는 인간 IL-5Rα, 쥐 IL-5Rα, 인간-쥐 변형 IL-5Rα 3종의 발현 모식도를 구체화한 것이다.
[표 10]
IL-5Rα의 효모 발현량을 감지하기 위하여 c-Myc에 결합하는 마우스 항체인 9E10을 1:200을 100μl의 볼륨으로 상온에서 30분 동안 결합시킨 후, 결합되지 않은 항체들은 워싱하였다. Alexa 488이 접합된 항-쥐 IgG 항체 (goat Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG antibody, Thermo)를 4 도에서 15 분 동안 결합시킨 후 유세포 분석기로 분석하였다.
항체의 결합능을 확인하기 위하여 100nM의 항체를 107개의 효모와 상온에서 30분간 결합시킨다. 이후 Alexa 488이 접합된 항-쥐 IgG 항 체(goat Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG antibody, Thermo)를 4 도에서 15 분 동안 결합시킨 후 유세포 분석기로 분석하였다.
그 결과 도 7C에서 보는 바와 같이, 벤랄리주맙 유사체는 인간 IL-5Rα가 발현된 효모에는 결합능을 보이고 마우스 IL-5Rα에는 결합능을 가지지 않는다. 또한 이전 결과와 마찬가지로 인간 IL-5Rα의 도메인 1 (domain 1, D1)을 포함하는 인간 IL-5Rα와 hD1-mD2-mD3 IL-5Rα 변형 IL-5Rα에 결합능을 보였다. 5R65 항체 역시 인간 IL-5Rα가 발현된 효모에는 결합능을 보이고 쥐 IL-5Rα에는 결합능을 가지지 않았다. 그러나 벤랄리주맙 유사체와는 달리 인간 IL-5Rα의 도메인 3 (domain 3, D3)을 포함하는 인간 IL-5Rα와 mD1-mD2-hD3 IL-5Rα 변형 IL-5Rα에 결합능을 보였다.
이는 5R65가 벤랄리주맙 유사체와는 다른 에피토프를 가지고 있음을 나타낸다. 구체적으로 5R65는 세포막과 근접한 도메인 (membrane-proximal domain)인 D3에 에피토프를 가지고, 벤랄리주맙 유사체는 세포막과 먼 도메인 (membrane-distal domain)인 D1에 에피토프를 가진다. 5R65의 경우 벤랄리주맙 유사체보다 약 2배정도 높은 친화도를 가지고 있음에도 불구하고 비슷한 수준의 IL-5의 생물활성 저해도를 가진다고 여겨진다. 따라서 벤랄리주맙 유사체보다 더 높은 수준의 IL-5 생물 활성 저해도를 가지기 위해서는 더 높은 수준의 친화도를 가져야 한다고 가정하고 한 차례의 친화도 성숙과정을 더 수행하였다.
실시예 17: 5R65 항체 기반 추가 친화도 개량을 위한 고다양성 항체 라이브러리 구축 및 선별
VL-CDR3와 VH-CDR3를 동시에 다양화하여 친화도 성숙을 위한 라이브러리를 구축하고자 하였다. 일반적으로 인간 생식선 유전자에서 고도로 보존된 VL-CDR3의 잔기 Q89 및 Q90 및 VH-CDR3의 잔기 M100f, D101 및 Y102를 제외하고, 나머지 잔기는 모두 다양화되었다. CDR에서의 돌연변이로 인해, 항원 결합 능력이 상실되거나 모 항체 (5R65)와 다른 에피토프를 가질 수 있다. 이를 최소화하기 위해, 50 % 확률로 5R65의 잔기를 인코딩하는 수동 혼합된 스파이크 올리고 뉴클레오티드를 사용하였다. 이에 대한 모식도를 도 8A에 나타내었다.
항체의 길항 활성을 높이기 위하여 항체가 수용체에 결합한 후 떨어지지 않는 상태를 유지하는 것이 중요하다. 이를 위해서는 Koff rate가 낮은 항체가 필요하기 때문에 카이네틱 스크리닝 (kinetic screening) 방식을 수행하였다. 바이오틴화된 sIL-5Rα에 결합하는 효모는 초기에 1 라운드의 MACS (Magnetic activated cell sorting) 방법으로 스크리닝되었다. 이어 4 라운드의 FACS는 카이네틱 스크리닝 방법으로 스크리닝 하였다.
구체적으로, 라이브러리를 5 nM의 바이오틴화된 sIL-5Rα로 포화시킨 후, 2 배 몰 과량의 비-바이오틴화된 sIL-5Rα가 포함된 1ml 해리 버퍼에 현탁시켜 37 ℃에서 인큐베이션하여 해리 된 바이오틴화 sIL-5Rα가 효모 표면에 다시 결합하는 것을 방지하였다. 해리 시간은 다음 라운드를 진행할 때마다 1 시간씩 증가시켰다. 매시간마다 해리 버퍼는 제거되고 새로운 해리 버퍼로 재현탁되었다. 해리 후에는 scFab의 효모 발현량을 감지하기 위하여 c-Myc에 결합하는 쥐 항체인 9E10을 1:200을 100μl의 볼륨으로 준비하였다. 이후, PE가 접합된 streptavidin (Streptavidin-R-phycoerythrin conjugate (SA-PE), Thermo)과 Alexa 488이 접합된 항-마우스 IgG 항체 (goat Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG antibody, Thermo)를 4 도에서 15 분 동안 결합시킨 후 FACS (fluorescence-activated cell sorting)를 이용하여 scFab의 발현량이 높고, 바이오틴화된 sIL-5Rα와 결합력이 높은 클론을 선별하였다.
결과적으로, 6종의 새로운 클론이 분리되었다. 놀랍게도 모든 클론들은 VL-CDR3 서열은 변이가 들어가지 않았고 VH-CDR3 에만 변이를 가지고 있었다. 이를 다시, 인간 IgG1 형태로 전환하여 정제하였다.
표 11, 표 12은 선별된 6개의 개별 클론의 중쇄 CDR 및 중쇄가변영역의 서열이다.
[표 11]
[표 12]
실시예 18: 5R65 기반 친화도 성숙을 통해 선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 결합능 분석
선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체들 (5R65.7, 5R65.10, 5R65.14, 5R65.18, 5R65.39, 5R65.45)에 대해서 IL-5Rα에 대한 결합력을 더 정량적으로 분석하기 위하여 Octet QKe (ForteBio, USA) 기기를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 의하여 측정하였다. 구체적으로는, 10x 카이네틱 버퍼 (ForteBio, 18-1105)를 PBS에 희석하여 1x 카이네틱 버퍼를 준비한다. 항체를 1x 카이네틱 버퍼에 1㎍/㎖의 농도로 희석하여 준비하고, <실시예 1>에서 정제한 IL-5Rα은 400, 200, 100, 12.5, 6.25 및 0nM의 농도로 1x 카이네틱 버퍼에 순차적으로 희석하여 각 200㎕씩 빛이 통과하지 않는 불투명한 96-웰 플레이트에 넣어주었다. AHC (anti-human IgG Fc capture) 센서 칩이 1x 카이네틱 버퍼, 항체 희석 용액, 1x 카이네틱 버퍼, 항원 희석 용액, 1x 카이네틱 버퍼의 순서로 옮겨가면서 항체에 항원이 결합했다가 떨어질 때 발생하는 굴절률의 변화를 통해 항체의 항원 친화도 (affinity)을 분석하였다. 친화도는 1:1 결합 모델로 Octet Data Analysis software 11.0으로 계산하였다. 그 결과를 도 8B에 나타내었다.
표 13는 Octet QKe를 이용하여 IL-5Rα에 대한 선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 친화도 분석 결과를 나타낸다. IL-5Rα에 대한 친화도(KD)는 4.64-8.64 nM 수준으로 모두 한 자릿수의 친화도를 나타내며 모 항체인 5R65보다 높아졌음이 확인되었다.
[표 13]
실시예 19: 친화도가 향상된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 도메인 맵핑
IL-5Rα의 효모 발현량을 감지하기 위하여 c-Myc에 결합하는 마우스 항체인 9E10을 1:200을 100μl의 볼륨으로 상온에서 30분 동안 결합시킨 후, 결합되지 않은 항체들은 워싱하였다. Alexa 488이 접합된 항-마우스 IgG 항체 (goat Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG antibody, Thermo)를 4℃에서 15 분 동안 결합시킨 후 유세포 분석기로 분석하였다.
항체의 결합능을 확인하기 위하여 100nM의 항체를 107개의 효모와 상온에서 30분간 결합시킨다. 이후 Alexa 488이 접합된 항-쥐 IgG 항체 (goat Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG antibody, Thermo)를 4℃ 에서 15 분 동안 결합시킨 후 유세포 분석기로 분석하였다.
그 결과 도 8C에서 보는 바와 같이, 5R65를 기반으로 친화도가 성숙된 항체들은 5R65와 마찬가지로 인간 IL-5Rα와 mD1-mD2-hD3 IL-5Rα를 발현한 효모에 결합능을 보여 세포막에 근접한 도메인(membrane-proximal domain)인 D3에 에피토프를 가지고 있어 세포막과 먼 도메인 (membrance-distal domain)에 에피토프를 가지는 벤랄리주맙 유사체와는 다른 에피토프를 가지고 있음을 나타낸다.
실시예 20: 친화도가 향상된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 TF-1/IL-5Rα 세포주에서의 IL-5 의존성 증식 억제능 비교
IL-5Rα을 안정적으로 발현하는 형질 전환된 TF-1 세포 (TF-1/IL-5Rα cell) 2x104 개를 96-웰 플레이트에 100μl씩 분주하였다. 동일한 날에 50μl의 320 pM의 IL-5과 미리 128nM에서 2배씩 희석한 항-IL-5Rα항체 용액 50 μl의를 첨가한 후, 96-웰 플레이트를 37℃ 및 5％ CO2에서 40시간 배양시켰다. 세포의 증식능을 측정하기 위하여, 각 웰로부터 100㎕의 세포현탁액을 회수한후 100㎕의 셀타이터-글로 (CellTiter-Gloㄾ) 프로메가사 제) 시료를 넣어주고 실온에서 20 분간 반응시켜 CytationTM 3 cell Imaging multi-mode reader로 분석하였다 (도 8D). 그 결과 벤랄리주맙 아날로그는 Absolute IC50 (Abs IC50) 값이 1.99 nM를 나타내며, 선별된 항-IL-5Rα 항체들 (5R65.7, 5R65.10, 5R65.14, 5R65.18, 5R65.39, 5R65.45)은 0.57 nM에서 1.34 nM의 범위에서 Abs IC50를 가져 벤랄리주맙 아날로그 보다 TF-1/IL-5Rα 세포주에서의 IL-5 의존성 증식 억제능이 향상됨을 알 수 있다. 특히 5R65.7이 가장 강한 증식 억제능을 나타내었다 (도 8D).
실시예 21: 건강한 기증자와 중증 천식 환자 유래 인체 과립구에서의 IL-5Rα 발현 확인
호산구를 이용한 항- IL-5Rα 항체들의 생물학적 활성을 평가하기에 앞서 건강한 기증자의 말초혈액에서 과립구 층에 있는 호산구와 호중구의 IL-5Rα의 발현을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 50㎖ 용량의 폴리프로필렌 원심관에 Ficoll-Paque solution (GE Healthcare, 17-5442-03)를 20㎖씩 분주하여 각각에 헤파린 처리를 한 건강한 기증자 혈액 20㎖을 중층하였다. 이것을 879Xg, 실온에서 25 분간 원심분리하여 가장 아래층을 분리, 회수하였다. 2% 덱스트란 용액을 분주하여 적혈구(하층)과 과립구(상층)을 분리하고 그 중 과립구 층을 회수하여 거기에 혼재하는 적혈구를 제거할 목적으로 27㎖ 멸균시킨 물과 3㎖ 10x HBSS를 분주하였다. 300Xg, 4℃에서 10 분간 원심 분리하여 적혈구를 제거한 과립구 (호산구, 호중구)가 농축된 층을 분리, 회수하였다.
농축된 과립구는 Siglec-8 (sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 8)의 발현에 따라 호산구와 호중구로 구분할 수 있다. 호산구는 Siglec-8을 발현하고 있으며 호중구는 발현하지 않는다. 구체적으로, 각 기증자 샘플 당 1X106 개의 농축된 과립구 세포와 5μl의 APC anti-human Siglec-8 Ab (Biolegen; 347105)와 0.5μl의 PE anti-human IL-5Rα Ab (BD Pharmingen; 555902)을 혼합하여 4℃에서 30분간 반응시키고 PBSM (Miltenyli biotec;130-091-221)으로 세척 후, 유세포 분석기기인 FACS Calibur (BD Bioscience)로 분석하였다. 분석 후, 각각의 샘플에 대한 점 그래프를 얻었다.
도 9는 건강한 기증자 유래 농축된 과립구 세포들에서 호산구와 호중구를 siglec-8의 발현 유무에 따라 구분한 게이팅 전략과 호산구 (도 9A) 호중구 (도 9B)에서의 IL-5Rα의 발현을 확인한 결과이다. 도 10는 중증 천식 환자 유래 농축된 과립구 세포들에서 호산구와 호중구를 siglec-8의 발현 유무에 따라 구분한 게이팅 전략과 호산구 (도 10A) 호중구 (도 10B)에서의 IL-5Rα의 발현을 확인한 결과이다. 도 11A는 도 10과 도 9에서 확인한 농축된 과립구 세포에서의 호산구와 호중구의 비율을 나타낸다. 중증 천식 환자에서는 호산구의 비율은 건강한 기증자에 비하여 유의미하게 높았고, 호중구의 비율은 유의미하게 낮았다. 도 11B에서 호중구는 거의 IL-5Rα를 발현하지 않고 IL-5Rα를 발현하는 호산구의 비율은 중증 천식환자와 건강한 기증자에서 차이가 없지만, 발현 정도는 중증 천식 환자가 더 높다는 것을 확인하였다 (도 11C).
실시예 22: 친화도가 향상된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 건강한 기증자 및 중증 천식 환자 유래 인체 호산구의 증식 억제능 평가
상기 실시예 15에서 수행하였던 호산구의 증식 억제능을 친화도가 향상된 항-IL-5Rα 인간화 항체들 중에서 5R65.7 항체에 대해서 다시 수행하였다.
구체적으로, 50㎖ 용량의 폴리프로필렌 원심관에 Ficoll-Paque solution (GE Healthcare, 17-5442-03)를 20㎖씩 분주하여 각각에 헤파린 처리를 한 환자 혈액 20㎖을 중층하였다. 이것을 879 X g, 실온에서 25 분간 원심분리하여 가장 아래층을 분리, 회수하였다. 2% 덱스트란 용액을 분주하여 적혈구(하층)과 과립구 층 (상층)을 분리하고 그 중 과립구 층을 회수하여 거기에 혼재하는 적혈구를 제거할 목적으로 27㎖ 멸균시킨 물과 3㎖ 10XHBSS를 분주하였다. 300Xg, 4℃에서 10 분간 원심분리하여 적혈구를 제거한 농축된 과립구 (호산구, 호중구)를 분리, 회수하였다. 최종적으로 상업적으로 이용가능한 eosinophil Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec; 130-092-010)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 과립구에서 호산구만 정제하였다.
96 웰의 세포 배양용 플레이트에 5x104개/웰의 호산구를 분주하고, 최종농도 100pM의 인체 IL-5을 첨가하고 또한 최종농도 5nM, 20nM, 100nM의 항-IL-5Rα 항체들을 각각 첨가하였다. 각 항체에 대하여 2-3웰 배양하고 각 웰의 용량은 최종적으로 200㎕로 되도록 조제하였다. CO2인큐베이터 37℃에서 2 일간 배양하고, 배양 종료 후 각 웰로부터 100㎕의 세포현탁액을 회수한 후 100㎕의 셀타이터-글로 (CellTiter-Gloㄾ 프로메가사 제) 시료를 넣어주고 실온에서 20 분간 인큐베이션한다. 마이크로플레이트 측정기로 발광을 측정하여 호산구의 증식능을 분석한다.
분석 결과 5R65.7이 가장 강한 호산구 증식 억제능을 보였으며 이는 벤랄리주맙 유사체보다도 높았다 (도 12). 중증 천식 환자 유래 호산구 (도 12B)에 대한 항체들의 효과는 건강한 기증자 유래 호산구 (도 12A)에 비하여 낮았다. 이는 중증 천식 환자들의 호산구에서의 IL-5Rα의 발현이 건강한 기증자보다 높았기 때문에 IL-5에 의한 신호전달이 더 강하게 가는 것이라 유추된다.
실시예 23: 친화도가 향상된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 건강한 기증자 및 중증 천식 환자 유래 인체 호산구의 항체-의존적 세포 독성 유도능 평가
벤랄리주맙은 afucosylated Fc를 가지고 있어 IgG1 Fc 보다 NK cell 등에 발현된 FcγRIIIa와의 친화력이 높아 더 높은 ADCC 활성을 나타낼 수 있다. 높은 ADCC 활성으로 인해 벤랄리주맙은 효과적으로 천식 환자 내의 호산구의 수를 감소시킬 수 있다. 본 발명자들은 afucosylated 항체를 생산하기 위한 설비를 갖추고 있지 않기 때문에 IgG1 Fc를 가지는 벤랄리주맙 유사체를 역시 동일한 IgG1 Fc를 가지는 항-IL-5Rα 인간화 항체들 (5R65, 5R65.7)과의 활성을 비교하였다.
도 13A의 벤랄리주맙 유사체와 5R65, 5R65.7이 IL-5Rα에 결합하여 ADCC를 나타내는 모식도이다. 벤랄리주맙 유사체는 IL-5Rα의 D1에 결합하고 5R65, 5R65.7은 D3에 결합한다. 이전 연구에서 이펙터 세포 (ex. NK cell)과 표적 세포 (ex. 호산구)의 거리 (Immunological synapse)가 가까울수록 더 높은 ADCC 활성을 나타낸다는 보고가 있어 5R65, 5R65.7에게서 더 높은 ADCC 활성이 기대된다.
구체적으로 50㎖ 용량의 폴리프로필렌 원심관에 Ficoll-Paque solution (GE Healthcare, 17-5442-03)를 20㎖씩 분주하여 각각에 헤파린 처리를 한 환자 혈액 20㎖을 중층하였다. 이것을 879 X g, 실온에서 25 분간 원심분리하여 NK 세포 단리를 위해 버피코트층을 분리, 회수하고 호산구 단리를 위해 가장 아래층을 분리, 회수하였다. 단리된 일차 NK 세포 및 호산구를 각기 5:1의 비로 이펙터 및 표적 세포로서 사용하였다. 96 웰의 세포 배양용 플레이트에 5 x 104개/웰의 호산구와 2.5 x 105개/웰의 일차 NK 세포를 분주하고 최종농도 100pM의 인체 IL-5을 첨가한다. 또한 최종농도 1μM의 각종 친화도를 향상시킨 항-IL-5Rα 항체를 각각 첨가하였다. 각 항체에 대하여 2웰 배양하고 각 웰의 용량은 최종적으로 200㎕로 되도록 조제하였다. CO2인큐베이터 37℃에서 20 시간 배양하고, 세포현탁액을 회수하기 2시간 전에 20㎕ 용해용액을 최대 Lactate DeHydrogenase (LDH) 유출시킬 샘플에 넣어준다. 배양 종료후 각 웰로부터 50㎕의 세포현탁액을 회수한후 50㎕의 사이토톡스96 (CytoTox96ㄾ Reagent) 프로메가사 제) 시료를 넣어주고 실온에서 30 분간 인큐베이션하였다. 50㎕의 반응정지액을 넣어주고 마이크로플레이트 측정기로 흡광을 측정하여 항체-의존적 세포 독성 유도능을 분석한다. Y 및 X 축은 각기 % 최대 세포독성 및 항체 농도를 나타낸다.
세포 독성(%) = (A-B)/(C-B) X 100
A : 항체 처리시 방출값
B : 세포 자발적인 방출값
C : 세포 최대 방출값
분석결과, 건강한 기증자와 중증 천식 환자 유래 호산구에서 5R65, 5R65.7의 항체 의존적 세포독성 유도능은 벤랄리주맙 유사체보다 높았으며 특히 5R65.7이 가장 강한 유도능을 보였다. 이는 정량화한 그래프로 확인할 수 있다 (도 13B).
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Antibody Binding to human IL-5R alpha and Uses Thereof <130> 214 <160> 32 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> m2B7 VH <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Tyr Pro Ser Glu Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu2B7 VH <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Tyr Pro Ser Glu Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CDR1 Sequence <400> 3 Ser Tyr Trp Ile Asn 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CDR2 Sequence <400> 4 His Ile Tyr Pro Ser Glu Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CDR3 Sequence <400> 5 Asp Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> m2B7 VL <400> 6 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Phe Gly Arg Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu2B7 VL <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Arg Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Val Lys 100 105 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CDR1 Sequence <400> 8 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala Trp Ala Ser Thr Arg 1 5 10 15 His Thr Gln Gln Phe Gly Arg Tyr Pro Tyr Thr 20 25 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CDR2 Sequence <400> 9 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CDR3 Sequence <400> 10 Gln Gln Phe Gly Arg Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 11 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Tyr Pro Asn Lys Asn Glu Asn Tyr Tyr Asn His Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Tyr Pro Thr Ala Thr Ile Ala Val Tyr Asn Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Tyr Pro Gln Lys Thr Leu Thr Ile Tyr Asn His Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Tyr Pro Thr Ser Ser Val Lys Phe Tyr Asn Asn Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CDR2 Sequence <400> 15 His Ile Tyr Pro Asn Lys Asn Glu Asn Tyr Tyr Asn His Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CDR2 Sequence <400> 16 His Ile Tyr Pro Thr Ala Thr Ile Ala Val Tyr Asn Asp Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CDR2 Sequence <400> 17 His Ile Tyr Pro Gln Lys Thr Leu Thr Ile Tyr Asn His Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CDR2 Sequence <400> 18 His Ile Tyr Pro Thr Ser Ser Val Lys Phe Tyr Asn Asn Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 19 <211> 322 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-5R alpha <400> 19 Asp Leu Leu Pro Asp Glu Lys Ile Ser Leu Leu Pro Pro Val Asn Phe 1 5 10 15 Thr Ile Lys Val Thr Gly Leu Ala Gln Val Leu Leu Gln Trp Lys Pro 20 25 30 Asn Pro Asp Gln Glu Gln Arg Asn Val Asn Leu Glu Tyr Gln Val Lys 35 40 45 Ile Asn Ala Pro Lys Glu Asp Asp Tyr Glu Thr Arg Ile Thr Glu Ser 50 55 60 Lys Cys Val Thr Ile Leu His Lys Gly Phe Ser Ala Ser Val Arg Thr 65 70 75 80 Ile Leu Gln Asn Asp His Ser Leu Leu Ala Ser Ser Trp Ala Ser Ala 85 90 95 Glu Leu His Ala Pro Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Ile Val Asn Leu 100 105 110 Thr Cys Thr Thr Asn Thr Thr Glu Asp Asn Tyr Ser Arg Leu Arg Ser 115 120 125 Tyr Gln Val Ser Leu His Cys Thr Trp Leu Val Gly Thr Asp Ala Pro 130 135 140 Glu Asp Thr Gln Tyr Phe Leu Tyr Tyr Arg Tyr Gly Ser Trp Thr Glu 145 150 155 160 Glu Cys Gln Glu Tyr Ser Lys Asp Thr Leu Gly Arg Asn Ile Ala Cys 165 170 175 Trp Phe Pro Arg Thr Phe Ile Leu Ser Lys Gly Arg Asp Trp Leu Ala 180 185 190 Val Leu Val Asn Gly Ser Ser Lys His Ser Ala Ile Arg Pro Phe Asp 195 200 205 Gln Leu Phe Ala Leu His Ala Ile Asp Gln Ile Asn Pro Pro Leu Asn 210 215 220 Val Thr Ala Glu Ile Glu Gly Thr Arg Leu Ser Ile Gln Trp Glu Lys 225 230 235 240 Pro Val Ser Ala Phe Pro Ile His Cys Phe Asp Tyr Glu Val Lys Ile 245 250 255 His Asn Thr Arg Asn Gly Tyr Leu Gln Ile Glu Lys Leu Met Thr Asn 260 265 270 Ala Phe Ile Ser Ile Ile Asp Asp Leu Ser Lys Tyr Asp Val Gln Val 275 280 285 Arg Ala Ala Val Ser Ser Met Cys Arg Glu Ala Gly Leu Trp Ser Glu 290 295 300 Trp Ser Gln Pro Ile Tyr Val Gly Asn Asp Glu His Lys Pro Leu Arg 305 310 315 320 Glu Trp <210> 20 <211> 321 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mIL-5R alpha D1 <400> 20 Asp Leu Leu Asn His Lys Lys Phe Leu Leu Leu Pro Pro Val Asn Phe 1 5 10 15 Thr Ile Lys Ala Thr Gly Leu Ala Gln Val Leu Leu His Trp Asp Pro 20 25 30 Asn Pro Asp Gln Glu Gln Arg His Val Asp Leu Glu Tyr His Val Lys 35 40 45 Ile Asn Ala Pro Gln Glu Asp Glu Tyr Asp Thr Arg Lys Thr Glu Ser 50 55 60 Lys Cys Val Thr Pro Leu His Glu Gly Phe Ala Ala Ser Val Arg Thr 65 70 75 80 Ile Leu Lys Ser Ser His Thr Thr Leu Ala Ser Ser Trp Val Ser Ala 85 90 95 Glu Leu Lys Ala Pro Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Val Thr Asn Leu 100 105 110 Thr Cys Thr Thr His Thr Val Val Ser Ser His Thr His Leu Arg Pro 115 120 125 Tyr Gln Val Ser Leu Arg Cys Thr Trp Leu Val Gly Lys Asp Ala Pro 130 135 140 Glu Asp Thr Gln Tyr Phe Leu Tyr Tyr Arg Phe Gly Val Leu Thr Glu 145 150 155 160 Lys Cys Gln Glu Tyr Ser Arg Asp Ala Leu Asn Arg Asn Thr Ala Cys 165 170 175 Trp Phe Pro Arg Thr Phe Ile Asn Ser Lys Gly Phe Glu Gln Leu Ala 180 185 190 Val His Ile Asn Gly Ser Ser Lys Arg Ala Ala Ile Lys Pro Phe Asp 195 200 205 Gln Leu Phe Ser Pro Leu Ala Ile Asp Gln Val Asn Pro Pro Arg Asn 210 215 220 Val Thr Val Glu Ile Glu Ser Asn Ser Leu Tyr Ile Gln Trp Glu Lys 225 230 235 240 Pro Leu Ser Ala Phe Pro Asp His Cys Phe Asn Tyr Glu Leu Lys Ile 245 250 255 Tyr Asn Thr Lys Asn Gly His Ile Gln Lys Glu Lys Leu Ile Ala Asn 260 265 270 Lys Phe Ile Ser Lys Ile Asp Asp Val Ser Thr Tyr Ser Ile Gln Val 275 280 285 Arg Ala Ala Val Ser Ser Pro Cys Arg Met Pro Gly Arg Trp Gly Glu 290 295 300 Trp Ser Gln Pro Ile Tyr Val Gly Lys Glu Arg Lys Ser Leu Val Glu 305 310 315 320 Trp <210> 21 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Tyr Pro Asn Lys Asn Glu Asn Tyr Tyr Asn His Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Phe Tyr Gly Arg Gln Tyr Tyr Gln Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Tyr Pro Asn Lys Asn Glu Asn Tyr Tyr Asn His Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Ala Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Tyr Pro Asn Lys Asn Glu Asn Tyr Tyr Asn His Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu His Tyr Gly Arg Pro Tyr Tyr Asn Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Tyr Pro Asn Lys Asn Glu Asn Tyr Tyr Asn His Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Tyr Tyr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 25 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Tyr Pro Asn Lys Asn Glu Asn Tyr Tyr Asn His Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Phe Tyr Gly Arg Ser Arg Tyr Ser Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Tyr Pro Asn Lys Asn Glu Asn Tyr Tyr Asn His Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Asn Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 27 Glu Phe Tyr Gly Arg Gln Tyr Tyr Gln Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 28 Glu Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Ala Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 29 Glu His Tyr Gly Arg Pro Tyr Tyr Asn Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 30 Glu Tyr Tyr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 31 Glu Phe Tyr Gly Arg Ser Arg Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 <400> 32 Glu Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Asn Ala Met Asp Tyr 1 5 10

Claims (15)

  1. 서열번호 19로 표시되는 인간 IL-5 수용체 알파 서브유닛(IL-5Rα)의 서열 중 도메인 3(domain 3, D3)에 해당하는 아미노산 잔기 221번 내지 322 위치로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 에피토프로 인식하는, 인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 4, 15 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR2, 서열번호 5, 27 내지 32 로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3를 포함하는, 인간 IL-5 수용체 알파 서브유닛(IL-5Rα)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 4의 중쇄 CDR2, 서열번호 5의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
    서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 5의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
    서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 16의 중쇄 CDR2, 서열번호 5의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
    서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 17의 중쇄 CDR2, 서열번호 5의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
    서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 18의 중쇄 CDR2, 서열번호 5의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
    서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 27의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
    서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 28의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
    서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 29의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
    서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 30의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3;
    서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 31의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3; 또는
    서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 중쇄 CDR2, 서열번호 32의 중쇄 CDR3 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2, 서열번호 10의 경쇄 CDR3를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 1, 2, 11-14, 21-26으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 6 또는 7의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산.
  7. 제6항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
  8. 제7항의 발현벡터로 형질전환된 세포.
  9. 다음 단계를 포함하는 인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법:
    (a) 제8항의 세포를 배양하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편 및 이에 연결된 생체활성분자를 포함하는 접합체.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이항체.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환은 과호산구증후군(Hypereosinophilic syndrome, HES); 과호산구증가증(hypereosinophilia); 호산구성 천식 (eosinophilic asthma), 호산구성 기관지 천식 (eosinophilic bronchial asthma, ABA) 및 중증 호산 구성 기관지 천식 (severe eosinophilic bronchial asthma, ABA) 등의 천식; 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) ; Cherge-Strauss 증후군; 호산구성 식도염 (eosinophilic esophagitis); 호산구성 위장염 (eosinophilic gastroenteritis); 호산구성 위장관병(EGID); 아토피 피부염(Atopic Dermatitis) 등의 아토피 질환(atopic disease); 알레르기성 비염(allergic rhinitis) 등의 알레르기 질환(allergic disease); 면역글로불린(IgE)-매개 식품 알레르기; 염증성 장 질환, 알레르기성 대장염; 위식도 역류; 심내막심근 섬유증; 뢰플러 심장내막염; 데이비스병; 호산구증가증과 관련된 간헐 맥관부종; 호산구증 가증-근육통 증후군/스페인 독성 오일 증후군(Spanish Toxic Oil Syndrome); 간경변증; 피부염 농가진; 수포성 유천포창; 척-스트라우스 증후군; 급성 골수성 호산구성 백혈병; 급성 림프구성 호산구성 백혈병; 호산구증가증 동반의 전신성 비만세포병; 습진; 베그너 육이종증; 결절다발 동맥염; 호산구성 혈관염; 및 류마티스성 관절염으로 구성된 군에서 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 진단용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환은 과호산구증후군(Hypereosinophilic syndrome, HES); 과호산구증가증(hypereosinophilia); 호산구성 천식 (eosinophilic asthma), 호산구성 기관지 천식 (eosinophilic bronchial asthma, ABA) 및 중증 호산 구성 기관지 천식 (severe eosinophilic bronchial asthma, ABA) 등의 천식; 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) ; Cherge-Strauss 증후군; 호산구성 식도염 (eosinophilic esophagitis); 호산구성 위장염 (eosinophilic gastroenteritis); 호산구성 위장관병(EGID); 아토피 피부염(Atopic Dermatitis) 등의 아토피 질환(atopic disease); 알레르기성 비염(allergic rhinitis) 등의 알레르기 질환(allergic disease); 면역글로불린(IgE)-매개 식품 알레르기; 염증성 장 질환, 알레르기성 대장염; 위식도 역류; 심내막심근 섬유증; 뢰플러 심장내막염; 데이비스병; 호산구증가증과 관련된 간헐 맥관부종; 호산구증 가증-근육통 증후군/스페인 독성 오일 증후군(Spanish Toxic Oil Syndrome); 간경변증; 피부염 농가진; 수포성 유천포창; 척-스트라우스 증후군; 급성 골수성 호산구성 백혈병; 급성 림프구성 호산구성 백혈병; 호산구증가증 동반의 전신성 비만세포병; 습진; 베그너 육이종증; 결절다발 동맥염; 호산구성 혈관염; 및 류마티스성 관절염으로 구성된 군에서 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.

KR1020200117668A 2020-09-14 2020-09-14 인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 및 이의 용도 KR102697770B1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200117668A KR102697770B1 (ko) 2020-09-14 2020-09-14 인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 및 이의 용도
PCT/KR2021/012345 WO2022055300A1 (ko) 2020-09-14 2021-09-10 인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 및 이의 용도
US18/025,833 US20230416380A1 (en) 2020-09-14 2021-09-10 ANTIBODY BINDING HUMAN IL-5R alpha AND USE THEREOF
EP21867165.9A EP4212551A4 (en) 2020-09-14 2021-09-10 ANTIBODIES AGAINST HUMAN IL-5R AND USE THEREOF

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200117668A KR102697770B1 (ko) 2020-09-14 2020-09-14 인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220035656A true KR20220035656A (ko) 2022-03-22
KR102697770B1 KR102697770B1 (ko) 2024-08-23

Family

ID=80630324

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200117668A KR102697770B1 (ko) 2020-09-14 2020-09-14 인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 및 이의 용도

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230416380A1 (ko)
EP (1) EP4212551A4 (ko)
KR (1) KR102697770B1 (ko)
WO (1) WO2022055300A1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030096977A1 (en) * 1995-09-11 2003-05-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody against human interleukin-5 receptor alpha chain
KR20070114765A (ko) * 2005-02-23 2007-12-04 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 생물학적 활성을 조절하기 위한 이특이성 결합제
KR20160010891A (ko) * 2007-05-14 2016-01-28 메디뮨 엘엘씨 호산구 수준을 감소시키는 방법
KR20200058537A (ko) * 2017-10-03 2020-05-27 조인트 스탁 컴퍼니 "바이오케드" IL-5Rα에 대한 단일클론 항체

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050226867A1 (en) * 2003-10-08 2005-10-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. IL-5R-specific antibody composition

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030096977A1 (en) * 1995-09-11 2003-05-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody against human interleukin-5 receptor alpha chain
KR20070114765A (ko) * 2005-02-23 2007-12-04 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 생물학적 활성을 조절하기 위한 이특이성 결합제
KR20160010891A (ko) * 2007-05-14 2016-01-28 메디뮨 엘엘씨 호산구 수준을 감소시키는 방법
KR20200058537A (ko) * 2017-10-03 2020-05-27 조인트 스탁 컴퍼니 "바이오케드" IL-5Rα에 대한 단일클론 항체

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ISHINO ET AL., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 280(24), PP.22951~22961, 2005.04.12 *
KOLBECK ET AL., JOURNAL OF ALLERGY AND CLINICAL IMMUNOLOGY, 125(6), PP.1344~1353, 2010.05.31* *
KUSANO ET AL., PROTEIN SCIENCE, 21(6), PP.850~864, 2012.03.30 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102697770B1 (ko) 2024-08-23
EP4212551A4 (en) 2024-09-25
EP4212551A1 (en) 2023-07-19
US20230416380A1 (en) 2023-12-28
WO2022055300A1 (ko) 2022-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3878868B1 (en) Human antibody having high affinity to human il-4 receptor alpha, and use thereof
CA2919790C (en) Anti-cxcr4 antibodies and antibody-drug conjugates
EP2793940B1 (en) Surrogate binding proteins
JP2019509021A (ja) Ｒｏｒ１抗体組成物及び関連の方法
KR20170099918A (ko) 항-axl 길항성 항체
KR20190021244A (ko) 항-axl 길항성 항체
KR20220113353A (ko) Ceacam5 및 cd3에 대한 이중특이적 항체
EP4209513A1 (en) Anti-vegf-anti-pd-l1 bispecific antibody, pharmaceutical composition of same, and uses thereof
KR20220147642A (ko) Il4r에 결합하는 항체 및 이의 용도
EP3778636A1 (en) Anti-cd27 antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof
KR20200128544A (ko) Pd1 결합제
WO2013079973A1 (en) Antibodies against hgf - receptor and uses
KR20230125042A (ko) 항-tslp 나노항체 및 이의 응용
CN116059341A (zh) 药物组合物及用途
KR20210121102A (ko) 항-cd79b 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 이의 약학적 용도
KR20240052881A (ko) Pmel17에 대한 항체 및 이의 접합체
KR102697769B1 (ko) 인터루킨-4 수용체 알파 서브유닛과 인터루킨-5 수용체 알파 서브유닛에 동시에 결합하는 이중특이항체 및 이의 용도
KR102697770B1 (ko) 인간 IL-5Rα에 결합하는 항체 및 이의 용도
KR101804988B1 (ko) 신규 항-tfpi 항체 및 이를 포함하는 조성물
JP2023551113A (ja) 二重特異性抗体及びその応用
TWI843182B (zh) 一種抗b7-h4抗體及其製備方法和應用
KR20170076332A (ko) 항 Ang2 항체를 포함하는 면역강화제
TW202337908A (zh) 抗b7-h7抗體或其抗原結合片段及製備方法與應用
TW202430573A (zh) 針對pmel17之抗體及其軛合物
CN117843781A (zh) Cd138抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant