JP7440724B2 - Ｃｔｌａ４に結合する抗体及びその使用 - Google Patents

Description

関連出願及び援用
本出願は、２０２０年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／００８，９３１号に対する優先権を主張するものである。

上記の出願、及びその中に又はその審査手続中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）及び本明細書に引用又は参照される全ての文献（本明細書に引用される全ての文献、特許、公開特許出願を含むがこれらに限定されない）（「本明細書に引用される文献」）、及び本明細書に引用される文献に引用又は参照される全ての文献は、本明細書又は参照により本明細書に援用されるあらゆる文献に記載されるあらゆる製品についてのあらゆる製造業者の説明書、記載、製品仕様書、及び製品シートと一緒に、参照により本明細書に援用され、本発明の実施に用いられ得る。より詳細には、全ての参照される文献は、各個々の文献が、具体的に及び個別に、参照により援用されることが示されるのと同程度に、参照により援用される。本開示に記載されるあらゆるＧｅｎｂａｎｋ配列は、本開示の最先の有効出願日のものであるＧｅｎｂａｎｋ配列とともに、参照により援用される。

本開示は、一般に、高い親和性及び機能性でヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体、特に、マウス、キメラ又はヒト化モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分に関する。抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞及び抗体又はその抗原結合部分を発現するための方法も提供される。本開示はさらに、免疫抱合体、二重特異性分子、キメラ抗原受容体、腫瘍溶解性ウイルス、及び抗体又はその抗原結合部分を含む医薬組成物、並びに本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合部分を用いた診断又は治療方法を提供する。

免疫チェックポイントは、免疫系をレギュレートして系が無差別に細胞を攻撃するのを予防する。免疫チェックポイントのうち、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）及びプログラム死１（ＰＤ－１）は、２つの重要なチェックポイントであり、免疫反応時に阻害性シグナルを提供する。例えば、ＣＴＬＡ４は、ネイティブＴ細胞活性化の初期段階で自己反応性Ｔ細胞を停止する可能性があると報告されており、ＰＤ－１は、より後の段階で活性化Ｔ細胞をレギュレートすることが分かっている。これらの２つの阻害性免疫チェックポイント経路はまた、免疫系の攻撃を回避するために腫瘍細胞によって操作される（Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ ＥＩ，ａｎｄ Ｄｅｓａｉ Ａ．（２０１６）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．３９（１）：９８－１０６）。

ＣＴＬＡ４は、ＣＤ２８ホモログであり、主に休止ナイーブＴ細胞の細胞内区画に位置する。それは、ＣＤ８０／ＣＤ８６上でＣＤ２８と競合してかなり高い結合親和性でＣＤ８０／ＣＤ８６に結合する（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ＣＡ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：５６５－５９４）。ＣＤ２８－ＣＤ８０／ＣＤ８６相互作用は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に提示された抗原へのＴＣＲの結合後のＴ細胞活性化に重要であり、十分なＣＤ２８－ＣＤ８０／ＣＤ８６結合レベルは、Ｔ細胞の増殖、生存及び分化をもたらす（Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ ＥＩ，ａｎｄ Ｄｅｓａｉ Ａ．（２０１６）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．３９（１）：９８－１０６）。ＣＴＬＡ４は、ＴＣＲ－ＴＣＲ及びＣＤ２８－ＣＤ８０／８６相互作用からの刺激性シグナルが存在するときに細胞表面に移行し（Ｌｉｎｓｌｅｙ ＰＳ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．４：５３５－５４３）、ＣＤ８０／ＣＤ８６へのＣＴＬＡ４の結合は、刺激性シグナルを生成しないか、又はさらにはＴＣＲ－ＴＣＲ及びＣＤ２８－ＣＤ８０／８６結合からの刺激性シグナルを打ち消す阻害性シグナルを発生する（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ＣＡ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：５６５－５９４；Ｅｇｅｎ ＪＧ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：６１１－６１８；Ｐａｒｒｙ ＲＶ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５：９５４３－９５５３；Ｆａｌｌａｒｉｎｏ Ｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８８：２０５－２１０；Ｍａｓｔｅｌｌｅｒ ＥＬ ｅｔ ａｌ．，（２０００）１６４：５３１９－５３２７）。したがって、ＣＤ２８－ＣＤ８０／８６結合とＣＴＬＡ４－ＣＤ８０／８６結合との相対量は、Ｔ細胞が活性化を起こすか又はアネルギーを起こすかを決定する（Ｋｒｕｍｍｅｌ ＭＦ，ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ ＪＰ．（１９９５）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８２：４５９－４６５）。ＣＴＬＡ４は、その他、ＣＤ８０／ＣＤ８６を介してリバースシグナル伝達を引き起こしてインドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼを誘導することによって、トリプトファン異化及びＴ細胞増殖阻害をもたらし得る（Ｂｏａｓｓｏ Ａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：１５７４－１５８１）。

ＣＴＬＡ－４はまた、正常細胞又は新生物細胞のどちらでも非Ｔ細胞上に発現される（Ｌａｕｒｅｎｔ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７１：９３４－９４１；Ｃｏｎｔａｒｄｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１７：５３８－５５０）。新生物細胞での持続的ＣＴＬＡ－４発現は、血液学的及び固形腫瘍進行に寄与し（Ｐｉｓｔｉｌｌｏ ＭＰ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０１：２０２－２０９；Ｋｏｓｍａｃｚｅｗｓｋａ Ａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １９：３０１－３０４）、ＣＴＬＡ４経路ブロッケードは、腫瘍増殖を減少させるのに有効であることが分かっている（Ｌｅａｃｈ ＤＲ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）２７１：１７３４－１７３６；Ｈｉｒａｎｏ Ｆ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：１０８９－１０９６）。抗ＣＴＬＡ４抗体イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））は、黒色腫、結腸直腸癌、肝細胞癌、悪性胸膜中皮腫、非小細胞肺癌及び腎細胞癌を治療することが承認されている。別の抗ＣＴＬＡ４抗体トレメリムマブは、例えば、中皮腫、黒色腫及び結腸直腸癌の治療用として、臨床試験段階にある。ＣＴＬＡ－４抗体はまた、抗ＰＤ－１抗体及び／又は他の抗腫瘍剤との組合せで使用されてきた。例えば、同様に抗ＣＴＬＡ－４抗体のＡＧＥＮ１８８４は、子宮頸癌、血管肉腫、筋肉浸潤性膀胱癌及び軟組織肉腫（滑膜肉腫、神経鞘腫及び葉状腫瘍を含む）を治療するために抗ＰＤ－１抗体との組合せで臨床試験された（国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））。

ＣＴＬＡ－４は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などによる慢性感染症で上方制御されることが研究によってさらに示されており、抗ＣＴＬＡ－４療法単独又は抗ＰＤ－１との併用は、臨床試験でＨＩＶ持続を撹乱することが分かっている（Ｔｈｏｍａｓ Ａ Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０２１）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｃｉａａ１５３０；Ｃｏｌｓｔｏｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １３（６）：ｅ０１９８１５８）。また、イピリムマブ及びニボルマブは、エプスタイン・バーウイルス（ＨＨＶ－４）感染症の治療用として第ＩＩ相試験段階にある。さらに、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、末梢神経傷害及び神経線維腫症Ｉ型（フォンレックリングハウゼン病）に及ぼすイピリムマブの影響が、前臨床試験によって探究されている。

継続的努力によって、より効力のある又はより望ましい特性を有するより多くの抗ＣＴＬＡ４結合部分を見いだすことが試みられている。

本発明におけるあらゆる文献の引用又は特定は、このような文献が本開示の先行技術として利用可能であることを認めるものではない。

本開示は、ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４及びサルＣＴＬＡ４）に結合する、且つイピリムマブなどの先行技術の抗ＣＴＬＡ４抗体と比較して、ＣＴＬＡ４に対してより高くないとしても同等の結合親和性、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０／ＣＤ８６相互作用に対してより高くないとしても同等の遮断活性及びＴ細胞応答を促進する同等の活性を有する、単離モノクローナル抗体、例えば、マウス、ヒト、キメラ、若しくはヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。

本開示の抗体又は抗原結合部分は、ＣＴＬＡ４タンパク質の検出並びに癌や感染性疾患などのＣＴＬＡ４関連疾患の治療及び予防をはじめとする様々な用途に使用可能である。

したがって、一態様において、本開示は、ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域及びＶＨ ＣＤＲ３領域を含み得る重鎖可変領域であって、ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域及びＶＨ ＣＤＲ３領域が、（１）配列番号１、２及び３のそれぞれ；（２）配列番号７、８及び９のそれぞれ；（３）配列番号１、２及び１３のそれぞれ；（４）配列番号１６、１７及び１８のそれぞれ；（５）配列番号２２、２３及び２４のそれぞれ；（６）配列番号２８、２９及び３０のそれぞれ；（７）配列番号２２、３４及び２４のそれぞれ；（８）配列番号３６、３７及び３８のそれぞれ；（９）配列番号４２、４３及び４４のそれぞれ；若しくは（１０）配列番号４８、４９及び５０のそれぞれに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得る、重鎖可変領域；並びに／又はｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域及びＶＬ ＣＤＲ３領域を含み得る軽鎖可変領域であって、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域及びＶＬ ＣＤＲ３領域が、（１）配列番号４、５及び６のそれぞれ；（２）配列番号１０、１１及び１２のそれぞれ；（３）配列番号１４、５及び１５のそれぞれ；（４）配列番号１９、２０及び２１のそれぞれ；（５）配列番号２５、２６及び２７のそれぞれ；（６）配列番号３１、３２及び３３のそれぞれ；（７）配列番号３５、２６及び２７のそれぞれ；（８）配列番号３９、４０及び４１のそれぞれ；（９）配列番号４５、４６及び４７のそれぞれ；若しくは（１０）配列番号５１、５２及び５３のそれぞれに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得る、軽鎖可変領域、を有する、ＣＴＬＡ４に結合する単離モノクローナル抗体（例えば、マウス、キメラ、若しくはヒト化抗体）又はその抗原結合部分に関する。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域及びＶＨ ＣＤＲ３領域を含み得る重鎖可変領域、並びにＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域及びＶＬ ＣＤＲ３領域を含み得る軽鎖可変領域を含み得、ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域、ＶＨ ＣＤＲ３領域、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域及びＶＬ ＣＤＲ３領域は、（１）配列番号１、２、３、４、５及び６のそれぞれ；（２）配列番号７、８、９、１０、１１及び１２のそれぞれ；（３）配列番号１、２、１３、１４、５及び１５のそれぞれ；（４）配列番号１６、１７、１８、１９、２０及び２１のそれぞれ；（５）配列番号２２、２３、２４、２５、２６及び２７のそれぞれ；（６）配列番号２８、２９、３０、３１、３２及び３３のそれぞれ；（７）配列番号２２、３４、２４、３５、２６及び２７のそれぞれ；（８）配列番号３６、３７、３８、３９、４０及び４１のそれぞれ；（９）配列番号４２、４３、４４、４５、４６及び４７のそれぞれ；又は（１０）配列番号４８、４９、５０、５１、５２及び５３のそれぞれに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＣＴＬＡ４に結合する。

本開示の抗体又はその抗原結合部分の重鎖可変領域は、５４、５５（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｖ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ；Ｘ１＝Ｇ、Ｘ２＝Ｖ；Ｘ１＝Ｇ、Ｘ２＝Ａ）、５８、５９（Ｘ１＝Ｐ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｄ；Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｎ；Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｄ；Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｎ）、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４又は７６に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得、抗体又はその抗原結合部分は、ＣＴＬＡ４に結合する。配列番号５４のアミノ酸配列は、配列番号８０又は８１のヌクレオチド配列によってコードされ得る。配列番号５８のアミノ酸配列は、配列番号８６又は８７のヌクレオチド配列によってコードされ得る。配列番号５５（Ｘ１＝Ｇ、Ｘ２＝Ａ）及び５９（Ｘ１＝Ｐ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｄ）のアミノ酸配列は、配列番号８２及び８８のそれぞれのヌクレオチド配列によってコードされ得る。

本開示の抗体又はその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、配列番号５６、５７（Ｘ１＝Ｓ、Ｘ２＝Ｍ、Ｘ３＝Ｒ、Ｘ４＝Ｙ；Ｘ１＝Ｓ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｆ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｆ）、６０、６１（Ｘ１＝Ｔ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｆ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｆ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｙ）、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５又は７７に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得、抗体又はその抗原結合部分は、ＣＴＬＡ４に結合する。配列番号５６のアミノ酸配列は、配列番号８３又は８４のヌクレオチド配列によってコードされ得る。配列番号６０のアミノ酸配列は、配列番号８９又は９０のヌクレオチド配列によってコードされ得る。配列番号５７（Ｘ１＝Ｓ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｆ）及び６１（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｙ）のアミノ酸配列は、配列番号８５及び９１のそれぞれのヌクレオチド配列によってコードされ得る。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、（１）配列番号５４及び５６のそれぞれ；（２）配列番号５５（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｖ）及び５７（Ｘ１＝Ｓ、Ｘ２＝Ｍ、Ｘ３＝Ｒ、Ｘ４＝Ｙ）のそれぞれ；（３）配列番号５５（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ）及び５７（Ｘ１＝Ｓ、Ｘ２＝Ｍ、Ｘ３＝Ｒ、Ｘ４＝Ｙ）のそれぞれ；（４）配列番号５５（Ｘ１＝Ｇ、Ｘ２＝Ｖ）及び５７（Ｘ１＝Ｓ、Ｘ２＝Ｍ、Ｘ３＝Ｒ、Ｘ４＝Ｙ）のそれぞれ；（５）配列番号５５（Ｘ１＝Ｇ、Ｘ２＝Ａ）及び５７（Ｘ１＝Ｓ、Ｘ２＝Ｍ、Ｘ３＝Ｒ、Ｘ４＝Ｙ）のそれぞれ；（６）配列番号５５（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｖ）及び５７（Ｘ１＝Ｓ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｆ）のそれぞれ；（７）配列番号５５（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ）及び５７（Ｘ１＝Ｓ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｆ）のそれぞれ；（８）配列番号５５（Ｘ１＝Ｇ、Ｘ２＝Ｖ）及び５７（Ｘ１＝Ｓ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｆ）のそれぞれ；（９）配列番号５５（Ｘ１＝Ｇ、Ｘ２＝Ａ）及び５７（Ｘ１＝Ｓ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｆ）のそれぞれ；（１０）配列番号５５（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｖ）及び５７（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｆ）のそれぞれ；（１１）配列番号５５（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ａ）及び５７（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｆ）のそれぞれ；（１２）配列番号５５（Ｘ１＝Ｇ、Ｘ２＝Ｖ）及び５７（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｆ）のそれぞれ；（１３）配列番号５５（Ｘ１＝Ｇ、Ｘ２＝Ａ）及び５７（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｔ、Ｘ４＝Ｆ）のそれぞれ；（１４）配列番号５８及び６０のそれぞれ；（１５）配列番号５９（Ｘ１＝Ｐ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｄ）及び６１（Ｘ１＝Ｔ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｆ）のそれぞれ；（１６）配列番号５９（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｎ）及び６１（Ｘ１＝Ｔ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｆ）のそれぞれ；（１７）配列番号５９（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｄ）及び６１（Ｘ１＝Ｔ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｆ）のそれぞれ；（１８）配列番号５９（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｎ）及び６１（Ｘ１＝Ｔ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｆ）のそれぞれ；（１９）配列番号５９（Ｘ１＝Ｐ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｄ）及び６１（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｆ）のそれぞれ；（２０）配列番号５９（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｎ）及び６１（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｆ）のそれぞれ；（２１）配列番号５９（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｄ）及び６１（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｆ）のそれぞれ；（２２）配列番号５９（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｎ）及び６１（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｆ）のそれぞれ；（２３）配列番号５９（Ｘ１＝Ｐ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｄ）及び６１（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｙ）のそれぞれ；（２４）配列番号５９（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｎ）及び６１（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｙ）のそれぞれ；（２５）配列番号５９（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ａ、Ｘ３＝Ｄ）及び６１（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｙ）のそれぞれ；（２６）配列番号５９（Ｘ１＝Ｌ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｎ）及び６１（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｙ）のそれぞれ；（２７）配列番号６２及び６３のそれぞれ；（２８）配列番号６４及び６５のそれぞれ；（２９）配列番号６６及び６７のそれぞれ；（３０）配列番号６８及び６９のそれぞれ；（３１）配列番号７０及び７１のそれぞれ；（３２）配列番号７２及び７３のそれぞれ；（３３）配列番号７４及び７５のそれぞれ；又は（３４）配列番号７６及び７７のそれぞれに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み得る。

本開示の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、ジスルフィド結合によって連結された重鎖及び軽鎖を含み得、重鎖は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含み得、軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含み得、重鎖可変領域のＣ末端は、重鎖定常領域のＮ末端に連結され、且つ軽鎖可変領域のＣ末端は、軽鎖定常領域のＮ末端に連結され、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、上述されるアミノ酸配列を含み得、抗体又はその抗原結合部分は、ＣＴＬＡ４に結合する。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖定常領域、例えば、配列番号７８などに示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ４重鎖定常領域であり得る。Ｆｃフラグメントなどの重鎖定常領域は、低減又は増強されたＦｃＲ結合親和性を有するように操作され得る。軽鎖定常領域は、κ定常領域、例えば、配列番号７９などに示されるアミノ酸配列を有するヒトκ定常領域であり得る。配列番号７８及び７９のアミノ酸配列は、配列番号９２及び９３のそれぞれのヌクレオチド配列によってコードされ得る。

特定の実施形態の本開示の抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含み得るか又はそれらからなり得、各重鎖は、上述される重鎖定常領域、重鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含み得るし、各軽鎖は、上述される軽鎖定常領域、軽鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含み得、抗体は、ＣＴＬＡ４に結合する。本開示の抗体又はその抗原結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４アイソタイプなどの全長抗体であり得る。他の実施形態の本開示の抗体又はその抗原結合部分は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体又はＦａｂ又はＦ（ａｂ'）_２フラグメントなどの抗体フラグメントであり得る。

本開示はまた、本開示の抗体又はその抗原結合部分を前記抗体又はその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能性部分（例えば、第２の抗体）に連結して含み得る二重特異性分子を提供する。本開示はまた、本開示の抗体又はその抗原結合部分を細胞毒素などの治療剤に連結して含み得る抗体－薬剤コンジュゲートなどの免疫抱合体を提供する。別の態様において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部として作製可能である。また、抗原キメラ受容体を含み得る免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞も提供される。本開示の抗体又はその抗原結合部分はまた、腫瘍溶解性ウイルスによってコード可能であるか又はそれとの関連で使用可能である。

本開示の抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子、さらにはかかる核酸を含み得る発現ベクター及びかかる発現ベクターを含み得る宿主細胞もまた、本開示に包含される。宿主細胞を用いて本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合部分を調製する方法も提供される。この方法は、（ｉ）宿主細胞で抗体を発現する工程及び（ｉｉ）宿主細胞又はその細胞培養物から抗体を単離する工程を含み得る。

本開示の抗体又はその抗原結合部分、免疫抱合体、二重特異性分子、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ、ＣＡＲ－Ｔ細胞、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞と、薬学的に許容される担体と、を含み得る組成物もまた、提供される。特定の実施形態において、医薬組成物は、抗癌剤などの治療剤をさらに含有し得る。

さらに別の態様において、本開示は、対象において免疫応答をモジュレートする方法であって、対象において免疫応答がモジュレートされるように治療有効量の本開示の抗体若しくはその抗原結合部分又は代替的に対象においてそれらを発現する能力のある核酸分子を対象に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、対象において免疫応答の増強、刺激又は増加を行う。

さらに別の態様において、本開示は、必要とされる対象において腫瘍増殖を阻害する方法であって、治療有効量の本開示の抗体若しくはその抗原結合部分又は代替的に対象においてそれらを発現する能力のある核酸分子を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、本開示の二重特異性分子、免疫抱合体、ＣＡＲ－Ｔ細胞又は抗体をコードする若しくは抗体を保有する腫瘍溶解性ウイルスを投与することを含む。腫瘍は、固形又は血液学的腫瘍であり得る。特定の実施形態において、腫瘍は、限定されるものではないが、黒色腫、結腸直腸癌、肝細胞癌、胸膜中皮腫、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、腎細胞癌、子宮頸癌、血管肉腫、悪性胸膜中皮腫、転移移行（尿路上皮）尿路癌、尿管癌、尿道癌、尿路癌、頭頸部癌、扁平上皮癌、移行細胞癌（尿路上皮細胞癌）、食道癌、胃癌、胃食道（ＧＥ）接合部癌、食道胃接合部腺癌、肛門癌、胆管癌（胆管癌腫）、未分化胚細胞腫、子宮内膜癌、ファロピウス管癌、胚細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、腹膜癌、前立腺癌、唾液腺癌、肉腫、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）及び筋肉浸潤性膀胱癌を含む固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合部分と共に、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＳＴＡＴ３抗体及び／又は抗ＲＯＲ１抗体などの少なくとも１つの追加の抗癌抗体を投与可能である。さらに別の実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ及び／又はＩＬ－４）又は共刺激抗体（例えば、抗ＣＤ１３７及び／又は抗ＧＩＴＲ抗体）と共に投与される。別の実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、エピルビシン、オキサリプラチン及び／又は５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの細胞傷害剤であり得る化学療法剤と共に投与される。本開示の抗体又はその抗原結合部分は、例えば、マウス、ヒト、キメラ又はヒト化型であり得る。

別の態様において、本開示は、必要とされる対象において感染性疾患を治療又は軽減する方法であって、治療有効量の本開示の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。感染性疾患は、ウイルス、細菌、真菌又はマイコプラズマ感染に起因する疾患であり得る。特定の実施形態において、感染性疾患は、慢性ＨＩＶ感染又はＨＨＶ－４感染に起因する。特定の実施形態において、対象は、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗真菌剤又は抗マイコプラズマ剤などの少なくとも１つの抗感染剤がさらに投与され得る。

本開示の他の特徴及び利点は、限定であると解釈されるべきではない以下の詳細な説明及び実施例から明らかになるであろう。本出願を通して引用される全ての参照文献、Ｇｅｎｂａｎｋエントリ、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。

したがって、本発明の目的は、任意の既に公知の製品、その製品の作製方法、又はその製品の使用方法を本発明に包含することではなく、したがって、本出願人は、その権利を留保し、任意の既に公知の製品、プロセス、又は方法の放棄を本明細書に開示する。本発明は、ＵＳＰＴＯの書面による記載及び実施可能要件（米国特許法第１１２条、第１段落）又はＥＰＯ（欧州特許条約（ＥＰＣ）８３条）を満たさない任意の製品、プロセス、又はその製品の作製方法又はその製品の使用方法を本発明の範囲内に包含することを意図しないことがさらに留意され、したがって、本出願人は、その権利を留保し、任意の既に記載された製品、その製品の作製方法、又はその製品の使用方法の放棄を本明細書に開示する。本発明の実施において、５３条（ｃ）ＥＰＣ及び規則２８（ｂ）及び（ｃ）ＥＰＣに準拠していることが有利であり得る。本出願の系統又は任意の他の系統又は任意の第三者の任意の先行出願における出願人の任意の登録特許の主題である任意の実施形態を明確に放棄する全ての権利が、明確に留保される。本明細書に記載されるいずれも、保証として解釈されるべきではない。

本開示、特に、特許請求の範囲及び／又は段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語が、米国特許法による意味を有し得；例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得ること；及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語が、米国特許法による意味を有し、例えば、それらは、明示されていない要素を許容するが、先行技術において見出されるか又は本発明の基本的又は新規な特徴に影響を与える要素を除外することが留意される。

例として示されるが、本発明を記載される特定の実施形態のみに限定することは意図されていない、以下の詳細な説明が、添付の図面と併せて最もよく理解され得る。

捕捉ＥＬＩＳＡにおけるヒトＣＴＬＡ４に対するマウス抗体Ｄ１Ｈ４、Ｄ１Ａ７及びＤ１Ｂ６の結合能を示す。 捕捉ＥＬＩＳＡにおけるヒトＣＴＬＡ４に対するマウス抗体Ｃ１Ｇ４、Ｄ１Ｈ３、Ｄ１Ｂ８、Ｄ１Ｄ５、Ｄ２Ａ４、Ｃ１Ｄ１及びＤ１Ｇ６の結合能を示す。 競合ＥＬＩＳＡにおけるヒトＣＴＬＡ４へのベンチマーク結合をブロックするマウス抗体Ｄ２Ａ４、Ｃ１Ｄ１、Ｃ１Ｇ４、Ｄ１Ｂ６及びＤ１Ｄ５の能力を示す。 競合ＥＬＩＳＡにおけるヒトＣＴＬＡ４へのベンチマーク結合をブロックするマウス抗体Ｄ１Ｈ３、Ｄ１Ａ７、Ｄ１Ｇ６、Ｄ１Ｈ４及びＤ１Ｂ８の能力を示す。 細胞ベースのブロッキングＦＡＣＳアッセイにおける細胞表面ＣＤ８０／ＣＤ８６へのＣＴＬＡ４結合をブロックするマウス抗体Ｄ１Ｈ４、Ｄ１Ａ７、及びＤ１Ｂ６の能力を示す。 細胞ベースのブロッキングＦＡＣＳアッセイにおける細胞表面ＣＤ８０／ＣＤ８６へのＣＴＬＡ４結合をブロックするマウス抗体Ｃ１Ｇ４、Ｄ１Ｈ３、Ｄ１Ｂ８、Ｄ１Ｄ５、Ｄ２Ａ４、Ｃ１Ｄ１及びＤ１Ｇ６の能力を示す。 細胞ベースの機能アッセイにおいてマウス抗体Ｄ２Ａ４、Ｃ１Ｄ１、Ｃ１Ｇ４、Ｄ１Ｂ６、Ｄ１Ｄ５、Ｄ１Ｈ３、Ｄ１Ｈ４、Ｄ１Ｇ６、Ｄ１Ｂ８及びＤ１Ａ７がＣＴＬＡ４－ＣＤ８０結合をブロックしてＩＬ－２放出を誘導したことを示す。 捕捉ＥＬＩＳＡにおけるヒトＣＴＬＡ４に対するキメラ抗体Ｃ１Ｇ４の結合能を示す。 捕捉ＥＬＩＳＡにおけるヒトＣＴＬＡ４に対するキメラ抗体Ｄ１Ｂ６の結合能を示す。 捕捉ＥＬＩＳＡにおけるヒトＣＴＬＡ４に対するキメラ抗体Ｃ１Ｄ１の結合能を示す。 捕捉ＥＬＩＳＡにおけるヒトＣＴＬＡ４に対するキメラ抗体Ｄ１Ｄ５の結合能を示す。 捕捉ＥＬＩＳＡにおけるヒトＣＴＬＡ４に対するキメラ抗体Ｄ１Ｂ８の結合能を示す。 細胞ベースのブロッキングＦＡＣＳアッセイにおける細胞表面ＣＤ８０／ＣＤ８６へのＣＴＬＡ４結合をブロックするキメラ抗体Ｃ１Ｇ４、Ｄ１Ｂ６及びＣ１Ｄ１の能力を示す。 細胞ベースのブロッキングＦＡＣＳアッセイにおける細胞表面ＣＤ８０／ＣＤ８６へのＣＴＬＡ４結合をブロックするキメラ抗体Ｄ１Ｄ５及びＤ１Ｂ８の能力を示す。 捕捉ＥＬＩＳＡにおけるヒトＣＴＬＡ４に対するヒト化抗体ｈｕＣ１Ｄ１－Ｖ８の結合能を示す。 捕捉ＥＬＩＳＡにおけるヒトＣＴＬＡ４に対するヒト化抗体ｈｕＤ１Ｄ５－Ｖ９の結合能を示す。 競合ＥＬＩＳＡにおけるベンチマーク－ヒトＣＴＬＡ４結合をブロックするヒト化抗体ｈｕＣ１Ｄ１－Ｖ８の能力を示す。 競合ＥＬＩＳＡにおけるベンチマーク－ヒトＣＴＬＡ４結合をブロックするヒト化抗体ｈｕＤ１Ｄ５－Ｖ９の能力を示す。 細胞ベースのブロッキングＦＡＣＳアッセイにおける細胞表面ＣＤ８０／ＣＤ８６へのＣＴＬＡ４結合をブロックするヒト化抗体ｈｕＣ１Ｄ１－Ｖ８の能力を示す。 細胞ベースのブロッキングＦＡＣＳアッセイにおける細胞表面ＣＤ８０／ＣＤ８６へのＣＴＬＡ４結合をブロックするヒト化抗体ｈｕＤ１Ｄ５－Ｖ９の能力を示す。 細胞ベースの機能アッセイにおいてヒト化抗体ｈｕＣ１Ｄ１－Ｖ８及びｈｕＤ１Ｄ５－Ｖ９がＣＴＬＡ４－ＣＤ８０結合をブロックしてＩＬ－２放出を誘導したことを示す。 ヒト化抗体ｈｕＣ１Ｄ１－Ｖ８のタンパク質サーマルシフトアッセイ結果を示す。 ヒト化抗体ｈｕＤ１Ｄ５－Ｖ９のタンパク質サーマルシフトアッセイ結果を示す。

本開示がより容易に理解され得ることを確実にするために、いくつかの用語がまず定義される。さらなる定義は、詳細な説明を通して記載される。

「ＣＴＬＡ４」という用語は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４を指す。「ＣＴＬＡ４」という用語は、変異体、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ及びパラログを含む。例えば、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質に特異的な抗体は、ある場合において、サルなどの、ヒト以外の種に由来するＣＴＬＡ４タンパク質と交差反応し得る。他の実施形態において、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質に特異的な抗体は、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質に完全に特異的であり得、他の種に対する又は他のタイプの交差反応性を示さないことがあり、又は全ての他の種ではなく特定の他の種に由来するＣＴＬＡ４と交差反応し得る。

「ヒトＣＴＬＡ４」という用語は、ＮＰ＿００５２０５のＧｅｎｂａｎｋ受託番号を有するヒトＣＴＬＡ４のアミノ酸配列などの、ヒトに由来するアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４タンパク質を指す。「サル又はアカゲザルＣＴＬＡ４」及び「マウスＣＴＬＡ４」という用語はそれぞれ、サル及びマウスＣＴＬＡ４配列を指し、例えば、それぞれＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０３８２０４．１及びＮＰ＿０３３９７３．２を有するアミノ酸配列を有するものである。

「免疫応答」という用語は、侵入病原体、病原体に感染した細胞若しくは組織、癌性細胞又は自己免疫若しくは病理学的炎症の場合には正常ヒト細胞若しくは組織への選択的損傷、それらの破壊又はヒト身体からのそれらの排除をもたらす、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球及び以上の細胞又は肝臓によって産生される可溶性マクロ分子（抗体、サイトカイン及び補体を含む）の作用を意味する。

本明細書において使用される際の「抗体」という用語は、少なくとも１つの抗原結合性部位を介してＣＴＬＡ４などの標的を認識して特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味し、この場合、抗原結合性部位は、通常、免疫グロブリン分子の可変領域内にある。本明細書において使用される際、この用語は、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）、軽鎖抗体（ＬＣＡｂ）、多重特異的抗体、二重特異性抗体、単一特異的抗体、一価抗体、抗体の抗原結合性部位を含む融合タンパク質及び抗体が所望の生物学的活性を呈する限り、抗原結合性部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子（例えば、デュアル可変ドメイン免疫グロブリン分子）を包含する。抗体はまた、限定されるものではないが、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体を含む。抗体は、α、δ、ε、γ及びμとしてそれぞれ参照される重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、免疫グロブリンの５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ又はそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のいずれかであり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造及び三次元配置を有する。抗体は、ネイキッドであり得るか又は限定されるものではないが毒素及び放射性同位体をはじめとする他の分子にコンジュゲートされ得る。特に明示的な指定がない限り、本明細書において使用される際の「抗体」という用語は、インタクトな抗体の「抗原結合部分」を含む。ＩｇＧは、ジスルフィド結合により相互接続された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含み得る糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｈと略記される）及び重鎖定常領域から構成され得る。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３から構成され得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｌと略記される）及び軽鎖定常領域から構成され得る。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、Ｃ_Ｌから構成され得る。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分類され得る。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。

本明細書において使用される際の、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ＣＴＬＡ４タンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能が、完全長抗体のフラグメントによって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ及びＣ_Ｈ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）_２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含み得る二価フラグメント；（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ及びＣ_Ｈ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶ_Ｌ及びＶ_ＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；並びに（ｖｉｉｉ）ナノボディ、単一可変ドメイン及び２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、それらをＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）として作製可能にする合成リンカーによる、組換え方法を用いて結合され得る。このような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、これらのフラグメントは、インタクトな抗体と同じように有用性についてスクリーニングされる。

本明細書において使用される際の「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＣＴＬＡ４タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、ＣＴＬＡ４タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、他の種に由来するＣＴＬＡ４タンパク質などの他の抗原に対する交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。

本明細書において使用される際の「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。

本明細書において使用される際の「マウス抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がマウス生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域はまた、マウス生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のマウス抗体は、マウス生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダム若しくは部位特異的変異誘発又はインビボで体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される際の「マウス抗体」という用語は、別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がマウスフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことは意図されていない。

「キメラ抗体」という用語は、非ヒト源に由来する遺伝物質を、ヒトに由来する遺伝物質と組み合わせることによって作製される抗体を指す。又はより一般に、キメラ抗体は、特定の種に由来する遺伝物質を、別の種に由来する遺伝物質とともに有する抗体である。

本明細書において使用される際の「ヒト化抗体」という用語は、タンパク質配列が、ヒトにおいて天然に産生される抗体形態との類似性を増大するように修飾された、非ヒト種に由来する抗体を指す。

「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。

「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義的に使用される。

本明細書において使用される際、「ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合する」抗体は、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質（場合により、１つ以上の非ヒトに由来するＣＴＬＡ４タンパク質）に結合するが、非ＣＴＬＡ４タンパク質に実質的に結合しない抗体を指すことが意図される。好ましくは、抗体は、「高い親和性」、すなわち、５．０×１０^－８Ｍ以下、より好ましくは、１．０×１０^－８Ｍ以下、より好ましくは、７．０×１０^－９Ｍ以下のＫ_ＤでヒトＣＴＬＡ４タンパク質に結合する。

本明細書において使用される際の、タンパク質又は細胞に「実質的に結合しない」という用語は、タンパク質又は細胞に結合しないか又は高い親和性で結合しない、すなわち、１．０×１０^－６Ｍ以上、より好ましくは、１．０×１０^－５Ｍ以上、より好ましくは、１．０×１０^－４Ｍ以上、より好ましくは、１．０×１０^－３Ｍ以上、さらにより好ましくは、１．０×１０^－２Ｍ以上のＫ_Ｄでタンパク質又は細胞に結合することを意味する。

ＩｇＧ抗体に対する「高い親和性」という用語は、標的抗原に対して１．０×１０^－６Ｍ以下、より好ましくは、５．０×１０^－８Ｍ以下、さらにより好ましくは、１．０×１０^－８Ｍ以下、さらにより好ましくは、７．０×１０^－９Ｍ以下、さらにより好ましくは、１．０×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄを有する抗体を指す。しかしながら、「高い親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変化し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高い親和性」結合は、１０^－６Ｍ以下、より好ましくは、１０^－７Ｍ以下、さらにより好ましくは、１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄを有する抗体を指す。

本明細書において使用される際の「Ｋ_{ａｓｓｏｃ}」又は「Ｋ_ａ」という用語が、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度を指すことが意図される一方、本明細書において使用される際の「Ｋ_ｄｉｓ」又は「Ｋ_ｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことが意図される。本明細書において使用される際の「Ｋ_Ｄ」という用語は、解離定数を指すことが意図され、これは、Ｋ_ｄ対Ｋ_ａの比率（すなわち、Ｋ_ｄ／Ｋ_ａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体についてのＫ_Ｄ値は、当該技術分野において十分に確立された方法を用いて決定され得る。抗体のＫ_Ｄを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いる、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いることによる。

最大半量の有効濃度としても知られている「ＥＣ_５０」という用語は、特定の曝露時間の後の、ベースラインと最大値との間の中間の応答を誘導する抗体の濃度を指す。

半数阻害濃度としても知られている「ＩＣ_５０」という用語は、抗体の非存在と比べて５０％だけ特定の生物学的又は生化学的機能を阻害する抗体の濃度を指す。

「対象」という用語は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、及びは虫類などの、哺乳動物及び非哺乳動物を含むが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ及びウマなどの哺乳動物が好ましい。

「治療有効量」という用語は、疾患若しくは病態（癌など）に関連する症状を予防若しくは改善し、及び／又は疾患若しくは病態の重症度を低下させるのに十分な、本開示の抗体の量を意味する。治療有効量は、治療される病態に関して理解され、実際の有効量は、当業者によって容易に理解される。

本開示の様々な態様が、以下のサブセクションにさらに詳細に記載される。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、イピリムマブなどの既に記載された抗ＣＴＬＡ４抗体と比較して、より良好でないとしても同等の結合親和性／結合能でヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合する。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、イピリムマブなどの既に記載された抗ＣＴＬＡ４抗体と比較して、同等又はより高い活性でＣＤ８０／ＣＤ８６へのＣＴＬＡ４結合をブロックする。本開示の抗体又はその抗原結合部分は、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０／ＣＤ８６結合によって阻害されたＴ細胞応答を促進する。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、マウス、キメラ又はヒト化型である。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、以下及び下記実施例に記載のように構造的及び化学的に特徴決定される。抗体の重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列ＩＤ番号は、以下の表１にまとめられており、いくつかの抗体は、同一Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌを共有する。抗体の重鎖定常領域は、例えば配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ４重鎖定常領域であり得、抗体の軽鎖定常領域は、例えば配列番号７９に示されるアミノ酸配列を有するヒトκ定常領域であり得る。これらの抗体はまた、マウスＩｇＧ４重鎖定常領域及びマウスκ定常領域を含有し得る。

表１中の重鎖可変領域ＣＤＲ及び軽鎖可変領域ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって定義されている。しかしながら、当該技術分野において周知であるように、ＣＤＲ領域はまた、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づいて、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、及びＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステム／方法などの他のシステムによって決定され得る。

ヒトＣＴＬＡ４に結合する他の抗ＣＴＬＡ４抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列（又はＣＤＲ配列）は、本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列（又はＣＤＲ配列）と「混合及び適合させる」ことができる。好ましくは、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ鎖（又はこのような鎖内のＣＤＲ）が、混合及び適合される場合、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ対合からのＶ_Ｈ配列が、構造的に類似のＶ_Ｈ配列で置き換えられる。同様に、好ましくは、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ対合からのＶ_Ｌ配列が、構造的に類似のＶ_Ｌ配列で置き換えられる。

したがって、一実施形態において、本開示の抗体、又はその抗原結合部分は、
（ａ）表１中で上に列挙されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
（ｂ）表１中で上に列挙されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は別の抗ＣＴＬＡ４抗体のＶ_Ｌを含み、ここで、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合する。

別の実施形態において、本開示の抗体、又はその抗原結合部分は、
（ａ）表１中で上に列挙される重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域；及び
（ｂ）表１中で上に列挙される軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域又は別の抗ＣＴＬＡ４抗体のＣＤＲを含み、ここで、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合する。

さらに別の実施形態において、抗体、又はその抗原結合部分は、ヒトＣＴＬＡ４に結合する他の抗体のＣＤＲ、例えば、重鎖可変領域からのＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ３と組み合わされた抗ＣＴＬＡ４抗体の重鎖可変ＣＤＲ２領域、並びに／或いは異なる抗ＣＴＬＡ４抗体の軽鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含む。

さらに、ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２ドメインから独立して、ＣＤＲ３ドメインは、単独で、同種抗原に対する抗体の結合特異性を決定することができること、及び複数の抗体が、予想通りに、共通のＣＤＲ３配列に基づいて、同じ結合特異性を有して生成され得ることが当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８３（２）：２５２－２６０（２０００）；Ｂｅｉｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３－８４９（２０００）；Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０－８９１５（１９９８）；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１－２１６２（１９９４）；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９－２５３３（１９９５）；Ｄｉｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９－７４９（１９９６）；Ｂｅｒｅｚｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ ８：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ８（２００１）；Ｉｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２－７（１９９５）；Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２：８０７－１０（１９９８）；Ｌｅｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４－８（１９９３）；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８－５３２９（１９９４）及びＸｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７－４５（２０００）を参照されたい。また、米国特許第６，９５１，６４６号明細書；同第６，９１４，１２８号明細書；同第６，０９０，３８２号明細書；同第６，８１８，２１６号明細書；同第６，１５６，３１３号明細書；同第６，８２７，９２５号明細書；同第５，８３３，９４３号明細書；同第５，７６２，９０５号明細書及び同第５，７６０，１８５号明細書を参照されたい。これらの参照文献はそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される。

したがって、別の実施形態において、本開示の抗体は、抗ＣＴＬＡ４抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２、並びに抗ＣＴＬＡ４抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３、又は別の抗ＣＴＬＡ４抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含み、ここで、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合することが可能である。これらの抗体は、好ましくは、（ａ）ＣＴＬＡ４との結合について競合し；（ｂ）機能的特性を保持し；（ｃ）同じエピトープに結合し；及び／又は（ｄ）本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体と同様の結合親和性を有する。さらに別の実施形態において、抗体は、抗ＣＴＬＡ４抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、又は別の抗ＣＴＬＡ４抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２をさらに含み得、ここで、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合することが可能である。別の実施形態において、本開示の抗体は、抗ＣＴＬＡ４抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１、又は別の抗ＣＴＬＡ４抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１をさらに含み得、ここで、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合することが可能である。

保存的修飾
別の実施形態において、本開示の抗体は、１つ以上の保存的修飾だけ、本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体のものと異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。特定の保存的配列修飾が、抗原結合を除去せずに作製され得ることが、当該技術分野において理解される。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０－８；ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５－４１；Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４－２６８７０；Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５－１２；Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ'Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２－３５；Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１－６及びＢｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５－４３を参照されたい。

したがって、一実施形態において、抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域及び／又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで：
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｂ）重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｃ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｄ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び／又はＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列；及び／又はその保存的修飾を含み；
（ｅ）抗体は、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合する。

本開示の抗体は、上述される次の機能的特性、例えば、ヒトＣＴＬＡ４への高い親和性の結合及びＣＴＬＡ４－ＣＤ８０／ＣＤ８６結合の遮断活性の１つ以上を有する。

様々な実施形態において、抗体は、例えば、マウス、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体であり得る。

本明細書において使用される際、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に実質的に影響を与えないか又は変化させないアミノ酸修飾を指すことが意図される。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加及び欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などの、当該技術分野において公知の標準的な技術によって、本開示の抗体に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β－分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置換され得、改変された抗体が、本明細書に記載される機能アッセイを用いて、保持された機能（すなわち、上記の機能）について試験され得る。

本開示の抗体は、修飾された抗体を操作するように、出発材料として本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ配列の１つ以上を有する抗体を用いて調製され得る。抗体は、１つ又は両方の可変領域（すなわち、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ）内、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域内及び／又は１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基を修飾することによって操作され得る。それに加えて又はその代わりに、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能を改変するために、定常領域内の残基を修飾することによって操作され得る。

特定の実施形態において、ＣＤＲグラフト法は、抗体の可変領域を操作するのに使用され得る。抗体は、主に、６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外部の配列より個々の抗体間でより異なっている。ＣＤＲ配列が、ほとんどの抗体－抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列にグラフトされた特定の天然抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．を参照されたい。Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９－１００３３；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書も参照されたい）。

したがって、本開示の別の実施形態は、上述される、本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、及び／又は上述される、本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分に関する。これらの抗体が、本開示のモノクローナル抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ ＣＤＲ配列を含む一方、それらは、異なるフレームワーク配列を含み得る。

このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベース又は刊行されている参照文献から得られる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列の配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで、インターネットで利用可能）、並びにＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）（上記に引用される）；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８；及びＣｏｘ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７－８３６（これらのそれぞれの内容が、参照により本明細書に明示的に援用される）において見出され得る。別の例として、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおいて見出され得る。例えば、ＨＣｏ７ ＨｕＭＡｂマウスにおいて見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋ受託番号１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７及びＢＣ０７０３３３）、３－３３（ＮＧ－－００１０１０９及びＮＴ－－０２４６３７）並びに３－７（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）において利用可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ ＨｕＭＡｂ マウスにおいて見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋ受託番号１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７及びＢＣ０７０３３３）、５－５１（ＮＧ－－００１０１０９及びＮＴ－－０２４６３７）、４－３４（ＮＧ－－００１０１０９及びＮＴ－－０２４６３７）、３－３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）並びに３－２３（ＡＪ４０６６７８）において利用可能である。

抗体タンパク質配列は、当業者に周知の、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、上記を参照）と呼ばれる配列類似性検索法の１つを用いて、コンパイルされたタンパク質配列データベースに対して比較される。

本開示の抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、本開示の抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に類似のものである。Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子において見出されるものと同一の配列を有するフレームワーク領域にグラフトされ得、又はＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較して１つ以上の変異を含むフレームワーク領域にグラフトされ得る。例えば、ある場合において、抗体の抗原結合能力を維持又は強化するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが分かっている（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。

別のタイプの可変領域修飾は、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させることであり、それによって、対象とする抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善する。部位特異的変異誘発又はＰＣＲ媒介変異誘発は、変異を導入するために行われ得、抗体結合に対する効果、又は対象とする他の機能的特性が、当該技術分野において公知のインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価され得る。好ましくは、保存的修飾（当該技術分野において公知であるように）が導入される。変異は、アミノ酸置換、付加又は欠失であり得るが、好ましくは、置換である。さらに、典型的に、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４又は５つ以下の残基が改変される。

したがって、別の実施形態において、本開示は、（ａ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ１領域；（ｂ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ２領域；（ｃ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ ＣＤＲ３領域；（ｄ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ１領域；（ｅ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ２領域；及び（ｆ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ ＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む、単離された抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。

本開示の操作された抗体は、修飾が、例えば、抗体の特性を改善するために、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ内のフレームワーク残基に行われたものを含む。典型的に、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、一手法は、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列へと「復帰変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」させることである。より詳細には、体細胞変異を起こした抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することによって同定され得る。

別のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって、抗体の潜在的な免疫原性を低下させるために、フレームワーク領域内、或いは１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を変異させることを含む。この手法は、「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許出願公開第２００３／０１５３０４３号明細書にさらに詳細に記載されている。

フレームワーク若しくはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えて、又はその代わりに、本開示の抗体は、典型的に、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は抗原依存的細胞毒性などの、抗体の１つ以上の機能的特性を改変するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作され得る。さらに、本開示の抗体は、同様に抗体の１つ以上の機能的特性を改変するために化学修飾され得るか（例えば、１つ以上の化学部分が、抗体に結合され得る）又はそのグリコシル化を改変するために修飾され得る。

一実施形態において、Ｃ_Ｈ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変化される、例えば、増加又は減少されるように修飾される。この手法は、米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。Ｃ_Ｈ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖の組み立てを容易にするために、又は抗体の安定性を増大若しくは低下させるために変化される。

別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生体半減期を減少させるように変異される。より詳細には、１つ以上のアミノ酸変異は、抗体が、天然Ｆｃ－ヒンジ領域ＳｐＡ結合と比べて損なわれたブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有するように、Ｆｃ－ヒンジフラグメントのＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメイン境界領域に導入される。この手法は、米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳細に記載されている。

さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化は、修飾される。例えば、非グリコシル化抗体が作製され得る（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増大するために改変され得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を改変することによって達成され得る。例えば、１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位をなくし、それによって、その部位におけるグリコシル化をなくすように行われ得る。このような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増大し得る。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び同第６，３５０，８６１号明細書を参照されたい。

それに加えて又はその代わりに、改変されたタイプのグリコシル化を有する抗体、例えば、減少した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体又は増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体が作製され得る。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増大又は減少することが実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現することによって達成され得る。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当該技術分野において記載されており、本開示の組換え抗体を発現する宿主細胞として使用され、それによって、改変されたグリコシル化を有する抗体を産生することができる。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（α（１，６）－フコシルトランスフェラーゼ）を欠いており、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９細胞株において発現される抗体が、それらの炭水化物においてフコースを欠くようになっている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９ ＦＵＴ８－／－細胞株を、２つの置換ベクターを用いて、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的化破壊によって生成した（米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号明細書及びＹａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４－２２を参照されたい）。別の例として、欧州特許第１，１７６，１９５号明細書には、このような細胞株において発現される抗体が、α－１，６結合関連酵素を減少させるか又は除去することによって低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株が記載されている。また、欧州特許第１，１７６，１９５号明細書には、抗体のＦｃ領域に結合するか又は酵素活性を有さない、フコースのＮ－アセチルグルコサミンへの付加に対して低い酵素活性を有する細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）が記載されている。国際公開第０３／０３５８３５号には、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に結合する能力を低下させ、その宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化ももたらす変異ＣＨＯ細胞株であるＬｅｃ１３細胞が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照）。修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体はまた、国際公開第０６／０８９２３１号に記載されるように、ニワトリ卵において産生され得る。或いは、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、アオウキクサ属（Ｌｅｍｎａ）などの植物細胞において産生され得る。植物系における抗体の産生のための方法は、２００６年８月１１日に出願されたＡｌｓｔｏｎ＆Ｂｉｒｄ ＬＬＰ代理人整理番号０４０９８９／３１４９１１号に対応する米国特許出願に開示されている。抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を用いて切断され得；例えば、フコシダーゼα－Ｌ－フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６－２３）。

本開示によって想定される本明細書の抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生体（例えば、血清）半減期を増加させるために、ペグ化され得る。抗体をペグ化するために、抗体、又はそのフラグメントは、典型的に、１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体フラグメントに結合される条件下で、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応される。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応によって行われる。本明細書において使用される際、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ_１～Ｃ_１０）アルコキシ－又はアリールオキシ－ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール－マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているＰＥＧの形態のいずれかを包含することが意図される。特定の実施形態において、ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当該技術分野において公知であり、本開示の抗体に適用され得る。例えば、欧州特許第１５４ ３１６号明細書及び欧州特許第０ ４０１ ３８４号明細書を参照されたい。

本開示の抗体は、その異なるクラスを検出及び／又は区別するために、それらの様々な物理的特性によって特徴付けられ得る。

例えば、抗体は、軽鎖又は重鎖可変領域のいずれかにおける１つ以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗体の増加した免疫原性又は改変された抗原結合による抗体のｐＫの改変をもたらし得る（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１：６７３－７０２；Ｇａｌａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：５４８９－９４；Ｗａｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６８：１０９９－１０９；Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：４３Ｒ－５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４５２－７；Ｍｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：６９７－７０６）。グリコシル化は、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフにおいて起こることが知られている。ある場合には、可変領域グリコシル化を含まない抗ＣＴＬＡ４抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択することによって、又はグリコシル化領域内の残基を変異させることによって、達成され得る。

好ましい実施形態において、抗体は、アスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ－Ｇ又はＤ－Ｇ配列において起こり得、結合をポリペプチド鎖に導入し、その安定性を低下させる（イソアスパラギン酸効果）イソアスパラギン酸残基の生成をもたらし得る。

各抗体は、一般に６～９．５のｐＨ範囲内の特有の等電点（ｐＩ）を有する。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、典型的に、７～９．５のｐＨ範囲内であり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、典型的に、６～８のｐＨ範囲内である。正常範囲外のｐＩを有する抗体が、インビボ条件下でいくらかのアンフォールディング及び不安定性を有し得ると推測されている。したがって、正常範囲内のｐＩ値を有する抗ＣＴＬＡ４抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲内のｐＩを有する抗体を選択することによって、又は荷電表面残基を変異させることによって達成され得る。

別の態様において、本開示は、本開示の抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域、又はＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。核酸は、全細胞で、細胞溶解物で、又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、標準的な技術によって、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質から精製されたとき、「単離された」又は「実質的に純粋にされた」。本開示の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでいても又は含まなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。

本開示の核酸は、標準的な分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体について、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって得られる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて）得られる抗体について、このような抗体をコードする核酸が、遺伝子ライブラリーから回収され得る。

本開示の好ましい核酸分子は、ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列又はＣＤＲをコードするものを含む。Ｖ_Ｈ及びＶ_ＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントは、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作され得る。これらの操作において、Ｖ_Ｌ－又はＶ_ＨをコードするＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域又はフレキシブルリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡフラグメントに作動可能に連結される。この文脈において使用される際の「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に留まるように、２つのＤＮＡフラグメントが結合されることを意味することが意図される。

Ｖ_Ｈ領域をコードする単離されたＤＮＡは、Ｖ_ＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知であり、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得られる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子について、Ｖ_ＨをコードするＤＮＡは、重鎖Ｃ_Ｈ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。

Ｖ_Ｌ領域をコードする単離されたＤＮＡは、Ｖ_ＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、Ｃ_Ｌをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知であり、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得られる。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域であり得る。

ｓｃＦｖ遺伝子を生成するために、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列が、フレキシブルリンカーによって結合されたＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域を有する連続一本鎖タンパク質として発現され得るように、Ｖ_Ｈ－及びＶ_ＬをコードするＤＮＡフラグメントは、フレキシブルリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３をコードする別のフラグメントに作動可能に連結される（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４を参照されたい）。

本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５の周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技術を用いて産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための他の実施形態は、Ｂリンパ球のウイルス又は発癌性形質転換及びファージディスプレイ技術を含む。キメラ又はヒト化抗体も、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書（これらの内容は、全体が参照により本明細書に具体的に援用される）を参照されたい。

本開示の抗体はまた、例えば、当該技術分野において周知であるような、組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション方法の組合せを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマ中で産生され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）。一実施形態において、標準的な分子生物学技術によって得られる部分的又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結されるように、１つ以上の発現ベクターに挿入される。これに関して、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように、抗体遺伝子が、ベクターにライゲートされることを意味することが意図される。

「調節配列」という用語は、抗体遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））に記載されている。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指向するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルスに由来するプロモーター及び／又はエンハンサー、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）及びポリオーマを含む。或いは、ユビキチンプロモーター又はβ－グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列が使用され得る。さらにまた、調節要素は、ＳＶ４０初期プロモーター及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列からの配列を含む、ＳＲαプロモーター系などの異なる源に由来する配列から構成される（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６－４７２）。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。

抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、同じ又は別個の発現ベクターに挿入され得る。好ましい実施形態において、可変領域は、Ｖ_Ｈセグメントが、ベクター内のＣ_Ｈセグメントに作動可能に連結され、Ｖ_Ｌセグメントが、ベクター内のＣ_Ｌセグメントに作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常及び軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに可変領域を挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を生成するために使用される。それに加えて又はその代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド）であり得る。

抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子を有し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書；同第４，６３４，６６５号明細書及び同第５，１７９，０１７号明細書を参照されたい）。例えば、典型的に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞において、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ－宿主細胞における使用のため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。

軽鎖及び重鎖の発現のため、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形態が、外来性ＤＮＡを原核生物又は真核生物宿主細胞に導入するために一般的に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。原核生物又は真核生物宿主細胞のいずれにおいても本開示の抗体を発現させることが理論上可能であるが、真核細胞、特に哺乳動物細胞が、原核細胞より、適切に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が高いため、このような真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。

本開示の組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１に記載されているような、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０に記載されている、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞との使用について、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号、国際公開第８９／０１０３６号及び欧州特許第３３８，８４１号明細書に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞に導入されるとき、抗体は、宿主細胞における抗体の発現又は、より好ましくは、宿主細胞が増殖される培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたって、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、培養培地から回収され得る。

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などの免疫抱合体を形成するために、治療剤にコンジュゲートされ得る。好適な治療剤としては、細胞毒素、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、及び抗有糸分裂剤が挙げられる。ＡＤＣにおいて、抗体及び治療剤は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィド、又はヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｃｉｔ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、又はＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００号明細書；同第６，９８９，４５２号明細書；及び同第７，１２９，２６１号明細書；国際公開第０２／０９６９１０号；国際公開第０７／０３８，６５８号；国際公開第０７／０５１，０８１号；国際公開第０７／０５９，４０４号；国際公開第０８／０８３，３１２号；及び国際公開第０８／１０３，６９３号；米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号明細書；同第２００６／０００４０８１号明細書；及び同第２００６／０２４７２９５号明細書（これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される）に記載されているように調製され得る。

別の態様において、本開示は、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成するために、少なくとも１つの他の機能分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体又はリガンド）に連結された本開示の１つ以上の抗体を含む二重特異性分子を特徴とする。したがって、本明細書において使用される際、「二重特異性分子」は、３つ以上の特異性を有する分子を含む。

二重特異性分子は、多くの異なるフォーマット及びサイズであり得る。サイズスペクトルの一方の側では、二重特異性分子は、同一の特異性の２つの結合アームを有する代わりに、それぞれ異なる特異性を有する２つの結合アームを有することを除いて、従来の抗体フォーマットを保持している。他方の側では、ペプチド鎖によって連結される２つの一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ'ｓ）、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）_２構築物からなる二重特異性分子である。中間サイズの二重特異性分子は、ペプチジルリンカーによって連結される２つの異なるＦ（ａｂ）フラグメントを含む。これらの及び他のフォーマットの二重特異性分子は、遺伝子組換え、体細胞ハイブリダイゼーション、又は化学的方法によって調製され得る。例えば、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（上記に引用される）；Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｕｒｅｓｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９（６），６３５－６４４（１９９８）；及びｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，２１（８），３９１－３９７（２０００）、並びにそれらの中に引用される参照文献を参照されたい。

優先的に癌細胞を感染させ死滅させる、腫瘍溶解性ウイルスも、本明細書において提供される。本開示の抗体は、腫瘍溶解性ウイルスとともに使用され得る。或いは、本開示の抗体をコードする腫瘍溶解性ウイルスは、ヒトの身体に導入され得る。

抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も、本明細書において提供され、この抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖは、本明細書に記載されるＣＤＲ及び重鎖／軽鎖可変領域を含む。

抗ＣＴＬＡ４ ＣＡＲは、（ａ）抗ＣＴＬＡ４ ｓｃＦｖを含む細胞外抗原結合ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン；及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。

ＣＡＲは、新生受容体を小胞体に指向する、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端におけるシグナルペプチド、及び受容体を結合のためにより多く利用できるようにする、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端におけるヒンジペプチドを含有し得る。ＣＡＲは、好ましくは、細胞内シグナル伝達ドメインにおいて、主要な細胞内シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。主に使用される、最も有効な主要な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭを含むＣＤ３－ζ細胞質ドメインであり、そのリン酸化が、Ｔ細胞活性化をもたらす。共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＯＸ４０などの共刺激タンパク質に由来し得る。

ＣＡＲは、Ｔ細胞増殖、持続性、及び抗腫瘍活性を促進する因子、例えば、サイトカイン、及び共刺激リガンドをさらに追加し得る。

本明細書において提供されるＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞も提供される。ある実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、又は胚性幹細胞である。ある実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。

別の態様において、本開示は、本開示の抗体若しくはその抗原結合部分、二重特異性抗体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞の１つ以上を薬学的に許容される担体と共に製剤化して含み得る医薬組成物を提供する。組成物が２つ以上の抗体（若しくはその抗原結合部分、二重特異性抗体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞）を含有するとき、抗体若しくはその抗原結合部分、二重特異性抗体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞は、個別に投与可能である。組成物は、１つ以上の追加の医薬活性成分、例えば、別の抗体又は抗腫瘍薬剤などの薬剤を任意に含有し得る。

医薬組成物は、あらゆる賦形剤を含み得る。使用され得る賦形剤は、担体、表面活性剤、増粘剤又は乳化剤、固体結合剤、分散若しくは懸濁補助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング、崩壊剤、滑沢剤、甘味料、防腐剤、等張剤、及びそれらの組合せを含む。好適な賦形剤の選択及び使用が、Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）（その開示内容は、参照により本明細書に援用される）に教示されている。

好ましくは、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に好適である。投与経路に応じて、有効成分は、酸の作用及びそれを不活性にし得る他の天然条件からそれを保護するための材料でコーティングされ得る。本明細書において使用される際の「非経口投与」という語句は、経腸及び局所投与以外の、通常注射による投与方法を意味し、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外並びに胸骨内注射及び注入を含む。或いは、本開示の抗体は、経口（ｎｏｎ－ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路によって、例えば、局所、表皮又は粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下又は局所的に投与され得る。

医薬組成物は、滅菌水溶液又は分散体の形態であり得る。それらはまた、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は他の高い薬物濃度に好適な規則的な構造で製剤化され得る。

単一剤形を製造するために担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、治療される対象及び特定の投与方法に応じて変化し、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００％のうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、約０．０１％～約９９％の有効成分の範囲である。

投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するために調整される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、経時的に数回の分割投与で投与されてもよく、又は用量は、治療状況の緊急性により示されるとき比例的に減少若しくは増加され得る。投与の容易性及び投与量の均一性のため、非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される際の投与単位形態は、治療される対象に対する単位投与量として適した物理的に分離した単位を指し；各単位は、必要な医薬担体とともに、所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の有効成分を含有する。或いは、抗体は、あまり頻繁でない投与が必要とされる場合、徐放性製剤として投与され得る。

組成物の投与のため、投与量は、約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲であり得る。

本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体、又はその抗原結合部分、又は二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体の「治療有効投与量」は、好ましくは、疾患の症状の重症度の低下、疾患の無症状期間の頻度及び持続時間の増加、又は疾患の苦痛に起因する障害若しくは身体障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍を有する対象の治療について、「治療有効投与量」は、好ましくは、非治療対象と比べて、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、さらにより好ましくは、少なくとも約６０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８０％だけ腫瘍増殖を阻害する。治療有効量の治療用抗体は、腫瘍サイズを減少させるか、又は典型的にヒトであるか又は別の哺乳動物であり得る対象において症状を改善することができる。

医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤であり得る。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸が使用され得る。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。

治療用組成物は、医療デバイス、例えば、（１）無針皮下注射デバイス（例えば、米国特許第５，３９９，１６３号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；及び同第４，５９６，５５６号明細書）；（２）微小注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号明細書）；（３）経皮デバイス（米国特許第４，４８６，１９４号明細書）；（４）注入装置（米国特許第４，４４７，２３３号明細書及び同第４，４４７，２２４号明細書）；並びに（５）浸透デバイス（米国特許第４，４３９，１９６号明細書及び同第４，４７５，１９６号明細書）（これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される）によって投与され得る。

特定の実施形態において、本開示のモノクローナル抗体は、インビボで適切な分布を確実にするため製剤化され得る。例えば、本開示の治療用抗体が、血液脳関門を通過することを確実にするために、それらは、リポソーム中で製剤化され得、これらは、特定の細胞又は器官への選択的輸送を促進するための標的分子をさらに含み得る。例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書；同第５，３７４，５４８号明細書；同第５，４１６，０１６号明細書；及び同第５，３９９，３３１号明細書；Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５；Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８；Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０；Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０；Ｋｅｉｎａｎｅｎ ａｎｄ Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；及びＫｉｌｌｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３を参照されたい。

本開示の組成物は、例えば癌及び感染性疾患の治療をはじめとする数多くのインビトロ及びインビボ有用性を有する。組成物は、例えばインビボで、腫瘍増殖を阻害するために又は病原体を低減若しくは排除するために、ヒト対象に投与可能である。

別の態様において、本開示は、必要とされる対象において感染性疾患を治療又は軽減する方法であって、治療有効量の本開示の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。感染性疾患は、ウイルス、細菌、真菌又はマイコプラズマ感染に起因する疾患であり得る。特定の実施形態において、感染性疾患は、慢性ＨＩＶ又はＨＨＶ－４感染に起因する。特定の実施形態において、対象は、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗真菌剤、又は抗マイコプラズマ剤などの少なくとも１つの抗感染剤がさらに投与され得る。

ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０／ＣＤ８６媒介Ｔ細胞抑制を逆転してＴ細胞応答を促進する本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体又は抗原結合部分の能力を考慮して、本開示は、対象において腫瘍の成長が阻害されるように本開示の組成物を対象に投与することを含む、対象において腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供する。本開示の組成物によって治療可能な腫瘍の非限定的例としては、限定されるものではないが、黒色腫、結腸直腸癌、肝細胞癌、胸膜中皮腫、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、腎細胞癌、子宮頸癌、血管肉腫及び筋肉浸潤性膀胱癌が挙げられる。その他、本開示の抗体を用いて難治性又は再発悪性病変の成長が抑制され得る。

別の態様において、本開示は、対象において腫瘍増殖を阻害するのに有効な１つ以上の追加の抗体と共に、本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体若しくはその抗原結合部分又は二重特異性抗体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体を共投与する、組合せ療法の方法を提供する。一実施形態において、本開示は、抗ＣＴＬＡ４抗体（若しくはその抗原結合部分又はＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体）並びに１つ以上の追加の抗体、例えば、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び／又は抗ＰＤ－１抗体を対象に投与することを含む、対象において腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。特定の実施形態において、対象はヒトである。

ＣＴＬＡ４シグナル伝達ブロッケードはまた、標準的癌治療とさらに組合せ可能である。例えば、ＣＴＬＡ４シグナル伝達ブロッケードは、ＬＡＧ－３及び／又はＰＤ－１ブロッケード、さらには化学療法レジームと組合せ可能である。例えば、化学療法剤は、細胞傷害剤であり得る抗ＣＴＬＡ４抗体と共に投与可能である。例えば、エピルビシン、オキサリプラチン及び５－ＦＵは、抗ＣＴＬＡ４療法を受けている患者に投与される。

任意に、抗ＣＴＬＡ４抗体及び１つ以上の追加の抗体（例えば、抗ＴＩＭ－３及び／又は抗ＬＡＧ－３及び／又は抗ＰＤ－１抗体）の組合せは、免疫原性剤、例えば、癌性細胞、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド及び炭水化物分子を含む）及び免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子がトランスフェクトされた細胞とさらに組合せ可能である（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４９１９－２８）。使用可能な腫瘍ワクチンの非限定的例としては、黒色腫抗原のペプチド、例えば、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ－２、ＭＡＲＴ１及び／若しくはチロシナーゼのペプチド、又はサイトカインＧＭ－ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられる。

抗ＣＴＬＡ４療法と組み合わせ得る他の療法としては、限定されるものではないが、インターロイキン－２（ＩＬ－２）投与、放射線、手術又はホルモン剥奪が挙げられる。

別の態様において、本開示は、病原体を低減又は排除するのに有効な１つ以上の追加の作用剤と共に、本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合部分を共投与する、組合せ療法の方法を提供する。一実施形態において、本開示は、抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合部分、並びに病原体に対する１つ以上の追加の作用剤、例えば、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗真菌剤又は抗マイコプラズマ剤を対象に投与することを含む、対象において感染性疾患を治療又は軽減する方法を提供する。特定の実施形態において、対象はヒトである。

本明細書において説明される治療剤の組合せは、薬学的に許容される担体中の単一の組成物と同時に、又は薬学的に許容される担体中の各薬剤を含む別個の組成物として同時に投与され得る。別の実施形態において、治療剤の組合せは、連続して投与され得る。

さらに、組合せ治療の２つ以上の用量が、連続して投与される場合、連続投与の順序は、投与の各時点で逆になり得るか又は同じ順序に保持され得、連続投与は、同時投与と組み合わされ得、又はそれらの任意の組合せである。

本開示は、以下の実施例によってさらに例示され、これは、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用される全ての図及び全ての参照文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。

実施例１ ハイブリドーマ技術を用いたマウス抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体の生成
免疫化
マウスを、Ｅ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８に記載されている方法にしたがって免疫化した。Ｃ末端にヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグを有する組換えヒトＣＴＬＡ４タンパク質（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ＣＴ４－Ｈ５２５５）を、免疫原として使用した。ヒトＣＴＬＡ４－ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ＣＴ４－Ｈ５２２９）を、抗血清力価を決定するため、及び抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマをスクリーニングするために使用した。免疫化投与量は、一次及び追加免疫の両方のために２５μｇのヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃタンパク質／マウス／注射を含んでいた。免疫応答を増加させるために、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）を、一次及び追加免疫のためにそれぞれ使用した。簡潔には、まず、ボルテックスを用いてバイアル中でアジュバントを穏やかに混合することによって、アジュバント－抗原混合物を調製した。所望の量のアジュバントを、加圧滅菌された１．５ｍＬの微小遠心分離管に移した。抗原を、０．２５～０．５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するＰＢＳ又は生理食塩水中で調製した。次に、計算された量の抗原を、アジュバントとともに微小遠心分離管に加え、得られた混合物を、２分間にわたって穏やかにボルテックスすることによって混合して、油中水型エマルジョンを生成した。次に、アジュバント－抗原エマルジョンを、動物に注射するための適切なシリンジに吸い込ませた。合計で２５μｇの抗原を、１００～２００μｌの体積で注射した。各動物を免疫化し、次に、抗血清力価に応じて４～５回追加接種した。良好な力価を有する動物に、融合前に腹腔内注射によって最終追加接種を与えた。

ハイブリドーマ融合及びスクリーニング
マウス骨髄腫細胞株（ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１５８１）の細胞を培養して、融合直前に対数期段階に到達させた。免疫化マウスに由来する脾臓細胞を、Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ，ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ，"Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ"，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７（１９７５）に記載される方法にしたがって、滅菌的に調製し、骨髄腫細胞と融合させた。続いて、融合された「ハイブリッド細胞」を、ＤＭＥＭ／２０％のＦＣＳ／ＨＡＴ培地中の９６ウェルプレート中に分配した。生存しているハイブリドーマコロニーが、融合の７～１０日後に顕微鏡で観察された。２週間後、各ウェルからの上清を、組換えヒトＣＴＬＡ４－ｈｉｓタンパク質を用いて間接ＥＬＩＳＡに供した。次に、ヒトＣＴＬＡ４－ｈｉｓタンパク質に結合した抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを選択して、２４ウェルプレートに移した。細胞表面ＣＤ８０／ＣＤ８６へのヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃタンパク質結合をブロックする活性について、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によってハイブリドーマをさらに試験した。細胞系列のクローン性を確保するために限界希釈によって、高い特異的ヒトＣＴＬＡ４結合活性及びＣＴＬＡ４－Ｄａｕｄｉ細胞遮断活性を示した抗体を産生するハイブリドーマクローンをサブクローニングし、次にモノクローナル抗体を精製した。簡潔に述べると、５～１０カラム体積のＰＢＳ緩衝液を用いてプロテインＡセファロースカラム（ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、Ｃａｔ＃ＡＡ０２７３）を洗浄した。ハイブリドーマモノクローンの細胞上清をカラムに通し、次に、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまでＰＢＳ緩衝液を用いてカラムを洗浄した。溶出緩衝液（０．１Ｍのグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．７）でカラムから溶出し、中和緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を含む１．５ｍｌ管にただちに収集した。免疫グロブリンを含有する画分をプールして、ＰＢＳ中４℃で一晩透析した。続いて、精製モノクローナル抗体のインビトロ機能活性を以下のように特徴決定した。

実施例２ ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴を用いたマウス抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体の結合親和性決定
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって、実施例１で生成された精製抗ＣＴＬＡ４マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を結合親和性及び結合速度について特徴決定した。

簡潔に述べると、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって提供される標準的アミンカップリングキットを用いて、第一級アミンを介して、ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ＃ＢＲ１００８３８，Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ）をＣＭ５チップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃ＢＲ１００５３０製のカルボキシメチルデキストラン被覆チップ）に共有結合で連結し、プロテインＧチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ＃２９－１７９３－１５）をベンチマークの親和性決定に使用した。バイオセンサー表面上の未反応部分をエタノールアミンでブロックした。次に、１０μｇ／ｍｌの濃度の本開示の精製抗ＣＴＬＡ４抗体及びＣＴＬＡ４ベンチマーク（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）又はＢＭとも呼ばれるＢｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ、Ｃａｔ＃ ＮＤＣ：０００３－２３２７－１１）を１０μＬ／ｍｉｎの流量でチップ上に流した。次に、ＨＢＳ－ＥＰ^＋緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅによって提供された）中の連続希釈組換えヒトＣＴＬＡ４－ｈｉｓ（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ ＣＴ４－Ｈ５２２９、８０ｎＭから出発して２倍連続希釈で）又はカニクイザルＣＴＬＡ４－ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ＣＴ４－Ｃ５２２７、８０ｎＭから出発して２倍連続希釈で）を３０μＬ／ｍｉｎの流量でチップ上に流した。抗原－抗体会合速度を２分間追跡し、解離速度を１０分間追跡した。ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて会合及び解離曲線を１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。Ｋ_Ｄ、Ｋ_ａ及びＫ_ｄ値を決定して、以下の表２に要約した。

本開示のマウス抗体は全て、ベンチマークと比較して同等又はより高い結合親和性でヒト及びカニクイザルＣＴＬＡ４に特異的に結合した。抗体Ｃ１Ｄ１、Ｃ１Ｇ４、Ｄ１Ｄ５、Ｄ１Ｈ４、Ｄ１Ｂ８及びＤ１Ａ７は、ヒトＣＴＬＡ４に対して最高レベルの結合親和性を示した。

実施例３ マウス抗ＣＴＬＡ－４抗体のＣＴＬＡ４結合活性
捕捉ＥＬＩＳＡによってＣＴＬＡ４に対する本開示のマウス抗ＣＴＬＡ４抗体の結合活性を決定した。

簡潔に述べると、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ'）_２フラグメント特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ＃１１５－００５－０７２）で９６ウェルプレートを被覆し（１００μｌ／ウェル）、４℃で一晩インキュベートした。洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ－２０、ＰＢＳＴ）でプレートを１回洗浄し、次に、３７℃で２時間にわたり２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（５％ｗ／ｖ無脂肪乳を含むＰＢＳＴ）でブロックした。プレートを４回洗浄し、１００μｌ／ウェルの本開示の連続希釈マウス抗ＣＴＬＡ４抗体、ベンチマーク又は陰性対照ｈＩｇＧ（静脈注射用ヒト免疫グロブリン（ｐＨ４）、Ｈｕａｌａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．）（１００００ｎｇ／ｍｌから出発して２．５％ｗ／ｖ無脂肪乳を含むＰＢＳＴ中５倍希釈）と共に３７℃で４０分間インキュベートし、次に再び４回洗浄した。捕捉された抗ＣＴＬＡ４抗体を含有するプレートに１００μｌ／ウェルのビオチン標識ヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃタンパク質（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ＣＴ４－Ｈ５２５５、２．５％ｗ／ｖ無脂肪乳を含むＰＢＳＴ中２６ｎｇ／ｍｌ）を添加して３７℃で４０分間インキュベートし、４回洗浄し、そしてストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ（ＰＢＳＴ中１：１００００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ＃０１６－０３０－０８４、１００μｌ／ウェル）と共に３７℃で４０分間インキュベートした。最終洗浄後、１００μｌ／ウェルの基質ＴＭＢ（Ｉｎｎｏｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｃａｔ＃ＴＭＢ－Ｓ－００２）と共にプレートをインキュベートした。５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を用いて反応を室温で１５分以内に停止させ、ＴＭＢに対して４５０ｎｍ及び参照波長として６３０ｎｍでの二波長モードを用いてマイクロプレートリーダーで各ウェルの吸光度を読み取り、次に、ＯＤ（４５０－６３０）値を抗体濃度に対してプロットした。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＥＣ_５０値を報告した。結果を図１Ａ及び１Ｂに示した。

Ｄ１Ｂ８を除いて本開示のマウス抗ＣＴＬＡ４抗体は全て、高い結合能でヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合することが、図１Ａ～１Ｂから分かる。

実施例４ マウス抗ＣＴＬＡ－４抗体のベンチマーク遮断活性及びＣＴＬＡ４－ＣＤ８０／８６遮断活性
４．１ ベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡ
ベンチマーク－ヒトＣＴＬＡ４結合をブロックする本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体の能力を競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定した。簡潔に述べると、ＰＢＳ中１．０μｇ／ｍＬでベンチマークを９６ウェルマイクロプレート上に被覆して（１００μｌ／ウェル）、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄緩衝液でプレートを１回洗浄し、５％ｗ／ｖ無脂肪乳を含む２００μｌのＰＢＳＴでブロックし、３７℃で２時間インキュベートし、そして４回洗浄した。

１３３．３３ｎＭから出発して３倍連続希釈で本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体又はコントロールをビオチン標識ヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃ（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ＣＴ４－Ｈ５２５５、２．５％ｗ／ｖ無脂肪乳を含むＰＢＳＴ中６５ｎｇ／ｍｌ）で希釈し、室温で４０分間インキュベートし、次に抗体／ヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃ混合物をベンチマーク被覆プレートに添加した（１００μｌ／ウェル）。３７℃で４０分間のインキュベーション後、洗浄緩衝液を用いてプレートを再び４回洗浄した。次に、プレートに１００μｌ／ウェルのストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ（ＰＢＳＴ中１：１００００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ＃０１６－０３０－０８４、１００μｌ／ウェル）を添加して３７℃で４０分間インキュベートした。洗浄緩衝液を用いてプレートを最終洗浄した。最後に、ＴＭＢを添加し、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を用いて反応を停止させ、そしてＴＭＢに対して４５０ｎｍ及び参照波長として６３０ｎｍでの二波長モードを用いてマイクロプレートリーダーで各ウェルの吸光度を読み取り、次に、ＯＤ（４５０－６３０）値を抗体濃度に対してプロットした。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＩＣ_５０値を報告した。

４．２ 細胞ベースのリガンドブロッキングＦＡＣＳ
細胞表面ヒトＣＤ８０及びヒトＣＤ８６を発現する細胞系列Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２１３）を用いて、細胞表面ＣＤ８０／ＣＤ８６へのヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃタンパク質結合をブロックする本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体の活性をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で評価した。

３３．３３ｎＭから出発して２倍連続希釈で本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体、ベンチマーク又は陰性対照ｈＩｇＧ（静脈注射用ヒト免疫グロブリン（ｐＨ４）、Ｈｕａｌａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．）をヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃ溶液（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ＣＴ４－Ｈ５２５５、ＦＡＣＳ緩衝液中１μｇ／ｍＬ）で希釈し、そして室温で３０分間インキュベートした。Ｄａｕｄｉ細胞を対数期に細胞培養フラスコから採取し、２回洗浄し、そして２％ｖ／ｖウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中に再懸濁した。１００μｌ／ウェルの抗体／ＣＴＬＡ４－Ｆｃ混合物を含む９６ウェルプレート中でＤａｕｄｉ細胞（１×１０^５細胞／ウェル）を４℃で４０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液でプレートを２回洗浄し、次に１００μｌ／ウェルのＲ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ，Ｆｃγフラグメント特異的抗体（ＦＡＣＳ緩衝液中１：１０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１０９－１１５－０９８）を添加し、そして暗所４℃で４０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄して、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ－ＨＴＳ装置を用いて蛍光を測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＩＣ_５０値を報告した。

図２Ａ～２Ｂ及び３Ａ～３Ｂに結果を示した。

本開示のほとんどの抗体は、ヒトＣＴＬＡ４－ベンチマーク結合をブロック可能であることが、図２Ａ～２Ｂから分かるので、本開示のこれら抗体は、ベンチマークと同一又は類似のエピトープに結合することが示唆される。抗体Ｄ２Ａ４、Ｄ１Ｂ８及びＤ１Ｈ４は、ベンチマークへのヒトＣＴＬＡ４結合をブロックできなかったことから、Ｄ２Ａ４、Ｄ１Ｂ８及びＤ１Ｈ４は異なるエピトープに結合するであろうことが示唆される。

本開示のほとんどの抗体は、ベンチマークと同等又はより高い活性で細胞表面ＣＤ８０／ＣＤ８６へのＣＴＬＡ４結合をブロックする能力のあることが、図３Ａ～３Ｂから示された。

実施例５ マウス抗ＣＴＬＡ－４抗体の細胞ベースの機能アッセイ
Ｔ細胞応答を促進する活性について本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体を試験した。

簡潔に述べると、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃１００９９－１４１）及び５μｇ／ｍＬのＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃Ｌ１６６８－５Ｍ）が補充された２０μＬのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃１１８７５－０９３）中の４×１０^４ＧＳ－Ｊ１細胞（ＣＤ２８を発現する不死化ヒトＴリンパ球、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｃａｔ＃Ｍ００６１１）を３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔ＃３７０７）の各ウェルにプレーティングした。１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地でヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃ（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ＣＴ４－Ｈ５２５５）を８μｇ／ｍＬに希釈して、２０μＬのＣＴＬＡ４－Ｆｃをプレートの各ウェルに添加した。次に、１０％ＦＢＳが補充された２０μＬのＲＰＭＩ１６４０培地中の２×１０^４ＧＳ－Ｃ１／ＣＤ８０細胞（細胞表面ＣＤ８０を発現する不死化抗原提示細胞、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｃａｔ＃Ｍ００６１４）、続いて１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中の２０μＬの連続希釈抗ＣＴＬＡ４抗体（３３３．３３ｎＭから出発して２．５倍連続希釈で）をプレートの各ウェルに添加した。３７℃で２４ｈにわたりプレートを５％ＣＯ_２インキュベーターに入れた。プレートを遠心分離し、ヒトＩＬ－２ ＨＴＲＦキット（Ｃｉｓｂｉｏ，Ｃａｔ＃６２ＨＩＬ０２ＰＥＧ）を用いて３８４ウェル少量マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｃａｔ＃７８４０７５）で上清中のＩＬ２レベルを測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてデータを分析し、ＥＣ_５０値を報告した。

図４にアッセイ結果を示した。

本開示の抗体は全て、ベンチマークと比較して、少し高いＥＣ_５０であるが類似の最大ＩＬ２放出レベルでＴ細胞応答を促進する能力のあることが分かる。

実施例６ キメラ抗体の生成及び特徴決定
抗ＣＴＬＡ４マウスｍＡｂの重鎖及び軽鎖の可変ドメインをシーケンシングして、配列ＩＤ番号を表１に要約した。

抗ＣＴＬＡ４マウスｍＡｂ Ｃ１Ｇ４、Ｄ１Ｂ６、Ｃ１Ｄ１、Ｄ１Ｄ５及びＤ１Ｂ８の重鎖及び軽鎖の可変ドメインを、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（配列番号７８）及びヒトκ軽鎖定常領域（配列番号７９）のそれぞれにインフレームでクローニングし、可変領域のＣ末端をそれぞれの定常領域のＮ末端に連結した。

１ｍｇ／ｍＬのＰＥＩを用いて、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（配列番号７８）に連結された重鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含有するベクター及びヒトκ軽鎖定常領域（配列番号７９）に連結された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含有するベクターを、１．１：１の重鎖対軽鎖構築物比で２００ｍｌの２９３Ｆ懸濁細胞培養物中に一過性にトランスフェクトした。

振とうフラスコ中で６日間後、キメラ抗体を含有する細胞上清を採取し、次に上述されるように細胞上清からキメラ抗体を精製した。以下に記載の修正及びプロトコルを用いて又は用いずに上記の実施例のプロトコルに従って、捕捉ＥＬＩＳＡ、Ｏｃｔｅｔ親和性試験及び細胞ベースのリガンドブロッキングＦＡＣＳで精製キメラ抗体を試験した。

Ｏｃｔｅｔシステム（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ９６）によって、結合親和性及び結合速度について精製抗ＣＴＬＡ４キメラ抗体を特徴決定した。簡潔に述べると、ＡＨＣバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ製の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉）に１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を３秒間予め滲み込ませ、次に泳動用緩衝液（ＰＢＳＴ中０．５％ｗ／ｖ ＢＳＡ）を含むウェル中に３秒間浸漬し、滲込み及び浸漬の工程を３回繰り返した。次に、５μｇ／ｍｌのＨＢＳ－ＥＰ^＋中キメラ抗ＣＴＬＡ４抗体又は５μｇ／ｍｌのＨＢＳ－ＥＰ^＋中ベンチマークを含むウェル中にセンサーを１００秒間浸漬し、そして泳動用緩衝液を含むウェル中に５ｍｉｎ完全に沈めた。泳動用緩衝液を含む別のウェル中で新しいベースラインで１８０秒間泳動させた。次に、泳動用緩衝液中の連続希釈ヒトＣＴＬＡ４－ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ＣＴ４－Ｈ５２２９、８０ｎＭから出発して２倍連続希釈で）を含むウェル中にセンサーを１００秒間浸漬し、次にベースラインウェル中に１０ｍｉｎ浸漬した。最後に、センサーに１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を３秒間予め滲み込ませ、次に、泳動用緩衝液を含むウェル中に３秒間浸漬し、滲込み及び浸漬の工程を３回繰り返した。ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析８．１を用いて会合及び解離曲線を１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。Ｋ_ａ、Ｋ_ｄ及びＫ_Ｄ値を決定して、以下の表３に要約した。

捕捉ＥＬＩＳＡでは、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ，Ｆ（ａｂ'）_２フラグメント特異的抗体の代わりにＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ，Ｆｃγフラグメント特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ＃１０９－００５－００８）を使用した（１００μｌ／ウェル）。

表３並びに図５Ａ～５Ｅ及び図６Ａ～６Ｂに結果を示した。

表３に示されるように、キメラＣ１Ｇ４、Ｃ１Ｄ１及びＤ１Ｄ５抗ＣＴＬＡ４抗体は、ベンチマークよりも高い結合親和性でヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合した。

図５Ａ～５Ｅ及び６Ａ～６Ｂに示されるように、キメラ抗ＣＴＬＡ４抗体は、それらの親マウスｍＡｂに類似した結合能及びリガンド遮断活性を有していた。キメラＤ１Ｂ６、Ｃ１Ｄ１及びＤ１Ｄ５の抗ＣＴＬＡ４抗体は、細胞ベースのリガンドブロッキングＦＡＣＳでＹｅｒｖｏｙ（登録商標）よりも少し良好な遮断活性を有していた。

実施例７ 抗ＣＴＬＡ４マウスモノクローナル抗体Ｃ１Ｄ１及びＤ１Ｄ５のヒト化
ヒト化及びさらなる研究のために、マウス抗ＣＴＬＡ４抗体Ｃ１Ｄ１及びＤ１Ｄ５を選択した。以下に詳細に記載されるように、十分に確立されたＣＤＲ移植法を用いてマウス抗体のヒト化を行った。

マウス抗体Ｃ１Ｄ１及びＤ１Ｄ５のヒト化のための受容体フレームワークを選択するために、ヒト免疫グロブリン遺伝子データベースに対して各マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域配列をブラスト検索した。最も高い相同性を有するヒト生殖系列をヒト化用の受容体フレームワークとして選択した。選択されたフレームワークにマウス抗体重鎖／軽鎖可変領域ＣＤＲを挿入し、より多くの候補重鎖／軽鎖可変領域を得るためにフレームワーク内の残基をさらに復帰変異させた。合計で１２のヒト化Ｃ１Ｄ１抗体、すなわち、ｈｕＣ１Ｄ１－Ｖ１～ｈｕＣ１Ｄ１－Ｖ１２及び１２のヒト化Ｄ１Ｄ５抗体、すなわち、ｈｕＤ１Ｄ５－Ｖ１～ｈｕＤ１Ｄ５－Ｖ１２を得た。その重鎖／軽鎖可変領域配列ＩＤ番号は表１に挙げた。

１ｍｇ／ｍＬのＰＥＩを用いて、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（配列番号７８）に連結されたヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含有するベクター及びヒトκ軽鎖定常領域（配列番号７９）に連結されたヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含有するベクターを、１．１：１の重鎖対軽鎖構築物比で２００ｍｌの２９３Ｆ懸濁細胞培養物中に一過性にトランスフェクトした。

実施例８ ヒト化抗体の特徴決定
振とうフラスコ中で６日間後、ヒト化抗体を含有する細胞上清を採取し、ＨＢＳ－ＥＰ^＋中５μｇ／ｍｌの濃度でキメラ抗体及びベンチマークと共に上述されるプロトコルに従ってＯｃｔｅｔによってヒトＣＴＬＡ４に対する結合親和性について試験した。Ｋ_ａ、Ｋ_ｄ及びＫ_Ｄ値を決定して、以下の表４及び５に要約した。

ヒト化Ｃ１Ｄ１抗体を含有する細胞上清は全て、ヒトＣＴＬＡ４に対してベンチマークよりも高い結合親和性を示し、且つｈｕＣＴＬＡ４ Ｄ１Ｄ５－Ｖ１～ｈｕＣＴＬＡ４ Ｄ１Ｄ５－Ｖ３を含有する細胞上清は、ヒトＣＴＬＡ４に対してベンチマークよりも高い結合親和性を示すことが、データから示唆された。

上述されるようにヒト化抗体ｈｕＣ１Ｄ１－Ｖ８及びｈｕＤ１Ｄ５－Ｖ９を精製し、マイナー変更を施して上記実施例のプロトコルに従って、Ｂｉａｃｏｒｅ、捕捉ＥＬＩＳＡ、ベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡ、細胞ベースのリガンドブロッキングＦＡＣＳ及び細胞ベースのＴ細胞応答促進試験で試験した。捕捉ＥＬＩＳＡアッセイでは、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ'）_２フラグメントの代わりに、２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ，Ｆ（ａｂ'）_２フラグメント特異的抗体、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ＃１０９－００５－０９７）で９６ウェルマイクロプレートを被覆した（１００μｌ／ウェル）。Ｂｉａｃｏｒｅ試験では、ヤギ抗マウスＩｇＧの代わりにヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ＃ＢＲ１００８３９，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ）をＣＭ５チップに共有結合で連結し、ベンチマークに対してはプロテインＧチップの代わりにＣＭ５チップを使用した。

また、ＧｌｏＭｅｌｔ（商標）サーマルシフトタンパク質安定性キット（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｃａｔ＃３３０２２－Ｔ）を用いて熱安定性アッセイで精製抗体を試験し、Ｔｍ（融解温度）を決定した。簡潔に述べると、ＧｌｏＭｅｌｔ（商標）色素を解凍して室温に達するようにした。色素を含有するバイアルをボルテックスし、遠心分離した。次に、９５μＬのＰＢＳに５μＬの２００×色素を添加することによって１０×色素を調製した。２μＬの１０×色素及び１０μｇのヒト化抗体を添加し、２０μＬの合計反応体積になるようにＰＢＳを添加した。色素及び抗体を含有する管を短時間スピンし、表６のパラメータを有する融解曲線プログラムで構成されたリアルタイムＰＣＲサーモサイクラー（Ｒｏｃｈｅ，ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩ）中に配置した。

表７並びに図７Ａ～７Ｂ、図８Ａ～８Ｂ、図９Ａ～９Ｂ、図１０及び図１１Ａ～１１Ｂに結果を示した。

抗体ｈｕＣ１Ｄ１－Ｖ８は、ヒトＣＴＬＡ４及びカニクイザルＣＴＬＡ４に対して親抗体又はベンチマークよりも低い結合親和性を示したことが、表７から分かる。この抗体は、細胞表面ＣＤ８０／ＣＤ８６へのＣＴＬＡ４結合を効果的にブロックし、且つ遮断活性は、ベンチマークと比較したときに同等であることが、図９Ａに示された。

また、抗体ｈｕＤ１Ｄ５－Ｖ９は、ヒトＣＴＬＡ４及びカニクイザルＣＴＬＡ４に対して同等の結合親和性を有していたことが、表７から分かる。この抗体は、ベンチマークと比較したときに少し高いブロッキング能で細胞表面ＣＤ８０／ＣＤ８６へのＣＴＬＡ４結合を効果的にブロックすることが、図９Ｂに示された。

図８Ａ～８Ｂによれば、本開示のヒト化抗体ｈｕＣ１Ｄ１－Ｖ８及びｈｕＤ１Ｄ５－Ｖ９は、ヒトＣＴＬＡ４－ＢＭ結合をブロック可能であったことから、本開示の抗体ｈｕＣ１Ｄ１－Ｖ８及びｈｕＤ１Ｄ５－Ｖ９は、ＢＭと類似のエピトープに結合し得ることが示唆される。

図１０に示されるように、本開示のヒト化抗体ｈｕＣ１Ｄ１－Ｖ８及びｈｕＤ１Ｄ５－Ｖ９は、ＢＭと比較したときにＴ細胞反応を促進する同等の活性を有していた。

本開示は、１つ以上の実施形態とともに上述されているが、本開示が、それらの実施形態に限定されないことが理解されるべきであり、説明は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれ得る際、全ての代替例、修飾、及び均等物を包含することが意図される。本明細書に引用される全ての参照文献は、全体が参照によりさらに援用される。

本出願中の配列が、以下に要約される。

このように、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明してきたが、上記の段落によって定義される本発明は、その多くの明らかな変形が、本発明の趣旨又は範囲から逸脱せずに可能であるため、上記の説明に記載される特定の詳細に限定されないことが理解されるべきである。

Claims (15)

1. ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域及びＶＨ ＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域、並びに、
   ｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域及びＶＬ ＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含み、
   前記ＶＨ ＣＤＲ１領域、前記ＶＨ ＣＤＲ２領域、前記ＶＨ ＣＤＲ３領域、前記ＶＬ ＣＤＲ１領域、前記ＶＬ ＣＤＲ２領域及び前記ＶＬ ＣＤＲ３領域のアミノ酸配列が、配列番号１、２、３、４、５及び６のそれぞれであり、
   細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）に結合することができる、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
2. 前記重鎖可変領域が、配列番号５４、又は５５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、
   前記配列番号５５の４９番目及び８１番目のアミノ酸残基は、それぞれAla (A) 及び Val (V)；それぞれAla (A) 及び Ala (A)；それぞれ Gly (G) 及び Val (V)；又はそれぞれ Gly (G) 及び Ala (A)である、
   請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
3. 前記軽鎖可変領域が、配列番号５６、又は５７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、
   前記配列番号５７の４３番目、５８番目、６９番目及び７１番目のアミノ酸残基は、それぞれSer (S), Met (M), Arg (R) 及び Tyr (Y)；それぞれ Ser (S), Val (V), Thr (T) 及び Phe (F)； 又はそれぞれ Val (V), Val (V), Thr (T) 及び Phe (F)である、
   請求項１または２に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
4. 前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、
   （１）配列番号５４及び５６のそれぞれ；
   （２）配列番号５５及び５７のそれぞれであって、前記配列番号５５の４９番目及び８１番目のアミノ酸残基は、それぞれAla (A) 及び Val (V)であり、前記配列番号５７の４３番目、５８番目、６９番目及び７１番目のアミノ酸残基は、それぞれSer (S), Met (M), Arg (R) 及び Tyr (Y)である；
   （３）配列番号５５及び５７のそれぞれであって、前記配列番号５５の４９番目及び８１番目のアミノ酸残基は、それぞれAla (A) 及び Ala (A)であり、前記配列番号５７の４３番目、５８番目、６９番目及び７１番目のアミノ酸残基は、それぞれSer (S), Met (M), Arg (R) 及び Tyr (Y)である；
   （４）配列番号５５及び５７のそれぞれであって、前記配列番号５５の４９番目及び８１番目のアミノ酸残基は、それぞれGly (G) 及び Val (V)であり、前記配列番号５７の４３番目、５８番目、６９番目及び７１番目のアミノ酸残基は、それぞれSer (S), Met (M), Arg (R) 及び Tyr (Y)である；
   （５）配列番号５５及び５７のそれぞれであって、前記配列番号５５の４９番目及び８１番目のアミノ酸残基は、それぞれGly (G) 及び Ala (A)であり、前記配列番号５７の４３番目、５８番目、６９番目及び７１番目のアミノ酸残基は、それぞれSer (S), Met (M), Arg (R) 及び Tyr (Y)である；
   （６）配列番号５５及び５７のそれぞれであって、前記配列番号５５の４９番目及び８１番目のアミノ酸残基は、それぞれAla (A) 及び Val (V)であり、前記配列番号５７の４３番目、５８番目、６９番目及び７１番目のアミノ酸残基は、それぞれSer (S), Val (V), Thr (T) 及び Phe (F)である；
   （７）配列番号５５及び５７のそれぞれであって、前記配列番号５５の４９番目及び８１番目のアミノ酸残基は、それぞれAla (A) 及び Ala (A)であり、前記配列番号５７の４３番目、５８番目、６９番目及び７１番目のアミノ酸残基は、それぞれSer (S), Val (V), Thr (T) 及び Phe (F)である；
   （８）配列番号５５及び５７のそれぞれであって、前記配列番号５５の４９番目及び８１番目のアミノ酸残基は、それぞれGly (G) 及び Val (V)であり、前記配列番号５７の４３番目、５８番目、６９番目及び７１番目のアミノ酸残基は、それぞれSer (S), Val (V), Thr (T) 及び Phe (F)である；
   （９）配列番号５５及び５７のそれぞれであって、前記配列番号５５の４９番目及び８１番目のアミノ酸残基は、それぞれGly (G) 及び Ala (A)であり、前記配列番号５７の４３番目、５８番目、６９番目及び７１番目のアミノ酸残基は、それぞれSer (S), Val (V), Thr (T) 及び Phe (F)である；
   （１０）配列番号５５及び５７のそれぞれであって、前記配列番号５５の４９番目及び８１番目のアミノ酸残基は、それぞれAla (A) 及び Val (V)であり、前記配列番号５７の４３番目、５８番目、６９番目及び７１番目のアミノ酸残基は、それぞれVal (V), Val (V), Thr (T) 及び Phe (F)である；
   （１１）配列番号５５及び５７のそれぞれであって、前記配列番号５５の４９番目及び８１番目のアミノ酸残基は、それぞれAla (A) 及び Ala (A)であり、前記配列番号５７の４３番目、５８番目、６９番目及び７１番目のアミノ酸残基は、それぞれVal (V), Val (V), Thr (T) 及び Phe (F)である；
   （１２）配列番号５５及び５７のそれぞれであって、前記配列番号５５の４９番目及び８１番目のアミノ酸残基は、それぞれGly (G) 及び Val (V)であり、前記配列番号５７の４３番目、５８番目、６９番目及び７１番目のアミノ酸残基は、それぞれVal (V), Val (V), Thr (T) 及び Phe (F)である；又は、
   （１３）配列番号５５及び５７のそれぞれであって、前記配列番号５５の４９番目及び８１番目のアミノ酸残基は、それぞれGly (G) 及び Ala (A)であり、前記配列番号５７の４３番目、５８番目、６９番目及び７１番目のアミノ酸残基は、それぞれVal (V), Val (V), Thr (T) 及び Phe (F)である；
   に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
5. 前記重鎖可変領域に連結された、配列番号７８のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、及び前記軽鎖可変領域に連結された配列番号７９のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分。
6. マウス、キメラ又はヒト化抗体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分。
7. ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分。
8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド。
9. 請求項８に記載のヌクレオチドを含む発現ベクター。
10. 請求項８に記載のヌクレオチド又は請求項９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
11. 請求項１～７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体若しくはその抗原結合部分、請求項８に記載のヌクレオチド、請求項９に記載の発現ベクター又は請求項１０に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
12. 必要とされる対象において腫瘍の増殖を阻害するのに使用するための請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 前記腫瘍が、黒色腫、結腸直腸癌、肝細胞癌、胸膜中皮腫、肺癌、腎細胞癌、子宮頸癌、血管肉腫、悪性胸膜中皮腫、転移尿路上皮尿路癌、尿管癌、尿道癌、尿路癌、頭頸部癌、扁平上皮癌、尿路上皮細胞癌、食道癌、胃癌、胃食道（ＧＥ）接合部癌、食道胃接合部腺癌、肛門癌、胆管癌、未分化胚細胞腫、子宮内膜癌、ファロピウス管癌、胚細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、腹膜癌、前立腺癌、唾液腺癌、肉腫、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）又は筋肉浸潤性膀胱癌である、請求項１２に記載の使用のための医薬組成物。
14. 必要とされる対象において感染性疾患を治療又は軽減するのに使用するための請求項１１に記載の医薬組成物。
15. 前記感染性疾患が、慢性ＨＩＶ感染又はＨＨＶ－４感染に起因する、請求項１４に記載の使用のための医薬組成物。

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