KR20230097165A - 나노바디에 결합하는 trop2 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

인간 TROP2에 특이적으로 결합하는 중쇄 전용 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 본원에 제공된다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 발현시키기 위한 방법도 제공된다. 본 개시는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 면역접합체 및 약학적 조성물, 뿐만 아니라 본 개시의 항-TROP2 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 사용한 치료 방법을 추가로 제공한다.

Description

나노바디에 결합하는 TROP2 및 이의 용도
관련 출원 및 참조에 의한 포함
본 출원은 2020년 11월 3일에 출원된 중국 특허 출원 일련 번호 제 202011209105.X 및 2021년 4월 23일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제 63/178,741에 대한 우선권을 주장한다.
상기 출원, 이들에 인용되거나 심사 중인 모든 문헌("출원에 인용된 문헌") 및 본원에 인용되거나 참조된 모든 문헌(본원에 인용된 모든 문헌 문서, 특허, 공개 특허 출원을 비제한적으로 포함함)("본원에 인용된 문헌"), 및 본원에 인용된 문헌에서 인용되거나 참조된 모든 문헌은 본원에 언급된 임의의 생산물을 위한 또는 본원에 참조로 포함되는 임의의 문헌 내의 임의의 제조업체의 지침, 설명, 생산물 사양 및 생산물 시트와 함께 이에 의해 참조로 본원에 포함되고 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 모든 참조된 문헌은 각각의 개별 문헌이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 포함되어 있는 것으로 지시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 본 개시에서 언급된 임의의 젠뱅크(Genbank) 서열은 본 개시의 가장 빠른 유효한 출원일의 젠뱅크 서열을 참조로 포함한다.
발명의 분야
본 개시는 일반적으로 높은 친화성 및 작용성으로 인간 보체 TROP2에 결합하는 단리된 단클론성 중쇄 전용 항체, 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 발현시키기 위한 방법도 제공된다. 본 개시는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함할 수 있는 이중특이적 분자, 면역접합체, 키메라 항원 수용체, 종양용해 바이러스, 및 약학적 조성물, 뿐만 아니라 본 개시의 항-TROP2 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 사용한 치료 방법을 추가로 제공한다.
TROP2는 상피 당단백질-1(EGP-1), 막 성분 표면 표지자-1(M1S1), 종양 관련 칼슘 신호 변환기-2(TACSTD2) 및 위장 항원 733-1(GA733-1)로도 알려진 막관통 당단백질이다. 각 TROP2 분자는 소수성 전구체 펩티드, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 꼬리로 구성된다. 세포질 꼬리는 고도로 보존된 포스파티딜이노시톨 4, 5-이인산(PIP2) 결합 서열 및 303 위치의 세린 인산화 부위를 포함한다(Zaman S et al., (2019) Targeting Trop-2 in solid tumors: future prospects. Onco Targets Ther. 12:1781-1790). TROP2의 결합 파트너는 IFG-1, Claudin-1, Claudin-7, cyclin D1 및 PKC을 포함한다(Shvartsur A et al., (2015) Trop2 and its overexpression in cancers: regulation and clinical/therapeutic implications. Genes Cancer. 6(3-4):84-105).
TROP2는 정상 조직에서 낮은 수준으로 발현되며, 예를 들어, 배아 기관 발달 및 태아 성장에 역할을 하는 반면, 정상 대조군의 기준 TROP2 발현 수준과 무관하게 모든 암 유형에서 발현이 증가하는 것으로 밝혀졌다(Mustata RC et al., (2013) Identification of Lgr5-independent spheroid-generating progenitors of the mouse fetal intestinal epithelium. Cell Reports. 5(2):421-432; Guerra E et al., (2012) mTrop1/Epcam knockout mice develop congenital tufting enteropathy through dysegulation of intestinal e-cadherin/β-catenin. PLoS ONE. 7(11): e49302; Trerotola M et al., (2013) Upregulation of Trop-2 quantitatively stimulates human cancer growth. Oncogene. 32(2): 222-233). 연구에 따르면, TROP2 발현을 결정하는 여러 전사 인자는 TP63/TP53L 및 빌름스 종양1(WT1)과 같은 암의 발생과 관련이 있으며, TROP2는 종양 발생과 관련된 많은 세포 신호 전달 경로에 관여하는 것으로 나타났다. 예를 들어, TROP2 신호 전달은 β-카테닌 신호 전달을 통해 세포의 자기재생 및 증식을 조절하여 암 세포의 줄기 세포와 유사한 특성을 촉진시킨다(Stoyanova T et al., (2012) Regulated proteolysis of Trop2 drives epithelial hyperplasia and stem cell self-renewal via β-catenin signaling. Genes Dev. 26(20):2271-2285). TROP2 과발현은 자궁경부암, 난소암, 대장암, 갑상선암의 종양 침입을 촉진시키고, TROP2 녹다운은 암 세포의 침입을 감소시킨다(Guan H et al., (2017) Trop2 enhances invasion of thyroid cancer by inducing MMP2 through ERK and JNK pathways. BMC Cancer. 17(1):486; Liu T et al., (2013) Overexpression of Trop2 predicts poor prognosis of patients with cervical cancer and promotes the proliferation and invasion of cervical cancer cells by regulating ERK signaling pathway. PLoS One. 8(9):e75864; Wu B et al., (2017) Overexpression of Trop2 promotes proliferation and invasion of ovarian cancer cells. Exp Ther Med. 14(3):1947-1952; Zhao P et al., (2018) TNF-αpromotes colon cancer cell migration and invasion by upregulating Trop-2. Oncol Lett. 15(3):3820-3827). 최근에 TROP2 신호 전달은 세포 이동을 위한 신호 전달을 조절하는 것으로 추가로 밝혀졌다. 예를 들어, TROP2는 β1 인테그린 기능을 조절하여 전립선암의 전이를 촉진하는 것으로 보고되었다(Trerotola M et al., (2013) Trop-2 promotes prostate cancer metastasis by modulating β(1) integrin functions. Cancer Res. 73(10):3155-3167).
TROP2의 고발현은 임상적으로 간문부 담관암, 자궁경부암, 위암 등의 불량한 예후와 상관관계가 있다. 2,569명의 환자를 포함한 메타 분석에서 TROP2 발현 증가는 여러 고형 종양에서 양호하지 않은 전체 생존 및 무병 생존 결과와 통계적으로 관련이 있었다(Fong D et al., (2008) High expression of Trop2 correlates with poor prognosis in pancreatic cancer. Br J Cancer. 99(8):1290-1295; Ning S et al., (2013) Trop2 correlates with microvessel density and poor prognosis in hilar cholangiocarcinoma. J Gastrointest Surg. 17(2):360-368; Liu T et al., (2013) Overexpression of Trop2 predicts poor prognosis of patients with cervical cancer and promotes the proliferation and invasion of cervical cancer cells by regulating ERK signaling pathway. PLoS One. 8(9):e75864; Zhao W et al., (2016) Trop2 is overexpressed in gastric cancer and predicts poor prognosis. Oncotarget. 7(5):6136-6145; Zeng P et al., (2016) Impact of Trop2 expression on prognosis in solid tumors: a systematic review and meta-analysis. Sci Rep. 6:33658). 종양 표지자로서 TROP2의 역할은 특정 임상시험에서 시험되고 있다.
그 구조적 특성과 암과의 상관관계 때문에 TROP2는 매력적인 치료 표적이다. 여러 항-TROP2 항체가 제조되었으며, 일부는 유방암의 진행을 억제하고 이종 이식 마우스 모델에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 확인되었다(Lin H et al., (2014) A novel human Fab antibody for Trop2 inhibits breast cancer growth in vitro and in vivo. Int J Cancer. 134(5):1239-1249). 그러나, 2015년 IKEDA 등에 의해 Pr1E11의 높은 결합 친화성 및 낮은 내부화 활성이 확인되기 전까지, 기존 항체(naked antibody)는 높은 내부화율로 인해 치료적 가치를 나타내지 못한 것으로 보인다(Ikeda M et al., (2015) Pr1E11, a novel anti-TROP-2 antibody isolated by adenovirus-based antibody screening, recognizes a unique epitope. Biochem Biophys Res Commun. 458(4):877-82). 후속 연구에서 Pr1E11은 높은 세포 표면 유지와 관련이 있는 것으로 추정되는 강력한 항체 의존적 세포 독성을 생체내에서 유도하는 것으로 밝혀졌다(Ikeda M et al., (2016) Cell Surface Antibody Retention Influences In Vivo Antitumor Activity Mediated by Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity. Anticancer Res. 36(11):5937-5944). 현재 임상 전 및 임상 시험 중인 대부분의 TROP2 표적 치료제는 DS-1062a, IMMU-132, PF-06664178 등의 항체-약물 접합체(ADC)이며, 현재까지 제한된 독성을 사용한 고형암 치료에서 고무적인 결과를 얻었다(Zaman S et al., (2019) supra).
기존 항체로 사용할 내부화 활성이 낮은 추가적인 항-TROP2 항체 또는 ADC 제조를 위한 내부화 활성이 높은 추가적인 항-TROP2 항체가 필요가 있다.
본 출원에서 임의의 문헌의 인용 또는 확인은 그러한 문헌이 본 발명에대한 종래 기술로서 이용 가능하다는 것을 인정하는 것이 아니다.
본 개시는 TROP2(예를 들어, 인간 TROP2)에 결합하고 사시투주맙(IMMU-132의 항체 부분)과 같은 종래 기술의 항-TROP2 항체와 비교하여 더 높지는 않더라도 비슷한 인간 및/또는 원숭이 TROP2에 대한 결합 친화성/결합능, 더 높지는 않더라도 비슷한 내부화 활성을 갖는 단리된 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
본 개시의 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 방사성으로 표지된 TROP2 단백질의 시험관내 및 생체내 검출 및 암과 같은 TROP2 관련 질환의 치료를 포함하여 다양한 적용을 위해 사용할 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 개시는 VH CDR1 영역, VH CDR2 영역 및 VH CDR3 영역을 포함할 수 있는 가변 영역(여기서, VH CDR1 영역, VH CDR2 영역, 및 VH CDR3 영역은 (1) 각각 SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=G, X3=D, X4=S) 및 3(X1=D, X2=G); 각각 (2) SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=G, X3=D, X4=S) 및 3(X1=E, X2=G); 각각 (3) SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=G, X3=D, X4=S) 및 3(X1=D, X2=A); 각각 (4) SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=G, X3=D, X4=S) 및 3(X1=I, X2=G); 각각 (5) SEQ ID NO: 1, 2(X1=E, X2=G, X3=D, X4=S) 및 3(X1=E, X2=G); 각각 (6) SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=A, X3=D, X4=S) 및 3(X1=E, X2=G); 각각 (7) SEQ ID NO: 1, 2(X1=E, X2=G, X3=D, X4=S) 및 3(X1=D, X2=A); 각각 (8) SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=A, X3=D, X4=S) 및 3(X1=D, X2=A); 각각 (9) SEQ ID NO: 1, 2(X1=E, X2=G, X3=E, X4=S) 및 3(X1=E, X2=G); 각각 (10) SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=A, X3=E, X4=S) 및 3(X1=E, X2=G); 각각 (11) SEQ ID NO: 1, 2(X1=E, X2=G, X3=D, X4=T) 및 3(X1=D, X2=A); 각각 (12) SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=A, X3=D, X4=T) 및 3(X1=D, X2=A)과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있음)을 갖는, TROP2에 결합하는 단리된 단클론성 중쇄 전용 항체(예를 들어, 카멜리드, 키메라 또는 인간화 항체) 또는 이의 항원 결합 부분에 관한 것이다.
본 개시의 단리된 단클론성 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 가변 영역은 SEQ ID NO: 4(X1=S, X2=Q, X3=D, X4=G, X5=P; X1=S, X2=Q, X3=E, X4=G, X5=P; X1=S, X2=Q, X3=D, X4=A, X5=P; X1=S, X2=Q, X3=I, X4=G, X5=P; 또는 X1=T, X2=G, X3=D, X4=G, X5=L), 5(X1=E, X2=G, X3=D; X1=D, X2=A, X3=D; X1=E, X2=G, X3=E; 또는 X1=D, X2=A, X3=E); 6(X1=E, X2=G, X3=S; X1=D, X2=A, X3=S; X1=E, X2=G, X3=T; 또는 X1=D, X2=A, X3=T), 7, 8(X1=F, X2=Y, X3=K, X4=A; X1=L, X2=F, X3=K, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=R, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=K, X4=R; 또는 X1=L, X2=Y, X3=K, X4=A), 9(X1=F, X2=Y, X3=K, X4=A; X1=L, X2=F, X3=K, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=R, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=K, X4=R; 또는 X1=L, X2=Y, X3=K, X4=A), 10(X1=F, X2=Y, X3=K, X4=A; X1=L, X2=F, X3=K, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=R, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=K, X4=R; 또는 X1=L, X2=Y, X3=K, X4=A); 11(X1=F, X2=Y, X3=K, X4=A; X1=L, X2=F, X3=K, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=R, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=K, X4=R; 또는 X1=L, X2=Y, X3=K, X4=A), 12 또는 13(X1=V, X2=W; 또는 X1=F, X2=G)과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. SEQ ID NO: 4(X1=S, X2=Q, X3=D, X4=G, X5=P), 6(X1=D, X2=A, X3=T) 및 9(X1=L, X2=Y, X3=K, X4=A)의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 23, 24 및 25의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
본 개시의 단리된 단클론성 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 가변 영역에 연결된 불변 영역 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있으며, 여기서 가변 영역의 C-말단은 불변 영역의 N-말단에 연결되었다. 불변 영역은 SEQ ID NO: 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 이의 기능적 단편과 같이, 향상된 FcR 결합능을 갖는 중쇄 불변 영역일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 향상된 FcR 결합 친화성을 갖도록 조작된 인간 IgG2 또는 IgG4 불변 영역이거나 이의 기능적 단편일 수도 있다. SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 26의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
본 개시는 또한 상기 항체, 또는 이의 항원-결합 부분과는 상이한 결합 특이성을 갖는 제2 기능적 모이어티(예를 들어, 제2 항체)에 연결된 본 개시의 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함할 수 있는 이중특이적 분자를 제공한다.　 본 개시는 또한 치료제, 세포독소(예컨대, SN-38) 또는 방사성 표지와 같은 치료제에 연결된, 본 개시의 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함할 수 있는 면역접합체를 제공한다. 본 개시의 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부로 구성될 수 있다. 또한 T 세포 및 NK 세포와 같은 항원 키메라 수용체를 포함할 수 있는 면역 세포가 제공된다. 본 개시의 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 또한 종양용해 바이러스에 의해 인코딩되거나 이와 함께 사용될 수 있다.
중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는 방사성으로 표지되고 예를 들어, 전이성 종양/암의 분포를 포함하여 종양/암의 분포를 추적/검출하는 임상 영상에 사용될 수 있다. 방사성 표지는 3H를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 개시의 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 면역접합체 또는 CAR을 인코딩하는 핵산 분자뿐만 아니라 이러한 핵산 분자를 포함할 수 있는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함할 수 있는 숙주 세포가 또한 본 개시에 의해 포괄된다. 숙주 세포를 사용하여 본 개시의 항-TROP2 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제조하기 위한 방법으로서, (i) 숙주 세포에서 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 발현하는 단계 및 (ii) 숙주 세포 또는 이의 세포 배양물로부터 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 단리하는 단계를 포함할 수 있는, 방법도 제공된다.
본 개시의 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 면역접합체, 이중특이적 분자, 종양용해 바이러스, CAR 또는 CAR-T 세포, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는 약학적 조성물이 또한 제공된다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 항암제와 같은 특정 질환을 치료하기 위한 치료제를 추가로 함유할 수 있다.
추가의 또 다른 양태에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체의 TROP2 (예를 들어, 과도한 TROP2 발현) 관련 질환을 치료하는 방법으로서, 본 개시의 치료적 유효량의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 질환은 종양 또는 암일 수 있다. 종양은 유방암, 대장암, 위선암, 식도암, 간세포암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 난소상피암, 전립선암, 췌장관선암, 두경부암, 편평상피세포암, 신장세포암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 여포성 갑상선암, 다형성 교모세포종을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 고형 종양 또는 비고형 종양일 수 있다. 특정 구현에에서, 적어도 하나의 추가적인 항암 항체, 예컨대, 항-VISTA 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-LAG-3 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-STAT3 항체 및/또는 항-ROR1 항체가 추가로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체의 암 영상화를 위한 방법으로서, 방사성으로 표지된 본 개시의 항-TROP2 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 이 방법은 식도 편평상피세포암, 대장암, 췌장암, 결장암, 유두상 갑상선암, 유방암 및 방광암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 TROP2 고발현 종양 또는 암의 분포를 추적/검출하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본 개시의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이고, 이들은 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 젠뱅크 항목, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 명백히 참조로 본원에 포함된다.
따라서, 본 발명의 목적은 출원인이 권리를 유보하도록 임의의 이전에 공지된 생산물, 생산물을 제조하는 공정, 또는 생산물을 사용하는 방법을 본 발명 내에 포함시키지 않으며, 이에 의해 임의의 이전에 공지된 생산물, 공정, 또는 방법의 포기를 개시한다. 본 발명은 출원인이 권리를 유보하도록 USPTO(35 U.S.C. §112, 첫 단락) 또는 EPO(EPC의 83항)의 서면 기재 요건 및 실시 가능 요건을 충족하지 않는 임의의 생산물, 공정, 또는 생산물의 제조 또는 생산물의 사용 방법을 본 발명의 범주 내에 포함시키고자 하는 것이 아니고, 이에 의해 임의의 이전에 기재된 생산물, 생산물의 제조 공정, 또는 생산물의 사용 방법의 포기를 개시한다는 것이 추가로 주목된다. 본 발명의 실시에 있어서 Art. 53(c) EPC 및 규칙 28(b) 및 (c) EPC를 준수하는 것이 유리할 수 있다. 본 출원의 계보 또는 임의의 다른 계보 또는 임의의 제3자의 종래 출원된 출원에서 출원인의 임의의 등록된 특허(들)의 요지인 임의의 구현예를 명백히 포기하는 모든 권리는 명백히 유보된다. 본 명세서에서 어떤 것도 약속으로 해석되어서는 안된다.
본 개시 내용 및 구체적으로 청구항 및/또는 단락에서, "포함한다(comprises)", "포함된(comprised)", "포함하는(comprising)" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 귀속된 의미를 가질 수 있다는 것이 주목되며; 예를 들어, 이들은 "포함한다(includes)", "포함된(included)", "포함하는(including)" 등을 의미할 수 있고; "필수적으로 이루어지는(consisting essentially of)" 및 "필수적으로 이루어진다(consists essentially of)"와 같은 용어는 미국 특허법에서 이들에게 부여된 의미를 갖고, 예를 들어, 명시적으로 열거되지 않은 요소를 허용하지만, 종래 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특징에 영향을 미치는 요소는 제외한다.
본 발명을 기술된 특정 구현예로만 제한하고자 하는 것이 아닌, 예로서 주어진 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1은 간접 ELISA에서 인간 TROP2에 대한 단일 도메인 항체 01-9F 및 01-5A의 결합능을 보여주는 것이다.
도 2는 경쟁 ELISA에서 벤치마크-인간 TROP2 결합을 차단하는 단일 도메인 항체 01-9F 및 01-5A의 능력을 보여주는 것이다.
도 3은 293F-TROP2 세포에서 단일 도메인 항체 01-9F 및 01-5A의 DT3C 접합체의 내부화 매개 세포 독성을 보여주는 것이다.
도 4는 293F-TROP2 세포에서 중쇄 전용 항체 01-9F-CDR-V5-Fc, 01-9F-CDR-V6-Fc, 01-9F-CDR-V9-Fc 및 01-9F-CDR-V11-Fc의 DT3C 접합체의 내부화 매개 세포 독성을 보여주는 것이다.
도 5는 293F-TROP2 세포에서 인간화 항체 01-9F-CDR-V11-V1-Fc, 01-9F-CDR-V11-V9-Fc 및 01-9F-CDR-V11-V11-Fc의 DT3C 접합체의 내부화 매개 세포 독성을 보여주는 것이다.
도 6은 포획 ELISA에서 인간 TROP2에 대한 인간화 항체 01-9F-CDR-V11-V11-Fc의 결합능을 보여주는 것이다.
도 7은 간접 ELISA에서 인간 TROP2에 대한 인간화 항체 01-9F-CDR-V11-V11-Fc의 결합능을 보여주는 것이다.
도 8은 간접 ELISA에서 시노몰구스 TROP2에 대한 인간화 항체 01-9F-CDR-V11-V11-Fc의 결합능을 보여주는 것이다.
도 9는 세포 기반 결합 FACS 검정에서 인간 TROP2을 발현하는 293F-TROP2 세포에 대한 인간화 항체 01-9F-CDR-V11-V11-Fc의 결합능을 보여주는 것이다.
도 10은 경쟁 ELISA에서 벤치마크-인간 TROP2 결합을 차단하는 인간화 항체 01-9F-CDR-V11-V11-Fc의 능력을 보여주는 것이다.
도 11a 내지 11c는 항체 01-9F(a), 01-9F-CDR-V11-Fc(b) 및 01-9F-CDR-V11-V11-Fc (c)의 단백질 열 이동 검정 결과를 보여주는 것이다.
본 개시를 보다 용이하게 이해할 수 있도록 보장하기 위해, 소정의 용어가 먼저 정의된다. 추가 정의가 상세한 설명 전반에 걸쳐 기재된다.
용어 "TROP2" 상피 당단백질-1, 위장 항원 733-1 및 막 성분 표면 마커-1로도 알려진 종양 관련 칼슘 신호 변환기-2를 지칭한다. 용어 "TROP2"는 변이체, 동형, 동족체, 동원체 및 이원체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 TROP2 단백질에 특이적인 항체는, 특정 경우에, 원숭이와 같은 인간 이외의 종으로부터의 TROP2 단백질과 교차 반응할 수 있다. 다른 구현예에서, 인간 TROP2 단백질에 특이적인 항체는 인간 TROP2 단백질에 완전 특이적일 수 있고, 다른 종에 대한 또는 다른 유형의 교차 반응성을 나타내지 않거나, 다른 모든 종이 아니라 다른 특정 종으로부터의 TROP2와 교차 반응할 수 있다.
용어 "인간 TROP2"는 SEQ ID NO: 20에 기재된 인간 TROP2의 아미노산 서열과 같은, 인간으로부터의 아미노산 서열을 갖는 TROP2 단백질을 지칭한다. 용어 "원숭이 TROP2" 또는 "시노몰구스 TROP2"는 NCBI 수탁 번호 XP_001114599.1 또는 XP_011762693.1을 갖는 아미노산 서열과 같은, 돼지꼬리 원숭이(macaca nemestrina) 또는 붉은털 원숭이(macaca mulatta)로부터의 아미노산 서열 갖는 TROP2 단백질을 지칭한다.
일부 경우에, 용어 "항체"는 구체적으로 본 개시의 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 지칭한다. 용어 "중쇄 전용 항체" 또는 "HCAb"는 주로 4-체인 면역글로불린에서 발견되는 중쇄만 포함하고 경쇄는 결여된 기능적 항체를 지칭한다. 자연적으로 발생하는 중쇄 전용 항체는 예를 들어 카멜리드(낙타, 리마, 아파카 등)에서 발견된다. 각 카멜리드 중쇄 전용 항체는 VHH 도메인, VHH 단편 또는 단쇄 항체(sdAb)로 불리는 중쇄 가변 영역/도메인과 중쇄 불변 영역을 함유한다. VHH 는 항원과 상호작용하는 기능을 한다. VHH는 아미노-말단부터 카복시-말단까지 다음 순서로 배열된 3개의 상보성 결정 영역(CDR)과 4개의 프레임워크 영역(FR)을 함유한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 불변 영역은 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 함유한다. 결여된 CH1 도메인은 확장된 힌지 영역으로 대체된다. 키메라 또는 인간화 중쇄 전용 항체에서 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2 또는 IgG4와 같은 일반적인 IgG, 불변 영역를 함유할 수 있다. 불변 영역은 중쇄 전용 항체가 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 전통적인 보체계의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다.
중쇄 전용 항체와 함께 사용되는 "항원 결합 부분"은 항원(예를 들어, TROP2)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 중쇄 전용 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 중쇄 항체의 항원-결합 기능은 전장 중쇄 전용 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 중쇄 전용 항체의 "항원-결합 부분"의 예는 (i) 단리된 상보성 결정 영역(CDR), (ii) 1가 VHH 단편, (iii) 1가 VHH 단편 2개를 포함하는 2가 단편, (iv) 중쇄 불변 영역의 CH2 도메인 또는 CH2 및 CH3 도메인에 연결된 VHH 도메인과 같은, 부분 중쇄 불변 영역에 연결된 VHH 단편을 포함하는 1가 단편, (v) 각각 부분 중쇄 불변 영역에 결합하는 2개의 VHH 단편을 포함하는 2가 단편, (vi) 링커로 또는 링커 없이 연결된 다수의 1가 VHH 도메인을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 용어 "단일 도메인 항체", "sdAb", 또는 "나노바디"는 상응하는 CDR-함유 폴리펩티드와 쌍을 이루지 않고 항원에 결합할 수 있는, 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 단일　단량체　가변 항체 도메인을 포함하는 단일 항원-결합 폴리펩티드를 지칭한다. 경우에 따라, 단일 도메인 항체는 카멜리드 HCAb로부터 조작되며, VHH 도메인 또는 HCAb의 단편이라고도 불린다. 단일 도메인 항체는 중쇄 전용 항체의 항원-결합 부분이다. VHH는 나노바디로도 알려져 있다. 카멜리드 sdAb는 알려진 가장 작은 항원-결합 항체 단편 중 하나이다(예를 들어, 문헌[Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-8 (1993); Greenberg et al., Nature 374:168-73 (1995); Hassanzadeh-Ghassabeh et al., Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013)] 참조).
본원에서 사용되는 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 하고자 한다(예를 들어, TROP2 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 TROP2 단백질 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음) 그러나, 인간 TROP2 단백질 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종으로부터의 TROP2 단백질과 같은 다른 항원에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "카멜리드"는 프레임워크와 CDR 영역 둘 모두가 카멜리드 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 하고자 한다. 추가로, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 카멜리드 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 개시의 카멜리드 항체는 카멜리드 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-지정 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "카멜리드 항체"는 또 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 카멜리드 프레임워크 서열 상에 접목된 항체를 포함하는 것으로 하고자 하지 않는다.
용어 "키메라 항체"는 비인간 공급원으로부터의 유전 물질을 인간으로부터의 유전 물질과 조합함으로써 제조된 항체를 지칭한다. 또는 보다 일반적으로, 키메라 항체는 특정 종으로부터의 유전 물질과 함께 또 다른 종으로부터의 유전 물질을 갖는 항체이다.
본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"는 인간에서 자연적으로 생성된 항체 변이체와의 유사성을 증가시키도록 변형된 단백질 서열을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 동종인 항체의 개체군에서 얻은 항체를 지칭한다. 즉, 개체군을 구성하는 개별 항체들은 자연적으로 발생할 수 있는 소량의 돌연변이 및/또는 번역 후 변형(예를 들어, 이성질화, 아미드화)을 제외하고 동일하다. 단클론성 항체는 단일 항원 부위에 대해 매우 특이적으로 지시된다. 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제제와 달리, 각각의 단클론성 항체는 항원의 단일 결정기에 대해 지시된다. 단클론성 항체는 이러한 특이성 외에도, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론성"은 항체의 특성이 실질적으로 동종 항체의 개체군으로부터 얻어지는 것임을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산이 필요한 것으로 해석되어서는 안 된다. 예컨대, 본 발명에 따라 사용되는 단클론성 항체는 이를테면, 하이브리도마법을 포함하는 다양한 기법으로 제조될 수 있다.
용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 항체 부류(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
문구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 용어 "항원에특이적으로 결합하는 항체"와 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 "인간 TROP2에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 TROP2 단백질(및 가능하게는 하나 이상의 비-인간 종으로부터의 TROP2 단백질)에 결합하지만 비-TROP2 단백질에는 실질적으로 결합하지 않는 항체를 지칭하는 것으로 하고자 한다. 바람직하게는, 항체는 "고친화성", 즉 5.0 x10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 1.0 x10-8 M 이하, 및 더욱 바람직하게는 2.0 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 TROP2 단백질을 결합한다.
본원에서 사용되는 단백질 또는 세포에 "실질적으로 결합하지 않는"이라는 용어는 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나 고친화성으로 결합하지 않는,즉, 1.0 x 10-6 M 이상, 더욱 바람직하게는 1.0 x 10-5 M 이상, 더욱 바람직하게는 1.0 x 10-4 M 이상, 더욱 바람직하게는 1.0 x 10-3 M 이상, 더욱더 바람직하게는 1.0 x 10-2 M 이상의 KD로 단백질 또는 세포에 결합하는 것을 의미한다.
IgG 항체에 대한 "고친화성"이라는 용어는 표적 항원에 대한 1.0 x 10-6 M 이하, 더욱 바람직하게는 5.0 x 10-8 M 이하, 더욱더 바람직하게는 1.0 x 10-8 M 이하, 더욱더 바람직하게는 1.0 x 10-9 M 이하 및 더욱더 바람직하게는 5.0 x 10-10 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, "고친화성" 결합은 다른 항체 이소형에 대해서는 다를 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화성" 결합은 10-6 M 이하, 더욱 바람직하게는 10-7 M 이하, 더욱더 바람직하게는 10-8 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의결합 속도를 지칭하는 것으로 하고자 하지만, 본원에서 사용되는 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것으로 하고자 한다. 본원에서 사용되는 용어 "KD"는 Kd 대 Ka의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 수득되고 몰 농도(M)로 표현되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 하고자 한다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에서 잘 확립된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를결정하는 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것, 바람직하게는 BiacoreTM 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것에 의해 이루어진다.
최대 유효 농도의 절반으로도 알려진 용어 "EC50"은 특정 노출 시간 후 기준선과 최대 값 사이의 중간의 반응을 유도하는 항체의 농도를 지칭한다.
최대 억제 농도의 절반으로도 알려진 용어 "IC50"은 항체의 부재에 비해 50%만큼 특정 생물학적 또는 생화학적 기능을 억제하는 항체의 농도를 지칭한다.
용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함하지만, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말과 같은 포유동물이 바람직하다.
용어 "치료적 유효량"은 질환 또는 질병(예컨대, 만성 염증)과 관련된 증상을 예방하거나 개선하고/하거나 질환 또는 질병의 중증도를 감소시키기에 충분한 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 양을 의미한다. 치료적 유효량은 치료되는 질병에 대한 맥락과 관련하여 이해되며, 여기서 실제 유효량은 당업자가 용이하게 알 수 있다.
본 개시의 다양한 양태는 하기 세부 항목에서 더욱 상세히 기술된다.
본 개시는 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 사시투주맙(IMMU-132의 항체 부분)과 같은 종래 기술의 항-TROP2 항체와 비교하여 더 높지는 않더라도 비슷한 인간 및/또는 원숭이 TROP2에 대한 결합 친화성/결합능, 더 높지는 않더라도 비슷한 내부화 활성을 갖는 인간 TROP2에 특이적으로 결합한다.
본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 카멜리드, 키메라 및 인간화일 수 있다. 본 개시의 항체는 중쇄 전용 항체이다.
[표 1] 중쇄 전용 항체의 중쇄/경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 ID 번호
Figure pct00001
Figure pct00002
본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 하기에서 그리고 실시예에서 기술되는 바와 같이 구조적 및 화학적으로 특징화되는 단클론성 항체이다. 본 개시의 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 ID 번호는 상기 표 1에 요약되어 있으며, 일부 항체는 동일한 VH를 공유한다 항체의 불변 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 이의 기능적 단편일 수 있다. 본 개시의 항체는 또한 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 함유할 수 있다.
표 1의 가변 영역 CDR은 카바트(Kabat) 넘버링 체계에 의해 정의되었다. 그러나, 당업계에 널리 공지된 바와 같이, CDR 영역은 또한 가변 영역 서열에 기초하여 코티아(Chothia), 및 IMGT, AbM, 또는 콘택트(Contact) 넘버링 체계/방법과 같은 다른 체계에 의해 결정될 수 있다.
인간 TROP2에 결합하는 다른 항-TROP2 항체의 VH 서열(또는 CDR 서열)은 본 개시의 VH 서열(또는 CDR 서열)과 "혼합 및 매칭"될 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 상기 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함할 수 있는 가변 영역을 포함할 수 있고, 여기서 항체는 인간 TROP2에 특이적으로 결합한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 상기 표 1에 열거된 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함할 수 있고, 여기서 항체는 인간 TROP2에 특이적으로 결합한다.
추가의 또 다른 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 인간 TROP2에 결합하는 다른 항체의 CDR과 조합된 항-TROP2 항체의 CDR2 영역, 예를 들어, 상이한 항-TROP2 항체의 가변 영역으로부터의 CDR1 및/또는 CDR3을 포함한다.
또한, CDR1 및/또는 CDR2 도메인(들)과 무관하게 CDR3 도메인 단독이 동족 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정할 수 있고, 공통 CDR3 서열에 기초하여 동일한 결합 특이성을 갖는 다수의 항체가 예측 가능하게 생성될 수 있음이 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260(2000); Beiboer et al., J. Mol. Natl. Acad. Sci. 296:833-849(2000); Rader et al., Proc. J. Mol. Biol. U.S.A. 95:8910-8915 (1998); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162(1994); Barbas et al., Proc. J. Mol. Biol. U.S.A. 92:2529-2533(1995); Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749(1996); Berezov et al., BIAjournal 8: Scientific Review 8(2001); Igarashi et al., J. Biochem(Tokyo) 117:452-7(1995); Bourgeois et al., J. Virol 72:807-10(1998); Levi et al., Proc. J. Mol. Biol. U.S.A. 90:4374-8(1993); Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329(1994) 및 Xu and Davis, Immunity 13:37-45 (2000)]을 참조한다. 또한 미국 특허 제6,951,646호; 제6,914,128호; 제6,090,382호; 제6,818,216호; 제6,156,313호; 제6,827,925호; 제5,833,943호; 제5,762,905호 및 제5,760,185호를 참조한다. 이들 참고문헌 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 개시의 항체는 상술된 다음의 기능적 성질들 중 하나 이상, 예컨대, 인간 TROP2에 대한 고친화성을 지닌다.
다양한 구현예에서, 항체는, 예를 들어, 카멜리드, 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의하게 영향을 미치거나 이를 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 것으로 하고자 한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가및 결실을 포함한다. 변형은 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발과 같이 당업계에 공지된 표준 기법에 의해 본 개시의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 아미노산 잔기가대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당업계에 정의되었다. 이러한 계열은 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 개시의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 항체는 본원에 기재된 기능적 분석을 사용하여 보유된 기능(즉, 상기 제시된 기능)에 대해 시험될 수 있다.
본 개시의 항체는 변형된 항체를 조작하기 위해 출발 물질로서 본 개시의 항-TROP2 항체의 VH 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 항체는, 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역 내의 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 가변 영역(즉, VH) 내의 하나 이상의 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는, 예를 들어, 항체의 효과기 기능(들)을 변경하기 위해, 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다.
특정 구현예에서, CDR 접목은 항체의 가변 영역을 조작하는 데 사용될 수 있다. 항체는 주로 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이런 이유로 인해, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체 간에 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 되기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 접목된 특정 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현할 수 있다(예를 들어, 문헌[Riechmann et al., (1998) Nature 332:323-327; Jones et al., (1986) Nature 321:522-525; Queen et al., (1989) Proc. J. Acad] 참조; 또한 U.S.A. 86:10029-10033; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,225,539호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
따라서, 본 개시의 또 다른 구현예는 상술된 바와 같은 본 개시의 서열을포함할 수 있는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함할 수 있는 가변 영역을 포함하는 단리된 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 이들 항체는 본 개시의 단클론성 항체의 VHH CDR 서열을 함유하지만, 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.
이러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 DNA 서열은 "VBase" 인간생식계열 서열 데이터베이스(인터넷 상의 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용 가능함), 뿐만 아니라 상기 언급된 문헌[Kabat et al., (1991)]; 및 문헌[Tomlinson et al., (1992) J. Mol. Natl. Acad. Sci. 227:776-798]; 및 문헌[Cox et al., (1994) Eur. J. Immunol. 24:827-836](이들 각각의 내용은 본원에 참조로 명백히 포함됨)에서 확인될 수 있다. 다른 예로서, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 젠뱅크 데이터베이스에서 확인될 수 있다. 예를 들어, HCo7 HuMAb 마우스에서 확인되는 다음 중쇄 생식계열 서열은 첨부된 젠뱅크 수탁 번호 1 내지 69(NG--0010109, NT--024637 & BC070333), 3 내지 33(NG--0010109 & NT--024637) 및 3 내지 7(NG--0010109 & NT--024637)에서 이용 가능하다. 또 다른 예로서, HCo12 HuMAb 마우스에서 확인되는 다음 중쇄 생식계열 서열은 첨부된 젠뱅크 수탁 번호 1 내지 69(NG--0010109, NT--024637 & BC070333), 5 내지 51(NG--0010109 & NT--024637), 4 내지 34(NG--0010109 & NT--024637), 3 내지 30.3(CAJ556644) & 3 내지 23(AJ406678)에서 이용 가능하다.
항체 단백질 서열은 당업자에게 널리 공지된 Gapped BLAST(상기 문헌[Altschul et al., (1997)]로 불리는 서열 유사성 탐색 방법 중 하나를 사용하여 종합된 단백질 서열 데이터베이스와 비교된다.
본 개시의 항체에서 사용하기 위한 바람직한 프레임워크 서열은 본 개시의 항체에 의해 사용된 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것들이다. VHH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 프레임워크 서열이 유래된 생식계열 면역글로불린 유전자에서 확인된 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 접목될 수 있거나, CDR 서열은 생식계열 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역 상에 접목될 수 있다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 능력을 유지하거나 향상시키기 위해 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시키는 것이 특정 경우에 이로울 수 있는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
또 다른 유형의 가변 영역 변형An은 VHH CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성(예를 들어, 친화성)을 개선하는 것이다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 항체 결합, 또는 관심 있는 다른 기능적 특성에 대한 효과가 당업계에 공지된 바와 같이 시험관내 또는 생체내 분석에서 평가될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 변형(당업계에 공지된 바와 같음)이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 더욱이, 전형적으로 CDR 영역 내의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기가 변경된다.
따라서, 또 다른 구현예에서, 본 개시는 다음을 포함하는 가변 영역을 포함하는 단리된 항-TROP2 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다: (a) 본 개시의 서열 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있는 CDR1 영역; (b) 본 개시의 서열 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있는 CDR2 영역; (c) 본 개시의 서열 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있는 CDR3 영역.
본 발명의 조작된 항체는, 예를 들어, 항체의 특성을 개선하기 위해, VHH 내의 프레임워크 잔기가 변형된 항체들을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식계열 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 거친 항체는 항체가 유래된 생식계열 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 생식계열 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 T 세포 에피토프를 제거하여 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해, 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 포함한다. 이러한 접근법은 "탈면역화"로도 지칭되며, 미국 특허 공개 제20030153043호에 더욱 상세히 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형 외에도, 또는 그에 대한 대안으로, 본 개시의 항체는, 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성,예컨대, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적 세포 세포 독성을 변경하기 위해, Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 개시의 항체는 화학적으로 변형되거나(예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 또는 이의 당화를 변경하도록, 또 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하도록 변형될 수 있다.
일 구현에에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어, 증가되거나 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,677,425호에 더욱 상세히 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하도록 또는 항체의 안정성을 증가시키거나 감소시키도록 변경된다.
또 다른 구현예에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 항체가 네이티브 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해 손상된 포도구균 단백질 A(SpA) 결합을 갖도록, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 도입된다. 이러한 접근법은 미국 특허 제6,165,745호에 더욱 상세히 기재되어 있다.
추가의 또 다른 구현예에서, 항체의 당화는 변형된다. 예를 들어, 무당화된(aglycosylated) 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 당화를 결여함). 당화는, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체 서열 내의 하나 이상의 당화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 당화 부위를 제거하여 해당 부위에서 당화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 무당화는 항원의 항체에 대한 친화성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,714,350 및 도 6,350,861에 나타나 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 당화를 갖는 항체, 예컨대, 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화(hypofucosylated) 항체 또는 증가된 바이섹팅(bisecting) GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 당화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 변경된 당화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현함으로써 달성될 수 있다. 변경된 당화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기술되어 있고, 본 개시의 재조합 항체를 발현하여 변경된 당화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705, 및 Ms709는 푸코실트랜스페라제 유전자인 FUT8(α(1, 6)-푸코실트랜스페라제)을 결여하고 있고, 그에 따라 Ms704, Ms705, 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체는 이들의 탄수화물 상에 푸코스를 결여하고 있다. Ms704, Ms705, 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는 2개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자의 표적화된 파괴에 의해 생성되었다(미국 특허 공개 제20040110704호 및 문헌[Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22)] 참조). 또 다른 예로서, 제EP 1,176,195호에는 푸코실 트랜스페라제를 인코딩하는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주가 기재되어 있으며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 α-1,6 결합-관련 효소를 감소시키거나 제거함으로써 저푸코실화를 나타낸다. 제EP 1,176,195호에는 또한 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하는 낮은 효소 활성을 갖거나 효소 활성을 갖지 않는 세포주, 예를 들어, 랫트 골수종 세포주 YB2/0(ATCC CRL 1662)가 기재되어 있다. PCT 공개 제WO 03/035835호에는푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착하는 능력이 감소되어 숙주 세포에서발현된 항체의 저푸코실화도 초래하는 변이체 CHO 세포주인 Lec13 세포가 기재되어 있다(또한 문헌[Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). 변형된 당화 프로파일을 갖는 항체는 또한 PCT 공개 제WO 06/089231호에 기재된 바와 같이, 달걀에서 생산될 수 있다. 대안적으로, 변형된 당화 프로파일을 갖는 항체는 좀개구리밥(Lemna)과 같은 식물 세포에서 생산될 수 있다. 식물계에서 항체를 생산하는 방법은 2006년 8월 11일에 출원된 Alston & Bird LLP 대리인 명부 제040989/314911호에 상응하는 미국 특허 출원에 개시되어 있다. 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단될 수 있고; 예를 들어, 푸코시다제 α-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다(Tarentino et al., (1975) Biochem. 14:5516-23).
본 개시에 의해 고려되는 본원의 항체의 또 다른 변형은 페길화이다. 항체는, 예를 들어, 항체의 생물학적(예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 페길화될 수 있다. 항체를 페길화하기 위해, 항체, 또는 이의 단편은 전형적으로 하나 이상의 PEG 그룹이 항체 또는 항체 단편에 부착하게 되는 조건 하에, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 반응된다. 바람직하게는, 페길화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용된 PEG의 임의의 형태, 예컨대, 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하는 것으로 하고자 한다. 특정 구현예에서, 페길화될 항체는 무당화된 항체이다. 단백질을 페길화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 개시의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, 제EP 0 154 316호 및 EP 0 401 384호를 참조한다.
본 개시의 항체는 이의 상이한 부류를 검출하고/하거나 구별하기 위한 이들의 다양한 물리적 특성을 특징으로 할 수 있다.
예를 들어, 항체는 가변 영역 내에 하나 이상의 당화 부위를 함유할 수 있다. 이러한 당화 부위는 변경된 항원 결합으로 인해 항체의 증가된 면역원성 또는 항체의 pK의 변경을 초래할 수 있다(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697-706). 당화는 N-X-S/T 서열을 함유하는 모티프에서 발생하는 것으로 알려졌다. 일부 경우에, 가변 영역 당화를 함유하지 않는 항-TROP2 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이는 가변 영역 내에 당화 모티프를 함유하지 않는 항체를 선택함으로써 또는 당화 영역 내의 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 항체는 아스파라긴 이성(isomerism) 부위를 함유하지 않는다. 아스파라긴의 탈아미드화는 N-G 또는 D-G 서열 상에서 발생할 수 있고, 이는 폴리펩티드 사슬 내에 링크를 도입하고 이의 안정성을 감소시키는 이소아스파트산 잔기의 생성을 초래할 수 있다(이소아스파트산 효과).
각각의 항체는 일반적으로 6 내지 9.5의 pH 범위에 속하는 고유한 등전점(pI)을 가질 것이다. IgG1 항체에 대한 pI는 전형적으로 7 내지 9.5의 pH 범위에 속하고, IgG4 항체에 대한 pI는 전형적으로 6 내지 8의 pH 범위에 속한다. 정상 범위 이외의 pI를 갖는 항체가 생체내 조건 하에 일부 언폴딩 및 불안정성을 가질 수 있다는 추측이 있다. 따라서, 정상 범위에 속하는 pI 값을 함유하는 항-TROP2 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이는 정상 범위 내의 pI를 갖는 항체를 선택함으로써 또는 전하를 띤 표면 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 항체의 가변 영역, 또는 CDR을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산은 전체 세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 표준 기법에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게 된다". 본 개시의 핵산은, 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 개시의 핵산은 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 수득될 수 있다. 하이브리도마(예를 들어, 하기에 추가로 기재된 바와 같은 인간 면역글로불린 유전자를 갖는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 중쇄를 인코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기법에 의해 수득될 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득된 항체의 경우(예를 들어, 파지 디스플레이 기법을 이용함), 이러한 항체를 인코딩하는 핵산은 유전자 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
본 개시의 바람직한 핵산 분자는 TROP2 단클론성 항체의 VHH 서열, 또는 CDR을 인코딩하는 것들을 포함한다. VHH 분절을 인코딩하는 DNA 단편이 얻어지면, 이들 DNA 단편은, 예를 들어, 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, 또는 VHH 단편 유전자로 변환시키기 위해, 표준 재조합DNA 기법에 의해 더 조작될 수 있다.
VHH 영역을 인코딩하는 단리된 DNA는 VH-인코딩 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 변환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다.
본 개시의 단클론성 항체(mAb)는 문헌[ Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495]의 잘 알려진 체세포 혼성화(하이브리도마) 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 단클론성 항체를 생산하기 위한 다른 구현예는 B 림프구의 바이러스 또는 종양발생 형질전환 및 파지 디스플레이 기법을 포함한다. 키메라 또는 인간화 항체는 또한 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 내용의 전체가 특히 본원에 참조로 특히 포함되는 미국 특허 제4,816,567호; 제5,225,539호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호를 참조한다.
본 개시의 항체는 또한, 예를 들어, 당업계에 널리 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기법과 유전자 형질감염 방법의 조합을 사용하여, 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다(예를 들어, 문헌[ Morrison, S. (1985) Science 229:1202). 일 구현예에서, 표준 분자 생물학 기법에 의해 얻어진 부분 또는 전장 중쇄를 인코딩하는 DNA는 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 하나 이상의 발현 벡터에 삽입된다. 이러한 문맥에서 용어 "작동 가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 제공하도록 항체 유전자가 벡터 내로 리게이션되는 것을 의미하고자 한다.
용어 "조절 서열"은 항체 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 하고자 한다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, 문헌[Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990))]에 기재되어 있다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소, 예컨대, 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스 조절 서열, 예컨대, 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다. 추가로 또한, 조절 요소는 상이한 공급원으로부터의 서열, 예컨대, SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 긴 말단 반복으로부터의 서열을 함유하는, SRα 프로모터 시스템으로 구성되었다(Takebe et al., (1988) Mol. Cell. Natl. Acad. Sci. 8:466-472). 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열 외에도, 본 개시의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기점) 및 선별 마커 유전자와 같은 추가 서열을 가질 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호; 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참조). 예를 들어, 전형적으로 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭을 갖는 dhfr-숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 네오 유전자(G418 선별을 위함)를 포함한다.
중쇄의 발현을 위해, 중쇄를 인코딩하는 발현 벡터(들)는 표준 기법에 의해 숙주 세포 내로 형질감염된다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는 데 일반적으로 사용되는 매우 다양한 기법, 예를 들어, 전기천공, 칼슘-인산염 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하는 것으로 하고자 한다. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 개시의 항체를 발현하는 것이 이론적으로 가능하지만, 진핵 세포, 및 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서 항체의 발현이 가장 바람직한데, 그 이유는 이러한 진핵 세포, 및 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다 적절히 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비할 가능성이 더 높기 때문이다.
본 개시의 재조합 항체를 발현하기 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포는차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들어, 문헌[R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선별 마커와 함께 사용되는, 문헌[Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr-CHO 세포를 포함함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위해, 또 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 제87/04462호, WO 제89/01036호 및 EP 제338,841호에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 인코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 항체는 숙주 세포에서 항체를 발현하게 하거나, 더욱 바람직하게는, 항체를 숙주 세포가 성장한 배양 배지 내로 분비하게 하는 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 적어도 하나의 다른 기능적 분자, 예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질(예를 들어, 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)에 연결되어 적어도 2 개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성하는 본 개시의 하나 이상의 항체를 포함하는 이중특이적 분자를 특징으로 한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "이중특이적 분자"는 3개 이상의 특이성을 갖는 분자를 포함한다.
일 구현예에서, 이중특이적 분자는, FcR 결합 특이성 및 항-TROP2 결합 특이성 외에, 제3 특이성을 갖는다.
추가의 또 다른 양태에서, 본 발명은 진단 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 조직에서 TROP2의 존재 및 발현을 결정하기 위해 사용된다. 일 구현예에서, 진단은 예후를 나타내고, 또는 치료 및/또는 후속 치료를 지시한다. 예를 들어, TROP2 신호 전달은 종양의 치료를 목표로 한다. 일 구현에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 TROP2 관련 종양 또는 암의 예후 및 적절한 치료 및 후속 치료를 결정하기 위한 진단 키트 또는 방법에 사용된다.
본 개시의 항체는 치료제, 세포독소 또는 방사성 표지와 접합되어 면역접합체를 형성할 수 있다. 세포독소는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 갖는 DT3C라는 재조합 단백질일 수 있다.
종양용해 바이러스는 암 세포를 우선적으로 감염시키고 사멸시킨다. 본 개시의 항체는 종양용해 바이러스와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 개시의 항체를 인코딩하는 종양용해 바이러스는 인간 신체에 도입될 수 있다.
또한 항-TROP2 VHH 단편을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 제공되고, 항-TROP2 VHH는 본원에 기재된 CDR 및 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
항-TROP2 CAR은 (a) 항-TROP2 VHH를 포함할 수 있는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다
CAR은 신생 수용체를 내형질 세망으로 유도하는 세포외 항원 결합 도메인의 N-말단에 신호 펩티드를 함유할 수 있고, 수용체가 결합에 더욱 이용 가능하게 만드는 세포외 항원 결합 도메인의 N-말단에 힌지 펩티드를 함유할 수 있다. CAR은 바람직하게는 세포내 신호전달 도메인에서 일차 세포내 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 주로 사용되며 가장 효과적인 일차 세포내 신호전달 도메인은 ITAM을 함유하는 CD3-제타 세포질 도메인이며, 이의 인산화는 T 세포 활성화를 초래한다. 공동-자극 신호 전달 도메인은 CD28, CD137 및 OX40과 같은 공동-자극 단백질로부터 유래될 수 있다
CAR은 T 세포 확장, 지속성, 및 항-종양 활성을 향상시키는 인자, 예컨대, 사이토카인 및 공동-자극 리간드를 더 부가할 수 있다.
또한, 본원에 제공된 CAR을 포함할 수 있는 조작된 면역 효과기 세포가 제공된다. 특정 구현예에서, 면역 효과기 세포는 T 세포, NK 세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 또는 배아 줄기 세포이다. 특정 구현예에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된 본 개시의 하나 이상의 항체(또는 이의 항원-결합 부분, 이중특이적 항체, CAR-T 세포, 종양용해 바이러스, 면역접합체, 또는 대안적으로 이를 발현할 수 있는 핵산 분자 또는 발현 벡터)를 포함할 수 있는 약학적 조성물을 제공한다. 항체(또는 이의 항원-결합 부분, 이중특이적 항체, CAR-T 세포, 종양용해 바이러스, 면역접합체, 또는 대안적으로 이를 발현할 수 있는 핵산 분자 또는 발현 벡터)는 조성물이 하나 이상의 항체(또는 이의 항원-결합 부분, 이중특이적 항체, CAR-T 세포, 종양용해 바이러스, 면역접합체, 또는 대안적으로 이를 발현할 수 있는 핵산 분자 또는 발현 벡터)를 함유할 때 개별적으로 투여될 수 있다. 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가 약학적 활성 성분, 예컨대, 또 다른 항체, 또는 약물, 예컨대, 항종양제를 함유할 수 있다.
약학적 조성물은 임의의 수의 부형제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 담체, 표면 활성제, 증점제 또는 에멀션화제, 고형 결합제, 분산 또는 현탁 보조제, 가용화제, 착색제, 향미제, 코팅제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 보존제, 등장제, 및 이들의 조합물을 포함한다. 적합한 부형제의 선택 및 사용은 개시가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)]에 교시되어 있다.
바람직하게는, 약학적 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 성분을 산의 작용 및 불활성화를 초래할 수 있는 기타 자연 조건으로부터 보호하는 물질로 코팅할 수 있다. 본원에서 사용되는 문구 "비경구 투여"는 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 일반적으로 주사에 의한 것을 의미하며, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 관절낭내(intracapsular), 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 기관경유, 피하, 표피하(subcuticular), 관절내, 관절낭하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 대안적으로, 본 개시의 항체는 비-비경구 경로, 예컨대, 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어, 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
약학적 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액의 형태일 수 있다. 이들은 또한 마이크로-에멀션, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다.
단일 투여형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상, 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이고, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 이 양은 활성 성분의 약 0.01% 내지 약 99%의 범위일 것이다.
투여량 요법은 최적의 요망되는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소하거나 증가할 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 투여 단위형은 치료될 대상체를 위한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 요망되는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 성분을 함유한다. 대안적으로, 항체는 서방형 제형으로 투여될 수 있고, 이러한 경우에 투여가 덜 빈번하게 필요하다.
조성물의 투여의 경우, 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg의 범위일 수 있다. 예시적인 치료 방법은 한 달에 한 번씩 투여하는 것이다.
본 개시의 항-TROP2 항체, 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 이중특이적 분자, CAR-T 세포, 종양용해 바이러스, 면역접합체의 "치료적 유효 투여량"은 바람직하게는 질환 증상의 중증도 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속 증가, 또는 질환 발병으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 초래한다. 예를 들어, 종양-보유 대상체의 치료를 위해, "치료적 유효 투여량"은 바람직하게는 비치료 대상체에 비해 적어도 약 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 40%, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 60%, 및 또한 더욱 바람직하게는 적어도 약 80%만큼 염증을 제거한다.
약학적 조성물은 임플란트, 경피 패치, 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형일 수 있다. 생분해성, 생체적합성 폴리머, 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 (1) 무니들 피하 주사 장치(예를 들어, 미국 특허 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호; 및 제4,596,556호); (2) 미세주입 펌프(미국 특허 제4,487,603호); (3) 경피 장치(미국 특허 제4,486,194호); (4) 주입 장치(미국 특허 제4,447,233호 및 제4,447,224호); 및 (5) 삼투 장치(미국 특허 제4,439,196호 및 제4,475,196호)와 같은 의료 장치를 통해 투여될 수 있고, 이의 개시는 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, 본 개시의 단클론성 항체는 생체내에서 적절한 분배를 보장하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 치료용 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 것을 보장하기 위해, 이들은 리포좀 내에서 제형화될 수 있는데, 이는 추가적으로 특정 세포 또는 기관으로의 선택적 수송을 향상시키기 위해 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 제5,416,016호; 및 제5,399,331호; 문헌[V. V. Ranade(1989) J. Clin.Pharmacol.29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al., (1995) FEBS Lett.357:140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; and Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조한다.
본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 이중특이적 분자, CAR-T 세포, 종양용해 바이러스, 면역접합체, 또는 대안적으로 이를 발현할 수 있는 핵산 분자 또는 벡터를 포함할 수 있는 약학적 조성물은, 예를 들어, 과도한 TROP2 신호 전달을 갖는 종양의 치료를 포함하는 수많은 시험관내 및 생체내 유용성을 갖는다.
TROP2가 종양 세포 증식과 관련이 있다는 점을 고려하여, 본 개시는 TROP2 관련 종양 또는 암을 치료하는 방법으로서, 본 개시의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있는, 방법을 제공한다. 종양은 유방암, 대장암, 위선암, 식도암, 간세포암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 난소상피암, 전립선암, 췌장관선암, 두경부암, 편평상피세포암, 신장세포암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 여포성 갑상선암, 다형성 교모세포종을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 고형 종양 또는 혈액 종양일 수 있다. 특정 구현에에서, 적어도 하나의 추가적인 항암 항체, 예컨대, 항-VISTA 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-LAG-3 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-STAT3 항체 및/또는 항-ROR1 항체가 추가로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 약학적 조성물이 대상체에서 종양 성장을 억제하는 데 효과적인 하나 이상의 추가 항체와 공동으로 투여되는 병용 요법의 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 약학적 조성물 및 하나 이상의 추가 항체, 예컨대, 항-OX40 항체, 항-TIM-3 항체, 항-CD137 항체, 항-GITR 항체, 항-LAG-3 항체, 항-PD-L1 항체 및 항-PD-1 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있는, 대상체에서 종양 성장을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. TROP2 경로 차단은 또한 표준 암 치료와 추가로 조합될 수 있다. 예를 들어, TROP2 경로 차단은 LAG-3 및/또는 PD-1 차단 및 또한 화학치료 요법과 조합될 수 있다. 예를 들어, 화학치료제를 항-TROP2 항체와 함께 투여할 수 있으며, 상기 화학치료제는 세포독성제일 수 있다. 예를 들어, 에피루비신, 옥살리플라틴 및 5-FU를 항-TROP2 요법을 받는 환자에게 투여한다. 선택적으로, 항-TROP2와 하나 이상의 추가 항체(예를 들어, 항-LAG-3 및/또는 항-PD-1 항체)의 조합은 면역원성 제제, 예컨대 암성 세포, 정제된 종양 항원(재조합 단백질, 펩티드 및 탄수화물 분자 포함), 및 면역 자극 사이토카인을 인코딩하는 유전자로 형질감염된 세포와 추가로 조합될 수 있다(He et al., (2004) J. Immunol. 173:4919-28). 사용될 수 있는 종양 백신의 비제한적 예는 흑색종 항원의 펩티드, 예컨대, gp100, MAGE 항원, Trp-2, MART1 및/또는 티로시나제, 또는 사이토카인 GM-CSF를 발현하도록 형질감염된 종양 세포의 펩티드를 포함한다. 항-TROP2 항체와 조합될 수 있는 다른 요법은 인터루킨-2(IL-2) 투여, 방사선, 수술 또는 호르몬 박탈을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 논의되는 치료제의 조합은 약학적으로 허용되는 담체에서 단일 조성물로서 동시에, 또는 약학적으로 허용되는 담체에서 각 작용제를 갖는 별개의 조성물로서 동시에 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조합되는 치료제는 순차적으로 투여될 수 있다.
또한, 병용 요법의 1회 초과의 용량이 순차적으로 투여되는 경우, 순차적 투여의 순서는 각 투여 시점에 역전되거나 동일한 순서로 유지될 수 있고, 순차적 투여는 동시 투여, 또는 이들의 임의의 조합과 조합될 수 있다.
본 개시는 이를 필요로 하는 대상체의 TROP2-양성 조직(예컨대, 암)의 영상화를 위한 방법으로서, 방사성으로 표지된 본 개시의 항-TROP2 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 추가로 제공한다. 이 방법은 식도 편평상피세포암, 대장암, 췌장암, 결장암, 유두상 갑상선암, 유방암 및 방광암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 TROP2 고발현 종양 또는 암의 분포를 추적/검출하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본 발명 및 그 이점에 대해 상술하였지만, 첨부된 청구항에 정의된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에서 다양한 변경, 치환 및 변형이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
본 개시는 하기 실시에에 의해 추가로 예시되며, 하기 실시예는 추가로 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 젠뱅크 서열, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 명백히 참조로 본원에 포함된다.
실시예
실시예 1 TROP2에 대한 단일 도메인 항체의 생성
라이브러리 구축 및 스크리닝
문헌[E Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998]에 기재된 바와 같은 방법에 따라 건강한 성체 낙타를 면역화시켰다. C-말단에 인간 IgG1 Fc가 있는 자체 제조한 재조합 인간 TROP2 단백질(SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산)을 면역원으로 사용하였다. 면역화 투여량은 일차 면역화의 경우 1.0 mg의 인간 TROP2-Fc 단백질/낙타/주사를 함유하였으며 부스트 면역화의 경우 0.5 mg 인간 TROP2-Fc 단백질/낙타/주사를 함유하였다. 면역 반응을 증가시키기 위해, 완전 프로이트 애주번트(complete Freud's adjuvant) 및 불완전 프로이트 애주번트(incomplete Freud's adjuvant)(Sigma, St. Louis, Mo., USA)를 각각 일차 면역화 및 부스트 면역화에 사용하였다. 5회 면역화 후, 100㎖ 낙타 말초혈액에서 림프구를 분리하고, FastPure 세포/조직 토탈 RNA 분리 키트(Vazyme, Cat#RC101)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 Hiscript III 1st Strand cDNA 합성 키트(+gDNA 와이퍼)(Vazyme, Cat#R312-01)를 사용하여 설명서에 따라 cDNA로 역전사시켰다. VHH를 인코딩하는 핵산 단편은 nested PCR로 증폭시켰다.
표적 VHH 핵산 단편은 엔도뉴클레아제 Pst 및 NotI(NEB)을 사용하여 파지 디스플레이 벡터 pMECS로 복제하였다. 그런 다음, 생산물을 대장균 수용성 세포 TG1(Lucigen Corporation)로 전기 변환시키고, TROP2에 대한 단일 도메인 항체에 대한 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하고 검증하였다. 연속 희석을 통해 라이브러리 능력은 약 2.0 x 108로 결정되었다. 라이브러리의 삽입률을 결정하기 위해 95개의 클론을 무작위로 선택하여 콜로니 PCR을 수행하였다. 결과는 89.5 % 이상의 삽입률을 보여주었다.
TROP2에 대한 단일 도메인 항체 패닝
인간 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 16으로 자체 제조)을 사용하여 파지 ELISA에서 인간 TROP2 단백질에 대한 항-TROP2 항체의 교차 반응을 측정하였다. TROP2에 특이적으로 결합하는 파지를 글리신(pH=2.2, 100 mM)으로 해리하고 대수 성장기의 대장균 TG1을 감염시켜 다음 라운드 스크리닝을 위해 정제된 파지를 생산하였다. 동일한 스크리닝을 2회 반복하였다.
파지 효소 면역 측정법(ELISA)을 통한 개별 양성 클론 선택
2회 패닝 후 수득한 TROP2 결합 양성 파지를 사용하여 블랭크 대장균을 감염시킨 후 플레이트에 분주하였다. 총 940개의 단일 콜로니를 선별하여 100 ㎍/㎖의 암피실린을 보충한 2YT 배지에 주입하였다. 박테리아 용액의 광학 밀도(OD)가 0.6-0.8이 되면 1M IPTG(QIAGEN, Cat#RT108-01)를 1000:1의 비율로 첨가하여 30°C에서 밤새 항체 발현을 유도하였다.
ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 탄산염/중탄산염 완충액(PH 9.6)에100 ㎕ 1 ㎍/㎖ 인간 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 16으로 자체 제조) 또는 1 ㎍/㎖ 시노몰구스 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 19로 자체 제조)로 코팅하고, 세척 완충액(PBS+0.05% v/v Tween-20, PBST)으로 1회 세척한 후, 37℃에서 2시간 동안 200 ㎕/웰의 차단 완충액(PBST 중 5% w/v 무지방 우유)으로 차단하였다. 플레이트를 4회 세척하고, 각각 100 ㎕ 세균 배양 상청액과 사시투주맙(벤치마크로 사용, 이하 BM 또는 BMI이라고도 함, SEQ ID NO: 17 및 18에 기재된 중쇄 및 경쇄 아미노 서열로 자체 제조)과 함께 PBST 중 5% w/v 무지방 우유 200 ㎍/㎖에 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 4회 세척하고, THE™ HA 태그 항체 [HRP], mAb, 마우스 항체(PBST에서 1:5000 희석, GenScript, Cat#A01296, 100 μl/웰, 본 개시의 세균 배양 상청액 플레이트용) 또는 퍼옥시다제 AffiniPure F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편(Cat#109-036-098, 벤치마크 플레이트용)와 함께 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 100 ㎕/웰 ELISA 기질 TMB(Innoreagents, Cat#S-002)와 함께 실온에서 인큐베이션하였다. 50 ㎕/웰의 1M H2SO4를 사용하여 3-10분 후에 반응을 중단하고, TMB의 경우 450 nm이고 참조 파장이 630 nm인 이중 파장 모드를 이용하여 마이크로 플레이트 리더에서 각 웰의 흡광도를 판독하였다. 검체 웰의 OD가 블랭크 웰의 OD보다 2 배 높았을 때 검체가 양성으로 결정될 수 있었다. 예시적인 상청액의 결과는 표 2에 나타나 있다.
[표 2] TROP2에 대한 클론의 결합 활성
Figure pct00003
양성 웰의 박테리아는 플라스미드 추출 및 후속 시퀀싱을 위해 100 ㎍/㎖의 암피실린을 보충한 LB 액체 배지로 옮겨 배양하였다.
각 클론에서 생산된 항체의 아미노산 서열을 서열 정렬 소프트웨어 Vector NTI에 따라 분석하여, 2개의 단일 도메인 항체를 최종적으로 수득하였으며, 이의 CDR과 VHH 서열은 표 1에 나열되어 있다.
실시예 2 TROP2에 대한 단일 도메인 항체의 예비 평가
VHH를 인코딩하는 뉴클레오티드를 각각 함유하는 벡터를 3 ㎍/㎖의 PEI와 함께 100 ㎖의 293F 현탁 세포 배양물에 일시적으로 형질감염시켰다. 단일 도메인 항체를 함유하는 세포 상청액을 진탕 플라스크에서 6일 후에 수확하고, 펠렛 세포로 회전한 후, 단백질 A 세파로스 컬럼(bestchrom (Shanghai) Biosciences, Cat#AA0273)을 통해 세포 상청액에서 단일 도메인 항체를 정제하였다. 간략히, PBS 완충액을 사용하여 5 내지 10 컬럼 부피로 컬럼을 세척하였다. 세포 상청액을 컬럼에 통과시킨 후, 단백질의 흡광도가 기준선에 도달할 때까지 PBS 완충액을 사용하여 컬럼을 세척하였다. 컬럼을 용리 완충액(0.1 M 글리신-HCl, pH 2.7)으로 용출하고, 즉시 중화 완충액(1 M Tris-HCl, pH 9.0)을 사용하여 1.5 ㎖ 튜브에 수집하였다. 단일 도메인 항체를 함유하는 분획을 풀링하고, 4℃에서 밤새 PBS 중에 투석하였다.
정제된 단일 도메인 항체는 하기 프로토콜에 따라 간접 ELISA, 에피토프 비닝, BIAcore 친화성 시험 및 세포-기반 내부화 검정을 수행하였다.
시노몰구스 TROP2 단백질에 대한 본 개시의 단일 도메인 항체의 교차 반응을 간접 ELISA에서 시험하였다. 간략히, 96웰 마이크로 플레이트를 4℃에서 밤새 탄산염/중탄산염 완충액(PH 9.6)에100 ㎕ 2 ㎍/㎖ 인간 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 16으로 자체 제조)로 코팅하였다. ELISA 플레이트를 세척 완충액(PBS+0.05% v/v Tween-20, PBST)으로 1회 세척한 후, 37℃에서 2시간 동안 200 ㎕/웰의 차단 완충액(PBST 중 5% w/v 무지방 우유)으로 차단하였다. 플레이트를 4회 세척하고 100 ㎕/웰의 연속 희석된 본 개시의 항-TROP2 항체 또는 대조군(66.7 nM에서 시작, PBST 중 2.5% w/v 무지방 우유로 5배 연속 희석)과 함께 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 4 회 세척하고, 퍼옥시다제 AffiniPure F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편(Jackson Immuno Research, Cat#109-036-098, PBST 완충액에서 1:5000 희석, 100 ㎕/웰)과 함께 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 100 ㎕/웰의 TMB(Innoreagents)와 함께 실온에서 인큐베이션하였다. 50 ㎕/웰의 1M H2SO4를 사용하여 실온에서 3-10분 후에 반응을 중단하고, TMB의 경우 450 nm이고 참조 파장이 630 nm인 이중 파장 모드를 이용하여 마이크로 플레이트 리더에서 각 웰의 흡광도를 판독하였다. OD(450-630) 값을 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, EC50 값을 보고하였다. 결과는 도 1에 나타나 있다.
Biacore T200 시스템(GE healthcare, Pittsburgh, PA, USA)에 의해 정제된 항-TROP2 마우스 단클론성 항체(mAb)를 결합 친화성 및 결합 동역학에 대하여 특징화하였다. 간략히, Biacore에 의해 제공되는 표준 아민 커플링 키트(GE healthcare, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 일차 아민을 통해 CM5 칩(카르복시 메틸 덱스트란 코팅된 칩, GE healthcare# BR100530)에 염소 항-인간 IgG(GE healthcare, Cat#BR100839,　인간 항체 포획 키트)를 공유 연결하였다. 칩(바이오센서) 표면 상의 미반응 모이어티를 에탄올아민으로 차단하였다. 본 개시의 항-TROP2 항체 및 2 ㎍/㎖ 농도의 벤치마크를 각각 10 ㎕/min의 유량으로 칩 상에 흘렸다. 이어서, 연속 희석된 인간 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 16으로 자체 제조) 또는 시노몰구스 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 19로 자체 제조)을160 nM에서 시작하여 HBS-EP+ 완충액(Biacore 제공)에서 2배 희석하여 30 ㎕/min의 유량으로 칩 상에 흘렸다. 항원-항체 결합 동역학을 2분 동안 추적하고, 해리 동역학을 10분 동안 추적하였다. 결합 및 해리 곡선을 BIAcore 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 Langmuir 결합 모델에 피팅시켰다. 결과는 표 3에 나타나 있다.
항-TROP2 항의 에피토프 결합을 경쟁 ELISA 검정에서 시험하였다. 간략히, 37℃에서 2시간 동안 PBS 중 1 ㎍/㎖ 벤치마크 100 ㎕로 96-웰 마이크로플레이트를 코팅하였다. ELISA 플레이트를 세척 완충액(PBS+0.05% v/v Tween-20, PBST)으로 1회 세척한 후, 37℃에서 2시간 동안 200 ㎕의 차단 완충액(PBST 중 5% w/v 무지방 우유)으로 차단하였다. 차단하는 동안, 본 개시의 항-TROP2 항체 또는 대조군을 비오틴 표지 인간 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 16, 2.5% w/v 무지방 우유 PBST 중 34 ng/㎖)로 희석하고(80 nM에서 시작하여 5배 연속 희석), 실온에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 4회 세척 후, 항체/TROP2-his 단백질 혼합물을 벤치마크 코팅 플레이트에 웰 당 100 ㎕씩 첨가하였다. 37℃에서 40분 동안 인큐베이션한 후 세척 완충액을 사용하여 플레이트를 다시 4회 세척하였다. 이어서, 플레이트에 100 ㎕의 퍼옥시다제 스트렙타비딘(PBST 완충액 중 1:10000 희석, Jackson Immunoresearch, Cat#016-030-084)을 첨가하여 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 세척 완충액을 사용하여 플레이트를 다시 세척하였다. 마지막으로, TMB를 첨가하고, 1M H2SO4를 사용하여 반응을 중단하였다. TMB의 경우 450 nm이고 참조 파장이 630 nm인 이중 파장 모드를 이용하여 마이크로플레이트 리더에서 각 웰의 흡광도를 판독하고, OD(450 내지 630) 값을 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, IC50 값을 보고하였다. 결과는 도 2에 나타나 있다.
세포 기반 내부화 분석을 위해, 세포막 상에서 전장 인간 TROP2(uniprot#P09758, SEQ ID NO: 20)를 안정적으로 발현하는 Biosion 자체 제조 293F-TROP2 세포(클론 ID#3A8)를 사용하여 항-TROP2 항체의 내부화 효율을 정확하게 평가하였다. 293F-TROP2 세포는 293F 세포(Thermofisher Inc., Cat# 11625019)를 EcoR I 및 XbaI 부위 사이에 TROP2 코딩 서열이 삽입된 pCMV-T-P 플라스미드로 리포펙타민 3000 형질감염 시약(Thermo Fisher)의 지침에 따라 형질감염시킴으로써 제조하였다. 먼저, 10% v/v FBS(Gibco, Cat#10099-141)을 보충한 100 ㎕ FreeStyle293 배지(Gibco, Cat#12338-018)에서 5 x l03의 293F-TROP2 세포를 바닥이 평평한 96웰 플레이트(Thermo Fisher Scientific Inc., Cat#167008)에 분주하였다. 세포 시딩 다음날, 10% v/v FBS가 첨가된 FreeStyle293 배지에서 본 개시의 항-TROP2 항체 또는 대조군 1.6 ㎍/㎖을 SEQ ID NO: 22에 기재된 아미노산 서열을 사용하여 합성한 재조합 단백질 DTTP1170 1.6 ㎍/㎖(10% v/v FBS가 첨가된 FreeStyle293 배지에서)과 1:1 부피비로 혼합하여 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양 배지에서 0.8 ㎍/㎖에서 시작하여 3배 연속 희석하였다. 이어서, 연속 희석된 항체//DTTP1170 혼합물 100 ㎕를 세포 플레이트에 첨가하여 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트에 Cell Titer Glo 시약(Vazyme Biotech Co., Ltd, Cat#DD1101-02)을 첨가하여 실온에서 3-5분 동안 인큐베이션하였다. 그런 후, 세포 배양 플레이트를 Tecan infinite 200Pro 플레이트-리더로 분석하였다. Graphpad prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 IC50 값을 보고하였다. 세포 생존율에 대한 최대 50%의 억제를 달성한 항체 농도로 보고하였다. 결과는 도 3에 나타나 있다. mAb-DTTP 접합체가 표적 세포에 의해 내부화되었을 때 표적 세포 생존율은 현저하게 감소하였다. 접합체가 내부화되지 않은 경우, 배지 내의 유리 DTTP1170에서 세포 살상 활성이 없거나 거의 없었다.
[표 3] 단일 도메인 항체의 결합 친화성
Figure pct00004
본 개시의 단일 도메인 항체가 벤치마크보다 더 높은 결합 친화성으로 인간 TROP2에 특이적으로 결합하였으며, 비슷한 결합 친화성으로 시노몰구스 원숭이 TROP2에 특이적으로 결합했다는 것을 표 3으로부터 알 수 있다.
도 1에 나타난 바와 같이, 본 개시의 단일 도메인 항체가 벤치마크와 비교하여 유사한 Bmax 및 약간 더 낮은 EC50으로 인간 TROP2 단백질에 특이적으로 결합하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 개시의 단일 도메인 항체는 인간 TROP2-벤치마크 결합을 차단할 수 있었으며, 이는 동일하거나 유사한 에피토프에 결합한다는 것을 시사한다.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 본 개시의 단일 도메인 항체의 DT3C 접합체는 벤치마크-DT3C 접합체보다 더욱 효과적으로 표적 세포의 사멸을 유발하였다.
실시예 3 단일 도메인 항체 01-9F의 유전자 조작
01-9F 단일 도메인 항체(VHH)를 인간 IgG1 Fc 영역(SEQ ID NO: 14로 자체 제조)에 프레임내에서 클로닝하였고, 여기서 VHH의 C-말단은 Fc 영역의 N-말단에 연결되었다.
인간 IgG1-Fc 영역에 연결된 VHH를 인코딩하는 뉴클레오티드를 각각 함유하는 벡터를 3 ㎍/㎖의 PEI와 함께 100 ㎖의 293F 현탁 세포 배양물에 일시적으로 인큐베이션하였다. 중쇄 전용 항체(VHH-Fc)를 함유하는 세포 상청액을 진탕 플라스크에서 6일 후에 수확하고, 펠렛 세포로 회전한 후, 수득한 중쇄 전용 항체(본원에서 01-9F-Fc라고도 함)를 상술된 바와 같이 세포 상청액에서 정제하였다.
항체의 생산, 안정성, 안전성 및/또는 효능에 부정적인 영향을 미칠 수 있는, 예를 들어, CDR 영역에서 특정 아미노산 잔기의 이성질화와 같은 번역 후 변형을 피하거나 감소시키기 위해, 단일 도메인 항체 01-9F를 CDR2 또는 CDR3 영역에서 추가 변형시켜 총 11개의 변형된 변이체, 즉, 01-9F-CDR-V1에서 01-9F-CDR-V11까지를 수득하였으며, 이의 CDR 및 VHH 서열 ID 번호는 표 1에 나열되어 있다.
인간 IgG1 중쇄 불변 영역(SEQ ID NO: 14)에 연결된 01-9F-CDR-V1에서 01-9F-CDR-V11 중 하나의 VHH를 인코딩하는 뉴클레오티드를 각각 함유하는 벡터를 3 ㎍/㎖ PEI와 함께 100 ㎖의 293F 현탁 세포 배양물에 일시적으로 형질감염시켰다.
실시예 4 01-9F-Fc 변이체의 특징화
중쇄 전용 항체(01-9F-Fc variants), 즉, 01-9F-CDR-V1-Fc 내지 01-9F-CDR-V11-Fc를 함유하는 세포 상청액을 진탕 플라스크에서 6일 후에 수확하고, 펠렛 세포로 회전한 후, 하기의 수정된 상기 실시예의 프로토콜에 따라 BIAcore 친화성 시험 및 세포-기반 내부화 검정에서 시험하였다.
BIAcore 시험의 경우, 01-9F-Fc 변이체를 함유하는 세포 상청액을 각각 10 ㎕/min의 유량으로 정제된 항-TROP2 항체 대신 칩 상에 흘렸으며, HBS-EP+ 완충액(Biacore 제공)의 40 nM 인간 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 16으로 자체 제조)을 연속 희석된 인간 TROP2-his 단백질 대신 30 ㎕/min의 유량으로 칩 상에 흘렸다. KD, Ka 및 Kd 값을 결정하고 하기 표 4에 요약하였다.
세포 기반 내부화 검정에서, DT3C를 사용하여 중쇄 전용 항체를 접합시키고, 자체 제조 항-CD22 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 간략히, 10% v/v FBS(Gibco, Cat#10099-141)을 보충한 100 ㎕ FreeStyle293 배지(Gibco, Cat#12338-018)에서 1.5 x l03의 293F-TROP2 세포를 바닥이 평평한 96웰 플레이트(Thermo Fisher Scientific Inc., Cat#167008)에 분주하였다. 10% v/v FBS가 첨가된 FreeStyle293 배지의 01-9F-Fc 변이체 또는 대조군 40 nM을 10% v/v FBS가 첨가된 FreeStyle293 배지의 DT3C 단백질 40 nM과 1:1 부피비로 혼합하여 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양 배지에서 20 nM에서 시작하여 3배 연속 희석하였다. 결과는 도 4에 나타나 있다.
[표 4] 01-9F-Fc 변이체의 결합 친화성
Figure pct00005
본 개시의 01-9F-CDR-Fc 변이체가 01-9F 및 01-9F-Fc와 비슷한 결합 친화성으로 인간 TROP2에 특이적으로 결합했다는 것을 표 4로부터 알 수 있다.
도 4에 따르면, 01-9F-CDR-V5-Fc, 01-9F-CDR-V9-Fc 및 01-9F-CDR-V11-Fc을 포함하는 01-9F-Fc 변이체의 DT3C 접합체는 벤치마크-DT3C 접합체보다 더욱 효과적으로 표적 세포의 사멸을 유발하였다.
실시예 5 01-9F-CDR-V11의 인간화
변이체 01-9F-CDR-V11-Fc를 정제하고 인간화하여 총 24개의 예시적인 인간화 항체, 즉, 01-9F-CDR-V11-V1-Fc에서 01-9F-CDR-V11-V24-Fc까지를 수득하였으며, 이의 VHH 서열 ID 번호는 표 1에 나열되어 있다.
인간 IgG1 중쇄 불변 영역(SEQ ID NO: 14)에 연결된 01-9F-CDR-V11-V1에서 01-9F-CDR-V11-V24 중 하나의 VHH를 인코딩하는 뉴클레오티드를 각각 함유하는 벡터를 3 ㎍/㎖ PEI와 함께 100 ㎖의 293F 현탁 세포 배양물에 일시적으로 형질감염시켰다.
실시예 6 예시적인 인간화 01-9F-CDR-V11 항체의 특징화
인간화 01-9F-CDR-V11 항체를 함유하는 세포 상청액을 진탕 플라스크에서 6일 후에 수확하고, 펠렛 세포로 회전한 후, 하기의 수정된 상기 실시예의 프로토콜에 따라 BiAcore T200 시스템(GE healthcare, Pittsburgh, PA, USA)을 통해 인간 TROP2에 대한 결합 친화성을 시험하였다.
BIAcore 시험의 경우, 인간화 01-9F-CDR-V11 항체를 함유하는 세포 상청액을 각각 10 ㎕/min의 유량으로 칩 상에 흘렸으며, HBS-EP+ 완충액(Biacore 제공)의 40 nM 인간 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 16으로 자체 제조)을 30 ㎕/min의 유량으로 칩 상에 흘렸다. KD, Ka 및 Kd 값을 결정하고 하기 표 5에 요약하였다.
[표 5] 인간화 01-9F-CDR-V11 항체의 결합 친화성
Figure pct00006
인간화 01-9F-CDR-V11 항체는 높은 인간 TROP2 결합 친화성을 가지며, 01-9F-CDR-V11-V1, 01-9F-CDR-V11-V9 및 01-9F-CDR-V11-V11가 가장 높은 결합 친화성을 가진다는 것을 표 5로부터 알 수 있다.
실시예 7 예시적 인간화 01-9F-CDR-V11 항체의 추가 특징화
인간화 항체 01-9F-CDR-V11-V1-Fc, 01-9F-CDR-V11-V9-Fc 및 01-9F-CDR-V11-V11-Fc를 상술된 바와 같이 정제하여, 하기의 수정된 상기 실시예의 프로토콜에 따라 세포 기반 내부화 검정에서 시험하였다.
세포 기반 내부화 검정에서, DT3C를 사용하여 이 항체들을 접합시키고, 자체 제조 항-CD22 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 간략히, 10% v/v FBS(Gibco, Cat#10099-141)을 보충한 100 ㎕ FreeStyle293 배지(Gibco, Cat#12338-018)에서 1.5 x l03의 293F-TROP2 세포(클론 ID#3A8)를 바닥이 평평한 96웰 플레이트(Thermo Fisher Scientific Inc., Cat#167008)에 분주하였다. 10% v/v FBS가 첨가된 FreeStyle293 배지의 인간화 항체 또는 대조군 40 nM을 10% v/v FBS가 첨가된 FreeStyle293 배지의 DT3C 단백질 40 nM과 1:1 부피비로 혼합하여 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양 배지에서 20 nM에서 시작하여 3배 연속 희석하였다. 결과는 도 5에 나타나 있다.
도 5에 따르면, 01-9F-CDR-V11-V1-Fc, 01-9F-CDR-V11-V9-Fc 및 01-9F-CDR-V11-V11-Fc을 포함하는 인간화 01-9F-CDR-V11 항체의 DT3C 접합체는 벤치마크-DT3C 접합체와 유사한 비율로 표적 세포의 사멸을 유발하였다.
인간화 항체 01-9F-CDR-V11-V11-Fc를 수정된 또는 수정되지 않은 상기 실시예의 프로토콜 및 하기 프로토콜에 따라 Biacore, 포획 ELISA, 간접 ELISA, 세포-기반 결합 FACS, 경쟁 ELISA 및 단백질 열 이동 검정에서 추가로 시험하였다.
BIAcore 시험 결과를 하기 표 6에 요약하였다.
포획 ELISA의 경우, 96-웰 플레이트를 4℃에서 밤새 PBS 중 2 ㎍/㎖의 AffiniPure F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편 (Jackson Immuno Research, Cat#109-006-008) 100 ㎕로 코팅하였다. 플레이트를 세척 완충액(PBS+0.05% v/v Tween-20, PBST)으로 1회 세척한 후, 37℃에서 2시간 동안 200 ㎕/웰의 차단 완충액(PBST 중 5% w/v 무지방 우유)으로 차단하였다. 플레이트를 4회 세척하고, 각각 100 ㎕의 연속 희석된 본 개시의 항-TROP2 항체, 벤치마크 또는 음성 대조군 hIgG(정맥 주사용 인간 면역글로불린(pH 4), Hualan Biological Engineering Inc.)(66.7 nM에서 시작하여 PBST 중 2.5% w/v 무지방 우유로 5배 연속 희석)와 37℃에서 40분 동안 인큐베이션한 후, 다시 4회 세척하였다. 포획된 항-TROP2 항체를 함유하는 플레이트를 비오틴-표지 인간 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 16으로 자체 제조, PBST 중 2.5% w/v 무지방 우유 110 ng/㎖, 100 ㎕/웰)과 함께 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하고, 4회 세척하고, 스트렙타비딘 접합 HRP(PBST 중 1:10000 희석, Jackson Immuno Research, Cat#016-030-084, 100 ㎕/웰)와 함께 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 100 ㎕/웰 ELISA 기질 TMB(Innoreagents, Cat#S-002)와 함께 실온에서 인큐베이션하였다. 50 ㎕/웰의 1M H2SO4를 사용하여 실온에서 3-10분 후에 반응을 중단하고, TMB의 경우 450 nm이고 참조 파장이 630 nm인 이중 파장 모드를 이용하여 마이크로 플레이트 리더에서 각 웰의 흡광도를 판독하였다. OD(450-630) 값을 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, EC50 값을 보고하였다. 결과는 도 6에 나타나 있다.
간접 ELISA의 경우, AffiniPure 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편(Jackson Immunoresearch, Cat#109-005-098) 100 ㎕/웰을 사용하였다. 결과는 도 7 및 도 8에 나타나 있다.
세포-기반 결합 FACS에서, 293F-TROP2 세포를 세포 배양 플라스크로부터 수확하고, 2회 세척하고, 2% v/v 소 태아 혈청(FACS 완충액)을 함유하는 인산염 완충액(PBS)에 재현탁하였다. 이어서, 96 웰-플레이트에서 웰 당 2 x 105 293F-TROP2 세포를 FACS 완충액에서 다양한 농도(66.7 nM에서 시작하여 4배 연속 희석)의 항-TROP2 항체 또는 대조군 100 ㎕와 함께 얼음 위에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 100 ㎕/웰 R-피코에리트린 AffiniPure 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편(FACS 완충액에 1:1000 희석, Jackson Immunoresearch, Cat#109-115-098)을 첨가하였다. 암소에서 4℃에서 40분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 2회 세척하고, FACS 완충액에 재현탁하였다. 형광을 Becton Dickinson FACS Canto II-HTS 장비를 사용하여 측정하고, MFI(평균 형광 강도)를 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, EC50 값을 보고하였다. 결과는 도 9에 나타나 있다.
에피토프 비닝의 경우, 2 ㎍/㎖ 벤치마크 100 ㎕/웰을 사용하였다. 인간화 항체 01-9F-CDR-V11-V11 또는 대조군을 비오틴 표지 인간 TROP2-his 단백질(SEQ ID NO: 16, 2.5% w/v 무지방 우유 PBST 중 8.7 ng/㎖)로 희석하고(66.7 nM에서 시작하여 5배 연속 희석), 실온에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 결과는 도 10에 나타나 있다.
열 이동 검정의 경우, Protein Thermal ShiftTM 염료 키트(Thermo Fisher, Cat# 4461146)를 사용하여 Tm(용융 온도)을 결정하였다. 간략히, GloMelt™ 염료가 해동되고 실온에 도달하도록 하였다. 염료가 들어 있는 바이알을 볼텍싱하고 원심분리하였다. 이어서, 5 ㎕의 200x 염료를 95 ㎕의 PBS에 첨가함으로써 10x 염료를 제조하였다. 2 ㎕의 10x 염료 및 10 ㎍의 인간화 항체를 첨가하고, 총 반응 부피가 20 ㎕가 되도록 PBS를 첨가하였다. 염료 및 항체가 들어 있는 튜브를 잠시 회전시키고 CFX Connect 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad, Cat#1855201)에 배치하였다. 결과는 도 11a 내지 도 11c에 나타나 있다.
[표 6] 01-9F-CDR-V11-V11-Fc의 결합 친화성
Figure pct00007
표 6에 따르면, 01-9F-CDR-V11-V11-Fc는 01-9F 및 01-9F-CDR-V11-Fc와 비슷하고 벤치마크보다 약간 더 높은 인간 및 시노몰구스 TROP2에 대한 결합 친화성을 보여주었다. 도 6 내지 도 9는 01-9F-CDR-V11-V11-Fc가 벤치마크보다 인간 및 원숭이 TROP2에 대한 결합 활성이 더 높다는 것을 보여주었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 01-9F-Fc-CDRV11-V11은 BM1-TROP2 결합을 차단할 수 있었으며, 이는 BM1과 유사한 에피토프에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
또한, 도 11a 내지 도 11c에 나타난 바와 같이, 용융 온도에서 항체 01-9F, 01-9F-CDR-V11-Fc 및 01-9F- CDR-V11-V11-Fc는 아마도 인간 체내에서 안정적이었을 것이다.
본 개시는 하나 이상의 구현예와 연관되어 상술되었지만, 본 개시는 이들 구현예로 제한되지 않고, 본 설명은 첨부된 청구항의 사상 및 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형, 및 등가물을 포괄하는 것으로 하고자 함이 이해되어야 한다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 추가로 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 출원의 서열은 하기에서 요약된다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
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본 발명의 바람직한 구현예가 이와 같이 상세히 기술되었지만, 상기 단락에 의해 정의된 발명은, 이의 다수의 분명한 변동이 본 발명의 사상 또는 범위로부터 벗어남 없이 가능함에 따라 상기 설명에 기재된 특정 세부 사항으로 제한되지 않아야 함이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Biosion Inc. <120> NANOBODIES BINDING TROP2 AND USES THEREOF <130> 55532 00042 <150> CN202011209105.X <151> 2020-11-03 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH CDR1 for 01-9F, 01-9F-CDR-V1 to 01-9F-CDR-V11, 01-9F-CDR-V11-V1 to 01-9F-CDR-V11-V24 <400> 1 Arg Tyr Cys Val Ala 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH CDR2 for 01-9F and 01-5A antibodies <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Gly or Ala <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be Ser or Thr <400> 2 Arg Ile Leu Ser Xaa Xaa Thr Thr Ser Tyr Ser Xaa Xaa Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH CDR3 for 01-9F and 01-5A antibodies <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be Asp, Glu 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tgaagggctt ctacccctct 480 gacattgctg tggagtggga gagcaatggg cagcctgaga acaactacaa gaccaccccc 540 cctgtgctgg actctgatgg cagcttcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagagc 600 agatggcagc aaggcaatgt gttcagctgc tctgtgatgc atgaggccct gcacaaccac 660 tacacacaga agagcctgag cctgagccct ggcaagtga 699

Claims (15)

  1. CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 영역(여기서, CDR1 영역, CDR2 영역, 및 CDR3 영역은 (1) 각각 SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=G, X3=D, X4=S) 및 3(X1=D, X2=G); 각각 (2) SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=G, X3=D, X4=S) 및 3(X1=E, X2=G); 각각 (3) SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=G, X3=D, X4=S) 및 3(X1=D, X2=A); 각각 (4) SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=G, X3=D, X4=S) 및 3(X1=I, X2=G); 각각 (5) SEQ ID NO: 1, 2(X1=E, X2=G, X3=D, X4=S) 및 3(X1=E, X2=G); 각각 (6) SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=A, X3=D, X4=S) 및 3(X1=E, X2=G); 각각 (7) SEQ ID NO: 1, 2(X1=E, X2=G, X3=D, X4=S) 및 3(X1=D, X2=A); 각각 (8) SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=A, X3=D, X4=S) 및 3(X1=D, X2=A); 각각 (9) SEQ ID NO: 1, 2(X1=E, X2=G, X3=E, X4=S) 및 3(X1=E, X2=G); 각각 (10) SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=A, X3=E, X4=S) 및 3(X1=E, X2=G); 각각 (11) SEQ ID NO: 1, 2(X1=E, X2=G, X3=D, X4=T) 및 3(X1=D, X2=A); 각각 (12) SEQ ID NO: 1, 2(X1=D, X2=A, X3=D, X4=T) 및 3(X1=D, X2=A)과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있음)을 갖는, TROP2에 결합하는 중쇄 전용 항체, 또는 이의 항원-결합 부분.
  2. 제1항에 있어서, 가변 영역은 SEQ ID NO: 4(X1=S, X2=Q, X3=D, X4=G, X5=P; X1=S, X2=Q, X3=E, X4=G, X5=P; X1=S, X2=Q, X3=D, X4=A, X5=P; X1=S, X2=Q, X3=I, X4=G, X5=P; 또는 X1=T, X2=G, X3=D, X4=G, X5=L), 5(X1=E, X2=G, X3=D; X1=D, X2=A, X3=D; X1=E, X2=G, X3=E; 또는 X1=D, X2=A, X3=E); 6(X1=E, X2=G, X3=S; X1=D, X2=A, X3=S; X1=E, X2=G, X3=T; 또는 X1=D, X2=A, X3=T), 7, 8(X1=F, X2=Y, X3=K, X4=A; X1=L, X2=F, X3=K, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=R, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=K, X4=R; 또는 X1=L, X2=Y, X3=K, X4=A), 9(X1=F, X2=Y, X3=K, X4=A; X1=L, X2=F, X3=K, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=R, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=K, X4=R; 또는 X1=L, X2=Y, X3=K, X4=A), 10(X1=F, X2=Y, X3=K, X4=A; X1=L, X2=F, X3=K, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=R, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=K, X4=R; 또는 X1=L, X2=Y, X3=K, X4=A); 11(X1=F, X2=Y, X3=K, X4=A; X1=L, X2=F, X3=K, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=R, X4=A; X1=L, X2=Y, X3=K, X4=R; 또는 X1=L, X2=Y, X3=K, X4=A), 12 또는 13(X1=V, X2=W; 또는 X1=F, X2=G)과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  3. 제1항에 있어서, 가변 영역에 연결된, SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 불변 영역을 포함하는 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  4. 제1항에 있어서, (a) 인간 TROP2에 결합하고; (b) 원숭이 TROP2에 결합하고;/하거나 (c) TROP2+에 의해 내부화되는 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  5. 제1항에 있어서, 카멜리드, 키메라 또는 인간화된 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  6. 제1항에 있어서, 독소 또는 방사성 동위원소에 연결된 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는, 면역접합체.
  7. 제6항에 있어서, 독소는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 단백질인 면역접합체.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 제6항 또는 제7항의 면역접합체를 인코딩하는, 핵산 분자.
  9. 제8항의 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터.
  10. 제9항의 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 제6항 또는 제7항의 면역접합체, 제8항의 핵산 분자, 제9항의 발현 벡터 또는 제10항의 숙주 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 항종양제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  13. TROP2와 관련된 질환을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 제11항 또는 제12항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 질환은 유방암, 대장암, 위선암, 식도암, 간세포암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 난소상피암, 전립선암, 췌장관선암, 두경부암, 편평상피세포암, 신장세포암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 여포성 갑상선암, 다형성 교모세포종인, 방법
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 중쇄 전용 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 방사성으로 표지하여 대상체에서 암을 영상화하는, 방법.
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