JP2017523807A - 抗ｃｔｌａ４モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、医薬組成物および使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、腫瘍処置および分子免疫学の分野に属し、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、その医薬組成物およびその使用を提供する。本発明のモノクローナル抗体は、ＣＴＬＡ４がＢ７に結合するのを阻止し、それにより、宿主におけるＣＴＬＡ４の免疫抑制効果を排除し、Ｔリンパ球を活性化する。

Description

本発明は、腫瘍治療および分子免疫学の分野に属する。本発明は、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、それらの医薬組成物、それらのコード配列および前記のものを使用した、診断、予防、治療および／または補助療法の方法およびそれらにおける使用に関する。

細胞傷害性Ｔリンパ球結合抗原４（ＣＴＬＡ４と略される。）は、遺伝子構造、染色体位置、配列相同性および遺伝子発現においてＣＤ２８分子と非常に密接な関係を有する。これらは両者とも、活性化Ｔ細胞の表面上で主に発現される同時刺激性分子Ｂ７に対する受容体である。しかし、リンパ球活性化の同時刺激シグナルとして、ＣＴＬＡ４は、ＣＤ２８とは反対の機能を有する。Ｂ７への結合後、ＣＴＬＡ４は、マウスおよびヒトＴ細胞の活性化を阻害し得、Ｔ細胞の活性化における負の制御の役割を果たす。

ＣＴＬＡ４ ｍＡｂまたはＣＴＬＡ４リガンドは、ＣＴＬＡ４がそのネイティブリガンドに結合するのを防ぎ得、それによってＣＴＬＡ４によるＴ細胞負制御シグナルの伝達を阻止し、様々な抗原へのＴ細胞の応答性を促進する。この点において、インビボおよびインビトロ実験からの結果は、実質的に呼応している。現在のところ、いくつかのＣＴＬＡ４ ｍＡｂ（１０Ｄ１、１１．２．２）が、前立腺癌、膀胱癌、結直腸癌、消化管の癌、肝臓癌、悪性メラノーマなどを処置することについて、臨床治験で試験されている（ＣＴＬＡ−４ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｇｒｏｓｓｏ ＪＦ．，Ｊｕｒｅ−Ｋｕｎｋｅｌ ＭＮ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ．２０１３；１３：５．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｊａｎ ２２；米国特許第６９８４７２０号明細書；および米国特許第６６８２７３６号明細書）。とりわけ、１０Ｄ１および１１．２．２は、最良の効果を有する抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体とみなされる。

インターロイキン２（ＩＬ−２）はＴ細胞により産生される。これはＴ細胞のサブグループを制御する増殖因子（ｆａｃｔｏｒｅ）である。これは、免疫反応を調整する重要な因子でもある。これは、Ｂ細胞の増殖を促進し、活性化し得、抗体反応、血球新生および腫瘍監視に関連する。組み換えヒトＩＬ−２は、悪性腫瘍（メラノーマ、腎臓腫瘍などを含む。）の処置について米国ＦＤＡにより承認されている。これは、慢性ウイルス感染を処置する臨床治験中でもある（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２．Ｃｈａｖｅｚ，Ａ．Ｒ．ら、Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，２００９．１１８２：１４−２７）。

Ｔ細胞の機能に影響を及ぼす重要な因子として、ＣＴＬＡ４およびＣＴＬＡ４ ｍＡｂは、身体中の免疫微小環境に干渉することによって疾患において特定の治療効果を生み出し得る。これらは、高い効力を有し、従来の投薬の欠陥を修正し、遺伝子治療の新規経路を開く。ＣＴＬＡ４およびＣＴＬＡ４ ｍＡｂは、実験および臨床治験の様々なステージで試験されている。例えば、自己免疫疾患において、これらは、喘息の動物モデルにおいて気道過敏症を効果的に抑制し、リウマチ疾患の発症を防ぎ、身体において同種移植片への免疫寛容に介在するなどした。一方で、生物学的遺伝子治療は短期臨床治験で悪影響が全く示されなかったものの、長期適用後の潜在的影響に注意を払うべきである。例えば、ＣＴＬＡ４ ｍＡｂによるＣＴＬＡ４−Ｂ７シグナル伝達の過剰な阻止の結果、自己免疫疾患を発症し得る。抗体はそれらのリガンドに特異的に結合し、標的細胞の溶解を誘導するか、または病態の進行を阻止し得るので、抗体、特にヒト化抗体に基づく薬物の開発および利用は、ヒトにおける悪性腫瘍および他の免疫疾患の臨床処置において重要な意義を有する。

現在、Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合を阻止する新規抗体およびそれらのヒト化抗体を開発する必要がなお存在する。

米国特許第６９８４７２０号明細書 米国特許第６６８２７３６号明細書

Ｇｒｏｓｓｏ ＪＦ．，Ｊｕｒｅ−Ｋｕｎｋｅｌ ＭＮ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ．２０１３；１３：５．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｊａｎ ２２ Ｃｈａｖｅｚ，Ａ．Ｒ．ら、Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，２００９．１１８２：１４−２７

発明者らによる集中的な研究および独創的な取り組みの後、哺乳動物細胞発現系を用いて組み換えＣＴＬＡ４を発現させ、免疫マウスへの抗原として使用した。マウス脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させることによりハイブリドーマ細胞を得た。発明者らによる非常に多くの試料のスクリーニング後、ＣＴＬＡ４に特異的に結合し、Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合を非常に効率的に阻止し得る特異的なモノクローナル抗体を分泌し、産生することが可能なハイブリドーマ細胞株を得た。さらに、ヒト化抗体を作製した。したがって、次の発明を提供する。

本発明のある態様は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関し、ここで、
本モノクローナル抗体は、
配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２および
配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
および／または
配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号３１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２および
配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。

本発明の実施形態の何れか１つによる、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
本モノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４および配列番号１８から選択され；
および／または
本モノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４から選択されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。

本発明の実施形態の何れか１つによる、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、本モノクローナル抗体は、
（１）配列番号６で規定されるＶＨおよび配列番号８で規定されるＶＬ；
（２）配列番号１０で規定されるＶＨおよび配列番号１２で規定されるＶＬ；
（３）配列番号１４で規定されるＶＨおよび配列番号１６で規定されるＶＬ；
（４）配列番号１８で規定されるＶＨおよび配列番号２０で規定されるＶＬ；
（５）配列番号１４で規定されるＶＨおよび配列番号２２で規定されるＶＬ；または
（６）配列番号１４で規定されるＶＨおよび配列番号２４で規定されるＶＬ
を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。

本発明において、上記の群（１）から（６）は、それぞれ８Ｄ２／８Ｄ２（Ｒｅ）、８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。

具体的に、配列番号６、配列番号１０および配列番号１４の位置１８のメチオニン（Ｍｅｔ）は、独立に、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）またはアラニン（Ａｌａ）から選択されるアミノ酸で置換される。

抗体、特にモノクローナル抗体（ＭＡＢ）に基づく治療薬は、一部の疾患の処置において優れた効能を達成した。このような治療用抗体を得るための従来法は、抗原で動物に免疫付与し、免疫付与動物からの抗原に対する抗体を得ること、または親和性成熟によって抗原に対する親和性が低い抗体を改善することである。しかし、このような方法は、時間がかかり、労力を要し、抗原上の特異的なエピトープを標的とすることができないことが多い。

抗原結合は、軽鎖および重鎖の可変領域に依存し；各鎖の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる３個の超可変領域を含む（重鎖（Ｈ）はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、軽鎖（Ｌ）はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み；定義については、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９１），Ｖｏｌ．１−３，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄを参照のこと。）。

当業者にとって周知の技術的手段によって、例えばＶＢＡＳＥ２データベース分析によって、上記実施形態（１）から（６）のモノクローナル抗体配列におけるＣＤＲのアミノ酸配列を分析した。結果を以下で提供する。

（１）重鎖可変領域の３個のＣＤＲのアミノ酸配列を以下で示す：
ＨＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＤＮＷ （配列番号２７）、
ＨＣＤＲ２：ＩＲＮＫＰＹＮＹＥＴ （配列番号２８）、
ＨＣＤＲ３：ＴＡＱＦＡＹ （配列番号２９）。

軽鎖可変領域の３個のＣＤＲのアミノ酸配列を以下で示す：
ＬＣＤＲ１：ＥＮＩＹＧＧ （配列番号３０）、
ＬＣＤＲ２：ＧＡＴ （配列番号３１）、
ＬＣＤＲ３：ＱＮＶＬＲＳＰＦＴ （配列番号３２）。

（２）重鎖可変領域の３個のＣＤＲのアミノ酸配列を以下で示す：
ＨＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＤＮＷ （配列番号２７）、
ＨＣＤＲ２：ＩＲＮＫＰＹＮＹＥＴ （配列番号２８）、
ＨＣＤＲ３：ＴＡＱＦＡＹ （配列番号２９）。

軽鎖可変領域の３個のＣＤＲのアミノ酸配列を以下で示す：
ＬＣＤＲ１：ＥＮＩＹＧＧ （配列番号３０）、
ＬＣＤＲ２：ＧＡＴ （配列番号３１）、
ＬＣＤＲ３：ＱＮＶＬＲＳＰＦＴ （配列番号３２）。

（３）重鎖可変領域の３個のＣＤＲのアミノ酸配列を以下で示す：
ＨＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＤＮＷ （配列番号２７）、
ＨＣＤＲ２：ＩＲＮＫＰＹＮＹＥＴ （配列番号２８）、
ＨＣＤＲ３：ＴＡＱＦＡＹ （配列番号２９）。

軽鎖可変領域の３個のＣＤＲのアミノ酸配列を以下で示す：
ＬＣＤＲ１：ＥＮＩＹＧＧ （配列番号３０）、
ＬＣＤＲ２：ＧＡＴ （配列番号３１）、
ＬＣＤＲ３：ＱＮＶＬＲＳＰＦＴ （配列番号３２）。

（４）重鎖可変領域の３個のＣＤＲのアミノ酸配列を以下で示す：
ＨＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＤＮＷ （配列番号２７）、
ＨＣＤＲ２：ＩＲＮＫＰＹＮＹＥＴ （配列番号２８）、
ＨＣＤＲ３：ＴＡＱＦＡＹ （配列番号２９）。

軽鎖可変領域の３個のＣＤＲのアミノ酸配列を以下で示す：
ＬＣＤＲ１：ＥＮＩＹＧＧ （配列番号３０）、
ＬＣＤＲ２：ＧＡＴ （配列番号３１）、
ＬＣＤＲ３：ＱＮＶＬＲＳＰＦＴ （配列番号３２）。

（５）重鎖可変領域の３個のＣＤＲのアミノ酸配列を以下で示す：
ＨＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＤＮＷ （配列番号２７）、
ＨＣＤＲ２：ＩＲＮＫＰＹＮＹＥＴ （配列番号２８）、
ＨＣＤＲ３：ＴＡＱＦＡＹ （配列番号２９）。

軽鎖可変領域の３個のＣＤＲのアミノ酸配列を以下で示す：
ＬＣＤＲ１：ＥＮＩＹＧＧ （配列番号３０）、
ＬＣＤＲ２：ＧＡＴ （配列番号３１）、
ＬＣＤＲ３：ＱＮＶＬＳＲＨＰＧ （配列番号３３）。

（６）重鎖可変領域の３個のＣＤＲのアミノ酸配列を以下で示す：
ＨＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＤＮＷ （配列番号２７）、
ＨＣＤＲ２：ＩＲＮＫＰＹＮＹＥＴ （配列番号２８）、
ＨＣＤＲ３：ＴＡＱＦＡＹ （配列番号２９）。

軽鎖可変領域の３個のＣＤＲのアミノ酸配列を以下で示す：
ＬＣＤＲ１：ＥＮＩＹＧＧ （配列番号３０）、
ＬＣＤＲ２：ＧＡＴ （配列番号３１）、
ＬＣＤＲ３：ＱＮＶＬＳＳＲＰＧ （配列番号３４）。

本発明の実施形態の何れか１つによる、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、本モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、１本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体またはダイアボディから選択されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。

本発明の実施形態の何れか１つによる、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、本モノクローナル抗体は、約１０^−５Ｍ未満、例えば約１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ以下のＫ_ＤでＣＴＬＡ４タンパク質と結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。

本発明の実施形態の何れか１つによる、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、本モノクローナル抗体は、非ＣＤＲ領域を含み、この非ＣＤＲ領域は、マウス以外の種、例えばヒトの抗体由来であるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。

本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合し得る、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。

腫瘍の、予防および／または治療および／または補助療法および／または診断での使用のための、本発明の実施形態の何れか１つによる、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片；具体的には、この腫瘍は、メラノーマ、腎臓腫瘍／腎腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結直腸癌、消化管の癌および肝臓癌／肝癌から選択される。

Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合を阻止すること、
ＣＴＬＡ４の活性またはＣＴＬＡ４のレベルを制御（例えば下方制御）すること、
ＣＴＬＡ４による身体における免疫抑制を緩和すること、または
Ｔリンパ球を活性化するかもしくはＴリンパ球におけるＩＬ−２の発現を増加させる薬剤
における使用のための、本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体。

本発明の別の態様は、単離核酸分子に関し、この単離核酸分子は、抗体の重鎖可変領域をコードすることが可能な核酸配列を含み、
抗体の重鎖可変領域は、配列番号２７から２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；
具体的に、本抗体の重鎖可変領域は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８で規定されるようなアミノ酸配列を有し；
より具体的には、本核酸分子は、配列番号５、配列番号９、配列番号１３または配列番号１７で規定されるようなヌクレオチド配列を有する。

本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする単離核酸分子をさらに提供する。このような核酸分子は、ハイブリドーマ細胞から単離され得るか、または遺伝子操作の組み換え技術もしくは化学合成法の方法を通じて得ることができる。

本発明のさらなる態様は、単離核酸分子に関し、この単離核酸分子は、抗体の軽鎖可変領域をコードすることが可能な核酸配列を含み、
本抗体の軽鎖可変領域は、
１）配列番号３０から３２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ；
２）配列番号３０、配列番号３１および配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ；または
３）配列番号３０、配列番号３１および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ；
を含み、
具体的に、本抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４で規定されるようなアミノ酸配列を有し；
より具体的には、本核酸分子は、配列番号配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３で規定されるようなヌクレオチド配列を有する。

本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか１つによる単離核酸分子を含むベクターに関する。本発明のベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。好ましい実施形態において、本発明のベクターは、例えばプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、コエミド（ｃｏｅｍｉｄ）などである。

本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか１つの単離核酸分子または本発明によるベクターを含む宿主細胞に関する。このような宿主細胞としては、原核細胞、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞など、および真核細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞（例えば、マウス細胞、ヒト細胞などを含む哺乳動物細胞など）が挙げられるが限定されない。本発明の細胞は、２９３Ｔ細胞などの細胞株でもあり得る。

本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか１つによる、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を調製する方法に関し、この方法は、本発明の宿主細胞を適切な条件下で培養し、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を細胞培養物から回収する段階を含む。

本発明のさらなる態様は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片および複合部分を含む複合物に関し、ここで本モノクローナル抗体は、本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、複合部分は検出可能な標識である。具体的に、複合部分は、放射性同位体、蛍光物質、発光性物質、発色物質または酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）である。

本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片または本発明による複合物を含むキットに関し；
具体的に、本キットは、前記のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を特異的に認識する二次抗体をさらに含み；この二次抗体は、検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光物質、発光性物質、発色物質または酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）をさらに含んでいてもよい。

本発明のさらなる態様は、試料中のＣＴＬＡ４の存在またはそのレベルを検出することにおける使用のためのキットの調製における、本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用に関する。

本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片または本発明による複合物を含む医薬組成物に関し、これは、医薬的に許容可能な担体および／または賦形剤をさらに含んでいてもよい。

本発明のさらなる態様は、腫瘍の、予防および／または治療および／または補助療法および／または診断における使用のための薬剤の調製における、本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片または本発明による複合物の使用に関し；具体的に、この腫瘍は、メラノーマ、腎臓腫瘍／腎腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結直腸癌、消化管の癌および肝臓癌／肝癌から選択される。

本発明のさらなる態様は、次の薬剤：
試料中でＣＴＬＡ４の存在またはそのレベルを検出する薬剤、
Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合を阻止する薬剤、
ＣＴＬＡ４の活性またはＣＴＬＡ４のレベルを制御（例えば下方制御）する薬剤、
ＣＴＬＡ４による身体における免疫抑制を緩和する薬剤、
Ｔリンパ球を活性化する薬剤、または
Ｔリンパ球におけるＩＬ−２の発現を増加させる薬剤
の調製における、本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片または本発明による複合物の使用に関する。

本発明のさらなる態様は、有効量の本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片または本発明による複合物を細胞に投与する段階を含む、インビボまたはインビトロ法に関し、この方法は：
試料中のＣＴＬＡ４の存在またはそのレベルを検出する方法、
Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合を阻止する方法、
ＣＴＬＡ４の活性またはＣＴＬＡ４のレベルを制御（例えば下方制御）する方法、
ＣＴＬＡ４による身体における免疫抑制を緩和する方法、
Ｔリンパを活性化する方法、または
Ｔリンパ球におけるＩＬ−２の発現を増加させる方法
から選択される。

この方法は、診断もしくは治療目的または非診断もしくは非治療目的（例えば試料が、患者からの試料ではなく、細胞試料である場合）のために使用し得る。

本発明のさらなる態様は、有効量の本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片または本発明による複合物を対象に投与することを含む、腫瘍の、予防および／または治療および／または補助療法および／または診断の方法に関し；具体的に、この腫瘍は、メラノーマ、腎臓腫瘍／腎腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結直腸癌、消化管の癌および肝臓癌／肝癌から選択される。

本発明において、別段の指定のない限り、本明細書中で使用される科学用語および技術用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。さらに、本明細書中で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、免疫学の手順は、関連技術分野で広く利用される方法である。一方で、本発明をより理解する目的のために、関連用語の定義および説明を以下で提供する。

本明細書中で使用される場合、ＣＴＬＡ４タンパク質（細胞傷害性Ｔ−リンパ球抗原４）のアミノ酸配列について申し述べる場合、これは、ＣＴＬＡ４タンパク質の全長またはＣＴＬＡ４の細胞外断片、ＣＴＬＡ４ＥＣＤ（配列番号２）またはＣＴＬＡ４ＥＣＤを含む断片を含み；これはまた、ＣＴＬＡ４ＥＣＤの融合タンパク質、例えばマウスＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃ）（配列番号３）と融合される断片も含む。しかし、当業者により理解されるように、突然変異または変異（置換、欠失および／または付加を含むが限定されない。）は、その生物学的機能に影響を及ぼすことなく、ＣＴＬＡ４タンパク質のアミノ酸配列において天然に生じるかまたはＣＴＬＡ４タンパク質のアミノ酸配列に人工的に導入され得る。したがって、本発明において、「ＣＴＬＡ４タンパク質」という用語は、配列番号２で規定されるような配列ならびにそのネイティブもしくは人工的変異体を含め、全てのこのような配列を含むべきである。さらに、ＣＴＬＡ４タンパク質の配列断片について申し述べる場合、これは配列番号２の配列断片を含むだけでなく、そのネイティブまたは人工的変異体の対応する配列断片も含む。

本明細書中で使用される場合、具体的に指定されない限り、Ｂ７はＢ７−１および／またはＢ７−２を指し；それらの具体的なタンパク質配列は、当技術分野で公知の配列を指す。先行技術またはＧｅｎＢａｎｋの文献、例えばＢ７−１（ＣＤ８０、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４１）、Ｂ７−２（ＣＤ８６、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４２）で開示される配列を参照し得る。

本明細書中で使用される場合、ＥＣ_５０という用語は、最大効果の５０％に対する濃度、すなわち最大効果の５０％を引き起こす濃度を指す。

本明細書中で使用される場合、「抗体」という用語は、一般に２対のポリペプチド鎖（各対は「軽」（Ｌ）鎖および「重」（Ｈ）鎖を有する。）からなる免疫グロブリン分子を指す。抗体軽鎖は、κおよびλ軽鎖として分類され得る。重鎖はμ、δ、γ、αまたはεとして分類され得、抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして定められる。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域を介して連結され、重鎖は約３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をさらに含む。各重鎖は、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）からなる。重鎖定常領域は、３個のドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）および軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）からなる。軽鎖定常領域はＣ_Ｌドメインからなる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的な補体系（Ｃ１ｑ）の第一の構成成分を含め、宿主組織また因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、比較的保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域に散在する高い可変性を有する領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。）にさらに細かく分けられ得る。各Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端へと次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並んでいる、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなる。重鎖／軽鎖の各対の可変領域（Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ）は抗体結合部位をそれぞれ形成する。各領域またはドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３で提供される定義に従う。「抗体」という用語は、抗体を作製するための何らかの具体的な方法に限定されない。例えば、これは、特に、組み換え抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体であり得る。

本明細書中で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」という用語は、全長抗体により結合される抗原に特異的に結合し、および／または抗原への特異的な結合について全長抗体と競合する能力を保持する全長抗体の断片を含むポリペプチドを指す。これは、「抗原結合部分」とも呼ばれる。全般的には、全ての目的に対してその全体において参照により本明細書中に組み込まれる、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．ｅｄ．，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。抗体の抗原結合断片は、組み換えＤＮＡ技術またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断により作製され得る。いくつかの場合において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、１本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディおよび、ポリペプチドに特異的抗原結合能を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むこのようなポリペプチドを含む。

本明細書中で使用される場合、「Ｆｄ断片」という用語は、Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる抗体断片を指し；「Ｆｖ断片」という用語は、抗体のシングルアームのＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインからなる抗体断片を指し；「ｄＡｂ断片」という用語は、Ｖ_Ｈドメインからなる抗体断片を指し（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６（１９８９））；「Ｆａｂ断片」という用語は、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_ＬおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる抗体断片を指し；「Ｆ（ａｂ’）_２断片」という用語は、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を指す。

いくつかの場合において、抗体の抗原結合断片は、１本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）であり、ここでＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインは互いに対して、１価分子を形成させるために１本のポリペプチド鎖の生成を可能にするリンカーを介して対形成する（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（１９８８）を参照のこと。）。このようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ_２−Ｖ_Ｌ−リンカー−Ｖ_Ｈ−ＣＯＯＨまたはＮＨ_２−Ｖ_Ｈ−リンカー−Ｖ_Ｌ−ＣＯＯＨを有し得る。先行研究からの適切なリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはその変異体からなる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_４を有するリンカーを使用し得るが、その変異体も使用し得る（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８）。本発明において有用な他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５−７３１；Ｃｈｏｉら（２００１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４−１０６；Ｈｕら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１−５６およびＲｏｏｖｅｒｓら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌに記載されている。

いくつかの場合において、抗体の抗原結合断片は、ダイアボディ（２価抗体）であり、ここでＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは、単一ポリペプチド鎖上で発現される。しかし、利用されるリンカーは、短すぎて同じ鎖上の２個のドメインが互いに対形成できず、別の鎖上の相補的なドメインと対形成せざるを得ない。このようにして、２個の抗原結合部位が形成される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）およびＰｏｌｊａｋ Ｒ．Ｊ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３（１９９４）を参照のこと。）。

抗体の抗原結合断片（例えば上記の抗体断片）は、当業者にとって公知の従来技術（例えば、組み換えＤＮＡ技術または酵素的もしくは化学的切断法）を用いて、ある種の抗体（例えば本発明において提供されるモノクローナル抗体４Ｂ３、１３Ａ１０、１２Ｂ９または４Ｈ４）から得ることができ、インタクト抗体の場合と同じように特異性についてスクリーニングし得る。

本明細書中で、文脈において明らかに指定されない限り、「抗体」という用語について申し述べる場合、インタクトな抗体を含むだけでなく、抗体の抗原結合断片も含む。

本明細書中で使用される場合、「ｍＡｂ」または「モノクローナル抗体」という用語は、非常に均一な抗体分子の集団からの抗体または抗体断片を指し、すなわち、この集団を含む個々の抗体は、可能性のある天然の突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに非常に特異的である。モノクローナル抗体とは対照的に、ポリクローナル抗体調製物は、一般的には、抗原上の異なるエピトープを認識する少なくとも２つ以上の異なる抗体を含む。モノクローナル抗体は、一般に、最初にＫｏｈｌｅｒらにより記載されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５）を用いて得ることができるか、または組み換えＤＮＡ技術（例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照のこと。）を使用して得ることができる。

本明細書中で使用される場合、番号とともに述べられるモノクローナル抗体は、同じ番号の付いたハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体と同一である。例えば、モノクローナル抗体４Ｂ３（または１３Ａ１０、１２Ｂ９または４Ｈ４）は、ハイブリドーマ細胞株４Ｂ３（または１３Ａ１０、１２Ｂ９または４Ｈ４）またはそのサブクローンまたは子孫細胞から得られる抗体と同一である。

本明細書中で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、標的抗原への結合のための活性を保持する限り、軽鎖および／または重鎖の部分が（特定の種由来であり得るかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属し得る）抗体由来であり、一方で軽鎖および／または重鎖の別の部分が、（同一であるまたは異なる種由来であり得るか、または同一であるまたは異なる抗体クラスもしくはサブクラスに属し得る）別の抗体由来であるような抗体を指す（Ｃａｂｉｌｌｙらに対する米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。

本明細書中で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）の全てのまたは一部のＣＤＲを非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲで置き換えた後に得られる抗体または抗体断片を指し、ドナー抗体は、所望の特異性、親和性または反応性を有する非ヒト（例えばマウス、ラットまたはウサギ）抗体であり得る。さらに、レシピエント抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）の一部のアミノ酸残基は、抗体の性能をさらに向上させるかまたは最適化するために非ヒト抗体の対応するアミノ酸残基または他の抗体のアミノ酸残基で置き換えられ得る。ヒト化抗体に関するより詳細な説明については、例えばＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）；およびＣｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３９７−４０２（２０００）を参照のこと。

本明細書中で使用される場合、「中和抗体」は、標的ウイルスの病原性（例えば細胞に感染する能力）を取り除き得るかまたは顕著に低下させ得る、抗体または抗体断片を指す。

本明細書中で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体により特異的に結合される抗原上の部分（ｐｒａｔ）を指す。当技術分野において、「エピトープ」は「抗原決定基」とも呼ばれる。エピトープまたは抗原決定基は一般に、分子の化学的に活性のある表面基、例えばアミノ酸または炭水化物化合物または糖側鎖からなり、一般に特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。例えば、エピトープは一般に、別個の（ｄｉｓｔｉｎｃｅ）空間的な高次構造において、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続または非連続アミノ酸を含む。これは、「直鎖状」または「高次構造的」エピトープであり得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照のこと。直鎖状エピトープにおいて、タンパク質と相互作用分子（例えば抗体）との間の相互作用点は全て、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って一列に存在する。高次構造的エピトープにおいて、相互作用点は、互いから離れているタンパク質のアミノ酸残基にわたるように存在する。

本明細書中で使用される場合、「単離される」という用語は、人工的手段によってネイティブ状態から得られていることを意味する。「単離される」物質または構成成分が天然に生じる場合、その天然の環境が変化しているか、またはその物質が天然の環境から単離されているか、またはその両方であると考えられる。例えば、単離されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、インビボで生きている動物中に天然に存在し、このような天然の状態から単離される高純度の同一であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されている」ものとされる。「単離される」という用語は、人工的または合成物質との混合物を排除せず、物質の活性に影響を与えない他の不純物の存在を排除しない。

本明細書中で使用される場合、「Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系」という用語は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ステイン（ｓｔａｉｎ））およびベクターからなる発現系を意味し、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（株）は、例えば市販の株由来であるが、ＧＩ６９８、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）およびＢＬＲ（ＤＥ３）に限定されない。

本明細書中で使用される場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドが挿入され得る核酸保有ツールを指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、そのベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、ベクターにより保有される遺伝物質構成要素が宿主細胞で発現されるように、形質転換、形質導入または遺伝子移入によって宿主細胞に導入することができる。ベクターは、当業者にとって周知であり、プラスミド；ファージミド；コスミド；人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１−由来人工染色体（ＰＡＣ）；バクテリオファージ、例えばλファージまたはＭ１３ファージならびに動物ウイルスなどが含まれるが限定されない。ベクターとして使用し得る動物ウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む。）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えばＳＶ４０）が挙げられるが限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択構成要素およびレポーター遺伝子を含むが限定されない、発現を調節するためのいくつかの構成要素を含み得る。さらに、ベクターは、複製開始部位も含み得る。

本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクターの導入のために使用し得る細胞を指し、原核細胞、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など、真菌細胞、例えば酵母細胞またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）など、昆虫細胞、例えばＳ２ショウジョウバエ細胞もしくはＳｆ９など、または動物細胞、例えば線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはヒト細胞が含まれるが限定されない。

本明細書中で使用される場合、「同一性」という用語は、２つのポリペプチド間または２つの核酸間で一致する配列を述べるために使用される。比較した２つの配列における対応する位置に同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットが存在する場合（例えば、２つのＤＮＡ分子における対応する位置に両方ともアデニンが存在するか、または２つのポリペプチドにおける対応する位置に両方ともリジンが存在する場合）、これらの分子はその位置で同一である。２つの配列間の「パーセント同一性」は、これらの２つの配列が共有する、一致する位置の数を比較した位置の数で除して１００をかけた関数である。例えば、２つの配列の１０カ所の位置のうち６カ所が一致する場合、これらの２つの配列は６０％同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴおよびＣＡＧＧＴＴは、５０％同一性を共有する（全体で６カ所のうち３カ所が一致する。）。一般に、アライメント後に２つの配列を比較して、同一性が最大になるようにする。例えば、このようなアライメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の方法により、コンピュータプログラム、例えばＡｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて都合よく達成され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定するために、ＰＡＭ１２０ウエイトレジデューテーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））を使用し得る。さらに、ＧＣＧパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれるＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクス、ギャップウェイト（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さウェイト（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５または６を用いて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定するために使用し得る。

本明細書中で使用される場合、「保存的置換」という用語は、不都合な影響を及ぼさないかまたはそのアミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの必須の特性を変更しないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、当技術分野で公知の標準的技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在型突然変異誘発などにより導入し得る。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基、例えば、物理または機能について対応するアミノ酸残基（例えば、同様のサイズ、形態、電荷、共有結合または水素結合の形成能を含む化学的特性などを有する。）と同様の残基で置換されるものが挙げられる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインおよびトリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニンおよびメチオニン）、ベータ−分岐状側鎖（例えばスレオニン、バリンおよびイソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、対応するアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換することが好ましい。アミノ酸保存的置換を同定する方法は当技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書中に組み込まれる、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３２：１１８０−１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：４１２−４１７（１９９７）を参照のこと）。

本明細書中で使用される場合、「免疫原性」という用語は、特異的な抗体を産生させるために、またはリンパ球を感作するために身体を刺激する能力を指す。これは、免疫細胞の、活性化、増殖および分化ならびに最終的には抗体などの免疫エフェクター物質の産生を誘導するために特異的な免疫細胞を刺激し得、リンパ球を感作し得る抗原の特性を指すだけでなく、抗原による身体の刺激後に、抗体を産生させるかまたはＴリンパ球を感作するための、身体の免疫系による特異的な免疫反応も指す。免疫原性は、抗原の最も重要な特性である。抗原が宿主における免疫反応の誘導に成功し得るか否かは、３つの要因：抗原の性質、宿主の反応性および免疫付与方式に依存する。

本明細書中で使用される場合、「特異的な結合」という用語は、２つの分子間の非無作為結合反応、例えば抗体とその標的抗原との間の反応などを指す。いくつかの実施形態において、抗原に特異的に結合する抗体（または抗原に特異的な抗体）は、抗体が約１０^−５Ｍ未満、例えば約１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ以下の親和性（Ｋ_Ｄ）で抗原に結合することを意味する。

本明細書中で使用される場合、「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指し、これは、抗体と抗原との間の結合親和性を述べるために使用される。平衡解離定数が小さいほど、抗体−抗原結合が堅固であり、抗体と抗原との間の親和性が高い。一般に、抗体（例えば、本発明のモノクローナル抗体４Ｂ３、１３Ａ１０、１２Ｂ９または４Ｈ４）は、ＢＩＡＣＯＲＥ機器上で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して決定した場合、約１０^−５Ｍ未満、例えば約１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ以下の解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）で抗原（例えばＬ１タンパク質）と結合する。

本明細書中で使用される場合、「モノクローナル抗体」および「ｍＡｂ」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用され得る。また、「ポリクローナル抗体」および「ｐＡｂ」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用され得る。また、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用され得る。さらに、本発明において、アミノ酸は一般に、当技術分野で周知の、１文字または３文字略号により表される。例えば、アラニンはＡまたはＡｌａで表し得る。

本明細書中で使用される場合、「ハイブリドーマ」および「ハイブリドーマ細胞株」という用語は、交換可能に使用され得る。さらに、「ハイブリドーマ」または「ハイブリドーマ細胞株」という用語について申し述べる場合、これは、ハイブリドーマのサブクローンおよび子孫細胞も含む。例えば、ハイブリドーマ細胞株４Ｂ３について申し述べる場合、これは、ハイブリドーマ細胞株４Ｂ３のサブクローンおよび子孫細胞も含む。

本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容可能なベクターおよび／または賦形剤」という用語は、薬理学および／または生理学において対象および活性のある構成要素に適合するベクターおよび／または賦形剤を指し、これらは当技術分野で周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ編，１９ｔｈ ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５を参照のこと。）、これらには、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度促進剤が含まれるが限定されない。例えば、ｐＨ調整剤としてはリン酸緩衝液が挙げられるが限定されず；界面活性剤としては陽イオン性、陰イオン性または非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ−８０が挙げられるが限定されず；イオン強度促進剤としては塩化ナトリウムが挙げられるが限定されない。

本明細書中で使用される場合、「アジュバント」という用語は、非特異的な免疫促進剤を指し、これは、抗原に対する身体の免疫反応を促進し得るかまたは抗原と一緒にもしくは身体に予め送達される場合、免疫反応のタイプを変化させ得る。アルミニウムアジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、リポ多糖類、サイトカインなどを含むが限定されない多くのアジュバントがある。フロイントアジュバントは、現在のところ動物試験において最も一般的に使用されるものであり、水酸化アルミニウムは臨床実験で広く使用されるものである。

本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の効果を達成するかまたは少なくとも一部達成するのに十分な量を指す。例えば、疾患（例えば、Ｂ７へのＣＴＬＡ４の過剰な結合またはＣＴＬＡ４活性が関連する疾患、例えば腫瘍など）に対する予防的有効量は、疾患（例えば、Ｂ７へのＣＴＬＡ４の過剰な結合またはＣＴＬＡ４活性が関連する疾患、例えば腫瘍など）の発症を防ぐか、抑止するかまたは遅延させるのに十分である量を指し；疾患に対する治療的有効量は、疾患に罹患している患者において疾患およびその合併症を治癒させるか少なくとも部分的に抑止するのに十分な量を指す。このような有効量を決定することは十分に当業者の技術の範囲内である。例えば、治療的有効量は、処置しようとする疾患の重症度、患者の免疫系の全般的状況、患者の全般的状況、例えば年齢、体重および性別、薬剤の投与形式、同時に行われる他の治療などに依存する。

本発明のモノクローナル抗体８Ｄ２およびそのヒト化抗体は、ＣＴＬＡ４と非常によく特異的に結合し得る。中でも、抗体８Ｄ２および８Ｄ２（Ｒｅ）は、対照抗体１０Ｄ１（Ａｌａｎ Ｊ．Ｋｏｒｍａｎ，Ｅｄｗａｒｄ Ｌ．Ｈａｌｋら、ＨＵＭＡＮ ＣＴＬＡ−４ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、米国特許第６９８４７２０号明細書）および１１．２．１（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｈａｎｓｏｎ，Ｍａｒｋ Ｊｏｓｅｐｈ Ｎｅｖｅｕら、Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ＣＴＬＡ−４、米国特許第６８２７３６号明細書）よりも良好な結合効率でマウスＣＴＬＡ４抗原に結合する。ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１は、対照抗体１０Ｄ１よりも良好で、１１．２．１に匹敵する結合効率でマウスＣＴＬＡ４抗原に結合する。ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ２Ｌ２は、１０Ｄ１に匹敵する結合効率でヒトＣＴＬＡ４抗原に結合する。ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ２Ｌ２および８Ｄ２Ｈ３Ｌ３は、１０Ｄ１に匹敵する結合効率でサルＣＴＬＡ４抗原に結合する。抗体８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７は、対照抗体１０Ｄ１および１１．２．１よりも良好な結合効率でヒトＣＴＬＡ４抗原に結合する。

抗体８Ｄ２、８Ｄ２（Ｒｅ）および８Ｄ２ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７は、抗原ＣＴＬＡ４への結合についてＢ７と競合し得る。中でも、８Ｄ２、８Ｄ２（Ｒｅ）、８Ｄ２Ｈ１Ｌ１および８Ｄ２Ｈ２Ｌ２は、ＣＴＬＡ４への結合についてのＢ７−２との競合において１０Ｄ１よりも強力であり；８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７は、全て、ＣＴＬＡ４への結合についてのＢ７−１およびＢ７−２との競合において抗体１０Ｄ１および１１．２．１よりも強力である。

本発明のモノクローナル抗体８Ｄ２およびそのヒト化抗体は、Ｂ７へのＣＬＴＡ４の結合を阻止し得、具体的には、ＣＴＬＡ４による身体上の免疫抑制を緩和し、非常に効率的にＴリンパ球を活性化する。中でも、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５は、Ｔリンパ球を活性化することにおいて、対照抗体１０Ｄ１および１１．２．１よりも強力である。

ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。４つのレーンでの試料およびそれらのローディング量は、左から右へ、次のとおりであった：Ｍ、マーカー、１０μＬ；ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ融合タンパク質、１μｇ；ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ融合タンパク質、２μｇ；ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ融合タンパク質、３μｇ。 ８Ｄ２抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。４つのレーンでの試料およびそれらのローディング量は、左から右へ、次のとおりであった：Ｍ、マーカー、１０μＬ；タンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、０．３μｇ；タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液、２μＬ；タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、０．３μｇ。 ８Ｄ２組み換え抗体（８Ｄ２（Ｒｅ））のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。４つのレーンでの試料およびそれらのローディング量は、左から右へ、次のとおりであった：Ｍ、マーカー、１０μＬ；タンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、１μｇ；タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液、２μＬ；タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、１μｇ。 ８Ｄ２、８Ｄ２Ｈ１Ｌ１のヒト化抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。４つのレーンでの試料およびそれらのローディング量は、左から右へ、次のとおりであった：Ｍ、マーカー、１０μＬ；タンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、１μｇ；タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液、２μＬ；タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、１μｇ。 ８Ｄ２、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２のヒト化抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。４つのレーンでの試料およびそれらのローディング量は、左から右へ、次のとおりであった：Ｍ、マーカー、１０μＬ；タンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、１μｇ；タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液、２μＬ；タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、１μｇ。 ８Ｄ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３のヒト化抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。４つのレーンでの試料およびそれらのローディング量は、左から右へ、次のとおりであった：Ｍ、マーカー、１０μＬ；タンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、１μｇ；タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液、２μＬ；タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、１μｇ。 ８Ｄ２、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５のヒト化抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。試料およびそれらのローディング量は、次のとおりであった：Ｍ、マーカー、１０μＬ；タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、１μｇ；タンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、１μｇ。 ８Ｄ２、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７のヒト化抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。試料およびそれらのローディング量は、次のとおりであった：Ｍ、マーカー、１０μＬ；タンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、１μｇ；タンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液中の抗体試料、１μｇ。 ｍＡｂ８Ｄ２の動的特性パラメーター決定の結果。 ８Ｄ２Ｈ１Ｌ１の動的特性パラメーター決定の結果。 ８Ｄ２Ｈ２Ｌ２の動的特性パラメーター決定の結果。 ８Ｄ２Ｈ３Ｌ３の動的特性パラメーター決定の結果。 ８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５の動的特性パラメーター決定の結果。 ８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７の動的特性パラメーター決定の結果。 フローサイトメトリーを使用して検出した場合の、非標識２９３Ｆ細胞、アイソタイプ対照および２９３Ｆ−ＣＴＬＡ４細胞における、ＣＴＬＡ４の発現を示すヒストグラム（細胞数−蛍光（ＦＩＴＣ））。 フローサイトメトリーを使用して検出した場合の、非標識２９３Ｆ細胞、アイソタイプ対照および２９３Ｆ−ＣＴＬＡ４細胞における、ＣＴＬＡ４の発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。 標識２９３Ｆ−ＣＴＬＡ４細胞に対するｍＡｂ８Ｄ２の結合のＥＣ_５０の結果。 標識２９３Ｆ−ＣＴＬＡ４細胞に対する８Ｄ２（Ｒｅ）抗体の結合のＥＣ_５０の結果。 標識２９３Ｆ−ＣＴＬＡ４細胞に対する８Ｄ２Ｈ１Ｌ１の結合のＥＣ_５０の結果。 標識２９３Ｆ−ＣＴＬＡ４細胞に対する８Ｄ２Ｈ２Ｌ２の結合のＥＣ_５０の結果。 標識２９３Ｆ−ＣＴＬＡ４細胞に対する８Ｄ２Ｈ３Ｌ３の結合のＥＣ_５０の結果。 ＥＬＩＳＡ法を用いたＣＴＬＡ４への抗体８Ｄ２、８Ｄ２Ｈ１Ｌ１および８Ｄ２（Ｒｅ）の結合の判定。 ＥＬＩＳＡ法を用いたヒトＣＴＬＡ４への組み換え抗体８Ｄ２Ｈ２Ｌ２および８Ｄ２Ｈ３Ｌ３の結合の判定。 ＥＬＩＳＡ法を用いたサルＣＴＬＡ４への組み換え抗体８Ｄ２Ｈ２Ｌ２および８Ｄ２Ｈ３Ｌ３の結合の判定。 ＥＬＩＳＡ法を用いたサルＣＴＬＡ４への組み換え抗体８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７の結合の判定。 Ｂ７−１との抗体８Ｄ２、８Ｄ２Ｈ１Ｌ１および８Ｄ２（Ｒｅ）の競合に対するＥＬＩＳＡの結果。 Ｂ７−２との抗体８Ｄ２、８Ｄ２Ｈ１Ｌ１および８Ｄ２（Ｒｅ）の競合に対するＥＬＩＳＡの結果。 Ｂ７−１との８Ｄ２Ｈ２Ｌ２および８Ｄ２Ｈ３Ｌ３抗体の競合に対するＥＬＩＳＡの結果。 Ｂ７−２との８Ｄ２Ｈ２Ｌ２および８Ｄ２Ｈ３Ｌ３抗体の競合に対するＥＬＩＳＡの結果。 Ｂ７−１との８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７抗体の競合に対するＥＬＩＳＡの結果。 Ｂ７−２との８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７抗体の競合に対するＥＬＩＳＡの結果。 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、Ｒａｊｉ細胞およびそれぞれヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２または８Ｄ２Ｈ３Ｌ３との７２時間の同時培養後の、ＥＬＩＳＡ法により検出した場合のＴリンパ球によるＩＬ−２分泌レベルに対する効果。結果から、ｍＡｂ８Ｄ２のヒト化抗体が、ＣＴＬＡ４の受容体を妨害することによって、Ｔリンパ球によるＩＬ−２分泌を増加させたことが示される。 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、Ｒａｊｉ細胞およびそれぞれヒト化抗体８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５または８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７との７２時間の同時培養後の、ＥＬＩＳＡ法により検出した場合のＴリンパ球によるＩＬ−２分泌レベルに対する効果。結果から、ｍＡｂ８Ｄ２のヒト化抗体が、ＣＴＬＡ４の受容体を妨害することによって、Ｔリンパ球によるＩＬ−２分泌を増加させたことが示される。 ８Ｄ２Ｈ２Ｌ２で処置したｈｕ−ＳＣＩＤ−ｒａｊｉモデルにおける皮下移植腫瘍の増殖曲線。

以下で実施例を参照して本発明の実施形態を詳述する。当業者は、次の実施例が単に本発明を例示するために提供されることを理解しよう。これらは、何であれ、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきものではない。具体的な技術または条件が記載されない実施例は、当技術分野の文献で開示される技術または条件を使用して（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｐｅｉｔａｎｇ ＨＵＡＮＧら訳、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ）、または製品とともに提供される説明書に従い、行った。供給者が示されていない試薬および機器は、市販の従来製品である。

本発明の次の実施例において、ＢＡＬＢ／Ｃマウスは、Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒから購入した。

本発明の次の実施例において、使用したＴ細胞は、Ａｋｅｓｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ．，Ｚｈｏｎｇｓｈａｎから入手した。

対照抗体、１０Ｄ１は米国特許第６９８４７２０号明細書に従い調製し；１１．２．１は米国特許第６６８２７３６号明細書に従い調製した。

［実施例１］ＣＴＬＡ４−８Ｄ２ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００１の作製およびモノクローナル抗体８Ｄ２の調製
抗原としてマウスに免疫付与するために、哺乳動物細胞発現系において、組み換えＣＴＬＡ４を発現させ、マウス脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させることによってハイブリドーマ細胞を得た。多数の試料をスクリーニングした後、ハイブリドーマ細胞株（ＣＴＬＡ４−８Ｄ２ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００１）を得た。前記の細胞株は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合するモノクローナル抗体８Ｄ２を分泌し得た。具体的な方法を以下に記載する。

１．ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ遺伝子の合成
設計（配列番号３）に従い、ＣＴＬＡ４遺伝子（細胞傷害性Ｔ−リンパ球抗原４、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１４９３、配列番号１）の細胞外断片（ＣＴＬＡ４ＥＣＤ）に対応するアミノ酸配列（配列番号２）をマウスＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃ）に融合させたが、ｍＦｃは、配列番号３の下線部により示されるようなアミノ酸配列を有するマウスＩｇＧのＦｃタンパク質断片を指す。

２９３ｆ細胞発現系における関心のある遺伝子の発現効率を上昇させるために、コドン選択性、ＧＣ含量、ｍＲＮＡの二次構造および反復配列などを主に考慮して、配列番号３タンパク質配列をコードする核酸配列をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏ．で最適化した。ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ融合タンパク質をコードする最終的な最適化遺伝子は次の配列（配列番号４）を有し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏ．で合成された。

ＣＴＬＡ４ＥＣＤ遺伝子の配列（３７５ｂｐ）：

ＣＴＬＡ４ＥＣＤによりコードされるタンパク質の配列（１２５ａａ）：

ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ融合タンパク質の配列（３６４ａａ）：
ここで、ＣＴＬＡ４ＥＣＤ部分に波線を付し、ｍＦｃ部分に実線を付す。

ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ融合タンパク質に対応する遺伝子のコード配列（１０９２ｂｐ）：
ここで、ＣＴＬＡ４ＥＣＤ部分に波線を付し、ｍＦｃ部分に実線を付す。

２．ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃプラスミドの作製
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏ．でｐＵＣ５７ ｓｉｍｐｌｅ発現ベクター（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏ．より提供）への合成ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ融合遺伝子（配列番号４）のクローニングが行われ、その結果、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃプラスミドが得られた。

３．ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ組み換えプラスミドの構築
エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃプラスミドを消化した。電気泳動を介してＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ融合遺伝子断片を回収し、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．より購入）に連結させた。得られたｐｃＤＮＡ３．１−ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃプラスミドを使用して、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＨ５ａ株のコンピーテント細胞（ＴＩＡＮＧＥＮ Ｃｏ．より購入）に遺伝子移入した。説明書に従って、遺伝子移入および培養を行った。ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃについて陽性のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーをスクリーニングして選び出し、従来法に従い増殖させた。次いで、キット（Ｔｉａｎｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．ＬＴＤ，ＤＰ１０３−０３より購入）を使用して、キットとともに提供される説明書に従い、ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ組み換えプラスミドを抽出した。

４．リポフェクタミン遺伝子移入キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．より購入）を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ組み換えプラスミドを用いて２９３Ｆの細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．より購入）に遺伝子移入した。

５．２９３Ｆ細胞にｐｃＤＮＡ３．１−ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ組み換えプラスミドを用いて遺伝子移入してから７日後、高速遠心、細孔フィルター膜を通じた真空ろ過およびＨｉＴｒａｐプロテインＡ ＨＰカラムクロマトグラフィーによって、ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ融合タンパク質を培養液から精製した。精製後、試料を採取し、タンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液に添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって試験した。図１で示されるように、関心のあるタンパク質は、約４５ｋＤのバンドとして示される。

６．ＣＴＬＡ４−８Ｄ２ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００１の作製
確立された方法（例えば、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ中の、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｓ．Ｊ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｅｄｓ．Ｇ．Ｃ．ＨｏｗａｒｄおよびＤ．Ｒ．Ｂｅｔｈｅｌｌ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２０００）に従い、抗原としてＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃ融合タンパク質を用いて、免疫付与ＢＡＬＢ／Ｃマウス（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒより購入）からの脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させることによって、ハイブリドーマ細胞を得た。

ＥＬＩＳＡプレートを被覆するために抗原としてＣＴＬＡ４を使用し、間接的ＥＬＩＳＡスクリーニングによって、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する新規抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を得た。競合ＥＬＩＳＡスクリーニングによって、間接的ＥＬＩＳＡスクリーニングで得られたハイブリドーマ細胞から、ＣＴＬＡ４への結合についてリガンドＢ７−１（ＣＤ８０、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：９４１）またはＢ７−２（ＣＤ８６、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：９４２）と競合したモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を得た。限界希釈を介して、安定したハイブリドーマ細胞株を得た。このハイブリドーマ細胞株はＣＴＬＡ４−８Ｄ２ハイブリドーマ細胞株と名付け、限界希釈を介してＣＴＬＡ４−８Ｄ２安定細胞株を得た（本発明においてＬＴ００１とも呼ぶ；これにより分泌されるモノクローナル抗体を８Ｄ２と名付けた。）。

７．抗体８Ｇ２の調製
１０％低ＩｇＧのウシ胎仔血清を補給した培地中で本発明のＣＴＬＡ４−８Ｄ２（ＬＴ００１）細胞株を培養した。７日後、抗体８Ｄ２を精製するために、細胞培養の上清を回収した。

８．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる８Ｄ２抗体の検出
精製試料をタンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液およびタンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液に添加した。沸騰後、検出を行った。この結果から、関心のあるタンパク質が、還元性タンパク質試料の場合は約５０ｋＤおよび２５ｋＤの２本のバンドとして、または、非還元性タンパク質試料の場合は約１５０ｋＤのバンドとして示されることが分かる（図２）。

［実施例２］モノクローナル抗体８Ｄ２の軽鎖および重鎖配列の決定
培養細胞／細菌Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｉａｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＰ４３０）の説明書に従い、実施例１で作製したＣＴＬＡ４−８Ｄ２ハイブリドーマ細胞株（ＬＴ００１細胞）からｍＲＮＡを抽出した。

ＲＴ−ＰＣＲキット用のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍの説明書に従い、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲにより増幅させた。ｐＥＡＳＹ−Ｔ１ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴｒａｎｓＧｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＴ１０１）の説明書に従い、ＰＣＲ増幅産物をすぐにＴＡクローニングに供した。ＴＡクローニングの産物をすぐに配列決定に供し、配列決定の結果を以下で提供する。

重鎖可変領域のＤＮＡ配列決定の結果（３４５ｂｐ）：

それによりコードされるタンパク質配列（１１５ａａ）：

軽鎖可変領域のＤＮＡ配列決定の結果（３１８ｂｐ）：

それによりコードされるタンパク質配列（１０６ａａ）：

［実施例３］ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７の軽鎖および重鎖配列の設計
ＣＴＬＡ４タンパク質の三次元結晶構造（Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）４，ｐ．５２７）および実施例２で得られた８Ｄ２抗体の配列に基づき、コンピュータ上で抗体の構造をモデル化した。抗体配列および構造モデル（抗体の定常領域配列はＮＣＢＩデータベース由来）に基づいて、抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７の可変領域配列を設計した。可変領域配列を以下で提供する。

１．モノクローナル抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１の軽鎖および重鎖配列
重鎖可変領域のＤＮＡ配列（３４５ｂｐ）：

それによりコードされるタンパク質配列（１１５ａａ）：

軽鎖可変領域のＤＮＡ配列（３２１ｂｐ）：

それによりコードされるタンパク質配列（１０７ａａ）：

２．８Ｄ２ヒト化モノクローナル抗体８Ｄ２Ｈ２Ｌ２の軽鎖および重鎖配列
重鎖可変領域のＤＮＡ配列（３４５ｂｐ）：

それによりコードされるタンパク質配列（１１５ａａ）：

軽鎖可変領域のＤＮＡ配列（３２１ｂｐ）：

それによりコードされるタンパク質配列（１０７ａａ）：

３．８Ｄ２ヒト化モノクローナル抗体８Ｄ２Ｈ３Ｌ３の軽鎖および重鎖配列
重鎖可変領域のＤＮＡ配列（３４５ｂｐ）：

それによりコードされるタンパク質配列（１１５ａａ）：

軽鎖可変領域のＤＮＡ配列（３２１ｂｐ）：

それによりコードされるタンパク質配列（１０７ａａ）：

４．８Ｄ２ヒト化モノクローナル抗体８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５の軽鎖および重鎖配列
重鎖可変領域のＤＮＡ配列（３４５ｂｐ）：

それによりコードされるタンパク質配列（１１５ａａ）：

軽鎖可変領域のＤＮＡ配列（３２１ｂｐ）：

それによりコードされるタンパク質配列（１０７ａａ）：

５．８Ｄ２ヒト化モノクローナル抗体８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７の軽鎖および重鎖配列
重鎖可変領域のＤＮＡ配列（３４５ｂｐ）：

それによりコードされるタンパク質配列（１１５ａａ）：

軽鎖可変領域のＤＮＡ配列（３２１ｂｐ）：

それによりコードされるタンパク質配列（１０７ａａ）：

［実施例４］８Ｄ２組み換え抗体、８Ｄ２（Ｒｅ）および８Ｄ２ヒト化抗体、８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ３、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７の調製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる検出
１．８Ｄ２組み換え抗体、８Ｄ２（Ｒｅ）の調製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる検出
８Ｄ２の、重鎖のｃＤＮＡ配列（その可変領域配列は配列番号５で示す。）および軽鎖のｃＤＮＡ配列（その可変領域配列は配列番号７で示す。）をｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅベクター（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏ．により提供）にそれぞれクローニングし、その結果、プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−８Ｄ２ＨおよびｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−８Ｄ２Ｌを得た。

プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−８Ｄ２ＨおよびｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−８Ｄ２Ｌをエンドヌクレアーゼ（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ）でそれぞれ消化した。電気泳動を介して回収した重鎖および軽鎖をコードする断片を個別にｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングした。組み換えプラスミドを抽出し、２９３Ｆの細胞に同時遺伝子移入した。細胞培養７日後、培養液を高速遠心、細孔フィルター膜を通じた真空ろ過およびＨｉＴｒａｐプロテインＡ ＨＰカラム上での精製に供した。精製試料をタンパク質電気泳動用の還元性ローディング緩衝液およびタンパク質電気泳動用の非還元性ローディング緩衝液に添加した。沸騰後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出を行った。図３で示されるように、関心のあるタンパク質が、還元性タンパク質試料の場合は約５０ｋＤおよび２５ｋＤの２本のバンドとして、または、非還元性タンパク質試料の場合は約１５０ｋＤのバンドとして示されることが分かる。

２．８Ｄ２ヒト化抗体、８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２および８Ｄ２Ｈ３Ｌ３の調製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる検出
８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７の、重鎖のｃＤＮＡ配列（それらの可変領域配列は、それぞれ配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１３、配列番号１３で示される。）および軽鎖のｃＤＮＡ配列（それらの可変領域配列は、それぞれ配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３で示される。）をｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅベクター（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏ．により提供）にそれぞれクローニングし、その結果、プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５およびｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７を得た。８Ｄ２（Ｒｅ）に対する上記の手順に従い、これらを個別にｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングした。

組み換えプラスミドを２９３Ｆの細胞に遺伝子移入した。８Ｄ２（Ｒｅ）に対する上記の手順に従い精製した後、２９３Ｆ細胞の培養液を検出に供した。結果は、図４、図５、図６、図７および図８で示す。還元性タンパク質試料は、約５０ｋＤおよび２５ｋＤの２本のバンドとして関心のあるタンパク質を示し、非還元性タンパク質試料は、約１５０ｋＤのバンドとして関心のあるタンパク質を示した。

この実施例に記載の手順に従い、次の実施例で使用する８Ｄ２組み換え抗体、８Ｄ２（Ｒｅ）および８Ｄ２ヒト化抗体、８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ３、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７を調製した。

［実施例５］抗体の動的パラメーターの決定
Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子相互作用分析装置を使用して、抗原ＣＴＬＡ４（配列番号２５で示されるようなコード核酸配列および配列番号２６で示されるようなコードされるアミノ酸配列を有する、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１４９３）に対する抗体８Ｄ２およびヒト化８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２および８Ｄ２Ｈ３Ｌ３の結合の動的パラメーターを決定した。

１．ＣＴＬＡ４−ｍＦｃタンパク質（ＣＴＬＡ４ＥＣＤ−ｍＦｃの合成について実施例１に記載のものと同じ方法に従い、ＣＴＬＡ４−ｍＦｃを作製した。）をＴＥＶプロテアーゼで切断し、カラム上での精製によってＣＴＬＡ４抗原を得た。

ＣＴＬＡ４遺伝子の配列（６３６ｂｐ）：

コードされる対応するアミノ酸配列（２１２ａａ）：

２．アミノカップリングにより、ＡＲ２Ｇセンサーの表面上に、抗体８Ｄ２およびそのヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７を固定し、エタノールアミンでブロッキングした。ＰＢＳＴ中での平衡化後、結合のためにＣＴＬＡ４抗原を添加した。ＣＴＬＡ４をＰＢＳＴ中で連続２ｘ希釈し、次の濃度：３００、１５０、７５、３７．５、１８．７５、９．３８、４．６９、０ｎＭを得た。ＰＢＳＴ中で解離が起こった。８Ｄ２と同じ方法によって、ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３、Ｈ２Ｌ１５およびＨ２Ｌ１７を検出し、抗原濃度は、１８０、９０、４５、２２．５、１１．２５、５．６２５、２．８１３、０ｎＭであった。

抗体８Ｄ２およびそのヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７の動的パラメーターを表１で提供し、動的特性パラメーターを決定した結果は、それぞれ図９から１４で示す。

結果から、６種類の抗体の全てが抗原に対して良好な親和性を有し、対照抗体１０Ｄ１および１１．２．１に匹敵するかまたはこれよりさらに優れていることが明らかになる。

［実施例６］フローサイトメトリーによる、ハイブリドーマ細胞株の表面上の抗原ＣＴＬＡ４に結合するための抗体の活性の判定
最初に、ＣＴＬＡ４抗原を発現する２９３Ｆ宿主細胞を作製し、それぞれ本発明において調製した、モノクローナル抗体８Ｄ２（実施例１）および８Ｄ２（Ｒｅ）および８Ｄ２ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２および８Ｄ２Ｈ３Ｌ３（実施例４）で標識した。次いで、フローサイトメトリーにより、細胞表面上のネイティブ高次構造を有する抗原への抗体の特異的結合能を確認した。

具体的な段階を以下で提供する。

１．ＣＴＬＡ４抗原を発現する２９３Ｆ宿主細胞の作製
リポフェクタミン遺伝子移入キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．より購入）を使用して、ＣＴＬＡ４に対するプラスミドｐＬｅｎｔｉ６．３−ＣＴＬＡ４（ベクターｐＬｅｎｔｉ６．３はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．より購入）を用いて２９３Ｆの細胞に遺伝子移入した。スクリーニング後、ＣＴＬＡ４（２９３Ｆ−ＣＴＬＡ４）を安定に発現する細胞のクローン集団（２９３Ｆ−ＣＴＬＡ４）を得た。

２．抗体での標識およびフローサイトメーターを用いた検出
従来法に従い、上記段階により得られたＣＴＬＡ４抗原を発現する２９３Ｆ宿主細胞をトリプシンで消化し、２×１０^５個の細胞を各回収チューブに添加した。１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中の８Ｄ２抗体の希釈溶液を調製して、それぞれ２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭおよび０ｎＭの濃度を得た。ＣＴＬＡ４を発現する２９３Ｆ細胞との氷上での２時間の温置後、１００μＬのＦＩＴＣ−ヤギ−抗マウスＩｇＧ（１：５００）を各チューブに添加し、このチューブを氷上で１時間温置した。３００μＬ ＰＢＳの添加後、フローサイトメーター上でＦＩＴＣチャネルを用いて蛍光シグナルを検出した。他の抗体を８Ｄ２抗体に対するものと同様の方法で検出した。

３．結果
２９３Ｆ−ＣＴＬＡ４細胞上でのＣＴＬＡ４の発現を確認した結果を図１５および図１６でそれぞれ示す。２９３Ｆ細胞に対する抗体８Ｄ２、８Ｄ２（Ｒｅ）および３種類のヒト化抗体の結合の結果を図１７から２１でそれぞれ示す。これらの図で示されるように、８Ｄ２抗体およびそのヒト化抗体は、２９３Ｆ宿主細胞の表面上でＣＴＬＡ４標的タンパク質に効率的に結合し得、それらの結合効率は用量依存性である。各用量での蛍光強度を表２で提供する。

結合した抗体８Ｄ２およびそのヒト化抗体の蛍光定量分析での曲線シミュレーションによって８Ｄ２およびそのヒト化抗体の、結合効率、ＥＣ_５０を得たが、それを表３で示す。

結果から、抗体８Ｄ２、８Ｄ２（Ｒｅ）および８Ｄ２ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２および８Ｄ２Ｈ３Ｌ３が全て、２９３Ｆ−ＣＴＬＡ４宿主細胞の表面上のＣＴＬＡ４抗原に結合する、非常に強い能力があることが明らかになる。

［実施例７］ＥＬＩＳＡによる、ＣＴＬＡ４抗原に結合するための抗体の活性の判定
４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレートをＣＴＬＡ４で被覆した。３７℃で２時間、１％ＢＳＡでブロッキングした後、ＣＴＬＡ４抗体８Ｄ２、８Ｄ２（Ｒｅ）および８Ｄ２ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７および対照抗体１０Ｄ１（Ａｌａｎ Ｊ．Ｋｏｒｍａｎ，Ｅｄｗａｒｄ Ｌ．Ｈａｌｋら、ＨＵＭＡＮ ＣＴＬＡ−４ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，米国特許第６９８４７２０号明細書）および１１．２．１（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｈａｎｓｏｎ，Ｍａｒｋ Ｊｏｓｅｐｈ Ｎｅｖｅｕら、Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ＣＴＬＡ−４，米国特許第６８２７３６号明細書）を３０分にわたる反応のために添加した。酵素複合二次抗体を３０分にわたる温置のために添加した。次いで、ＥＬＩＳＡプレートリーダー上で４５０ｎｍでの吸収を決定した。

ＣＴＬＡ４抗原に対する８Ｄ２抗体およびそのヒト化抗体の結合を検出した結果は図２２から２５でそれぞれ示す。これらの図で示されるように、抗体８Ｄ２、８Ｄ２（Ｒｅ）および８Ｄ２ヒト化抗体は全て、ＣＴＬＡ４タンパク質に効率的に結合し得、それらの結合効率は用量依存性である。各用量での蛍光強度を表４から８で提供する。結合した８Ｄ２、８Ｄ２（Ｒｅ）およびヒト化抗体の蛍光定量分析での曲線シミュレーションによって、８Ｄ２、８Ｄ２（Ｒｅ）およびヒト化抗体の、結合効率、ＥＣ_５０を得た（表９）。

上記の結果から、抗体８Ｄ２および８Ｄ２（Ｒｅ）が対照抗体１０Ｄ１および１１．２．１よりも良好な効率でマウスＣＴＬＡ４抗原に結合することが明らかになる。ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１は、対照抗体１０Ｄ１よりも強く、１１．２．１と匹敵する効率でマウスＣＴＬＡ４抗原と結合する。

ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ２Ｌ２は、１０Ｄ１に匹敵する効率でヒトＣＴＬＡ４抗原に結合する。ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ２Ｌ２および８Ｄ２Ｈ３Ｌ３は、１０Ｄ１に匹敵する効率でサルＣＴＬＡ４抗原に結合する。ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７は、対照抗体１０Ｄ１および１１．２．１よりも顕著に強い効率でヒトＣＴＬＡ４抗原と結合する。

［実施例８］競合的ＥＬＩＳＡによる、ＣＴＬＡ４抗原に対する結合についてＢ７−１／２と競合するための抗体の活性の検出
１．ＥＬＩＳＡによる、ＣＴＬＡ４抗原に対する結合についてＢ７−１と競合するための抗体の活性の検出
４℃で一晩、Ｂ７−１でＥＬＩＳＡプレートを被覆した。１％ＢＳＡで３７℃にて２時間ブロッキングした後、抗ＣＴＬＡ４抗体、すなわちモノクローナル抗体８Ｄ２および８Ｄ２（Ｒｅ）および８Ｄ２ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７ならびに対照抗体１０Ｄ１および１１．２．１を添加した。１０分間温置した後、ＣＴＬＡ４−ｍＦｃを添加した。３７℃で４０分間温置した後、酵素複合二次抗体を添加した。３７℃で３０分間温置した後、ＥＬＩＳＡプレートリーダー上で４５０ｎｍでの吸収を検出した。

２．ＥＬＩＳＡによる、ＣＴＬＡ４抗原に対する結合についてＢ７−２と競合するための抗体の活性の検出
４℃で一晩、ＣＴＬＡ４−ｍＦｃでＥＬＩＳＡプレートを被覆した。１％ＢＳＡで３７℃にて２時間ブロッキングした後、抗ＣＴＬＡ４抗体、すなわちモノクローナル抗体８Ｄ２および８Ｄ２（Ｒｅ）および８Ｄ２ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７ならびに対照抗体１０Ｄ１および１１．２．１を添加した。１０分間温置した後、Ｂ７−２−ｈｉｓを添加した。３７℃で４０分間温置した後、酵素複合二次抗体を添加した。３７℃で３０分間温置した後、ＥＬＩＳＡプレートリーダー上で４５０ｎｍでの吸収を検出した。ＣＴＬＡ４抗原に対する８Ｄ２、８Ｄ２（Ｒｅ）およびヒト化抗体の結合を検出した結果は図２６から３１でそれぞれ示す。これらの図で示されるように、８Ｄ２、８Ｄ２（Ｒｅ）抗体および８Ｄ２ヒト化抗体は、ＣＴＬＡプレオテイン（ｐｒｅｏｔｅｉｎ）に効率的に結合し得、それらの結合効率は用量依存性である。各用量での蛍光強度を表１０から１６で提供する。結合した抗体８Ｄ２、８Ｄ２（Ｒｅ）およびヒト化抗体の蛍光定量分析での曲線シミュレーションによって、８Ｄ２、８Ｄ２（Ｒｅ）およびヒト化抗体の、結合効率、ＥＣ_５０を得た（表１７）。

上記の結果から、抗体８Ｄ２、８Ｄ２（Ｒｅ）および８Ｄ２ヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７の全てが、ＣＴＬＡ４抗原への結合についてＢ７と競合し得ることが明らかになった。特に、８Ｄ２、８Ｄ２（Ｒｅ）、８Ｄ２Ｈ１Ｌ１および８Ｄ２Ｈ２Ｌ２は、ＣＴＬＡ４への結合についてのＢ７−２との競合において１０Ｄ１よりも強力であり；一方で、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７は、ＣＴＬＡ４への結合についてのＢ７−１およびＢ７−２の両方との競合において抗体１０Ｄ１および１１．２．１よりも強力である。

［実施例９］細胞におけるモノクローナル抗体８Ｄ２およびヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７の生物学的活性の分析
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＩＬ−２発現におけるモノクローナル抗体８Ｄ２およびヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７および対照抗体１０Ｄ１および１１．２．１の効果を検出するために、ヘパリンナトリウムを含有する回収チューブに健康なドナーからの末梢血を回収した。ＰＢＳ中での希釈および分離液上での遠心（２５５０ｒｐｍで２０分間）後、細胞懸濁液としてＰＢＭＣを得た。ＳＥＢ（１μｇ／ｍＬ）／ＰＨＡ（３０μｌ／ｍｌ）とともに細胞懸濁液を添加し、さらなる培養のために５％ＣＯ_２を含有する飽和湿度の３７℃のインキュベーターに置いた。Ｒａｊｉリンパ球および抗体を添加した。４８時間（ｈｏｕｓ）の同時温置後、ＰＢＭＣをＰＢＳで２回洗浄し、細胞１０，０００個／ウェルで９６ウェルプレートに添加した。次いで、対応する濃度勾配の抗体を添加した。２０分間の温置後、７２時間の同時温置のために、細胞１０，０００個／ウェルで、ＭＭＣで１時間処理したＲａｊｉ細胞を添加した。７２時間の同時温置後、細胞培養物を上清のために回収し、キット（Ｄａｋｅｗｅ Ｃｏ．，ＤＫＷ１２−１０２０−０９６）ともに提供される説明書に従い、ＥＬＩＳＡキットを使用して細胞同時培養物の上清中のＩＬ−２発現プロファイルを検出した。

統計学的分析後、実験の結果を図３２および３３で示す。モノクローナル抗体８Ｄ２について、Ｔ細胞群およびＲａｊｉ細胞群と比較した場合、そのヒト化抗体８Ｄ２Ｈ１Ｌ１、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ３Ｌ３、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７は全て、Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合を効果的に阻止し、Ｔリンパ球中でＩＬ−２発現を改善し得る（図３２および３３）。特に、驚くことに、発明者らは、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５および８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７が対照抗体１０Ｄ１および１１．２．１よりも顕著に優れていることを発見した。１０ｎＭの濃度で、これらは、１００ｎＭの濃度で１０Ｄ１または１１．２．１により達成されるものに匹敵するかまたはこれらよりさらに良好であるＩＬ−２レベルに到達した。したがって、本発明の抗体は、より低い濃度、例えば約１０ｎＭでＩＬ−２のレベルを上昇させ得る。

［実施例１０］モノクローナル抗体８Ｄ２Ｈ２Ｌ２のインビボ抗腫瘍活性
ｈｕ−ＳＣＩＤ−ｒａｊｉ動物モデルを使用して、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２のインビボ抗腫瘍活性を評価した。Ｆｉｃｏｌｌ試薬を用いてヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、１μｇ／ｍｌのＳＥＢを用いて３日間活性化した。次いで、１．２５×１０^６個の活性化ＰＢＭＣを５×１０^６個のｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞および８Ｄ２Ｈ２Ｌ２（２０ｍｇ／ｋｇ）と混合し、ＳＣＩＤ−ベージュマウスの背部に皮下注射した。同時に、１群あたり５匹の動物でアイソタイプ対照群を設定した。次に、週に１回、３週間連続で静脈内注射によって２０ｍｇ／ｋｇの用量を投与した。実験終了時まで、または腫瘍体積が１０００ｍｍ^３に到達するまで、腫瘍体積を週に２回測定した。

図３４で示されるように、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２は、ｈｕ−ＳＣＩＤ−ｒａｊｉモデルにおいて腫瘍成長を著しく抑制し得た。この結果から、リンパ腫を処置するために臨床的にこの抗体を使用し得ることが示された。

本発明の具体的な実施形態を詳細に記載してきたが、当業者は、本明細書で開示される教示に照らして、様々な改変および変更が詳細に対してなされ得、これらが全て本発明の保護範囲に包含されることを理解しよう。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲およびその何らかの同等物において定められる。

Claims (21)

1. モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって：
   ａ．配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
   ｂ．配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２および
   ｃ．配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
   および／または
   ｄ．配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
   ｅ．配列番号３１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２および
   ｆ．配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
   から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、
   モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
2. 請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
   前記モノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４および配列番号１８から選択され；
   および／または
   前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４から選択される、
   モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
3. 請求項３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
   前記モノクローナル抗体が、
   （１）配列番号６で規定されるＶＨおよび配列番号８で規定されるＶＬ；
   （２）配列番号１０で規定されるＶＨおよび配列番号１２で規定されるＶＬ；
   （３）配列番号１４で規定されるＶＨおよび配列番号１６で規定されるＶＬ；
   （４）配列番号１８で規定されるＶＨおよび配列番号２０で規定されるＶＬ；
   （５）配列番号１４で規定されるＶＨおよび配列番号２２で規定されるＶＬ；または
   （６）配列番号１４で規定されるＶＨおよび配列番号２４で規定されるＶＬ
   を含み、
   具体的には、配列番号６、配列番号１０および配列番号１４の位置１８のメチオニンが、ロイシン、バリン、イソロイシンまたはアラニンから選択されるアミノ酸で独立して置換される、
   モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
4. Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、１本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体およびダイアボディから選択される、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片から選択される、請求項１から３の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
5. 請求項１から４の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記モノクローナル抗体が、約１０^−５Ｍ未満、例えば約１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ以下のＫ_ＤでＣＴＬＡ４タンパク質と結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
6. 請求項１から５の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記モノクローナル抗体が非ＣＤＲ領域を含み、前記非ＣＤＲ領域が、マウス以外の種、例えばヒトの抗体由来である、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
7. 単離核酸分子であって、
   抗体の重鎖可変領域をコードすることが可能な核酸配列を含み、
   前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号２７から２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；
   具体的に、前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８で規定されるようなアミノ酸配列を有し；
   より具体的には、前記核酸分子が、配列番号５、配列番号９、配列番号１３または配列番号１７で規定されるようなヌクレオチド配列を有する、
   単離核酸分子。
8. 抗体の軽鎖可変領域をコードすることが可能な核酸配列を含む単離核酸分子であって、
   前記抗体の軽鎖可変領域が、
   １）配列番号３０から３２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ；
   ２）配列番号３０、配列番号３１および配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ；
   ３）配列番号３０、配列番号３１および配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ；
   を含み、
   具体的に、前記抗体の軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４で規定されるようなアミノ酸配列を有し；
   より具体的には、前記核酸分子が、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３で規定されるようなヌクレオチド配列を有する、
   単離核酸分子。
9. 請求項７および／または請求項８に記載の単離核酸分子を含む、ベクター。
10. 請求項７および／または請求項８に記載の単離核酸分子または請求項９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
11. 請求項１から６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を調製する方法であって、請求項１０に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を細胞培養物から回収する段階を含む、方法。
12. モノクローナル抗体またはその抗原結合断片および複合部分を含む複合物であって、前記モノクローナル抗体が、請求項１から６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、前記複合部分が検出可能な標識であり；具体的には前記複合部分が放射性同位体、蛍光物質、発光性物質、発色物質または酵素である、複合物。
13. 請求項１から６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１２に記載の複合物を含むキットであって；
    具体的に、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を特異的に認識する二次抗体をさらに含み；前記二次抗体が、検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光物質、発光性物質、発色物質または酵素をさらに含んでいてもよい、
    キット。
14. 試料中のＣＴＬＡ４の存在またはそのレベルを検出することにおける使用のためのキットの調製における、請求項１から６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用。
15. 請求項１から６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１２に記載の複合物を含む医薬組成物であって、医薬的に許容可能な担体および／または賦形剤をさらに含んでいてもよい、医薬組成物。
16. 腫瘍の、予防および／または処置および／または補助療法および／または診断での使用のための薬剤の調製における、請求項１から６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１２に記載の複合物の使用であって；具体的に、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍／腎腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結直腸癌、消化管の癌および肝臓癌／肝癌から選択される、使用。
17. 次の薬剤：
    試料（ｓａｍｐｌ）中でＣＴＬＡ４のレベルを検出する薬剤、
    Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合を阻止する薬剤、
    ＣＴＬＡ４の活性またはＣＴＬＡ４のレベルを制御（例えば下方制御）する薬剤、
    ＣＴＬＡ４による身体における免疫抑制を緩和する薬剤、
    Ｔリンパ球を活性化する薬剤、または
    Ｔリンパ球におけるＩＬ−２の発現を増加させる薬剤
    の調製における、請求項１から６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１２に記載の複合物の使用。
18. 有効量の、請求項１から６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１２に記載の複合物を細胞に投与する段階を含む、インビボまたはインビトロの方法であって、
    試料中のＣＴＬＡ４のレベルを検出する方法、
    Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合を阻止する方法、
    ＣＴＬＡ４の活性またはＣＴＬＡ４のレベルを制御（下方制御）する方法、
    ＣＴＬＡ４による身体における免疫抑制を緩和する方法、
    Ｔリンパ球を活性化する方法、または
    Ｔリンパ球におけるＩＬ−２の発現を増加させる方法
    から選択される、インビボまたはインビトロの方法。
19. 有効量の、請求項１から６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１２に記載のモノクローナル抗体複合物を投与する段階を含む、腫瘍の、予防および／または処置および／または補助療法および／または診断の方法であって；具体的に、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍／腎腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結直腸癌、消化管の癌および肝臓癌／肝癌から選択される、方法。
20. 腫瘍の、予防および／または処置および／または補助療法および／または診断での使用のための、請求項１から６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって；具体的に、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍／腎腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結直腸癌、消化管の癌および肝臓癌／肝癌から選択される、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
21. Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合を阻止すること、
    ＣＴＬＡ４の活性またはＣＴＬＡ４のレベルを制御（例えば下方制御）すること、
    ＣＴＬＡ４による身体における免疫抑制を緩和すること、または
    Ｔリンパ球を活性化するかもしくはＴリンパ球におけるＩＬ−２の発現を増加させる薬剤
    における使用のための、請求項１から６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体。

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