KR20230125042A - 항-tslp 나노항체 및 이의 응용 - Google Patents

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상하이 노바맙 바이오파아슈티컬 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 항-TSLP 나노항체 및 이의 응용체를 제공한다. 본 발명은 항-TSLP 나노항체를 제공하며, 본 발명은 상기 나노항체를 코딩하는 코딩 서열, 대응하는 발현 벡터 및 상기 나노항체를 발현할 수 있는 숙주 세포, 및 본 발명의 나노항체의 생성 방법을 더 제공한다. 본 발명의 나노항체는 양호한 TSLP/TSLPR 차단 활성을 가지며; 본 발명의 나노항체는 피키아 파스토리스(pichia pastoris)에 의해 발현되며, 발효 탱크에서 이의 발현 생산량은 17-23g/L에 달할 수 있다.

Description

항-TSLP 나노항체 및 이의 응용
본 발명은 바이오의학 또는 바이오제약 기술분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로 항-TSLP 나노항체 및 이의 응용에 관한 것이다.
최근 몇 년간, 중등도에서 중증 천식 치료 경로는 Th2 세포를 제어하려는 반응에 초점을 맞추었다. 중증 천식 치료에 사용되는 대부분의 항체 약물은 Th2 경로를 표적으로 하는 IgE(오말리주맙(omalizumab)), IL5(메폴리주맙(Mepolizumab), 렐리주맙(relizumab)), IL5R(벤라리주맙(benralizumab)), IL4R(두필루맙(Dupilumab)) 등이다. 이상 약물은 모두 과호산구성 천식에 양호한 조절 효과가 있으며 모두 피하 또는 정맥 주사로 치료한다. 중증 천식 환자의 약 3분의 1은 Th2 염증 경로 활성화의 특징이 없으며, 현재 확립된 표준 간호 치료에서 이러한 비 Th2 기반 질병이 통제되지 않는 환자에 대한 생물학적 치료 옵션이 없으므로 새로운 치료 경로의 개발이 시급하다.
흉선기질림프포이에틴(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)은 4개의 나선 다발 접힘 구조를 가진 단쇄 사이토카인이며 IL-2 사이토카인 계열에 속한다. TSLP는 전 염증성 자극(예를 들어, 폐 알레르겐, 바이러스 및 기타 병원체)에 반응하여 생성되는 상피 사이토카인이며 기도 염증의 발생 및 지속에서 중요한 역할을 한다. TSLP는 IL-4, IL-5 및 IL-13을 포함한 다운스트림 Th2 사이토카인의 방출을 유도하여 염증 및 천식 증상을 유발한다. TSLP는 또한 비 Th2 유발 염증과 관련된 다양한 세포 유형을 활성화할 수 있다. 따라서, 염증 캐스케이드 반응에서 TSLP의 초기 업스트림 활성은 광범위한 천식 환자 집단에서 잠재적 표적으로 확인되었다. TSLP를 차단하면 면역 세포가 전 염증성 사이토카인을 방출하는 것을 방지하여 천식 악화를 예방하고 천식 조절 및 만성 폐쇄성 폐질환과 같은 관련 질병을 개선한다.
나노항체(nanobody, Nb) 즉 중쇄 나노항체(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody, VHH)-낙타 체내에는 선천적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체(heavy-chain antibody, HCAb)가 존재하며, 이의 가변 영역을 클로닝하여 얻은 나노항체는 하나의 중쇄 가변 영역으로만 조성되며, 현재 얻을 수 있는 완벽한 기능을 가진 안정적이며 항원에 결합 가능한 최소 단위이다. 나노항체는 안정성이 높고 수용성이 좋으며 인간화가 간단하고 표적성이 높으며 침투성이 강한 등 특성을 가지며, 면역 실험, 진단 및 치료에서 상상을 초월하는 큰 기능을 발휘한다. 나노항체는 점차 차세대 항체 요법에서의 새로운 힘이 되고 있다.
따라서, 본 분야는 차단 활성이 양호하고, 임상 약효가 좋으며, 생산이 용이한 항-TSLP 나노항체를 개발하는 것이 시급하다.
본 발명의 목적은 차단 활성이 양호하고, 임상 약효가 좋으며, 생산이 용이한 항-TSLP 나노항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태는 항-TSLP 나노항체를 제공하며, 상기 나노항체 중의 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)은,
(1) 서열번호 1로 표시되는 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 3으로 표시되는 CDR3;
(2) 서열번호 14로 표시되는 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 16으로 표시되는 CDR3; 및
(3) 서열번호 27로 표시되는 CDR1, 서열번호 28로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 29로 표시되는 CDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3은 VHH 사슬의 프레임 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)에 의해 분리된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 VHH 사슬은 프레임 영역(FR)을 더 포함하고, 상기 프레임 영역(FR)은,
(1) 서열번호 4로 표시되는 FR1, 서열번호 5로 표시되는 FR2, 서열번호 6으로 표시되는 FR3, 및 서열번호 7로 표시되는 FR4;
(2) 서열번호 10으로 표시되는 FR1, 서열번호 5로 표시되는 FR2, 서열번호 6으로 표시되는 FR3, 및 서열번호 11로 표시되는 FR4;
(3) 서열번호 17로 표시되는 FR1, 서열번호 18로 표시되는 FR2, 서열번호 19로 표시되는 FR3, 및 서열번호 20으로 표시되는 FR4;
(4) 서열번호 23으로 표시되는 FR1, 서열번호 18로 표시되는 FR2, 서열번호 19로 표시되는 FR3, 및 서열번호 24로 표시되는 FR4;
(5) 서열번호 30으로 표시되는 FR1, 서열번호 31로 표시되는 FR2, 서열번호 32로 표시되는 FR3, 및 서열번호 33으로 표시되는 FR4; 및
(6) 서열번호 36으로 표시되는 FR1, 서열번호 31로 표시되는 FR2, 서열번호 32로 표시되는 FR3, 및 서열번호 37로 표시되는 FR4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 나노항체 VHH 사슬의 CDR 영역은 서열번호 1-3, 서열번호 14-16, 서열번호 27-29 중 어느 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 나노항체 VHH 사슬의 CDR 영역의 아미노산 서열은 서열번호 1-3, 서열번호 14-16, 서열번호 27-29 중 어느 하나와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 바람직하게는 보존된 아미노산 치환을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열은 선택적으로 적어도 하나(예를 들어 1-3개, 비교적 바람직하게는 1-2개, 보다 바람직하게는 1개)의 아미노산의 추가, 결실, 변형 및/또는 치환을 거치고 TSLP에 특이적으로 결합하는 기능을 보유하는 유도체 서열을 더 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 나노항체는 TSLP에 특이적으로 결합할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 나노항체는 TSLP와 TSLPR의 상호 작용을 효과적으로 차단할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TSLP는 인간 또는 비인간 포유동물의 TSLP이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TSLP는 인간, 마우스, 래트 또는 비인간 영장류(예: 원숭이)의 TSLP이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 나노항체는 인간화 항체, 낙타원 항체, 키메라 항체를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 나노항체의 VHH 사슬의 아미노산 서열은 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 34, 서열번호 38, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-TSLP 나노항체는 단량체, 2가체(2가 항체), 4가체(4가 항체), 및/또는 다가체(다가 항체)를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-TSLP 나노항체는 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 34 또는 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VHH 사슬을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-TSLP 나노항체는 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 34, 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 2개의 VHH 사슬을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 VHH 사슬 간에는 연결 펩티드를 통해 연결된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 연결 펩티드는 (GaSb)x의 서열로부터 선택되며, 여기서 a, b, x=0 또는 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10(비교적 바람직하게는, a＝4이고 b＝1, x=4)이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 연결 펩티드의 서열은 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS이다.
본 발명의 제2 양태는 항-TSLP 항체를 제공하며, 이는 TSLP 에피토프에 대한 항체이고, 본 발명의 제1 양태에 따른 항-TSLP 나노항체를 가진다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-TSLP 항체는 하나 이상의 항-TSLP 나노항체를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-TSLP 항체는 단량체, 2가체(2가 항체), 4가체(4가항체), 및/또는 다가체(다가 항체)를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-TSLP 항체는 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 34 또는 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 VHH 사슬을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-TSLP 항체는 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 34 또는 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 2개의 VHH 사슬을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 TSLP에 특이적으로 결합할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 정확한 공간 구조를 가진 TSLP 단백질을 특이적으로 표적화할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 TSLP와 TSLPR의 상호 작용을 효과적으로 차단할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, TSLP에 대한 상기 항체의 친화도(KD값)는 3.77nM보다 작다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 양호한 TSLP/TSLPR 차단 활성을 가지고, 차단 활성은 대조군 항체 Tezepelumab에 비해 현저하게 우수하며, 여기서 대조군 항체 Tezepelumab은 AstraZeneca 또는 Amgen사로부터 입수하였다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 BaF3/TSLPR-IL7R 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있고, 그 억제 활성은 대조군 항체 Tezepelumab에 비해 우위적이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 나노항체이다.
본 발명의 제3 양태는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 제1 양태에 따른 항-TSLP 나노항체 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 항-TSLP 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 조합 형태이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 9, 13, 22, 26, 35 또는 39로 표시되는 서열 중 하나 이상을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA 또는 cDNA를 포함한다.
본 발명의 제4 양태는 본 발명의 제3 양태에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 제공한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 발현 벡터는 DNA, RNA, 바이러스 벡터, 플라스미드, 트랜스포손, 다른 유전자 전달 시스템, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 발현 벡터는 렌티바이러스, 아데노바이러스, AAV 바이러스, 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명의 제5 양태는 숙주 세포를 제공하며, 상기 숙주 세포는 본 발명의 제4 양태에 따른 발현 벡터를 함유하거나, 또는 이의 유전체에 본 발명의 제3 양태에 따른 폴리뉴클레오티드가 통합되어 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 대장균, 효모 세포, 포유동물 세포, 파지, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 원핵 세포는 대장균, 고초균, 유산균, 스트렙토미세스, 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 진핵 세포는 피치아 파스토리스, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로미세스(schizosaccharomyces), 트리코더마, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 숙주 세포는 피치아 파스토리스이다.
본 발명의 제6 양태는 항-TSLP 나노항체 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(a) 나노항체를 생성하기에 적합한 조건에서, 본 발명의 제5 양태에 따른 숙주 세포를 배양함으로써 상기 항-TSLP 나노항체를 함유한 배양물을 획득하는 단계;
(b) 상기 배양물로부터 상기 항-TSLP 나노항체를 분리하거나 회수하는 단계; 및
(c) 선택적으로, 단계 (b)에서 획득한 항-TSLP 나노항체를 정제 및/또는 변형하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 제7 양태는 면역접합체를 제공하며, 상기 면역접합체는,
(a) 본 발명의 제1 양태에 따른 항-TSLP 나노항체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 항-TSLP 항체; 및
(b) 검출 가능한 마커, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성 핵종, 효소, 금 나노입자/나노막대, 자성 나노입자, 바이러스 코트 단백질 또는 VLP, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합 부분을 함유한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 방사성 핵종은 하기 동위원소를 포함하며,
(i) 진단용 동위원소, 상기 진단용 동위원소는 Tc-99m, Ga-68, F-18, I-123, I-125, I-131, In-111, Ga-67, Cu-64, Zr-89, C-11, Lu-177, Re-188, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는
(ii) 치료용 동위원소, 상기 치료용 동위원소는 Lu-177, Y-90, Ac-225, As-211, Bi-212, Bi-213, Cs-137, Cr-51, Co-60, Dy-165, Er-169, Fm-255, Au-198, Ho-166, I-125, I-131, Ir-192, Fe-59, Pb-212, Mo-99, Pd-103, P-32, K-42, Re-186, Re-188, Sm-153, Ra223, Ru-106, Na24, Sr89, Tb-149, Th-227, Xe-133, Yb-169, Yb-177, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 접합 부분은 약물 또는 독소이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약물은 세포 독성 약물이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 세포 독성 약물은 항튜불린 약물, DNA 마이너 그루브 결합시약, DNA 복제 억제제, 알킬화제, 항생제, 엽산 길항제, 항대사제, 화학증감제, 토포이소머라아제 억제제, 빈카 알칼로이드, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 특히 유용한 세포 독성 약물의 예는 DNA 마이너 그루브 결합시약, DNA 알킬화제, 튜불린 억제제를 포함하며, 전형적인 세포 독성 약물은 아우리스타틴(auristatins), 캄프토테신(camptothecins), 듀오카르마이신/베이칸마이신(duocarmycins), 에토포사이드(etoposides), 메이탄신(maytansines) 및 메이탄시노이드(maytansinoids)(예를 들어, DM1 및 DM4), 탁산(taxanes), 벤조디아제핀(benzodiazepines) 또는 벤조디아제핀 함유 약물(benzodiazepine containing drugs)(예를 들어, 피롤로[1,4]벤조디아제핀(PBDs), 인돌리노벤조디아제핀(indolinobenzodiazepines) 및 옥사졸리디노벤조디아제핀(oxazolidinobenzodiazepines)), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids), 또는 이들의 조합을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 독소는 아우리스타틴(예: 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 F, MMAE 및 MMAF), 아우레오마이신(aureomycin), 메이탄시놀(maytansinol), 리신(ricin), 리신 A 사슬, 콤브레타스타틴(combretastatin), 듀오카르마이신(duocarmycin), 멀티카르시노이드 랄라스타틴(multicarcinoid Lalastatin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin), cc1065, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide), 미토마이신(mitomycin), 에토포사이드(etoposide), 테노포사이드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜키신(colchicine), 디히드록시안트락신디온(dihydroxyanthraxindione), 악티노마이신(actinomycin), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin)(PE)A, PE40, 아브린(abrin), 아브린 A 사슬, 시링가 뿌리 독소 A 사슬, α-사르시니아(α-Sarcina), 젤로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(retstrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노노마이신(enonomycin), 쿠리신(curicin), 크로토닌(crotonin), 칼리케아미신(calicheamicin), 사파오나리아 오피시날리스 억제제(Sapaonaria officinalis inhibitor), 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 접합 부분은 검출 가능한 마커이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 접합 부분은 형광 또는 발광 마커, 방사성 마커, MRI(자기 공명 영상) 또는 CT(전자 컴퓨터 X선 단층 촬영 기술) 조영제 또는 검출 가능한 생성물을 생성할 수 있는 효소, 방사성 핵종, 생물독소, 사이토카인(예: IL-2 등), 항체, 항체 Fc 단편, 항체 scFv 단편, 금 나노입자/나노막대, 바이러스 입자, 리포솜, 자성 나노입자, 전구약물 활성화 효소(예: DT-디아포라아제(DTD) 또는 비페닐히드롤라아제 유사 단백질(BPHL)) 또는 임의의 형태의 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제8 양태는 본 발명의 제1 양태에 따른 항-TSLP 나노항체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 항-TSLP 항체를 포함하는 다중특이성 항체를 제공한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 다중특이성 항체는 항체의 Fc 부분을 더 포함한다.
본 발명의 제9 양태는 재조합 단백질을 제공하며, 상기 재조합 단백질은,
(i) 본 발명의 제1 양태에 따른 항-TSLP 나노항체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 항-TSLP 항체; 및
(ii) 발현 및/또는 정제를 돕기 위한 선택적인 태그 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 태그 서열은 Fc 태그, HA 태그 및 6His 태그를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 재조합 단백질은 TSLP 단백질에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 제10 양태는 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학적 조성물은,
(i) 본 발명의 제1 양태에 따른 항-TSLP 나노항체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 항-TSLP 항체, 또는 본 발명의 제7 양태에 따른 면역접합체 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 다중특이성 항체 또는 본 발명의 제9 양태에 따른 재조합 단백질; 및
(ii) 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 면역접합체의 접합 부분은 약물, 독소, 및/또는 치료용 동위원소이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물에는 면역계 질환 또는 종양 질환을 치료하는 다른 약물이 더 함유된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 면역계 질환 또는 종양 질환을 치료하는 다른 약물은, 부데소니드(budesonide), 플루티카손(fluticasone), 베클로메타손(beclomethasone), 모메타손 푸로에이트(mometasone furoate), 알부테롤(albuterol), 테오필린(theophylline), 포르모테롤(formoterol), 티오트로피움(tiotropium), 설파살라진(sulfasalazine), 메토트렉세이트(methotrexate), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 플루오로우라실(fluorouracil), 블레오마이신(bleomycin), 아나스트로졸(Anastrozole), 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물은 TSLP 관련 질환 또는 병증의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조에 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TSLP 관련 질환 또는 병증은 면역계 질환 또는 종양 질환을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 면역계 질환은 천식, 아토피성 피부염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 알레르기성 결막염, 음식 알레르기, 궤양성 결장염, 크론병, 비염, 강직성 척추염, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 과민성 폐렴, 알레르기성 육아종성 혈관염, 비용종증, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 종양 질환은 유방암, 췌장암, 자궁경부암, 다발성골수종, 결장직장암, 폐암, 갑상선암, 난소암, 간암, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제11 양태는 (a) TSLP 관련 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약물을 제조하거나; 및/또는 (b) TSLP 검출 시약, 검출 플레이트 또는 키트를 제조하는 본 발명의 제1 양태에 따른 항-TSLP 나노항체, 본 발명의 제2 양태에 따른 항-TSLP 항체, 본 발명의 제7 양태에 따른 면역접합체 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 다중특이성 항체 또는 본 발명의 제9 양태에 따른 재조합 단백질 또는 본 발명의 제10 양태에 따른 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TSLP 관련 질환 또는 병증은 면역계 질환 또는 종양 질환을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 면역계 질환은 천식, 아토피성 피부염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 알레르기성 결막염, 음식 알레르기, 궤양성 결장염, 크론병, 비염, 강직성 척추염, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 과민성 폐렴, 알레르기성 육아종성 혈관염, 비용종증, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 종양 질환은 유방암, 췌장암, 자궁경부암, 다발성골수종, 결장직장암, 폐암, 갑상선암, 난소암, 간암, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 TSLP는 인간 TSLP이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 시약은 진단 시약이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 진단 시약은 조영제이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 시약은 샘플 중의 TSLP 단백질 또는 이의 단편을 검출하는데 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출은 유세포분석 검출, 세포 면역형광 검출을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 용도는 진단적 및/또는 비진단적 및/또는 치료적 및/또는 비치료적이다.
본 발명의 제12 양태는 샘플 중 TSLP 단백질의 검출 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(1) 샘플을 본 발명의 제1 양태에 따른 항-TSLP 나노항체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 항-TSLP 항체, 또는 본 발명의 제7 양태에 따른 면역접합체 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 다중특이성 항체 또는 본 발명의 제9 양태에 따른 재조합 단백질과 접촉시키는 단계; 및
(2) 항원-항체 복합체를 형성하는지 여부를 검출하되, 복합체를 형성하면 샘플에 TSLP 단백질이 존재한다는 것을 나타내는 단계;를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 방법은 비진단적 및 비치료적 방법이다.
본 발명의 제13 양태는 TSLP 단백질 검출 시약을 제공하며, 상기 검출 시약은,
(i) 본 발명의 제1 양태에 따른 항-TSLP 나노항체, 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 항-TSLP 항체, 또는 본 발명의 제7 양태에 따른 면역접합체 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 다중특이성 항체 또는 본 발명의 제9 양태에 따른 재조합 단백질; 및
(ii) 검출학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 면역접합체의 접합 부분은 진단용 동위원소이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출학적으로 허용 가능한 담체는 무독성, 불활성 수성 담체 매질이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시약은 동위원소 추적자, 조영제, 흐름 검출 시약, 세포 면역형광 검출 시약, 자성 나노입자 및 영상화제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시약이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시약은 체내 검출에 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시약의 제형은 액체 또는 분말(예: 물 제제, 주사제, 동결 건조 분말, 정제, 구강 제제, 에어로졸)이다.
본 발명의 제14 양태는 TSLP 단백질 검출 키트를 제공하며, 상기 키트는 본 발명의 제7 양태에 따른 면역접합체 또는 본 발명의 제13 양태에 따른 검출 시약 및 설명서를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 설명서에 기재된 바에 따르면, 상기 키트는 측정 대상의 TSLP 발현을 비침습적으로 검출하는데 사용된다.
본 발명의 제15 양태는 체내에서 TSLP 단백질을 검출하기 위한 조영제를 제조하는 본 발명의 제7 양태에 따른 면역접합체의 용도를 제공한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출은 TSLP 관련 질환 또는 병증의 진단 또는 예후에 사용된다.
본 발명의 제16 양태는 질환 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 필요한 대상에게 본 발명의 제1 양태에 따른 항-TSLP 나노항체, 본 발명의 제2 양태에 따른 항-TSLP 항체, 본 발명의 제7 양태에 따른 면역접합체 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 다중특이성 항체 또는 본 발명의 제9 양태에 따른 재조합 단백질 또는 본 발명의 제10 양태에 따른 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 대상은 인간 또는 비인간 포유동물을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 비인간 포유동물은 설치류(예: 마우스, 토끼), 비인간 영장류(예: 원숭이)를 포함한다.
본 발명의 범위내에서, 본 발명의 상기 각 기술특징과 아래(예를 들어 실시예)에서 구체적으로 설명되는 각 기술특징은 서로 조합될 수 있으므로 새롭거나 바람직한 기술적 해결수단을 구성함을 이해해야 한다. 편폭의 제한으로 여기서 더이상 일일이 반복하지 않는다.
도 1a 및 도 1b는 31주의 후보 항체에 대해 유세포 분석 차단 활성 검출을 수행한 결과이다. 결과, 31주 후보 항체 중의 14주의 항체의 차단 활성은 대조군 항체 Tezepelumab에 비해 현저하게 우위적이다.
도 2는 14주의 차단형 TSLP 나노항체의 결합 동역학 검출 결과이다.
도 3은 피치아 파스토리스에서 2가 단일 도메인 항체 Bi-HuNb5-31, Bi-HuNb7-54, Bi-HuNb10-63의 진탕 플라스크 발현 상청액의 SDS-PAGE 결과이며, 그 생산량은 각각 475ug/mL, 310ug/mL, 510ug/mL이다.
도 4는 인간화 2가 항체의 차단 활성을 ELISA로 검출한 결과이다. 결과, 3주의 인간화 2가 항체의 차단 활성은 대조군 항체 Tezepelumab에 비해 현저하게 우위적이다.
도 5는 BaF3/TSLPR-IL7R 세포 증식에 대한 인간화 2가 항체의 억제 효과를 나타낸 결과이다. 결과, BaF3/TSLPR-IL7R 세포에서 pSTAT5 신호 경로에 대한 그 중 2주의 인간화 항체의 억제 효과는 대조군 항체 Tezepelumab에 비해 우위적이다.
항-TSLP 나노항체가 최초로 예기치 않게 발견되었으며, 실험 결과, 본 발명의 나노항체는 TSLP와 TSLPR의 상호 작용을 효과적으로 차단할 수 있고, 차단 활성은 대조군 항체 Tezepelumab에 비해 현저하게 우위적이며; 본 발명의 나노항체는 Baf3/TSLPR-IL7R 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있고 그 억제활성은 대조군 항체 Tezepelumab에 비해 우위적이며; 피치아 파스토리스에서 본 발명의 나노항체의 발효 탱크 발현량은 17-23g/L에 달할 수 있고 업계 수준보다 현저하게 높다. 이의 기초상에서, 본 발명자는 본 발명을 완료하였다.
용어
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “본 발명의 나노항체”, “본 발명의 나노항체”, “본 발명의 항-TSLP 나노항체”, “본 발명의 TSLP 나노항체”, “항-TSLP 나노항체”, “TSLP 나노항체”는 동일한 의미를 가지며, 서로 교환하여 사용할 수 있고, 모두 TSLP(인간 TSLP를 포함함)를 특이적으로 인식하고 결합하는 나노항체를 의미한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “항체” 또는 “면역글로불린”은 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 동일한 구조적 특징을 갖는 약 150,000달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되며, 상이한 면역글로불린의 동종형의 중쇄 사이에서 이황화 결합의 수는 상이하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 사슬내 이황화 결합을 갖는다. 각각의 중쇄의 일단에 가변 영역(VH)이 있고 그 뒤는 복수의 불변 영역이 있다. 각각의 경쇄의 일단에 가변 영역(VL)이 있고 타단에 불변 영역이 있으며; 경쇄의 불변 영역과 중쇄의 첫 번째 불변 영역은 대향하고, 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역은 대향한다. 특수한 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄의 가변 영역 사이에 인터페이스를 형성한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “단일 도메인”, “VHH”, “나노항체(nanobody)”, “중쇄 항체”(single domain antibody, sdAb, 또는 나노항체nanobody)는 동일한 의미를 가지며, 서로 교환하여 사용할 수 있고, 항체 중쇄의 가변 영역에 대한 클로닝을 의미하며, 하나의 중쇄 가변 영역으로만 조성된 나노항체(VHH)를 구축하고, 이는 완전한 기능을 가진 최소 항원 결합 단편이다. 일반적으로 먼저 경쇄와 중쇄 불변 영역 1(CH1)이 자연적으로 결실된 항체를 얻은 후, 항체 중쇄의 가변 영역을 클로닝하여 하나의 중쇄 가변 영역으로만 조성된 나노항체(VHH)를 구축한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “가변”은 항체 중 가변 영역의 일부분이 이의 특정 항원에 대한 다양한 특정 항체의 결합과 특이성을 형성하는 서열에서 다소 상이한 것을 나타낸다. 그러나, 가변성은 항체 가변 영역 전체에 균일하게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 영역 중 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역이라고 하는 3개의 단편에 집중되어 있다. 가변 영역에서 비교적 보존적인 부분을 프레임 영역(FR)이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각은 연결 루프를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된 대략적인 b-접힘 구성의 4개의 FR 영역을 포함하며, 이는 일부 경우에 부분적인 b-접힘 구조를 형성할 수 있다. 각 사슬의 CDR은 FR 영역에 의해 근접하게 되고 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성한다(Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol.I, 647-669페이지(1991)). 불변 영역은 항체와 항원의 결합에 직접 참여하지 않지만, 예를 들어 항체의 항체 의존성 세포독성에 참여하는 것과 같이 상이한 이펙터 기능을 나타낸다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 면역접합체 및 융합 발현 생성물은 약물, 독소, 사이토카인(cytokine), 방사성 핵종, 효소 및 다른 진단 또는 치료 분자가 본 발명의 항체 또는 이의 단편과 결합하여 형성된 접합체를 포함한다. 본 발명은 상기 항-TSLP 항체 또는 이의 단편과 결합한 세포 표면 마커 또는 항원을 더 포함한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “중쇄 가변 영역”과 “VH”는 서로 교환하여 사용할 수 있다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “가변 영역”과 “상보성 결정 영역 (complementarity determining region, CDR)”은 서로 교환하여 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 상기 항체의 중쇄는 상기 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명에서, 용어 “본 발명의 항체”, “본 발명의 단백질”, 또는 “본 발명의 폴리펩티드”는 서로 교환하여 사용할 수 있고, 모두 TSLP 단백질에 특이적으로 결합한 폴리펩티드를 의미하며, 예를 들어 중쇄 가변 영역을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 이들은 시작 메티오닌을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항체를 갖는 다른 단백질 또는 융합 발현 생성물을 더 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 가변 영역이 본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역과 동일하거나 적어도 90%의 상동성, 비교적 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지면, 가변 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 임의의 단백질 또는 단백질 접합체 및 융합 발현 생성물(즉, 면역접합체 및 융합 발현 생성물)을 포함한다.
일반적으로, 항체의 항원 결합 특성은 가변 영역(CDR)이고 지칭하는 중쇄 가변 영역에 위치한 3개의 특정 영역으로 설명할 수 있으며, 이 구간을 4개의 프레임 영역(FR)으로 나누고 4개의 FR의 아미노산 서열은 상대적으로 보존적이며, 결합 반응에 직접 참여하지 않는다. 이러한 CDR은 고리형 구조를 형성하고, 그 사이의 FR을 통해 형성된 β 접힘은 공간 구조에서 서로 근접하며 중쇄의 CDR과 대응하는 경쇄의 CDR은 항체의 항원 결합 부위를 구성한다. 비교적 동일한 유형의 항체의 아미노산 서열을 통해 FR 또는 CDR 영역을 구성한 아미노산을 결정할 수 있다.
본 발명의 항체의 가변 영역은 이들 중 적어도 일부가 항원 결합에 관여하기 때문에 주목을 받고 있다. 따라서 본 발명은 이의 CDR과 여기서 감정된 CDR이 90% 이상(비교적 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상)의 상동성을 갖는 한, CDR을 보유한 항체 중쇄 가변 영역을 갖는 분자를 포함한다.
본 발명은 완전한 항체를 포함할 뿐만 아니라, 면역 활성을 가진 항체의 단편 또는 항체와 다른 서열로 형성된 융합 단백질을 더 포함한다. 따라서, 본 발명은 상기 항체의 단편, 유도체 및 유사물질을 더 포함한다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 “단편”, “유도체” 및 “유사물질”은 기본적으로 본 발명의 항체와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 유지하는 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 단편, 유도체 또는 유사물질은 (i) 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드일 수 있고, 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전적 코드에 의해 코딩된 것일 수 있고 코딩되지 않을 것일 수 있으며, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기를 갖는 폴리펩디드일 수 있거나, 또는 (iii) 성숙한 폴리펩티드를 다른 화합물(예: 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리펩티드의 반감기를 연장시키는 화합물)에 융합하여 형성된 폴리펩티드일 수 있거나, 또는 (iv) 추가적인 아미노산 서열을 이 폴리펩타이드 서열에 융합하여 형성된 폴리펩티드(예: 리더 서열 또는 분비 서열 또는 폴리펩티드를 정제하는데 사용되는 서열 또는 단백질 서열, 또는 6His 태그로 형성된 융합 단백질)일 수 있다. 본문의 교시에 따르면, 이러한 단편, 유도체 및 유사물질은 당업자에게 공지된 범위에 속한다.
본 발명의 항체는 TSLP 결합 활성을 가지고, 상기 CDR 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 용어는 본 발명의 항체와 동일한 기능을 가지고, 상기 CDR 영역을 포함하는 폴리펩티드의 변이 형태를 더 포함한다. 이러한 변이 형태는 하나 이상(일반적으로 1-50개, 비교적 바람직하게는 1-30개, 보다 바람직하게는 1-20개, 가장 바람직하게는 1-10개)의 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환, 및 C말단 및/또는 N말단에 하나 이상(일반적으로 20개 이내, 비교적 바람직하게는 10개 이내, 보다 바람직하게는 5개 이내)의 아미노산을 추가하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 분야에서 성능이 근접하거나 유사한 아미노산으로 치환할 경우, 일반적으로 단백질의 기능이 변경되지 않는다. 또한 예를 들어, C말단 및/또는 N말단에 하나 이상의 아미노산을 추가하여도 일반적으로 단백질의 기능이 변경되지 않는다. 상기 용어는 본 발명의 항체의 활성 단편 및 활성 유도체를 더 포함한다.
상기 폴리펩티드의 변이 형태는 상동 서열, 보존적 변이체, 대립형질 변이체, 천연 돌연변이체, 유도 돌연변이체, 엄격도가 높거나 낮은 조건에서 본 발명의 항체의 코딩 DNA와 혼성화될 수 있는 DNA에 의해 코팅된 단백질, 및 본 발명의 항체에 저항하는 항혈청으로 얻은 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다.
본 발명은 나노항체 또는 이의 단편을 포함한 융합 단백질과 같은 다른 폴리펩티드를 더 제공한다. 거의 전체길이인 폴리펩티드를 제외한 외, 본 발명은 본 발명의 나노항체의 단편을 더 포함한다. 일반적으로, 상기 단편은 본 발명의 항체의 적어도 약 50개의 연속 아미노산, 비교적 바람직하게는 적어도 약 50개의 연속 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 80개의 연속 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 약 100개의 연속 아미노산을 갖는다.
본 발명에서, “본 발명의 항체의 보존적 변이체”는 본 발명의 항체의 아미노산 서열과 비교하여 최대 10개, 비교적 바람직하게는 최대 8개, 보다 바람직하게는 최대 5개, 가장 바람직하게는 최대 3개의 아미노산이 성질이 유사하거나 근접한 아미노산으로 대체되어 폴리펩티드를 형성하는 것을 의미한다. 이러한 보존적 변이 폴리펩티드는 표 A에 따른 아미노산 치환에 의해 생성되는 것이 가장 바람직하다.
표 A
본 발명은 상기 항체 또는 이의 단편 또는 이의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 더 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 형태 또는 RNA 형태일 수 있다. DNA 형태는 cDNA, 유전체 DNA 또는 인공 합성의 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩 가닥 또는 비코딩 가닥일 수 있다.
본 발명의 성숙한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 성숙한 폴리펩티드만 코딩하는 코딩 서열; 성숙한 폴리펩티드의 코딩 서열 및 다양한 추가적 코딩 서열; 성숙한 폴리펩티드의 코딩 서열(임의의 추가적 코딩 서열) 및 비코딩 서열을 포함한다.
용어 “폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드”는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 추가적 코딩 및/또는 비코딩 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 서열과 혼성화되고 또한 2개의 서열 사이에 적어도 50%, 비교적 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄격한 조건에서 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, “엄격한 조건”은, (1) 0.2×SSC, 0.1% SDS, 60℃와 같이 비교적 낮은 이온 강도 및 비교적 높은 온도에서의 혼성화 및 용리; 또는 (2) 혼성화 동안 0%(v/v) 포름아미드, 0.1% 송아지 혈청/0.1% Ficoll, 42℃ 등과 같은 변성제의 첨가; 또는 (3) 두 서열 사이의 상동성이 적어도 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상일 때에만 혼성화가 발생하는 것이다. 또한, 혼성화 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 성숙한 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 및 활성을 갖는다.
본 발명의 항체의 뉴클레오티드 전장 서열 또는 이의 단편은 일반적으로 PCR 증폭법, 재조합법 또는 인공 합성 방법에 의해 얻을 수 있다. 실행 가능한 방법은 인공 합성 방법으로 관련 서열을 합성하는 것으로, 특히 단편 길이가 비교적 짧을 경우이다. 일반적으로, 우선 복수의 작은 단편을 합성한 다음 연결하여 긴 서열의 단편을 획득할 수 있다. 이 밖에, 또한 중쇄의 코딩 서열과 발현 태그(예: 6His)를 융합하여 융합 단백질을 형성할 수 있다.
일단 관련 서열을 획득하면 재조합법으로 관련 서열을 일괄적으로 획득할 수 있다. 일반적으로 이를 벡터에 클로닝한 후 세포에 형질전환한 다음 일반 방법으로 증식된 숙주 세포로부터 관련 서열을 분리하여 얻는다. 본 발명에 관여되는 생물 분자(핵산, 단백질 등)는 분리된 형태로 존재하는 생물 분자를 포함한다.
현재, 본 발명의 단백질(또는 이의 단편, 또는 이의 유도체)을 코딩하는 DNA 서열은 화학 합성을 통해 완전히 얻을 수 있다. 다음 상기 DNA 서열을 본 분야에 공지된 다양한 기존의 DNA 분자(또는 예를 들어 벡터)와 세포에 도입할 수 있다. 이 밖에, 화학 합성을 통해 돌연변이를 본 발명의 단백질 서열에 도입할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 적절한 DNA 서열 및 적절한 프로모터 또는 제어 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 적절한 숙주 세포를 형질전환하여 단백질을 발현할 수 있도록 한다.
숙주 세포는 세균 세포와 같은 원핵 세포; 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포; 또는 포유동물 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다. 대표적인 예로는 대장균, 스트렙토미세스; 쥐장티푸스균의 세균 세포; 효모와 같은 진균 세포; 초파리의 S2 또는 Sf9의 곤충세포; CHO, COS7, 293 세포의 동물세포 등이 있다.
재조합 DNA에 의한 숙주 세포의 형질전환은 당업자에게 잘 알려진 통상적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 숙주가 대장간균과 같은 원핵 생물인 경우, DNA를 흡수할 수 있는 수용성 세포는 지수 성장기 후에 수확될 수 있고 당업계에 잘 알려진 절차를 사용하여 CaCl2법으로 처리될 수 있다. 다른 방법은 MgCl2를 사용하는 것이다. 형질전환은 또한 필요하면 전기천공에 의해 수행될 수 있다. 숙주가 진핵생물인 경우 인산칼슘 공침법 및 미세주입, 전기천공법, 리포솜 패키징 등과 같은 기존의 기계적 방법과 같은 DNA 형질감염 방법을 사용할 수 있다.
획득된 형질전환체는 일반 방법으로 배양할 수 있으며, 본 발명의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현한다. 배양에 사용되는 배지는 사용되는 숙주 세포에 따라 다양한 일반 배지로부터 선택될 수 있다. 숙주 세포의 성장에 적합한 조건에서 배양한다. 숙주 세포가 적절한 세포 밀도로 성장한 후, 적절한 방법(예를 들어, 온돈 전환 또는 화학적 유도)으로 선택된 프로모터를 유도하고 세포를 일정한 시간 더 배양한다.
상기 방법에서 재조합 폴리펩티드는 세포 내 또는 세포막에서 발현되거나 세포 외로 분비될 수 있다. 재조합 단백질은 필요하면 물리적, 화학적 및 다른 특성을 이용하여 다양한 분리 방법으로 분리 및 정제할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법의 예는 기존 재생 처리, 단백질 침전제를 이용한 처리(염석법), 원심분리, 삼투압 파괴, 초처리, 초원심분리, 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액상 크로마토그래피(HPLC) 및 다른 다양한 액상 크로마토그래피 기술 및 이러한 방법의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체는 단독으로 사용하거나 검출 가능한 마커(진단 목적용), 치료제, PK(단백질 키나아제) 변형 부분 또는 이상 물질의 임의의 조합과 결합되거나 접합될 수 있다.
진단 목적용 검출 가능한 마커는 형광 또는 발광 마커, 방사성 마커, MRI(자기 공명 영상) 또는 CT(전자 컴퓨터 X선 단층 촬영 기술) 조영제 또는 검출 가능한 생성물을 생성할 수 있는 효소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체와 결합되거나 접합될 수 있는 치료제는 1. 방사성 핵종; 2. 생물 독소; 3. IL-2 등과 같은 사이토카인; 4. 금 나노입자/나노막대; 5. 바이러스 입자; 6. 리포솜; 7. 자성 나노입자; 8. 전구약물 활성화 효소(예: DT-디아포라아제(DTD) 또는 비페닐히드롤라아제 유사 단백질(BPHL))등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
흉선기질림프포이에틴(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)
흉선기질림프포이에틴은 4개의 나선 다발 접힘 구조를 가진 단쇄 사이토카인이며 IL-2 사이토카인 계열에 속한다. 새로운 사이토카인으로서, TSLP는 일반적으로 폐, 피부 및 장 장벽 표면의 상피 세포에서 발현된다. 동물 실험 결과, TSLP는 알레르겐 유발 천식 모델 마우스의 폐에서 높게 발현되는 반면, TSLP 수용체 결핍 마우스는 천식 성능이 현저하게 감소되었으며, 폐 특이적 TSLP 형질전환 마우스는 Th2형 염증과 IgE로 증가된 기도 염증 및 높은 반응성을 나타냈다. 추가 연구에 따르면 TSLP는 골수 유래 수지상 세포를 활성화하고 공동 자극 분자를 상향 조절하여 Th2형 세포 주화성 인자 CCL17을 생성한다. 따라서 TSLP는 기도 알레르기성 염증의 시작에 중요한 인자이자 필요 조건이다. 이는 천식을 포함한 다양한 질병에서 여러 염증 경로의 상류 조절자이며 기도 염증의 발생과 지속에 매우 중요하다. 또한 연구에 따르면, TSLP는 아토피성 피부염(AD)의 병인과 관련된 사이토카인이기도 하다. 더 중요한 것은, 연구자들은 다양한 유형의 종양에서 TSLP 수준이 증가하고 TSLP가 종양 세포가 BCL-2라는 또 다른 단백질을 발현하도록 유도하여 종양을 사멸로부터 보호할 수 있다는 사실을 발견하였다. 따라서 TSLP는 종양 생존에도 매우 중요하다.
흉선기질림프포이에틴 수용체(thymic stromal lymphopoietin receptor, TSLPR)
TSLPR 수용체는 I형 막관통 단백질이고, 조혈 사이토카인 수용체 계열에 속한다. 기능성 TSLPR 복합체는 TSLPR 및 IL-7Ra로 조성된다. TSLPR은 사이토카인 수용체 유사 분자 2 또는 I형 사이토카인 수용체 σ1로도 지칭된다. TSLP는 고친화성 헤테로다이머 수용체 복합체에 결합하여 세포 내 2형 신호 전달을 개시하며, 헤테로다이머 수용체 복합체는 이의 특이적 수용체 TSLPR로 조성되고, IL-2, IL-4, IL-9 및 IL-15의 공통 수용체 γ 사슬과 24% 상동성을 가지며, δ-공동 사슬 IL-2 계열, 및 TSLPR 및 IL-7Rα를 공동 발현하는 세포 중의 IL-7Rα 서브유닛(CD127)을 포함하지 않는다. TSLP는 처음에 TSLPR에 결합된 다음 IL-7Rα 사슬을 모집한다.
약학적 조성물
본 발명은 조성물을 더 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약학적 조성물로, 상기 항체 또는 이의 활성 단편 또는 이의 융합 단백질, 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유한다. 일반적으로, 이러한 물질을 무독성, 불활성의 약학적으로 허용 가능한 수성 담체 매질에서 조제할 수 있으며, 여기서 pH는 pH값이 조제된 물질의 성질과 치료할 병증에 따라 다소 변화가 있을 수 있지만 일반적으로 약 5-8, 비교적 바람직하게는 pH는 약 6-8이다. 조제된 약학적 조성물은 일반 경로를 통해 투여될 수 있고, 여기에는 복강내, 정맥내, 또는 국소 투여가 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 TSLP 단백질 분자에 직접적으로 결합하여 TSLP 관련 질환 또는 병증(면역계 질환 또는 종양 질환 포함)을 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 다른 치료제도 병용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 안전 유효량(예를 들어, 0.001-99wt%, 비교적 바람직하게는 0.01-90wt%, 보다 바람직하게는 0.1-80wt%)의 본 발명에 따른 나노항체(또는 이의 접합체) 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유한다. 이러한 담체는 식염수, 완충액, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 약물 제제는 투여 방식과 일치해야 한다. 본 발명의 약학적 조성물은 주사제 형태로 제조될 수 있으며, 예를 들어 생리식염수 또는 포도당과 다른 보조제를 함유한 수용액을 사용하여 일반 방법으로 제조된다. 약학적 조성물은 예를 들어 주사제, 용액과 같은 무균 조건에서 제조된다. 활성 성분의 투여량은 치료 유효량이며, 예를 들어 하루에 약 10㎍/kg 체중 내지 약 50mg/kg 체중이다. 이 밖에, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 다른 치료제와 병용될 수 있다.
약학적 조성물을 사용할 경우, 안전 유효량의 면역접합체를 포유동물에게 투여하되, 여기서 상기 안전 유효량 보통 적어도 약 10 ㎍/kg 체중이고, 대부분의 경우 약 50 mg/kg 체중을 초과하지 않으며, 비교적 바람직하게는 상기 투여량은 약 10 ㎍/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중이다. 물론 구체적인 투여량은 투여 경로 및 환자의 건강 상태와 같은 요인도 고려되어야 하며 이는 숙련된 의사의 기술 범위 내에 있다.
항-TSLP 나노항체
본 발명에서, 상기 항-TSLP 나노항체의 VHH 사슬의 아미노산 서열은 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 34 또는 서열번호 38 중 하나 이상으로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 일 예에서, 상기 항-TSLP 나노항체는 단량체, 2가체(2가 항체), 4가체(4가항체), 및/또는 다가체(다가 항체)를 포함한다.
전형적으로, 상기 항-TSLP 나노항체는 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 34 또는 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 2개의 VHH 사슬을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 VHH 사슬 사이는 연결 펩티드를 통해 연결된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 연결 펩티드는 (GaSb)x의 서열로부터 선택되며, 여기서 a, b, x=0 또는 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10(비교적 바람직하게는, a＝4이고 b＝1, x=4)이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 연결 펩티드의 서열은 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS이다.
표기된 나노항체
본 발명의 바람직한 일 예에서, 상기 나노항체는 검출 가능한 마커를 보유한다. 보다 바람직하게는, 상기 마커는 동위원소, 콜로이드 금 마커, 컬러 마커 또는 형광 마커로 이루어진 군으로부터 선택된다.
콜로이드 금 표기는 당업자에게 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 해결수단에서, TSLP의 나노항체는 콜로이드 금으로 표기되어 콜로이드 금으로 표기된 나노항체를 얻는다.
검출 방법
본 발명은 또한 TSLP 단백질 검출 방법에 관한 것이다. 상기 방법의 단계는 대략 다음과 같다. 세포 및/또는 조직 샘플을 획득하고; 샘플을 매질에 용해시키며; 상기 용해된 샘플에서 TSLP 단백질의 수준을 검출한다.
본 발명의 검출 방법에서, 사용되는 샘플은 특별히 제한되지 않으며, 대표적인 예로는 세포 보존액에 존재하는 세포 함유 샘플이다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 항체(또는 이의 단편) 또는 검출 플레이트를 포함하는 키트를 더 제공하며, 본 발명의 바람직한 일 예에서, 상기 키트는 용기, 사용 설명서, 완충제 등을 더 포함한다.
본 발명은 또한 TSLP 수준을 검출하는 검출 키트를 더 제공하며, 상기 키트는 TSLP 단백질을 인식하는 항체, 샘플을 용해하기 위한 열분해 매질, 검출에 필요한 일반 시약 및 완충액, 예를 들어 다양한 완충액, 검출 마커, 검출 기질 등을 포함한다. 상기 검출 키트는 체외 진단 장치일 수 있다.
응용
상술한 바와 같이, 본 발명의 나노항체는 광범위한 생물학적 및 임상적 응용 가치를 가지며, 그 응용은 TSLP 관련 질환 또는 병증의 진단 및 치료, 기초 의학 연구, 생물학 연구 및 여러 분야에 관여된다. 바람직한 일 응용은 TSLP에 대한 임상 진단 및 표적 치료이다.
본 발명의 주요 장점은 다음을 포함한다.
(a) 본 발명의 나노항체는 TSLP와 TSLPR의 상호 작용을 효과적으로 차단할 수 있다.
(b) 본 발명의 나노항체는 대조군 항체 Tezepelumab에 비해 더 강한 차단 활성을 갖는다.
(c) 본 발명의 나노항체는 피치아 파스토리스에서 발현될 수 있고, 진탕 플라스크의 발현 생산량은 비교적 높으며 발효 탱크 생산량은 17-23g/L에 달할 수 있다.
(d) BaF3/TSLPR-IL7R 세포에서 pSTAT5 신호 경로에 대한 본 발명의 나노항체의 억제 효과는 대조군 항체 Tezepelumab에 비해 현저하게 우위적이다.
아래에 구체적인 실시예를 결합하여 본 발명을 더 설명한다. 이해해야 할 것은, 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다. 아래 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 실험 방법은 일반 조건, 예를 들어 Sambrook 등, 분자 클론: 실험실 수첩(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 따른 조건, 또는 제조업체에서 권장하는 조건을 따른다. 달리 설명되지 않는 한, 백분율과 부수는 중량 백분율과 중량 부수이다.
특별히 설명되지 않는 한, 본 발명의 실시예에 사용되는 재료와 시약은 모두 시중에서 구입되는 제품이다.
실시예 1 TSLP 특이성 나노항체 선별
퓨린 부위 돌연변이가 있는 인간 TSLP의 아미노산 서열을 인간 코돈에 따라 최적화한 후 이의 염기 서열을 pFUSE 벡터에 클로닝하고 HEK293F 세포에 형질감염시켜 인간 TSLP 단백질로 정제하였다. 고순도 단백질과 면역보강제를 혼합한 후 신장 박트리아 낙타 4마리를 주 1회 면역화하고 7회 면역 후 낙타 말초혈액을 채취하여 RNA를 분리하고 VHH 유전자 단편을 증폭시킨 후 pMECS 벡터에 클로닝하며, TG1 수용성 세포에 전기 형질전환하여 고품질의 파지 디스플레이 나노항체 라이브러리를 구축하였다. 검출 결과, 4개의 라이브러리의 저장 용량은 모두 1x109 CFU 이상에 도달했으며 단편 삽입률은 80% 이상이었다.
파지 디스플레이 기술을 사용하여 TSLP 특이성 나노항체를 선별하였다. “흡착-세척-농축”의 3회 과정 후, 각 라이브러리에 모두 특이성 나노항체 파지 농축이 나타났다. 1200개의 클론을 무작위로 선택하여 ELISA 검출 및 시퀀싱 분석을 수행함으로써 최종 312주의 차등 서열 항체를 획득하였다.
실시예 2 유세포 분석법에 의한 차단형 TSLP 나노항체 선별
이상의 서열이 상이한 나노항체 클론을 TB 배지에 접종하여 배양하고 IPTG로 밤새 동안 유도하며 차단 활성 검출을 위해 세포를 열분해하여 상층액을 수집하였다. 배양된 CHOZEN/TSLPR의 안정적으로 형질감염된 세포를 웰당 3E 5개의 세포씩 96웰 플레이트에 나누고 3000rpm에서 3분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하며 각 항체의 열분해액 및 TSLP-Biotin 단백질을 첨가하여 20분 동안 배양하였다. 원심분리하여 상층액을 버리고 희석된 SA-PE 항체를 첨가하여 4℃에서 20분 동안 배양하였다. 다시 원심분리하여 상층액을 버리고 각 웰에 200uL PBS를 넣어 세포를 재현탁한 후 유세포 분석기로 샘플의 PE 신호를 검출하였다. 결과, 총 64주의 후보 항체가 TSLP와 TSLPR 사이의 상호 작용을 차단하는 기능을 구비하였다. 서열 분석과 결합하여 31주의 상이한 계열의 항체를 선택하여 발현 및 정제하였다. 정제 방법에 대해서는 특허 CN110144011A의 실시예 4를 참조한다.
상기 31주의 정제된 항체에 대해 유세포 분석법으로 다시 차단 활성을 검출하였다. 배양된 HEK293F/TSLPR의 순간적으로 형질감염된 세포를 웰당 3E 5개의 세포씩 96웰 플레이트에 나누고 3000rpm에서 3분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하며 구배 희석된 각 항체(20ug/mL에서 시작하여 2배 구배 희석) 및 TSLP-Biotin 단백질을 첨가하여 20분 동안 배양하였다. 이번 실험은 Tezepelumab을 대조군 항체로 사용하였다. 이어서 원심분리하여 상층액을 버리고 희석된 SA-PE 항체를 첨가하여 4℃에서 20분 동안 배양하였다. 다시 원심분리하여 상층액을 버리고 각 웰에 200uL PBS를 넣어 세포를 재현탁한 후 유세포 분석기로 샘플의 PE 신호를 검출하였다. 결과, 도 1a 및 1b에 도시된 바와 같이, 여기서 14주의 항체의 차단 활성은 대조군 항체 Tezepelumab에 비해 현저하게 우위적이며, 14주의 항체의 번호는 각각 Nb1-41, Nb1-51, Nb1-59, Nb3-18, Nb3-43, Nb5-31, Nb6-29, Nb7-54, Nb10-55, Nb10-63, Nb10-87, Nb11-6, Nb11-72, Nb11-75이다.
실시예 3 항체 친화도 측정
생물막층 간섭 기술(Bio-layer interferometry BLI)을 통해 14주의 차단형 TSLP 나노항체의 결합 동역학을 검출하였다. 동역학 측정을 위해 후보 항체를 PBST 완충액으로 5ug/mL로 희석하고 TSLP-Fc 항원을 PBST 완충액으로 6개의 농도 구배(20nM에서 시작하여 2배 구배로 희석)로 2배 구배로 희석하고, 기기 작동 조건 30℃, Shake speed 1000rpm을 설정하였다. Protein A로 코팅된 프로브를 사용하여 항체를 60초 동안 포획하였다. 구배 희석된 항원과 결합하며 결합 시간은 240초이고; 해리 시간은 300초이며; 10mM 글리신(pH 1.7)으로 매회 5초씩 2회 재생하였다. Fortebio Analysis 9.0 버전으로 분석하고 Global 모드로 피팅하였으며, 결합율(Kon), 해리율(Kdis) 및 해리상수 KD를 계산하였다. 결과는 도 2에 도시된 바와 같다.
실시예 4 피치아 파스토리스에서 인간화 2가 항체의 발현
후보 항체에 대해 인간화 개선을 수행하여 가변 영역이 변하지 않도록 유지하며, 4개의 프레임 영역 서열에 대해 인간화 설계를 수행하고, 개선 방법은 특허 CN2018101517526의 실시예 4의 방법을 참조한다. 인간화 후 항체의 아미노산 서열은 표 1에 표시된 바와 같다.
상기 인간화의 항체를 2가 형태로 구축하고, 링커(G4S)4로 연결하며, 연결된 서열은 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42로 표시된 바와 같으며, 이어서 피치아 파스토리스를 이용하여 발현하였다. 간단하게, 발현 방법은 다음과 같다. (1) 상기 TSLP 나노항체 2가체 서열을 pPICZaA 벡터로 구축하였다. (2) Sac I 제한 엔도뉴클레아제로 선형화한 후 X-33 수용성 세포에 전기 형질전환하였다. (3) 전기 형질전환된 샘플을 상이한 농도의 블레오마이신을 함유하는 YPD 플레이트 배지에 각각 코팅하고, 30℃의 배양 탱크에서 3-4일 동안 배양하였다. (4) 플레이트 배지에서 단일 클론이 성장한 후, 상이한 농도의 플레이트 위의 단일 클론을 BMGY 배지에 넣고, BMGY 배양액의 OD값이 약 20에 도달하면 균체를 수집하여 BMMY 배지로 교체하고 28℃, 250rpm에서 배양하였다. (5) 이후 24시간마다 샘플을 채취하고 최종 부피가 1%인 메탄올을 보충 첨가하여 샘플을 채취하며, 12,000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 취하여 -20에서 보관하였으며, 5일 동안 유도를 계속한 후 배양을 종료하였다. (6) 얻은 상층액 샘플에 대해 SDS-PAGE 검출을 수행하였다. 2가 단일 도메인 항체의 진탕 플라스크 발현량은 도 3에 도시된 바와 같다.
실시예 5 ELISA에 의한 인간화 2가 항체의 차단 활성 검출
상기 정제된 2가 인간화 항체에 대해 ELISA로 차단 활성을 검출하였다. 인간 TSLP 항원 단백질을 96웰 플레이트에 나누고 4에서 밤새 동안 배양하였다. PBST로 5회 세척하고 300uL 1% BSA 차단액을 첨가하여 37에서 2시간 동안 배양하였다. PBST로 5회 세척한 후, 50uL의 구배 희석된 항체 샘플을 첨가하고 각 웰에 0.02ug/mL 비오티닐화된 TSLPR 단백질 50uL를 첨가하여, 37에서 1시간 동안 배양하였다. PBST로 5회 세척한 후 SA-HRP(1:100000 희석) 100uL를 첨가하여, 37에서 1시간 동안 배양하였다. PBST로 5회 세척한 후 TMB 발색액 100uL를 첨가하여, 37에서 10분 동안 발색하고 2M H2SO4 50uL/웰을 첨가하여 반응을 종료시켰으며, 마이크로플레이트 리더로 450nm의 파장에서의 흡수값을 측정하였다. 결과는 도 4에 도시된 바와 같으며, 3주의 인간화 2가 항체의 차단 활성은 대조군 항체 Tezepelumab에 비해 현저하게 우위적이었다.
실시예 6 BaF3/TSLPR-IL7R 세포에서 pSTAT5 신호 경로에 대한 인간화 2가 항체의 억제 효과
양호하게 성장한 BaF3/TSLPR-IL7R 세포를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하고, PBS로 세포를 재현탁하며, 웰당 1x105개의 세포씩 96웰 플레이트에 나누었다. 25uL의 희석된 인간 TSLP 인자를 구배 희석된 2가 인간화 항체 또는 Tezepelumab과 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 배양한 후 혼합물을 세포에 넣고 37℃, 5% CO2의 조건에서 20분 동안 방치하였다. PBS로 세포를 세척한 후 포름알데히드를 첨가하고, 미리 냉각시킨 메탄올을 첨가하여 10분 동안 배양하였다. 마지막에 항인산화 STAT5-PE 표기 항체를 첨가하여 30분 동안 배양하고, 세포를 세척한 후 유세포 분석기로 PE 신호값을 검출하였다. 결과는 도 5에 도시된 바와 같고, BaF3/TSLPR-IL7R 세포에서 pSTAT5 신호 경로에 대한 2주의 인간화 항체의 억제 효과는 대조군 항체 Tezepelumab에 비해 현저하게 우위적이었다.
실시예 7 7L 발효 탱크에서 인간화 2가 항체의 생산량 평가
상기 3개의 항체의 발현 균주인 글리세롤 세균을 각각 1:100으로 1급 종자로 증폭 배양한 후, 신선한 배지에 옮겨 2급 종자 배양을 수행하였으며, 2급 종자 배양이 합격될 때까지 대기한 후 7L 발효 탱크에 넣고 발효 배양을 수행하였으며, 암모니아수를 자동으로 투입하여 발효 배양물의 pH가 6.0이도록 조절하였다. 배양 과정에서, 정기적으로 샘플을 채취하여 발효액의 pH, 균체의 습중량, 균액의 OD값 등을 검출하고, 용존산소량의 변화에 따라 교반 회전속도, 탱크 압력, 산소 통풍량을 조절하였다. 발효 균체의 습중량과 용존산소량의 변화에 따라 발효 배양의 상이한 단계에 각각 글리세롤 공급 배지와 메탄올 공급 배지를 첨가하였다. 메탄올로 160h~200h 동안 유도 배양한 후 발효를 멈추었다. 검출 결과, 상기 3개의 인간화 2가 항체의 생산량은 각각 17g/L, 19g/L 및 23g/L이었다. 상기 항체 생산량은 보고된 모든 유형의 항체 발효 및 발현 생산량보다 훨씬 높아 업계 최고 수준에 도달하였다.
서열 정보:
SEQ ID NO.1 :
GFTLDDSDMG
SEQ ID NO.2 :
ISSLGGT
SEQ ID NO.3 :
APGTDRYSDCPNEYSV
SEQ ID NO.4 :
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTAS
SEQ ID NO.5 :
WYRQAPGDECELVST
SEQ ID NO.6:
YYADSVKGRFTISHDNAKNTVYLQMNSLKPHDTAVYYC
SEQ ID NO.7 :
WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO.8:
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTASGFTLDDSDMGWYRQAPGDECELVSTISSLGGTYYADSVKGRFTISHDNAKNTVYLQMNSLKPHDTAVYYCAPGTDRYSDCPNEYSVWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO.9:
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACTTTGGATGATTCTGACATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGGATGAGTGCGAGTTGGTCTCAACTATTAGTAGTTTGGGTGGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCATGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTCACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCCGGGGACAGACCGTTATAGCGACTGCCCTAATGAGTATAGCGTCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.10:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTAS
SEQ ID NO.11:
WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.12:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTLDDSDMGWYRQAPGDECELVSTISSLGGTYYADSVKGRFTISHDNAKNTVYLQMNSLKPHDTAVYYCAPGTDRYSDCPNEYSVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.13:
GAGGTTCAATTGTTGGAATCTGGTGGTGGTTTGGTTCAACCAGGTGGTTCTTTGAGATTGTCTTGTACTGCTTCTGGTTTCACCTTGGACGATTCTGATATGGGATGGTACAGACAAGCTCCAGGAGATGAGTGTGAGTTGGTTTCTACTATCTCTTCCTTGGGTGGAACCTACTACGCTGATTCTGTCAAGGGTCGTTTCACTATTTCTCACGATAATGCTAAGAACACCGTTTACTTGCAAATGAACTCTTTAAAGCCACATGATACTGCCGTTTACTACTGTGCTCCTGGTACTGATAGATACTCTGACTGTCCAAACGAATACTCCGTTTGGGGTCAGGGTACTTTGGTTACTGTCTCTTCC
SEQ ID NO.14:
GFTFDDSDMG
SEQ ID NO.15:
ISSDGMT
SEQ ID NO.16:
AATKYSSDYDVAEDWRRGVCGDMDY
SEQ ID NO.17:
QVQLQESGGGSVQAGETLRLSCTAS
SEQ ID NO.18:
WYRQAPGNECELVSI
SEQ ID NO.19:
YYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC
SEQ ID NO.20:
WGKGTQVTVSS
SEQ ID NO.21:
QVQLQESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFDDSDMGWYRQAPGNECELVSIISSDGMTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATKYSSDYDVAEDWRRGVCGDMDYWGKGTQVTVSS
SEQ ID NO.22:
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGAGACTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACTTTTGATGATTCTGACATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAATGAGTGCGAGTTGGTCTCAATTATTAGTAGTGATGGTATGACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGCGGCGACGAAGTACTCCAGCGACTATGACGTAGCTGAGGATTGGAGACGCGGGGTCTGTGGAGACATGGACTACTGGGGCAAAGGAACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.23:
EVQLLESGGGLVQPGETLRLSCTAS
SEQ ID NO.24:
WGKGTLVTVSS
SEQ ID NO.25:
EVQLLESGGGLVQPGETLRLSCTASGFTFDDSDMGWYRQAPGNECELVSIISSDGMTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATKYSSDYDVAEDWRRGVCGDMDYWGKGTLVTVSS
SEQ ID NO.26:
GAAGTCCAATTGCTTGAATCCGGTGGTGGATTAGTTCAACCAGGTGAGACCTTGAGACTGTCCTGTACCGCTTCCGGTTTCACTTTCGACGACTCCGACATGGGTTGGTACAGACAGGCTCCAGGTAATGAGTGTGAGTTGGTTTCTATTATTTCCTCTGATGGTATGACTTACTACGCTGATTCTGTTAAGGGTAGATTCACTATCTCTCAAGACAATGCTAAGAACACTGTTTACTTGCAAATGAACTCTTTGAAGCCTGAAGATACCGCCGTCTACTACTGTGCTGCCACCAAGTACTCCTCCGATTATGATGTCGCTGAAGATTGGAGAAGAGGAGTTTGTGGAGATATGGATTACTGGGGTAAAGGTACTTTGGTTACCGTTTCTTCT
SEQ ID NO.27:
GFTSGGSDMG
SEQ ID NO.28:
ISSDGST
SEQ ID NO.29:
AATDYGLGPPPSSTGQCYGMDY
SEQ ID NO.30:
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTAS
SEQ ID NO.31:
WYRQAPGNECDLVSY
SEQ ID NO.32:
YYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC
SEQ ID NO.33:
WGKGTQVTVSS
SEQ ID NO.34:
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTASGFTSGGSDMGWYRQAPGNECDLVSYISSDGSTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATDYGLGPPPSSTGQCYGMDYWGKGTQVTVSS
SEQ ID NO.35:
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACTTCTGGCGGTTCTGACATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAATGAGTGCGACTTGGTCTCATATATTAGTAGTGATGGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGGCCACCGACTATGGGTTGGGGCCGCCCCCTTCTTCGACGGGCCAATGTTACGGCATGGACTACTGGGGCAAAGGAACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.36:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTAS
SEQ ID NO.37:
WGKGTLVTVSS
SEQ ID NO.38:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTSGGSDMGWYRQAPGNECDLVSYISSDGSTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATDYGLGPPPSSTGQCYGMDYWGKGTLVTVSS
SEQ ID NO.39:
GAAGTTCAGTTGTTGGAATCAGGTGGTGGTTTGGTTCAACCAGGAGGTTCTCTGAGATTGTCTTGTACTGCTTCCGGTTTCACTTCCGGAGGTTCTGACATGGGATGGTACCGTCAAGCTCCTGGTAACGAGTGCGACTTGGTTTCTTACATCTCTTCCGACGGTTCCACTTACTACGCTGATTCTGTTAAGGGTAGATTCACTATTTCTCAAGACAACGCTAAGAATACTGTTTACTTGCAGATGAACTCTTTGAAGCCAGAGGATACCGCTGTTTACTATTGTGCCGCCACTGATTACGGTTTGGGTCCTCCACCATCTTCTACTGGACAATGTTACGGTATGGATTACTGGGGTAAAGGTACCCTGGTCACCGTTTCCTCT
SEQ ID NO.40:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTLDDSDMGWYRQAPGDECELVSTISSLGGTYYADSVKGRFTISHDNAKNTVYLQMNSLKPHDTAVYYCAPGTDRYSDCPNEYSVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTLDDSDMGWYRQAPGDECELVSTISSLGGTYYADSVKGRFTISHDNAKNTVYLQMNSLKPHDTAVYYCAPGTDRYSDCPNEYSVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.41:
EVQLLESGGGLVQPGETLRLSCTASGFTFDDSDMGWYRQAPGNECELVSIISSDGMTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATKYSSDYDVAEDWRRGVCGDMDYWGKGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGETLRLSCTASGFTFDDSDMGWYRQAPGNECELVSIISSDGMTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATKYSSDYDVAEDWRRGVCGDMDYWGKGTLVTVSS
SEQ ID NO.42:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTSGGSDMGWYRQAPGNECDLVSYISSDGSTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATDYGLGPPPSSTGQCYGMDYWGKGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTSGGSDMGWYRQAPGNECDLVSYISSDGSTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATDYGLGPPPSSTGQCYGMDYWGKGTLVTVSS
본 발명에서 언급된 모든 문헌은 한 편의 문헌이 별도로 참조로서 인용되는 바와 같이 본 발명에서 참조로서 인용된다. 이 밖에, 본 발명의 상기 교시 내용을 열독한 후, 당업자는 본 발명에 대해 다양한 변동 또는 수정을 진행할 수 있을 것이며, 이러한 등가 형식은 마찬가지로 본 발명의 청구보호범위에 의해 한정된 범위에 속함을 이해해야 한다.
Sequence listing <110> SHANGHAI NOVAMAB BIOPHARMACEUTICALS CO., LTD. <120> Anti-TSLP nanobodies and their applications <130> P2022-0980 <150> CN202210111727.1 <151> 2022-01-26 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Leu Asp Asp Ser Asp Met Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR2 <400> 2 Ile Ser Ser Leu Gly Gly Thr 1 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR3 <400> 3 Ala Pro Gly Thr Asp Arg Tyr Ser Asp Cys Pro Asn Glu Tyr Ser Val 1 5 10 15 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR1 <400> 4 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser 20 25 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR2 <400> 5 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asp Glu Cys Glu Leu Val Ser Thr 1 5 10 15 <210> 6 <211> 38 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR3 <400> 6 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn 1 5 10 15 Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro His Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR4 <400> 7 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 122 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> the VHH chain of the nanobody <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Ser 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asp Glu Cys Glu Leu Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Ser Leu Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro His Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Pro Gly Thr Asp Arg Tyr Ser Asp Cys Pro Asn Glu Tyr Ser Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 366 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> the polynucleotide sequence <400> 9 caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60 tcctgtacag cctctggatt cactttggat gattctgaca tgggctggta ccgccaggct 120 ccaggggatg agtgcgagtt ggtctcaact attagtagtt tgggtggcac atactatgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc catgacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240 caaatgaaca gcctgaaacc tcacgacacg gccgtgtatt actgtgcgcc ggggacagac 300 cgttatagcg actgccctaa tgagtatagc gtctggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR1 <400> 10 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser 20 25 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR4 <400> 11 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 122 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> the VHH chain of the nanobody <400> 12 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Ser 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asp Glu Cys Glu Leu Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Ser Leu Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro His Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Pro Gly Thr Asp Arg Tyr Ser Asp Cys Pro Asn Glu Tyr Ser Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 366 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> the polynucleotide sequence <400> 13 gaggttcaat tgttggaatc tggtggtggt ttggttcaac caggtggttc tttgagattg 60 tcttgtactg cttctggttt caccttggac gattctgata tgggatggta cagacaagct 120 ccaggagatg agtgtgagtt ggtttctact atctcttcct tgggtggaac ctactacgct 180 gattctgtca agggtcgttt cactatttct cacgataatg ctaagaacac cgtttacttg 240 caaatgaact ctttaaagcc acatgatact gccgtttact actgtgctcc tggtactgat 300 agatactctg actgtccaaa cgaatactcc gtttggggtc agggtacttt ggttactgtc 360 tcttcc 366 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR1 <400> 14 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ser Asp Met Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR2 <400> 15 Ile Ser Ser Asp Gly Met Thr 1 5 <210> 16 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR3 <400> 16 Ala Ala Thr Lys Tyr Ser Ser Asp Tyr Asp Val Ala Glu Asp Trp Arg 1 5 10 15 Arg Gly Val Cys Gly Asp Met Asp Tyr 20 25 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR1 <400> 17 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Thr Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser 20 25 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR2 <400> 18 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val Ser Ile 1 5 10 15 <210> 19 <211> 38 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR3 <400> 19 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn 1 5 10 15 Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR4 <400> 20 Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 131 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> the VHH chain of the nanobody <400> 21 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Thr Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ser 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val 35 40 45 Ser Ile Ile Ser Ser Asp Gly Met Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Thr Lys Tyr Ser Ser Asp Tyr Asp Val Ala Glu Asp Trp Arg Arg 100 105 110 Gly Val Cys Gly Asp Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser 130 <210> 22 <211> 393 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> the polynucleotide sequence <400> 22 caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ctggagagac tctgagactc 60 tcctgtacag cctctggatt cacttttgat gattctgaca tgggctggta ccgccaggct 120 ccagggaatg agtgcgagtt ggtctcaatt attagtagtg atggtatgac atactatgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc caagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240 caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacaca gccgtgtatt actgtgcggc gacgaagtac 300 tccagcgact atgacgtagc tgaggattgg agacgcgggg tctgtggaga catggactac 360 tggggcaaag gaacccaggt caccgtctcc tca 393 <210> 23 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR1 <400> 23 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser 20 25 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR4 <400> 24 Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 25 <211> 131 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> the VHH chain of the nanobody <400> 25 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ser 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val 35 40 45 Ser Ile Ile Ser Ser Asp Gly Met Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Thr Lys Tyr Ser Ser Asp Tyr Asp Val Ala Glu Asp Trp Arg Arg 100 105 110 Gly Val Cys Gly Asp Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser 130 <210> 26 <211> 393 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> the polynucleotide sequence <400> 26 gaagtccaat tgcttgaatc cggtggtgga ttagttcaac caggtgagac cttgagactg 60 tcctgtaccg cttccggttt cactttcgac gactccgaca tgggttggta cagacaggct 120 ccaggtaatg agtgtgagtt ggtttctatt atttcctctg atggtatgac ttactacgct 180 gattctgtta agggtagatt cactatctct caagacaatg ctaagaacac tgtttacttg 240 caaatgaact ctttgaagcc tgaagatacc gccgtctact actgtgctgc caccaagtac 300 tcctccgatt atgatgtcgc tgaagattgg agaagaggag tttgtggaga tatggattac 360 tggggtaaag gtactttggt taccgtttct tct 393 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR1 <400> 27 Gly Phe Thr Ser Gly Gly Ser Asp Met Gly 1 5 10 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR2 <400> 28 Ile Ser Ser Asp Gly Ser Thr 1 5 <210> 29 <211> 22 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR3 <400> 29 Ala Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Gly Pro Pro Pro Ser Ser Thr Gly Gln 1 5 10 15 Cys Tyr Gly Met Asp Tyr 20 <210> 30 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR1 <400> 30 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser 20 25 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR2 <400> 31 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Asp Leu Val Ser Tyr 1 5 10 15 <210> 32 <211> 38 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR3 <400> 32 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn 1 5 10 15 Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR4 <400> 33 Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 34 <211> 128 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> the VHH chain of the nanobody <400> 34 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Asp Leu Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Gly Pro Pro Pro Ser Ser Thr Gly Gln Cys 100 105 110 Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 35 <211> 384 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> the polynucleotide sequence <400> 35 caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60 tcctgtacag cctctggatt cacttctggc ggttctgaca tgggctggta ccgccaggct 120 ccagggaatg agtgcgactt ggtctcatat attagtagtg atggtagcac atactatgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctcc caagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240 caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcggc caccgactat 300 gggttggggc cgcccccttc ttcgacgggc caatgttacg gcatggacta ctggggcaaa 360 ggaacccagg tcaccgtctc ctca 384 <210> 36 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR1 <400> 36 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser 20 25 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> FR2 <400> 37 Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 38 <211> 128 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> the VHH chain of the nanobody <400> 38 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Asp Leu Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Gly Pro Pro Pro Ser Ser Thr Gly Gln Cys 100 105 110 Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 39 <211> 384 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> the polynucleotide sequence <400> 39 gaagttcagt tgttggaatc aggtggtggt ttggttcaac caggaggttc tctgagattg 60 tcttgtactg cttccggttt cacttccgga ggttctgaca tgggatggta ccgtcaagct 120 cctggtaacg agtgcgactt ggtttcttac atctcttccg acggttccac ttactacgct 180 gattctgtta agggtagatt cactatttct caagacaacg ctaagaatac tgtttacttg 240 cagatgaact ctttgaagcc agaggatacc gctgtttact attgtgccgc cactgattac 300 ggtttgggtc ctccaccatc ttctactgga caatgttacg gtatggatta ctggggtaaa 360 ggtaccctgg tcaccgtttc ctct 384 <210> 40 <211> 264 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> the sequences after ligation <400> 40 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Ser 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asp Glu Cys Glu Leu Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Ser Leu Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro His Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Pro Gly Thr Asp Arg Tyr Ser Asp Cys Pro Asn Glu Tyr Ser Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 130 135 140 Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 145 150 155 160 Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Ser Asp Met 165 170 175 Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asp Glu Cys Glu Leu Val Ser Thr 180 185 190 Ile Ser Ser Leu Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 195 200 205 Phe Thr Ile Ser His Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met 210 215 220 Asn Ser Leu Lys Pro His Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Pro Gly 225 230 235 240 Thr Asp Arg Tyr Ser Asp Cys Pro Asn Glu Tyr Ser Val Trp Gly Gln 245 250 255 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 41 <211> 282 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> the sequences after ligation <400> 41 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ser 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val 35 40 45 Ser Ile Ile Ser Ser Asp Gly Met Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Thr Lys Tyr Ser Ser Asp Tyr Asp Val Ala Glu Asp Trp Arg Arg 100 105 110 Gly Val Cys Gly Asp Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu Thr Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser 165 170 175 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ser Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro 180 185 190 Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val Ser Ile Ile Ser Ser Asp Gly Met Thr 195 200 205 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn 210 215 220 Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 225 230 235 240 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Lys Tyr Ser Ser Asp Tyr Asp 245 250 255 Val Ala Glu Asp Trp Arg Arg Gly Val Cys Gly Asp Met Asp Tyr Trp 260 265 270 Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 275 280 <210> 42 <211> 276 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> the sequences after ligation <400> 42 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Asp Leu Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Gly Pro Pro Pro Ser Ser Thr Gly Gln Cys 100 105 110 Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 145 150 155 160 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr 165 170 175 Ser Gly Gly Ser Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu 180 185 190 Cys Asp Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 195 200 205 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn 210 215 220 Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Gly Pro Pro Pro Ser Ser 245 250 255 Thr Gly Gln Cys Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val 260 265 270 Thr Val Ser Ser 275

Claims (19)

  1. 항-TSLP 나노항체로서,
    상기 나노항체 중의 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)은,
    (1) 서열번호 1로 표시되는 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 3으로 표시되는 CDR3;
    (2) 서열번호 14로 표시되는 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 16으로 표시되는 CDR3; 및
    (3) 서열번호 27로 표시되는 CDR1, 서열번호 28로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 29로 표시되는 CDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항-TSLP 나노항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항-TSLP 나노항체의 VHH 사슬은 프레임 영역(FR)을 더 포함하고, 상기 프레임 영역(FR)은,
    (1) 서열번호 4로 표시되는 FR1, 서열번호 5로 표시되는 FR2, 서열번호 6으로 표시되는 FR3, 및 서열번호 7로 표시되는 FR4;
    (2) 서열번호 10으로 표시되는 FR1, 서열번호 5로 표시되는 FR2, 서열번호 6으로 표시되는 FR3, 및 서열번호 11로 표시되는 FR4;
    (3) 서열번호 17로 표시되는 FR1, 서열번호 18로 표시되는 FR2, 서열번호 19로 표시되는 FR3, 및 서열번호 20으로 표시되는 FR4;
    (4) 서열번호 23으로 표시되는 FR1, 서열번호 18로 표시되는 FR2, 서열번호 19로 표시되는 FR3, 및 서열번호 24로 표시되는 FR4;
    (5) 서열번호 30으로 표시되는 FR1, 서열번호 31로 표시되는 FR2, 서열번호 32로 표시되는 FR3, 및 서열번호 33으로 표시되는 FR4; 및
    (6) 서열번호 36으로 표시되는 FR1, 서열번호 31로 표시되는 FR2, 서열번호 32로 표시되는 FR3, 및 서열번호 37로 표시되는 FR4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항-TSLP 나노항체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항-TSLP 나노항체의 VHH 사슬의 아미노산 서열은 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 21, 서열번호 25, 서열번호 34, 서열번호 38, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항-TSLP 나노항체.
  4. 항-TSLP 항체로서,
    TSLP 에피토프에 대한 항체이며, 제1항에 따른 항-TSLP 나노항체를 갖는 것을 특징으로 하는 항-TSLP 항체.
  5. 항-TSLP 항체로서,
    상기 항체는 하나 이상의 제1항에 따른 항-TSLP 나노항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-TSLP 항체.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 항체는 단량체, 2가 항체, 및/또는 다가 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-TSLP 항체.
  7. 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 제1항에 따른 항-TSLP 나노항체, 제4항에 따른 항-TSLP 항체 또는 제5항에 따른 항-TSLP 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 발현 벡터로서,
    상기 발현 벡터는 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  9. 숙주 세포로서,
    상기 숙주 세포는 제8항에 따른 발현 벡터를 함유하거나, 이의 유전체에 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드가 통합되어 있는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  10. 항-TSLP 나노항체 생성 방법으로서,
    (a) 나노항체를 생성하기에 적합한 조건에서, 제9항에 따른 숙주 세포를 배양함으로써 상기 항-TSLP 나노항체를 함유한 배양물을 획득하는 단계;
    (b) 상기 배양물로부터 상기 항-TSLP 나노항체를 분리하거나 회수하는 단계; 및
    (c) 선택적으로, 단계 (b)에서 획득한 항-TSLP 나노항체를 정제 및/또는 변형하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-TSLP 나노항체 생성 방법.
  11. 면역접합체로서,
    상기 면역접합체는,
    (a) 제1항에 따른 항-TSLP 나노항체, 제4항에 따른 항-TSLP 항체 또는 제5항에 따른 항-TSLP 항체; 및
    (b) 검출 가능한 마커, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성 핵종, 효소, 금 나노입자/나노막대, 자성 나노입자, 바이러스 코트 단백질 또는 VLP, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합 부분을 함유하는 것을 특징으로 하는 면역접합체.
  12. 다중특이성 항체로서,
    상기 다중특이성 항체는, 제1항에 따른 항-TSLP 나노항체, 제4항에 따른 항-TSLP 항체 또는 제5항에 따른 항-TSLP 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중특이성 항체.
  13. 재조합 단백질로서,
    상기 재조합 단백질은,
    (i) 제1항에 따른 항-TSLP 나노항체, 제4항에 따른 항-TSLP 항체 또는 제5항에 따른 항-TSLP 항체; 및
    (ii) 발현 및/또는 정제를 돕기 위한 선택적인 태그 서열;을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
  14. 약학적 조성물로서,
    상기 약학적 조성물은,
    (i) 제1항에 따른 항-TSLP 나노항체, 제4항에 따른 항-TSLP 항체 또는 제5항에 따른 항-TSLP 항체, 또는 제11항에 따른 면역접합체 또는 제12항에 따른 다중특이성 항체 또는 제13항에 따른 재조합 단백질; 및
    (ii) 약학적으로 허용 가능한 담체;를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제1항에 따른 항-TSLP 나노항체, 제4항에 따른 항-TSLP 항체 또는 제5항에 따른 항-TSLP 항체, 제11항에 따른 면역접합체 또는 제12항에 따른 다중특이성 항체 또는 제13항에 따른 재조합 단백질 또는 제14항에 따른 약학적 조성물의 용도로서,
    (a) TSLP 관련 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약물을 제조하거나; 및/또는 (b) TSLP 검출 시약, 검출 플레이트 또는 키트를 제조하는 것을 특징으로 하는 용도.
  16. 샘플 중 TSLP 단백질의 검출 방법으로서,
    상기 방법은,
    (1) 샘플을 제1항에 따른 항-TSLP 나노항체, 제4항에 따른 항-TSLP 항체 또는 제5항에 따른 항-TSLP 항체, 또는 제11항에 따른 면역접합체 또는 제12항에 따른 다중특이성 항체 또는 제13항에 따른 재조합 단백질과 접촉시키는 단계; 및
    (2) 항원-항체 복합체를 형성하는지 여부를 검출하되, 복합체를 형성하면 샘플에 TSLP 단백질이 존재한다는 것을 나타내는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플 중 TSLP 단백질의 검출 방법.
  17. TSLP 단백질 검출 시약으로서,
    상기 검출 시약은,
    (i) 제1항에 따른 항-TSLP 나노항체, 제4항에 따른 항-TSLP 항체 또는 제5항에 따른 항-TSLP 항체, 또는 제11항에 따른 면역접합체 또는 제12항에 따른 다중특이성 항체 또는 제13항에 따른 재조합 단백질; 및
    (ii) 검출학적으로 허용 가능한 담체;를 포함하는 것을 특징으로 하는 TSLP 단백질 검출 시약.
  18. TSLP 단백질 검출용 키트로서,
    상기 키트는 제7항에 따른 면역접합체 또는 제17항에 따른 검출 시약 및 설명서를 함유하는 것을 특징으로 하는 TSLP 단백질 검출용 키트.
  19. 제11항에 따른 면역접합체의 용도로서,
    체내에서 TSLP 단백질을 검출하기 위한 조영제를 제조하는 것을 특징으로 하는 용도.
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