UA119570C2 - Анти-ctla4 моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, фармацевтична композиція і їх застосування - Google Patents

Анти-ctla4 моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, фармацевтична композиція і їх застосування Download PDF

Info

Publication number
UA119570C2
UA119570C2 UAA201701943A UAA201701943A UA119570C2 UA 119570 C2 UA119570 C2 UA 119570C2 UA A201701943 A UAA201701943 A UA A201701943A UA A201701943 A UAA201701943 A UA A201701943A UA 119570 C2 UA119570 C2 UA 119570C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
antigen
zeo
amino acid
sti
Prior art date
Application number
UAA201701943A
Other languages
English (en)
Inventor
Байюн Лі
Байюн ЛИ
Юй СЯ
Чжунмінь Ван
Чжунминь ВАН
Пен ЧЖАН
Пэн Чжан
Сінхуа Пан
Синхуа Пан
Original Assignee
Акесо Байофарма, Інк.
Акесо Байофарма, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Акесо Байофарма, Інк., Акесо Байофарма, Инк. filed Critical Акесо Байофарма, Інк.
Publication of UA119570C2 publication Critical patent/UA119570C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70521—CD28, CD152

Abstract

Винахід стосується анти-СТLА4 моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, його фармацевтичної композиції і їх застосування.

Description

(57) Реферат:
Винахід стосується анти-СТІ А4 моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, його фармацевтичної композиції і їх застосування.
Галузь техніки, до якої належить винахід
Даний винахід стосується галузей терапії пухлин і молекулярної імунології. Даний винахід стосується анти-СТІ А4 моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, його фармацевтичної композиції, його кодуючих послідовностей і способу і застосування його в діагностиці, профілактиці, терапії і/або ад'ювантній терапії.
Рівень техніки
Асоційований з цитотоксичними Т-лімфоцитами антиген 4 (скорочено СТІ А4) має високу міру схожості з молекулою СО28 по генній структурі, хромосомній локалізації, гомології послідовності і генній експресії. Обидві ці молекули є рецепторами для костимулюючої молекули В7, яка в основному експресується на поверхні активованих Т-лімфоцитів. Однак, як костимулюючий сигнал активації лімфоцитів, СТІ А4 виконує функцію, протилежну СО28. Після зв'язування з В7 СТІ А4 може інгібувати активацію мишачих і людських Т-лімфоцитів, граючи негативну регулюючу роль в активації Т-лімфоцитів.
СТІ А4 тАБ5 або ліганди СТІ А4 можуть запобігати зв'язуванню СТІ А4 з його нативними лігандами, блокуючи тим самим передачу негативного регулюючого сигналу Т-лімфоцитам через СТІ А4 і підвищуючи чутливість Т-лімфоцитів до різних антигенів. У цьому аспекті, результати досліджень іп мімо і іп міго значною мірою узгоджуються. На даний час одержано декілька СТІ А4 тАбБ5 (1001, 11.2.2), які проходять клінічні випробування при лікуванні раку передміхурової залози, раку сечового міхура, колоректального раку, раку шлунково-кишкового тракту, раку печінки, злоякісної меланоми і т. д. (СТІ А-4 ріосКаде іп шШтог тодвеі!в5: ап омегуієм/ ої ргесіїпіса! апа їмапвзіайопа! гезеагсі. Стовво .Р., диге-КипКе! М.М., Сапсег Іттип. 2013; 13:5.
Ериб 2013 дап 22; 005 6984720 В1; і 05 6682736 В1). Серед цих антитіл, антитіла 1001 і 11.22 розглядаються як анти-СТІ А4 моноклональні антитіла, що мають найкращий ефект.
Інтерлейкін 2 (1-2) продукується Т-лімфоцитами. Він являє собою фактор росту, регулюючий підгрупу Т-лімфоцитів. Також він є важливим фактором, що модулює імунну відповідь. Він може стимулювати і активувати експресію В-лімфоцитів і бере участь в гуморальній відповіді, кровотворенні і виживанні пухлин. Рекомбінантний людський 1-2 був схвалений Управлінням по контролю якості продуктів харчування і лікарських засобів США для лікування злоякісних пухлин (включаючи меланому, пухлини нирок і т. д.). Крім того, його дія
Зо вивчалася в клінічних дослідженнях при лікуванні хронічної вірусної інфекції (Рпаптасоїодіс адтіпівігайіоп ої іпіепеицйкіп-2 Спаме? А.В. еїгаї., Апп МУ Асад 5сі, 2009. 1182:14-27).
Як важливі фактори, що впливають на функцію Т-лімфоцитів, СТІ А4 і СТІ А4 тАбре5 можуть надавати специфічний терапевтичний вплив на захворювання шляхом порушення імунного мікрооточення в організмі. Вони мають високу ефективність і усувають недоліки традиційних лікарських засобів, відкриваючи новий шлях генної терапії. СТІ А4 і СТІ А4 тАбБ5 тестуються в експериментах на різних стадіях клінічних випробувань. Наприклад, при аутоіїмунних захворюваннях вони ефективно інгібували гіперчутливість дихальних шляхів в тваринних моделях астми, запобігали розвитку ревматичних захворювань, опосередковували імунну толерантність до алотрансплантанта в організмі і тому подібне. З іншого боку, хоч біологічна генна терапія не показала якого-небудь небажаного побічного ефекту в короткострокових клінічних випробуваннях, потрібно звернути увагу на можливий ефект після тривалого застосування. Наприклад, надмірна блокада передачі сигналу через СТІ А4 за допомогою
СТІ АЯ4 тАБр5 може привести до розвитку аутоїмунних захворювань. Оскільки антитіла можуть специфічно зв'язуватися зі своїми антигенами і індукувати лізис клітин-мішеней або блокувати перебіг патологічного процесу, розробка і застосування лікарських засобів на основі антитіл, особливо гуманізованих антитіл, мають важливе значення для клінічного лікування злоякісних пухлин і інших імунних захворювань у людини.
На даний час все ще існує потреба в розробці нових антитіл, які блокують зв'язування
СТІ А4 з В7, і їх гуманізованих варіантів.
Суть винаходу
Після інтенсивних досліджень і творчих зусиль авторами даного винаходу з використанням системи експресії в клітинах ссавця був одержаний рекомбінантний СТІ А4, який використовували як імуноген для імунізації мишей. Клітини гібридоми одержували шляхом злиття мишачих клітин селезінки з клітинами мієломи. Після скринінгу великої кількості зразків, авторами даного винаходу була одержана гібридомна клітинна лінія, здатна секретувати і продукувати конкретне моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язується з СТІ А4 і може з високою ефективністю блокувати зв'язування СТІ А4 з В7. Крім того, були одержані гуманізовані антитіла. Таким чином, запропоноване наступне.
У одному аспекті даний винахід стосується моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, де це моноклональне антитіло містить області, що визначають комплементарність (СОК5), вибрані з наступних:
НОСОК, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 27,
НОоОКа, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 28, їі
НОСОК, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 29; імабо
ІГСОН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 30,
ІГСО2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 31, і
ІГСОМЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО ІЮ МО: 32, 5ЕО ІЮ МО: 33 і
ЗЕО І МО: 34.
Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу, де амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга (МН) цього моноклонального антитіла вибрана з БЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 10, 5ЕО ІЮ
МО: 14 ії БЕО ІЮ МО: 18; імабо амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга (Мі) цього моноклонального антитіла вибрана з 5ЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮО МО: 12, 5ЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО ІЮ МО: 20, ЗЕО ІЮО МО: 22 і БЕО ІЮО МО: 24.
Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу, де це моноклональне антитіло містить (1) МН, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 6, і МІ, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 8; (2) МН, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 10, і МІ, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 12; (3) МН, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 14, і МІ, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 16; (4) МН, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 18, і МІ, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 20; (5) МН, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 14, і МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 22; або (6) МН, представлену в ЗЕО ІО МО: 14, і МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 24.
У даному винаході вищезгадані групи (1)-(б) мають амінокислотні послідовності варіабельної області важкого ланцюга і варіабельної області легкого ланцюга антитіл 802/802(Ке), 802Н111,
Зо 802Н212, 802НЗІ 3, 802НІ1 15 і 802НІІ 17, відповідно.
Зокрема, метіонін (Ме) в положенні 18 в БЕО ІЮ МО: 6, 5ЕБЕО ІО МО: 10 ї 5ЕО ІЮО МО: 14 незалежно замінений амінокислотою, вибраною з наступних амінокислот: лейцин (І еи), валін (маї), ізолейцин (Пе) або аланін (Аа).
Терапевтичні лікарські засоби на основі антитіл, особливо моноклональних антитіл (МАВ), показали чудову ефективність в лікуванні деяких захворювань. Стандартним способом одержання таких терапевтичних антитіл є імунізація тварини антигеном, одержання від цієї імунізованої тварини антитіл до цього антигену або поліпшення антитіл, що мають низьку афінність до антигену, за допомогою дозрівання афінності. Однак такий спосіб вимагає великих витрат часу і є трудомістким, а також часто за допомогою нього не вдається одержати антитіла, специфічні до конкретного епітопа антигену.
Зв'язування з антигеном залежить від варіабельних областей легкого ланцюга і важкого ланцюга; варіабельна область кожного ланцюга містить три гіперваріабельних ділянки, що також іменуються область, що визначає комплементарність (СОК) (важкий ланцюг (Н) містить
НОСОК, НСОК2 і НСОКУ, і легкий ланцюг (І) містить Ї/СОКІ1, І СО і Г СОКЗ; визначення див. в
Кабаї єї аї., Зедиепсев ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, РійА Еайіоп (1991), Мої. 1-3, МІН
Рибріїсайоп 91-3242, Веїйезаа Ма).
Амінокислотні послідовності СОК5 в послідовностях моноклональних антитіл вищезгаданих варіантів здійснення (1)-(б) аналізували за допомогою технічних способів, добре відомих фахівцям в даній галузі техніки, наприклад, за допомогою аналізу бази даних МВАБЕ2.
Результати представлені нижче. (1) Амінокислотні послідовності 3 СОМ варіабельної області важкого ланцюга показані нижче:
НОСОВІ: аЕТЕБЗОММУ (ЗЕО ІЮ МО: 27),
НСОВ2: ІВМКРУМУЕТ (5ЕО ІЮ МО: 28),
НСОВЗ: ТАОГАМ (5ЕО ІО МО: 29).
Амінокислотні послідовності З СОМ»: варіабельної області легкого ланцюга показані нижче:
ІСОВІ1: ЕМІМОаСЄ (ЗЕО ІО МО: 30),
ГСОВг: САТ (5ЕО І МО: 31),
ІГСОВЗ: ОММІ В5ОРЕТ (5ЕО ІЮ МО: 32).
(2) Амінокислотні послідовності 3 СОМ варіабельної області важкого ланцюга показані нижче:
НОСОВІ: аЕТЕБЗОММУ (ЗЕО ІЮ МО: 27),
НСОВ2: ІВМКРУМУЕТ (5ЕО ІЮ МО: 28),
НСОВЗ: ТАОГАМ (5ЕО ІО МО: 29).
Амінокислотні послідовності З СОМ»: варіабельної області легкого ланцюга показані нижче:
ІСОВІ1: ЕМІМОаСЄ (ЗЕО ІО МО: 30),
ГСОВг: САТ (5ЕО І МО: 31),
ІГСОВЗ: ОММІ В5ОРЕТ (5ЕО ІЮ МО: 32). (3) Амінокислотні послідовності 3 СОК5 варіабельної області важкого ланцюга показані нижче:
НОСОВІ: аЕТЕБЗОММУ (ЗЕО ІЮ МО: 27),
НСОВ2: ІВМКРУМУЕТ (5ЕО ІЮ МО: 28),
НСОВЗ: ТАОГАМ (5ЕО ІО МО: 29).
Амінокислотні послідовності З СОН»: варіабельної області легкого ланцюга показані нижче:
ІСОВІ1: ЕМІМОаСЄ (ЗЕО ІО МО: 30),
ГСОВг: САТ (5ЕО І МО: 31),
ІГСОВЗ: ОММІ В5ОРЕТ (5ЕО ІЮ МО: 32). (4) Амінокислотні послідовності 3 СОМ варіабельної області важкого ланцюга показані нижче:
НОСОВІ: аЕТЕБЗОММУ (ЗЕО ІЮ МО: 27),
НСОВ2: ІВМКРУМУЕТ (5ЕО ІЮ МО: 28),
НСОВЗ: ТАОГАМ (5ЕО ІО МО: 29).
Амінокислотні послідовності З СОМ»: варіабельної області легкого ланцюга показані нижче:
ІСОВ1: ЕМІМОаС (5ЕО ІЮ МО: 30),
ГСОВг: САТ (5ЕО І МО: 31),
ІГСОВЗ: ОММІ В5ОРЕТ (5ЕО ІЮ МО: 32). (5) Амінокислотні послідовності 3 СОМ варіабельної області важкого ланцюга показані нижче:
Коо) НОСОВІ: аЕТЕБЗОММУ (ЗЕО ІЮ МО: 27),
НСОВ2: ІВМКРУМУЕТ (5ЕО ІЮ МО: 28),
НСОВЗ: ТАОГАМ (5ЕО ІО МО: 29).
Амінокислотні послідовності З СОМ»: варіабельної області легкого ланцюга показані нижче:
ІСОВІ1: ЕМІМОаСЄ (ЗЕО ІО МО: 30),
ГСОВг: САТ (5ЕО І МО: 31),
ГСОВЗ: ОММІ БВНРО (ЗЕО ІО МО: 33). (б) Амінокислотні послідовності 3 СОМ варіабельної області важкого ланцюга показані нижче:
НОСОВІ: аЕТЕБЗОММУ (ЗЕО ІЮ МО: 27),
НСОВ2: ІВМКРУМУЕТ (5ЕО ІЮ МО: 28),
НСОВЗ: ТАОГАМ (5ЕО ІО МО: 29).
Амінокислотні послідовності З СОМ»: варіабельної області легкого ланцюга показані нижче:
ІСОВІ1: ЕМІМОаСЄ (ЗЕО ІО МО: 30),
ГСОВг: САТ (5ЕО І МО: 31),
ІГСОВЗ: ОММІ 55АРа (5ЕО І МО: 34).
Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу, де це моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент вибрано з Раб, Раб, Р(аб)», Ба, Ем, аАБ, фрагмента області, що визначає комплементарність, одноланцюжкового антитіла (наприклад, 5сЕм), гуманізованого антитіла,
БО гібридного антитіла або діатіла.
Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу, де це моноклональне антитіло зв'язується з білком СТІ А4 з Ко менше ніж приблизно 105 М, наприклад менше ніж приблизно 105 М, 107 М, 109 М, 109 М або 1079 або менше.
Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу, де це моноклональне антитіло містить області, що не є СОБ, і ці області, що не є СОК, одержані з антитіла виду, відмінного від миші, наприклад людини.
Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент даного винаходу являє собою анти-СТІ А4 моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що може бо специфічно зв'язуватися з СТІ А4.
Моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу для застосування в профілактиці і/або терапії, і/або ад'ювантній терапії, і/або діагностиці пухлини, зокрема пухлини, вибраної з меланоми, пухлини нирки/раку нирки, раку передміхурової залози, раку сечового міхура, колоректального раку, раку шлунково- кишкового тракту і пухлини печінки/раку печінки.
Моноклональне антитіло за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу для застосування в: блокуванні зв'язування СТІ А4 з В7, регуляції (наприклад, пригнічення) активності СТІ А4 або рівня СТІ А4, зняття імуносупресії організму СТІ А4, або активації Т-лімфоцитів або підвищення рівня експресії ІІ -2 в Т-лімфоцитах.
У іншому аспекті даний винахід стосується виділеної молекули нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, здатну кодувати варіабельну область важкого ланцюга антитіла, де ця варіабельна область важкого ланцюга антитіла містить СОН» з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІЮ МО: 27-29; зокрема варіабельна область важкого ланцюга антитіла має амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 6, ЗЕО ІЮ МО: 10, 5ЕО ІО МО: 14 або 5ЕО ІЮ МО: 18; більш конкретно, молекула нуклеїнової кислоти має нуклеотидну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІЮО МО: 9, 5ЕО ІЮ МО: 13 або 5ЕО ІЮО МО: 17.
Даний винахід також стосується виділених молекул нуклеїнової кислоти, які кодують моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент даного винаходу. Такі молекули нуклеїнової кислоти можуть бути виділені з клітин гібридоми або одержані за допомогою рекомбінантних технологій генної інженерії або способів хімічного синтезу.
У ще одному аспекті даний винахід стосується виділеної молекули нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, здатну кодувати варіабельну область легкого ланцюга антитіла, де ця варіабельна область легкого ланцюга антитіла містить 1) СОК5 з амінокислотними послідовностями ЗЕО ІЮ МО: 30-32; 2) СОК5 з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІЮ МО: 30, 5ЕО ІЮ МО: 31 ї БЕО ІЮО МО: 33; або 3) СОК5 з амінокислотними послідовностями ЗЕО ІО МО: 30, 5ЕО ІЮО МО: 31 і БЕО ІЮО МО: 34;
Зо зокрема, варіабельна область легкого ланцюга антитіла має амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 8, ЗЕО ІЮ МО: 12, 5ЕО ІО МО: 16, 5ЕО ІЮ МО: 20, ЗЕО ІЮ МО: 22 або 5БЕО ІЮО МО: 24; більш конкретно, молекула нуклеїнової кислоти має нуклеотидну послідовність, представлену в БХЕО ІЮО МО: 5ЕО ІО МО: 7, 5ЕО ІО МО: 11, 5ЕО ІЮ МО: 15, 5ЕО ІЮО МО: 19, 5ЕО
ІО МО: 21 або 5ЕО ІО МО: 23.
У ще одному аспекті даний винахід стосується вектора, який містить виділену молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу. Вектор даного винаходу може являти собою клонуючий вектор або експресійний вектор. У переважному варіанті здійснення винаходу вектор даного винаходу являє собою, наприклад, плазміду, косміду, бактеріофаг або тому подібне.
У ще одному аспекті даний винахід стосується клітини-хазяїна, яка містить виділену молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу або вектор даного винаходу. Такі клітини-хазяїни включають в себе, без обмежень, прокаріотичні клітини, такі як клітини БЕ.соїї, ії еукаріотичні клітини, такі як клітини дріжджів, клітини комах, рослинні клітини їі тваринні клітини (такі як клітини ссавців, включаючи мишачі клітини, клітини людини або тому подібне). Клітини даного винаходу також можуть являти собою клітинну лінію, таку як клітини 293Т.
У ще одному аспекті даний винахід стосується способу одержання моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу, який включає в себе етапи культивування клітини-хазяїна даного винаходу у придатних умовах і виділення моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента з культури клітин.
У ще одному аспекті даний винахід стосується кон'югата, який містить моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент і кон'юговану молекулу, де моноклональне антитіло являє собою моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу, і кон'юЮптована молекула являє собою детектовану мітку. Зокрема, кон'югована молекула являє собою радіоїзотоп, флуоресцентну речовину, люмінесцентну речовину, хромогенну речовину або фермент (наприклад, пероксидазу хрону).
У ще одному аспекті даний винахід стосується набору реагентів, який містить моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу або кон'югат даного винаходу; зокрема, набір реагентів додатково включає в себе друге антитіло, яке специфічно розпізнає вказане моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент; при необхідності вказане друге антитіло додатково містить детектовану мітку, наприклад радіоїзотоп, флуоресцентну речовину, люмінесцентну речовину, хромогенну речовину або фермент (наприклад, пероксидазу хрону).
У ще одному аспекті даний винахід стосується застосування моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу в приготуванні набору реагентів, який застосовується для виявлення наявності або рівня СТІ А4 в зразку.
У ще одному аспекті даний винахід стосується фармацевтичної композиції, яка містить моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу або кон'югат даного винаходу; при необхідності вона додатково містить фармацевтично прийнятний носій і/або допоміжну речовину.
У ще одному аспекті даний винахід стосується застосування моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу або кон'югата даного винаходу в приготуванні лікарського препарату для застосування в профілактиці і/або терапії, і/або ад'ювантній терапії, і/або діагностиці пухлини, зокрема пухлини, вибраної з меланоми, пухлини нирки/раку нирки, раку передміхурової залози, раку сечового міхура, колоректального раку, раку шлунково-кишкового тракту і пухлини печінки/раку печінки.
У ще одному аспекті даний винахід стосується застосування моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу або кон'югата даного винаходу в приготуванні наступних агентів: агент, який виявляє наявність або рівень СТІ АА4 в зразку, агент, який блокує зв'язування СТІ А4 з В7, агент, який регулює (наприклад, пригнічує) активність СТІ А4 або рівень СТІ А4, агент, який знімає імуносупресію організму СТІ А4, агент, який активує Т-лімфоцити, або
Зо агент, який підвищує рівень експресії 1-2 в Т-лімфоцитах.
У ще одному аспекті даний винахід стосується іп мімо або іп міго способу, який включає в себе етап введення в клітини ефективної кількості моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу або кон'югата даного винаходу, де цей спосіб вибраний з наступних способів: спосіб виявлення наявності або рівня СТІ АА4 в зразку, спосіб блокування зв'язування СТІ А4 з В7, спосіб регуляції (наприклад, пригнічення) активності СТІ А4 або рівня СТІ А4, спосіб зняття імуносупресії організму СТІ А4, спосіб активації Т-лімфоцитів, або спосіб підвищення рівня експресії ІІ -2 в Т-лімфоцитах.
Такі способи можуть застосовуватися для діагностичних або терапевтичних цілей або недіагностичних або нетерапевтичних цілей (наприклад, в тих випадках, коли зразок являє собою зразок клітин, а не зразок, одержаний від пацієнта).
У ще одному аспекті даний винахід стосується способу профілактики і/або терапії, і/або ад'ювантної терапії, і/або діагностики пухлини, який включає в себе введення суб'єкту ефективної кількості моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з варіантів здійснення даного винаходу або кон'югата даного винаходу, зокрема пухлини, вибраної з меланоми, пухлини нирки/раку нирки, раку передміхурової залози, раку сечового міхура, колоректального раку, раку шлунково-кишкового тракту і пухлини печінки/раку печінки.
У даному винаході, якщо не вказане інше, використовувані тут наукові і технічні терміни мають те ж значення, яке звичайно розуміється фахівцями в даній галузі техніки. Крім того, використовувані тут способи культивування клітин, молекулярної генетики, хімії нуклеїнових кислот, імунології є методиками, що широко використовуються в даній галузі техніки. У той же час, для кращого розуміння даного винаходу нижче наводяться визначення і пояснення відповідних термінів.
У даному описі при згадуванні амінокислотної послідовності білка СТІ А4 (асоційований з цитотоксичними Т-лімфоцитами антиген 4) цей термін включає в себе повнорозмірний білок
СТІ А4 або позаклітинний фрагмент СТ А4 СТІ АЯ4ЕСО (5ЕО ІЮО МО: 2), або фрагмент, що 60 містить СТІ А4ЕСО. Він також включає в себе злитий білок СТ А4ЕСО, наприклад фрагмент,
злитий з фрагментом Есо-білка мишачого ІдсС (тЕс) (ЗЕО ІЮ МО: 3). Однак, як зрозуміло фахівцям в даній галузі техніки, мутація або зміна (включаючи, без обмежень, заміну, делецію або додавання) може виникнути природним чином або може бути штучно введена в амінокислотну послідовність білка СТІ А4 без порушення його біологічних функцій. Таким чином, в даному винаході термін "білок СТІ А4" включає в себе всі такі послідовності, в тому числі послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 2, а також її нативний або штучний варіант.
Крім того, при згадуванні фрагмента послідовності білка СТІ А4 цей термін включає в себе не тільки фрагмент послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2, але також він включає в себе відповідні фрагменти послідовності нативного або штучного варіанта.
Використовуваний тут термін "В7", якщо спеціально не вказане інше, стосується В7-1 і/або
В7-2; їх конкретні білкові послідовності належать до числа послідовностей, відомих з рівня техніки. Посилання може бути зроблене на послідовності, розкриті в літературі попереднього рівня техніки або в базі даних СсепВапк, наприклад В7-1 (СО80, МСВІ Сепе І: 941), В7-2 (С086,
МОВІ Сепе І: 942).
Використовуваний тут термін "ЕСво" стосується концентрації що має 5095 від максимального ефекту, тобто концентрації, що забезпечує 50 95 максимального ефекту.
Використовуваний тут термін "антитіло" стосується молекули імуноглобуліну, яка, як правило, складається з двох пар поліпептидних ланцюгів (кожна пара має "легкий" (І) ланцюг і "важкий" (Н) ланцюг). Легкі ланцюги антитіла можуть бути класифіковані як к і А легкий ланцюг.
Важкі ланцюги можуть бути класифіковані як |, б, у, а або є, і ізотипи антитіл визначають як І9М,
ЧО, Ідс, ІдДА ї ЗЕ, відповідно. Всередині легкого ланцюга і важкого ланцюга варіабельна область і константна область з'єднуються через область ")", що складається з приблизно 12 або більше амінокислот, і важкий ланцюг додатково містить область "ОО", що складається з приблизно З або більше амінокислот. Кожний важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (МН) і константної області важкого ланцюга (СН). Константна область важкого ланцюга складається з З доменів (СНІ, СН2 і СНЗ). Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (МІ) і константної області легкого ланцюга (СІ).
Константна область легкого ланцюга складається з домену Сі. Константна область антитіла може опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами організму-
Зо хазяїна, в тому числі з різними клітинами імунної системи (наприклад, ефекторними клітинами) і першим компонентом класичної системи комплементу (С14). Області МН і МІ. можуть бути додатково підрозділені на області, що мають високу варіабельність (іменовані області, що визначають комплементарність (СОК5)), розділені областями, іменованими каркасні області (ЕК), які є відносно консервативними. Кожна МН або Мі складається з З СОК5 і 4 ЕК, розташованих в наступному порядку від амінотермінального кінця до карбокситермінального кінця: ЕКТ, СОМ1, ЕК2, СОМК2, ЕКЗ, СОКЗ, ЕК4. Варіабельні області (МН і МІ) кожної пари важкий ланцюг/легкий ланцюг утворюють антигензв'язувальний сайт, відповідно. Віднесення амінокислот до кожної області або домену здійснюється відповідно до визначення, наданого в
Каваї, Зедиепсез ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодіса! Іпієгеві (Маїййопаї! Іпвійшез ої Неапцй, Веїйезаа, Ма. (1987 апа 1991)), або Споїйпіа 8. І е5К (1987) 9. Мої. ВіоїІ. 196:901-917; Споїпіа єї аї. (1989), Маїиге, 342:878-883. Термін "антитіло" не обмежується яким-небудь конкретним способом одержання антитіла. Наприклад, він, зокрема, включає в себе рекомбінантні антитіла, моноклональні антитіла і поліклональні антитіла. Антитіла можуть являти собою антитіла різних ізотипів, наприклад антитіла Ідс (наприклад, субтипи Ідс1, Ідс2, ІдОоЗ або Ідса4), ІдДА1, ІдЧАг, ІдО, ІДЕ або
ІМ.
Використовуваний тут термін "антигензв'язувальний фрагмент" антитіла стосується поліпептиду, що містить фрагмент повнорозмірного антитіла, який зберігає здатність специфічно зв'язуватися антигеном, з яким зв'язується це повнорозмірне антитіло, і/або конкурувати з цим повнорозмірним антитілом за специфічне зв'язування з антигеном. Також цей фрагмент іменується як "антигензв'язувальна частина". Загальний опис див. в книзі Рипдатепіаї
Іттипоіодау, Си. 7 (Раш! МУ., єд., бесопа Еййоп, Намеп Ргевз5, М.М. (1989)), яка повністю включена в даний винахід шляхом посилання для всіх цілей. Антигензв'язувальні фрагменти антитіл можуть бути одержані за допомогою технології рекомбінантних ДНК або шляхом ферментативного або хімічного розщеплення інтактних антитіл. У деяких випадках антигензв'язувальні фрагменти включають в себе фрагменти Раб, Рар', Е(аб)», Ба, Ем, ад, фрагмент області, що визначає комплементарність, одноланцюжкове антитіло (наприклад, 5СЕм), гібридне антитіло, діатіло і такі поліпептиди, які містять щонайменше частину антитіла, достатню для надання даному поліпептиду здатності специфічно зв'язуватися з антигеном.
Використовуваний тут термін "Ра-фрагмент" стосується фрагмента антитіла, що бо складається з доменів МН ї СНІ; термін "ЕГм-фрагмент" стосується фрагмента антитіла, що складається з доменів МІ і МН одного плеча антитіла; термін "ЗАбБ-фрагмент" стосується фрагмента антитіла, що складається з домену МН (мага еї аї., Маїиге, 341:544-546 (1989)); термін "бГар-фрагмент" стосується фрагмента антитіла, що складається з доменів МІ, МН, СІ і
СНІ; ї термін "Е(ар)2-фрагмент" стосується фрагмента антитіла, що складається з двох Еар- фрагментів, з'єднаних дисульфідними містками на шарнірній області.
У деяких випадках антигензв'язувальний фрагмент антитіла являє собою одноланцюжкове антитіло (наприклад, 5сЕм), де домени Мі і МН з'єднані один з одним через лінкер, який дозволяє одержати один поліпептидний ланцюг з утворенням моновалентної молекули (див., наприклад, Віга еї аї., 5сіепсе, 242:423-426 (1988); і Ниб5іюп еї аї., Ргос. Майї). Асай. з5сі. О5А, 85:5879-5883 (1988)). Такі молекули зсЕм можуть мати загальну структуру МН2-МІ-Лінкер-МН-
СООН або МНо-МН-Лінкер-мМІ -СООН. Придатні лінкери, відомі з рівня техніки, складаються з повторюваної амінокислотної послідовності (0005 або її варіантів. Наприклад, може бути використаний лінкер, що має амінокислотну послідовність ((503(05(05)4, але також можуть бути використані і його варіанти (Ноїїдег еї аї. (1993), Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА, 90:6444-6448). Інші лінкери, придатні для використання в даному винаході, описані в АїйКйап еї аї. (1995), Ргоїеїп
Епа. 8:725-731; Сної еї аї. (2001), Ек. У. Іттипої. 31:94-106; Ни єї аї. (1996), Сапсег Вез. 56:3055-3061; Кірпуапом еї аї. (1999), У. Мої. Віої. 293:41-56; і Коомег5 еї аїІ. (2001) Сапсег
ІттипоЇї.
У деяких випадках антигензв'язувальний фрагмент антитіла являє собою діатіло (бівалентне антитіло), де домени МН і Мі експресуються на одному поліпептидному ланцюзі. Однак використовуваний лінкер є дуже коротким, і ці два домени на одному і тому ж ланцюзі не можуть утворювати пару один з одним і змушені утворювати пару з комплементарним доменом на іншому ланцюзі. Завдяки цьому утворюються два антигензв'язувальних сайти (див., наприклад,
Ноїїїдег Р. еї аї., Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА, 90:6444-6448 (1993); і РоЦак К.). еї аї., 5ігисіиге, 2:1121-1123 (1994)).
Антигензв'язувальні фрагменти антитіл (наприклад, вищезгадані фрагменти антитіл) можуть бути одержані з вказаних антитіл (наприклад, з моноклонального антитіла 802, описаного в даному винаході) за допомогою стандартних методів, відомих фахівцям в даній галузі техніки (наприклад, технології рекомбінантних ДНК або способу ферментативного або хімічного
Зо розщеплення), і можуть бути піддані скринінгу на специфічність тими ж способами, що і інтактні антитіла.
У даному винаході, якщо з контексту явним чином не випливає інше, термін "антитіло" включає в себе не тільки інтактні антитіла, але також і антигензв'язувальні фрагменти антитіл.
Використовуваний тут термін "тАБ" або "моноклональне антитіло" стосується антитіла або фрагмента антитіла з групи високою мірою однорідних молекул антитіл, тобто окремі антитіла, що складають групу, є ідентичними за винятком можливих природних мутацій. Моноклональні антитіла є високоспецифічними відносно одного епітопа антигену. На відміну від моноклональних антитіл, препарати поліклональних антитіл, як правило, включають в себе щонайменше два або декілька типів різних антитіл, які розпізнають різні епітопи антигену.
Моноклональні антитіла, як правило, можуть бути одержані з використанням технології гібридом, вперше описаної в Копіег еї аї. (Маїиге, 256:495, 1975), або можуть бути одержані за допомогою технології рекомбінантних ДНК (див., наприклад, Патент США Мо 4816567).
У даному винаході моноклональне антитіло з номером є ідентичним моноклональному антитілу, одержаному з гібридоми з тим же номером. Наприклад, моноклональне антитіло 802 є ідентичним антитілу, одержаному з гібридомної клітинної лінії 802 або її субклонів або дочірніх клітин.
Використовуваний тут термін "гібридне антитіло" стосується такого антитіла, в якому частина легкого ланцюга і/або важкого ланцюга одержана з одного антитіла (яке може бути одержане з конкретного виду або належати до конкретного класу або підкласу антитіл), в той час як інша частина легкого ланцюга і/або важкого ланцюга одержана з іншого антитіла (яке може бути одержане з ідентичного або іншого виду або належати до ідентичного або іншого класу або підкласу антитіл), за умови, що воно зберігає активність зв'язування з цільовим антигеном (Патент США Ме 4816567, виданий СаршШу еї а1!.; Моттізоп еї аї., Ргос. Маї!. Асай. 5бі.
ИБА, 81:6851-6855 (1984)).
Використовуваний тут термін "гуманізоване антитіло" стосується антитіла або фрагмента антитіла, одержаного після заміни всіх або декількох СОМ» імуноглобуліну людини (антитіло- реципієнт) СОК5 нелюдського антитіла (антитіло-донор), де антитіло-донор може являти собою нелюдське (наприклад, мишаче, щуряче або кроляче) антитіло, що має бажану специфічність, афінність або реактивність. Крім того, деякі амінокислотні залишки каркасних областей (ЕКз5) бо антитіла-реципієнта можуть бути замінені відповідними амінокислотними залишками нелюдського антитіла або амінокислотними залишками інших антитіл з метою додаткового поліпшення або оптимізації характеристик антитіла. Більш докладну інформацію про гуманізовані антитіла див., наприклад, в щдопез еї аї., Маїшге, 321:522-525 (1986); Неісптапп єї а!І., Майте, 332:323-329 (1988); Ргевіа, Сит. Ор. Зігисі. Віої!., 2: 593-596 (1992); і Сіагк, Іттипої.
Тодау, 21:397-402 (2000).
Використовуваний тут термін "нейтралізуюче антитіло" стосується антитіла або фрагмента антитіла, яке здатне усувати або значно зменшувати вірулентність цільового вірусу (наприклад, його здатність інфікувати клітини).
Використовуваний тут термін "епітоп" стосується частини антигену, що специфічно зв'язується з імуноглобуліном або антитілом. У даній галузі техніки "епітоп" також називається "антигенною детермінантою". Епітоп або антигенна детермінанта, як правило, складається з хімічно активних поверхневих груп молекули, наприклад амінокислот або вуглеводних сполук або вуглеводних бічних ланцюгів, і, як правило, має специфічні характеристики тривимірної структури і специфічні властивості заряду. Наприклад, епітоп, як правило, містить щонайменше 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 послідовних або непослідовних амінокислот в просторовій конформації, що визначається відстанню між ними. Це може бути "лінійний" або "конформаційний" епітоп. Див., наприклад, Ерйоре Марріпд Ргоїосої5 іп Меїпод5 іп МоїІесшаг
Віоіїоду, Мої. 66, с.Е. Могїті5 Ей. (1996). У лінійному епітопі всі точки взаємодії між білком і взаємодіючою молекулою (наприклад, антитілом) розташовані по первинній амінокислотній послідовності білка лінійно. У конформаційному епітопі взаємодіючі точки утворені зв'язаними містками амінокислотними залишками білка, які віддалені один від одного.
Використовуваний тут термін "виділений" означає одержаний з нативного стану штучним шляхом. Якщо "виділена" речовина або компонент зустрічаються в природі, то імовірно, що їх природне оточення було змінене або речовина була виділена з природного оточення, або і те, і інше. Наприклад, невиділені полінуклеотиди або поліпептиди в природі знаходяться в живих організмах іп мімо, і ідентичні полінуклеотиди або поліпептиди високої чистоти, виділені з такого природного стану, описуються як "виділені". Термін "виділений" не виключає суміш зі штучними або синтетичними речовинами і не виключає наявність інших домішок, які не надають впливу на активність речовини.
Зо Використовуваний тут термін "експресійна система Е.соїї" стосується експресійної системи, що складається з Е.соїї (штам) і вектора, де Е.соїї (штам) одержаний з комерційно доступних штамів, наприклад, але без обмежень, 51698, ЕК2566, ВІ 21(0ЕЗ), В834(ОЕЗ) і ВІ (СЕЗ).
Використовуваний тут термін "вектор" стосується системи, що несе нуклеїнову кислоту, в яку може бути вбудований полінуклеотид. Коли вектор забезпечує експресію білка, кодованого вбудованим полінуклеотидом, цей вектор називається експресійним вектором. Вектор може бути введений в клітину-хазяїна шляхом трансформації, трансдукції або трансфекції, таким чином, що генетичний компонент, який міститься в цьому векторі, експресується в клітині- хазяїні. Вектори, добре відомі фахівцям в даній галузі техніки, включають в себе, без обмежень, плазміду; фагміду; косміду; штучну хромосому, наприклад штучну хромосому дріжджів (АС), бактеріальну штучну хромосому (ВАС) або штучну хромосому на основі бактеріальної Р1- плазміди (РАС); бактеріофаг, наприклад фаг А або фаг М13, а також вірус тварин і тому подібне.
Віруси тварин, які можуть бути використані як вектор, включають в себе, без обмежень, ретровірус (в тому числі лентивірус), аденовірус, аденоасоційований вірус, вірус герпесу (наприклад, вірус простого герпесу), поксвірус, бакуловірус, вірус папіломи, паповавірус (наприклад, 5М40). Вектор може містити декілька компонентів для контролю експресії, що включають в себе, без обмежень, промоторну послідовність, послідовність ініціації транскрипції, енхансерну послідовність, селекційний компонент і репортерний ген. Крім того, вектор також може містити сайт ініціації реплікації.
Використовуваний тут термін "клітина-хазяїн" стосується клітин, які можуть бути використані для введення вектора. Ці клітини включають в себе, без обмежень, прокаріотичні клітини, такі як Е.соїї або Васійи5 5ибБійб, клітини грибів, такі як клітини дріжджів або АзрегойЙив5, клітини комах, такі як клітини дрозофіли 52 або 519, або клітини тварин, такі як фібробласти, клітини
СНО, клітини СО5, клітини М5О, клітини Неї! а, клітини ВНК, клітини НЕК293 або клітин людини.
Використовуваний тут термін "ідентичність" призначений для опису збігу послідовності між двома поліпептидами або між двома нуклеїновими кислотами. Коли відповідні положення в двох порівнюваних послідовностях зайняті однаковими мономерними субодиницями (основами або амінокислотами) (наприклад, відповідні положення в двох молекулах ДНК обидва зайняті аденіном або відповідні положення в двох поліпептидах обидва зайняті лізином), ці молекули є ідентичним в цьому положенні. "Процент ідентичності" між двома послідовностями являє собою 60 наступну функцію: число положень, що збігаються, для цих двох послідовностей, ділене на число порівнюваних положень х 100. Наприклад, якщо 6 з 10 положень в двох послідовностях збігаються, то ці дві послідовності мають 60 95 ідентичності. Наприклад, ДНК послідовності
СТОАСТ і САССОТТ мають 50 95 ідентичності (в загальній складності збігаються З з б положень).
Як правило, дві послідовності порівнюють після вирівнювання для одержання максимальної ідентичності. Наприклад, таке вирівнювання зручно проводити з використанням комп'ютерної програми, наприклад, програми Аїїдп (ОМАФвіаг, Іпс.), способом, описаним в МееаіІетап еї аї. (1970), 9. Мої. Віо!. 48:443-453. Крім того, алгоритм Е. Меуеєг5 апа УМ. МіПег (Сотриї. Аррі. Віозоі., 4:11-17 (1988)), включений в програму АГІСМ (версія 2.0), може бути використаний для визначення процента ідентичності між двома амінокислотними послідовностями, із застосуванням таблиці ваг замін залишків РАМ120, штрафу за продовження гепа 12 і штрафу за геп 4. Крім того, алгоритм Меедіетап апа Ууспз5сй (9. Мої. ВіоїІ. 48:444-453 (1970)), включений в програму САР з пакета СО (доступного на сайті мм/лм.дсд.сот), може бути використаний для визначення процента ідентичності між двома амінокислотними послідовностями, із застосуванням матриці Віо55ит 62 або матриці РАМ250О, ваги гепа 16, 14, 12, 10,8, б або4 і ваги продовження гепа 1, 2, 3, 4, 5 або 6.
Використовуваний тут термін "консервативна заміна" стосується амінокислотних замін, які не надають негативного впливу або не змінюють суттєвих властивостей білка/поліпептиду, що містить цю амінокислотну послідовність. Наприклад, консервативні заміни можуть бути введені за допомогою стандартних методів, відомих з рівня техніки, таких як сайт-направлений мутагенез, ПЛР-опосередкований мутагенез. Консервативні амінокислотні заміни включають в себе заміни, при яких амінокислотний залишок замінений амінокислотним залишком, що має аналогічний бічний ланцюг, наприклад залишком, аналогічним відповідному амінокислотному залишку з точки зору фізичних властивостей або функції (наприклад, має схожий розмір, форму, заряд, хімічні властивості, в тому числі здатність утворювати ковалентний зв'язок або водневий зв'язок, або тому подібне). Сімейства амінокислотних залишків, що мають аналогічні бічні ланцюги, визначені у відповідній галузі техніки. Ці сімейства включають в себе амінокислоти, що мають основний бічний ланцюг (наприклад, лізин, аргінін і гістидин), кислотний бічний ланцюг (наприклад, аспарагінова кислота і глутамінова кислота), незаряджений полярний бічний ланцюг (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін,
Зо тирозин, цистеїн і триптофан), неполярний бічний ланцюг (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін і метіонін), бета-розгалужений бічний ланцюг (наприклад, треонін, валін і ізолейцин) і ароматичний бічний ланцюг (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан і гістидин). Таким чином, переважною є заміна відповідного амінокислотного залишку іншим амінокислотним залишком з того ж сімейства бічного ланцюга. Способи ідентифікації консервативних амінокислотних замін добре відомі з рівня техніки (див., наприклад, Вгиттеї!! еї аї., Віоспет., 32:1180-1187 (1993); Корауавні еї аї., Ргоїєїп Епа. 12(10):879-884 (1999); і Вигкз5 еї а!., Ргос. Маї). Асад. Зсі. О5А, 94:412-417 (1997), які включені в даний винахід шляхом посилання).
Використовуваний тут термін "імуногенність" стосується здатності стимулювати організм виробляти специфічні антитіла або сенсибілізувати лімфоцити. Він стосується не тільки властивостей антигену, який може стимулювати конкретні імунні клітини таким чином, щоб індукувати активацію, проліферацію і диференціацію імунних клітин, і в кінцевому результаті продукування імунних ефекторних речовин, таких як антитіла, і може сенсибілізувати лімфоцити, але також стосується специфічних імунних реакцій імунної системи організму, що викликають продукування антитіл або сенсибілізованих Т-лімфоцитів після стимуляції організму антигеном. Імуногенність є найбільш важливою властивістю антигену. Чи зможе антиген успішно індукувати імунну відповідь в організмі хазяїна, залежить від трьох факторів: природа антигену, реактивності організму хазяїна і способу імунізації.
Використовуваний тут термін "специфічне зв'язування" стосується невипадкових реакцій зв'язування між двома молекулами, таких як реакція між антитілом і його цільовим антигеном. У деяких варіантах здійснення винаходу специфічне зв'язування антитіла з антигеном (або антитіло специфічне відносно антигену) означає, що антитіло зв'язується з антигеном з афінністю (Ко) менше ніж приблизно 105 М, наприклад менше ніж приблизно 105 М, 107 М, 1039
М, 109 М або 10-9 М або менше.
Використовуваний тут термін "Ко" стосується константи рівноваги дисоціації конкретної взаємодії антитіло-антиген, що використовується для опису афінності зв'язування між антитілом і антигеном. Чим менше константа рівноваги дисоціації, тим сильніше зв'язування антитіла з антигеном і тим вище афінність між антитілом і антигеном. Як правило, антитіло (наприклад, моноклональне антитіло 802 даного винаходу) зв'язується з антигеном (наприклад, білком І 1) з 60 константою рівноваги дисоціації (Ко), яка менше ніж приблизно 105 М, наприклад менше ніж приблизно 105 М, 107 М, 108 М, 109 М або 10-79 М або менше, наприклад, як визначено за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ППР) на приладі ВІАСОКЕ.
Використовувані тут терміни "моноклональне антитіло" і ""пАБр" мають одне і те ж значення і можуть бути використані взаємозамінно. Також терміни "поліклональне антитіло" і "рАБ" мають одне і те ж значення і можуть бути використані взаємозамінно. Також терміни "поліпептид" і "білок" мають одне і те ж значення і можуть бути використані взаємозамінно. Крім того, в даному винаході амінокислоти, як правило, позначаються однобуквеними або трибуквеними абревіатурами, добре відомими в даній галузі техніки. Наприклад, аланін може бути позначений як А або Аа.
Використовувані тут терміни "гібридома" і "гібридомна клітинна лінія" можуть бути використані взаємозамінно. Крім того, при згадуванні терміна "гібридома" або "гібридомна клітинна лінія", він також включає в себе субклони і дочірні клітини гібридомної клітинної лінії 483.
Використовуваний тут термін "фармацевтично прийнятний вектор і/або допоміжна речовина" стосується вектора і/або допоміжної речовини, сумісних з суб'єктом і активним компонентом в фармакології і/або фізіології, які добре відомі в даній галузі техніки (див., наприклад, Кептіпаїоп'є Рнаптасецшіїйса! Зсієпсев. Едіїєд Бу Сеппаго А.В., 191п ед. РеппзуїЇмапіа:
Маск Рибіїєпіпд Сотрапу, 1995), і включає в себе без обмежень: регулюючий рН агент, поверхнево-активну речовину, ад'ювант, підсилювач іонної інтенсивності. Наприклад, регулюючий рН агент включає в себе, без обмежень, фосфатний буфер; поверхнево-активна речовина включає в себе, без обмежень, катіонну, аніонну або неіонну поверхнево-активну речовину, наприклад Твін-80; і підсилювач іонної інтенсивності включає в себе, без обмежень, хлорид натрію.
Використовуваний тут термін "ад'ювант" стосується неспецифічного підсилювача імунітету, який може посилювати імунну відповідь організму на антиген або змінювати тип імунної відповіді при введенні в організм разом з антигеном або до введення антигену. Існує багато ад'ювантів, включаючи, без обмежень, алюмінієвий ад'ювант (наприклад, гідроксид алюмінію), ад'ювант Фрейнда (наприклад, повний адювант Фрейнда і неповний ад'ювант Фрейнда), ліпополісахарид Согупебасіегішт рагмит, цитокін і тому подібне. Ад'ювант Фрейнда найбільш
Зо широко застосовується в експериментах на тваринах на даний час, а гідроксид алюмінію широко використовується в клінічних випробуваннях.
Використовуваний тут термін "ефективна кількість" стосується кількості, достатньої для досягнення або щонайменше часткового досягнення бажаних ефектів. Наприклад, термін "профілактично ефективна кількість" для захворювання (наприклад, захворювання, пов'язаного з надмірним зв'язуванням СТІ А4 з В7 або активністю СТІ А4, такого як пухлина) стосується кількості, достатньої для запобігання, купірування або затримки розвитку захворювання (наприклад, захворювання, пов'язаного з надмірним зв'язуванням СТІ А4 з В7 або активністю
СТІ А4, такого як пухлина); і термін "т"ерапевтично ефективна кількість" для захворювання стосується кількості, достатньої для лікування або щонайменше часткового купірування захворювання і його ускладнень у пацієнта, що страждає на це захворювання. Визначення такої ефективної кількості знаходиться в межах компетенції фахівців в даній галузі техніки.
Наприклад, терапевтично ефективна кількість буде залежати від тяжкості підлягаючого лікуванню захворювання, загального стану імунної системи пацієнта, загального стану пацієнта, наприклад віку, маси тіла і статі, способу введення агента, інших видів терапії, що проводяться одночасно, і тому подібного.
Корисний ефект винаходу
Моноклональне антитіло 802 і його гуманізовані антитіла даного винаходу можуть дуже добре і специфічно зв'язуватися з СТІ А4. З них, антитіла 802 і 802(Ке) зв'язуються з мишачим антигеном СТІ А4 з ефективністю зв'язування, яка краще, ніж у контрольних антитіл 1001 (Аїап у. Коппап, Едуага Г.. НаїкК егаІ., НОМАМ СТІ А-4 АМТІВООІЕ5, Патент США Мо 05 698472081) і 11.2.1 (Ооцаїаз Снапев Напзоп, Маїк дозері Мехєи еї а), Нитап топосіопаї апіїрбодієв о СТІ А- 4, Патент США Мо 5 68273681). Гуманізоване антитіло 802НІ111 зв'язується з мишачим антигеном СТІ А4 з ефективністю зв'язування, яка краще, ніж у контрольного антитіла 1001, і порівнянна з 11.2.1. Гуманізоване антитіло 802Н212 зв'язується з антигеном СТІ А4 людини з ефективністю зв'язування, порівнянною з 1001. Гуманізовані антитіла 802Н212 ії 802НЗІЗ зв'язуються з антигеном СТГ А4 мавпи з ефективністю зв'язування, порівнянною з 1001.
Антитіла 802Н2115 ії 802Н21/17 зв'язуються з антигеном СТІ А4 людини з ефективністю зв'язування, яка краще, ніж у контрольних антитіл 1001 і 11.2.1.
Антитіла 802, 802(Ке) і гуманізовані антитіла 802 802Н111, 802Н212, 802НЗІ 3, 802НІ2І1 15 і бо 802Нна2г1І17 можуть конкурувати з В7 за зв'язування з антигеном СТІ А4. З них, 802, 802(Не),
80211 і 802На212 сильніше, ніж 1001, конкурують з В7-2 за зв'язування з СТІ А4; і 802Н111, 802Нна212, 802НЗІ 3, 802НІІ 15 і 802НІІ 17 всі сильніше, ніж антитіла 1001 ї 11.2.1, конкурують з
В7-1 і В7-2 за зв'язування з СТІ А4.
Моноклональне антитіло 802 і його гуманізовані антитіла даного винаходу можуть блокувати зв'язування СІ ТА4 з В7, зокрема, полегшуючи імуносупресію організму СТІ А4 і активуючи Т-лімфоцити з високою мірою ефективності. З них, 802Н212 ії 802Н2115 сильніше, ніж контрольні антитіла 1001 і 11.21, активують Т-лімфоцити.
Короткий опис креслень
Фігура 1. Результати ДСН-ПААГ-електрофорезу злитого білка СТ А4ЕСО-тЕс. Зразки і їх кількості, що наносяться, в 4 доріжках зліва направо: М, маркер, 10 мкл; злитий білок
СТІ АХЕСО-теЕс, 1 мкг; злитий білок СТІ АХЗЕСО-теЕс, 2 мкг; злитий білок СТІ АХЕСО-тЕс, З мкг.
Фігура 2. Результати ДСН-ПААГ-електрофорезу антитіла 802. Зразки і їх кількості, що наносяться, в 4 доріжках зліва направо: М, маркер, 10 мкл; зразок антитіла у відновлювальному буфері для нанесення для білкового електрофорезу, 0,3 мкг; невідновлювальний буфер для нанесення для білкового електрофорезу, 2 мкл; зразок антитіла в невідновлювальному буфері для нанесення для білкового електрофорезу, 0,3 мкг.
Фігура 3. Результати ДСН-ПААГ-електрофорезу рекомбінантного антитіла 802 (802(Ке)).
Зразки і їх кількості, що наносяться, в 4 доріжках зліва направо: М, маркер, 10 мкл; зразок антитіла у відновлювальному буфері для нанесення для білкового електрофорезу, 1 мкг; невідновлювальний буфер для нанесення для білкового електрофорезу, 2 мкл; зразок антитіла в невідновлювальному буфері для нанесення для білкового електрофорезу, 1 мкг.
Фігура 4. Результати ДСН-ПААГ-електрофорезу рекомбінантного антитіла 802, 802Н111.
Зразки і їх кількості, що наносяться, в 4 доріжках зліва направо: М, маркер, 10 мкл; зразок антитіла у відновлювальному буфері для нанесення для білкового електрофорезу, 1 мкг; невідновлювальний буфер для нанесення для білкового електрофорезу, 2 мкл; зразок антитіла в невідновлювальному буфері для нанесення для білкового електрофорезу, 1 мкг.
Фігура 5. Результати ДСН-ПААГ-електрофорезу рекомбінантного антитіла 802, 802Н212.
Зразки і їх кількості, що наносяться, в 4 доріжках зліва направо: М, маркер, 10 мкл; зразок антитіла у відновлювальному буфері для нанесення для білкового електрофорезу, 1 мкг;
Зо невідновлювальний буфер для нанесення для білкового електрофорезу, 2 мкл; зразок антитіла в невідновлювальному буфері для нанесення для білкового електрофорезу, 1 мкг.
Фігура 6. Результати ДСН-ПААГ-електрофорезу рекомбінантного антитіла 802, 802НЗІ 3.
Зразки і їх кількості, що наносяться, в 4 доріжках зліва направо: М, маркер, 10 мкл; зразок антитіла у відновлювальному буфері для нанесення для білкового електрофорезу, 1 мкг; невідновлювальний буфер для нанесення для білкового електрофорезу, 2 мкл; зразок антитіла в невідновлювальному буфері для нанесення для білкового електрофорезу, 1 мкг.
Фігура 7. Результати ДСН-ПААГ-електрофорезу рекомбінантного антитіла 802, 802Н21 15.
Зразки і їх кількості, що наносяться: М, маркер, 10 мкл; зразок антитіла в невідновлювальному буфері для нанесення для білкового електрофорезу, 1 мкг; зразок антитіла у відновлювальному буфері для нанесення для білкового електрофорезу, 1 мкг.
Фігура 8. Результати ДСН-ПААГ-електрофорезу рекомбінантного антитіла 802, 802Н21 17.
Зразки і їх кількості, що наносяться: М, маркер, 10 мкл; зразок антитіла в невідновлювальному буфері для нанесення для білкового електрофорезу, 1 мкг; зразок антитіла у відновлювальному буфері для нанесення для білкового електрофорезу, 1 мкг.
Фігура 9. Результати визначення динамічних характеристичних параметрів тАбБ 802.
Фігура 10. Результати визначення динамічних характеристичних параметрів 802НІ111.
Фігура 11. Результати визначення динамічних характеристичних параметрів 802Н212.
Фігура 12. Результати визначення динамічних характеристичних параметрів 802НЗІ 3.
Фігура 13. Результати визначення динамічних характеристичних параметрів 802Н2І 15.
Фігура 14. Результати визначення динамічних характеристичних параметрів 802Н21 17.
Фігура 15. Гістограма, яка показує експресію СТІ А4 на немічених клітинах 293Е, в ізотипічному контролі і клітинах 293Е-СТІ А4, як визначено за допомогою проточної цитометрії (кількість клітин-флуоресценція (ФІТЦ)У).
Фігура 16. Середня інтенсивність флуоресценції (СІФ) експресії СТІ А4 на немічених клітинах 293Е, в ізотипічному контролі і клітинах 293Е-СТІ А4, як визначено за допомогою проточної цитометрії.
Фігура 17. Результати ЕСзо зв'язування тА 802 з міченими клітинами 293БЕ-СТІ А4.
Фігура 18. Результати ЕСзхо зв'язування антитіла 802(Ке) з міченими клітинами 293Е-СТІ А4.
Фігура 19. Результати ЕСзо зв'язування 802НІ1 1 з міченими клітинами 293БЕ-СТІ А4. бо Фігура 20. Результати ЕСзо зв'язування 802Н212 з міченими клітинами 293БЕ-СТІ А4.
Фігура 21. Результати ЕСзо зв'язування 802НЗІ З з міченими клітинами 293БЕ-СТІ А4.
Фігура 22. Визначення зв'язування антитіл 802, 802НТІ 1 і 802(Ке) з СТІ А4 з використанням методу ІФА.
Фігура 23. Визначення зв'язування рекомбінантних антитіл 802Н212 і 802НЗІЗ з СТІ А4 людини з використанням методу ІФА.
Фігура 24. Визначення зв'язування рекомбінантних антитіл 802Н212 і 802НЗІЗ з СТІ А4 мавпи з використанням методу ІФА.
Фігура 25. Визначення зв'язування рекомбінантних антитіл 802Н21 15 і 802Н2117 з СТІ А4 мавпи з використанням методу ІФА.
Фігура 26. Результати ІФА для конкурування антитіл 802, 802Н111 і 802(Ке) з В7-1.
Фігура 27. Результати ІФА для конкурування антитіл 802, 802НТІ 1 і 802(Ке) з В7-2.
Фігура 28. Результати ІФА для конкурування антитіл 802Н212 і 802 НЗІЗ з В7-1.
Фігура 29. Результати ІФА для конкурування антитіл 802Н212 і 802НЗІЗ з В7-2.
Фігура 30. Результати ІФА для конкурування антитіл 802Н21 15 і 802Н21 17 з В7-1.
Фігура 31. Результати ІФА для конкурування антитіл 802На21І 15 і 802Н21 17 з В7-2.
Фігура 32. Вплив на рівень секреції І/-2 Т-лімфоцитами, визначений за допомогою методу
ІФА, після спільного культивування протягом 72 годин з мононуклеарними клітинами периферичної крові (МКПК), клітинами Раджі і гуманізованими антитілами 802Н111, 802Н212 або 802НЗІ 3, відповідно. Результати показують, що гуманізовані антитіла тАБб 802 підвищують секрецію 1-2 Т-лімфоцитами, шляхом блокування рецептора СТІ А4.
Фігура 33. Вплив на рівень секреції І/-2 Т-лімфоцитами, визначений за допомогою методу
ІФА, після спільного культивування протягом 72 годин з мононуклеарними клітинами периферичної крові (МКПК), клітинами Раджі і гуманізованими антитілами 802Н2115 або 802 На 17, відповідно. Результати показують, що гуманізовані антитіла тАб 802 підвищують секрецію 1-2 Т-лімфоцитами, шляхом блокування рецептора СТІ А4.
Фігура 34. Крива росту пухлини, підшкірно трансплантованої моделі пи-5С10О-га)ії, що одержувала лікування 802На212.
Конкретні варіанти здійснення винаходу
Варіанти здійснення даного винаходу будуть детально описані нижче з посиланням на
Зо Приклади. Фахівцям в даній галузі техніки буде зрозуміло, що наступні Приклади призначені тільки для ілюстрації даного винаходу. Їх ні при яких обставинах не треба розглядати як обмежуючі обсяг винаходу. Приклади, для яких не описані конкретні методи або умови, виконували з використанням методів або умов, розкритих в літературі даної галузі техніки (наприклад, 4). затьгоок еї а!., переведеної Рейапд НОАМО еї аї., МоІесшаг СіІопіпод: А Гарогафогу
Мапиаї!, Тріга Еайіоп, Зсіепсе Ргев55), або відповідно до інструкцій до продуктів. Реагенти і інструменти, для яких не вказаний постачальник, являють собою звичайні продукти, які є комерційно доступними.
У наступних Прикладах даного винаходу мишей лінії ВАГВ/С придбавали у сцапдаопда
Меаісаї! І арогаюгу Апітаї! Сепівг.
У наступних Прикладах даного винаходу Т-лімфоцити одержували від АКезо Віорпагта Іпс., «4 попд5пап.
Контрольне антитіло 1001 одержували, як описано в Патенті США Мо 698472081; і антитіло 11.21 одержували, як описано в Патенті США Мо 668273681.
Приклад 1. Одержання СТІ А4-802 гібридомної клітинної лінії ЇТ001 їі одержання моноклонального антитіла 802
Рекомбінантний СТІ А4 експресували в експресійній системі клітин ссавця для імунізації ним мишей як антигеном, і клітини гібридоми одержували шляхом злиття мишачих клітин селезінки з клітинами мієломи. Гібридомну клітинну лінію (СТІ А4-802 гібридомну клітинну лінію І Т001) одержували після скринінгу великої кількості зразків. Вказана клітинна лінія могла секретувати моноклональне антитіло 802, яке специфічно зв'язується з СТІ А4. Конкретні способи описані нижче. 1. Синтез гена СТІ АЗЕСО-тЕс
Згідно зі схемою будови злитого білка (ЗЕО ІО МО: 3), амінокислотну послідовність (ЗЕО ІЮ
МО: 2), відповідну позаклітинному фрагменту гена СТІ А4 (асоційований з цитотоксичними Т- лімфоцитами антиген 4 МСВІ Сепе ІО: 1493, 5ЕО ІЮ МО: 1) (СТІ АЗЕСО), зливали з фрагментом
Ес-білка мишачого ІдсСс (тс), де тес означає фрагмент Ес-білька мишачого Ідс яз амінокислотною послідовністю, показаною у вигляді підкресленої частини в ХЕО ІЮ МО: 3.
Для підвищення ефективності експресії цільового гена в клітинній експресійній системі 293, нуклеотидну послідовність, кодуючу білкову послідовність ЗЕО ІЮ МО: 3, оптимізували в 60 Сепзогірі Со., враховуючи, головним чином, такі фактори як переважні кодони, вміст сс,
повторна структура мРНК і повторювані послідовності. Кінцевий оптимізований ген, кодуючий злитий білок СТІ АЗЕСО-тЕс, мав наступну послідовність (ЗЕО ІЮО МО: 4) і був синтезований в
Сепвсетгірі Со.
Послідовність гена СТІ АХЕСО (375 п.н.):
ССААТОСАССТОССССАСССТОСТОТОСТАСТОИаСССАССАС
СССАСССАТССССАССТІ ТОТОТСОТСОАСТАТСОСАТСТССАСССА
ААХИХССАСТОАЛАСТСССОИССТСАСАСТОСТТССИССАСССТАсСАС
ССАССТСАСТСААСТСТОТСССССААССТАСАТСАТССССААТ
САСТТІТСАССТІССТАСАТСАТТССАТСТОаСАСССССАССТССА С
ТОоОСАААТСААСТСОААССТСАСТАТССААССАСТОАСССОССАТОС
АСАССССАСТСТАСАТСТИСААССТОСАССТСАТСТАСССАССС
ССАТАСТАССТСОСОССАТАСССААСССТААСССАСАТІТАТСТААТ
ТСсСАТССАСААСССТССССАСАТТСТСАС. ( ЗЕОІЮ МО: 1 )
Послідовність білка, кодованого СТІ А4ЕСО (125 а.к.):
АМНУАХОРАУМІАВЗЗВКСОСТАЗВЕУСЕУХАВРСОКАТЕУВУТУІКОАОВ
ОУТЕУСААТУММОМЕ ТЕ ВОВІСТСТ5ЗСМОУМОТІОСІКАМОТ
СІМІСКУЕІМУРРРУМСІСМСТОТУУІЮРЕРСРОБО ( КО ІВ МО: 2)
Послідовність злитого білка СТІ АЗЕСО-теЕс (364 а.к.), де частина СТІ А4ЕСО підкреслена хвилястою лінією, а частина тес підкреслена жирною лінією:
АМНУАОРАУУГАВЗКО1ІАЗБЕУСЕХАЗРОКАТЕУКУТУГ КОХАЮ
ОУТЕУСААТУММОМЕГСТЕСООВІСТОТ5ЗОМОУМ С ЛІОСГКАМОТ
ОСГУІСКУЕСМУРРРУХСІСМСТО1УУІЮРЕРСРОЗБОЛ ЕМ УКОСРКСО
РІКРСРРСКСРАРМІЛ,ССРЗУКІКРРКІКОМІ,МІБВІ5РІУТСУУУЮВУВ
ЕПРОРОМОІЗМВЕУММУЕУНТАаОТОТНКЕВУМОТІ КУУВАГРІОНОЮ
УМ5ОКЕЕКСКУМАКОРАРІСЄКТІЗКРЕСЗУВАРОМУМІРРРЕЕЕМ
ТЕКОУТІЛСМУТОЕМРЕТУ УЕУУТАМСОКТЕМУ КМТЕРМІ,Ю5ОСВ
МмЕМУ5КІКУЄЕККАУММУЄЕКМВУВСЗУМУНЕСІНУННТІТКьЕАТРОК (5ЕО І МО: 3)
Кодуюча послідовність гена, відповідна злитому білюу СТГ АЯ4ЕСО-тЕс (1092 п.н.), де частина СТІ АЯ4ЕСО підкреслена хвилястою лінією, а частина тес підкреслена жирною лінією:
ССААТОССАТОСтТСОСАСАОССТОСАСТОСТССТО САЛО
САССССААТСОСТАССТТССТСОТОССААТАСОСТТІССССАСССА
АСОССЛАССОАОСтТССССОТОАСАОтТССтТОвАСАСАоОсСССАСАС
ССАССТОСАСАСААСТСТОСССССОССТАСТТАТАТСАТССССААСС
АССТСАССІТТСТОСАССАТАССАТТТСТАСССССАСАТСТАСТ.
ССАЛДАССААСТСААТСТОАССАТССАСООССТОСОССОСТАТОС
АСАСЛДОСССТСТАСАТТТСТАЛАСТОСАССТОАТСТАТСССССТ
ССАТАСТАТСТОССААТССССААСОИССАСССАСАТСТАССТСАТ.
ТОСАТССТСЛАССАТОСССССАСТОСССАТОАСААТСТОТАТТТСС
АОсССАССАСОАССССССАСААТТААСОССАТОТСССССТІССААА
ТСТССТоОСАССААДАССТОСТОССАССАССААСССТСТТСАТСТТ
ТССАСССААСАТСААДССАССОСТОСТОАТСАТСТСАСТСОАСССССА
ТІСТСАССТОССТОСТССТОСАССТСАСССАССАССАТССТСА
ТСТОсССАСАТСАЄСТТСОССТТССТСААСААТСТОаСААСТССАСАСАС
СТСАСАСТСАСАСССАТАСССАССАТТАСААТАСТАСТСТО СОС
СТСОТСТСАССАСТОСССАТТСАССАССАССАСТОСАТСАО СС
ССААССАСТТСААСТОСАААСТСОААСААСААССАТСТОСССОС
АССТАТССАСАСААСТАТТ ТССААаСОССТАаЛАсСсСсСТОТОТ САС
ССССАСАССОТОТАТО ТТ ССТОССТССАССССАССААСАСАТСАСТ
ААСААдАСАССТСАСАСТСОАСТІТСТАТОСТСАСССАСТТСАТОСС
СОСААСАТАТСТАСЬТОСАСТСОСАСТААСААТОССЛАСАСССАА
СТСААСТАТАААААТАСАСАСЄССТОТССТОСАСТСАСАТСОСА АС
СТАСТТТАТСТАТАССААСОСТОССАСТОСААЛААСАААААСТОСС
ТССАСССОСААСАССТАСТСТТ СТАТ СТОСТССАССААССССТО
САТААТСАССАСАССАСТАААТСАТТСТССССААСТССАСССАА
А (5ЕО І МО: 4) 2. Одержання плазміди РОС575ітріе-СТІ АХЗФЕСО-тЕс
Синтезований злитий ген СТ А4ЕСО-тЕс (5ЕО ІЮ МО: 4) клонували в експресійний вектор рОсС575ітріє (наданий Сепзогірі Со.) в Сепзсгірі Со., одержуючи плазміду рОС575ітріе-
СП АЯЕСО-теЕс. 3. Конструювання рекомбінантної плазміди рсОМАЗ.1-СТІ АЗФЕСО-тЕс
Плазміду рОС575ітріе-СТ А4ЕСО-тЕс розщеплювали ендонуклеазами Хбра! і Ватні.
Фрагмент злитого білка СТ А4ЕСО-тЕс виділяли за допомогою електрофорезу і лігували в експресійний вектор рсрМАЗ.1 (придбаний у Іпмігодеп Со.). Одержану плазміду ресОМАЗ.1-
СТІ А4ЕСО-тЕс використовували для трансфекції компетентних клітин Е.соїї штаму ОН5ба (придбані у ТІАМСЕМ Со.). Трансфекцію і культивування проводили відповідно до інструкцій.
Позитивні по рсОМАЗ.1-СТІАЯ4ЕСО-тЕс колонії Е.соїї відбирали і розмножували загальноприйнятими способами. Потім рекомбінантну плазміду екстрагували за допомогою набору реагентів (придбаного у Тіапдеп Віоїесп (Веїйп9д) Со. ГТО, ОР103-03) відповідно до інструкцій, прикладених до цього набору. 4. Клітини 293Е (придбані у Іпмігодеп Со.) трансфікували рекомбінантною плазмідою реОМАЗ.1-СТІ А4ЕСО-тЕс з використанням набору реагентів для трансфекції І іроїтесіатіпе (придбаний у Іпмігодеп Со.).
5. Через сім днів після трансфекції клітин 293 рекомбінантною плазмідою рсОМАЗ.1-
СТІ АЕСО-тЕс злитий білок СТІ А4ЕСО-тЕс виділяли з культуральної рідини за допомогою високошвидкісного центрифугування, вакуумної фільтрації через мікропористу фільтрувальну мембрану і хроматографії на колонці НіТгар з білком А НР. Після очищення зразки відбирали, додавали у відновлювальний буфер для білкового електрофорезу і аналізували за допомогою
ДСН-ПААГ-електрофорезу. Як показано на Фігурі 1, цільовий білок видний у вигляді зони електрофоретичної рухливості масою приблизно 45 кДа. 6. Одержання СТІ А4-802 гібридомної клітинної лінії ЇТ001
Використовуючи злитий білок СТІ АЗЕСО-тЕс як імуноген, клітини гібридоми одержували шляхом злиття клітин селезінки імунізованих мишей лінії ВАГ! В/С (придбані у зчапддопу Меаіїсаї
ІГарогаїогу Апіта! Сепіег; з мишачими клітинами мієломи по стандартному протоколу (наприклад, 5іемагі 5.9., "Мопосіопа! Апіїбоду Ргодисійоп", іп Вазіс Меїпод3з іп апіїроду Ргодисіп апа Спагасівєгігайноп, Едв. Сб. Ноуага апа О.В. ВеїйеїІЇ, Воса Найоп: САС Ргезв, 2000). СТІ А4 використовували як антиген для покривання ІФА-планшета, і клітини гібридоми, секретуючі нові антитіла, що специфічно зв'язуються з СТІ А4, одержували шляхом скринінгу за допомогою непрямого ІФА. Гібридомні клітинні лінії, секретуючі моноклональні антитіла, які конкурують з лігандом В7-1 (С080, МОВІ Сепе І: 941) або В7-2 (2086, МСВІ Сепе І: 942) за зв'язування з
СТІ АЯ4, одержували шляхом скринінгу за допомогою конкурентного ІФА з клітин гібридоми, одержаних на етапі скринінгу за допомогою непрямого ІФА. Стабільну гібридомну клітинну лінію одержували за допомогою лімітуючого розведення. Гібридомну клітинну лінію позначали як
СТІ А4-802 гібридомна клітинна лінія, і СТГ А4-802 стабільну клітинну лінію одержували за допомогою лімітуючого розведення (також іменовану в даному винаході як 17001; моноклональне антитіло, секретоване цією лінією, позначали як 802). 7. Одержання антитіла 802
Клітинну лінію СТІ А4-802 (11001) даного винаходу культивували в середовищі, доповненому 1095 фетальної бичачої сироватки з низьким вмістом дес. Через сім діб супернатант клітинної культури відбирали для очищення антитіла 862. 8. Визначення антитіла 852 за допомогою ДСН-ПААГ-електрофорезу
Очищені зразки додавали у відновлювальний буфер для нанесення для білкового
Зо електрофорезу і в невідновлювальний буфер для нанесення для білюового електрофорезу.
Після кип'ятіння проводили виявлення. Результати показують, що цільовий білок видний у вигляді двох зон електрофоретичної рухливості масою приблизно 50 кДа і 25 кДа для зразка білка в відновлювальному буфері або у вигляді зони електрофоретичної рухливості масою приблизно 150 кДа для зразка білка в невідновлювальному буфері (Фігура 2).
Приклад 2. Визначення послідовностей легкого ланцюга і важкого ланцюга моноклонального антитіла 802
Додержуючись інструкцій до набору реагентів для ЗТ-ПЛР системи синтезу першого ланцюга Зирегеогірке ПІ (Іпмігодеп), синтезували кДНК і ампліфікували її за допомогою ПЛР.
Продукт ПЛР-ампліфікації негайно піддавали ТА-клонуванню по інструкції до набору реагентів для клонування рЕАБУ-Т1 (Тгап5беп, Са Мо СТ101). Продукти ТА-клонування негайно секвенували, результати секвенування наведені нижче.
Результати секвенування ДНК варіабельної області важкого ланцюга (345 п.н.):
СсСАССТСАААСТОСАССАААСТОСССССССОСТОСТОСАСС
ССССАССАССТАТСААСЮСТОТСАТОССЬТССЬССАСССССТТСАСС
ТТАСССАСААСТОСАТСААТТИСТпАСССАСПАССССАСАСА
АОСССОСТОСААТОСЮСТОССТСАСАТССССААСААДАСССТАСААТ
ТАТСАСАССТАСТАТТСТОАСАСТОТСААСССССССТТСАСААТ
ПІССАСАСАССАТІСТААААЮСТСССТСТАССТОСАСАТСААСА
АТСТОСАСАССССААСАТАТОСССАТСТАСТАТТОСАСАССАСАС
ТтІСССТТАТТОСССАСАССССАСТСТОСТСАСАСТСТССОСС (5ЕО ПО МО: 5)
Кодована нею білкова послідовність (115 а.к.):
ЕУКГСОЕТСССІМОРСЕРМКІВСУАЗСКЕТЕЗОКУММУУКОВР
ЕКСТГСЕУМГАОКМКРУМУЄТУУВОоВУКОКЕТКООВКВьУМУ ОМ
ІВСЕРМСІУУСТАОКАУМСОСТІУТУВА (5КО І МО: 6)
Результати секвенування ДНК варіабельної області легкого ланцюга (318 п.н.):
САСАТТСАСАТСАСАСАСАСТССТОСТІСССТСАСТОССтТС
АСТОССССАСАСССТСАСААТСАСТТСССССАССТСТСААААСА
ТІСТАСССОССССССТСААТТОСОТАТСАССССААССАССССАЛААС
ТССССАСОСТОСТСАТСТТСИСАССААСАААССТОИССССАССССА
ТСАССТССССОСТІТАССССОТССССАТСТОаССАСАСАСТАСАС
ССТОоААСАТТТСТАСТСТОоСАСССАСАССАТСОСТОСОСТАСТТАСТ
АТТОССАСААТОТ ССТСАССАСТСССТІТСАССТТТОСОСТСАССА
АСАААССТССАСАТС (5ЕО ТО МО: 7)
Кодована нею білкова послідовність (106 а.к.):
ПІОМТО5РАВІБАЗУСЕТУТІТССТЗЕМУССІММУУОВКОСКЬ
РОГІЛЕСАТМ АОсоМЗЗКЕСсВ КОМІ КІЗЗІ НРОЮУАТУХУСОМ
Е УКЕ5РЕТЕС5СТКІЖІ (5ЕО 1 МО: 8)
Приклад 3. Дизайн послідовностей легкого ланцюга і важкого ланцюга гуманізованих антитіл 8ра2н111, 8р2Ннаг12, 802НЗІ 3, 802НІІ 15 і 802Н21І 17
На основі тривимірної кристалічної структури білка СТІ А4 (Маї. бігисі. Віої. (1997) 4, р. 527) і послідовностей антитіла 802, одержаних в Прикладі 2, структуру антитіла моделювали на комп'ютері. Послідовності варіабельної області антитіл 802Н111, 8р2Нна12, 802НЗІ З, 802Н2115 і 802Н2117 були сконструйовані на основі послідовностей антитіла і структурної моделі (послідовності константної області антитіла були взяті з бази даних МСВІ). Послідовності варіабельної області наведені нижче. 1. Послідовності легкого ланцюга і важкого ланцюга моноклонального антитіла 802НІ11 1
Послідовність ДНК варіабельної області важкого ланцюга (345 п.н.):
СААСТОСАССТОСТССАСТ ССО ССССтТОСТОСАСсС
САССАССАТСААТОССАСТОАССТОаССССОСТТСССССТТСАСС
ПСсСАаССпАСААСТОСАТСААТТИСТСАСССАСССАССАССАА
АСССАСТОСАСТООССТОССАСАСАТСССИСААСАААССТТАСАА
СТАССАААСТТАСТАСАСССВАСТОССТаАЛ АС ССССТТСАССА
ТПІТСТАСАСАССАТТСТАААААСАСЮТОТОТАССТОСАСАТСААТ
АСССТСААСАСССВАССАТАСАССАСТСТАСТАТТСТАССССАСА
СТІТТОИСТТАТ ТО ССССАССССАСТСТОСТСОСАСАСТСТСТТСА
(ЗЕО І МО: 9)
Кодована нею білкова послідовність (115 а.к.):
ЕМО УЕВСССТМОРОСЗМЕВСААВСЕТЕОМУММУМУКОАР
СКСЕМГАОВМКРУМУЕТУУОУКСВЕТІВКООЗКМВУМІ ОМ М
ІКТЕОТСУХУСТАОВгАаУМСОСТІУТУвВ ( ЗКО І МО: 10 )
Послідовність ДНК варіабельної області легкого ланцюга (321 п.н.):
САСАТТСАСАТСАСТСАСАССССТТСААСССТОТССССАТС
ТТ ОССССАСССАСТСАССАТСАСАТСОСАСААССТСССАСААСА
ТСТАССССССОСОСТСААТТОСТАТСАИСПВАлАССАпСаИСАлААс
ТСССААОСТОСТОАТСТАССЬССССААСАААССТаИСССАССОСА
АТСАССТССАСАТТСАСТОСАТСАСССАСССССАСАСАТТАТАС
ТСТСААААТІТСТАСТСТОСАСССАСАССАТСОСТСОССААССТАСТ
АТТОССАСААТСОСТОССТОСАССТСАСССТТСАССТІ ТССАЛЛСССОСС
АСААААСТССАСАТСААС, ( ЗКО І МО: 11 )
Кодована нею білкова послідовність (107 а.к.):
ПІОМТО5Р5ЬВІ БАБУ СОКУТІТСКТЗЕМ МСС МУ МОККОСК
РКІЛІУСАТМАВСМЗА КОС СТО МІ КІВІ НРОПУАТУ СОМ
УП Е5РЕТЕСЗСТКІКІК (5ЕО І МО: 12) 2. Послідовності легкого ланцюга і важкого ланцюга 802 гуманізованого моноклонального антитіла 802Н212
Послідовність ДНК варіабельної області важкого ланцюга (345 п.н.): селу с еукеосевкеекве: сек весеееееевокеекеолео
САССАССАТСААТОССАСТОАЛАСОСтТОСОССОСТТССОССТТСАсСС
ТТСАСССАСААСТОСАТСОСААТТОСТСАСССАСССАССАССАА
АСССАСТОСАСТОСОСТОССАСАСАТССССААСААЛАССТТАСАА
СТАССАААСТТАСТАСАСССИССТСССТпЛ АС ССОСТТСАССА
ПІТСТАСАСАССАТІСТАААААСАСТОТСОСТАССТСОСАСАТОСААТ
АСССТСААСАСССАССАТАСАССАСТСТАСТАТТСТАССССАСА
СТІТОССТТАТТССССССАССССАСТСТОСТСОАСАСТСТСТТСА
(5ЕО І МО: 13)
Кодована нею білкова послідовність (115 а.к.):
ЕМО МЕССІ МОРССЗМЕКЕЗСААВСЕТЕОММУММУМУ КОР
СКСГЕМАОКМКРУМУЄЕТУУЗАЗУКСККТІЗКООВКМВУМУ ГОМ
ІКТЕОТСУУУСТАОБАУМУСОСТІУТУВ55 (5ЕО І МО: 14)
Послідовність ДНК варіабельної області легкого ланцюга (321 п.н.):
САСАТТСАСАТСОАСТСАСАСОСССТТСААОССТОАоТОССТС
АСТОССАСАСССССТСАССАТСАСАТССАСААССАСССАСААС
АТСТАССССССОССТОААСТОСТАТСАСССААЛАСССАССИСААСА
СССССААССТОСТСАТСТАССССССААССААССТООССТСТОСА
СТСАССТССАСАТТСАССССПССАСССССТСТСССАСССАСТАТА
СТСТСАССАТІТ ТСТАСТСТОСАСОСССТСОААСАТСТОССААСАТАС
ТАТТИССАСААТОТ ССТаАЛ ОС ТССССАТТСАССТТТОСАТСТОС
САССААССТОССАСАТСААС ( 5ЕО І МО: 15)
Кодована нею білкова послідовність (107 а.к.):
РІОМТО5Р5ЬВІ ЗБАЗУСОКУТТСКТВЕМІ КОСІ МУ МОВКРОКВР
КІЛУСАТМГАВОСУЗВЗККВСВОЗСТОУТІЛІЗВОРЕОУАТУУСОМУ
ІВ5РЕТЕС5СТКІ КІК ( ЗзКО 10 МО: 16 )
З. Послідовності легкого ланцюга і важкого ланцюга 802 гуманізованого моноклонального антитіла 802НЗІ З
Послідовність ДНК варіабельної області важкого ланцюга (345 п.н.): емо еике олово елек елек ее оо
СсССООССССОСТСАСТОССАСТОАССТОССОССССТІСССССТТСАС
СсСТТСАаАСССАСААСТОСАТСААТТ СТ пас САСО САС
ААССОССТОСАСТОССТССОСТСАСАТССССААСААДАССТТАСА
АТТАТСАСЧАСАСААТАСИСАСССТСТИТпЛ АС СОСТТСАСТ
АТТАСТАСАСАССАТАССААСААСАСССССТАТСТОСАСАТСАА
ТАСССТОААСАСССААСАТАСАССССОТСТАСТАТТСТАСАССТС
АСТІТОСАТАСТОСССССАСОССААСТСТОСТОвАССОТСАОСТСС (5ЕО ІВ МО: 17)
Кодована нею білкова послідовність (115 а.к.):
ЕМХОГСУЕВССОМОРОСВІ КІ ЗСААВОЕТЕОМКУММУМУКОАРС
КО ЕМУАОЇКМКРУМУЕЄЕТЕУААВУКСКЕТІКООЗКУЗАУ ОМ МІ,
КТЕОТАУУУСТАОКАУМСОСТІУТУВ5 (5ЕО І МО: 18)
Послідовність ДНК варіабельної області легкого ланцюга (321 п.н.):
САСАТТСАСАТОСАСТСАСАССССТІСТІСТСТОТСССОСАТСТ
СТоОСОСАСАСССОССТСАССАТСАСАТОСАСАСССАСССАСААСА
ТСТАССОССОССОССТОСААСТОСТАТСАССАСАА ССС СААлАОС
ТСсСССААССТОСТОАТСТАСИСАССААССТОССТОССАТСТОСАС
ТОоОССАТССССООСТТСАСТОСАТСАСССАСССОСАСССАСТАТАСТ
СТСАССАТТАССТОСССТОСАСССТСААСАСТІССССАСАТАСТА
ТТОССАСААССОТОСТОоАССТССССАТТСАССТІТТОСАТСТОССА
ССААССТОССАСАТСААС (5ЕО І МО: 19)
Кодована нею білкова послідовність (107 а.к.):
ПЛІОМТО5РЬБІЗАЗУСОКУТІ ТТ СКАВЕМТУ СС МУ КООКРОКА
РКІЛІЛУСАТОАВСУРЗККЗОЗСЗСОСТОУТІ ЛІЗІ ОРЕОКАТУУСОМУ
ІЕ5РЕТЕСЗСТКІ ІК (5ЕО І МО: 20) 4. Послідовності легкого ланцюга і важкого ланцюга 802 гуманізованого моноклонального антитіла 802Н21І15
Послідовність ДНК варіабельної області важкого ланцюга (345 п.н.):
СААСТССАССТОСТССАСТССССССсССССССТоСстТоС
АСССАССАССАТСААТСОСССАСтТСАЛОССТОСОССОоСТТССсоС
СТТСАССТТСАСССАСААСТОСАТСААТТОССТСАсСОСАСС
САССАССААдАСССАСТОСАСТ ОСТ ССАСАСАТСССИСАА
СААДАССТТАСААСТАССАЛААСТТАСТАСАСССОССТСССТоА
АСССССССТТСАССАТІТСТАСАСАССАТІСТААДАААСАСТ
СТОТАССТОСАСАТСААТАСССТОААСАСССАССАТАСАСС
АСТСТАСТАТТСТАССССАСАСТТТОСТТАТТОССССОСАсСсе
ССАСТСТОСТСАСАСТСТСтТТСА (5ЕО І МО: 13)
Кодована нею білкова послідовність (115 а.к.): ,опажевепочеслимвсевуе ши ьулльаг
ОАРОКСТ ЕМ АОКМКРУМУЄТУУВАЗУКОКЕТІЗКООЗКУВУ
УГОММУБІКТЕОТСУУХУСТАаОКАУМСОСТІУТУ55 ( ЗО І
МО: 14)
Послідовність ДНК варіабельної області легкого ланцюга (321 п.н.):
САСАТССАСАТСАСТСАСОТСТСССАОСстТСССТОтТССсос
ПСО СОоССАТССССТСАСТАТСАССТСОСТАСААССАССС
АСААСАТІТАССССССАСТСОААТТСОСТАТСАСАССАлЛсССС
СССААДААСТССТААОСТОСТОАТСТАССЬСАССААСААЛАССТ
ССССТССССССОСТСОТІСТАСТСОСТІСАСТСОСАТСАСССАсСсс
СОСАСССАСТАТАСАСТОАСТАТТ ТСААСССТОоСАСССАСАС
САТОТССССАСАТАСТАТТОССАСААТОТССТСАССССССА
СсССсСССССАТТТОССТСАСССАССАААСТССАААТТААС (КО
Іо МО: 21)
Кодована нею білкова послідовність (107 а.к.):
ПРІОМТО5РЬБІЗАЗУСОКУТІТСКІВЕМІ УСС КМУ УОККР
СКЗРКІЛІУСАТААВСУВЗКЕЗСВСЗСТОУТІЛІВВ ОРЕППХУАТ
УУСОММУІ5ЕНРСЕСВ5СТКІКІК (5КО І МО: 22) 5. Послідовності легкого ланцюга і важкого ланцюга 802 гуманізованого моноклонального антитіла 80221 17
Послідовність ДНК варіабельної області важкого ланцюга (345 п.н.):
елучекеолоевкееквелсенковеееееевевокееике о.
АСССсСАОСАССАТСААТОССАСТОАЛАОСТОСОССОСТТССос
СТТСАССІТ ТСАСССАСААСТОСАТСААТТОССТСАСССАСс
САССАССААдАССОССАСТОСАСТОСОСТОССАСАСАТССССАА
САААССТТАСААСТАССАААСТТАСТАСА ССОССТССОТОА
АСССССССТТСАССАТІТСТАСАСАСОСАТІСТААДАААСАСТ
СТСоОТАССТОСАСАТСААТАСССТОоААСАСССАССАТАСАСС
АСТСТАСТАТІСТАССССАСАСТІТОССТТАТТССССССАСС
ССАСТСТОСТОАСАСТСТСТТСА (5ЕО І МО: 13)
Кодована нею білкова послідовність (115 а.к.):
ЕМО МОРОЗ МКІЗСААВСЕТЗОМУММУУК
ОАРОКСТ ЕМ АОЇКМКРУМУЄЕТУУЗАЗУКСКЕТІЗКООЗКМВУ
УмОМУБІКТЕЮЮТСУУУСТАаОВКАУУМСОСТІУТУВЬ ( зКО 1
МО: 14)
Послідовність ДНК варіабельної області легкого ланцюга (321 п.н.):
САСАТССАСАТСОАСТСАСТСАСССАОСТСССТОАСТО
СТПСАСТОССССАТССОИССТСАСТАТСАССТОТА СА АССАСС
САСААСАТТТАСССИСССАСТСААТТОСТАТСА СПА ССАлсСС
СсСаСсСсСАААлАССССТААСОСТОСТОаАТСТАСИЧНА ССААСААА СС укееооиковесвекоенковру. еко еоишколевееоевевоикону
ССААСССАСТАТАСАСТСАСТАТТТСААСССТССАСССАСА
ССАТСТОСССАСАТАСТАТТСССАСААТСТССТОТССТСтТС
САСССССАТІТОССАСТОССАССАААСТСОСАААТТААС
Е (5ЕО І МО: 23)
Кодована нею білкова послідовність (107 а.к.):
ЛОМТО5РЗВІ ЗАЗ СОКУТІТСКТЗЕМІ СС МУ МОККР
СКьРКІЛЛІЛУСАТААВСУВВКЕССВСЗСОСТОУТІЛІЗВОРКЮЄОЮМУАТ
УХСОМУМІвЗЗеРОКСзЗОСТ КІ КК ( ЗзКО 10 МО: 24 )
Приклад 4. Одержання 802 рекомбінантного антитіла, 802(Ке) і 802 гуманізованих антитіл 8ра2нІ11, 802Н213, 802НЗІ 3, 802Н21І 15 і 802НІІ 17 і їх виявлення за допомогою ДСН-ПААГ- електрофорезу 1. Одержання 802 рекомбінантного антитіла, 802(Ке) і виявлення за допомогою ДСН-ПААГ- електрофорезу
Послідовність КДНК важкого ланцюга (послідовність її варіабельної області показана в ЗЕО
ІО МО: 5) і послідовність КДНК легкого ланцюга (послідовність її варіабельної області показана в 5ЕО І МО: 7) антитіла 802 клонували у вектор руС575ітріе (наданий Сепзогірі Со.), відповідно, одержуючи плазміду РОС575ітріє-802Н і рОоС575ітріє-8021.
Плазміди рОС575ітріє-802Н і рОоС575ітрівє-802І!. розщеплювали ендонуклеазами (Ніпані і
ЕсоКІ), відповідно. Фрагменти, кодуючі важкий ланцюг і легкий ланцюг, виділені за допомогою електрофорезу, окремо субклонували у вектор рсОМАЗ.1. Рекомбінантні плазміди екстрагували і котрансфікували ними клітини 293Е. Через сім днів культивування клітин культуральну рідину піддавали високошвидкісному центрифугуванню, вакуумній фільтрації через мікропористу фільтрувальну мембрану і очищенню на колонці Нітїтар з білююм А НР. Очищені зразки додавали у відновлювальний буфер для нанесення для білкового електрофорезу і в невідновлювальний буфер для нанесення для білкового електрофорезу. Після кип'ятіння проводили виявлення за допомогою ДСН-ПААГ-електрофорезу. Як показано на Фігурі 3, цільовий білок видний у вигляді двох зон електрофоретичної рухливості масою приблизно 50 кДа і 25 кДа для зразка білка в відновлювальному буфері або у вигляді зони електрофоретичної рухливості масою приблизно 150 кДа для зразка білка в невідновлювальному буфері. 2. Одержання 802 гуманізованих антитіл 802НІ111, 802На212 і 802НЗІЗ ії їх виявлення за допомогою ДСН-ПААГ-електрофорезу
Послідовності КДНК важкого ланцюга (послідовності їх варіабельних областей показані в
ЗЕО ІЮО МО: 9, 5ЗЕО ІО МО: 13, 5ЕО ІЮ МО: 17, ЗЕО ІЮО МО: 13, 5ЕО ІО МО: 13, відповідно) і послідовності КДНК легкого ланцюга (послідовності їх варіабельних областей показані в 5ХЕО ІЮ
МО: 11, 5ЕО ІО МО: 15, 5ЕО ІЮ МО: 19, 5ЕО ІЮ МО: 21, 5ЕО ІЮО МО: 23, відповідно) антитіл 8ра2н111, 8р2наг1І2, 802НЗІ 3, 802НІІ 15 і 802Н21І 17 клонували у вектор рОС575ітріеє (наданий
Сепвзогірі Со.), відповідно, одержуючи плазміди руС575ітріє-ВО2НТІІ 1, рОоС575ітрівє-8р2Ннаг12, росС57вітріє-ВО2НЗІ 3, рОС57вітріеє-802Н2115 ії рОоС575ітрівє-802Н21 17. Ці плазміди окремо субклонували у вектор рсОМАЗ.1 по методиці, описаній вище для 802(Ке).
Рекомбінантними плазмідами котрансфікували клітини 293Е. Культуральну рідину від клітин 293Е піддавали детектуванню після очищення по методиці, описаній вище для 802(Ке).
Результати показані на Фігурі 4, Фігурі 5, Фігурі 6, Фігурі 7 і Фігурі 8. Цільовий білок видний у вигляді двох зон електрофоретичної рухливості масою приблизно 50 кДа і 25 кДа для зразків білка у відновлювальному буфері або у вигляді зони електрофоретичної рухливості масою приблизно 150 кДа для зразків білка в невідновлювальному буфері. 802 рекомбінантне антитіло, 802(Ке) і 802 гуманізовані антитіла 802НІ111, 8р2На13, 802НЗІ3, 802Н2115 ї 802Н2117, використовувані в наступних прикладах, одержували по методиці, описаній в цьому прикладі.
Приклад 5. Визначення динамічних параметрів антитіл
Динамічні параметри зв'язування антитіла 802 і гуманізованих антитіл 802 Н111, 802Н212 і 802НЗІЗ з антигеном СТІ А4 (МСВІ Сепе ІЮ: 1493 з кодуючою нуклеотидною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮО МО: 25, і кодованою амінокислотною послідовністю, показаною в 5ЕО ІЮ
МО: 26) визначали з використанням аналізатора молекулярної взаємодії Богіебіо. 1. Білок СТІ А4-тЕс (СТІ А4-тЕс одержували таким же способом, як описано в Прикладі 1 для синтезу СТ А4ЕСО-тЕс) розщеплювали протеазою ТЕМ, і антиген СТІ А4 одержували шляхом очищення на колонці.
Послідовність гена СТІ А4 (636 п.н.):
АТОООСОТССТОСТОСАСТСАСАСААСССТОСТОТСССТОСОТ
ССТОоОССАСТОСТОТТТССТТСААТООСТТСААТОССТАТОСАТО
ТОоОСТСАаАОССАССАСТОСТССТООСААОСТССАСССССАТССОС
САСТІТССТОТОССАСТАССССТСАССТОСАААСОССТАСАСААС
ТеССССТСАСТОИ ССТОаАСАСАСОСТСАСТСТСАССТСАСССА
ССТСТОСОССОСТАСАТАТАТВАТОСССААССААСТСАССТТТС
ТОоСАССАТТССАТТТСОТАСТОСОССАССТСТАСТОССААССААСТО
ААТСТОАСТАТССАССОСАСТОССАССААТСОСАСАССССАСТСОСТА
САТІТОСАААСТОСАССТСОАТОТАТСССССТССАТАСТАТСТОС
ССАТСССОССААТССААСАСАСАТСТАССЬТСОАТТСАТССССААССТ
ТОоОТССАСАСАСССАТІТССТОСТОТОСАТТСТОССАССССТОТС
ААлОССООССТОТСТТТТАТАЮСТІТТСТОСТОАСТОССОТСТСССтТ
СТСТААСАТИСТОААСАААСИПАТССССССТОаАССАСАСООССТО
СТСОТСААААТОССАССТАССТА СССССАСТОССАААААСАСТТ
ССАСССАТАСТТТАТСССТАТСААТ (5ЕО І МО: 25)
Кодована нею відповідна амінокислотна послідовність (212 а.к.):
МОМІЛТОВТІ 5 МАЛ ЕРОЗМАОМАМПУАОРАУУ ГГ, АВЗКСІ
АЗВБЕУСЕХМАЗБРОСКАТЕУКУТУ! КОАРЗОУТЕУСААТУММОСМЕЇТ КІ,
ПОБІСТСТ5ВЗОМОУМ ЛІОСТВАМОТСТМІСКУЄІМУРРРУ МІСТІ,
МСТОТУМПОРЕРСРОЗБОКІ Л.М ПАЛ АУВОТКЕУБКТАУБІЗКМІ Кк
КВ5РІТТОСУУУКМРРТЕРЕСЕКОКОРУТІРІМ ( ЗзКО 10 МО: 26 ) 2. Антитіло 802 і його гуманізовані антитіла 802Н111, 802Н212, 802НЗІЗ, 802НІІ 15 і 802Н2117 іммобілізували на поверхні датчика АК2ОС шляхом зв'язування амінокислот і блокували етаноламіном. Після зрівноважування в ФСБТ додавали антиген СТІ А4 для зв'язування. СТІ А4 2-кратно серійно розводили в ФОБТ, і одержували наступні концентрації: 300, 150, 75, 37,5, 18,75, 9,38, 4,69, 0 нМ. Дисоціація проходила в ФОСБТ. Виявлення гуманізованих антитіл 802Н111, 802Н212, 802НЗІ З, 802 НІ 15 і 802Н21 17 проводили таким же способом, що і 802, і концентрації антигену становили 180, 90, 45, 22,5, 11,25, 5,625, 2,813, 0
НМ.
Динамічні параметри антитіла 802 і його гуманізованих антитіл 802НІ111, 802Н212, 802НЗІ 3, 802Н2115 і 802Н2117 наведені в Таблиці 1, а результати визначення параметрів динамічних характеристик показані на Фігурах 9-14, відповідно.
Таблиця 1
Динамічні параметри антитіл 802, 802НІ111, 802Н212, 802НЗІ З, 802Н2І 15 і 802Н21 17 - Ко Коп Коп Каїє Каїв
Ко - афінна константа; Коп - швидкість асоціації антиген-антитіло; Каз - швидкість дисоціації антиген-антитіло; Ко-Кав/Коп.
Ці результати показують, що всі шість антитіл мають хорошу афінність до антигену, яка порівнянна або навіть перевищує афінність контрольних антитіл 1001 і 11.2.1.
Приклад 6. Визначення активності антитіл по зв'язуванню антигену СТІ А4 на поверхні гібридомної клітинної лінії за допомогою проточної цитометрії
Спочатку одержували клітини-хазяїни 293Е, експресуючі антиген СТГ А4 і мітили їх моноклональним антитілом 802 (Приклад 1) і 802(Ке) і 802 гуманізованими антитілами 802Н111, 802Н212 ї 802НЗІЗ (Приклад 4), одержаними в даному винаході, відповідно. Потім здатність антитіл специфічно зв'язуватися з антигеном, що має нативну конформацію, на поверхні клітин оцінювали за допомогою проточної цитометрії.
Конкретні етапи наводяться нижче. 1. Одержання клітин-хазяїнів 293Е, експресуючих антиген СТІ А4
Клітини 293Е трансфікували плазмідою рі епіїб.3-СТІ А4 для СТІ А4 (вектор рі епіїб.3 був придбаний у Іпмігодеп Со.) з використанням набору реагентів для трансфекції І іротесіатіпе
Зо (придбаний у Іпмйгодеп Со.). Після скринінгу одержували клональну популяцію клітин, стабільно експресуючу СТІ А4 (293БЕ-СТІ А4). 2. Мічення антитіл і виявлення за допомогою проточного цитометра
Клітини-хазяїни 293, експресуючі антиген СТГ А4, одержані на вищезгаданих етапах, обробляли трипсином по загальноприйнятій методиці і 2х105 клітин додавали в кожну пробірку для збирання. Розбавлені розчини антитіла 802 в ФСБ, що містить 1 95 БСА, готували, щоб одержати концентрації 20, 10, 5, 1, 0,1, 0,01 ї 0 нМ, відповідно. Після інкубації клітин 293Е, експресуючих СТІ А4, на льоду протягом 2 годин, в кожну пробірку додавали 100 мкл ФІТЦ- козячого-антимишачого дос (1:500) і інкубували ці пробірки на льоду протягом 1 години. Після додавання 300 мкл ФСБ, флуоресцентний сигнал реєстрували, використовуючи ФІТЦ-канал проточного цитометра. Виявлення інших антитіл проводили таким же способом, як виявлення антитіла 802. 3. Результати
Результати оцінки експресії СТІ А4 на клітинах 293Е-СТІ А4 показані на Фігурі 15 і Фігурі 16, відповідно. Результати зв'язування антитіл 802, 802(Ке) і трьох гуманізованих антитіл з клітинами 293Е показані на Фігурах 17-21, відповідно. Як показано на цих фігурах, антитіло 802 і його гуманізовані антитіла можуть ефективно зв'язуватися з цільовим білком СТІ А4 на поверхні клітин-хазяїнів 293Е, і їх ефективність зв'язування має дозозалежний характер. Значення інтенсивності флуоресценції для кожної дози наведені в Таблиці 2.
Ефективність зв'язування ЕСво антитіла 802 і його гуманізованих антитіл одержували з використанням моделюючої кривої в кількісному аналізі флуоресценції зв'язаного антитіла 802 і його гуманізованих антитіл, яка показана в Таблиці 3.
Таблиця 2
Аналіз інтенсивності флуоресценції, який визначає зв'язування антитіл 802, 802(Ке) і 802 гуманізованих антитіл 802Н111, 802Н212 і 802НЗІЗ з антигеном СТГ АА4 на поверхні клітин- хазяїнів 293Е-СТІ А4, за допомогою проточної цитометрії 11111111 802 | в8О2(Ве) | вреніії | врангі2 | врганзіз
Таблиця З
Ефективність зв'язування ЕСвхо антитіл 802, 802(Ке) і 802 гуманізованих антитіл 802НІ111, 802На212 і 802НЗІ З з антигеном СТІ А4 на поверхні клітин-хазяїнів 293Е-СТІ А4, одержана з використанням моделюючої кривої в аналізі за допомогою проточної цитометрії 77711111. 802 | 8О2а(Ве) | вргнтї | вана | в8рензіз
Ці результати показують, що антитіла 802, 80р2(Ке) і 802 гуманізовані антитіла 802НІ111, 802Н212 і 802Н313 всі мають дуже сильну здатність зв'язуватися з антигеном СТІ А4 на поверхні клітин-хазяїнів 293Е-СТІ А4.
Приклад 7. Визначення активності антитіл по зв'язуванню антигену СТІ А4 за допомогою ІФА
ІФА-планшет покривали СТІ А4 при температурі 4 "С протягом ночі. Після блокування 1 95
БСА при температурі 37 "С протягом 2 годин, додавали СТІ А4 антитіла 802, 80р2(Ке) і 802 гуманізовані антитіла 802НІ111, 802Н212, 802Н3І3, 802Н2115 і 802Н2117, їі контрольні антитіла 1001 (Айап .-). Коппап, Едучага Г. НаїК еї аі., НОМАМ СТІ А-4 АМТІВООІЕ5, Патент США
Мо 05 698472081) і 11.2.1 (боцйдіа5 Спагіез Напзоп, Мак дозерп Мемеи єї аІ., Нитап топосіопаї апіїродієз то СТІ А-4, Патент США Мо 05 68273681) для реагування протягом 30 хвилин.
Кон'юговане з ферментом вторинне антитіло додавали для інкубації протягом 30 хвилин. Потім визначали поглинання при довжині хвилі 450 нм на рідері для ІФА-планшетів.
Результати виявлення зв'язування антитіла 802 і його гуманізованих антитіл з антигеном
Зо СТІ А4 показані на Фігурах 22-25, відповідно. Як показано на цих фігурах, антитіла 802, 802(Ке) і 802 гуманізовані антитіла всі можуть ефективно зв'язуватися з білком СТІ А4 і їх ефективність зв'язування має дозозалежний характер. Значення інтенсивності флуоресценції для кожної дози наведені в Таблицях 4-8. Ефективність зв'язування ЕСвзо антитіл 802, 802(Ре) і гуманізованих антитіл одержували з використанням моделюючої кривої в кількісному аналізі флуоресценції зв'язаного антитіла 802, 802(Ре) і гуманізованих антитіл (Таблиця 9).
Таблиця 4
Зв'язування 802 і 802(Ке) з мишачим СТІ А4 (ІФА)
Концентрація антитіла Покривний антиген: мишачий СТІ А4, 0,5 мкг/мл (мкг/мл) 8О2(Ве 1001 2,823 2,682 2,872 2,769 2,995 2,975 2,806 2,763 2,690 2,735 2,852 2,900 2,754 2,718 2,796 2,685 2,429 2,538 2,336 2,381 2,305 2,259 1,507 1,704 1,614 1,560 1,897 1,446 0,673 0,794 0,003 0,784 0,760 0,662 0,674 0,292 0,328 0,001 0,358 0,355 0,315 0,321 0,136 0,142 0010063 0,052 0,053 0,046 0,046 0,050 й Козяче антимишаче Козяче антилюдське
Вторинне антитіло й й
Вторинне антитіло Вторинне антитіло
Таблиця 5
Зв'язування 802, 802НТ1 1 і 802(Ке) з людським СТІ А4 (ІФА)
Концентрація Покривний антиген: людський СТІ А4, 0,5 мкг/мл антитіла (мкг/мл) 1001 11241 8вр2гнт 802(Ве) 40013479 | 3432 | 3,584 | 3,547 | 3,016 | 3,031 | 3,029 | 3,107 | 3,058 | 3,085 43000001 8323 | 3155) 3499 | 3,479 | 2,834 | 2,904 | 3,076 | 3,074 | 2,930 | 3,072 19 25061 2293 3211 | 3187 | 2,610 2,670 2,878 | 2,988 | 2,805 | 2,868 1,331 | 1,194 | 2,337 | 2,293 ) 1,834 | 1,944 ) 2,265 | 2,287 | 2,052. | 2,064 0,552 | 0,528 | 1,254 ) 1,267 | 0,969 | 0,996 | 1,335 | 1,479 | 1,398 | 1,271 1:243 0,202 | 0,222 | 0,536.) 0,552 | 0,450 | 0,515 | 0,666 | 0,770 | 0,634 | 0,649 1:729 0,141 | 0115 | 0,253 | 0,263 | 0,204 | 0,206 | 0,277 | 0,351 | 0,307 | 0,309 0 |009010,086) 0,072 | 0,064 | 0,067 | 0,067 | 0,064 | 0,067 | 0,071 | 0,086
Вторинне Козяче антилюдське ІдДО Козяче антимишаче Іо антитіло Вторинне антитіло Вторинне антитіло
Таблиця 6
Зв'язування 802Н212 і 802НЗІ З з людським СТІ А4 (ІФА)
Концентрація антитіла Покривний антиген: людський СТІ А4, 0,5 мкг/мл (мкг/мл) 8р2нг12 рег З 1001 11.21 1,489 | 1,411 | 1,631 | 1,601 |) 1,775 | 2,069 | 2,206 | 2,150 1178 | 1,262 | 1192 | 1,455 | 1,527 | 1,480 | 1,825 | 2,047 0,710 | 0,872 | 0,943 | 1,007 | 1,073 | 1,204 | 1,292 | 1,409 0,336 | 0,370 | 0,642 | 0,658 | 0,663 | 0,585 | 0,893 | 0,682 0,192 | 0195 | 0415 | 0,374 | 0,349 | 0,323 | 0,499 | 0,426 1:243 0,097 | 009 | 0230 | 0,214 | 0132 | 0146 | 0,223 | 0,219 1:729 0,075 | 0,083 | 0100 | 0130 | 0,099 | 0,099 | 0,127 | 0,136 01 0,052 | 0,055 ) 0,052 | 0,057 | 0,056 | 0,053 | 0,057 | 0,061
НАР-кон'юговане козяче антилюдське до Вторинне антитіло
Таблиця 7
Зв'язування 802Н212 і 802НЗІ З з мавпячим СТІ А4 (ІФА)
Концентрація антитіла Покривний антиген: мавпячий СТІ. А4-ПЕс, 0,25 мкг/мл (мкг/мл) вранагі2 8ранзіз 1001 11.21 1,576 | 1,624 | 1235 | 1,321 | 1,788 | 1,846 | 1,718 | 1,632 1223 | 1199 | 0921) 0,873 | 1,250 | 1,344 | 1,540 |) 1,460 0,793 1 0,775 | 0,654 | 0,724 | 0,845 | 0,868 | 1,114 | 1,054 0,471 0,426 | 0441 | 0,403) 0,429) 0,402 ) 0,625 ) 0,665 0,220 1 0,230 | 0,239 | 0,218 0190) 0191 1 0,297 | 0,313 1:243 0,114 | 0117 | 0123 | 0119 | 0104 | 0108 | 0,130 | 0,172 1:729 0,071 0,076 | 0,088 | 0,096 | 0,063 | 0,067 | 0,082 | 0,094 0 | 0,048 | 0,048 | 0,048 | 0,050 | 0,049 | 0,053 | 0,048 | 0,051
НАР-кон'юговане козяче антилюдське Ідс, К(ар')2 Вторинне антитіло
Таблиця 8
Зв'язування 802Н21 15 і 802Н21І 17 з людським СТІ А4 (ІФА)
Концентра-ція Покривний антиген: СТІ А4, 0,5 мкг/мл антитіла вранагіг 8рагнаг1і15 | 8ранаг117 1001 11.21 врангіг2 (мкг/мл) 20150327 20140422 1213 728 770 10041 005 |оо5|о04|о004|005|004| 005005 005 | 005 | 05.
Вторинне антитіло: НКР-кон'юговане козяче антилюдське Іде (1:5000)
Таблиця 9
Ефективність зв'язування ЕСбо антитіл 802, 802(Ке) і 802 гуманізованих антитіл 802Н111, 802Нна212, 802НЗІ З, 802Н21 15 і 802НІ2І 17 з антигеном СТІ А4, одержана з використанням моделюючої кривої в аналізі за допомогою ІФА
Джерело антигену Антитіло ЕСво 1001 ЕСво 11.21 ЕСво
СТІ А4 (НМ) (нм) (нм) 0,015 0,062 0,023 нн 0,071 7024 802(ВНе 0,015 0,062 0,023 пн:нкжекиІНн 0,085 7024 врант1 0,025 0,062 0,023 вранагг 0,125 7009 2 щ "я вранагг 0,082 0,125 7009 2 щ "я вранагг 0,118 0,125 7009 2 щ "я вранзі-з 0,129 0,125 70609 2 щ "(І вранагіг 0,227 0,258 0,075 врензіз 0,385 0,258 0,075 вранагі15 0,042 0,138 0,075 вранагіл17 0,047 0,138 0,075
Примітка: 802Н212 вимірювали в трьох повторностях.
Наведені вище результати показують, що антитіла 802 і 802(Ке) зв'язуються з мишачим антигеном СТІ А4 з кращою ефективністю в порівнянні з контрольними антитілами 1001 і 11.2.1.
Гуманізоване антитіло 802НІ111 зв'язується з мишачим антигеном СТІ А4 з більш високою ефективністю в порівнянні з контрольним антитілом 1001 ії з ефективністю, порівнянною з 11.21.
Гуманізоване антитіло 802Н212 зв'язується антигеном СТГ А4 людини з ефективністю, порівнянною з ефективністю зв'язування 1001. Гуманізовані антитіла 802Н212 і 802НЗІЗ зв'язуються антигеном СТІ А4 людини з ефективністю, порівнянною з ефективністю зв'язування 1001. Гуманізовані антитіла 802Н2115 ї 802Н2117 зв'язуються антигеном СТІ А4 людини з ефективністю, що значно перевищує ефективність зв'язування контрольних антитіл 1001 і 11.21.
Приклад 8. Визначення активності антитіл по конкуруванню з В7-1/2 за зв'язування з антигеном СТІ А4 за допомогою конкурентного ІФА 1. Визначення активності антитіл по конкуруванню з В7-1 за зв'язування з антигеном СТІ А4 за допомогою ІФА
ІФА-планшети покривали В7-1 при температурі 4 "С протягом ночі. Після блокування 1 95
БСА при температурі 37 "С протягом 2 годин, додавали анти-СТІА4 антитіла, тобто моноклональні антитіла 8052 і 802(кКе) і 802 гуманізовані антитіла 802Н111, 802Н212, 802НЗІЗ, 802 НІ 15 і 802Н2І 17, а також контрольні антитіла 1001 ії 11.2.1. Після інкубації протягом 10 хвилин додавали СТІ А4-тЕс. Після інкубації при температурі 37 С протягом 40 хвилин додавали кон'юЮюговане з ферментом вторинне антитіло. Після інкубації при температурі 37 "С протягом 30 хвилин визначали поглинання при довжині хвилі 450 нм на рідері для ІФА- планшетів. 2. Визначення активності антитіл по конкуруванню з В7-2 за зв'язування з антигеном СТІ А4 за допомогою ІФА
ІФА-планшети покривали СТІ А4-тЕс при температурі 4 "С протягом ночі. Після блокування 195 БСА при температурі 37 "С протягом 2 годин, додавали анти-СТІ А4 антитіла, тобто моноклональні антитіла 802 і 802(Ке) і 802 гуманізовані антитіла 802НІ111, 802Н212, 802НЗІ З,
Зо 802 НІ 15 і 802Н2І 17, а також контрольні антитіла 1001 ії 11.2.1. Після інкубації протягом 10 хвилин додавали В7-2. Після інкубації при температурі 37 "С протягом 40 хвилин додавали кон'юговане з ферментом вторинне антитіло. Після інкубації при температурі 37 "С протягом 30 хвилин визначали поглинання при довжині хвилі 450 нм на рідері для ІФА-планшетів.
Результати виявлення зв'язування 802, 802(Ке) і гуманізованих антитіл з антигеном СТІ А4 показані на Фігурах 26-31, відповідно. Як показано на цих фігурах, антитіла 802, 802(Ке) і 802 гуманізовані антитіла можуть ефективно зв'язуватися з білююм СТІ А4 і їх ефективність зв'язування має дозозалежний характер. Значення інтенсивності флуоресценції для кожної дози наведені в Таблицях 10-16. Ефективність зв'язування ЕСвхо антитіл 802, 802(Ре) і гуманізованих антитіл одержували з використанням моделюючої кривої в кількісному аналізі флуоресценції зв'язаного антитіла 802, 802(Ре) і гуманізованих антитіл (Таблиця 17).
Таблиця 10
Антитіла 802 і 802(Ке) конкурують з В7-1 в ІФА (мкг/мл) 00111111 2228 17176617 1805. | 1779
Таблиця 11
Антитіла 802, 802НТІ 1 і 802(Ке) конкурують з В7-1 в ІФА
Концентрація антитіла Покривний білок: В7/1-пЕс, 0,2 мкг/мл
СТІ А4-тЕс (мкг/мл) 1001 11241 802 НІ 1 (0,6 мкг/мл) 1-2 8 Тол68|о05В| ОО | оло5 | 02301381 0,824 | 0,791 8010258 0,232| 0119 01331 0206 0,231 | 0,640 | 0,768 0,515 | 0,466 | 0,381 | 0,485 | 0445| 05291 0,750 | 0,717 0,577 | 0,508 | 0,597 | 0,579 | 0,509 | 0,659 | 0,653 | 0,626 0,801 | 0,730 | 0,650 | 0,613 | 0,669 | 0,723... 0,571 0,522 1:243 0,814 | 0,848 | 0,900 | 0,520 | 0,841 | 0,821. | 0459 | 0,327 1:729 0,854 | 0,732 | 0,993 | 0,841 | 0,848 | 0,822 | 0,312 | 0232 0 10856| 0,812 | 0826 | 0,550 | 0,672 | 0,600 | 0,071 0,074
СТІ АД-тЕс 0,3 мкг/мл
НАР-кон'юговане козяче антимишаче до Вторинне антитіло
Таблиця 12
Антитіла 802, 802НТІ 1 і 802(Ке) конкурують з В7-2 в ІФА
Концентрація Покривний антиген: СТІ А4-тЕес, 0,5 мкг/мл антитіла (мкг/мл) 1001 11.21 802 НІ 1 802(Ве) 0,569 | 0,550 | 0,492 | 0442 | 0450 | 0,984 | 0,407 | 0,336 | 0,367 | 0,375 0,500 | 0,466 | 0,387 | 0402) 0,404 | 0,332 | 0,959 | 0,306 | 0,331 | 0,289 1901 0,736 | 0,782) 0,412 | 0482 | 0467 | 0,371 | 0,456 | 0,355 | 0,384 | 0,915 227. |0,982) 1137 | 0676 | 0,585) 0,671 | 0,633 | 0,675 0,675 | 0,464 | 0,443 яв 00001496 | 1,355.) 1,120 | 0,965 | 1,038 | 1,007.) 1,091 | 1,050 | 0,713 | 0,622 1:243 11711 1,380 | 1,237 | 1,214 | 1,215 | 1,069 | 1,154 | 1,172 | 0,862 | 0,766 1:729 1,307 | 1,388 | 1,362 | 1,229 | 1,231 | 1,253 | 1,242 | 1,264 | 0,826 | 0,725 01030171 | лив | 1иоо | 130 | 1,076.) 1,034 | 1,183 | 0,915 | 0,861
В7/2-Нів, 1 мкг/мл
НАР-кон'юговане мишаче анти-Ні5 Вторинне антитіло антитіло
Таблиця 13
Антитіла 802Н212 і 802НЗІ З конкурують з В7-1 в ІФА
Концентрація антитіла Покривний білок: В7/1-пЕс, 0,3 мкг/мл (мкг/мл) 802 На 802 НЗІЗ 1001 11.21 0,207 | 0,232 | 0,187 0,202) 0166 | 0,172 | 0,080 | 0,089 0,346 | 0,267 | 0,286 0,327 | 0210 | 0194 | 0,090 | 0,097 0,625 | 0,702 | 0,416 | 0,388 | 0,486 | 0,548 | 0,160 | 0,138 0,577 | 0,727 | 0,590 | 0,503 | 0,673 | 0,621 | 0,488 | 0,369 0,830 | 0,743 | 0,747 | 0,617 | 0,663 | 0,647 0,698 | 0,660 1:243 0,707 | 0,760 | 0,673 | 0,768 | 0,652 | 0,775 | 0,755 | 0,900 1:729 0,780 | 0,882 | 0,840 | 0,842 | 0,705 | 0,691 | 0,909 | 0,793 001057 | 0,752 | 0,632 1 0,745 | 0,732 | 0,909 | 0,683 | 0,735
СТІ АД-тЕс 0,3 мкг/мл
НАР-кон'юговане козяче антимишаче ІдС Вторинне антитіло
Таблиця 14
Антитіла 802На212 і 802НЗІ З конкурують з В7-2 за зв'язування з СТІ А4 в ІФА
Концентрація антитіла Покривний антиген: СТІ А4-тЕс, 0,5 мкг/мл (мкг/мл) 802 НгІ2 802 НЗІ З 1001 11.21 0,377 | 0,376 | 0417 | 0432 | 0,449 | 0,408 | 0,372 | 0,494 0,616 | 0,537 | 0,540 | 0,511 0,553 | 0,602 | 0,437 | 0,348 0,988 | 0,927 | 0,548 | 0,614 0,806 | 0,788 | 0,479 | 0412 1,085 | 1,038 | 0,717 | 0,728 | 0,969 | 0,890 | 0,622 | 0,529 1,227 | 1,059 | 1,010 | 0,951 | 0,074 | 0,916 | 0,805 ) 0,649 1:243 1,136 | 1,066 | 1,255 | 1,160 | 0,935 ) 0,921 | 0,930 | 0,754 1:729 1,218 | 1,158 | 1,239 | 1,162 | 1108 ) 1,045 | 0,981 | 0,746 0015094 | 1,068 | 1,198 | 1,214 | 1,082 | 1,047 | 0,987 | 0,819
В7/2-Нів, 1 мкг/мл
НАР-кон'юговане мишаче анти-Ніх Вторинне антитіло
Таблиця 15
Антитіла 802Н21 15 і 802Н21 17 конкурують з В7-1 за зв'язування з СТІ А4 в ІФА
Розведення Покривний антиген: В7/1-пЕс, 0,5 мкг/мл антитіла 802 Нг12 | 802 Н21І15 | 802 Н2гІ 17 1001 11.21 8р2 нагІ2 20150327 20140422
Бмклмл |009| 0ло (0071007|0061007|00810и11 006006 0м2 | 0ля з |0л3 ол4|007|007|0061007|033|024 009 008) 026 | 024 719 1029 026 1|007|009|008|008|0и1078 033 00 045 | 049 727 |обб| ов (070 т03|089 093 | 11 ит | 14191 106 170 ві 1069 062 |068| 1181097 07916185 1и7 120) 109 109 ї243 | 066 064 |075|113| 1051099 127 148 180181 119 099 т/га |069 064 |0и4|107|725| 135 3|е6 182 | 131 6 12 770 |ове| ов |оввітов| тив в|88І|т28| тов|т80| ти | 104
СТІ А4-тЕс, 0,3 мкг/мл
НАР-кон'юговане мишаче анти-Ні5 Вторинне антитіло антитіло
Таблиця 16
Антитіла 802Н21 15 і 802Н21 17 конкурують з В7-2 за зв'язування з СТІ А4 в ІФА
Розведення СТІ АА-тЕс, 2 мкг/мл антитіла 8рагнгі2 | 8р2гнаг115 | 8р2нг117 1001 11.21 вранаг1іг 20140422 20150327 777779 |оль|олб би? оле|006|0и2 044035 047 0610651 058 1213 те о |0771076|094 1.001097 0981099 0291087 | 085 0,82 | 0,0. 77776 ол 1отв|ова|овууовт|ов2| ові ою | от | ово | 0861076
В7/2-Нів, 0,5 мкг/мл
НАР-кон'юговане мишаче анти-Ніх Вторинне антитіло (1:4000) антитіло
Таблиця 17
Ефективність зв'язування ЕСбо антитіл 802, 802(Ке) і 802 гуманізованих антитіл 802Н111, 802На212, 802НЗІ 3, 802 НІ 15 і 802НІ2І 17 з антигеном СТІ А4 в конкуренції з В7, одержана з використанням моделюючої кривої в аналізі за допомогою конкурентного ІФА
Антитіло ЕСво 1001 ЕСво 11.21 ЕСво
НМ НМ НМ
0вя |в 1вл | вл? | во | в ого 111 044 | 1 05 во2фе) | 054 | 0и53 101 ов | | 05 врантіл 2,418 0,178 0,464 1,691 врана12 5,932 1,643 2,056 1,073 0,172 ворона? 12973 | 0366 10110110 001101 ворона | зле 1 об 03303111 8рензі з 2,144 0,167 2,056 1,073 0,172 вранаг115 1,973 0,227 4,586 0,629 2,606 0,349 вранаг117 1,787 0,296 4,586 0,629 2,606 0,349
Примітка: 802Н212 вимірювали в трьох повторностях.
Наведені вище результати показують, що антитіла 802 і 8р2(кКе) і 802 гуманізовані антитіла 8р2нІ11, 8рг2гнаг12, 8рагнзі з, 8ранаі 15 і 802 НІ 17 всі можуть конкурувати з В7 за зв'язування антигеном СТІ А4. Зокрема, антитіла 802, 802(Ке), 802Н111 і 802Н212 сильніше, ніж 1001, конкурують з В7-2 за зв'язування з СТІ А4, в той час як 802Н21 17 сильніше, ніж антитіла 1001 і 11.2.1, конкурує як з В7-1, так і з В7-2 за зв'язування з СТІ А4.
Приклад 9. Аналіз біологічної активності моноклонального антитіла 802 і гуманізованих антитіл 802НІ111, 802Н212, 802НЗІ 3, 802НІІ 15 і 802НІІ 17 в клітинах
Для того, щоб визначити вплив моноклонального антитіла 802 і гуманізованих антитіл 8ра2нІ11, 8р2наг12, 802НЗІ3, 802Н21 15 ії 802Н2І117 їі контрольних антитіл 1001 ї 11.21 на експресію І--2 мононуклеарними клітинами периферичної крові (МКПК), периферичну кров від здорових донорів збирали в пробірки для збирання, що містять гепарин натрію. МКПК одержували у вигляді суспензії клітин після розведення в ФСБ і центрифугування в середовищі розділення (при 2550 об./хв. протягом 20 хвилин). У суспензію клітин додавали 5ЕВ (1 мкг/мл)/ФГА (30 мкл/мл) і поміщали в інкубатор при температурі 37 "С з насиченою вологою атмосферою, що містить 5 95 СО»2, для подальшого культивування. Додавали лімфоцити Раджі і антитіло. Після спільної інкубації протягом 48 годин МКПК двічі промивали ФСБ і додавали в 96- ямкові планшети по 10000 клітин на ямку. Потім додавали антитіла з відповідним градієнтом концентрації. Після інкубації протягом 20 хвилин клітини Раджі, оброблені ММС протягом 1 години, додавали в кількості 10000 клітин на ямку для спільного культивування протягом 72 годин. Після спільного культивування протягом 72 годин культуру клітин збирали для одержання супернатанту, і профіль експресії І/-2 в супернатанті спільної культури клітин визначали з використанням набору реагентів для ІФА по інструкції, прикладеній до цього набору (РаКкемжме Со., ОКМУ12-1020-096).
Після статистичного аналізу результати експериментів показані на Фігурах 32 і 33. У порівнянні з групою Т-лімфоцитів і групою клітин Раджі у випадку моноклонального антитіла 802, всі його гуманізовані антитіла 802НТ11 1, 802Н212, 802НЗІ З, 802На1 15 і 802НІ21 17 можуть
Зо ефективно блокувати зв'язування СТІ А4 з В7 і поліпшувати експресію ІЇ-2 Т-лімфоцитами (Фігури 32 і 33). Зокрема, авторами даного винаходу несподівано було виявлено, що антитіла 802На212, 802Н21 15 і 802НІ21 17 значно перевершують контрольні антитіла 1001 ї 11.2.1. При концентрації 10 нМ вони забезпечують рівень ІЇ/-2, що порівнянний або навіть перевищує рівень, який забезпечують 1001 або 11.2.1 при концентрації 100 нМ. Таким чином, антитіла даного винаходу можуть підвищувати рівень 1-2 при більш низьких концентраціях, наприклад приблизно 10 нМ.
Приклад 10. Протипухлинна активність моноклонального антитіла 802На12 іп мімо
Протипухлинну активність моноклонального антитіла 802Н21/2 іп мімо оцінювали з використанням тваринної моделі пи-5С1О-га| Мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК) людини виділяли з використанням реагенту Фікол і активували, використовуючи 5ЕВ в концентрації 1 мкг/мл протягом З діб. Потім 1,25х106 активованих МКПК змішували з 5х105 клітин Раджі лімфоми Беркітта і 802Н212 (20 мг/кг) і вводили підшкірно у бік 5ХСІЮ-мишам з уродженою відсутністю природних клітин-кілерів. Паралельно, формували групу ізотипічного контролю по 5 тварин на групу. Потім цим тваринам вводили дозу 20 мг/кг шляхом внутрішньовенної ін'єкції раз на тиждень протягом трьох послідовних тижнів. Об'єм пухлини вимірювали два рази на тиждень до кінця експериментів або до того моменту, коли об'єм пухлини досягав 1000 мм3.
Як показано на Фігурі 34, антитіло 802Н212 може помітно пригнічувати ріст пухлини в моделі пи-5С10-гаді. Цей результат вказує на те, що це антитіло може застосовуватися клінічно для лікування лімфоми.
У той час як конкретні варіанти здійснення даного винаходу були детально описані, фахівцям в даній галузі техніки в світлі розкритої в описі інформації буде зрозуміло, що різні зміни і модифікації можуть бути зроблені в окремих деталях і всі вони знаходяться в обсязі даного винаходу. Повний обсяг даного винаходу визначається прикладеною формулою винаходу і будь-якими її еквівалентами.
Зо
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«ТІЙ» АКЕСО БІОФАРМА, ІНК. «12ах АНТИ-СТЬАЯ МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО АБО ЯОГО АНТИГЕНЗВ'ЯЗУВАЛЬНИЙ ФРАГМЕНТ,
ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦЬЯ Її ЗАСТОСУВАННЯ «і1зах тЕС15808044РСТ «1502 81410327 352,9 «15із 2814-08-81 кій» зд «17а5 Патемтна версія 3.7 «ах ї «211» 375 «-й21йх ДНК «213» штучна послідовність «кЕйах гв23» нуклеотидна послідовність, яка кодує білок СТІ АЯЗЕСО «0 і всватрсаси тешессаксе твстисвета стввссавса вссвадисаї свссавстеЄ 5 яТВІвїКавХ аївсайстсс ависавансс асіваввісс ввЕсвасавс ЕеТТсввсавт 128 встрасаксс зевїваства арсстрЕвсв всвасстаєа тратсреряева травїтвасс ве їїсставаєв аітссатстя сасредсасс їссарірраа абсазкїраа ссетсастаєс 24 саавваства вЕрссаїтева сасренасіс Сасасссвсв зББіБЕВЕСУ сасежассса Зав ссядссаїастї зссівявсаЄ адясаасвва асссаваттї асбеЕтазетва сссзевасся з5а твесслваск страс То «таз 3 «яз 175 «13» білок «213» штучна послідовність «га «223 звмінокислотна послідовність білка СТЬАЗЕСЮ «3аа» 7 віз мМек ні Ууаі іа біз бго Аза Заї Узі сво діа бве Зек Ага бу ї 5 19 15
Її Аїа бев рНе Узі Су«х бій Ту діа чего Рго біу ув дія Таг 1 28 25 за
Уаї Ага Уві тий" Ма3і (еу Агро бій Ада Ар о бег біл уді Тпг оЗін чаї 35 аа 45
Суз діа Аз ТАгс о Тубє Меї Меї біу Ап бі Бец ТВе Ре Бен дзр Дер 5 ва зес Т18е Су Тпгб ОбІУу Те обеє бег біу дп зів уа1ї Аза бео Те 112 біп біу без Агв Аїда Меї Ар Те бі Себ Туб Т1е Си5 ух Уді 610 85 за 5
Кіеи Меє Тут рко Бго Рго Туб Туг бен 6б1іу Ще бі Азпобіу тТаг обівп 190 135 18 116 Ту маї Ї112 Ахр о рго бі Рго Суз Рго д5р бек А5р 115 1358 135 «2185 їз «-211»5 ЗБ «12» Білок «313» штучна послідовність «9852 «23» дмінокислотна послідовність гібридного білка СТт.АЯЕСВ-ЯЕс «400» з
Аів Мек ні уаії Аїа бій Рго діз Уаї Уві зей Аїа бе" Бек АгЕ біу 1 5 18 15
Ті Аїа бен вре уд) Си бін Туб Аїа его Рро біу уз Аза ТВгб би за 8 38 чаї Аги Ма! Твг о Маї Геу Аге біб А)вз й5р о бБег біп уаї Те бів Уві ав 45
Сух йіа Аїа Тс оТує Меє Мебє б51іу деп бій Мен Те Рв цем Азр Ар 5а 55 БО
Бег їі Сух Таг обі Те Беб баг біу Азп о бій маі А5ап без ТК Т1в 65 7 75 ща біп біу сен Аге Аїа Меї й5р о їНе біу йец Туг Сіе Сух фу Маі 031. за 95
Бен Меб Тук Ро го го Ту Туг іев 51у Ті біу дсп б1іу Те ій тва 185 112 її Туг мді Ї16е А5робго бій Рго Суб Рео Ахробег Ар бі доп г еу 115 128 125
Тут Ре біп біу Рго Агробіу Рго Те о Т1іе уз Рго Суб БРо Рго Сух 738 135 148 іїуз Суз Рего Аза РКО Ай іец ій біу біу РРО бек уа1ї Ве тів вве 145 150 155 1659 вго бго уз (18 їух до Маї іс Маї (1 бегс іез бек бго Ті Уві і55 і78 175
Тв" Сух Уві Уаї Уві Азр Уві Бег біц Ар Ар Рго Ахро Уві віп бів 188 185 98 за" Тер РНе Уві йб5л деп Маї біц Маї Ні ТвВе АтТа біп Твгб бів ТНг 135 2ао 285
Ніз Аг бій Ар Ту дз бев Тигрес дке Уа) Уаї бег Аза беоу рго 18 215 228
Іїе біп Ні5 біп Ар Тер оМеб 5ег 5іу уз іш Ре їу5 Су5 Суб Уві 225 23 35 а
АБп Аа гм Ар сен Рго Аїа рРго її біб Агро отВге Т3е зеб вух Рго 5 255
Су Щ1у бек Маі Ага Аїа Рго бій маії Туєб Уаї Тео бро Ргро Рко біз 255 278 бій бі Мебє тик о бу5 бух біп маї Так обец тег Су Меб маї Тпг Ар 375 зва 285
Рпе Меї Рго бін до ї1в Ту мві бід Тер ТВг ода доп бік ув Таке 28 295 зага піч їз АБ Ту? уз Ай о Тве 3 Рго Уді се Ахр баб Азов біу бек зах 10 15 з2а
Тут Рие Меї Туг бег із Сей йгЕ Уа) біц ух уз д5и Тгромаї біш 355 і38 335
АгЕ А5й баг оТуб бег Суб бек Уві Маї Ні бі біу со Ні Або Ні 348 345 358
Ні Те Таб офу5 ее Ре бек Аг їНг ого б1у кує 355 35 «2385 4 «211» 1892 «95123 ДНК «13» автучна послідовність «590» «й»3х нуклесотидна послідовність, яка кодує гібридний білок СТАЯЕСО-тЕс «400» 4 нЕсваївсвтв їсрсасавсс бвсзвЕвВЕсС стЕвсзавксї ссзввираає сдставсксс ва
ЕсЕСвсизат асрсттсссс арЕсаарвса ассваретсс рретвасавт сстразвасев 128
Ессвасансс арвтвасара авістесвсс вссасттата Сезїревсай сЕаЕстваєс ій
ТТтстввасв айаюСатстТвЕ Їзвссррраса їставтвреаза асслзадтваа сстдассате 2248 саЕЕВсССКЕс ВсЕстатТЕра сасавевсте асатттеса завсевавсї васвтатссс зва сстссвзтаст асссвевваї севсаасяве зсссвевістї асесвасєсва тсстваасса зва твЕссссваст ссваїтраваа Кствжтатесс саррвассає ваврвссссас аастаавсса яко тежкссссстЄ рсазатвісє їнсассазасє сірствЕвав нассазасве вксассске 488 ссасссвава їсазревсвї встваєваєс їсаствадсс ссвзіїрідас сте с за
Вівкасясва всравваска КссСТЕаТВТе савратсавїї десссиєсаз сзатясвева вва втссасасар стсавастса расссатаве дасдаїїтаса асавтаєстетх вевсвсеке Ба
Хсарсасєтис ссастсарса ссавввасснв зівревсввса аввавсїсаа шсвЕсававів 779 засзасааве аїсівсссвс ассіассвав зкзастаєкї ссвавсстаз ЗЕВС КЕ 7в8а авЕВСсссає арвтнтаівї сссвсстсса сссдарниаав зеаївассва кааасавесе вла зсастдастх втаїреїсвс свастєсасе сссрваваса сстасвтяра вірдвствас а9ва засвннаава ссезастнаа стабазазаї асздансссв сТВстЕдаскс арасвивас зва тасеСїаївї аіавсаавсї всвавсСвваа зареадвостх вЕвЕїісвавси вайсавстас 1858
ХестртавтсЕ срвїссасва авревстисаї авісассвса ссастазатс аїжстсссва Зо8а астссадвса ва 1892 «а» 5 «2115 За «2125 ДНК «213» штучна послідовність «22ах «323» нуклеотидна послідовність, яка кодує варіабельний домен важкого ланцюга маноклонального антитіла 80? «вах 5 ваввїдназс їврасвизас севсирЕКЕВ сІівЕсЕсавс ссввасвасс таїдависте ва хсатвсвтсв ссадсввете сасцстітадс деасзастяна сезаїсівреї казрЕсСававс і2а ссараназаке вВссвнзате ястдвстсав аїссвсваса зассстасвна сТасвадасе ї86 їастасїстєв асавівбваа ввЕВссвЕТС зсваїїїсса дарасвактє базавестсс 248 вІстасстис арасезасаа їстракавис рааватасян врвахстаста стрсасавса зва савстсвссЄ абтвввкаса пежшсасіств вісасавсс сс 245 «2105 5 «231» 115 «235: білок «2132 штучна послідовність
«223» змінокислатна послідовність варідабельного домена важкого ланцюга маноклонального антитіла 50? «00» 6
Біц Уаї їух фен Ар бі Таг біу ві б1у сей Уаі біп Рго «1у АгЕ ї 5 18 15
Рго Меї ух без бек Су Уві Аза бег обіу РНе Тиг Рів баг Ар доп 28 25 38
Тер Меї ази Тер оуУузі Ага бій бек бго 10 Гує біу їн бід тгр гей 4о 45
Аїа бів Ї18 Агв Авп Гу Рго Тує дп о Туб біб ТВгоТує Туб баг Аер 5а 5 Ба
Зек Маї іу5 Біу Аг Рпе Тиг ої1і6 бек Аг Дер а5розаєс ух Зег бек 65 7а 75 За
Маї Тує беу біп Меї Ази Ап оієм Абе біу бій Абр Ме біу тів Тує 85 за За
Тут Сує ТигР Аїа біп РНе Аза Тук Тгр біу бій бБіу Те сей чаї ТВг зва 185 318
Уві зем дія 115 «ій 7 «2її: 318 «Вій» ДНК «213» штучна послідовність «йайх «223» нуклеотидна послідовність, яка кодує варіабельний домен легкого ламцюга маоноклонального антитіла 802 «88 7 васаїїсзна снасасаран Ссствссссс стнавснссї сзибернена вассрісаса ва зісвссЄсясв всасєстства зазасзістас весевВства астввтаєса всеЕвааисаВ 1:0 ресяавантс сссавствсї ваєссісвне Есвасаазвсс СЕвЕссвасви сасвавскес 1858
СЕБЕ СТянся вніссЕнеїс бЕрсевнасад сасавсства авасєсстаю сстрсавссса 24а васнатїтніня стасстаєта Стрссадзає вссстнавна вбсесттсаєс сессврвтса зо вкаваасазавс тре З18 «ийх Я «2531з 186 «812» білок «213» штучна послідонність «2285 «2233 амінокислотна послідовність варіабального домена легкого ланцюга воноклонального антитіла 802 «аб» я дхр ї1е біп Меї Те бів бек Рко Аза ев о ів2и бег діа 5зег уві біу 1 5 3а 15 бін те Маї Те о ї)е те Сух бі Тйб бев біз А5п ЇТе Туб 5іу віу
Ко, 25 За іви деп Тер оТує бів дев осуз йіп 53у уз Зег Бго біп ів) їв 16 ке 45 рве біу Аза Те депо іви Діаз Ар Біу Меб баг баг Дер РЕ бог біу 5а 55 ев
Зек біу 5ег Щіу Аг біп Туг бБег Гей Куз Ті бЗег 5вг Гей Ні Рго в5 та її ва ар Ахромаі діа Те Ту Туб Сух Біп Ахп маї без Ася бЗеє Бго вне
За 95
Тв оРБа пі1у заг біу Тиг губ їву бій Тів 188 105 «з1ах З «и1їз 345 «215» ДНК «212» штучна послідовність
«383» нуклвотидна послідовність, яка кодує варіабельний домен важкого ланцюга моноклонального антитіла ВПЗНЯ «аа0» 9 даавїнсавс СЕЕССИеНІС СЕБЕВВЕВВС сСОдЕКесаве сзввЕавнаїс затвсвасів 68 звстТЕсвссв СТСССЕВСЕХ сассіссавс васааствва Тезаєєдявї сарисвзенса та єсарвзазее васіднавсвЕ вствнсасав асссвсавса зассіїтасваа стасвавасе тва тазсєзсврсв зстссвткаа веввсввїхс ассвЕсєста вбаваскатєєс сагвазасавє 24а
ЕІнтасствс адасязацсзи сссраарасс дзижаїасав взнсстастя ссрїассвса зо гавіїтвссІ ассрЕвевса врвсастств втірасавтст стеса 345 «8185 18 «211» 315 «2123 білок «213» штучна послідовність «202 «223» амінекисєлотна послідавність варіабельного домена легкого ланцюга момокломального антитіла ВІН «ява» їй бій маї бій ів Мф біз 5ег біу біу віу Сей Узі бїй рРко Б1у 5іу ї 5 нт 15
Зег Меї Агр іо бес Сух Діаз Аіа Бек бі Ра Те Ре бег Ар А5п 2 25 за
Тев Меї Ап Тгор уві Ага біп АТа го Б1у ух біу Гео біб Тер Бе за че ліз пів Ті Або Аа ук Рео Тубв ба Тує Бі) ТВе Туб Туб баг Ар 5а ЩЕ во бег Уві уз біу дге Рне Те Ііе 5ег Агв Ар Азр бБег Гуз деп Заг в5 7а Уа за
Уаї Туг іви біп Меї Ап о бег іви Гу ТВг о біц Азр Тс о аіу Уві Тут 85 за 5
Тук Сух Тег дів біп Ре діа Тугб Тер біу бів біу Тве ее Уві Тве 19 185 110
Уаї Заг о Зек 115 «ах «8115 391 «2125 ДНК «213» штучна послідовність к228» «223 нуклеотидна послідовність, яка кодує варіабельний домен легкого ланцюга моноклональнеого антитіля НБН «абох 11 расабЄссаса їрастсавав ссстїсвзавс сеідїссрсає стесЕвасЕа сєсвавісасе ца ассасаївса вазасстссва ваасаїстас весенества аствихасса всказавсає 2
Евваазантс ссвавссист ваксстасрое всавсвавсс СррссавсвЕ затевистсс і18а зваїбїсавсеЕ ваїсаррсав сррвасанат татастства ааасєтстав Сстесаєсса зай пасватвтреЕ сзасстаєта стрссарзаї дієствавеї сасесттсас сстттреаавс БІ висасзазас їрваваїсаа Є 321 «2185 15 ка1ї» 187 «212: білок «213» штучна послідовність «2205 «223» амінокислатна послідовність вврійбельного домена легкого ланцюга монохлонального антитіла ВАН «зай 1
Аза тів біп Меї Тиг бів бек рго Берг бег цаци баг Аїа бек уді БУ 1 5 із 15
Аза Аби Уві Те ї1іа Те Су5 Аве Тне бек бій Ап о Тів Туб біу біу 28 25 за
Кен Ай Тко Тут біп Агд Гуз біп б1у ух бег Рго Суб Сез цеу Ті і 45
Тут біу Аїа Тпг о А5п сен Афа бег б1у Мек 5ег бек АгЕ Ре заг біу «а 55 ча
Зегобіу бег біу ТАг Аза Ту ТВГ ої бух її бек о беє о їву Нія Рго 655 та 75 ва
Ахр Ар омаї дія Тве Тугб Тус Суз бБіп Аза Маі ви дгРБ бвг оБго РН 85 за 95
Те РБе піу зЗек бІу тгофГує ви Бі Ше тує 169 185 «-210з3 13 «-21їз 345 ки17з ДНК «213» штучна послідовність «иа» «223 нуклеотидня послідовність, яка кодує вапізбельний домен важкого ланцюга моноклонального антитіла ВОЗНЯК, 80ОЗНО15 або 802Н2Ь17 «чада» 11 кавартвсавс ТВЕСсВаисс сЕЕДЕВНЕНС СТВВСВсСазЕС савезяНатс засеснасте по анствевссв сССТСсевСЕХ сассттсанс васазсевва Свавстввик саввсаввса 129 ссавваазне ваствнавів встввсвсав аїсєвсваса зассттасаяа стасвааася іа таствсавсв сстссвЕтраа веввсвеЕКс ассастїста варасваєтс ваваасвех 240 нтвсасстдс араскаакан сстнзанасс радкатасав взвістаста сСтеЕтассрвсв за сактттвстс астввввиса вЕЕсасСссн БІвасавтсї ста зах «21аз 4 «81ї» 115 «212з білок «232» штучна послідовність «2202 «223 амінокислотна послідовність варіайельного домена важкого ланцюга моноклонального антитіла 8О2НІ2, 8БОМНСІ15 або З02НІТІ
«4ва» 18 бій маї біп йец маі бій бегх о біу б1іу 51іу іеи маі біп рго біу біу 3 5 18 15 5ег Маї йеросец бег Сух діа йіз бег біу Рпе Тве Ре зЗег Азр деп 28 25 38
Тер Меж да Тер оуаії Абв о біп Аза Бео б1у фує 01у беа бі Теро бе 35 40 45
Аіа бів 12 Ага Аа ух Ра Тук Ап Туб бій Те Тук Туг бЗег А1а а 55 ве
Бек Уві ух біу Аг Ре Твг Ос16 бБег АгРЕ АзЗр Ар бек Суб Ап Баг
Бо 7а 75 на
Уаї Тук ен бій Меї Акп бек іен їух ТР бін Аза ТВгбоб1у Уаії Туг 85 зе а5 туп Сує Те А13 Бій бБе діа Тує Теробіу бій б1іу ТВб оквеу узі ТВ 186 105 118
Уаі бег бег «2ї8» 15 «її 351 «713 ДНК «2733» штучна послідовність «аа» «233» нуклейтидна послідовність, яка кодує варідбельний домен легкого ланцюга монаклонального антитіла ВОЯНЯЯ «480» 15 дасасєтсара Євастсвнаю ссстісавес ствавтвсст савтекЕкака ссвввтсасс 5О зїсасаєсеса вразссавсра дзасатстас рЕсввсстра асктквтастса ссвазансса 128
Евсвававсс ссвавствсї ваїстасввеЕ свассвасс Севессіствв автванстсо на знаїтслвсе вшсСевсввотс Євнрассрває татактсктна ссатссстав тстреарссє 240 взаватЕсеЕ савсатасєта стрссакваї вЕсссранвт ссссаттсас ст Свваєсе зав вЕсСассварс їрраваєсай р 321 «26ах 16 «кїїз 07 «213У білок «21353 штучна послідовність «278» «Жй3» амінокислотна послідовність варіабельного домена легкого ланцюга монокловнального антитіла 802Н2 «-0а0з 15
Ар їі біп Меї тВгобіп бег Рко 5ег его фен бог А1в бБег маї б1у
Х 5 їа і2
Азр Аг чаї тиб Тіє Тиг оСуз Агв оте бек бід Аба Ті Тує біу біу «а 5 за іїви АбпоїероТуг біп Агеоїу5 Рго біу уз баб го губ ген ієз 116 35 ча 45
Туб б)іу Аа Тне о Аба Беч дія бек біу Узі бек 5ег Аги Ре бек О1у
Ба заг обіу 5еб біу ТВг о АБроТує Те ве Те їі 5ек о бег іо бій Рго 65 78 Ух за бі Ар Уаї діа ТВ оТук тує Суб біб деп маї і2у Абе бек рго ве 85 за 5
ТвВе рве бі бее біу ТВгосу5 бен 01 Тв уз ї9а 125 сій» 7 «211 345 «217» ДНК «8132 штучна послідовність «ах «223» нуклесотидна послідовність, яка кодує варіабельний домен важкого ланцюга моноклональнагао антитіла 80233 чада» 17 кавеїтдсарєс трижсезитс Треаввсвис стивінсвис ссвЕЕсВЕВІС аствсвасте б засідсвссЕ стТссвЕсСІт сассттсовнс вазсвгасіввра ГравітТЕВЕЇ ваввсаднса ї28 сссЕЕваавЕ висіввавсте ЕЕссЕсСтсає зсссвсааса азвссттасая СТасваваса 188 ваабтасвсав ссїстеисваа веЕБЕСЕйЕСс астаєтавта дарасвратад сазвзаєсаис 248 всстаїтстрс аватваасав сстрааваєс взаватасве ссвісєтаста стТеитасансї БІсІ савсссвсаї аствввисса нвраассств вівассвіса вс 345 «2195 18 «2312 115 «213» білок «213» штучна послідовність «2» «2232 амінокислотна послідовність варіабельного домена важкого ланцюга моноклонального антитіла 5БоНЗ| З «4805 ї8 бій Уаї біп бео Узі біб бес біу біу біу їв Уаії бій Рго біу б1іу 3 в 18 15 бек ів АгЕ ї2ги Заб Сух5 АтТа діа бає біу Ре Тег Ре бек дер АВ 28 755 за
Тгр Має А5п Тгро Узі АгЕ бій Аза Рго біу Куб бі їв бій Тер Уві 48 45 ліз біп ї112 Аг одхвоїух Рго Туб дай Туг о бі Тве бім Тук Аїа Аїа 55 68 заг уяії ух біу Акв РНе тб їфіе бег АгБ Азр АБроБек гфуз Ап бе 655 ув 75 ка
Аія Тує бен біп Меб Ап Бек ів ух Трг бін Ар Тпг А1а маі Тук я5 ов З5
Тугб Сух Те Аїа бів Ре Аза Туг Тер біу біп б1у ТВ о гбец ді Тв 18а 185 118
Ууак бек 5ег 115 «21 19 «іі» 321 «213» ДНК «2133 штучна послідовність «22 «2233 нуклеотидна послідовність, яка кодує варіабйельний домен легкого ланцюга моноклонального антитіла 8023 «ваах 19 насаїтсзаа тразсісавав ссстКетЖсЕ ссвжссвсає севтнинана ссЕЕВСсасс Ге ассасзтвса даздссарсвз взасасстас вЕскяссіва асівисаєсса всавазвсса 128 вЕсазавстс ссзавствсї ваїстасрра рсаасстссс Крисаїстри арбресаїсс 186 сннктсавїв ватсарисак сЕвнасснас татаєтства ссастанстс сствсавесх 248 кзанасттсв ссасасасіа сівсседазео вівстдавиї сессасссає СсССсЕКаїсх зав внсассванс ївварассва є а21 «21аз 20 «115 307 «вій» білок «2135 штучна послідовність «вах» «223» амінакислотна послідовність варіавбельнаго домена легкого ланцюга к«оноклонального антитіла З02НЗ З «дай» 2 дер тів бій Меє Те піп бег Рго бег обер ву б5еб АЇїа зЗеб Маї п1у 1 5 19 15
АхройгЕ Май Те ІЗе ТАиг о Суз Аг АТа бек біз Ап Т15 тує Б1у віу за
Мем Ажа Теротуб іп біп уз Рго 5І1у ГУБ Аїіа го ух Себ їва Тів з ща ак
Тує біу Аїз ТНг обег сечу Аза беє біу Уаї вро бег Ар овБе Бек віу 58 55 ва зае біу баг піу ТК оАбр о Туг ТВ офгец Таб Ті 5ег о бег сен зій РКО 55 та 75 ва бій Азр Ре дів ТНгоТугє Туг Суб біп Аби Уаї Бей Агв бек Рго Рпе 8 зо 5
Тег Бе біу баб біу ТВг бух зви 03 1 ух
І58 185 «иа» 1 «2ї1їз 3321 «хї13» ДНК «213» штучна послідовність «сх «223» нуклеотидна послідовність, яка кодує варіабельний домен легкого ланцюга моноклонального антитіла 8О2НЗвІ5 «й» 21 касатссава свастсавртс єсесардстсс ствтссвстс ствівевсова ксвввесасх 35, ассассїЕса кдзассавсрвра взасатєсас свЕсевастна зве їасса взркаазЕссс 128 квЕазаавіс сіванстесе вис стасвва вСазсазаєс свЕсстссве сетвеставх 185а свстссактв ваїсарвсак сеЕжассвас таїасасєда стаїїтсвар сстрсавсса 240 ваКватЕївя ссасатаста сткссаваає вЕсстнавсс весассссвв аєсеристса зва вЕвассвазс сСедазаєсав в 321 «183 72 «2115 187 «817» білок «2133 штучна послідовність «228» «2232 амінокислотна послідовність варіабельного домена легкого ланцюга моноклонального антитіла 809Н215 «4005 28
Ахр їі Зі Меї Тиг бій бек реко бегобег? Беу бефб Аїа баг уві Щ1У 1 5 18 15
Азр Агро Маї Те Ії тик Суб Агро ТИг о бег біз Абп тів Туг біу біу 2а 255 За їез А5п Тер оТує бів Абе зує Рго біу Бу Бек Рго Ку5 Те їву Те 4 «5
Туг біу Аїа Те Ап оМеч Аїд бЗег щіу Уві бег 5ег Арв Ре бег б1у ка 55 во
Бек Б1іу бек щіу Тк Ар тує Тег без ТР дів зег бек іву бів Бго 65 78 75 ва біц Абромаї А1із Те Туб Тук Суб біз доп Уві ви боб Абе Ні Рго я за 25 біу Ре б1іу бЗег П1Ту Трг о Куз бе бі Т16є Ку 188 105 «210» 23 «1: 381 х212з ДНК «а1їх штучна послідовність «?2и9» «233» нуклеотидна послідовність, яка кодує варіабельний домен легкого ланцюга моноклонального антитіла 80УНІЬІ «кави» 43 васайссака їрасісзвіс всссавсісєс сівзвівссЄ савсЕвисва їсвивбсасії ва аїсясствта взассзвсва дзасатєтстас весввастіка асткЕсаїса давеававссс 120 квЕлавався стзарствст ваїстасрра єсаасазаєс тЕЕсстссве свідтстадї і5а сЕсіїсадев рвсавсенстс їняассвас Састасастра стассєсяви сстдсарсса за вавватнсЕв ссасаїаста Ствссанаає вссстрЕсск сссвасссвв ассєвисанх зай кивассавас тррБаваєтаз є 323 «2105 38 «2115 387 «2122 білок
«313» штучна послідовність сашах «2235 амінокислотна послідовність варіабельного домена легкого ланцюга моноклонального антитіла 802 ТУ копа» 24 азр Іів біб Меє Те біл бег Рка боб бегр ієц бЗвг Аза беб Узі Бі
У 5 18 15 аєр Аги маї Те ожіє Те о Сух АГЕ ТНг бек обіц дхвп ї1е Тує б1у б1у а 25 3
Гей Ап Тер Ту біл АгЕ уз Рго Б1іУ уз бек орго Гуз ев Тен Ге 4а 45
Туєг 8І1у Аїз Трг дп оїгу діа бен біу Уві б5ег бек Акр Ре бег біу а 58 ве баг біу бБег біу Тіг й5р Тує ТВГоїем Те ІЗ беє бек іви бів РКО 05 76 75 ва бів Азр маії А13 Тбе оТук Туб Су бів Ахи Уві гів бБеб бек ар Ро
В За 95
Зіу Ре Зіу бег біу Тнг губ їви 016 Тв Гуз 188 155 «й1ї1а5 75 «211: 5635 «212» ДНК «213» штучна послідовність «еВ «23233 нуклестидна послідовність, яка кодує білок СТІЙ «ча 75 актЕннсвїсс срствастса вакавссств ствнтссстве ссср асе стві ссх 5 тсавВтввстЇЄ сасзтсресєтає всатвсврсї сарссапрсая ТЕвІсствЕЕс звавстссаре 128 кидассвсса вССтситетн севЕтасвсс ссасстнвза аржстасара звесснявсе 186 аствїсстяа васавеаства стстсаввтя ассвавеєст всвссвстас аївсвсвате о крсзаскаас Єрасстстстї роасевіїтсс акствтаств всасстстар срЕравссаа зва вгвавнїства сівіссадре асівсравса агркасасєся насівтїасаї Ствсвавекя зва вавстдеївї зіссссстсс атастатстя вЕСаїсввна зЕвнаасаса ваїстасетв 28 асттватсссв аассісвісс авасавсватє СссствстВсЄ вваскствЕс авесеевеса зва арсввсстрії сестттатав СЕСЕСТЕсТЕ ассвссвтст состріства ваїтрстраве 54а вазсяаєссс ссесірассас аррритивіс вІназаасвс сасстасєсва ксссвансис сао -езазвавсаду їссавссата ссстассест ассаве 36 «8гі85У 28 квіт 215 «212» білок «213» штучна послідовність «28» «243» амінокислотна послідовність білка СТЬАЯ «490» 56
Ммеє чіу Уві еп ісц Таб бій Абе ТВгоїви рей бек ен маї ви АіІа ї 5 іа 15
Бей івеу Бе Рго бек Меї Аіїаз бБег Меї йіз Меє ні Уаії діа біз рРго за 25 за
Аіз Уаї чаї Сей діа бек бЗег АгроБІУу Ге іа 5ег Рпе Уві Суб біц їв «8 45
Тут Аїа Зег о бго б1у уз А1їа Те біб Уаї Агдозмаї ТЛ оУЗІі Ге ге «8 55 що сСіп дів Азробає дій Уаї Тв обі) чаі СуУу5 Аза Дів Те Туб Меж Мет 65 79 т ве біу аби біз Гео Тве Ре фе Ар ар озег Т1е Сух Тйг обіу Таб 5ег 85 за з5 зер обіу Ахп о зЗіп о ма1ї Ап грец Те Ті бій бі ем АгЕ Аза Ме Ар 188 185 118
Твае о біу їец Тук 112 Су5 уз Ма1ї біш івги мМеб тТук Рга рго РРО Тук 115 158 155
Туг бе біу Ті б1у Абп біу Те о біп ї31е Туг Уаї тів Абр Рео бів 138 155 7438
РР Сує Рео йерояег ар Ре іс ге) Тер Т16е бен Аза АТа уаї бек 145 і5а 155 169
Бе" біу Ге) Ре Рне Туг б5ег Ре Бе сей ТР о АЗа Уаї 5ег беу бег ї65 170 175
БУХ Меї Гео ух ух Ага Бек вро ву Тпг Тве біу Уаї маї маї уз 185 1855 1538
МеС о Бго Рг Те бів Рго іш Су5 510 уз бій Ре бів Рго Тує Ре 195 28о 795
Її18 Рко тів Ап з1В «ій» 77 «-21ї1х 8 «2125 білок «213» штучна послідовність «еВ «8233 амінокислотна послідовність СОВ «19а» 257
О1у Ре Таб Ре бЗег Ар А5п Тер їі 5 «2305 8 «211» 18 «212» білок «13» штучна послідавність «2205 «723» амінокислотна послідовність СОК
«а» св
ЇТ18 Аг Абп о їу5 Рго Туг да Тує бін Те ї 5 18 «210» 25 «аїїх В «иїз» БілЖж «213» штучна послідовність «ТЯ; к«ва3» звміножисєлатна послідовність СО «аа» 25
Те діа бій Ре АЇЗ Тує ї с «ій» за «2415 й «2125 білок «233» штучна послідовність сив» «253» вмінскУєлотТна послідовність СО «а» о бій Ап ІЗ Туг 1Уу 01у 1 з «йівз зі «2415 ї «2712х білок «213» штучна поспідояність «ай» «223» амінокислотна послідовність СВ «Мах 3 іу Ада Те 1 «аа» 32 «3іх З «2123: Білок «йі3з штучна послідавність
«223» амінокислотна послідовність СОК чанах 35 51 Аєп Узі Гец дги бе ро Ре тег 1 5 «жі» 33 «11» З «2122 білок «213: штучна послідовність «2205 «23» амінокислотна послідовність СОК «80» 33 бів Аза Уві ів) бег Ага Ні Рг біу 1 5 «їз 34 «2113 З «212з білок «е1ї13з штучна послідовність ч22ах «2353» амінокислотна послідсвність СОК «400» 24 біп Ази Уві іви бек обег дев Рго біу

Claims (14)

1 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язується з СТІ А4 людини, що містить варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, де (а) варіабельна область важкого ланцюга містить: НОСОК, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 27, НОоОКа, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 28, і НОСОК, що містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО: 29; і (р) варіабельна область легкого ланцюга містить: ІГСОН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 30, ІГСО2, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 31, Її
ІГСОНМЗ, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО ІЮО МО: 32, 5ЕО ІЮ МО: 33 і ЗЕО ІО МО: 34.
2. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 1, що вибрано з групи, яка складається з: (а) антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить: варіабельну область важкого ланцюга, яка містить НСОКІ, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІО МО: 27, НСОК2О, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ОО МО: 28, і НСОКЗ, що містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО: 29, і варіабельну область легкого ланцюга, яка містить ЇСОКІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО: 30, ЇСОК2, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 31, і ГСОКЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 32; (Б) антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить: варіабельну область важкого ланцюга, яка містить НСОКІ, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІО МО: 27, НСОК2О, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ОО МО: 28, і НСОКЗ, що містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО: 29, і варіабельну область легкого ланцюга, яка містить ЇСОКІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО: 30, ЇСОК2, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 31, і ГСОКЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 33; (с) антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить: варіабельну область важкого ланцюга, яка містить НСОКІ, що містить амінокислотну послідовність ФЕО ІО МО: 27, НСОК2О, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ОО МО: 28, і НСОКЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 29, і варіабельну область легкого ланцюга, яка містить ЇСОКІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО: 30, ЇСОК2, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 31, і ГСОКЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО І МО: 34.
З. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 1 або п. 2, де амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга (УН) вибрана з 5ЕО ІЮ МО: 14 і БЕО ІЮ МО: 18, ЗЕО ІО МО: 6, 5ЕО ІО МО: 10, і амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга вибрана з ЗЕО ІЮО МО: 16, 5ЕО ІЮ МО: 20, ЗЕО ІЮО МО: 22 і 5ЕО ІЮ МО: 24, 5ЕО ІО МО: Коо) 12.
4. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-3, що вибрано з групи, яка складається з: (1) антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну область важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 6 і варіабельну область легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 8; (2) антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну область важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 10 і варіабельну область легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 12; (3) антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну область важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 14 і варіабельну область легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 16; (4) антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну область важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 18 і варіабельну область легкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО: 20; (5) антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну область важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 14 і варіабельну область легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 22; або (б) антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, що містить варіабельну область важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 14 і МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 24.
5. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за п. З або п. 4, де метіонін в положенні 18 в ЗЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 10 або 5ЕО ІО МО: 14 замінений амінокислотою, вибраною з групи, що включає: лейцин, валін, ізолейцин або аланін.
6. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 5, де метіонін в положенні 18 в ЗЕ ІО МО: 6, 5ЕО ІО МО: 10 або 5ЕО ІО МО: 14 замінений лейцином.
7. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язується з СТІ А4 людини, яке містить варіабельну область важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО: 14 і варіабельну область легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 16.
8. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 7, де метіонін в положенні 18 5ЕО ІЮ МО: 14 замінений лейцином.
9. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-8, що являє собою гуманізоване антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент.
10. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-9, що зв'язується з СТІ А4 людини з Ко менше ніж приблизно 105 М, як визначено за допомогою поверхневого плазмонного резонансу.
11. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-10, де антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент: (а) блокує зв'язування СТІ А4 з В7; (р) регулює активність СТІ А4; (с) знімає імуносупресію організму СТІ А4; (а) активує Т-лімфоцити, і/або (є) підвищує рівень експресії 1-2 в Т-лімфоцитах.
12. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, кодуюча варіабельну область важкого ланцюга антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, де (а) варіабельна область важкого ланцюга антитіла має амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 6, ЗЕО ІЮ МО: 10, 5ЕО ІЮО МО: 14 або 5ЕО ІЮ МО: 18; і (Б) виділена молекула нуклеїнової кислоти має нуклеотидну послідовність, представлену в ЗЕО ІО МО: 5, ЗЕО ІЮ МО: 9, ЗЕО ІЮ МО: 13 або ЗЕО ІЮ МО: 17.
13. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, кодуюча варіабельну область легкого ланцюга антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, де (а) варіабельна область легкого ланцюга антитіла має амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 8, 5ЕО ІЮО МО: 12, 5ЕО ІО МО: 16, 5ЕО ІЮО МО: 20, 5ЕО І МО: 22 або 5ЕО ІЮО МО: 24; і (Б) виділена молекула нуклеїнової кислоти має нуклеотидну послідовність, представлену в ЗЕО ІО МО: ЗЕО І МО: 7, ЗЕО ІЮ МО: 11, 5ЕО ІЮО МО: 15, 5ЕО ІЮ МО: 19, 5ЕО ІО МО: 21 або 5ЕО ІЮ МО: 23.
14. Вектор, який містить виділену молекулу нуклеїнової кислоти за п. 12 і/або п. 13.
15. Клітина-хазяїн, яка містить виділену молекулу нуклеїнової кислоти за п. 12 і/або п. 13 або вектор за п. 14.
16. Спосіб одержання антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з пп. 1- 11, який включає в себе етапи культивування клітини-хазяїна за п. 14 у придатних умовах і виділення антитіла або його антигензв'язувального фрагмента з культури клітин.
17. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-11 і фармацевтично прийнятний носій і/або допоміжну речовину. Зо 18. Спосіб лікування пухлини у суб'єкта-людини, який включає в себе введення цьому суб'єкту ефективної кількості антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з пп. 1-
11.
19. Іп мімо або іп міо спосіб, який включає в себе етап введення в клітини ефективної кількості антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з пп. 1-11, де цей спосіб вибраний з наступних способів: (а) спосіб виявлення рівня СТІ А4 в зразку, (Б) спосіб блокування зв'язування СТІ А4 з В7, (с) спосіб регуляції активності СТІ А4 або рівня СТІ А4, (а) спосіб зняття імуносупресії організму СТІ А4, (е) спосіб активації Т-лімфоцитів, або (Ї) спосіб підвищення рівня експресії ІІ -2 в Т-лімфоцитах.
20. Застосування антитіла або його антигензв'язувального фрагмента за будь-яким з пп. 1-11 для виготовлення лікарського препарату для лікування пухлини. Дам з,
че. Мн но о зе
Чиг.
кДа зе 1. йо а ее. - Вал с ! і с «5 с о шо с Знов с о я СО ОХ Іо ОО КО Зх а о о
0. о. .
У о. ХА МК ОМ да М " й М І І і г й й кВ є КЗ дж і КК о вв с саке но
5. п б 8 тіше с лю ль»
45. с г ще ва й. с. с о с ! . є о СУА о с о ОК З 1 Зк с г с о. о с Вих Б ОХ ща М Ох му не . с с с є с о. ЩО І З не с с Ох п. о о ши о с о. З МОВАХ 0 . А с Ма ех МОВ о У с : В З КУ ПО о. М АХ ОО о я с с дл Бе М ТЕ Ох о М ЗАСН МО х о с с Б - с о Мо с п. с о. с І с . о ----- о о. с о. : о о Сех ЗУ хх Ка СИ СИХ ХА ус ХВ У пе 183- с г с Щоки шо МОХ МК хх ве вени» о. с о с З: с с з Яфряь Б що о 0. с Ко УА о КеАщ ще хо щ 0 с ; що с с о. с с г ОЗ с М КО п ЗК о Ух Ох Ох : о. її о о с о с с о З о о. с . с т у с 5 о. М о З Ох де о. 5. сх що о. . - о ко о. о С . ЯЗ КО о. УКХ ще З що що ККУ ще о . о. . о СХ СХ З ЗХ УСІМ о о. о ОО сой ЩО с о
; с. с г. Шо кання ша «Да -к м . їз ПЕВ корнетнння -к с ення щи я; 6 с ще СО Ох с с с с в- ЩЕ с т44 с о Те п с ооо я а со М:
Янг. 4
Я та Да мі понвннне Є КО пи кв МОН Ки о ех - и ОБУ цес ЗМО ПІД АИВ КИКК ОМ Я кіномю МКК МК КК Мо АК: па» пн о В й ПЕОМ КЕН КК --Ннс щ ОХ і ІВ КЕ ПО СМАКУ КЕ ОХ У ОК Я У МЕН ВЕ УНН ПИ КК ПОКИ я ПОМ КЕ КУ щ -я ПЕН КОМАМИ КО НК Ка У КО я кв У с КОХ У У - ЩИЙ ОВ ОХ ох Б ПІОНЕХ ОО У ПОМ А КОККЕИ М ОАЕ о РИ ОМИНН КК о КИ с КОЕа с до ПЕ МАКИ ОО і: ПН ОО У ши с МЕ с З с КО, і; НН о М НВ В Б СОУ дух : ЧнНг. З Ж хо
З. М 1 і а йо. кн ще з Й РОК З З КІ В ОХ ПММ КО ОО Я пн о о ет ХУ Х МТА хх ОКА Ех жах ТУКА МЕ А зх УК Пе х 5 - ВОК СКК вшнн о
КУ. Ян ЗК Зх що хе ОХ п У ре ХОМА с З хх КОКОН 43-35 с з В ОО ш- с Ж ПеККев я УСС СОУ
ЗХ. а НО с ПММ ЯКА що УНН пи шо Я яки с пе В МО І ЗО шок ВВА КЕ п КО ПІШИХ зо За с ОХ сах М с Я по МКК З МИ ща НУ ОККО М Мико К о ШН НМ ко, ех; МОХ СЕК КИ КЕКОККОМК КВК ТК ХО ЛИКУ Пен ОО и ДАВНЯ ОО Я ПН ККУ ОК им А ПОС
14. п У ж В. о МОНО Е з сн
Фіг. о меж Не В НОВ Ви сопе ее я п пе АН Я МОХ он і я ПИВ ШІ ПЕКТИ ОО ПИШНЕ ШЕПІТ ОМИКК ХИСТ іх ПІДНЕВ М т МВКИ 116 ПоДшеінини: КМ ПК ПЛЕН АЕН шнек УНК ше НЯ ши що У ИНА ПТС ЕрВ МНК КН ин ООН вия МЕНЕ БІ СИМ В о КОНЯ Ви Б о ОН ши шодо мі Конт ПН ях Я Й повне НЯ у Я МИ БКЕНх я пр о Я КУ 2 В В Я ПКУ А их С: ПМ МК ПТО е С о ВК З В ПЕД НІВ нн КВН а. шо ля г КК ПИ і щ ПК її На ЕН и ЗК КЕ КК їх ОО ях МКК, ОО ПМ ПИКА ДВ ЗИМИ ПУЕ УКИ ЕМ ОВ В По с о У жін ОО ЕВ фей ССС Д " КОН и ПП ОО є КИМ В М ТІК що и . 55 в о. УМІВ Но ОВО ПОЛО Х роя ОА ВОМ ООН МИХ ОККО по ем Пе ЕЕ У о : дн о М Он КОХ ОК ХК МВ» о уя ; ПЕОМ 0. БУ ОО о Я шк и зи їГ 7
ПЕСНЯ де М дя ОПО СИДІВ я дн МТ ПИЛУ оо МЕНТИ ТЕПІИЙЖО ХХ ПОМПИ пк о НН пп ие ТЕ В ПИТНЕ ШІ: де тушу КК ВАНЯ ЦЯ ОН я Пи тих ПУТ ПО КОКО ЕН ши Не Я ВН щи От ПМ Пан ОН ЕІ, Боже У НЕ ІБ МЕЛЕ ПЕТ ЕН ЗА ПІДЕ ОК ПЕДЖ ЕМ ММК ПДТУ МАН ТУ ЕНН ер ПН ПОЕТ ТИ СЕ ПМК они МІП оих ЕК щі ОН нова ПІКС ТВ Ме о п. пор ЕВ що ЯК о ПЕК КЕКВ дн ца ТЕ НН МЕМ хек МІНИ ТИМ ЕЕ жЬ КК КК пон ТЕ БК Я Б МАО ОО повій Же и еВ і. Пи ни ХК и ТЕКИ ННатия шо КИТ ПИЛА я ТІМ Дн ПК Х ШлУЖК ти ПЕЕИТІТАТІ МАК У МАЕ ОН тех По СОпО ЗК ТЕКА Од ДИОИри ТАКА ПОЛЕ КЕ МОЛЕМННт Е ОО КОМИ ЕЙ ОКА МЕ ІМТ ШХ РОН СА 4 ї п Уха ОО НО Уа СЕК КЕН ПДК ВЕБ о я СОККНЕКу ПМК КМ ООН УНК ки М о с ве ЕН СЕМИ ДУ Пав ТИ Во СИМ ЕК МКС в Ен Ще ПА М о ДЕ тро. МЕМ КОТИ ТУТ МІОМИ: ШЕ СЯ т: ВАС Я ОМ НН в У пе я 356 с Бе Пе НВ Я ОВ о а М З МИХ нин я МОЯ при о. Ен и а ПО МИ ПЕЛТ ХЕ ОХ МКМ щу що ї п ех УК Ки я о у СМІШНІ МКМ ПО СЕК ПОМОЖЕ НЯ ПОЕМ ЕЛ СО сок ЗО ЕВ що Бе вах КО Я ОО я є: МО МО шо о о. т й с ПОКИ ОК ВУХ КО
Ж. МЖК, ОВО ВЕУ ДМ СОКУ НЕ НАХ шт МЕМ ПЕКТИ МНЕ о КА ЕР Х си ОН ОКА де ОО Ве ОК с я с о ООКОЕХ НН ЗК о о поко Ох я МСКО ОКА НН я по я й о с МО Я п Ме Но ро КЕКВ ПОД МО КО КК ки о у ІКОН МОН САУ ПК КАК ІЖ 4 ХЕ АК ЗО ОО ок ООН ЕКО ЕС КЕеАВ ОК ЕК у ЕН ОК КЕКВ ше по ЩО ООН я ОО ПМ ОХ зх З КЕСКОи г ох о п я с с і "о АКОАКЯ НВ СО ВХ ПОЕМ І шо о. МОН МОХ ей, Ї В СИМ КЕВИ КЕИ В потом їх ПОСТИ ПО НО ПІЕКЕЕК КЕ КЕ, ху МИТ ШЛИМШНІНИ КЕ КАН ПЕНІ МІН п Ке ОН ПЕЛЕХ ПЕКІН ТИХ пий ОКІМИМ ее Бо її ВВ ин ОН ВН ше НН ск ИН ПЕРЕВ Ві. г я ОАЕ вен ПІНОДИНЕ НЕО ОН А Спи анн Мн ЛЮДУ! пи ря зи В ОНИ ОО ЗУННя СЕНВЧ ле пе я п її МОЗ ПОН ху ПЕНІ ПІР ЕМВ МК ПЕ ШОН пн ща г . сон щещя ПЕК НВК МІД УТ МАТИ п а и нки у СІК вет обо дрт чека От На 5 ТОННИ ШИМИ ния ПОД ДЕ ни: еконо нання Піно оо. : В ПЕ НН, ІТИ КІНО еп поет Ноя дефіс ттни Іо. х БСлТлВ ПОЗНА СААДАДЕ чккка июня От, А У ФІН стіни Й ци оре лвіісюунки Е г ще ПЕН сіни Мена Іти в в бах кими -х оса тсвех у ІЗ с а Коен тн их нн ТИМ гію нх : х Косово Шия дедетчисинник нт КВ пн ван наши ; т: Еш Ж ж са сін сення марний 7 й | п и М Хо Вона . : 1 й ШИ Я ВЖК тен сни пет шюниня? : пом А : : : рагу пор котлі а вика м БАХ Н Май м ши жі . кож тик тич 5 яю : Що ще щ еконо, Я т Ка до ная ш 7 пок ложа х х Н ту хо. сир Н : стек ення ПАК нина пн й Й оБЕ Я пий х ща РИ дим Що СЕС за ще а а їй о ї що не шк Сади х ї Як: ГУК : жид 1 а й РК Поруч пітон Н ВЕ, кодові НА Ко дя і нов йо о то орки ди . ол и дк «кв оті ери її г в'я за м і ! ' . оЖаж й с ся Ї ве : ш І: ІНВ свій ве я жи ше 2 й З Ї хе 88; У о шк : : : ДН НН ий щей і гро. 3 щи Щі й С Кей : : а х ом ії: й Й зош Н : мама чали що . іш дяк и щи : | пи няння вн . :ОщО ех ЗК; Ко «і знане й і ся і п ї . Ж ЕІ ЗВ, дит тн : ХО КУМ усій секкнннв подеилнсьсяней зно уквнн не сні юа своею усдюснтК веюсу, ши ша: росою. : ! ї і зі ЗЕ 1. я ши и щи | І І ще ще : ї ЧО: Ї Йо : ак І й : ру НИ НЕ я ей ! У де Їй ки. пий Ї ! | о і У нини . Е М : СК о дюни й ' : пише - х МАЯ ух несе : М пи аа я : ШИ Н З і Яні : фони Щі пит квя ях азу янтко сту пе сще тиж : У Ди банної тонн - щей зять тирхххттт вловити тт пива й Кк щи 18 с Я Я ЛИ чн пеігтнекяяяитю тсуднттеот я рах вх ) і Е 7 фнтмнкюунтня : - но с М Й Щ і а сн о рнанн Й У ЩЕ -її зе іссКУН | шо ож КК фіг. 9 опе.
СК До ОТ Орнава Кп п КН і покаяння п КРТ ТУ Куна т ТИ ТТ ПІ УТ КИТ КО УУ ТК ток мем а В ОО В в в ен ни НН о НН ОН в ОН що ЕРИ М НИ І МЛМ: ШИ ЕШИИТИ ППУ МИТИ ПІП (1: ВЕШЖМИ ПІІ ТИЛ ЗМИВ, ПІХПИШИКМО ММК ср В г ЖМИПсл єм: МШИЖУП ПИІЛІЦИИ ПК ЕШИ и пе ПІНА ПОКИ ПІВ СТІЛІ МИЛИ ЛІМІТ МИТ ПММ т п ММ Оп МИ ШЕ ММ Бл НАУ ПОЛИТИ. Т ЦИ ТЯМ Ми ода Вк а я МИ лиш п ИН ТИ ТИМИ ЯТ А лив М; Пи : Пн На КВ аа б еш ВОВКИ! пої : 7 г ї пЦІЛІЯ ле нн ЖК ; ан дужки м : : : ! Бк ННЯ Ж шнщибчнкк ОК ран ей Ой Ме ши 7 . КК рон дп ще: З Ге Е ї век ІННИ шия МОВ вини ай 7 ре КЕ ГУ Той Що п со мМ г : ий Й ЕЙ Мох хе . ННЯ : 5 : я ХХ сао й Й . 1: У Ще Її Б : х ї х : НЕ нн ФАрв нн а а и ва и в МВ в: Вр Ви пн . не х Тожжюя : че - ж о Те. че : : ж. У К у я Са Ма шк Ах А : Х : : їх є Кано ше їх й ше ве ОА Кі : рез яд І шк дике хнкжвтинню -Гх керу саке зе одною КУ Я й Н я и ; ов ЛЕ ня Ан шої нення п САДИ и дик ред, с пе КУ мк: НК рон : : М п п ст НН Го чщще : Н НВ рр КУ | Н : хо ! ї з Ж С . 1 : | ї СЕ т я : ї 25 КЕ я т й : нку Н : х Той І У МАМ аж пит, : й : г и М Ж и НН ее и о ПИ о п Шо, тооживнй ле й вом. нн НН МИ в дв в п НН В а ї ес ТВ НК дит : КЕ Е : . : : ще ї В шах Й с В о мод ший с Й щ . я х : ЕиЯ В Ялина др ки ви ни вже і я дай мвелювнх х І т я ую курю уд а и на ША а о а о оо одно х : ге У ка о: ЗИ : ди ам Киї Я жк тк ни ан ни ам Ж : сан Ві по Б. м : ї Н ВЖКОЯК и оди ши М: паї ни МИ пу нин шо Е ше одн нене рот, : шт НЕ : Ч Кобу п ія й Хо и р, Кора ху ноу щ поза Он ож КИЙ її і днк ІКоойенй й нн С Я пс с о ос Кс Сеанс нене ін ї : ОЙ СЕУ ПО о сна он в В баже ше бинне х Я НК паца г. и : гЗ Я дк ве НИ ши : : : й : х : око т диски ЗУ й ї с - : ї МК не ся и х . : Н Е. ї краси Н Те й й : ву що ща ще Ж ЗО о ЩЕ Ам Б БИ Я лю БО що ж в : Й е ГУ : ре м Бе Е Я І І час секУнднІ : УМХ УКОСУ ВО РОМ ку Метт Кр т КУТ КК ТК о Коен ок и 2 К Фіг, 10 ен ВН З І С НЕ М нн и М НН НН Ну В а М НН ТЯБЕх и а и в НН ан НЯ ВІНОК НЕК ЕІ НН і ордени ше. ПН а В Я ЕМО Ше МНН Б в. : нн В ї га яв КІ п : В ї ПИ З : - ц ; да ліпом молнсг ння Б При! и ше : : їх : Не нн з зни зянт рони дике они щен ПА . : , : : х З Шев и п ни пока ЗО не : 5 З : Хот ей й ї В р ИЙ : й ї ї Боб Ши Й : Ме а ор со в : й Є : НИ шк : : ; . де, і як десяту. Я щі ей ї ї пн : : і БОЖУ ду: КО нтів їх сао ний : ОМ ИН : НЕ ще як : : Н : : - - х : Н ї щей . : ї . : й : р ши 1 і ! ! ї Ж ав: ї - : о. - Е їожу ункм о вх Й Н . : х І ж »й : Н ї : - . . хх ом, Її Й : : х Ем Щі : : : | : : ; : і ; їв дяк МЕ. : й І : 5 БУ : й Й і й х ! : х не г нин нн і ! і - В. ' а: а ШЕ : : х і М. й По ума віл с НН АН ше Е рою во : па а он нн о сно с сне З т й: : І Не с Мало дент плн тя поети, Аа о чан о ав В ЕзУй ! пак сон вин пав В со нс знан Е : я ес м с нн оо п пав вн мом о пі в они нн нн ванн : й : ї : : х Н Хо длй тарт рон, . : ї Ж ок Канн ки с р. й М з й сеалеєя ши МА оз Н 5 в ВК енннкктаютттт тя Я кос нн ан с нн Ай ення в ЗОВ нн ск вав ав х ! ши а | : і їй у й : ДИ . Й Е і ї й : і . : : ї : Мак й : ї : : й : . КУ Н - 1 : х Н - с : -к по си зх зе дж се ще ря з ща ще х Н Гм шо ще бо ле бе жО БО о Б ВюЮ Ж б Об я 55 БЮ Ж ГУ : її Ерец я сю: Че (СеКУНДИ) ответ і КУМ ККУ МООКМИ КМ М іні пд а сво М в о о нан
Чнг.
п о КВ ПН и А НН По ВЕК ЕЕ МВ ОІВ ПОШИ ВИНИ КАМ КАМИ ЕМ МН МІНІ МИТИ МІ ІБ ЗОЛИ ПУ ЖІ МИНУВ МОМ М: п ПІІ ЗНТУИИШИИЦИ ТОК ЕЕ М ШИНИ ІЗ МИ Еш ТТЛ РОБОДИДЕИЦІЦ СС МДШШЦИЙІ ЛІ ММЩЩІИ СІ ПИР ДІ ПІЛИ ПТО МІКЦ ПОТІТИ ІК ПОП В ВИНІ ПИВІ Ш 1 ІХ ХВ ШІ ЛИРПШИННІ ПН ВН НН а КЗ БЕБІ НВК ІМ ЕЕ НМ ЖИМУ ЕС СИНОМ ПИВНІ ВЕНИ НН ЕВ З пише ен в и НН и НН НН ШО Нв НН вн я НН ЕН ! миши ЛОБДЛИІ С МИЖмИМІ З Ем и ПІ ІІХИМ Се НПтТДО МІ ЗМІНЕНІ МІ ММ пи: СТЕ тТИ ТОМИ Жити ТИ скління нн ун АК дл інн ви ПК, ін й ад МИС УНЯ : пІЇ : х КОМИ у жи Фр ї вся дж и ПМ ОЛЯ З ши. НЕК пі ос Я с: Звинн в ВННЕ де кре оо ННЯ ПФ по ї Н пт х сени Що зе сло. как ОК о Дж она м" . ще : Я Ко Ви п вк а ї і : Іо Одне ге о іже : х лк п Її Сай я См ік джує що : й ПТ тут су матки КЕ : Куя м чай У рицибнттьья ух вка уж тя 77 Дччатюм пк ПО кт нн панно в -т р ї МОЖ КК з ДЕФЕКТ 3 Ша а ЧАН й Н пише . 1 Шо пп - . : х ї з " : : Ідею, нон й щ ЇХ жеек, НН НИ : і - и и о ОД піно й щ іа: НЯ ГК Й Я и Н ви он на он х ние ДЕ: ВЕ НЕ : : І: Ко : сЯ Е ух ІЗ - Ж : ЖЕ НЕ КЗ : Й І Е ТО НИК : : : : х Той И з ї Й Н . у Н й ЕЗ ї 5 ПЗ гі я г ше. : . . иа т. ме - їх и ни нн нн в п и па : ! : ї ї й хі ж Н і : й І ї ій ЯКУ : : ; : : : су НУ Я : ! ; Я КУ НЕ НМ : і о. шиш : ще ня З БУВ У ИНА йон 1. пеня бе нт ех : т : Я в МИ : : й : й Я х Х і НІ : . В ї щ ЧЕ Й - а Й : Й . . ; ро 4х веде . : : Я Її лякав Ж о. тоди мин віз КН сети к іме дАдсяи у, И : Що та В п мес КДЖ АД од тн Ат Жкрнжажето сддлтттннння -я В Н р Ще Н айс 1 Б у ВЕ ОМ ве юна КУ : КУ рт кн і пив п и В ОД оо ва ов ВН У ма Й я Кия як хх Й ре а не пов с и а ен п До пса ї І: флюси дути ут нік мк ше . Ж Я ун ех ати ооо на нн нн нина в ши тонни Ех : па о юю тво Я : гмж МК ом а ан й ВИ НИЙ куженктх з оком т ум ИН ян ЗУ ТИН В Н ЩІ бек зУан ля д а іа нан ж я зе Й ж Х : ВЕ : : і : : і : ау І Ні КУ Н т х : Ще . : й Е . . : т Ї н ефню ес суч -е хе рр шт х зву ру зх зр я дез г Е й шо ще со дм сф ов ЗШ о же Же 55 Що зм дю хо ВО БО : М УКХ У ТМ ве ех т - У, : : час(секунди З о п Н Й, д Бл ХМК У КО КК ок .
Фіг. 13 ПО вв в СВ и НИ НН В в о о о УПЦ ТИМ І ШКЕММШК І о Т ІПТ ИУМИ ЦО: ЕД ХП КК МИ ЕМ ІМ ТК НИ ОМЕЛИ НВ ШЕ ен в На М НН ни в в Нв я п ТІНИ МІІ НИ Ми МИТІ УНН ПЕ ЛИМАН МИТ КУ ДИКО о в А З ЗІ Іа и еЕННК Нв ва МО НИ а а м х ШІ ЕТ ММ ДИ де че о вн на НЕ он НО и КОЖ не со вся нок аа пи тики ТУ єю жа ЖІ Тамеєтй тини вик ж ку мн хи» х : Ь ШТ СИ, в ННЯ оса : - : Н Ве БУ Н Н Н «У пен В : : тоди МИ ПЕК ча: лу ї Е : : ХЕ рими г вки ТК, : ІД - їй ї пу ї- де ж ам во ОЙ нано , шк З : ах оибтх я Мн УТ кеди о. осока с КУ : : о я як Й ЕЕ ем зийм, У кове ІЗ : шу мс ЩО нори па НН Я КИ ос сх - с. проф луку в о и Я о яе їх Н Ма ж тню У : МК оду х : Еш ож Н КК рим вики рі І х Пи Й ц «Ех кхачя К лк Ко, подо них Пс во ШИ пп гам суди пиши попи ТУ х ВОЛЯ Кі що " Й в ЕК : З Таж КО сли Н РУХ кілок, : Но Н КЕ пре і ГО нудно х ом Кк сх І : хай ке нон полю кіт х Про М КО ке де м и М в дв Я ПВ: й Й шрехейн Тек нік исдлн КОЖ в кт ї : і-й г З Шин да ї й и КИЙ с КК окон. : Ка 68 м Кене р ин о ОНИ ех х все 833: Я рей дв піде КТ пл нн чи : ТВО кет ї НЕ ІЖЖЕ т ДИН Мн Її й ТК Км нопдісякхх й й й Бо НУ Ко р Кер довва х УМ дротик Я Ж ПЕ ж МТ п - : весен в са х Ша БЖ у оон 5. Щ . не й нання ГУ ПЕС ж сов Оси : : х - Ж сх КУ ча г х ША ЩЕ ой | ї : "Кх Я о их х Ж я - Й я -. п Кн щи що м хо. х І кох? іч Б що ІЗ ху; й х : Ех зі Ко ИН Й КЕ Н Ки укусу й с скуУ Х й М ко океани 2 - покине СКАН чн Я дна дверних З : а кд й - и в се . «ХЕ м Н 2. . не - Й пи. То х ВЕК певен ї : ї ! В й : : г. ї ГУ Коси й Шу Й Х : Й Жорж у : : Й х зх ло зх «м зх сон, ху с. ел КЗ я З Кз ж в В БІ НА ве БУ І ї Н 5 : Я - ГУ Її че с і сок ди | Щ. ен в ня ЗК КЛ, У ЛЕЖХМм ПН КОМУ ККУ КО КМ УМ УМ я Ек
Фіг. 13
ОВ ОК ОН НК В НВ и о они ноя ОН и М ОН КИ ПОМ ОВ ен ин а а НН НН а НН НН НН ПЕ НН ен в ше ВН и нн ан нн нн НЕ ННЯ ен В о А НН Ан н Н АН НУ ФОТО Ше ЛІЛЯЖЛІЇ ПОШИ СЛІШФС МТ ЦИСТІТО кН Пана КИНЕ КУТ МИ ОпОлО ПІК ОЛІШЕАЛИИ липи МИТО лип БО Ши нн нн о В НЯ Інн и ни нн ОО В ООН і ВИТ ОЗ ях акйжюі о рими дом дінки 0 ТМ мн пан піти пнів ВХ Биме св р: Ксавне Пт : На поле КК де, : г Я КУ : о Ка Н чає «дм я : . : Її шо. Н Ман Е : змі : Я ус дже : У ам, : ШЕ й пдв ї ху чл ки с й Трек : ІЙ : св ни пр КИ : - З : сокх Ши НЕ ВИНИ - пом НН и НИ ЧАДО НН : ; х рн Ще І ва ДИНИ Я Тон : о З Н па о ЦИ гу пе : а : : тн тих ЕЗ обо 0 т. «пол кйня до Лех Х МНН я мен й в сх НІ І І с, 3 Шк анн Н пк ОКХ . : Н : В а Десна ї : акне нн, гехкмкю, : Е і а пок пн реа ня оди 6. Бан й. ПО СТТУМУ юки Ей х щі май нин ред РОК ленту смдувху Мина х Енн І я Геові Кола : В со : ї ТО ху хх Ко ення ; По Й ї То ля в ШЕ ДЕ пожеж, що сх нні - 2: - ПТ р жнив дю дрож. 2 1 ЩІ КЗ КА Тон ї : . Ку я М І Есе З є Кожен ! і : Е і аю і г й еШи і Й : Ки ЖК ОК де ма НИ АЙ ккнм ся Ки дж, тя І п 7 7 і-ї й обох ее рн а : ре Її диня пн ни : зо х кн ни фе: джин : не ПУ мам туз ку ян г Е ха їй Ходити днк ї ї : р ШРІ ДМС доме : й : ЕЗ : БЖ дит Мсонй Й : й й : х : ва Мо : : Е: : БЖ жів Н й о. . - Е- і ЗК диня ї х : «дк ї и Т х : д «ех хх се ря яд ще жк з хе клем КУ : КУ ЩЕ р 8 БО я ва З «І хе БУ 5 С (сеККОЮ, ! п С СЕ кине ї АК КК КК АК НК ЕК коє а Фіг, 14 р оч ШУ 7 Я же її я Я. ЯК Ж я З НЕМІЧСНІ ето я хз Е "Е. г Р ж. пи де БО ж юк з Я ж й кети ЕКЗ ЕЕ По» Зотопічний контроль зт й
Ж. хі Б ще Я Кі К Я г 4 іще в. я 91) ук до
В. 5 клітини 293 Ай 1 5 КЛІТННИ деле Ки
З ї. ЖК ЯТІ Е і ще тиж з я 5 13 : ! Я ЕОЖУ х ях Е Ка СЯ жур вики. Е У: КО КІЛЬКІСТЬ г що - р 85 : ; 2 ї секту ЖЕ з їх ї Е Е Зх ї т Е З ; ї 5 Е: жк: З ї хо й ЩЕ з І х ЕВ як А ЯЗ х шкЯ Е ГУ ї 7 15 ї 3 : ї ї ї р ХЕ
Е. Не ж в Е ; ї- Ж Е Я: щу. Я З ; Я Шк оче с
Я я. НН Ж. ЕК Я ПДВ ет ТУ обста ве ча т їк ак т ще Фе У нг. 15 іт а то:
вв. с
0). зеиненвнцнютння..- отр НН немічені МОТОТЛчНИК клітини 9 вНприв ОДЕССА
Фіг. 16 ЩЕ ж не ШК ше Що / що А «й З «в - й З й З Лог іконцентрація) ЧФиг. 17 Ока) кох те) с ! ш -й ей не -ї В З Ж КІ Лог (концентрація) - «в У
Фіг. 15 бо зони по Е и 7 ї не ї зай Логікенцентрація)
Фіг. 19 пея Уа ще зв. са | зе ка ШИК З с я з. -8 «Ой що 8 З Х З Лог (концентрація)
Фіг. 20 ван чі ч де Зан : роси з М ж «3 Ж Я о и і і в ши м и ни М Лог (концевтранно
Фіг. 21
ЛЮ ДО дк чаду Х Вч п ТІ юЖ п АК НН ЮК КК Кат ККУ МАТ кіль т чне КН ЖЖ Мі лечо КОЖ ца Ж кедах КК пн у КОЖ ЕТЕТ Х КК Чи Че елаіві ли зе ус РАК злиття ик Ки САЖА Й - с кн я т. й В Й ТАКИХ шЕ : : СН в Я уд г АВК УЖ й й й МІ 1. я сл Ден : а ї 1. Н 7. т І нн ення Ж ! Е : : : Олю : я ол : КЗ Ок : ї : пе г тОпохА й КОДИ ее ик ква ЕВ р : : во Ши нон дим й : Не Я я о В е де : по зовн ях Х. : Ех : КОД Пак о ж Х - х Ж но у Я 4 ОХ й пи ШИХ ди ЖК нний З : г вом шо : Ії : НН В а В опо в пох х : Н о І ! М т ка В ї : о х п Б : Шо, С и ДЖ КИ сук де Н Е х гивя ї : ї В ОК З : : х ай «дл одомх х ; дж дж и і. ї Оп ща Ж : о. - ЩЕ. ПЕ (ак : г: нн НК ай в : : ТО КО ХТО я Я я : по лої х й Е : ВЗ Се Я ; ОО їх Зала х : : Я М ля КН : : : Я пак х : : : ї я хз о ші : : Я де ЖЕ : : ЗЕНЯ п ТЕКИ ї й ОСИ ї Бе Ж т Н Й : Не ВА и ЗЕ т : тп й х як В Н не ан МНН : Не ше: ооо ФП Я ; до Олх Ми Ще Я й мишеи я Н ї у їх -е и ї Й 7 ОН ХК. В Ж ТТ : Н Х м в 2 оди тих НА : Н її век мих КЕ Ох КЯй шооях й ШІ поп : : : ї пото мах кЗ Я З КК ВКй я Ж ОТ : ї опт Кк ХЕ : К НК ак Ж Н 7, : : ше рос ж пе го ; Се и ВЕД - (й НК ВЕУ пк ОКХ З 7 с ї он се я Ч ТОМ що у Й т Я х Е х - ; : поши я: : Ко ВОЖенХ ОО . ї-й ї я - : де Я не : гот ННЯ х х пе з ї шт : : ї ши РІ т їй г ї ї пу Шк, ресай с рай і: 7 Я : ї : ї ОТОЖ й ак п й КЗ БНЙ Вежа ЕТ ї 7 Ті те й ТЕ ї м и ЗЕ й 115 се 3 5 о Ин ов т : : В ЯК Я о о З Ши І о тях : го ЩЕЗ ТОЖ и суки кн нки те. с КН ча ие ие оо и пи ЗАМ ики т ния г. и нини пепсимиутг. ТИКИ ИКи и тя ЖІ Ще Ки КАН ї ги си . с Мак дж, М тя потисиетиіу КИТ Ми Тек Сх вони ВИ І дкАИ ТО я І : тооли ут : и у : и К ТК. Хе ДЕКАН В и я т . : ее : 2 гої па про сон : щк : воло - копії НУ ння сля . сії ї : ї їх й 7 т : х : Ко її : : Н пох : х І бе ен в ск в у ун кн сво со оп с м ок оо свои ОМ Що ЖоКО ТА Ахх тя МОМ х. соя АХ З ж зо зл стежу сфе г Й концпентозцІія анти лАаЗ гНО її Ж її а БОННІ я ша Ка 5 ВОде) ФнНе о ск В ю жене ККУ КОТУ РУК МУК ТОЮ МИ КА КК КК ЗКУ МУК АМКУ МКМ Ки нн вен о : ши ! Ше | ши ; : КоОТОЕ : ї ї : . ши 1 17Х 5 я х УМ сн її : Я ПИМИНИЯ х пу дя їде ї «ХЕ : Ого : Ол: У а : Я -. З лиж ї В г ОА ї ї : й мання : : ех Ко і Н Іі : З я я Бод В те ї : ї рОШм 1 ї І т І й ВИ : І х ; їх ї ХОШ Я : : 7 ми оті й ї й ІЗ ї. їх : й І то В я ТК х и ах чек УЖЕ ЕТ ПІ Я лот ПЕТ Я Я 7 й тІіЮНУ НИ пою Ка х : Н Н п: : же я КА Кн Ж Я ме Е г я : Ма : ВЖЕ гожих Ще ще х : їх ох : : Н ши КИ вм ско Б з ше НЕ ; : : по ен пок пиинетіВ хан ї : Ї ОТОЖ: : : МОР ак я дАее ї ; ї Я пої ЩІ : Уже ї З У ї Я й З ; РИ МІ : ї т Я Той КК Ох - Я - І с їх неши Н : ше КЕ - КИ они їй : -.Х с ї в: очи Ту - я Я мети и битої ие М Пд, ту Диня Не дет дю ще ик по ооо; Ех : От : : Я З п Ж ск й Я У жа ІЗ : : : у оди ПК я пт Зх ме ІЗ ї В К НЗ пошив ще це ї х ПМ ТА сш КЗ т : й нку ї- х шкі ще сх до щЕ х Н поло Я Я ШКТ щей шо Я й : Е км х х т й по Н : Ол щи : : т НН нс з : щ тот 4 : т. ДИТ ро Н : у хх 5 : : т гої яті еще ОЇ : : : : х гм З й : ї ТВ НО так. їх Ме 3: ї ще КТ. в Вот. пи дАМ : : : х рем ї Я го: Ох шия зо ДОМІ их Я 2 : в Щк гЗ ї. : пої М Оч ї п с ї НК с КЗ Я ол. а сон 1 ї ІЧ КУ - ЦП т де, КН ЖИ 1 :. н не ЗКУ ННЯ я вШеМ плини і а ДМЕ ння зла ния тони кн ння В У ц БИ НОЯ п я ой : 1 1 и ї " й їх ВІ рашя Но ДУ м ря поло ї : ї Ж НН са де : т Я ї .
ї. оо пе . ХА Ох ї : ; . Х Ме ор КВ сов МИ «бочки : Ош ОЇ : ї Ї З но В он : г : ; же Е Пе КК т вон : : що ї р он Озон Кк пов кр в - ВОІНИХ ханнпентвація пити ла їн М яооняя каншиенерація анти мМ су Ж ря я сви з о Я же
Коен нні нн ен нан вив в нн а в нн онко Х : ї Н : Й їх ЖЕ : : ТЕ : і ПИТ Й ! ІК Х Од : РШШЯ н ї ре І А ПЕ оч З - ШЕ ого с : дерен КЗ ЗІ Б . ОО Ох ГОТЕЛІ : Я ;. ШЕ НО ДЕК реа їх т і З : т. ї ТОД Я з КЗ - ї Н : я Я : в Пп КТ дж кош х з Я Я ї ї ї Н ни Ме 5 з В : и т ; Щ Я пию я мк До З Я : : ни Тл - : т : ши? так ото щі Е г м ин ях. х у У 1. : о МЛ и ЗА Хо сни тю ие ик лижних пееннннснння тка миня ня ШМК зе де НК ит судах с ау З її т 7 - Й тот ХУ аю - ї т ш 1 ях УАД НН : шкИУТ х , ох . : ще дж : кА їх кк ЕЗ ї ще Я : ї шо дух МК ГО кх «3 Е й от вил. їх Ще дит т У НН ННЯ - і вини нн НН нн нн нн подо тн оди сей В сах ї В й : реж ДРФО шо КЯ Є Я я г у єр : З КЗ ях ШЕ Вся ї мий отого Ж - Я я з : У - ї шт ОСА дю Я МЕ Мо, : пою що ди З мак НКУ о под: Ух ко н Х ме х : в пу 1 и Н . х Бех ї : їв : зе вс У --к ЕЗ Н ї жк Я Н ; й жи їх х У х Я з еще ї ОТ, : ни ша: : я ще жк. ня нт п : еїолуц . г. ння а шої я іти гу СА : ОТ хо ее овкМ Я Е мк . ТИ ши Ко носяяи : : Я й Е їокх - В : Ди Коен : 1 3 я З ї Й : я ШОН пох й ше 7 ОЕМ В, ї : Н нн НН : я " х Х На ва й : й - Е 7 я хх зар ЕНН й і БО : ! Е ян ХО о КО нн я й : х Ме ЕЕ г : Я Н и х кн - ЗВІНІІ концентрація антитіла НМА вичона: В ханцент ра вала См х З ЖК Є се з І х шк МЕ
МИ. щї Янг, За ЗНУ де Я ри ке кн кн КК сок ЮК УНК НЯ КК КК КМ сухих ую Мекку КК у м оо оо ававви Жх ї і; : ти уми Ві - пет и тю й е о от Ша Я їх : : ей І : ом ти ит : : пол б ру Ко . : ї полутї й 2 Од : й Ох ЩЕ он Я де Е " - ше : ї Не Н : Кен он й ЕЗ ; : : Не : : Н та вени ТА . оон й їх. ЖЕК ния пече КІ ПЕК ямою ПД ПЕИДИ УДК нет, о умея под Тони кит тити В й ЖЕ. : Н ще : : РНЖСР ЛЕ Не Не ю : ШЕ З ск: 3 ї ї Я ї : РОГ сов САНИ шк ШИК з - : : Я 2 п у РОЖ М Е ее : опа Я поз нен моз х Я МУ : Я Тату шЖ ро и З Шо ТИ ї зх З й виш пл ІРО ЖЖ НН Най НІ Ж тях Е : Я : пл : п Коло СК ОК ти Ен ОМ НН й еВ пні МеРЖИМИ едикт Мупивин ія УТ КУ ХХХ ЖКП КК тити ЖК и КИтиити и ит Коди Ж ія З шнї 17 ї - ОЛЖК ох Е и о . її ї у Ж ою : Ї не он нн ЗНА ще Й НИ Беж кова ше СО и не ЕЕ З шо г ї НО ши - х ло ДЕК о ах Я т ому х . ЖЖ у ни не я т ОВК шк КО 7 Не - й : их ох З р Й :. Н ОЗ Ж НД Я НИ ІЗ ся : : В : їх КОН КО Ат : т : - ото ро я 111 Я ОПО и т ї н : К и х жде А не Пи пох й ЖІ ой Не : Я -Ж ХУ ЗОЖ Ж КОТЛІ тих З й ОІЖИОХ я ох Як по Ск» К І І - : ов. оо, ОК, - : І 1 1 у ря ще ІЗ : Я Я СК о ах й й : Не Н х ре КЗ : : МК в Ж : : ї : ХЕ у ІЗ й Ше БІ си Не Й У ря ж З У ПШуие Мт то што пт нини тт кн лх понин х не ХЕ ! ій БО ДТ Я п гі Я ОХ ще ї і ме ТО и Ж ше ті КОКО : : : ї ко КЗ : у Я Ж Іо Поява от : ОТО : Ї їх і Е : голо ОТЖЕ Яку ЗК ЗНМ і: Й : : У мо х : хх А Кк ВО ОТО : : тож хі Н . х ШУ ї К й Не дк ай як КНУ си дат Я поло тех Я ЕЯ Б ЖЕ я плов по я. ї пеНІНГНЇ пет З сх ї і ши ех у ї ТЕ ОО та 11 : Ні : й ї В МН я й : тт ож : й Й ї З жи не Мини : Не НШН ше І: Н ї Кз в о а : О.І - 1 щи р кон в КУ Х ТІ : СЕ : : кож оо в І : : гІЇ ВИН й НН ум осн нн в в кн ХХХ оч Як х - З ЩА МК. х З ж. НЯ сов КГ ЯКЕ Ї Те 3 М ковшентрація аититіла сн! - ВОНИ? (20150327) зе аа Ж же хх у вк Кк Кк Я їй от. ВВ К а. ЕХ Ум ке: он
Фіг. 25 КОЖ ЖК хо бою сни нене нн нин нн нн нн ня КК коні : : : | Що Е АЙ вк а й : ї ї м ен я х ж В В НН Н : ї -е ї м щи шин : ї «З Ш - : Тут жу Ж Ото у : Н : 1 її З х й пк КК с НИ : х реє ох ; МН мм, В Н : пл Н ГУ щ ди ий Кх Зими Ж пи пт . 1 ло . Шо. шия, типи и, КУ : пот т За пт т : тот ТО І Я ш : : : їх що : ОТ І З зу КЕ в о УНН : її ІЗ Ха г Ка Ве ЗААЩЕ : х В Е : ОДН : ТА Х Я Стоп : Я і Бо Е Я Сея г З ї я х : ше ке : їЕ х : ож ЛТ й Н : Я НН І Е ж Е : : Я : : ой, ОХ : Яд БЕ БУ Ма ще Бо : : Не пох. НИ БУ Я ШЕУ с БЕ ни в п ще х - : нен хе ко ї ї - КУ : . . я и п "Зх. ї ни т Н Ех є г : ті Н голий Б» ЗЕМ : ко У. -- Е ї : Я ї потому ві ИН Ту тої її ж Е НН : оп вс В : ї ум Е я : Ох НН КЗ ще я ої з хх х Н Й : ЖК ТІ їх сі Ї : : : те Кк и : їх її г; я : 7 с ве о : : її щ-х їх : : В Б я Н : х Ка їх . пої БУМШь З. т . : х ак КЕ. но ї : т ОА : і ГУ - ЕЗ : м : ме Я Б щи : : х жк 5. . . : : МО юс : : 5 ш : : ї ї с НЕК п : : їх. ГУ : ї : ї тк. З ТИ : Ж х Я : : НН : вед я : ї З ни : : : г о хм, : гу ї : : ! : с: НИ 5 ї г З шк 4 ве Бе их ПИТ ня ї. : . : ї ня ї й г БИ ня У нн на сном нн нн нн Я жа КУ в т со - ще ; й с ж ех Й сезкаккжиж ее рити Кк Кк Кк «зі концентрація пититіла (нім;
Віг. 26
Чиг. схо рн п в т в о о о у 7 нка А и й й 7 Я У : : : : Н : : Ж Я ї я : в Н у : КУ ПНЯ о, : : і: Н я : Й ОХ Не а на АЛ плит й в и а п п в Ко ак Муха пил З ПИ ї : Н по Н Й : тож ДЕК ман в Б Її : : Ше : : Я хх кож по хх : ОП, : : : ї не : х : ОК З жи . все : : Н у лох нн КО гі шиї Не ЯНА : ше: х ХЕ Ше мкм 5 її шко ея и : Я Е х ОА, : ко Й шо. Н : Я З кої х ж с А ДЕННЯ р ї Е пог х Ж п у КУ : . й ол н : ГО ме: ї ї : К Со : ле : . : ї. ШК -- : : : ! : і ож Не : ше ся Я Я М, я : Бу БУ х : ! Бе : бе Не й є г: СТЕ, Н ОТ ОТ їх шк. в : | Ох ше ! в се ї В : : ї ї СВБ я БИ ОТ й ше Й як кни ти Кот п НН о пе тхуюх енлані у 4 ї : : я че оо ; : : ї ее до. : К : Я : Якя ЩІ ї : 3 - вв ОВ : В Б : и ОО оч. Ух ле в НА : ї МОХ : і Е Пе - Кай й В сеКхжуюн : ке х В лк : . й ї Ум ї : Пввн 1 о : Не : і. я БИШКЗ : 1 о НЕ 7 тії Кк й пі й Ум х. : не ТОЖ . гої с, . : Я -З ж З : пк, БО ЖОт й : З а ї ТОТь : МЕ Зежецу Я -к х : НЯ Б х СУЯ то во у 1.25 пе х г у ме ЯН тої пос у ї В. с оо? їх І Я Ел шк Е З : коню В мч КЗ шк пу ВЕНА о о п ПО пон пом М жк ря У пет жит їх пом : їх в: ЩІ : тю б. тео сиди Ж ї : полит о, я «ЖУК Б Х ї ; УК ЕК в 5 х я : : як, оо соні Ку ІЗ ї : ї Пк хх Вк. о как, анг осв Не З : й : оду мк оче и ан З : : Я и о в ННЯ МНК З : Н : : 7 й ши и З ЕНН Е В Х дО о и « МВ | що . ! гзниентрація вата НМ - «Ор. З ЕІ БР. С. . в. х у. Я - МА концентрація вита СМ) ж ВОЖНЯХ же ВОК ща «ї с ер. Ко у аа и нн нн о и ан ин ІЗ сек ше на З йй х на х сх воша ко а КУ ОКЛЛИКикиЖ, : т : 5 ї с УК Кк Б 2. : К . . ї ї ча : : Н : : ІЗ о НН А код 1 : Я І: ІЗ ще х Ь ен 5 щі Бен : І не 8 х : : «З жк т Як у : К КЗ Я : : : А: М х г : ше МК: ЯКО : Е : : х Ех : : п КІ ще То їх : тиж. ЕЗ Н щ : ву я ІТ к нк н ННЯ Бк а о мн о А В ВТК МПП жим моди ІД Ьл ти ШЕ ММК ех ж а Є ча жжх, що Жх : Н : ТЕ я ї : ке ХЕ Не а ке у КК же : - З й З 11: : прое от чем ИН З п; ї : : щі Ж Е Я : ОХ м, х : хх що ОК КІВ хе ї г: . Зх з и : ше: хе ЩЕ ! ! ше с: ЖІ я їх КК й Н і К- У чну х -к ж : Бе ще я я НУ гос У : : тотюх Бе ШНвсЯ го я ще: ї : ЩО НЕ СОНЯ Її ох Е : : Е т ге ННЯ Бе І хх У х : 11 Й - їх Кх й що. 5 5 ХЕ ї ї Н НН : їх ї ПК я : гу жк ї : : Мля : її Бех Не Во ї З Н ще Я : Ки ту х К х : . : т ке Н п Ех Кк у 5У ІЗ : с : й ще я ; о по. Н ЕЕ їх фа Код дники т век оті Ду лий ВТ ян ляти дня я се НИ дети в їв БЕЗ - ня пою ботвию ни ит КК В З побив реа ЕЯ Я : - : г ок НОМ ОК х : : ще й ям, М нах ї Й : : : я и НН х : : З ИН ГІ Е : : : А и ТІ х Я : Повія : Н Н н З ще и . и у : - : : 1 ТМ поп Й - х с -Е нн в нн в нн и в т . ж х х х че УК КЕ а ра ях УА я щМНЛЯ концентрація внтита сн з НЕ пк ОЗ -
«г. ак : ПИСК ан НЕЯСНІ нев, М Не я дллодху» й с жнюккжирннх Я В х 5 З ето сосок фі МИ ун В кт М днк м : : Я : я ХЕ Ж ям Фо що Ах : ше Я : З Ж «Вк Вени НЯ не СВ : : и т ее му, х ї н Пен: : Се ї. НН ї НЯ о я Я Х, ко ен и аа т НИ т х в З опи : ! Не ! г ще днк МЖК З од Ко : Я и : : От Я Ким Кз їх : - голу між Ж ї си п 7 : Я х Гек КЕ ше : з Ж нК Я : її : Ж ; х з Я м Я Сеня ОТ : оту х чі Ж. 5 в . т НЯ в Дуекжкт нн - 10 : ВН пмдо ШО У ОСИ г; Й ВУ ПО В пост З ї хи о «АНЯ я : пок хх З Ме : то я то г хх ес їх: Мао : и Б : Якої су Й її У Ь х не Я ; ? : БИ с : г ЕЯ Ся 5 : тиж, її ї б : : ДИ я і г: ВЗ тах Мей х ни їх ши з не НЯ й т тк Й ї ие дж Б сх з Й х ит У хе Е : ть ИН ЗД соби Ж : БЕ: ре х Н а як, : : ол поті Ох ке й Кох и Плед : ї Зк - оіІ Ж --к Є ва, пе Ж отв хх МУ їй : ба : БИ я ще У по их ї Н Н СДН Н С : их пост Хх не ї : : ЩО ше в го Тих ее Е. : пої : : ко Ще : Вч : й - тот ЕЗ ке ХО Н Н ій : ЗУ Ко - рол вк гЯ ї : : : пу : по, с Бе я хо Кая ш-кк З Я " : пох, й му в: НН: ДН а ї Е й . : куки, : ких, Зої - ї
Ех . : Са, Й у а КК КС Я - ї Є : її й : ст НД ДНИНИ ом ве г х їх Н : ш : ї НН хх. пн в: ЕК їЕ : Я Бе : ОЇ Полат п и нн нн Я . . - ж ; ся х: Кох ітузекрравку ак З ека т Кз м з ВЕНУ ковцентаанція антитіна МО о вржаня рих " з ВИН зи ЖИ. ев 3344 хи х їй »
Фіг. 79 » ня я Дн нік ю кеВ нні от і ее ккКй кі юооеюеее соку ссестосе екв оеото сс не сккроо оте еес нн сювіюк остео жхесестесетет шен них ен о НИЙ і ше : шия, ха В фей. ме явно няня Со ккм, Ст дитя Тацит дно інн тен ная ї в ІТИ : и ше її : ша щк КО КК ЗК ГІЇ : текти Ж в Дн ана НН о НН КАНА нн - І! і СИ ши нн шк НИ ША і | я її нн ви нан нн ВИН той с Бр : Ел: 5 ях х . : Не Пд ще : г: : : а со: КЗ росло то: : ОО МК гошї ни : Й кот ж ї ше я кн А МНН НН Мк нн пи в ЕЕ шен ех : Еш за ї ние : х яку Зм Не сх не і ти ши п АВІЮ ! ше ра х ки як НН ще - ї м м І нг -Х в 5 Ще ще Ж й ї Кая Я їх їх х ; : Не УК : Ше Б це а ; НЕ щі ща ї : Н Я : Щек Е НН КО ин шо : от Ж Е шин КК ші "е за зни мим у ум Моди Ми юдеї Бу : В ське ї т шия в и ИН, ! : п й НИ и НН я. кни нокравнакьї ро З дкддкжюкатк овес дал денне роди но ооо анод лісок поросі ддижу НАХ Купе Мо ох вод ловоійнинно оона кв а нн Ж ЩА Кі Бе У са с ев -ї з ух свй вч. - БЖ - ВОІВ ВІЗОВІ концентрація вититіна (им ж ВОМНЯЛЯ з ВОЗІ з я ЖЖ ш ВОНА ОНИ ще Ки с
Фіг. 30 канон нн КК в пп и вк ДМК УТ У ЖК НАСК ууки КИ щі т мн» ІТ х хх не : ї їх: АНЯ РОТ уки, її НК як шт : Тих У нннюестк ск уункхк ника вк кс оетк с по АКА М В КК некоео О З удллжхьнх г що ВТ ї : У ї Перси ект КТК ОО ТКУ УК У УЮ Ва я пом : ОКО у я га Мутні кети он ем пов Мн сн Я Ь їі ; : и Я В РЯД й гу ВІ п Се НИ щої 27: Н ще Ж они я и В У КК ПДК ях я Е зей б нн в нн в М І ї ї ОРІля : І: ЖЕ І ув НН Вл де каш НЕ шН Я Е тату тиху ї ще що ПТ Я! й я 4 : п Що х Ж рови : ЗШЕНЕ же НЕ та ; прий ШЕ Ки : ше; же ЖІ ше з ПТЯ ! МЕНЯ кА: УНН ТТ - ІЗ й : шН ли ЖІ РБК ее ІЗ ї КОШОтИмтї ТІ й пен я бЗровіт : й НИ що ІЗ От: НЕ: м нн Я Бої МІ Ю роя УНН ня ПЕ т везе ВАРЕНИК ек ке од ЕТ : в ОК гине ЛІВ хе зни не не ше ши шк Я їх ; : ке - ше я ше ти ОТИТ т Ж ІТ пої :Х. є я Є вн тяж «фон Пд лют З дн ня ке «Мет ей ні ї ПЕ : КОХ т І пе і : ик В тот їх : т Я пшши ЯН : Ж АК ІЕЕ ї шин ще кі тати ж ЕМсваня най їх нн НН ВКА дк «Уа З усу Вб дув ери ная ек УМ - ВОЛНЦ З ВОКЧИИУІ канНентрваи ня ЕЕ. ЕІ ск: Уч ее ЗБК ж ВИНІ - ЗОВ я ЗБЕ ж ВОНИ ТІНІ ПЕ їА 1 КК Ко ЯН, 2.
Е Ж зей. - З ще ну о хх ШО Ше
Оз. Що ши. Поу раю мкгімл В вою. о І озомко ою. і ж й БО М вООо З її шен їй м 0 | І с 50 мкг/мл в «ва Б . її є | о. й .
00 . . и и. я : ж БЕ ж В Б Я і. Я т ; ще щх з з і и ше " че чо о, Ж Тілок або антитіло сте ех
Фіг. 35 Я --о | чн З М дея Х юн ГІ ЩЕ сет Ж зо. . Ек) и ше о |. Ірен Фе | ша ше іх рес ЕІ « ло ка | ! і чі й шен нини и НИ ті хи ее В У Е і . її ІЗ | й КЗ К. о в | с СЕ : вс ВОК ЕНН ПЕК АЕН кити ще І балі лм. ож ож ж ожю ж ж ж ж ж ож ож ожожож ож жо ж МШЮтисіймку ДЮ - 02 100 10 300 40 300309 10109300 10 00300 10 00306 я НМ веб 10851 їїл2лі ВОНИ 8о2нил5 ОН? ння рінннноіттнннсг о ттненнністтннссеоснттнннноЙЛесио ФЕВ індуковані МКИК | " ФІ ОГА індуковані МКИК
Фів. 33 чо жвеКЛіТННИ Раджі Щи «еаехліниВ РОК МКК чи 6 І те кцітини Рахжі МКПКВОЗНоїо - зу сад щі | ! 20 МпУКг - жк 7 - : ї ко Ой» щі М | ї
Пе. я ди ! 8 НО з БЕБІ й З 40 днів після інскуляції щи
Фіг. 34
UAA201701943A 2014-08-01 2015-07-31 Анти-ctla4 моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, фармацевтична композиція і їх застосування UA119570C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410377352.9A CN105296433B (zh) 2014-08-01 2014-08-01 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途
PCT/CN2015/085721 WO2016015675A1 (zh) 2014-08-01 2015-07-31 抗ctla4的单克隆抗体或其抗原结合片段、药物组合物及用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA119570C2 true UA119570C2 (uk) 2019-07-10

Family

ID=55194268

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201701943A UA119570C2 (uk) 2014-08-01 2015-07-31 Анти-ctla4 моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, фармацевтична композиція і їх застосування

Country Status (40)

Country Link
US (3) US10449251B2 (uk)
EP (2) EP3858861A1 (uk)
JP (2) JP6514774B2 (uk)
KR (1) KR102017396B1 (uk)
CN (3) CN105296433B (uk)
AP (1) AP2017009762A0 (uk)
AU (2) AU2015295936C1 (uk)
BR (1) BR112017002080A2 (uk)
CA (1) CA2956000C (uk)
CL (1) CL2017000250A1 (uk)
CO (1) CO2017000754A2 (uk)
CR (1) CR20170033A (uk)
CY (1) CY1124190T1 (uk)
DK (1) DK3176181T3 (uk)
DO (1) DOP2017000031A (uk)
EA (1) EA036396B1 (uk)
EC (1) ECSP17012781A (uk)
ES (1) ES2857509T3 (uk)
GE (1) GEP20207166B (uk)
HR (1) HRP20210448T1 (uk)
HU (1) HUE053719T2 (uk)
IL (1) IL250321B (uk)
LT (1) LT3176181T (uk)
MA (2) MA40474B1 (uk)
MD (1) MD4795C1 (uk)
MX (2) MX2017001446A (uk)
MY (1) MY192822A (uk)
NI (1) NI201700008A (uk)
NZ (1) NZ729158A (uk)
PE (1) PE20170772A1 (uk)
PH (1) PH12017500190A1 (uk)
PL (1) PL3176181T3 (uk)
PT (1) PT3176181T (uk)
RS (1) RS61590B1 (uk)
SG (1) SG11201700819QA (uk)
SI (1) SI3176181T1 (uk)
TN (1) TN2017000010A1 (uk)
UA (1) UA119570C2 (uk)
WO (1) WO2016015675A1 (uk)
ZA (1) ZA201700528B (uk)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105296433B (zh) * 2014-08-01 2018-02-09 中山康方生物医药有限公司 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途
LT3303394T (lt) 2015-05-29 2020-10-12 Agenus Inc. Anti-ctla-4 antikūnai ir jų naudojimo būdai
PE20181322A1 (es) 2015-09-01 2018-08-14 Agenus Inc Anticuerpo anti-pd1 y sus metodos de uso
TW201735949A (zh) 2016-03-24 2017-10-16 千禧製藥公司 治療抗ctla4及抗pd-1組合治療中的胃腸道免疫相關不良事件之方法
JP7069032B2 (ja) 2016-03-24 2022-05-17 ミレニアム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド がん免疫治療における胃腸の免疫関連有害事象の治療方法
CN107400166A (zh) 2016-05-19 2017-11-28 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 针对ctla4的单域抗体及其衍生蛋白
CN109475603B (zh) 2016-06-20 2023-06-13 科马布有限公司 抗pd-l1抗体
CN106967172B (zh) * 2016-08-23 2019-01-08 康方药业有限公司 抗ctla4-抗pd-1 双功能抗体、其药物组合物及其用途
WO2018035710A1 (en) 2016-08-23 2018-03-01 Akeso Biopharma, Inc. Anti-ctla4 antibodies
US10618962B2 (en) 2016-10-10 2020-04-14 Crown Bioscience (Taicang) Inc. Anti-CTLA4 antibodies
US10844119B2 (en) 2016-10-11 2020-11-24 Agenus Inc. Anti-LAG-3 antibodies and methods of use thereof
IL307242A (en) 2016-12-07 2023-11-01 Agenus Inc Anti-CTLA-4 antibodies and methods of using them
CN108124445B (zh) * 2017-03-15 2021-05-04 苏州银河生物医药有限公司 Ctla4抗体、其药物组合物及其用途
CN110505882A (zh) * 2017-03-31 2019-11-26 默沙东公司 用pd-1的拮抗剂和抗ctla4抗体的组合治疗癌症的组合物和方法
AU2018263837A1 (en) * 2017-05-02 2019-12-05 Merck Sharp & Dohme Llc Stable formulations of anti-CTLA4 antibodies alone and in combination with programmed death receptor 1 (PD-1) antibodies and methods of use thereof
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
AU2018263868A1 (en) 2017-05-02 2019-12-12 Merck Sharp & Dohme Llc Formulations of anti-LAG3 antibodies and co-formulations of anti-LAG3 antibodies and anti-PD-1 antibodies
CN108948194B (zh) * 2017-05-19 2023-02-17 上海药明生物技术有限公司 一种新的ctla-4单克隆抗体
AR111760A1 (es) 2017-05-19 2019-08-14 Novartis Ag Compuestos y composiciones para el tratamiento de tumores sólidos mediante administración intratumoral
AU2017414149A1 (en) * 2017-05-19 2019-11-07 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel monoclonal antibodies to cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4)
CN107325181A (zh) * 2017-07-05 2017-11-07 无锡傲锐东源生物科技有限公司 抗ctla4蛋白单克隆抗体及其用途
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
EP3684812A4 (en) * 2017-09-21 2021-09-08 Eucure (Beijing) Biopharma Co., Ltd ANTI-CTLA4 ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2019148444A1 (en) * 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
MA51844A (fr) * 2018-02-13 2021-05-19 Merck Sharp & Dohme Méthodes de traitement du cancer avec des anticorps anti pd-1 et des anticorps anti ctla4
CN112218892B (zh) * 2018-03-19 2023-04-25 上海药明生物技术有限公司 新型抗ctla-4抗体多肽
CN109336975B (zh) * 2018-04-18 2022-05-13 中国科学院微生物研究所 一种靶向pd-1的肿瘤抑制性抗体及其应用
JP7359785B2 (ja) 2018-06-05 2023-10-11 江蘇康寧杰瑞生物制薬有限公司 二量体及びその使用
MA52889A (fr) 2018-06-15 2021-04-21 Flagship Pioneering Innovations V Inc Augmentation de l'activité immunitaire par modulation de facteurs de signalisation post-cellulaires
CN110760002A (zh) * 2018-07-25 2020-02-07 南京金斯瑞生物科技有限公司 人源化抗人ctla4单克隆抗体及其制备方法和用途
CN113614109A (zh) 2018-12-21 2021-11-05 Ose免疫疗法公司 双功能抗pd-1/il-7分子
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
CN110256561B (zh) * 2019-06-13 2021-04-16 东大生物技术(苏州)有限公司 一组ctla-4单克隆抗体及其医药用途
CN110256563A (zh) * 2019-07-05 2019-09-20 石河子大学 Ctla-4纳米抗体、制备方法及其应用
JP2023509359A (ja) 2019-12-17 2023-03-08 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド 鉄依存性細胞分解の誘導物質との併用抗癌療法
WO2021122866A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecules comprising an il-7 variant
EP4114863A4 (en) * 2020-03-05 2024-04-24 Merck Sharp & Dohme Llc METHODS OF TREATING CANCER OR INFECTION USING A COMBINATION OF AN ANTI-PD-1 ANTIBODY, AN ANTI-CTLA4 ANTIBODY AND AN ANTI-TIGIT ANTIBODY
CN115443291A (zh) * 2020-04-13 2022-12-06 博奥信生物技术（南京）有限公司 结合ctla4的抗体及其用途
WO2022006179A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
CN113980130B (zh) * 2020-07-27 2023-07-21 湖南远泰生物技术有限公司 人源化cd37和双特异性cd19-人源化cd37 car-t细胞
CN112079926A (zh) * 2020-09-17 2020-12-15 北京华大蛋白质研发中心有限公司 抗人ctla4单克隆抗体及其应用
WO2022112198A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Worldwide Innovative Network Method to select the optimal immune checkpoint therapies
AU2022246895A1 (en) 2021-03-31 2023-10-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
EP4320156A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 Ose Immunotherapeutics Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains
AU2022253351A1 (en) 2021-04-09 2023-10-12 Ose Immunotherapeutics New scaffold for bifunctional molecules with improved properties
CA3224374A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
WO2023143597A1 (en) * 2022-01-30 2023-08-03 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Anti-ctla4/ox40 bispecific antibodies and uses thereof
WO2024003360A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Institut Curie Biomarkers and uses thereof for the treatment of neuroblastoma
WO2024028386A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Ose Immunotherapeutics Multifunctional molecule directed against cd28
WO2024056049A1 (zh) * 2022-09-16 2024-03-21 同润生物医药(上海)有限公司 具有pH依赖性的抗CTLA4抗体或抗原结合片段
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US682736A (en) 1900-08-02 1901-09-17 James C Owen Oil-can.
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5851795A (en) * 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US6719972B1 (en) 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
KR19990008070A (ko) 1995-04-27 1999-01-25 게일 케이.노톤 합성 또는 천연 혈관 식피의 멸균, 내이식, 배양, 보존, 수송및 검사를 위한 장치 및 방법
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US6051227A (en) 1995-07-25 2000-04-18 The Regents Of The University Of California, Office Of Technology Transfer Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US5855887A (en) 1995-07-25 1999-01-05 The Regents Of The University Of California Blockade of lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
JP2001523958A (ja) 1997-03-21 2001-11-27 ブライハム アンド ウィミンズ ホスピタル，インコーポレイテッド 免疫療法のｃｔｌａ−４結合ペプチド
US7122615B1 (en) 1998-09-10 2006-10-17 Rutgers, The State University Of New Jersey Polyanhydrides with therapeutically useful degradation products
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
OA11917A (en) 1998-12-23 2006-04-13 Abgenix Inc Human monoclonal antibodies to ctla-4.
US7109003B2 (en) 1998-12-23 2006-09-19 Abgenix, Inc. Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
CA2589418A1 (en) * 1999-08-24 2001-03-01 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
US7034121B2 (en) 2000-01-27 2006-04-25 Genetics Institue, Llc Antibodies against CTLA4
IL149701A0 (en) 2001-05-23 2002-11-10 Pfizer Prod Inc Use of anti-ctla-4 antibodies
SI1503794T1 (sl) 2002-04-12 2012-09-28 Medarex Inc Postopek zdravljenja z uporabo ctla-4 antiteles
AU2003239878A1 (en) 2002-05-24 2003-12-12 Castrol Limited Preparation of monomers for grafting to polyolefins, and lubricating oil compositions containing grafted copolymer
DK2206517T3 (da) 2002-07-03 2023-11-06 Ono Pharmaceutical Co Immunpotentierende sammensætninger omfattende af anti-PD-L1-antistoffer
EP1549678A4 (en) 2002-09-30 2006-01-18 Pfizer Prod Inc HYBRIDOMAS THAT PRODUCE HIGH CONCENTRATIONS OF ANTIBODIES TO THE HUMAN SEQUENCE
US8168170B2 (en) 2002-10-03 2012-05-01 The Procter And Gamble Company Compositions having an inner core and at least three surrounding layers
US7465446B2 (en) 2003-05-30 2008-12-16 Medarex, Inc. Surrogate therapeutic endpoint for anti-CTLA4-based immunotherapy of disease
WO2005092380A2 (en) 2004-03-26 2005-10-06 Pfizer Products Inc Uses of anti-ctla-4 antibodies
DE102004063494A1 (de) * 2004-12-23 2006-07-13 Tegenero Ag Antikörper
BRPI0608855A2 (pt) 2005-03-08 2010-02-02 Pharmacia & Upjohn Co Llc composições de anticorpo anti - madcam processo para a preparação das mesmas e uso de anticorpo anti - madcam
WO2006110277A1 (en) 2005-04-11 2006-10-19 Medarex, Inc. Protein purification using hcic amd ion exchange chromatography
DK2161336T4 (en) 2005-05-09 2017-04-24 Ono Pharmaceutical Co Human monoclonal antibodies for programmed death 1 (PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapies
WO2007113648A2 (en) 2006-04-05 2007-10-11 Pfizer Products Inc. Ctla4 antibody combination therapy
CN101074264B (zh) * 2006-05-17 2011-08-17 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种重组抗ctla4单克隆抗体及其制备方法和用途
US8263073B2 (en) 2008-02-04 2012-09-11 Medarex, Inc. Anti-CTLA-4 antibodies with reduced blocking of binding of CTLA-4 to B7 and uses thereof
US9540426B2 (en) 2009-10-06 2017-01-10 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
WO2011045704A1 (en) 2009-10-12 2011-04-21 Pfizer Inc. Cancer treatment
NO2501822T3 (uk) 2009-11-17 2018-01-13
CN102134276A (zh) * 2010-01-22 2011-07-27 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种抗ctla-4嵌合抗体
CN103221544A (zh) 2010-09-24 2013-07-24 昂克斯治疗有限公司 编码单克隆抗-ctla-4抗体的溶瘤腺病毒载体
GB201103955D0 (en) 2011-03-09 2011-04-20 Antitope Ltd Antibodies
CN107988156B (zh) 2011-06-30 2022-01-04 建新公司 T细胞活化的抑制剂
US20150079100A1 (en) 2012-03-23 2015-03-19 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treatments using ctla-4 antibodies
CN113967253A (zh) 2012-05-15 2022-01-25 百时美施贵宝公司 通过破坏pd-1/pd-l1信号传输的免疫治疗
US8844207B2 (en) 2012-06-04 2014-09-30 Mity-Lite, Inc. Portable dance floor panel with floating magnet retention system
CN102801616B (zh) 2012-08-02 2015-04-15 华为技术有限公司 报文发送和接收的方法、装置和系统
EP2759305A1 (en) 2013-01-24 2014-07-30 Thrombotargets Europe, S.L. Hemostatic compositions
EP3757130A1 (en) 2013-09-26 2020-12-30 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
CN106255510A (zh) 2014-03-05 2016-12-21 百时美施贵宝公司 使用抗pd‑1抗体与另一抗癌剂的组合治疗肾癌
CN115590953A (zh) 2014-05-15 2023-01-13 百时美施贵宝公司（Us） 使用抗pd-1抗体和另一种抗癌剂的组合治疗肺癌
CN105296433B (zh) * 2014-08-01 2018-02-09 中山康方生物医药有限公司 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途
MX2017007390A (es) 2014-12-16 2017-11-06 Bristol Myers Squibb Co Uso de inhibidores de punto de control inmunitario en neoplasmas de sistemas nerviosos centrales.
CN104479019B (zh) 2014-12-26 2020-07-21 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 一种抗ctla-4人源抗体
CN107207582A (zh) 2015-02-16 2017-09-26 隆萨有限公司 用于药物缀合的cl和/或ch1突变抗体
WO2016183469A1 (en) 2015-05-13 2016-11-17 Robert Kirken Anti-ctla-4 blockade
CN108602892A (zh) 2016-01-27 2018-09-28 百时美施贵宝公司 使用抗-pd-1抗体和另一种抗癌剂的组合治疗肺癌

Also Published As

Publication number Publication date
IL250321B (en) 2021-06-30
CN106687479B (zh) 2022-10-25
ZA201700528B (en) 2022-11-30
US11291720B2 (en) 2022-04-05
US20230064544A1 (en) 2023-03-02
CA2956000C (en) 2022-09-27
LT3176181T (lt) 2021-04-12
MA55868A (fr) 2022-04-06
PH12017500190A1 (en) 2017-06-28
EP3858861A1 (en) 2021-08-04
MY192822A (en) 2022-09-12
AU2015295936A1 (en) 2017-03-09
NZ729158A (en) 2020-03-27
EP3176181A1 (en) 2017-06-07
JP2017523807A (ja) 2017-08-24
PL3176181T3 (pl) 2021-07-26
US20170216433A1 (en) 2017-08-03
PT3176181T (pt) 2021-03-04
AU2015295936B2 (en) 2018-11-08
WO2016015675A1 (zh) 2016-02-04
HRP20210448T1 (hr) 2021-05-28
US20200206346A1 (en) 2020-07-02
AP2017009762A0 (en) 2017-02-28
CN105296433A (zh) 2016-02-03
CN106687479A8 (zh) 2017-07-07
US10449251B2 (en) 2019-10-22
TN2017000010A1 (en) 2018-07-04
MX2017001446A (es) 2017-12-15
ES2857509T3 (es) 2021-09-29
JP6783886B2 (ja) 2020-11-11
CY1124190T1 (el) 2022-05-27
RS61590B1 (sr) 2021-04-29
EA036396B1 (ru) 2020-11-05
CN115960232A (zh) 2023-04-14
MA40474B1 (fr) 2021-02-26
CA2956000A1 (en) 2016-02-04
JP6514774B2 (ja) 2019-05-15
SI3176181T1 (sl) 2021-07-30
EP3176181A4 (en) 2018-03-14
EA201790288A1 (ru) 2017-06-30
GEP20207166B (en) 2020-10-12
CL2017000250A1 (es) 2017-08-18
KR20170036092A (ko) 2017-03-31
JP2019107018A (ja) 2019-07-04
DK3176181T3 (da) 2021-03-08
HUE053719T2 (hu) 2021-07-28
MD4795B1 (ro) 2022-02-28
EP3176181B1 (en) 2020-12-23
IL250321A0 (en) 2017-03-30
CN105296433B (zh) 2018-02-09
PE20170772A1 (es) 2017-07-04
ECSP17012781A (es) 2017-08-31
CR20170033A (es) 2017-09-29
AU2018247270A1 (en) 2018-11-01
MX2021013586A (es) 2021-12-10
DOP2017000031A (es) 2017-07-15
MA40474A (fr) 2017-06-07
MD20170022A2 (ro) 2017-06-30
CO2017000754A2 (es) 2017-06-30
KR102017396B1 (ko) 2019-09-02
NI201700008A (es) 2017-03-08
MD4795C1 (ro) 2022-09-30
BR112017002080A2 (pt) 2018-02-27
AU2015295936C1 (en) 2019-08-01
CN106687479A (zh) 2017-05-17
SG11201700819QA (en) 2017-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA119570C2 (uk) Анти-ctla4 моноклональне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, фармацевтична композиція і їх застосування
KR102089114B1 (ko) 항원 결합 단백질 및 암의 치료를 위한 어드레싱 산물로서 그의 용도
UA125611C2 (uk) Біспецифічні молекули, що мають імунореактивність відносно pd-1 і ctla-4, і способи їх застосування
AU2009296937B2 (en) Anti-CD147 antibodies, methods, and uses
EP3026062B1 (en) Anti-pd-1 antibody and use thereof
JP2022078101A (ja) Ｐｄ－１に特異的に結合する抗体及びその使用
EP2238170B1 (en) Antibodies against human cd39 and use thereof for inhibiting t regulatory cells activity
UA127048C2 (uk) Lag-3 антитіло, його антигензв'язуючий фрагмент та його фармацевтичне застосування
CN110462038A (zh) 抗gprc5d抗体和包含所述抗体的分子
UA121844C2 (uk) Людське антитіло до cd27, спосіб його одержання та застосування
CN111499767B (zh) 一种合成t细胞受体抗原受体复合物及其应用
UA122676C2 (uk) Біспецифічна антигензв'язувальна молекула проти folr1 і cd3, що активує t-клітини
UA124254C2 (uk) Біспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка активує t-клітини
UA120247C2 (uk) Антитіло до ceacam5 і його застосування
UA114883C2 (uk) Антитіло до рецептора епідермального фактора росту-3 (her3)
UA127308C2 (uk) Активована протеазою біспецифічна молекула, яка зв'язує т-клітини
UA127450C2 (uk) Рекомбінантний поліпептид, що зв'язується з cd123
UA121453C2 (uk) Спосіб одержання фармацевтичної композиції, яка містить антитіло
CN110914304A (zh) Cd96抗体、其抗原结合片段及医药用途
UA125366C2 (uk) Антитіло, яке специфічно зв’язується з людським cd127
KR20210050535A (ko) 항-bcma 단일 도메인 항체 및 그 적용
CN103476800B (zh) 融合蛋白
US10882906B2 (en) Claudin 5 antibody, and medicine containing said antibody
UA122390C2 (uk) Інтерналізоване моноклональне антитіло, що зв'язується з людським рецептором інсуліноподібного фактора росту (igf-1r)
UA112282C2 (uk) Антагоніст толл-подібного рецептора 3