KR20220147642A - Il4r에 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Il4r에 결합하는 항체 및 이의 용도 Download PDF

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밍주 첸
웨이 탄
케시 시아오유엔 종
마크 지칭 마
슈카이 시아
젱핑 장
홍지앙 쑤
지지안 루
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치아타이 티안큉 파마수티컬 그룹 주식회사
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Abstract

본 발명은 인간 IL4Rα에 특이적으로 결합하는 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위를 제공한다. 본 발명은 또한 항체 또는 그 항원 결합 부위를 코딩하는 핵산 분자, 항체 또는 그 항원 결합 부위를 발현하기 위한 발현 벡터, 숙주 세포 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 항체 또는 그 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이성 분자, 항암 바이러스 및 약학 조성물, 그리고 본 발명의 항IL4Rα 항체 또는 그 항원 결합 부위를 사용하는 치료방법을 제공한다.

Description

IL4R에 결합하는 항체 및 이의 용도
[관련 출원의 상호 참조]
본 출원은 2020년 2월 27일에 출원된 미국 가출원 No.62/982,521에 기초한 우선권을 주장한다.
전술한 출원 및 본 출원에서 인용되거나 심사된 모든 문헌("출원에서 인용된 문헌"), 본 출원에서 인용되거나 참조된 모든 문헌(본 출원에서 인용된 모든 문헌, 특허, 공개된 특허출원을 포함하지만 이에 한정되지 않음)("본 출원에서 인용된 문헌"), 및 본 출원에서 인용된 문헌에서 인용되거나 참조된 모든 문헌은 본 명세서에서 언급된 제품 또는 본 명세서에 참조로 포함된 문헌에서 언급된 제품의 제조업자의 지시, 설명, 제품 사양 및 제품 시트와 함께, 본 명세서에서 본 발명의 실시에 참조로 포함되어 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 모든 참조 문헌은 개별 문헌이 참조로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 제시된 경우와 동일한 정도로 참조로 포함된다. 본 발명에서 언급된 모든 Genbank 서열은 본 발명의 가장 빠른 유효 출원일의 서열이 되도록 Genbank 서열의 원용에 의해 포함된다.
[기술분야]
본 발명은 높은 친화력 및 기능성으로 인간 IL4R, 특히 IL4Rα에 결합하는, 단리된 단클론항체, 특히 마우스, 키메라 또는 인간화 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위를 코딩하는 핵산 분자, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위를 발현시키기 위한 발현 벡터, 숙주 세포 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이성 분자, 면역 복합체, 키메라 항원 수용체, 항암 바이러스 약학 조성물 및 본 발명의 항IL4Rα 항체 또는 그 항원 결합 부위를 사용하는 치료방법을 제공한다.
아토피성 피부염, 과민증, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식 등의 2형 염증 관련 알레르기성 질환은 전세계적으로 30억 명 이상이 앓고 있으며 발생률이 계속 증가하고 있다. 위생 가설에 따르면, 발생률이 높은 이유는 생활 수준이 향상됨에 따라 감염증에 대한 노출이 감소하여 면역계가 특정 무해한 알레르겐을 보다 많이 처리하기 때문이다(Stephen J. Galli et al., (2008) Nature 454 (7203): 445-454). 2형 면역의 두 가지 중심 요인은 인터루킨-4(IL-4)와 IL-13이다. 이들은 예를 들면 면역글로불린 E 생산 및 염증 부위로의 선천성 세포 동원 등, 2형 염증과 관련된 대부분의 주요 특징을 유도하는 데 필요하다(Gruning G et al., (1998) Science 282: 2261-2263; Rankin JA et al., (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 7821-7825; Wills-Karp M et al., (1998) Science 282: 2258-2261).
IL-4와 IL-13은 인간의 5번 염색체 상에서 서로 인접하여 조절 요소를 공유할 수 있다. T 헬퍼 2(TH2) 세포에서 이들 두 사이토카인의 협조적 및 비협조적 발현이 모두 관찰된다(Katherine Bao et al., (2015) Cytokine 75 (1): 25-37). 두 사이토카인은 세포 표면 수용체에 결합하여 세포 기능을 조절하고 전사 메커니즘을 활성화한다. 구체적으로, IL-4는 먼저 피코몰 친화성(picomolar affinity)으로 IL-4Rα 사슬에 결합하고, IL-2Rγ γc 사슬을 동원하여 I형 수용체 복합체를 형성하거나 IL-13Rα1을 동원하여 II형 수용체 복합체를 형성한다. IL-2Rγγc 및 IL-13Rα1의 수준 또는 가용성에 따라 수용체 복합체 형성에 어느 것을 동원할지가 결정된다. 비-조혈 세포는 IL-2Rγγc를 발현하지 않거나 저발현하고 IL-13Rα1을 고발현하는 반면, 림프구에서는 반대인 것이 발견되었다. 골수 세포는 이 두 종류의 세포 사이에 있다. II형 IL-4 수용체 복합체의 형성은 IL-13이 나노몰 친화성으로 IL-13Rα1 사슬에 결합함으로써 시작되고 IL-4Rα 사슬을 추가로 동원할 수도 있다. II형 IL-4 수용체 외에도 IL-13은 IL-13Rα2에 피코몰 친화성으로 결합할 수 있으며, 이는 미끼(decoy) 수용체로 기능한다(Irina G. Luzina et al., (2012) J Leukoc Biol 92 (4): 753-764). IL-4 수용체 복합체가 조립되면 세포 내 신호 전달 분자가 활성화되고, 그 중 STAT6 및 IRS 신호 전달은 I형 IL-4 수용체 활성화에 반응하지만, II형 IL-4 수용체는 IRS를 유의하게 활성화시킬 수 없다(Heller NM et al., (2008) Sci Signal 1 (51): ra17-ra17). STAT6 신호 전달은 TH2 세포의 분화와 IL-4 생산에 중요하며, IRS 분자는 PI3K 및 mTOR 등의 신호 전달 경로를 활성화한다(Gadani SP et al., (2012) J Immunol 189: 4213-4219).
연구에 따르면, 과도한 IL-4/IL-13 신호 전달은 알레르기성 질환을 일으킬 수 있음이 시사되었고, 따라서 IL-4 및 IL-13을 통한 신호 전달을 변형하기 위한 여러 치료용 항체가 개발되었다. 예를 들면, IL-13에 결합하는 레브리키주맙(Leprikizumab), 안루킨주맙(Anrukinzumab) 및 트랄로키누맙(Tralokinumab), 그리고 IL-4를 표적으로 한 파스콜리주맙(Pascolizumab)이 있다. 두필루맙(Dupilumab)과 피트라킨라(Pitrakinra)는 IL-4Rα 길항제이며, 피트라킨라(Pitrakinra)는 IL-4Rα에 결합하면 I형과 II형 모두에서 IL-4 수용체를 차단한다(Antoniu SA (2010) Curr Opin Investig Drugs 11: 1286-1294). 그리고 STAT6 억제제는 전립선암 세포의 증식을 억제하는 것으로 알려져 있으며, 이는 IL-4/IL-13을 표적으로 하는 것이 암 치료에 도움이 될 수 있음을 시사한다(Nappo G et al., (2017) Oncogenesis 2017, 6 (5): e342). 따라서, 보다 바람직한 치료 특성을 갖춘, IL-4, IL-13 및 이들의 수용체(특히 IL-4Rα)를 표적으로 한 보다 많은 항체가 요망된다.
본 발명은 종래기술인 예를 들면 두필루맙(Dupilumab)과 같은 항IL4Rα 항체와 비교해서 인간 및/또는 원숭이 IL4Rα와 동등 이상의 결합 친화성/능력, 그리고 IL4Rα-IL4/IL13-IL13Rα1 상호작용 및 대응하는 세포 내 신호 전달에 대한 동등 이상의 차단 활성을 갖는, IL4Rα(예를 들면, 인간 IL4Rα)에 결합하는 예를 들면 마우스, 인간, 키메라 또는 인간화 단클론항체인 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 단리된 단클론항체(예를 들면, 마우스 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체) 또는 그 항원 결합 부위를 제공한다. 상기 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위는 IL4Rα에 결합하고 중쇄 가변영역을 포함한다. 상기 중쇄 가변영역은 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. 여기서 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역은 (1) 각각 서열번호 1, 5 및 10에 표시된 아미노산 서열; (2) 각각 서열번호 1, 6 및 11에 표시된 아미노산 서열; (3) 각각 서열번호 2, 7 및 12에 표시된 아미노산 서열; (4) 각각 서열번호 3, 8 및 13에 표시된 아미노산 서열; (5) 각각 서열번호 4, 8 및 13에 표시된 아미노산 서열; 또는 (6) 각각 서열번호 3, 9 및 14에 표시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명의 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위는 중쇄 가변영역을 포함한다. 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 32, 33(X1=W, X2=S; X1=L, X2=A; X1=W, X2=A), 34, 38, 40, 41(X1=A, X2=K, X3=V, X4=H; X1=V, X2=K, X3=V, X4=H; X1=A, X2=Q, X3=V, X4=H; X1=A, X2=K, X3=M, X4=H; X1=A, X2=K, X3=V, X4=Y; X1=V, X2=K, X3=M, X4=H), 42(X1=R, X2=A, X3=S, X4=N; X1=K, X2=V, X3=S, X4=N; X1=K, X2=A, X3=T, X4=N; X1=K, X2=A, X3=S, X4=D; X1=R, X2=V, X3=T, X4=N), 43, 44, 47, 49, 51 또는 53에 표시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 여기서, 상기 항체 또는 그 항원 결합 부위는 IL4Rα에 결합한다. 서열번호 32에 표시된 아미노산 서열은 서열번호 59 또는 60에 표시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 서열번호 40에 표시된 아미노산 서열은 서열번호 65 또는 66에 표시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 서열번호 33(X1=W, X2=A) 및 41(X1=V, X2=K, X3=M, X4=H)에 표시된 아미노산 서열은 각각 서열번호 61 또는 67에 표시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위는 IL4Rα에 결합한다. 상기 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위는 경쇄 가변영역을 포함한다. 상기 경쇄 가변영역은 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. 여기서 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역은 (1) 각각 서열번호 15, 22 및 26에 표시된 아미노산 서열; (2) 각각 서열번호 16, 22 및 27에 표시된 아미노산 서열; (3) 각각 서열번호 17, 23 및 28에 표시된 아미노산 서열; (4) 각각 서열번호 18, 24 및 29에 표시된 아미노산 서열; (5) 각각 서열번호 19, 24 및 30에 표시된 아미노산 서열; (6) 각각 서열번호 20, 25 및 31에 표시된 아미노산 서열; 또는 (7) 각각 서열번호 21, 25 및 31에 표시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명의 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위는 경쇄 가변영역을 포함한다. 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 35, 36(X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; X1=F, X2=I), 37, 39, 45, 46, 48, 50, 52 또는 54에 표시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 여기서, 상기 항체 또는 그 항원 결합 부위는 IL4Rα에 결합한다. 서열번호 35에 표시된 아미노산 서열은 서열번호 62 또는 63에 표시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 서열번호 45에 표시된 아미노산 서열은 서열번호 68 또는 69에 표시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 서열번호 36(X1=F, X2=V) 및 46에 표시된 아미노산 서열은 각각 서열번호 64 또는 70에 표시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함한다. 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 각각 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. 여기서, 중쇄 가변영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 그리고 경쇄 가변영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 (1) 각각 서열번호 1, 5, 10, 15, 22 및 26에 표시된 아미노산 서열; (2) 각각 서열번호 1, 6, 11, 16, 22 및 27에 표시된 아미노산 서열; (3) 각각 서열번호 2, 7, 12, 17, 23 및 28에 표시된 아미노산 서열; (4) 각각 서열번호 3, 8, 13, 18, 24 및 29에 표시된 아미노산 서열; (5) 각각 서열번호 4, 8, 13, 19, 24 및 30에 표시된 아미노산 서열; (6) 각각 서열번호 3, 9, 14, 20, 25 및 31에 표시된 아미노산 서열; 또는 (7) 각각 서열번호 3, 9, 14, 21, 25 및 31에 표시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 여기서, 상기 항체 또는 그 항원 결합 부위는 IL4Rα에 결합한다.
일 측면에서, 본 발명의 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함한다. 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 (1) 각각 서열번호 32 및 35에 표시된 아미노산 서열; (2) 각각 서열번호 33(X1=W, X2=S) 및 36(X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; X1=F, X2=I)에 표시된 아미노산 서열; (3) 각각 서열번호 33(X1=W, X2=S) 및 37에 표시된 아미노산 서열; (4) 각각 서열번호 34 및 36(X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; X1=F, X2=I)에 표시된 아미노산 서열; (5) 각각 서열번호 34 및 37에 표시된 아미노산 서열; (6) 각각 서열번호 33(X1=L, X2=A) 및 36(X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; X1=F, X2=I)에 표시된 아미노산 서열; (7) 각각 서열번호 33(X1=L, X2=A) 및 37에 표시된 아미노산 서열; (8) 각각 서열번호 33(X1=W, X2=A) 및 36(X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; X1=F, X2=I)에 표시된 아미노산 서열; (9) 각각 서열번호 33(X1=W, X2=A) 및 37에 표시된 아미노산 서열; (10) 각각 서열번호 38 및 39에 표시된 아미노산 서열; (11) 각각 서열번호 40 및 45에 표시된 아미노산 서열; (12) 각각 서열번호 41(X1=A, X2=K, X3=V, X4=H; X1=V, X2=K, X3=V, X4=H; X1=A, X2=Q, X3=V, X4=H; X1=A, X2=K, X3=M, X4=H; X1=A, X2=K, X3=V, X4=Y; X1=V, X2=K, X3=M, X4=H) 및 46에 표시된 아미노산 서열; (13) 각각 서열번호 42(X1=R, X2=A, X3=S, X4=N; X1=K, X2=V, X3=S, X4=N; X1=K, X2=A, X3=T, X4=N; X1=K, X2=A, X3=S, X4=D; X1=R, X2=V, X3=T, X4=N) 및 46에 표시된 아미노산 서열; (14) 각각 서열번호 43 및 46에 표시된 아미노산 서열; (15) 각각 서열번호 44 및 46에 표시된 아미노산 서열; (16) 각각 서열번호 47 및 48에 표시된 아미노산 서열; (17) 각각 서열번호 49 및 50에 표시된 아미노산 서열; (18) 각각 서열번호 51 및 52에 표시된 아미노산 서열; 또는 (19) 각각 서열번호 53 및 54에 표시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 여기서, 상기 항체 또는 그 항원 결합 부위는 IL4Rα에 결합한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 상기 중쇄 및 경쇄는 디설파이드 결합을 통해 연결되고, 상기 중쇄는 중쇄 가변영역 및 중쇄 불변영역을 포함하고, 상기 경쇄는 경쇄 가변영역 및 경쇄 불변영역을 포함한다. 여기서, 중쇄 가변영역의 C말단은 중쇄 불변영역의 N말단에 연결되고, 경쇄 가변영역의 C말단은 경쇄 불변영역의 N말단에 연결된다. 여기서, 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 전술한 아미노산 서열을 포함하면서, 상기 항체 또는 그 항원 결합 부위는 IL4Rα에 결합한다. 중쇄 불변영역은 서열번호 55에 표시된 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG4 불변영역일 수 있다. 경쇄 불변영역은 서열번호 56에 표시된 아미노산 서열을 갖는 인간 κ 불변영역일 수 있다. 서열번호 55 및 56에 표시된 아미노산 서열은 각각 서열번호 71 및 72에 표시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함하거나, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 구성된다. 여기서, 각 중쇄는 상기 중쇄 불변영역, 상기 중쇄 가변영역 또는 CDR 서열을 포함하고, 각 경쇄는 상기 경쇄 불변영역, 상기 경쇄 가변영역 또는 CDR 서열을 포함한다. 여기서, 상기 항체는 IL4Rα에 결합한다. 본 발명의 항체는 전장 항체(full-length antibody), 예를 들면 IgG1, IgG2 또는 IgG4 아이소타입(isotype) 전장 항체, 바람직하게는 약한 ADCC 활성을 갖는 IgG4 아이소타입 전장 항체일 수 있다. 경쇄 불변영역은 κ 불변영역일 수 있다. 그 밖의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 단일사슬 가변영역(scFv) 항체 또는 항체 단편(fragment), 예를 들면 Fab 또는 F(ab')2 단편일 수 있다.
예를 들면, 두필루맙(Dupilumab) 등 종래기술의 항IL4Rα 항체와 비교해서, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위는 인간 IL4Rα 및/또는 원숭이 IL4Rα에 대해 더 높지는 않더라도 동등한 결합 친화성/능력을 가진다. 그리고 IL4Rα-IL4/IL13-IL13Rα1 상호작용 및 대응하는 세포 내 신호 전달에 대해 더 높지는 않더라도 동등한 차단 활성을 갖고 있다.
본 발명은 또한 상기 항체 또는 그 항원 결합 부위와 상이한 결합 특이성을 갖는 제2 기능적 모이어티(예를 들면, 제2 항체)에 연결된, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이성 분자를 제공한다. 본 발명은 예를 들면 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate)와 같은 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위를 포함하는 면역 복합체를 추가로 제공한다. 여기서, 상기 항체 또는 그 항원 결합 부위는 치료제(예를 들면, 세포 독소)에 연결된다. 다른 일 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위는 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부일 수 있다. 본 발명은 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포 등의 면역 세포를 추가로 제공한다. 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위는 항암 바이러스에 의해 코딩되거나 항암 바이러스와 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위, 면역 복합체, 이중특이성 분자, 항암 바이러스, CAR 또는 CAR-T 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 약학 조성물은 항알레르기제 또는 항종양제를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위를 코딩하는 핵산 분자, 그리고 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 (i) 숙주 세포에서 항체를 발현하는 것, 및 (ii) 숙주 세포 또는 그 세포 배양물로부터 항체를 단리하는 것을 포함하는, 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 의한 항IL4Rα 항체 또는 그 항원 결합 부위를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 일 측면에서, IL4/IL13 신호 전달을 감소시키는 방법을 제공한다. IL4는 IL-4Rα 및 γC를 포함하는 수용체를 통해 신호를 전달하고, IL13은 IL-4Rα 및 IL13Rα1을 포함하는 수용체를 통해 신호를 전달한다. IL4/IL13 신호 전달의 비한정적인 예에는 B 세포, 호산구, 마크로파지(예를 들면, 활성화 마크로파지)의 활성화 및/또는 증식, 섬유아세포의 증식, 및 기도 평활근 등 평활근의 증식이 포함된다.
다른 일 측면에서, 본 발명은 과잉 IL4/IL13 신호 전달 관련 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 치료 유효량의 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위를 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
상기 질환은 알레르기성 질환일 수 있다. 상기 알레르기성 질환은 아토피성 피부염, 알레르기 반응, 알레르기성 비염 또는 알레르기성 천식일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 알레르기성 질환을 치료하는 방법은 본 발명의 조성물, 이중특이성 분자, 또는 항체를 코딩하거나 보유하는 항암 바이러스, 또는 대상에서 전술한 것과 동일한 것을 발현할 수 있는 핵산 분자 또는 벡터를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은 또한 항알레르기제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 항알레르기제는 항히스타민제, 코르티코스테로이드, β-아드레날린 수용체 작용제(agonist), cyc-LT를 표적으로 한 약제, 또는 IgE를 표적으로 한 약제일 수 있다.
상기 질환은 종양 질환일 수 있다. 상기 종양은 고형 종양 또는 비고형 종양일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 종양은 전립선암이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 본 발명의 조성물, 이중특이성 분자, 항체-약물 접합체 등의 면역 복합체, CAR-T 세포, 또는 항체를 코딩하거나 보유하는 항암 바이러스, 또는 대상에서 전술한 것과 동일한 것을 발현할 수 있는 핵산 분자 또는 벡터를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 항암 항체, 예를 들면 항VISTA 항체, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항LAG-3 항체, 항CTLA-4 항체, 항TIM3 항체, 항STAT3 항체 및/또는 항ROR1 항체를 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위와 함께 투여할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위는 사이토카인(예를 들면, IL-2, IL-21 및/또는 GM-CSF) 또는 공동자극 항체(예를 들면, 항CD137 항체 및/또는 항GITR 항체)와 함께 투여할 수 있다. 본 발명의 항체는 예를 들면 마우스 항체, 인간 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.
다른 일 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 2형 면역 반응을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 본 발명의 조성물, 이중특이성 분자, 또는 항체를 코딩하거나 보유하는 항암 바이러스, 또는 대상에서 전술한 것과 동일한 것을 발현할 수 있는 핵산 분자 또는 벡터를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
다른 일 측면에서, 본 발명은 진단을 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 세포 또는 조직에서 IL4Rα의 존재 및 발현을 결정하기 위해 사용되며 예후 및 적절한 치료 및 후속 조치를 결정한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 아래의 상세한 설명 및 실시예를 통해 명백해질 것이나, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 출원에서 인용된 모든 문서, Genbank 기록, 특허 및 공개된 특허출원의 내용은 참조를 통해 명시적으로 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위는 IL4Rα 단백질의 검출, 그리고 알레르기성 질환 및 암 등 IL4, IL13 또는 IL4R 관련 질환의 치료 및 예방을 포함한 다양한 용도로 사용할 수 있다.
도 1a-1c는 인간 IL4Rα에 대한 마우스 항체 B1D2F7D3B5(A), B8G11F2B7G5E8 및 B9D1D11F8D8(B), C2C1A1A1 및 C2B2F7B7(C)의 결합 능력을 나타낸다.
도 2a-2d는 세포 표면 인간 IL4Rα에 대한 마우스 항체 B1D2F7D3B5(A), B8G11F2B7G5E8(B), B9D1D11F8D8(C), C2C1A1A1 및 C2B2F7B7(D)의 결합 능력을 나타낸다.
도 3은 게먹이원숭이(cynomolgus) IL4Rα에 대한 마우스 항체 B1D2F7D3B5, B8G11F2B7G5E8, B9D1D11F8D8, C2C1A1A1 및 C2B2F7B7의 결합 능력을 나타낸다.
도 4a-4b는 인간 IL4Rα-IL4 상호작용에 대한 마우스 항체 B1D2F7D3B5, B8G11F2B7G5E8 및 B9D1D11F8D8(A), C2C1A1A1 및 C2B2F7B7(B)의 차단 능력을 나타낸다.
도 5a-5b는 Benchmark-인간 IL4Rα의 결합에 대한 마우스 항체 B1D2F7D3B5, B8G11F2B7G5E8 및 B9D1D11F8D8(A), C2C1A1A1 및 C2B2F7B7(B)의 차단 능력을 나타낸다.
도 6a-6c는 인간 IL4와 세포 표면 인간 IL4Rα의 상호작용에 대한 마우스 항체 B1D2F7D3B5 및 B8G11F2B7G5E8(A), B9D1D11F8D8(B), C2C1A1A1 및 C2B2F7B7(C)의 차단 능력을 나타낸다.
도 7은 HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2 세포에서 IL4 유도 STAT6 인산화에 대한 마우스 항체 B1D2F7D3B5, B8G11F2B7G5E8, B9D1D11F8D8, C2C1A1A1 및 C2B2F7B7의 억제 활성을 나타낸다.
도 8은 HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2 세포에서 IL13 유도 STAT6 인산화에 대한 마우스 항체 B1D2F7D3B5, B8G11F2B7G5E8, B9D1D11F8D8, C2C1A1A1 및 C2B2F7B7의 억제 활성을 나타낸다.
도 9는 인간 IL4Rα에 대한 키메라 항체 B8G11F2B7G5E8 및 C2C1A1A1의 결합 능력을 나타낸다.
도 10은 세포 표면 인간 IL4Rα에 대한 키메라 항체 B8G11F2B7G5E8 및 C2C1A1A1의 결합 능력을 나타낸다.
도 11은 인간 IL4Rα-IL4 상호작용에 대한 키메라 항체 B8G11F2B7G5E8 및 C2C1A1A1의 차단 능력을 나타낸다.
도 12는 HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2 세포에서 IL4 유도 STAT6 인산화에 대한 키메라 항체 B8G11F2B7G5E8 및 C2C1A1A1의 억제 활성을 나타낸다.
도 13은 HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2 세포에서 IL13 유도 STAT6 인산화에 대한 키메라 항체 B8G11F2B7G5E8 및 C2C1A1A1의 억제 활성을 나타낸다.
도 14a-14b는 인간 IL4Rα에 대한 인간화 항체 huB8G11F2B7G5E8-V2, huB8G11F2B7G5E8-V4 및 huB8G11F2B7G5E8-V14(A), huC2C1A1A1-V14 및 huC2C1A1A1-V15(B)의 결합 능력을 나타낸다.
도 15a-15b는 cal-IL4Rα에 대한 인간화 항체 huB8G11F2B7G5E8-V2, huB8G11F2B7G5E8-V4 및 huB8G11F2B7G5E8-V14(A), huC2C1A1A1-V14 및 hUC2C1A1A1-V15(B)의 결합 능력을 나타낸다.
도 16A-16B는 cal-IL4Rα에 대한 인간화 항체 huB8G11F2B7G5E8-V2, huB8G11F2B7G5E8-V4 및 huB8G11F2B7G5E8-V14(A), huC2C1A1A1-V14 및 huC2C1A1A1-V15(B)의 결합 능력을 나타낸다.
도 17a-17b는 세포 표면 인간 IL4Rα에 대한 인간화 항체 huB8G11F2B7G5E8-V2, huB8G11F2B7G5E8-V4 및 huB8G11F2B7G5E8-V14(A), huC2C1A1A1-V14 및 huC2C1A1A1-V15(B)의 결합 능력을 나타낸다.
도 18a-18b는 인간 IL4와 인간 IL4Rα를 발현하는 293F 세포의 상호작용에 대한 인간화 항체 huB8G11F2B7G5E8-V2, huB8G11F2B7G5E8-V4 및 huB8G11F2B7G5E8-V14(A), huC2C1A1A1-V14 및 huC2C1A1A1-V15(B)의 차단 능력을 나타낸다.
도 19a-19b는 인간 IL4Rα-IL4 상호작용에 대한 인간화 항체 huB8G11F2B7G5E8-V2, huB8G11F2B7G5E8-V4 및 huB8G11F2B7G5E8-V14(A), huC2C1A1A1-V14 및 huC2C1A1A1-V15(B)의 차단 능력을 나타낸다.
도 20a-20b는 Benchmark-인간 IL4의 결합에 대한 인간화 항체 huB8G11F2B7G5E8-V2, huB8G11F2B7G5E8-V4 및 huB8G11F2B7G5E8-V14(A), huC2C1A1A1-V14 및 huC2C1A1A1-V15(B)의 차단 능력을 나타낸다.
도 21은 HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2 세포에서 IL4 유도 STAT6 인산화에 대한 인간화 항체 huB8G11F2B7G5E8-V2, huB8G11F2B7G5E8-V4 및 huB8G11F2B7G5E8-V14(A), huC2C1A1A1-V14 및 huC2C1A1A1-V15(B)의 억제 활성을 나타낸다.
도 22는 HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2 세포에서 IL13 유도 STAT6 인산화에 대한 인간화 항체 huB8G11F2B7G5E8-V2, huB8G11F2B7G5E8-V4 및 huB8G11F2B7G5E8-V14(A), huC2C1A1A1-V14 및 huC2C1A1A1-V15(B)의 억제 활성을 나타낸다.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 일부 용어를 먼저 정의한다. 그 밖의 정의는 상세한 설명 전체에 기재되어 있다.
용어 "IL4Rα"는 인터루킨 4 수용체의 α 서브유닛을 가리킨다. 용어 "IL4Rα"에는 베리언트(variant), 아이소폼(isoform), 호모로그(homolog), 오솔로그(ortholog) 및 파라로그(paralog)가 포함된다. 예를 들면, 인간 IL4Rα 단백질에 특이적인 항체는 어느 경우에는 원숭이와 같은 인간 이외의 종에서 유래된 IL4Rα 단백질과 교차 반응할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 인간 IL4Rα 단백질에 특이적인 항체는 인간 IL4Rα 단백질에 완전히 특이적일 수 있고, 다른 종 또는 다른 유형에 대해 교차 반응성을 나타내지 않거나, 다른 종을 제외하고 특정 종에서 유래된 IL4Rα와 교차 반응할 수 있다.
용어 "인간 IL4Rα"는 인간 유래의 아미노산 서열을 갖는 IL4Rα 단백질을 가리킨다. 예를 들면 Genbank 등록번호 NP_001244335.1을 갖는 인간 IL4Rα의 아미노산 서열 등일 수 있다. 용어 "게먹이원숭이(cynomolgus) IL4Rα" 및 "마모셋원숭이(marmoset monkey) IL4Rα"는 예를 들면 각각 Genbank 등록번호 EHH60265.1 및 NP_001244161.1의 아미노산 서열을 갖는 IL4Rα 서열일 수 있다.
본 명세서에서 언급된 "항체"라는 용어는 전장 항체 및 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원 결합 부위") 또는 그 단일사슬(single chain)을 포함한다. 전장 항체는 디설파이드 결합을 통해 상호 연결된 2개의 중(H)쇄와 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당 단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변영역(본 명세서에서는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변영역으로 구성된다. 중쇄 불변영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변영역(본 명세서에서는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변영역으로 구성된다. 경쇄 불변영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재하는, 상보성 결정영역(CDR)으로 불리는 초 가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배치된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변영역에는 항원과 상호작용하는 결합 도메인이 포함된다. 항체의 불변영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들면, 이펙터 세포) 및 고전적인 보체계의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
항체의 "항원 결합 부위"(또는 간단히 "항체 부위")라는 용어는 본 명세서에서 사용될 경우, 항원(예를 들면, IL4Rα 단백질)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 또는 복수의 단편을 가리킨다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 실행될 수 있는 것으로 나타나 있다. 항체의 "항원 결합 부위"라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지영역에서 디설파이드 가교를 통해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 싱글 암의 VL 및 VH로 이루어진 Fv 단편; (v) VH로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); (vi) 단리된 상보성 결정영역(CDR); 및 (vii) 나노 항체, 단일 가변 도메인과 2개의 정상 도메인을 포함하는 중쇄 가변영역;이 포함된다. 그리고 Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합법을 사용해서 이들을 싱글 단백질 사슬로 작성할 수 있게 하는 합성 링커를 통해 결합될 수 있다. 여기서, VL 및 VH는 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한다(단일사슬 Fv(scFv)라고 함; 예를 들면, Bird et al., (1988) Science 242: 423-426; 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883을 참조). 이러한 단일사슬 항체 역시 항체의 "항원 결합 부위"라는 용어에 포함되도록 사용된 것이다. 이들 항체 단편은 당업자에게 알려진 종래기술을 사용해서 얻어지며, 단편은 전장 항체와 동일한 방법으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본 명세서에서 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체를 실질적으로 포함하지 않는 항체를 사용된 것이다지칭한다(예를 들면, IL4Rα 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 IL4Rα 단백질 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 포함하지 않음). 그러나 인간 IL4Rα 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종의 IL4Rα 단백질과 같은 다른 항원에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질을 실질적으로 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "단클론항체(monoclonal antibody)" 또는 "단클론항체 조성물"은 단일 분자 조성인 항체 분자의 제조물을 가리킨다. 단클론항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 용어 "마우스 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 모두가 마우스 생식계열 면역글로불린 서열에서 유래된 가변영역을 갖는 항체를 포함하도록 사용된 것이다. 또한 항체가 불변영역을 포함할 경우, 불변영역도 마우스 생식계열 면역글로불린 서열에서 유래된다. 본 발명의 마우스 항체는 마우스 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들면, 인비트로에서 랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해, 또는 인비보에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나 본 명세서에서 사용된 "마우스 항체"라는 용어는 다른 포유동물 종의 생식계열에서 유래된 CDR 서열이 마우스 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
용어 "키메라 항체"는 인간 이외 유래원(source)의 유전 물질을 인간의 유전 물질과 조합함으로써 제작된 항체를 가리킨다. 또는, 보다 일반적으로 키메라 항체는 특정 종의 유전 물질과 다른 종의 유전 물질을 갖는 항체이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "인간화 항체"는 인간에게서 자연적으로 생산되는 항체 변이체와의 유사성을 높이기 위해 단백질 서열이 변형된 비인간 종에서 유래된 항체를 가리킨다.
용어 "아이소타입"은 중쇄 불변영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스(예를 들면, IgM 또는 IgG1)를 가리킨다.
용어 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체", "항원에 대해 특이성을 갖는 항체"는 본 명세서에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용 가능하다.
본 명세서에서, "인간 IL4Rα에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 IL4Rα 단백질(및 아마도 하나 또는 복수의 비인간 종에서 유래된 IL4Rα 단백질)에는 결합하지만 비인간 IL4Rα 단백질에는 실질적으로 결합하지 않는 항체를 가리킨다. 바람직하게는, 항체는 "고친화성(high affinity)"으로 인간 IL4Rα 단백질에 결합한다. 즉, 5.0×10-8M 이하, 바람직하게는 1.0×10-8M 이하, 보다 바람직하게는 7.0×10-9M 이하의 KD로 인간 IL4Rα 단백질에 결합한다.
본 명세서에서 사용된 단백질 또는 세포에 "실질적으로 결합하지 않는다"라는 용어는, 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나 고친화성으로 결합하지 않는 것, 즉 1.0×10-6M 이상, 바람직하게는 1.0×10-5M 이상, 보다 바람직하게는 1.0×10-4M 이상, 더욱 바람직하게는 1.0×10-3M 이상, 더욱 더 바람직하게는 1.0×10-2M 이상의 KD로 단백질 또는 세포에 결합하는 것을 의미한다.
IgG 항체에 대한 "고친화성"이라는 용어는 표적 항원에 대해 1.0×10-6M 이하, 바람직하게는 5.0×10-8M 이하, 보다 바람직하게는 1.0×10-8M 이하, 더욱 바람직하게는 7.0×10-9M 이하, 더욱 더 바람직하게는 1.0×10-9M 이하의 KD를 갖는 항체를 가리킨다. 단, "고친화성" 결합은 다른 항체 아이소타입에서는 다를 수 있다. 예를 들면, IgM 아이소타입에 대한 "고친화성" 결합은 1.0×10-6M 이하, 바람직하게는 1.0×10-7M 이하, 보다 바람직하게는 1.0×10-8M 이하의 KD를 갖는 항체를 가리킨다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도(association rate)를 지칭하기 위한 것인 반면, 본 명세서에서 사용된 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도(dissociation rate)를 지칭하기 위한 것이다. 본 명세서에서 사용된 "KD"라는 용어는 Ka에 대한 Kd의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지고 몰 농도(M)로 표현되는 해리 상수를 지칭하도록 사용된 것이다. 항체의 KD 값은 당해 기술분야에서 충분히 확립된 방법을 사용해서 결정할 수 있다. 항체의 KD를 결정하기 위한 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것이며, 바람직하게는 BiacoreTM 시스템 등의 바이오센서 시스템을 사용하는 것이다.
용어 "EC50"은 반수 최대 유효 농도(half maximal effective concentration)으로도 알려져 있으며, 특정 노출 시간 후에 베이스라인과 최대값 사이에서 중간 반응을 유발하는 항체의 농도를 가리킨다.
용어 "IC50"은 반수 최대 억제 농도(half maximal inhibitory concentration)로도 알려져 있으며, 특정 생물학적 또는 생화학적 기능을 항체 비존재일 때와 비교해서 50% 억제하는 항체의 농도를 가리킨다.
용어 "대상"은 모든 인간 또는 인간 외 동물을 포함한다. 용어 "인간 외 동물"이란 포유류 및 비포유류인 모든 척추 동물을 포함하며, 예를 들면 인간 이외의 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함하나, 인간 이외의 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말 등의 포유류가 바람직하다.
용어 "치료 유효량"은 질환 또는 상태(암 등)와 관련된 증상을 예방 또는 개선하고, 및/또는 질환 또는 상태의 중증도를 감소시키기에 충분한 본 발명의 항체 양을 의미한다. 치료 유효량은 치료되는 상태와 관련이 있는 것으로 이해되며, 실제 유효량은 당업자에 의해 용이하게 식별될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "동일성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이 또는 2개의 폴리펩티드 사이의 서열 유사성을 가리킨다. 두 서열 간 서열 비교 및 퍼센트 동일성 결정은 National Center For Biotechnology Institute Web 사이트에서 입수 가능한 BLASTN/BLASTP 알고리즘의 디폴트 설정으로 수행할 수 있다.
본 발명의 양태를 아래에 보다 상세하게 설명한다.
인간 IL4Rα에 대한 결합 친화성이 향상되고, IL4/IL13 신호 전달 차단 활성이 향상된 항IL4Rα 항체
본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위는 이전에 보고된 항-IL4Rα 항체(Dupilumab 등)와 비교해서, 더 낫지는 않더라도 동등한 결합 친화성/능력으로 인간 IL4Rα에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위는 IL4Rα의 IL4 또는 IL13-IL13Rα1에 대한 결합을 차단할 수 있고, 이에 따라 대응하는 세포 내 신호 전달을 차단할 수 있으며, 이는 보고된 항IL4Rα 항체(Dupilumab 등)와 비교해서 동등하거나 보다 높은 차단 활성을 갖는다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간화 단클론항체다. 또는 본 발명의 항체는 예를 들면 키메라 단클론항체일 수 있다.
항IL4Rα 단클론항체
본 발명의 항체는 하기 및 실시예에 기재된 바와 같이 구조적 및 화학적으로 특징지어진 단클론항체이다. 항체의 중쇄/경쇄 가변영역의 아미노산 서열 ID는 하기 표 1에 정리되어 있으며, 일부 항체는 동일한 VH 또는 VL을 갖는다. 항체의 중쇄 불변영역은 서열번호 55에 표시된 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG4 중쇄 불변영역일 수 있다. 또한 항체의 경쇄 불변영역은 서열번호 56에 표시된 아미노산 서열을 갖는 인간 κ(kappa) 불변영역일 수 있다.
[표 1]
표 1. 중쇄/경쇄 가변영역의 아미노산 서열 ID
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
표 1의 중쇄 가변영역 CDRs 및 경쇄 가변영역 CDRs는 Kabat 넘버링 시스템을 통해 정의되었다. 그러나 당해 기술분야에서 잘 알려진 바와 같이 CDR 영역을 중쇄/경쇄 가변영역 서열에 기초한 Chotia, IMGT, AbM 또는 Contact 넘버링 시스템/방법 등 다른 넘버링 시스템을 통해 결정할 수도 있다.
인간 IL4Rα에 결합하는 다른 항IL4Rα 항체의 VH 및 VL 서열(또는 CDR 서열)은 본 발명의 항IL4Rα 항체의 VH 및 VL 서열(또는 CDR 서열)과 "혼합 및 매칭"될 수 있다. 바람직하게는, VH 및 VL 사슬(또는 이 사슬들의 CDR)이 혼합되어 매칭될 경우, 특정 VH/VL 쌍의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체된다. 마찬가지로, 바람직하게는 특정 VH/VL 쌍의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체된다.
따라서 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위는 하기를 포함한다:
(a) 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
(b) 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 인간 IL4Rα에 특이적으로 결합하는 다른 항IL4Rα 항체의 VL.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위는 하기를 포함한다:
(a) 표 1에 열거된 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3; 및
(b) 표 1에 열거된 경쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 인간 IL4Rα에 특이적으로 결합하는 다른 항IL4Rα 항체의 CDR.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위는 항IL4Rα 항체의 중쇄 가변영역의 CDR2 그리고 인간 IL4Rα에 결합하는 다른 항체의 CDRs, 예를 들면 다른 항IL4Rα 항체에서 유래된 중쇄 가변영역의 CDR1 및/또는 CDR3, 및/또는 경쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함한다.
또한 CDR3 도메인은 CDR1 및/또는 CDR2 도메인과는 독립적으로, 단독으로 상동적인 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정할 수 있고, 공통된 CDR3 서열에 기초해서 동일한 결합 특이성을 갖는 복수의 항체를 예측 가능하게 생성할 수 있다. 예를 들면, Klimka et al.,, British J. of Cancer 83 (2): 252-260 (2000); Beiboer et al.,, J. Mol. Biol. 296: 833-849 (2000); Rader et al.,, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 8910-8915 (1998); Barbas et al.,, J. Am. Chem. Soc. 116: 2161-2162 (1994); Barbas et al.,, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 2529-2533 (1995); Ditzel et al.,, J. Immunol. 157: 739-749 (1996); Berezov et al.,, BIAjournal 8: Scientific Review 8 (2001); Igarashi et al.,, J. Biochem (Tokyo) 117: 452-7 (1995); Bourgeois et al.,, J. Virol 72: 807-10 (1998); Levi et al.,, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 4374-8 (1993); Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152: 5218-5329 (1994) 및 Xu and Davis, Immunity 13: 37-45 (2000)을 참조할 수 있다. 또한 미국특허번호 6,951,646; 6,914,128; 6,090,382; 6,818,216; 6,156,313; 6,827,925; 5,833,943; 5,762,905 및 5,760,185를 참조할 수 있다. 각각의 참고 문헌들은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
따라서 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 항IL4Rα 항체의 중쇄 가변영역의 CDR2와, 적어도 항IL4Rα 항체의 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역의 CDR3 또는 다른 항IL4Rα 항체의 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역의 CDR3을 포함하면서, 상기 항체가 인간 IL4Rα에 특이적으로 결합한다. 이들 항체는 바람직하게는 (a) IL4Rα에 대한 결합에 대해 본 발명의 항IL4Rα 항체와 경쟁하고; (b) 기능적 특성을 유지하고; (c) 동일한 에피토프에 결합하고; 및/또는 (d) 동일한 결합 친화성을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 또한 항IL4Rα 항체의 경쇄 가변영역의 CDR2, 또는 다른 항IL4Rα 항체의 경쇄 가변영역의 CDR2를 포함할 수 있고, 상기 항체는 인간 IL4Rα에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 항IL4Rα 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역의 CDR1, 또는 다른 항IL4Rα 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역의 CDR1을 더 포함할 수 있고, 상기 항체는 인간 IL4Rα에 특이적으로 결합한다.
변형보존적 변형보존적 변형(Conservative Modification)
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 각각 포함하는 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 본 발명의 항IL4Rα 항체의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 상이하다. 상기 "상이하다"는 것은 하나 또는 복수의 변형보존적 변형에 기인한다. 특정 보존적 서열 변형번형이 항원 결합을 무효화하지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 이해되는 바이다. 예를 들면, Brummell et al., (1993) Biochem 32: 1180-8; de Wildt et al., (1997) Prot. Eng. 10: 835-41; Komissarov et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 26864-26870; Hall et al., (1992) J. Immunol. 149: 1605-12; Kelley and O'Connell (1993) Biochem. 32: 6862-35; Adib-Conquy et al., (1998) Int. Immunol. 10: 341-6 및 Beers et al., (2000) Clin. Can. Res. 6: 2835-43을 참조할 수 있다.
따라서 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역을 포함한다. 그 중에서,
(a) 중쇄 가변영역의 CDR1은 표 1에 열거된 서열 및/또는 그 변형보존적 변형을 포함하고; 및/또는
(b) 중쇄 가변영역의 CDR2는 표 1에 열거된 서열 및/또는 그 변형보존적 변형을 포함하고; 및/또는
(c) 중쇄 가변영역의 CDR3은 표 1에 열거된 서열 및/또는 그 변형보존적 변형을 포함하고; 및/또는
(d) 경쇄 가변영역의 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 CDR3은 표 1에 열거된 서열 및/또는 그 변형보존적 변형을 포함하고; 및
(e) 이 항체는 인간 IL4Rα에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 항체는 인간 IL4Rα에 대한 고친화성 결합 및 IL4Rα-IL4 결합 또는 IL4Rα-IL13-IL13Rα1 결합에 대한 차단 활성과 같은 하나 또는 복수의 기능 특성을 갖는다.
일부 실시형태에 있어서, 항체는 예를 들면 마우스 항체, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
본 명세서에서, "변형보존적 서열 변형(conservative sequence modification)"이라는 용어는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성에 유의한 영향을 미치지 않거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭하도록 사용된 것이다. 이러한 변형보존적 변형에는 아미노산의 치환, 부가 및 결실이 포함된다. 변형은 점 돌연변이 및 PCR 매개 돌연변이 등 당해 기술분야에서 알려진 표준 기술을 통해 본 발명의 항체에 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 치환이란, 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 가리킨다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당해 기술분야에서 알려진 것들이다. 이들 아미노산 잔기 패밀리에는 염기성 측쇄(예를 들면, 리신, 아르기닌, 히스티딘 등), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산 등), 비-하전극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판 등), 비극성 측쇄(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산이 포함된다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 치환할 수 있고, 변경된 항체는 본 명세서에 기재된 기능 분석를 사용해서, 보유하는 기능(즉, 전술한 기능)에 대해 시험할 수 있다.
엔지니어링 및 변형된 항체
본 발명의 항체는 본 발명의 항IL4Rα 항체의 VH/VL 서열 중 하나 또는 복수 개를 갖는 항체를 출발 물질로 사용해서 공학적으로 변형 항체를 제조할 수 있다. 항체는 한쪽 또는 양쪽의 가변영역(즉, VH 및/또는 VL) 내(예를 들면, 하나 또는 복수의 CDR 영역 내 및/또는 하나 또는 복수의 프레임워크 영역 내)에서 하나 또는 복수의 잔기를 변형시킴으로써 공학적으로 변형시킬 수 있다.
어느 특정 실시형태에 있어서, CDR 이식은 항체의 가변영역을 변경하기 위해 사용할 수 있다. 항체는 주로 중쇄와 경쇄의 6개의 상보성 결정영역(CDR)에 있는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 따라서, CDR 내 아미노산 서열은 CDR 밖의 아미노산 서열보다 다양한 항체들 사이에서 보다 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용의 원인이기 때문에 특정 천연 항체의 CDR 서열을 특성이 상이한 항체의 프레임워크 서열에 이식할 수 있는 발현 벡터를 구축함으로써 특정 천연 항체의 특성을 모방한 재조합 항체를 발현시킬 수 있다(예를 들면, Riechmann et al., (1998) Nature 332: 323-327; Jones et al., (1986) Nature 321: 522-525; Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad.를 참조. 또한 U.S.A. 86: 10029-10033; 미국특허번호 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370을 참조).
따라서, 본 발명의 다른 실시형태는 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위에 관한 것이다. 상기 중쇄 가변영역은 본 발명의 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 본 발명의 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 이 항체들은 본 발명의 단클론항체의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하지만, 상이한 프레임워크 서열을 포함할 수 있다.
이러한 프레임워크 서열은 생식 세포 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고 문헌을 통해 입수할 수 있다. 예를 들면, 인간 중쇄 및 경쇄 가변영역 유전자의 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스(인터넷 www. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase에서 입수 가능); Kabat et al., (1991), 상기와 동일; Tomlinson et al., (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798; 및 Cox et al., (1994) Eur. J. Immunol. 24: 827-836에서 입수 가능하며, 이들은 참조를 통해 본 명세서에 명시적으로 포함된다. 다른 실시형태에 있어서, 인간 중쇄 가변영역 유전자 및 인간 경쇄 가변영역 유전자의 생식계열 DNA 서열은 Genbank 데이터베이스에서 입수 가능하다. 예를 들면, HCo7 HuMAb 마우스의 다음 중쇄 생식계열 서열은 Genbank 등록번호가 1-69(NG--0010109, NT--024637 & BC070333), 3-33(NG--0010109 & NT--024637) 및 3-7(NG--0010109 & NT--024637)이다. 다른 실시형태에 있어서, HCo12 HuMAb 마우스의 다음 중쇄 생식계열 서열은 Genbank 등록번호가 1-69(NG--0010109, NT--024637 & BC070333), 5-51(NG--0010109 & NT--024637), 4-34(NG--0010109 & NT--024637), 3-30.3(CAJ556644) 및 3-23(AJ406678)이다.
항체 단백질 서열은 당업자에게 주지한 Gapped BLAST(Altschul et al., (1997), 상기와 동일)로 불리는 서열 유사성 검색법을 사용해서 컴파일된 단백질 서열 데이터베이스와 비교되었다.
본 발명에서 사용되는 항체 프레임워크 서열은 바람직하게는 본 발명의 항체 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것이다. VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 프레임워크 서열이 유래된 생식계열 면역글로불린 유전자와 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역에 이식할 수 있다. 또는, CDR 서열은 생식계열 서열과 비교해서 하나 또는 복수의 변이를 포함하는 프레임워크 영역에 이식할 수 있다. 예를 들면, 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증강하기 위해 프레임워크 영역의 잔기를 변이시키는 것이 유리할 수 있다(예를 들면, 미국특허번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370을 참조).
가변영역 변형의 다른 유형은 VH 및/또는 VL의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내 아미노산 잔기를 변이시키고, 그에 따라 목적 항체의 하나 또는 복수의 결합 특성(예를 들면 친화성)을 개선하는 것이다. 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 PCR 매개 돌연변이 유발을 실시하여 돌연변이를 도입할 수 있고, 항체 결합 또는 관심 있는 다른 기능적 특성에 대한 효과를 당해 기술분야에 알려진 바와 같이 인비트로 또는 인비보 어세이로 평가할 수 있다. 바람직하게는 (당해 기술분야에 알려진) 보존적 변형이 도입된다. 돌연변이는 아미노산의 치환, 부가 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 또한 전형적으로는 CDR 영역 내 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
따라서 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 하기를 포함하는, 중쇄 가변영역을 포함하는 단리된 항IL4Rα 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위를 제공한다; (a) 본 발명의 VH CDR1 서열, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열이 포함되는 VH CDR1 영역; (b) 본 발명의 VH CDR2 서열, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열이 포함되는 VH CDR2 영역; (c) 본 발명의 VH CDR3 서열, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열이 포함되는 VH CDR3 영역; (d) 본 발명의 VL CDR1 서열, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열이 포함되는 VL CDR1 영역; (e) 본 발명의 VL CDR2 서열, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열이 포함되는 VL CDR2 영역; 및 (f) 본 발명의 VL CDR3 서열, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열이 포함되는 VL CDR3 영역.
본 발명의 엔지니어링 항체에는 예를 들면 항체 특성을 개선하기 위해 VH 및/또는 VL의 프레임워크 영역 잔기가 변형된 것이 포함된다. 일반적으로, 이러한 프레임워크 영역의 변형은 항체의 면역원성을 저하시키기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 복수의 프레임워크 영역 잔기가, 대응하는 생식계열 서열에 "복귀 돌연변이(backmutate)"된다. 보다 구체적으로, 체세포 변이를 겪는 항체는 항체가 유래된 생식계열 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 생식계열 서열과 비교함으로써 식별할 수 있다.
다른 종류의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내, 또는 하나 또는 복수의 CDR 영역 내 하나 또는 복수의 잔기를 변이시켜 T 세포 에피토프를 제거하고, 이에 따라 항체의 잠재적인 면역원성을 저하시킨다. 이 방법은 "탈면역화"라고도 불리며, 미국특허공개 제20030153043호에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
또한, 프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어지는 변형의 대안으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 또는 복수의 기능 특성, 예를 들면 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원 의존성 세포장애 등을 변경하기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 화학적으로 변형할 수 있거나(예를 들면, 하나 또는 복수의 화학 모이어티를 항체에 결합시킬 수 있음), 또는 변형하여 그 글리코실화를 변경하여 다시 항체의 하나 또는 복수의 기능 특성을 변경할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, CH1-힌지영역은 힌지영역 내 시스테인 잔기 수가 변경(예를 들면, 증가 또는 감소)되도록 변형된다. 이 방법에 대해서는 미국특허번호 5,677,425호에 기재되어 있다. CH1-힌지영역의 시스테인 잔기 수는 예를 들면 경쇄와 중쇄의 조립을 촉진하거나 항체 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다.
다른 실시형태에 있어서, 항체의 Fc 힌지영역을 돌연변이시켜 항체의 생물학적 반감기를 감소시킨다. 보다 구체적으로, 천연 Fc 힌지 도메인과 비교해서 포도상구균 단백질 A(SpA)와의 결합을 손상시키도록 하나 또는 복수의 아미노산 변이가 Fc 힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면영역에 도입된다. 이 방법은 미국특허번호 6,165,745호에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
다른 실시형태에 있어서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들면, 글리코실화 항체를 생산할 수 있다(즉, 항체는 글리코실화가 결여되어 있음). 글리코실화는 예를 들면 항원에 대한 항체의 친화성을 높이기 위해 변경할 수 있다. 이러한 글리코실화 변형은 예를 들면 항체 서열 내 글리코실화의 하나 또는 복수의 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 복수의 아미노산 치환을 수행함으로써 하나 또는 복수의 가변영역 프레임워크에서 글리코실화 부위를 제거하고, 그에 따라 그 부위의 글리코실화를 제거할 수 있다. 이러한 글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 높일 수 있다. 예를 들면, 미국특허번호 5,714,350호 및 6,350,861호를 참조할 수 있다.
또한, 푸코실 잔기의 양이 감소한 저푸코실화 항체 또는 바이섹팅(bisecting) GlcNac 구조가 증가한 항체 등, 글리코실화의 유형이 변경된 항체를 생산할 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가 또는 감소시키는 것이 입증된 바 있다. 이러한 글리코실화 변형은 예를 들면 변형된 글리코실화 메커니즘을 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변형된 글리코실화 메커니즘을 갖는 세포는 당해 기술분야에서 기술되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현하는 숙주 세포로 사용하고, 이에 따라 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 생산할 수 있다. 예를 들면, 세포주 Ms704, Ms705 및 Ms709는 푸코실 전달효소(fucosyltransferase) 유전자 FUT8(α(1,6)-푸코실 전달효소)가 결여되어 있기 때문에 Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현되는 항체는 그 당쇄(carbohydrate)에 푸코스가 결여되어 있다. Ms704, Ms705 및 Ms709 FUT8-/-세포주는 2개의 치환 벡터를 사용해서 CHO/DG44 세포 내의 목적으로 하는 FUT8 유전자의 파괴로 인해 작성되었다(미국특허공개번호 제20040110704호 및 Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol Bioeng 87: 614-22를 참조). 다른 예로서 EP 1,176,195에는 푸코실 전달효소를 코딩하는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주가 기재되어 있으며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 α-1,6 결합 관련 효소를 감소 또는 제거함으로써 저-푸코실화를 나타낸다. EP 1,176,195에는 또한 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 첨가하기 위한 효소 활성이 저하되거나 사라진 세포주, 예를 들면 랫트 골수종 세포주 YB2/0(ATCC CRL 1662)가 기재되어 있다. PCT 공개 WO 03/035835에는 Asn(297)-결합 당쇄에 푸코스를 결합하는 능력이 저하되고, 그 숙주 세포에서 발현되는 항체의 저-푸코실화도 초래하는 변이형 CHO 세포주인 Lec13 세포가 기재되어 있다(Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740 참조). 변형된 글리코실화 프로파일을 갖는 항체는 PCT 공개 WO 06/089231에 기재된 바와 같이 닭의 알에서도 생산할 수 있다. 또는 변형된 글리코실화 프로파일을 갖는 항체는 개구리밥 등의 식물 세포에서 생산할 수 있다. 식물 시스템에서 항체를 생산하는 방법은 2006년 8월 11일에 출원된 Alston & Bird LLP의 attorney 문서번호 040989/314911에 대응하는 미국특허출원에 개시되어 있다. 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용해서 절단할 수 있다. 예를 들면, α-L-푸코시다제는 항체에서 푸코실 잔기를 제거한다(Tarentino et al., (1975) Biochem. 14: 5516-23).
본 발명의 항체의 다른 변형은 PEG화(pegylation)이다. 항체는 예를 들면 항체의 생물학적(예를 들면, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 PEG화될 수 있다. 항체를 PEG화하기 위해, 전형적으로는 항체 또는 그 단편을 하나 또는 복수의 PEG기가 항체 또는 항체 단편에 결합하는 조건하에 PEG의 활성 에스테르 또는 알데히드 유도체 등의 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 반응시킨다. 바람직하게는, PEG화는 활성 PEG 분자(또는 유사한 활성 수용성 폴리머)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 실시된다. 본 명세서에서 사용된 "폴리에틸렌글리콜"이라는 용어는 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 등의 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용되어 온 PEG의 임의 형태를 포함하도록 사용된 것이다. 어느 특정 실시형태에 있어서, PEG화되는 항체는 비-글리코실화 항체이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다. 예를 들면 EP0154316 및 EP0401384를 참조할 수 있다.
항체의 물리적 특성
본 발명의 항체는 클래스를 검출 및/또는 구별하기 위해 이들의 다양한 물리적 특성을 통해 특징지을 수 있다.
예를 들면, 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변영역 중 어느 하나에 하나 또는 복수의 글리코실화 부위를 포함할 수 있다. 이러한 글리코실화 부위는 항체의 면역원성 증가 또는 항원 결합 변화에 따른 항체의 pK 변화를 초래할 수 있다(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41: 673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172: 5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168: 1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12: 43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316: 452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37: 697-706). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 포함하는 모티프에서 일어나는 것으로 알려져 있다. 경우에 따라서는 가변영역 글리코실화를 포함하지 않는 항IL4Rα 항체가 바람직하다. 이것은 가변영역에 글리코실화 모티프를 포함하지 않는 항체를 선택하거나 글리코실화 영역 내 잔기를 변이시킴으로써 달성할 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 항체는 아스파라긴 이성질화 부위를 포함하지 않는다. 아스파라긴의 탈-아미드화는 N-G 또는 D-G 서열에서 발생하며, 폴리펩티드 사슬에 가교(link)를 도입하여 그 안정성을 저하시키는 이소아스파르트산 잔기의 생성을 초래한다(이소아스파르트산 효과).
각 항체는 고유의 등전점(pI)을 가지며, 일반적으로 6~9.5의 pH 범위에 있다. IgG1 항체의 pI는 통상적으로 pH 범위 7~9.5에 있고, IgG4 항체의 pI는 통상적으로 pH 범위 6~8에 있다. 정상 범위 밖의 pI를 갖는 항체는 in vivo 조건하에 어느 정도 언폴딩(unfolding)과 불안정성이 있을 수 있다는 추측이 있다. 따라서, 정상 범위의 pI 값을 포함하는 항IL4Rα 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이는 정상 범위의 pI를 갖는 항체를 선택하거나 하전된 표면 잔기를 변이시킴으로써 달성할 수 있다.
본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자
다른 일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역, 또는 CDR을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산은 세포 전체, 세포 용해물에 존재하거나; 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 표준 기술을 통해 다른 세포 성분 또는 다른 불순물, 예를 들면 다른 세포의 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리"되거나 "실질적으로 순수"해진다. 본 발명의 핵산은 예를 들면 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산은 표준 분자생물학 기술을 사용해서 얻을 수 있다. 하이브리도마(예를 들면, 후술하는 인간 면역글로불린 유전자를 보유한 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체에 대해서는, 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술을 통해 얻을 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터(예를 들면, 파지 디스플레이 기술을 사용해서) 얻어진 항체에 대해서는 그러한 항체를 코딩하는 핵산을 유전자 라이브러리로부터 회수할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자에는 IL4Rα 단클론항체의 VH 및 VL 서열 또는 CDR을 코딩하는 것이 포함된다. VH 및 VL 세그먼트를 코딩하는 DNA 단편이 얻어지면, 이 DNA 단편들은 예를 들면 가변영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 변환하기 위해 표준 재조합 DNA 기술을 통해 추가로 조작할 수 있다. 이러한 조작시에 VH 또는 VL을 코딩하는 DNA 단편은 다른 단백질을 코딩하는 다른 DNA 단편에 항체 불변영역 또는 유연한 링커로 작동 가능하게 연결된다. 이 경우에 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된다"는 것은 2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 인-프레임(in-frame)으로 유지되도록 2개의 DNA 단편이 연결되는 것을 의미한다.
VH 영역을 코딩하는 DNA는 중쇄 불변영역(CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결함으로써 VH를 코딩하는 단리된 DNA를 전장 중쇄 유전자로 변환할 수 있다. 인간 중쇄 불변영역 유전자의 서열은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭을 통해 얻을 수 있다. 중쇄 불변영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변영역일 수 있으나, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH를 코딩하는 DNA는 중쇄 CH1 불변영역만을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결할 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 DNA는 경쇄 불변영역 CL을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결함으로써 VL을 코딩하는 단리된 DNA를 전장 경쇄 유전자(및 Fab 경쇄 유전자)로 변환할 수 있다. 인간 경쇄 불변영역 유전자의 서열은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭을 통해 얻을 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 경쇄 불변영역은 κ(kappa) 또는 λ(lambda) 불변영역일 수 있다.
scFv 유전자를 제조하기 위해 VH 및 VL을 코딩하는 DNA 단편을 유연한 링커를 코딩하는 다른 단편, 예를 들면 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 코딩하는 다른 단편에 작동 가능하게 연결하여, VH 및 VL 서열이 연속된 단일사슬 단백질로 발현될 수 있게 한다. VL 영역과 VH 영역이 이 유연한 링커를 통해 연결된다(예를 들면, Bird et al., (1988) Science 242: 423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al.,, (1990) Nature 348: 552-554를 참조).
본 발명의 단클론항체의 생산
본 발명의 단클론항체(mAb)는 Kohler and Milstein(1975) Nature 256: 495에서 주지된 체세포 혼성화(하이브리도마) 기술을 사용해서 생산될 수 있다. 단클론항체를 생산하기 위한 다른 실시형태에는 B 림프구의 바이러스 또는 발암성 형질전환 및 파지 디스플레이 기술이 포함된다. 키메라 항체 또는 인간화 항체도 당해 기술분야에서 주지이다. 예를 들면 미국특허번호 4,816,567; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370에 기재되어 있으며, 이들 내용은 참조를 통해 그 전체가 본 명세서에 구체적으로 포함된다.
본 발명의 단클론항체를 생산하는 트랜스펙토마(transfectoma)의 생성
본 발명의 항체는 예를 들면 당해 기술분야에서 주지인 재조합 DNA 기술과 유전자 트랜스펙션 방법의 조합을 이용해서 숙주 세포 트랜스펙토마로 생산할 수도 있다(예를 들면, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202). 일부 실시형태에 있어서, 표준 분자생물학 기술을 통해 얻어진 부분 또는 전장의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA는 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 하나 또는 복수의 발현 벡터에 삽입된다. 이 경우, "작동 가능하게 연결된다"는 용어는 벡터 내 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 규정 기능을 수행하도록 항체 유전자가 벡터에 연결되는 것을 의미한다.
용어 "조절 서열"은 항체 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소(예를 들면, 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 사용된 것이다. 이러한 조절 서열은 예를 들면 Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))에 기재되어 있다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열에는 예를 들면 사이토메갈로 바이러스(CMV), 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노 바이러스(예를 들면, 아데노 바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마 바이러스에서 유래된 프로모터 및/또는 인핸서에서 유래된, 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소가 포함된다. 또는 유비퀴틴 프로모터(ubiquitin promoter) 또는 β글로빈 프로모터 등 비-바이러스 조절 서열을 사용할 수 있다. 또한 조절 요소는 SV40 초기 프로모터의 서열과 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1형의 긴 말단 반복 서열을 포함하는 SRα 프로모터 시스템 등, 다양한 기원의 서열로 구성된다(Takebe et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-472). 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 적합하도록 선택된다.
항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 동일하거나 별개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, VH 세그먼트가 벡터 내 CH 세그먼트에 작동 가능하게 연결되고, VL 세그먼트가 벡터 내 CL 세그먼트에 작동 가능하게 연결되도록 가변영역을 원하는 아이소타입의 중쇄 불변영역 및 경쇄 불변영역을 코딩하는 발현 벡터에 삽입함으로써 임의의 항체 아이소타입의 전장 항체 유전자를 작성할 수 있다. 또한, 또는 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인-프레임으로 연결되도록 항체 사슬 유전자를 벡터에 클로닝할 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비면역글로불린 단백질에서 유래된 신호 펩티드)일 수 있다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터는 표준 기술을 통해 숙주 세포로 트랜스펙션된다. "트랜스펙션"이라는 용어의 다양한 형태는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 대한 외인성 DNA 도입에 일반적으로 사용되는 다양한 기술, 예를 들면 일렉트로포레이션, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 등을 포함하도록 사용된 것이다. 이론적으로 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포 중 어느 하나에서 본 발명의 항체를 발현시키는 것이 가능하지만, 진핵 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서 항체를 발현하는 것이 가장 바람직하다. 진핵 세포, 특히 포유동물 세포는 원핵 세포보다 항체를 구축하고 적절하게 폴딩된 면역 적합 항체를 분비할 가능성이 높기 때문이다.
본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포에는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)(DHFR 선별 마커로 사용하기 위한 dhfr-CHO 세포를 포함하고, Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220에 기재되어 있고, DHFR 선택 마커는 예를 들면 R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159: 601-621에 기재됨), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 특히 NSO 골수종 세포에서 사용될 경우, 다른 바람직한 발현 시스템은 WO87/04462, WO89/01036 및 EP338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입된 후, 숙주 세포 내에서 항체를 발현시키기에 충분한 시간, 또는 바람직하게는 숙주 세포가 증식하는 배지에 항체를 분비시키기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체가 제조된다. 항체는 표준 단백질 정제법을 사용해서 배지에서 회수될 수 있다.
이중특이성 분자
다른 일 측면에서, 적어도 2개의 상이한 결합 부위에 대한 결합 부위를 생성하기 위해, 다른 펩티드 또는 단백질 등 적어도 하나의 다른 기능 분자(예를 들면, 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)에 연결된 본 발명의 하나 또는 복수의 항체를 포함하는 이중특이성 분자를 제공한다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 "이중특이성 분자"에는 3개 이상의 특이성을 갖는 분자가 포함된다.
일부 실시형태에 있어서, 이중특이성 분자는 Fc에 대한 결합 특이성 및 IL4Rα에 대한 결합 특이성에 더해 제3 특이성을 갖는다.
이중특이성 분자는 많은 상이한 형식 및 사이즈일 수 있다. 사이즈 스펙트럼의 한쪽 끝에서 이중특이성 분자는 종래의 항체 포맷을 유지하지만, 다른 점은 2개의 결합 암이 동일한 특이성이 아니라 다른 특이성을 갖는 점이다. 다른 쪽 끝에는 펩티드 사슬에 의해 결합된 2개의 단일사슬 항체 단편(scFv's)으로 이루어진 이중특이성 분자, 이른바 Bs(scFv)2 구조물이다. 중간 사이즈의 이중특이성 분자에는 펩티딜 링커를 통해 연결된 2개의 상이한 F(ab) 단편이 포함된다. 이들 및 다른 포맷의 이중특이성 분자는 유전자 공학, 체세포 혼성화 또는 화학적 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들면, Kufer et al, cited supra; Cao and Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9 (6), 635-644 (1998); 및 van Spriel et al., Immunology Today, 21 (8), 391-397 (2000), 및 거기에 인용된 참고문헌을 참조할 수 있다.
면역 복합체
본 발명의 항체는 항체-약물 접합체(ADC) 등의 면역 콘쥬게이트를 형성하기 위해 치료제에 콘쥬게이션할 수 있다. 적절한 치료제에는 세포독소, 알킬화제, DNA 마이너 그루브 바인더(DNA minor groove binder), DNA 인터컬레이터, DNA 가교제, 히스톤 데아세틸라제 억제제(histone deacetylase inhibitor), 핵내 수송 억제제, 프로테아솜 억제제, 국소 이성질화 효소(topoisomerase) I 또는 II 억제제, 열 쇼크 단백질 억제제, 티로신 키나아제 억제제, 항생물질 및 유사 분열 억제제가 포함된다. ADC에서 항체 및 치료제는 바람직하게는 펩티딜, 디설파이드 또는 히드라존 링커와 같은 절단 가능한 링커를 통해 결합된다. 보다 바람직한 링커는 예를 들면 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser 또는 Glu 등의 펩티드 링커이다. ADC는 미국특허번호 7,087,600; 6,989,452; 및 7,129,261; PCT 공개 WO 02/096910; WO 07/038,658; WO 07/051,081; WO 07/059,404; WO 08/083,312; 및 WO 08/103,693; 미국특허공개 제20060024317; 20060004081; 및 20060247295에 따라 제조할 수 있고, 그 개시 내용은 참조를 통해 본 명세서에 포함된다.
항체를 코딩하거나 항체를 보유하는 항암 바이러스
항암 바이러스(oncolytic virus)는 암세포를 우선적으로 감염시켜 죽인다. 본 발명의 항체는 항암 바이러스와 함께 사용할 수 있다. 또는 본 발명의 항체를 코딩하는 항암 바이러스를 인간에게 도입할 수 있다.
키메라 항원 수용체
본 발명은 또한 본 발명의 CDR 및 중쇄/경쇄 가변영역을 포함하는 항IL4Rα scFv를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다.
항IL4Rα CAR은 (a) 항IL4Rα scFv를 포함하는 세포 외 항원 결합 도메인; (b) 막 관통 도메인; (c) 세포 내 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다.
CAR은 세포 외 항원 결합 도메인의 N말단에 신생 수용체를 소포체로 향하게 하는 신호 펩티드, 및 세포 외 항원 결합 도메인의 N말단에 수용체를 보다 결합하기 쉽게 하는 힌지 펩티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, CAR은 세포 내 신호 전달 도메인에서 1차 세포 내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공동자극 신호 전달 도메인을 포함한다. 일반적으로 사용되며 가장 강력한 1차 세포 내 신호 전달 도메인은 ITAM을 포함하는 CD3-zeta 세포질 도메인이며, 그 ITAM의 인산화가 T 세포 활성화로 이어진다. 공동자극 신호 전달 도메인은 CD28, CD137, OX40 등 공동자극 단백질에서 유래된다.
CAR은 사이토카인 및 공동자극 리간드 등, T 세포 증식, 지속성 및 항종양 활성을 증강시키는 인자를 더 추가할 수 있다.
또한 본 명세서에서 제공되는 CAR을 포함하는, 엔지니어링 면역 이펙터 세포도 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 면역 이펙터 세포는 T 세포, NK 세포, 말초혈 단핵 세포(PBMC), 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 면역 이펙터 세포는 T 세포이다.
약학 조성물
다른 일 측면에서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화된 본 발명의 하나 또는 복수의 항체(또는 그 항원 결합 부위, 또는 이중특이성 분자, CAR-T 세포, 항암 바이러스 또는 면역 복합체)를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 조성물이 복수의 항체(또는 그 항원 결합 부위, 또는 이중특이성 분자, CAR-T 세포, 항암 바이러스, 면역 복합체)를 포함할 경우, 항체(또는 그 항원 결합 부위, 또는 이중특이성 분자, CAR-T 세포, 항암 바이러스, 면역 복합체)를 별도로 투여할 수 있다. 조성물은 다른 항체, 또는 항종양제 또는 항알레르기제와 같은 약물 등, 하나 또는 복수의 추가적인 약학적 활성 성분을 선택적으로 포함할 수 있다.
약학 조성물은 임의 개수의 부형제를 포함할 수 있다. 사용할 수 있는 부형제에는 벡터, 계면활성제, 증점제 또는 유화제, 고체 결합제, 분산제 또는 현탁 제, 가용화제, 착색제, 향미제, 코팅제, 붕괴제, 윤활제, 감미료, 보존제, 등장제 및 이들의 조합이 포함된다. 적절한 부형제의 선택 및 사용은 Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)에 교시되어 있고, 그 개시 내용은 참조를 통해 본 명세서에 포함된다.
바람직하게는, 약학 조성물은 정맥 내, 근육 내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여(예를 들면, 주사 또는 주입을 통함)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 유효 성분을 불활성화시킬 수 있는 산이나 기타 자연 조건의 작용으로부터 보호하기 위해 유효 성분을 재료로 코팅할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "비경구 투여"는 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 통상 주사에 의한 방법이며, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 지주막하강 내, 피막 내, 안와 내, 심장 내, 피 내, 복강 내, 경기관, 피하, 표피하, 관절 내, 피막하, 지주막하, 척수 내, 경막 외 및 흉골 내 주사 및 주입이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 또는 본 발명의 항체는 예를 들면 비강 내, 경구, 질 내, 직장 내, 설하 또는 국소 등 국소, 표피 또는 점막 투여 경로 등의 비경구 경로를 통해 투여할 수 있다.
약학 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액 형태일 수 있다. 이들은 또한 마이크로에멀전, 리포좀 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 질서 구조(ordered structure)로 처방할 수도 있다.
단일 제형을 생성하기 위해 담체 재료와 조합할 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상 및 특정 투여 방식에 따라 달라지며, 일반적으로 치료 효과를 발휘하는 조성물의 양이다. 상기 양에 대하여, 통상 백분율 기준으로 약 0.01%에서 약 99%, 바람직하게는 약 0.1%에서 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1%에서 약 30% 범위의 활성 성분을 약학적으로 허용되는 담체와 조합한다.
투약 레지멘(regimen)은 최적의 원하는 반응(예를 들면, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들면, 단회 볼루스(bolus) 용량을 투여해도 되고, 복수의 분할 용량을 경시적으로 투여해도 되고, 또는 치료 상황의 긴급성에 따라 용량을 비례적으로 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 투여를 용이하게 하고 투여량을 균일하게 하기 위해 투여 단위 형태로 비경구 투여되는 조성물을 처방하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 투여 단위 형태는 치료 대상에 대한 단위 투여량으로서 적절한 물리적으로 별개의 단위를 가리키며, 각 단위는 필요한 약학적 벡터와 관련하여 원하는 치료 효과를 발휘하도록 계산된 소정 양을 포함한다. 또는 항체는 지속 방출 제제로서 투여될 수 있으며, 이 경우 필요한 투여 빈도는 적어진다.
조성물을 투여할 경우, 투여량은 숙주의 체중 1kg당 약 0.0001~100mg, 보다 일반적으로는 0.01~5mg 범위일 수 있다. 예를 들면, 투여량은 0.3mg/kg 체중, 1mg/kg 체중, 3mg/kg 체중, 5mg/kg 체중, 또는 10mg/kg 체중, 또는 1~10mg/kg 체중 범위일 수 있다. 예시적인 치료 계획은 1주에 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 1개월에 1회, 3개월에 1회, 또는 3~6개월에 1회 투여를 수반한다. 본 발명의 항IL4Rα 항체의 바람직한 투여 계획에는 1mg/kg 체중 또는 3mg/kg 체중에서 정맥 내 투여가 포함되며, 항체 투여는 아래 투약 레지멘 중 하나로 실시된다: (i) 4주마다 6회, 그 후 3개월마다; (ii) 3주마다; (iii) 3mg/kg 체중으로 1회, 그 후에는 3주마다 1mg/kg 체중으로 투여한다. 일부 방법에서, 투여량은 약 1~1000㎍/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정되고, 일부 방법에서는 약 25~300㎍/ml의 혈장 항체 농도가 달성된다.
본 발명의 항IL4Rα 항체 또는 그 항원 결합 부위, 이중특이성 분자, CAR-T 세포, 항암 바이러스 또는 면역 복합체의 "치료 유효량"은 바람직하게는 질환 증상의 중증도 완화, 질환 무증상 기간의 빈도 및 기간 증가, 또는 질환의 고통으로 인한 손상 또는 장애 예방을 가져올 수 있다. 예를 들면, 종양 대상 치료에서 "치료 유효량"은 미치료 대상과 비교해서 종양 증식을 바람직하게는 적어도 약 20% 억제, 바람직하게는 적어도 약 40% 억제, 보다 바람직하게는 적어도 약 60% 억제, 더욱 바람직하게는 적어도 약 88% 억제하는 양이다. 치료 유효량의 치료용 항체는 전형적으로 인간이거나 다른 포유동물일 수 있는 대상에서 종양 크기를 감소시키거나 증상을 개선할 수 있다.
약학 조성물은 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제제일 수 있다. 에틸렌비닐아세테이트, 폴리산무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산 등의 생분해성, 생체적합성 폴리머를 사용할 수 있다. 예를 들면, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조할 수 있다.
약학 조성물은 예를 들면 (1) 무침 피하 주사 장치(예를 들면, 미국특허번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 및 4,596,556); (2) 마이크로 인퓨전 펌프(미국특허번호 4,487,603); (3) 경피 약물 전달 장치(미국특허번호 4,486,194); (4) 주입 장치(미국특허번호 4,447,233 및 4,447,224); 및 (5) 침투 장치(미국특허번호 4,439,196 및 4,475,196) 등의 의료 장치를 통해 투여될 수 있으며, 이들 개시 내용은 참조를 통해 본 명세서에 포함된다.
어느 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 단클론항체는 인비보에서 적절한 분포를 보장하도록 처방할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 치료용 항체가 혈액뇌장벽을 통과하는 것을 보장하기 위해 이들을 리포좀으로 제제화할 수 있고, 특정 세포 또는 기관으로의 선택적 수송을 증강시키기 위한 타겟팅 부분을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 미국특허번호 4,522,811; 5,374,548; 5,416,016; 및 5,399,331; V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038; Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180; Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134; Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; 및 Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4: 273을 참조할 수 있다.
본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위, 또는 이중특이성, CAR-T 세포, 항암 바이러스, 면역 복합체를 포함하는 조성물은 예를 들면 과잉 IL4 및/또는 IL13 신호 전달 관련 알레르기 질환의 치료에 관여하는 등, 다수의 인비트로 및 인비보 유용성을 가진다.
본 발명의 항IL4Rα 항체가 IL4Rα와 IL4 또는 IL13-IL13Rα1의 결합을 차단하여 2형 면역을 저하시키는 능력이 있으므로 본 발명은 대상에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 2형 면역 관련 알레르기 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 알레르기성 질환은 아토피성 피부염, 알레르기 반응, 알레르기성 비염 또는 알레르기성 천식일 수 있다.
다른 일 측면에서, IL4 또는 IL13 신호 전달은 STAT6을 활성화시킬 수 있고, STAT6 억제제는 암세포 증식을 억제하는 것으로 밝혀졌으므로, 본 발명은 대상에서 종양 세포 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상에게 본 발명의 조성물을 투여하고, 그로 인해 대상의 종양 증식을 억제하는 것을 포함한다. 본 발명의 항체로 치료할 수 있는 종양의 비한정적인 예로는 흑색종, 폐암, 신장암, 전립선암, 자궁경부암, 결장 직장암, 위암, 췌장암, 난소암(varian cancer) 및 요로상피암이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
다른 일 측면에서, 본 발명은 IL-4 또는 IL-13에 반응하는 세포의 활성화를 감소시키거나 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 활성화를 억제하는 것은 사이토카인의 생산 또는 분비를 억제하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 활성화를 억제하는 것은 증식을 억제하는 것을 포함한다. 하이브리드 IL-4Rα/γC 수용체의 자극을 통해 IL-4에 반응하는 세포에는 B 세포, 호산구 및 마크로파지가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 하이브리드 IL-4Rα/IL-3Rα1 수용체의 자극을 통해 IL-13에 반응하는 세포에는 섬유아세포 및 평활근 세포가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 따라서 일부 실시형태에 있어서, 본 발명은 평활근 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 섬유아세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
다른 일 측면에서, 본 발명은 진단을 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 세포 또는 조직에서 IL4Rα의 존재 및 발현을 결정하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 진단은 예후를 나타내고, 및/또는 치료 및/또는 후속 조치를 가이드한다. 예를 들면, 인간 방광암에서 IL4Rα의 과발현은 질환의 병리학적 그레이드 및 병기(stage)와 관련이 있음이 밝혀졌다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 방광암의 그레이드 및 단계를 진단하는 데 사용된다. IL-4Rα의 과발현은 구강암의 발생 및 여러 번의 재발과 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 예후 및 적절한 치료 및 경과 관찰을 결정하기 위한 구강암 진단 키트 또는 방법에 사용된다. 종양에서 IL-4Ra 발현은 상피성 악성 흉막 중피종(MPM)의 외과적 절제술을 받은 환자의 생존율과 역상관관계가 있다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 MPM의 예후 및 적절한 치료 및/또는 후속 조치를 결정하기 위한 진단 키트 또는 방법에 사용된다.
병용 요법
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항IL4Rα 항체 또는 항원 결합 부위, 이중특이성 분자 또는 항암 바이러스를 2형 면역 관련 알레르기 질환을 개선하는 데에 효과적인 하나 또는 복수의 다른 약물과 조합하는 것을 포함하는 병용 요법을 제공한다. 상기 약물은 알레르기성 비염 치료에 임상적으로 사용되는 항히스타민제(H1 히스타민 수용체를 표적으로 함), 또는 천식 치료에 임상적으로 사용되는 코르티코스테로이드, β-아드레날린 수용체 작용제 및 cyc-LT를 표적으로 한 약물일 수 있다. 항IgE 항체인 오말리주맙(Omalizumab) 역시 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 부위, 이중특이성 분자 또는 항암 바이러스에 의한 알레르기성 질환 치료에 사용할 수 있다. 어느 특정 실시형태에 있어서, 대상은 인간이다.
다른 일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항IL4Rα 항체 또는 그 항원 결합 부위, 이중특이성 분자, CAR-T 세포, 항암 바이러스 또는 면역 복합체를, 대상에서 종양 증식을 억제하는 데 효과적인 하나 또는 복수의 다른 약제와 조합함으로써 병용 요법을 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명은 항IL4Rα 항체(또는 그 항원 결합 부위, 이중특이성 분자, 항암 바이러스, CAR-T 세포, 또는 면역 복합체) 및 항OX40 항체, 항TIM-3 항체, 항CD137 항체, 항GITR 항체, 항LAG-3 항체, 항PD-L1 항체 및 항PD-1 항체 등 하나 또는 그 이상의 다른 항체를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 종양 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 어느 특정 실시형태에 있어서, 대상은 인간이다. IL4Rα 경로 억제제는 암의 표준 치료와 추가로 조합될 수 있다. 예를 들면, IL4Rα 경로 억제제는 LAG-3 및/또는 PD-1 억제제 및 화학 요법 레지멘과 조합될 수 있다. 항IL4Rα 항체는 세포독성약일 수 있는 화학 요법약과 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 에피루비신, 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 5-플루오로우라실은 항IL4Rα 요법을 받는 환자에게 투여될 수 있다. 필요에 따라 항IL4Rα와 하나 또는 복수의 다른 항체(예를 들면, 항LAG-3 및/또는 항PD-1 항체)의 조합은 면역원성 물질과 추가로 조합될 수 있다. 상기 면역원성 물질은 예를 들면 암세포, 정제된 종양 항원(재조합 단백질, 펩티드 및 당 분자를 포함함) 및 면역 자극성 사이토카인을 코딩하는 유전자로 트랜스펙션된 세포이다(He et al., (2004) J. Immunol. 173: 4919-28). 사용 가능한 종양 백신의 비한정적인 예에는 gp100, MAGE 항원, Trp-2, MART1 및/또는 티로시나제(tyrosinase) 등의 흑색종 항원 펩티드, 또는 사이토카인 GM-CSF를 발현하도록 트랜스펙션된 종양 세포가 포함된다. 항IL4Rα 항체와 병용 가능한 다른 치료법에는 인터루킨-2(IL-2) 투여, 방사선, 수술 또는 호르몬 차단이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 논하는 치료제의 조합은 약학적으로 허용되는 담체 중 단일 조성물로서 동시에, 또는 약학적으로 허용되는 담체 중 각 약제와 별개의 조성물로서 동시에 투여할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 치료제의 조합은 순차적으로 실시할 수 있다.
또한 복수회의 병용 요법을 순차적으로 실시할 경우, 순차 투여의 순서는 각 투여 시점에서 반대로 하거나 동일 순서로 유지할 수 있고, 순차 투여를 동시 투여와 조합할 수 있고, 또는 이들을 임의로 조합할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 추가 설명되나 이로 한정하여 해석되어서는 안된다. 본 출원을 통해 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, Genbank 서열, 특허 및 공개된 특허출원의 내용은 참조를 통해 본 명세서에 명시적으로 포함된다.
실시예
실시예 1 : 하이브리도마 기술을 이용한 마우스 항IL4Rα 단클론항체의 제조
면역접종
E Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998에 기재된 방법에 따라 마우스를 면역시켰다. 재조합 인간 IL4Rα-his 단백질(Sino biological inc., 카탈로그 번호 10402-H08H)을 면역원으로 사용하고, 자체제작 인간 IL4Rα-his 단백질(서열번호 57에 표시된 아미노산 서열)을 사용해서 항혈청의 역가를 결정하고, 항원 특이적 항체를 분비하는 하이브리도마의 스크리닝에 사용하였다. 1차 면역 및 추가 면역의 면역 용량은 마우스 1마리당 주사당 20㎍의 인간 IL4Rα-his 단백질이었다. 면역 반응을 높이기 위해 완전 Freud's adjuvant 및 불완전 Freud's adjuvant(Sigma, St. Louis, Mo., USA)를 각각 초회 면역 및 추가 면역에 사용하였다. 간단히 설명하면, 아쥬반트와 면역원의 혼합물은 다음과 같이 제조되었다. 먼저, 아쥬반트를 바이알 내에서 볼텍스로 부드럽게 혼합하였다. 원하는 양의 아쥬반트를 오토 클레이브된 1.5mL 마이크로 원심 튜브로 옮겼다. 항원은 0.2~0.3mg/ml 범위의 농도가 되도록 PBS 또는 생리식염수로 제조하였다. 이어서, 계산된 양의 항원을 아쥬반트와 함께 마이크로 원심 분리 튜브에 첨가하고, 얻어진 혼합물을 2분간 부드럽게 볼텍싱해서 혼합하여 유중수 에멀전을 생성하였다. 다음으로, 아쥬반트-항원 에멀전을 동물 주사용인 적절한 주사기로 흡입하였다. 총 20㎍의 항원을 150~200㎕의 용량으로 주사하였다. 각 동물을 면역시키고 항혈청 역가에 따라 2~3회 추가 면역시켰다. 역가가 보다 양호한 동물에게는 세포 융합 전에 복강 내 주사를 통해 최종 추가 면역을 부여하였다.
하이브리도마의 융합과 스크리닝
융합 직전에 마우스 골수종 세포주(SP2/0-Ag14, ATCC#CRL-1581)의 세포를 배양하여 대수기에 도달시켰다. 면역시킨 마우스의 비장 세포를 무균적으로 제조하고 Kohler G, 및 Milstein C, "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity," Nature, 256: 495-497 (1975)에 기재된 방법에 따라 골수종 세포와 융합시켰다. 이어서, 융합된 "하이브리드 세포"를 DMEM/20% FCS/HAT 배지를 넣은 96-웰 플레이트에 분주하였다. 살아 있는 하이브리도마의 콜로니를 융합 7~10일 후에 현미경으로 관찰하였다. 2주 후, 각 웰의 상청을 재조합 인간 IL4Rα-his 단백질을 사용해서 ELISA 기반 스크리닝하였다. 간단히 설명하면, PBS 내 인간 IL4Rα-his 단백질(2.0㎍/mL)을 ELISA 플레이트에 60㎕/웰로 코팅하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척한 후, 200㎕의 블로킹 버퍼(5% w/v 스킴 밀크를 포함하는 PBST 내)로 블로킹하였다. 희석된 하이브리도마 상청(60㎕)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 40분간 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 4회 세척하고 HRP 염소 항-마우스 IgG(Jackson Immuno research, 카탈로그 번호 115-036-071)를 검출하는 데 사용하고 결합 OD 값을 450nm에서 관찰하였다. 이어서, 인간 IL4Rα-his 단백질에 결합 가능한 항체를 분비하는 양성 하이브리도마를 선택하고 24-웰 플레이트로 옮겼다. 높은 특이적 인간 IL4Rα 결합 및 IL4RαIL4 또는 IL4Rα-13Rα1-IL13 차단 활성을 나타내는 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 한계 희석법으로 서브클로닝하여 세포주의 클론성을 확보한 후, 단클론항체를 정제하였다. 간단히 설명하면, 단백질 A 세파로스 칼럼(bestchrom(Shangai) Biosciences, 카탈로그 번호 AA0273)을 5~10배 칼럼 용량의 PBS 버퍼를 사용해서 세척하였다. 세포 상청을 칼럼에 통과시키고, 그 후 단백질 흡광도가 기준선(baseline)에 도달할 때까지 PBS 버퍼를 사용해서 칼럼을 세척하였다. 칼럼을 용출 버퍼(0.1M 글리신-HCl, pH 2.7)로 용출시키고, 용출액을 바로 1.5mL 튜브에 수집하여 중화 버퍼(1M Tris-HCl, pH 9.0)로 중화하였다. 면역글로불린을 포함하는 분획을 풀링하고 4℃에서 하룻밤 PBS로 투석하였다. 이어서, 정제 단클론항체의 인비트로 기능 활성을 다음과 같이 특징지었다.
실시예 2 : BIACORE 표면 플라즈몬 공명을 이용한 마우스 항IL4Rα 단클론항체의 친화성 측정
실시예 1에서 생성된 정제 항IL4Rα 마우스 단클론항체(mAb)는 Biacore T200 시스템(GE Healthcare, Pittsburg, PA, USA)을 통해 결합 친화성 및 결합 동역학에 대해 특징지어졌다.
간단히 설명하면, Biacore(GE Healthcare, Pittsburg, PA, USA)가 제공하는 표준적인 아민 커플링 키트를 사용해서 염소 항-마우스 IgG(GE healthcare, 카탈로그 번호 BR100838, Mouse Antibody Capture Kit)를 1차 아민기를 통해 CM5 칩(카르복시 메틸화 덱스트란 피복 칩)에 공유 결합시켰다. 바이오센서 표면의 미반응 부분은 에탄올 아민으로 블로킹되었다. 이어서, 66.67nM 농도의 본 발명의 정제 항IL4Rα 항체 및 10㎍/㎖의 항IL4Rα 벤치마크(Dupilumab®, BM이라고도 함)를 10μL/분의 유속으로 칩 상에 흘려보냈다. 다음으로, HBS EP 버퍼(Biacore로부터 제공됨) 중 재조합 인간 IL4Rα-his(자사 제조, 서열번호 57에 표시된 아미노산 서열), 게먹이원숭이 IL4Rα-his 단백질(Sino biological inc., 카탈로그 번호 90897-C08H) 또는 마모셋 IL4Rα-his 단백질(Sinobiological Inc.의 외주품, cal-IL4Rα-his라고도 함, 아미노산 서열은 서열번호 58에 표시됨)의 단계 희석품을 30μL/분의 유속으로 칩에 흘려보냈다. 항원 항체 결합 동태는 2분간 추적하였고, 해리 동태는 10분간 추적하였다. BIA 평가 소프트웨어를 사용해서 결합 및 해리 곡선을 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델에 적합화하였다. KD, Ka 및 Kd 값을 결정하고 하기 표 2에 정리하였다.
[표 2]
표 2. 마우스 항IL4Rα 항체의 결합 친화성
Figure pct00004
본 발명의 모든 마우스 항체는 인간 IL4Rα에 특이적으로 결합하였으며, 이들 대부분은 벤치마크와 비교해서 동등하거나 더 높은 결합 친화성을 나타내었다.
실시예 3 : 마우스 항IL4Rα 항체의 IL4Rα 결합 활성
본 발명의 마우스 항IL4Rα 항체의 IL4Rα에 대한 결합 활성은 Capture ELISA, 유세포 분석(FACS) 및 간접 ELISA를 통해 결정되었다.
3.1 Capture ELISA
간단히 말하면, PBS에서 2㎍/㎖ 염소 항-마우스 IgG Fcγ 특이 단편(Jackson Immuno Research, 카탈로그 번호 115-005-008)을 100㎕/웰로 96-웰 플레이트에 코팅하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 버퍼(PBS + 0.05% w/v Tween-20, PBST)로 1회 세척한 후, 200㎕/웰의 블로킹 버퍼(5% w/v 스킴 밀크를 포함하는 PBST)를 첨가하고 37℃에서 2시간 블로킹하였다. 플레이트를 다시 세척하고 100㎕/웰의 연속 희석(2.5% w/v 탈지유 함유 PBST로 5배 희석, 66.7nM에서 시작)된 본 발명의 항IL4Rα 항체, 벤치마크 또는 음성 대조군 hIgG(정맥내 주사용 인간 면역글로불린(pH4), Hualan Biological Engineering Inc.)와 함께 37℃에서 40분간 인큐베이션하고, 플레이트를 다시 4회 세척하였다. 100μL/웰의 비오틴 표지된 인간 IL4Rα-his 단백질(서열번호 57로 자체제작, in 2.5% w/v 탈지유 함유 PBST, 0.14nM)을, 포획된 항IL4Rα 항체를 포함하는 96-웰 플레이에 추가하였다. 37℃에서 40분간 인큐베이션하고 플레이트를 4회 세척하여 HRP 표지 스트렙트아비딘(PBST로 1:10000으로 희석, Jackson Immuno Reserch, 카탈로그 번호 016-030-084)을 100μL/웰 첨가하고 37℃에서 40분간 인큐베이션하였다. 마지막 세척 후, 100μL/웰의 ELISA 기질 TMB(Innoreagents, 카탈로그 번호 MB-S-002)를 추가하고 인큐베이션하였다. 10분 후, 25℃에서 1M H2SO4를 50㎕/웰 첨가하여 반응을 정지시키고 흡광도를 450nm에서 판독하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용해서 데이터를 분석하여 EC50 값을 얻었다.
3.2 세포 기반 결합 FACS
293F-IL4Rα 세포 표면에 발현된 IL4Rα에 대한 마우스 항IL4Rα 항체의 결합 활성을 유세포 분석(FACS)으로 시험하였다. 293F 세포(Thermofisher Inc., 카탈로그 번호 11625019)에 EcoRI와 XbaI 사이에 인간 IL4Rα(uniprot #P24394-1의 아미노산 잔기 1-825)를 코딩하는 뉴클레오티드를 갖는 pCMV-T-P 플라스미드 구조물로 트랜스펙션하고 안정한 세포 풀(293F-IL4Rα로 명명됨)을 그 후의 세포 기반 결합 FACS 및 세포 기반 리간드 차단 FACS 분석을 위해 선택하였다. 293F-IL4Rα 세포를 세포 배양 플라스크에서 회수하고 2회 세척하여 FACS 완충액(2% v/v 소 태아 혈청을 포함한 인산 완충 생리식염수(PBS))에 재현탁하였다. 이어서, FACS 버퍼로 단계 희석(80nM에서 시작, 4배 연속 희석)한 항IL4Rα 항체 또는 대조 물질을 100μL/웰로, 2×105세포/웰을 포함하는 96-웰 플레이트에 첨가하고 40분간 빙욕하였다. 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척한 후, 100μL/웰의 R-피코에리트린(Phycoerythrin) 표지 아피니티 정제 F(ab')2 단편화 염소 항-마우스 IgG(H+L)(FACS 버퍼로 1:1000으로 희석, Jackson Immunoresearch, 카탈로그 번호 115-116-146)를 첨가하였다. 어두운 곳에서 4℃에서 40분간 인큐베이션한 후 세포를 3회 세척하고 FACS 완충액에 재현탁하였다. Becton Dickinson FACS Canto II-HTS를 이용해서 형광값을 측정하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용해서 데이터를 분석하여 EC50 값을 얻었다.
3.3 간접 ELISA
항IL4Rα 항체의 게먹이원숭이 IL4Rα 단백질 또는 cal-IL4Rα-his 단백질과의 교차 반응을 측정하였다. 간단히 설명하면, 탄산/중탄산 완충액(pH 9.6) 내 게먹이원숭이 IL4Rα-his 단백질(Sino biological inc., 카탈로그 번호 90897-C08H) 0.2㎍/mL 또는 탄산/중탄산 완충액(pH 9.6) 내 cal-IL4Rα-his 단백질(Sinobiological inc.의 외주품, 제품 카탈로그 BAX2) 0.2㎍/mL를 96-웰 플레이트에 100㎕/웰로 코팅하고 37℃에서 2시간 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 버퍼(PBS + 0.05% w/v Tween-20, PBST)로 1회 세척하고 200μL/웰의 블로킹 버퍼(5% w/v 탈지유를 포함한 PBST)를 첨가하고 37℃에서 2시간 블로킹하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 단계 희석한 본 발명의 항IL4Rα 항체 또는 대조 물질(0.004~66.7nM, 66.7nM에서 시작, 2.5% w/v 스킴 밀크를 포함한 PBST에서 5배 구배로 희석)을 100㎕로 각 웰에 첨가하고 37℃에서 40분간 인큐베이션하였다. 플레이트를 4회 세척한 후, 100μL/웰의 퍼옥시다제 표지 아피니티 정제 염소 항-마우스 IgG(Fcγ 단편 특이적)(PBST 버퍼로 1:5000으로 희석, Jackson Immunoresearch, 카탈로그 번호: 115-036-071)을 37℃에서 40분간 인큐베이션하였다. 마지막 세척 후, 100μL/웰의 TMB(Innoreagents)를 첨가하고 인큐베이션하였다. 3~10분 후 25℃에서 1M H2SO4를 50㎕/웰 첨가함으로써 반응을 정지시키고 흡광도를 450nm에서 판독하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용해서 데이터를 분석하여 EC50 값을 얻었다.
3개의 측정 결과를 표 3 및 도 1a~1c, 도 2a~2d, 도 3에 나타내었다.
결과를 통해, 본 발명의 마우스 항IL4Rα 항체는 높은 결합 능력으로 인간 IL4Rα에 특이적으로 결합하고, 이들 중 일부는 벤치마크보다 높은 결합 활성으로 원숭이 IL4Rα 단백질에 결합한 것을 알 수 있었다.
[표 3]
표 3. 마우스 항IL4Rα 항체의 결합 활성
Figure pct00005
실시예 4 : IL4Rα-벤치마크 또는 IL4Rα-IL4 상호작용에 대한 마우스 항IL4Rα 항체의 차단 활성
4.1 리간드 차단 ELISA
본 발명의 항IL4Rα 항체가 IL4-IL4Rα 상호작용을 블로킹하는 능력은 경쟁 ELISA에 의해 결정되었다. 간단히 설명하면, PBS 내 2㎍/㎖ 농도의 인간 IL4Rα-his 단백질(서열번호: 57, 자체제작)을 100㎕/웰로 96-웰 플레이트에 코팅하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, 플레이트를 세척 완충액(PBS + 0.05% w/v Tween-20, PBST)으로 세척하고 PBST 내 5% w/v 탈지유로 37℃에서 2시간 블로킹하였다. 이어서, 세척 완충액을 사용해서 플레이트를 다시 세척하였다.
항IL4Rα 항체 또는 대조 물질을 2.5% w/v 탈지유 함유 PBST 버퍼로 단계 희석(80nM에서 시작, 4배 단계 희석)하고, 단계 희석된 항IL4Rα 항체 또는 대조 물질을 IL4Rα 코팅 플레이트에 100㎕/웰로 첨가하고, 인간 IL4Rα-his 단백질과 함께 37℃에서 40분간 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 버퍼로 4회 세척한 후, 농도 0.56nM의 비오틴 표지 인간 IL4 단백질(Sinobiological Inc., 카탈로그 번호 11846-HNAE) 100㎕를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 40분간 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 버퍼로 다시 세척하였다. 이어서, 100㎕/웰의 HRP 표지 스트렙트아비딘(PBST 버퍼로 1:10000으로 희석, Jackson Immunoresearch, 카탈로그 016-030-084)을 첨가하고 37℃에서 40분간 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 버퍼로 다시 세척하였다. 마지막으로, TMB를 첨가하여 1M H2SO4로 반응을 정지시키고 흡광도를 450nm에서 판독하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용해서 데이터를 분석하여 IC50 값을 얻었다.
4.2 벤치마크 차단 ELISA
본 발명의 항IL4Rα 항체가 벤치마크-인간 IL4Rα 결합을 블로킹하는 능력을 경쟁 ELISA 어세이로 측정하였다. 간단히 설명하면, 96-웰 마이크로 플레이트에 PBS 내 2㎍/㎖ 농도의 벤치마크를 100㎕/웰로 코팅하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날 플레이트를 세척 버퍼(PBS + 0.05% w/v Tween-20, PBST)로 세척하고 PBST 내 5% w/v 무지방 우유로 37℃에서 2시간 블로킹하였다. 플레이트 블로킹 동안, 본 발명의 항IL4Rα 항체 또는 대조군을 비오틴 표지 인간 IL4Rα-his 단백질(서열번호 57, 사내 제조, PBST 내 2.5% w/v 무지방 우유로 0.55nM로 제조)로 100nM에서 시작해서 4배 연속 희석하고 25℃에서 40분간 인큐베이션하였다. 플레이트 세척 후, 항체/IL4Rα-his 혼합물을 벤치마크 코팅 플레이트에 1웰당 100㎕ 첨가하였다. 37℃에서 40분간 인큐베이션한 후, 세척 버퍼를 사용해서 플레이트를 세척하였다. 그 후, 100㎕/웰의 HRP 표지 스트렙트아비딘을 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 40분간 인큐베이션하여 플레이트에 결합된 비오틴 표지 인간 IL4Rα-his를 검출하였다. 플레이트를 세척 버퍼로 다시 세척하였다. 마지막으로 TMB를 첨가하여 1M H2SO4로 반응을 정지시키고 흡광도를 450nm에서 판독하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용해서 데이터를 분석하여 IC50 값을 얻었다.
4.3 세포 기반 리간드 차단 FACS
위에서 제조된 293F-IL4Rα 세포를 이용해서 세포 표면 IL4Rα에 대한 IL4 단백질의 결합을 블로킹하는 항IL4Rα 항체의 활성을 유세포 분석(FACS)으로 평가하였다.
간단히 말하면, 293F-IL4Rα 세포를 세포 배양 플라스크에서 회수하여 2회 세척하고 FACS 완충액(2% v/v 소 태아 혈청을 포함하는 PBS)에 재현탁하였다. 이어서, FACS 버퍼로 단계 희석(80nM에서 시작, 4배 단계 희석)된 항IL4Rα 항체 또는 대조 물질을 100μL/웰로, 1×105세포/웰을 포함하는 96-웰 플레이트에 첨가하여 40분간 빙욕하였다. 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 100㎕/웰의 1.67nM 비오틴 표지 인간 IL4 단백질(Sino biological inc., 카탈로그 번호 11846-HNAE)을 첨가하고, 어두운 곳에서 4℃에서 40분간 인큐베이션하였다. 플레이트를 FACS 버퍼로 2회 세척한 후, 100㎕/웰의 R-피코에리트린 스트렙트아비딘(FACS 버퍼로 1:500 희석, Jackson Immunoresearch, 카탈로그 번호 016-110-084)을 첨가하고, 어두운 곳에서 4℃에서 40분간 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고 FACS 버퍼에 재현탁하였다. Becton Dickinson FACS Canto II-HTS 장치를 사용해서 형광을 측정하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용해서 데이터를 분석하여 IC50 값을 얻었다.
3개의 측정 결과를 하기 표 4 및 도 4a~4b, 5a~5b 및 6a~6c에 나타내었다.
표 4 및 도 4a~4b를 통해, 본 발명의 모든 항IL4Rα 항체가 벤치마크에 필적하는 차단 활성으로 인간 IL4-인간 IL4Rα 상호작용을 차단할 수 있음을 알 수 있었다.
도 5a 및 5b는 본 발명의 항체 일부가 인간 IL4Rα-벤치마크 결합을 차단할 수 있음을 나타내며, 이들이 벤치마크와 동일하거나 유사한 에피토프에 결합할 수 있음을 시사한다.
또한 표 4 및 도 6a~6c에 나타낸 바와 같이, 모든 항IL4 Rα 항체는 IL4의 세포 표면 IL4Rα에 대한 결합을 블로킹할 수 있고, 그 차단 능력은 참조 제품의 차단 능력에 매우 가까웠다(단, IC50 값은 벤치마크 값보다 약간 높았다).
[표 4]
표 4. 벤치마크-IL4Rα 또는 IL4-IL4Rα 결합에 대한 항IL4Rα 항체의 차단 활성
Figure pct00006
실시예 5 : 마우스 항IL4Rα 항체의 세포 기반 기능 분석
IL4과 IL13은 IL4Rα에 결합할 수 있고 HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2 세포에서 STAT6의 인산화를 유도할 수 있다. 인산화 단계는 IL4/IL13 신호 전달 경로에서 중요하다.
간단히 설명하면, pcDNA3.1-Puro(YouBio biological inc., 카탈로그 번호 VT9222) 플라스미드 구조물(BamHI와 XhoI 사이에 인간 IL4Rα를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함함), STAT6 플라스미드(Sino Biological Inc., 카탈로그 번호 HG13190-NH)(KpnI와 XbaI 사이에 인간 STAT6을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함함) 및 STAT6 루시페라아제 리포터 유전자 플라스미드 STAT6-Luc(Yaesen biological, Inc., 카탈로그 번호 11588ES03)을 사용해서 IL13Rα1을 네이티브로 발현하는 HEK293T 세포(ATCC CRL-11268)를 안정적으로 트랜스펙션하고 HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2 세포를 사내에서 제조하였다. 이어서, 단일 세포 클론 LB2를 후속하는 모든 기능 분석을 위해 선택하였다.
본 발명의 항IL4Rα 항체에 대해, IL4 및 IL13 유도 STAT6 인산화에 대한 억제 효과를 시험하였다.
간단히 설명하면, 대수기의 HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2 세포를 배지(RPMI1640+10% FBS)에 재현탁하고, 100㎕/웰로 96-웰 플레이트에 파종하고 각 웰에는 5x105 세포가 포함되었다. 이어서, 50μL의 단계 희석된 항IL4Rα 항체 또는 대조군(자사에서 제조한 항CD22 항체를 포함함)(100nM에서 시작, 5배 단계 희석)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 다음으로, 50μL IL4 단백질(600pg/mL, Sino biological inc., 카탈로그 번호 11846-HNAE) 또는 IL13 단백질(50ng/mL, Sino biological inc., 카탈로그 번호 10369-HNAC)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 20분간 인큐베이션하였다. 플레이트를 원심 분리하고 염색 버퍼(사내에서 제조, DPBS + 0.5% w/v BSA+2mM EDTA)로 2회 세척한 후, 50μL의 고정 버퍼(BD biosciences inc., 카탈로그 5545655)를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고 200㎕의 투과화 완충액(BD biosciences inc., 카탈로그 번호 558050)을 각 웰에 첨가하고 30분간 빙욕하였다. 플레이트를 염색 완충액으로 3회 세척하였다. 그 후, 항pSTAT6 항체(pSTAT6 스톡 용액의 20배 희석, BD biosciences inc., 카탈로그 번호 562079)를 첨가하고 얼음 위에서 60분간 정치하였다. 마지막으로 플레이트를 2회 세척하고 염색 버퍼에 재현탁하였다. Becton Dickinson FACS Canto II-HTS를 사용해서 형광값을 측정하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용해서 데이터를 분석하여 IC50 값을 얻었다.
결과를 하기 표 5와 도 7, 8에 나타내었다.
결과는 모든 항IL4Rα 항체가 HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2 세포에서 IL4 또는 IL13 유도 STAT6 인산화를 참조 물질과 동등 이상의 차단 활성으로 차단할 수 있음을 나타낸다.
[표 5]
표 5. 항IL4Rα 항체의 기능 분석 결과
Figure pct00007
실시예 6 : 키메라 항체의 생성 및 특성화
항IL4Rα 마우스 단클론항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 서열 결정하고 서열 ID를 표 1에 정리하였다.
항IL4Rα 마우스 mAb C2C1A1A1 및 B8G11F2B7G5E8의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 각각 인간 IgG4 중쇄 불변영역(서열번호 55)을 포함하는 벡터 및 인간 κ 경쇄 불변영역(서열번호 56)을 포함하는 벡터에 클로닝하였고, 여기서 가변영역의 C말단은 대응하는 불변영역의 N말단에 연결된다.
인간 IgG4 중쇄 불변영역에 연결된 중쇄 가변영역을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 벡터와, 인간 κ 경쇄 불변영역에 연결된 경쇄 가변영역을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 경쇄 구조물:중쇄 구조물 60%:40%의 비율로 1mg/mL PEI로 50mL 293F 현탁 세포에 일시적으로 트랜스펙션하였다.
진탕 플라스크에서 6일간 배양한 후 세포 상청을 회수하고 스핀다운하여 세포를 펠렛화하고, 면역글로불린 분리를 위해 0.22㎛ 필터를 통과시켜 여과하였다. 키메라 항체는 단백질 A 어피니티 크로마토그래피로 정제하였다. 간단히 설명하면, 단백질 A 세파로스 칼럼(bestchrom(Shangai) Biosciences, 카탈로그 번호 AA0273)을 PBS 완충액을 사용해서 5~10배 칼럼 용적으로 세척하였다. 세포 상청을 단백질 A 세파로스 칼럼에 통과시키고 단백질 흡광도가 기준선에 도달할 때까지 칼럼을 PBS 완충액으로 세척하였다. 칼럼을 용출 버퍼(0.1M 글리신-HCl, pH 2.7)로 용출하고, 바로 중화 버퍼(1M Tris-HCl, pH 9.0)를 포함하는 1.5ml 튜브에 수집하고 중화하였다. 면역글로불린을 포함하는 분획을 풀링하고 PBS로 4℃에서 하룻밤 투석하였다.
정제된 항체는 Capture ELISA, 경쟁 ELISA, BIAcore 친화성 시험, 세포 기반 결합 FACS 및 세포 기반 기능 측정에서 상기 실시예의 프로토콜(이하에 기재된 약간의 변경을 가함)에 따라 시험하였다.
Capture ELISA에서는 염소 항-마우스 IgG(Fcγ 단편 특이적) 대신에 2㎍/ml의 염소 항-인간 IgG(어피니티 정제 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적, Jackson Immunoresearch, 카탈로그 번호 109-005-098)를 100μL/웰로 사용하였다.
간접 ELISA에서는 퍼옥시다아제 표지 어피니티 정제 염소 항-마우스 IgG(Fc γ 단편 특이적) 대신에 퍼옥시다아제 표지 어피니티 정제 F(ab')2 단편화 염소 항-인간 IgG(Fcγ 단편 특이적, Jackson Immunoresearch, Catalog 109-036-098)을 100μL/웰로 사용하였다.
BIAcore에서는 염소 항-마우스 IgG 대신에 염소 항-인간 IgG(GE healthcare, 카탈로그 번호 BR100839, Human Antibody Capture Kit)를 사용해서 CM5 칩에 공유 결합하였다.
세포 기반 결합 FACS에서는 R-피코에리트린 표지 어피니티 정제 F(ab')2 단편화 염소 항-마우스 IgG(H+L) 대신에, R-피코에리트린 표지 어피니티 정제 염소 항-인간 IgG(Fcγ 단편 특이적, Jackson Immunoresearch, 카탈로그 번호 109-115-098)를 FACS 버퍼로 1:1000으로 희석하고 100μL/웰로 사용하였다.
결과를 표 6 및 도 9~13에 나타내었다. 데이터는 키메라 항체가 그 부모 마우스 항체와 유사한 결합 친화성/능력 및 차단 활성을 갖는 것을 나타낸다.
[표 6]
표 6. 키메라 항체의 결합 및 기능 활성
Figure pct00008
실시예 7: 항IL4Rα 단클론항체 B8G11F2B7G5E8 및 C2C1A1A1의 인간화
마우스 항IL4Rα 항체 B8G11F2B7G5E8 및 C2C1A1A1을 인간화하여 특성을 더욱 명확히 하였다. 마우스 항체의 인간화는 확립된 CDR 그래프트법을 사용해서 하기에 설명된 바와 같이 수행되었다.
마우스 항체 B8G11F2B7G5E8 및 C2C1A1A1의 인간화를 위한 어셉터 프레임워크를 선택하기 위해, 각 마우스 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역 서열을 인간 면역글로불린 유전자 데이터베이스에 대해 블라스트(BLAST)하였다. 가장 높은 상동성을 갖는 인간의 생식계열이 인간화를 위한 어셉터 프레임워크로 선택되었다. 마우스 항체의 중쇄/경쇄 가변영역 CDR을 선택된 프레임워크에 삽입하고, 프레임워크의 잔기를 추가로 복귀 돌연변이시켜 보다 많은 후보 중쇄/경쇄 가변영역을 얻었다. 총 13개의 예시적인 인간화 B8G11F2B7G5E8 항체, 즉 huB8G11F2B7G5E8-V1에서 huB8G11F2B7G5E8-V11, huB8G11F2B7G5E8-V13 및 huB8G11F2B7G5E8-V14까지, 그리고 16개의 예시적인 인간화 C2C1A1A1 항체, 즉 huC2C1A1A1-V1에서 huC2C1A1A1-V16까지가 얻어졌고, 그 중쇄/경쇄 가변영역의 서열 ID를 표 1에 나타내었다.
인간 IgG4 중쇄 불변영역(서열번호 55)에 연결된 인간화 중쇄 가변영역을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 인간 κ 경쇄 불변영역(서열번호 56)에 연결된 인간화 경쇄 가변영역을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 경쇄 구조물: 중쇄 구조물 60%:40%의 비율로 1mg/mL PEI로 50mL 293F 현탁 세포에 일시적으로 트랜스펙션하였다.
진탕 플라스크에서 6일간 배양한 후에 세포 상청을 회수하고, 상청 내 세포를 원심 분리로 펠렛화하고 0.22㎛ 필터로 여과하여 면역글로불린을 분리하였다. 항체는 단백질 A 어피니티 크로마토그래피로 정제되었다. 간단히 설명하면, 단백질 A 세파로스 칼럼(bestchrom(Shangai) Biosciences, 카탈로그 번호 AA0273)을 PBS 완충액을 사용해서 5~10배 칼럼 용적으로 세척하였다. 세포 상청을 단백질 A 세파로스 칼럼에 통과시키고, 단백질의 흡광도가 기준선에 도달할 때까지 칼럼을 PBS 완충액으로 세척하였다. 칼럼을 용출 버퍼(0.1M 글리신-HCl, pH 2.7)로 용출하고, 바로 중화 버퍼(1M Tris-HCl, pH 9.0)를 포함하는 1.5ml 튜브에 모아서 중화하였다. 면역글로불린을 포함하는 분획을 풀링하고 PBS로 4℃에서 하룻밤 투석하였다.
실시예 8: 인간화 항체의 특성화
[표 7]
표 7. 인간화 B8G11F2B7G5E8 단클론항체의 결합 친화성
Figure pct00009
인간 IL4Rα에 대한 인간화 항체의 결합 친화성은 이전 실시예의 프로토콜에 따라 BIAcore 기술을 통해 평가되었다. Ka, Kd 및 KD 값을 측정하여 표 7 및 표 8에 정리하였다.
[표 8]
표 8. 인간화 C2C1A1A1 단클론항체의 결합 친화성
Figure pct00010
결과는 인간화 항체가 인간 IL4Rα에 대해 키메라 항체와 동일한 결합 친화성을 가지며, 모든 인간화 huC2C1A1A1 항체가 참조와 비교했을 때 인간 IL4Rα에 대해 보다 높은 결합 친화성을 가지는 것으로 나타났다.
인간화 항체 huB8G11F2B7G5E8-V2, huB8G11F2B7G5E8-V4, huB8G11F2B7G5E8-V14, huC2C1A1A1-V14 및 huC2C1A1A1-V15는 Biacore, capature ELISA, 간접 ELISA, 세포 기반 결합 FACS, 경쟁 ELISA 및 세포 기반 기능 측정에서, 상기 실시예의 프로토콜(아래에 기재된 약간의 변경을 가함)에 따라 시험하였다.
Capture ELISA에서는 염소 항-마우스 IgG(Fcγ 단편 특이적) 대신에 2㎍/mL 염소 항-인간 IgG(어피니티 정제 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적, Jackson Immunoresearch, 카탈로그 번호 109-005-098)을 100μL/웰로 사용하였다.
간접 ELISA에서는 퍼옥시다아제 표지 어피니티 정제 염소 항-마우스 IgG(Fcγ 단편 특이적) 대신에, 퍼옥시다아제 표지 어피니티 정제 F(ab')2 단편화 염소 항-인간 IgG(Fcγ 단편 특이적, Jackson Immunoresearch, 카탈로그 번호 109-036-098)을 100μL/웰로 사용하였다.
BIAcore에서는 염소 항-마우스 IgG 대신에 염소 항-인간 IgG(GE healthcare, 카탈로그 번호 BR100838, Human Antibody Capture Kit)를 사용하였고, CM5 칩에 공유 결합하였다.
세포 기반 결합 FACS에서는 R-피코에리트린 표지 어피니티 정제 F(ab')2 단편화 염소 항-마우스 IgG(H+L) 대신에, R-피코에리트린 표지 어피니티 정제 염소 항-인간 IgG(Fcγ 단편 특이적, Jackson Immunoresearch, 카탈로그 번호 109-115-098)를 FACS 버퍼로 1:1000으로 희석하고 100μL/웰로 사용하였다.
인간화 항체 huB8G11F2B7G5E8-V14 및 huC2C1A1A1-V15의 열 안정성도 시험하였다. 간단히 설명하면, GloMeltTM Thermal Shift Protein Stability Kit(Biotium, 카탈로그 번호 33022-T, 카탈로그 번호 181214)를 사용해서 단백질 서멀 시프트 어세이를 통해 Tm(융해 온도)를 측정하였다. 간단히 설명하면, GloMeltTM 색소를 실온에서 해동하였다. 염료가 포함된 바이알을 볼텍싱하고 원심분리하였다. 이어서, 5μL 200x 염료를 95μL PBS에 첨가하여 10x 염료를 제조하였다. 반응계에 2μL 10x 염료 및 10μg 인간화 항체를 첨가하고, PBS에 첨가하여 총 반응량을 20μL로 하였다. 색소와 항체를 포함하는 마이크로 원심 튜브를 간단하게 원심 분리하고 표 9의 파라미터를 사용해서 융해 곡선 프로그램을 설정한 실시간 PCR 서멀 사이클러(Roche, LightCycler 480 II)에 설치하였다.
[표 9]
표 9. 융해 곡선 프로그램의 파라미터
Figure pct00011
결과를 표 10-1~10-3 및 도 14a~14b 내지 도 22에 나타내었다.
[표 10-1]
표 10-1. 인간화 단클론항체의 결합 및 기능 활성
Figure pct00012
[표 10-2]
표 10-2. 인간화 단클론항체의 결합 및 기능 활성
Figure pct00013
[표 10-3]
표 10-3. 인간화 단클론항체의 결합 및 기능 활성
Figure pct00014
데이터에 따르면, 인간화 C2C1A1A1 항체는 벤치마크와 비교했을 때 인간 IL4Rα에 대해 더 좋지는 않더라도 동등한 결합 친화성/활성 및 IL4Rα-IL4/IL13에 대한 차단 능력을 나타내었다. 인간화 B8G11F2B7G5E8 항체는 IL4/IL13-IL13Rα1-IL4Rα 상호작용에 대해 유의하게 우수한 차단 능력을 나타내었다.
본 발명을 하나 또는 복수의 실시형태와 관련하여 위에서 설명하였지만, 본 발명은 이들 실시형태에 한정되지 않으며, 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 포함되는 모든 대체물, 수정물 및 등가물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 인용된 모든 문서는 참조를 통해 그 전체가 포함된다.
본 출원의 시퀀스 정보를 다음 표에 정리하였다.
[표 11]
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
<110> CHIA TAI TIANQING PHARMACEUTICAL GROUP CO., LTD. <120> ANTIBODIES BINDING IL4R AND USES THEREOF <150> US62982521 <151> 2020-02-27 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 1 Thr Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 2 Asp Thr Tyr Met His 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 3 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 4 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 5 Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 6 Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 7 Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Ile Tyr Ala Ser Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 8 Gly Ile Arg Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 9 Ser Ile Ser Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 10 Phe Phe Arg Phe Arg Asn Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 11 Phe Phe Arg Ile Arg Asn Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 12 Arg Arg Pro Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 13 Gly Asp Lys Leu Arg Pro Tyr His Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 14 Ser Gly Gly Ser Ala Pro Tyr 1 5 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 15 Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 16 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 17 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 18 Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 19 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Val 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 20 Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 21 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 22 Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 23 Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 24 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 25 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 26 Gln His Tyr Tyr Gly Pro Pro Thr Trp Thr 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 27 Gln His Tyr Tyr Gly Thr Pro Thr Trp Thr 1 5 10 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 28 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 29 Gln Gln His Tyr Ser Asp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 30 Gln Gln His Tyr Ser Ala Pro Tyr Thr 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 31 Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 32 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Phe Arg Phe Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH for huC2C1A1A1-V1 - huC2C1A1A1-V4 and huC2C1A1A1-V9 - huC2C1A1A1-V16 <220> <221> UNSURE <222> (47) <223> X= W or L <220> <221> UNSURE <222> (49) <223> X= S or A <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Xaa Val 35 40 45 Xaa Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Phe Arg Phe Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH for huC2C1A1A1-V5-huC2C1A1A1-V8 <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Phe Arg Phe Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 108 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Phe Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Asn Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Gly Pro Pro Thr 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 36 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for huC2C1A1A1-V1, huC2C1A1A1-V3-huC2C1A1A1-V5, huC2C1A1A1-V7 - huC2C1A1A1-V9, huC2C1A1A1-V11 - huC2C1A1A1-V13, huC2C1A1A1-V15 and huC2C1A1A1-V16 <220> <221> UNSURE <222> (46) <223> X= L or F <220> <221> UNSURE <222> (48) <223> X= I or V <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa Leu Xaa 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Gly Pro Pro Thr 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for huC2C1A1A1-V2,huC2C1A1A1-V6,huC2C1A1A1-V10 and huC2C1A1A1-V14 <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Gln Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Pro Pro Arg Phe Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser 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acggcggctc cacaagctac 180 cccgacagcg tgaagggaag attcaccatc tctagagaca acgccaagaa cacactgtat 240 ctgcagatga actctctgag agccgaagac accgctgtgt actactgcgc tagattcttt 300 agatttagaa acgccatgga ctactggggc caaggcacac tggtgacagt gtcctcc 357 <210> 62 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for mouse C2C1A1A1 <400> 62 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag 120 ggaaaatctc ctcagttcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga atatcaacag cctgcagtct 240 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat tattatggtc ctcccacgtg gacgttcggt 300 ggaggcacca agctggaaat caaa 324 <210> 63 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for chimeric C2C1A1A1 <400> 63 gacatccaga tgacacagag ccccgccagc ctgtccgcct ccgttggaga gaccgtgacc 60 atcacctgta ggacctccga gaatatctac agctacctgg cctggtatca acagaagcag 120 ggcaagtccc ctcagtttct ggtgtacaac gccaagaccc tggccgaggg cgtgccctct 180 aggttctccg gctccggcag cggcacccag ttcagcctga atatcaacag cctgcagagc 240 gaggactttg gcagctacta ctgtcagcac tactacggcc ctcccacctg gacatttggc 300 ggcggcacaa agctggagat caag 324 <210> 64 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for huC2C1A1A1-V3, huC2C1A1A1-V7, huC2C1A1A1-V11 and huC2C1A1A1-V15 <400> 64 gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgctt ccgtgggaga tagagtgacc 60 atcacatgca gaacctccga gaacatctac agctatctgg cttggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagttcct ggtgtacaac gccaagacac tggctgaggg cgtgcctagc 180 agattcagcg gctccggcag cggcacagac tttacactga caatcagctc tctgcaaccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcac tactatggcc cccctacatg gacctttggc 300 caaggcacca aggtggagat caag 324 <210> 65 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH for mouse B8G11F2B7G5E8 <400> 65 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagat cttgtgaggc caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagcagagg 120 cctgaacagg gcctggagtg ggttggaagg attgatccta cgaatggtta tactatatat 180 gcctcaaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcatccaa cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctggggac actgccgtct atcattgtgt tagtcggagg 300 ccctggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348 <210> 66 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH for chimeric B8G11F2B7G5E8 <400> 66 gaggtgcagc tgcagcagtc cggcgccgac ctggtgaggc caggagcttc cgtgaagctg 60 agctgcacag ccagcggctt caacatcaag gacacataca tgcactgggt gaagcagagg 120 cccgagcagg gcctggagtg ggtgggaaga atcgacccca ccaacggcta caccatctac 180 gcctccaagt tccagggcaa ggccaccatc acagccgata cctcctccaa cacagcctac 240 atgcagctgt ccagcctgac aagcggcgat accgccgtgt accactgcgt gtccagaagg 300 ccttggttcg cctactgggg ccagggcacc ctggtgacag tgtccgcc 348 <210> 67 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH for huB8G11F2B7G5E8-V14 <400> 67 gaggtgcagc tggtgcagag cggcgctgag gtgaagaagc ccggcgccac cgtgaagatc 60 agctgcaagg tgagcggctt caacatcaag gacacctaca tgcactgggt gaagcaagcc 120 cccggcaaag gactggagtg gatgggaaga atcgacccca ccaacggcta caccatctac 180 gccagcaagt tccaaggcaa ggccaccatc accgccgaca cctccagcaa taccgcctac 240 atggagctga gctctctgag aagcgaggac accgccgtgt accactgtgt gagcagaaga 300 ccttggttcg cctactgggg ccaaggcaca ctggtgaccg tgagcagc 348 <210> 68 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for mouse B8G11F2B7G5E8 <400> 68 gatattttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggagc tcaagcctcc 60 atctcttgca gatcaagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagttac caatcgattt 180 tctggggtcc cagataggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336 <210> 69 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for chimeric B8G11F2B7G5E8 <400> 69 gacatcctga tgacacagac acccctgtcc ctgcctgtgt ccctgggcgc tcaggcctcc 60 atctcctgta ggagcagcca gtccatcgtg cacagcaatg gcaacaccta cctggagtgg 120 tacttgcaga agcctggcca gagccccaag ctgctgatct acaaggtgac caacagattc 180 agcggcgtgc ccgataggtt cagcggctcc ggcagcggca ccgatttcac actgaagatc 240 tccagggtgg aggccgagga cctgggcatc tactactgct tccagggctc ccacgtgcct 300 tacacctttg gcggcggcac aaagctggag atcaag 336 <210> 70 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL for huB8G11F2B7G5E8-V1 - huB8G11F2B7G5E8-V11, huB8G11F2B7G5E8-V13 and huB8G11F2B7G5E8-V14 <400> 70 gacatcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgtccgtga cacccggcca gcctgccagc 60 atcagctgta ggagctccca gtccatcgtg cactccaatg gcaatacata cctggagtgg 120 tacttgcaga agcccggcca gtcccctcag ctgctgatct acaaggtgac caatagattc 180 tccggcgtgc ccgataggtt ctccggcagc ggctccggca cagacttcac actgaagatc 240 agcagagtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgct tccagggctc ccacgtgccc 300 tacaccttcg gccagggcac caagctggag atcaag 336 <210> 71 <211> 984 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain constant region for chimeric and humanized antibodies <400> 71 gccagcacaa agggcccttc cgtgtttccc ctggccccct gcagcaggag cacctctgag 60 tccaccgccg ccctgggctg tctggtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgagc 120 tggaattccg gcgccctgac atccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagtcctcc 180 ggcctgtaca gcctgagctc cgtggtgaca gtgccttcct cctccctggg caccaagacc 240 tacacatgta atgtggatca caagcccagc aacacaaagg tggataagag agtggagtcc 300 aagtacggcc ctccttgccc tccctgtcct gccccagagt tcctgggcgg cccctctgtg 360 ttcctgttcc cccctaagcc caaggacaca ctgatgatct ccaggacccc tgaggtgacc 420 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaggac cctgaggtgc agttcaattg gtacgtggat 480 ggcgtggagg tgcacaatgc caagacaaag cccagagagg agcagtttaa ttccacatac 540 agggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa ggagtacaag 600 tgtaaggtga gcaacaaggg cctgccttcc tccatcgaga agacaatcag caaggccaag 660 ggccagccta gggagcccca ggtgtacaca ctgcctccca gccaggagga gatgaccaag 720 aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ctagcgacat cgccgtggag 780 tgggagtcca acggccagcc cgagaataac tacaagacaa caccccccgt gctggattcc 840 gatggcagct tctttctgta ctccaggctg accgtggata agagcaggtg gcaggagggc 900 aatgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca atcactacac ccagaagagc 960 ctgtccctga gcctgggcaa gtga 984 <210> 72 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain constant region for chimeric and humanized antibodies <400> 72 cgtacggtgg cggcgccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttga 324

Claims (20)

  1. 인터루킨 4 수용체 알파 서브유닛(IL4Rα)에 결합하는 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위로서, 중쇄 가변영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 (1) 각각 서열번호 1, 5 및 10에 표시된 아미노산 서열; (2) 각각 서열번호 1, 6 및 11에 표시된 아미노산 서열; (3) 각각 서열번호 2, 7 및 12에 표시된 아미노산 서열; (4) 각각 서열번호 3, 8 및 13에 표시된 아미노산 서열; (5) 각각 서열번호 4, 8 및 13에 표시된 아미노산 서열; 또는 (6) 각각 서열번호 3, 9 및 14에 표시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 32, 33(X1=W, X2=S; X1=L, X2=A; X1=W, X2=A), 34, 38, 40, 41(X1=A, X2=K, X3=V, X4=H; X1=V, X2=K, X3=V, X4=H; X1=A, X2=Q, X3=V, X4=H; X1=A, X2=K, X3=M, X4=H; X1=A, X2=K, X3=V, X4=Y; X1=V, X2=K, X3=M, X4=H), 42(X1=R, X2=A, X3=S, X4=N; X1=K, X2=V, X3=S, X4=N; X1=K, X2=A, X3=T, X4=N; X1=K, X2=A, X3=S, X4=D; X1=R, X2=V, X3=T, X4=N), 43, 44, 47, 49, 51 또는 53에 표시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위.
  3. 청구항 1에 있어서, 경쇄 가변영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 (1) 각각 서열번호 15, 22 및 26에 표시된 아미노산 서열; (2) 각각 서열번호 16, 22 및 27에 표시된 아미노산 서열; (3) 각각 서열번호 17, 23 및 28에 표시된 아미노산 서열; (4) 각각 서열번호 18, 24 및 29에 표시된 아미노산 서열; (5) 각각 서열번호 19, 24 및 30에 표시된 아미노산 서열; (6) 각각 서열번호 20, 25 및 31에 표시된 아미노산 서열; 또는 (7) 각각 서열번호 21, 25 및 31에 표시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 35, 36(X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; X1=F, X2=I), 37, 39, 45, 46, 48, 50, 52 또는 54에 표시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 (1) 각각 서열번호 1, 5, 10, 15, 22 및 26에 표시된 아미노산 서열; (2) 각각 서열번호 1, 6, 11, 16, 22 및 27에 표시된 아미노산 서열; (3) 각각 서열번호 2, 7, 12, 17, 23 및 28에 표시된 아미노산 서열; (4) 각각 서열번호 3, 8, 13, 18, 24 및 29에 표시된 아미노산 서열; (5) 각각 서열번호 4, 8, 13, 19, 24 및 30에 표시된 아미노산 서열; (6) 각각 서열번호 3, 9, 14, 20, 25 및 31에 표시된 아미노산; 또는 (7) 각각 서열번호 3, 9, 14, 21, 25 및 31에 표시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 (1) 각각 서열번호 32 및 35에 표시된 아미노산 서열; (2) 각각 서열번호 33(X1=W, X2=S) 및 36(X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; X1=F, X2=I)에 표시된 아미노산 서열; (3) 각각 서열번호 33(X1=W, X2=S) 및 37에 표시된 아미노산 서열; (4) 각각 서열번호 34 및 36(X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; X1=F, X2=I)에 표시된 아미노산 서열; (5) 각각 서열번호 34 및 37에 표시된 아미노산 서열; (6) 각각 서열번호 33(X1=L, X2=A) 및 36(X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; X1=F, X2=I)에 표시된 아미노산 서열; (7) 각각 서열번호 33(X1=L, X2=A) 및 37에 표시된 아미노산 서열; (8) 각각 서열번호 33(X1=W, X2=A) 및 36(X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; X1=F, X2=I)에 표시된 아미노산 서열; (9) 각각 서열번호 33(X1=W, X2=A) 및 37에 표시된 아미노산 서열; (10) 각각 서열번호 38 및 39에 표시된 아미노산 서열; (11) 각각 서열번호 40 및 45에 표시된 아미노산 서열; (12) 각각 서열번호 41(X1=A, X2=K, X3=V, X4=H; X1=V, X2=K, X3=V, X4=H; X1=A, X2=Q, X3=V, X4=H; X1=A, X2=K, X3=M, X4=H; X1=A, X2=K, X3=V, X4=Y; X1=V, X2=K, X3=M, X4=H) 및 46에 표시된 아미노산 서열; (13) 각각 서열번호 42(X1=R, X2=A, X3=S, X4=N; X1=K, X2=V, X3=S, X4=N; X1=K, X2=A, X3=T, X4=N; X1=K, X2=A, X3=S, X4=D; X1=R, X2=V, X3=T, X4=N) 및 46에 표시된 아미노산 서열; (14) 각각 서열번호 43 및 46에 표시된 아미노산 서열; (15) 각각 서열번호 44 및 46에 표시된 아미노산 서열; (16) 각각 서열번호 47 및 48에 표시된 아미노산 서열; (17) 각각 서열번호 49 및 50에 표시된 아미노산 서열; (18) 각각 서열번호 51 및 52에 표시된 아미노산 서열; 또는 (19) 각각 서열번호 53 및 54에 표시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 중쇄 가변영역에 연결된 중쇄 불변영역 및 상기 경쇄 가변영역에 연결된 경쇄 불변영역을 포함하고, 상기 중쇄 불변영역은 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄 불변영역은 서열번호 56에 표시된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위는 (a) 인간 IL4Rα에 결합하고; (b) 원숭이 IL4Rα에 결합하고; (c) IL4Rα-IL4 상호작용을 차단하고; 및 (d) IL4Rα-IL13-IL13Rα1 상호작용을 차단하는, 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위는 마우스 항체, 인간 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체인, 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 아이소타입인, 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위.
  11. 청구항 1에 기재된 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위를 코딩하는 뉴클레오티드.
  12. 청구항 11에 기재된 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  13. 청구항 11에 기재된 뉴클레오티드 또는 청구항 12에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  14. 청구항 1에 기재된 단리된 단클론항체 또는 그 항원 결합 부위, 청구항 11에 기재된 뉴클레오티드, 청구항 12에 기재된 발현 벡터 또는 청구항 13에 기재된 숙주 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 항알레르기제 또는 항종양제를 더 포함하는 약학 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 항알레르기제는 항히스타민제, 코르티코스테로이드, β-아드레날린 수용체 작용제, cyc-LTs를 표적으로 한 약물 또는 IgE를 표적으로 한 약물인 약학 조성물.
  17. 치료 유효량의 청구항 14 또는 16에 기재된 약학 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 과잉 IL4 및/또는 IL13 신호 전달 관련 알레르기성 질환을 치료하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 알레르기성 질환은 아토피성 피부염, 알레르기 반응, 알레르기성 비염 또는 알레르기성 천식인 방법.
  19. 치료 유효량의 청구항 14에 기재된 약학 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, STAT6 활성화 증가 관련 종양을 치료하는 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 종양은 고형 종양인 방법.
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