UA114883C2 - Антитіло до рецептора епідермального фактора росту-3 (her3) - Google Patents

Антитіло до рецептора епідермального фактора росту-3 (her3) Download PDF

Info

Publication number
UA114883C2
UA114883C2 UAA201214744A UAA201214744A UA114883C2 UA 114883 C2 UA114883 C2 UA 114883C2 UA A201214744 A UAA201214744 A UA A201214744A UA A201214744 A UAA201214744 A UA A201214744A UA 114883 C2 UA114883 C2 UA 114883C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
presented
sequence
zeo
antibody
nekz
Prior art date
Application number
UAA201214744A
Other languages
English (en)
Inventor
Вінфрід Еліс
Сес Еттенберг
Ендрю Пол Гарнер
Ніколь Хаубст
Крістіан Карстен Сільвестр Кунц
Шпраг Елізабет Енн Рейзінгер
Original Assignee
Новартіс Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44630597&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA114883(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Новартіс Аг filed Critical Новартіс Аг
Publication of UA114883C2 publication Critical patent/UA114883C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Винахід стосується виділеного антитіла для застосування при лікуванні раку опосередкованого залежним від ліганду HER3 шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганду шляхом трансдукції сигналу.

Description

Перехресне посилання на споріднені заявки
Ця заявка заявляє пріоритет попередньої заявки на патент США Мо 61/375408, зареєстрованої 20 серпня 2010 р., зміст якої повністю включено в цей опис як посилання.
Галузь техніки, до якої відноситься винахід
Цей винахід відноситься в цілому до антитіл або їх фрагментів, які взаємодіють з рецепторами сімейства НЕК, наприклад, з НЕКЗ-рецептором. Зокрема, він відноситься до антитіл або їх фрагментів, які розпізнають конформаційний епітоп НЕК-рецептора (наприклад,
НЕКЗ), що містить залишки з обох доменів 2 і 4, що приводить до інгібування як залежної від ліганда, так і незалежної від ліганда трансдукції сигналу. Винахід відноситься також до антитіл і їх фрагментів, які конкурують з НЕК-рецепторами (наприклад, НЕКЗ-рецептором) за зв'язування з лігандом (наприклад, нейрегуліном), попереджаючи тим самим активацію трансдукції сигналу, що індуціюється лігандом.
Передумови створення винаходу
Рецептор людського епідермального фактора росту-3 (ЕгбВЗ3, який позначають також як
НЕКЗ) являє собою рецепторну протеїнтирозинкіназу і належить до підродини рецепторних протеїнтирозинкіназ епідермального фактора росту (ЕСЕК), яка включає також ЕСЕК (НЕК,
ЕгГЬВІ1), НЕКЗ2 (ЕгрВ2, Мей) і НЕКА (ЕгрВа) (Рісултап та ін., Ргос. Май). Асай. Зсі. О0.5.А. 87, 1990, сс. 4905-4909; Кгайзх та ін., Ргос. Маї). Асай. бсі. О.5.А. 86, 1989, сс. 9193-9197; і Кгашзх та ін.,
Ргос. Май. Асай. сі. О.5.А. 90, 1993, сс. 2900-2904). Подібно до прототипого рецептора епідермального фактора росту трансмембранний рецептор НЕКЗ складається з позаклітинного лігандзв'язувального домена (ЕСО), домена димеризації усередині ЕСО, трансмембранного домена, внутрішньоклітинного домена, що нагадує протеїнтирозинкіназний домен (ТКО), і С- кінцевого домена фосфорилювання. На відміну від інших представників сімейства НЕК кіназний домен НЕКЗ відрізняється дуже низькою властивою йому кіназною активністю.
Ліганди нейрегулін 1 (МКС) або нейрегулін 2 зв'язуються з позаклітинним доменом НЕКЗ і активують опосередковуваний рецептором шлях передачі сигналу в результаті посилення димеризації з іншими парнерами по димеризації такими як НЕК2. Гетеродимеризація приводить до активації і трансфосфорилювання внутрішньоклітинного домена НЕКЗ, ії це сприяє не тільки диверсифікованості сигналу, але також і до посилення сигналу. Крім того,
Зо гетеродимеризація НЕКЗ може відбуватися також без участі активуючих лігандів і цей процес, як правило, називають незалежною від ліганда активацією НЕКЗ. Наприклад, при високих рівнях експресії НЕК2 у результаті генної ампліфікації (наприклад, при раку молочної залози, легені, яєчника або шлунка) може відбуватися спонтанне утворення димерів НЕК2/НЕКЗ.
Вважається, що в цій ситуації НЕК2/НЕКЗ є найбільш активним ЕгОВ-сигнальним димером і тому має високу трансформуючу здатність.
Підвищений рівень НЕКЗ виявлено при деяких типах раку, таких як рак молочної залози, легені, шлунково-кишковий рак і рак підшлункової залози. Важливо відзначити, що була виявлена кореляція між експресією НЕК2/НЕКЗ і переходом захворювання з неінвазивної в інвазивну стадію (Аїїтапаї та ін., Опсодепе 10, 1995, сс. 1813-1821; Оегаліо та ін., Сапсег 87, 2000, сс. 487-498; Маїди та ін., Вг. У. Сапсег 78, 1988, сс. 1385-1390). Таким чином, існує необхідність у розробці агентів, які взаємодіють з опосередковуваною НЕКЗ передачею сигналу.
Короткий виклад суті винаходу
При створенні винаходу були виявлені антигензв'язувальні білки (наприклад, антитіла або їх фрагменти), які зв'язуються з конформаційним епітопом НЕКЗ-рецептора, що містять амінокислотні залишки, які входять у домен 2 і домен 4 НЕКЗ. Зазначене зв'язування антитіл або їх фрагментів з доменом 2 і доменом 4 стабілізує НЕКЗ-рецептор у неактивній або закритій конформації, що приводить до інгібування активації НЕКЗ. При створенні винаходу несподівано було встановлено, що зв'язування антитіл або їх фрагментів із зазначеним конформаційним епітопом блокує як залежні від ліганда (наприклад, нейрегуліна), так і незалежні від ліганда шляхи передачі сигналу НЕКЗ. Крім того, опосередковуване антитілом інгібування передачі сигналу, що індукується лігандом, має місце без блокади зв'язування ліганда (тобто як ліганд, так і антитіло можуть зв'язуватися з НЕКЗ), очевидно, з тієї причини, що НЕКЗ не може піддаватися конформаційним перегрупуванням, необхідним для активації.
Таким чином, одним з об'єктів винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який зв'язується з НЕК-рецептором у неактивному стані, де антитіло або його фрагмент блокує як залежну від ліганда, так і незалежну від ліганда трансдукцію сигналу. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент стабілізує НЕК-рецептор у неактивному стані. бо Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який розпізнає конформаційний епітоп НЕК-рецептора, де конформаційний епітоп містить амінокислотні залишки, що входять у домен 2 і домен 4 НЕК-рецептора, і де антитіло та його фрагмент блокує як залежну від ліганда, так і незалежну від ліганда трансдукцію сигналу. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується з НЕК-рецептором у неактивному стані. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується з НЕК-рецептором в активному стані і переводить його в неактивний стан.
Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу антитіло або його фрагмент стабілізує НЕК- рецептор у неактивному стані. НЕК-рецептор вибирають з групи, що включає НЕКІ1, НЕК,
НЕКЗ їі НЕКАЯ4. Антитіло вибирають з групи, що включає моноклональне антитіло, поліклональне антитіло, химерне антитіло, гуманізоване антитіло та синтетичне антитіло.
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який розпізнає конформаційний епітоп НЕК-рецептора, де конформаційний епітоп містить амінокислотні залишки, що входять у домен 2 і домен 4 НЕК-рецептора, де зв'язування з антитілом стабілізує
НЕН-рецептор у неактивному стані і де ліганд НЕК може конкурентно зв'язуватися з лігандзв'язувальним сайтом на НЕК-рецепторі. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу зв'язування ліганда НЕК з лігандзв'язувальним сайтом не може індукувати конформаційну зміну НЕК-рецептора в активний стан. В іншому варіанті здійснення винаходу зв'язування ліганда НЕК з лігандзв'язувальним сайтом не може активувати трансдукцію сигналу.
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу ліганд НЕК обраний з групи, що включає нейрегулін 1 (МКО), нейрегулін 2, нейрегулін З, нейрегулін 4, бетацелюлін, гепаринзв'язувальний епідермальний фактор росту, епірегулін, епідермальний фактор росту, амфірегулін і трансформуючий фактор росту альфа.
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який розпізнає конформаційний епітоп НЕК-рецептора, де конформаційний епітоп містить амінокислотні залишки, що входять у домен 2 і домен 4 НЕК-рецептора, де зв'язування з антитілом стабілізує
НЕВ-рецептор у неактивному стані, у результаті чого не може відбуватися димеризація НЕК- рецептора з корецептором з утворенням комплексу рецептор-рецептор. Відсутність здатності утворювати комплекс рецептор-рецептор перешкоджає активації як залежної від ліганда, так і
Зо незалежної від ліганда трансдукції сигналу.
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який розпізнає конформаційний епітоп НЕК-рецептора, де конформаційний епітоп містить амінокислотні залишки, що входять у домен 2 і домен 4 НЕК-рецептора, де зв'язування антитіла з НЕК- рецептором дозволяє відбуватися димеризації з корецептором з утворенням неактивного комплексу рецептор-рецептор. Утворення неактивного комплексу рецептор-рецептор перешкоджає активації незалежної від ліганда трансдукції сигналу.
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який зв'язується з
НЕВЗ-рецептором, що перебуває в неактивній конформації, при цьому антитіло блокує як залежну від ліганда, так і незалежну від ліганда трансдукцію сигналу. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент стабілізує НЕКЗ-рецептор у неактивному стані.
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який розпізнає конформаційний епітоп НЕКЗ-рецептора, де конформаційний епітоп містить амінокислотні залишки, що входять у домен 2 і домен 4 НЕКЗ-рецептора, і де антитіло або його фрагмент блокує як залежну від ліганда, так і незалежну від ліганда трансдукцію сигналу. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується з НЕКЗ- рецептором у неактивному стані. Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу антитіло або його фрагмент стабілізує НЕКЗ-рецептор у неактивному стані. Антитіло вибирають з групи, що включає моноклональне антитіло, поліклональне антитіло, химерне антитіло, гуманізоване антитіло та синтетичне антитіло.
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який розпізнає конформаційний епітоп НЕКЗ-рецептора, де конформаційний епітоп містить амінокислотні залишки, що входять у домен 2 і домен 4 НЕКЗ-рецептора, і де зв'язування з антитілом стабілізує НЕКЗ-рецептор у неактивному стані і де ліганд НЕКЗ може конкурентно зв'язуватися з лігандзв'язувальним сайтом на НЕКЗ-рецепторі. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу зв'язування ліганда НЕКЗ з лігандзв'язувальним сайтом не може індукувати конформаційну зміна НЕКЗ-рецептора, що переводить його в активний стан. В іншому варіанті здійснення винаходу зв'язування ліганда НЕКЗ з лігандзв'язувальним сайтом не може активувати трансдукцію сигналу. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу ліганд бо НЕКЗ обраний з групи, що включає нейрегулін 1 (МКО), нейрегулін 2, бетацелюлін,
гепаринзв'язувальний епідермальний фактор росту та епірегулін.
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який розпізнає конформаційний епітоп НЕКЗ-рецептора, де конформаційний епітоп містить амінокислотні залишки, що входять у домен 2 і домен 4 НЕКЗ-рецептора, і де антитіло або його фрагмент блокує як залежну від ліганда, так і незалежну від ліганда трансдукцію сигналу. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується з НЕКЗ- рецептором у неактивному стані. Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу антитіло або його фрагмент стабілізує НЕКЗ-рецептор у неактивному стані.
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який зв'язується з конформаційним епітопом НЕКЗ-рецептора, де конформаційний епітоп містить амінокислотні залишки, що входять у домен 2 і домен 4 НЕКЗ-рецептора, де домен 2 містить петлю димеризації і де антитіло або фрагмент блокує як залежну від ліганда, так і незалежну від ліганда трансдукцію сигналу. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент стабілізує НЕКЗ-рецептор у неактивному стані. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу конформаційний епітоп містить амінокислотні залишки 265-277, 315 (з домена 2), 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (з домена 4) або їх піднабір. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу МН антитіла або його фрагмента зв'язується щонайменше з одним з наступних залишків НЕКЗ: А5п266, І уз267, І еи268, Тпг269, СіІп271,
Сіш273, Рго274, Авзп275, Рго276, Нів277, Авзп315, Авр571, Рго583, Ніз584, Аїаб96, Іуз597.
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу Мі антитіла або його фрагмента зв'язується щонайменше з одним з наступних залишків НЕКЗ: Туг265, І уз267, І еи268, Рпе270,
Сспіуб82, Рго583, І уз597, Пебоб, І узб02, СИиб609, Аг9611, Ргоб12, Сузб13, Нізб14, СИШиб15.
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який розпізнає конформаційний епітоп першого НЕК-рецептора, де конформаційний епітоп містить амінокислотні залишки, що входять у домен 2 і домен 4 першого НЕК-рецептора, де зв'язування антитіла або його фрагмента з першим НЕК-рецептором у відсутності ліганда НЕК-рецептора знижує незалежне від ліганда утворення білкового комплексу перший НЕК-рецептор - другий
НЕВ-рецептор у клітині, у якій відбувається експресія першого НЕК-рецептора і другого НЕК- рецептора. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент
Зо стабілізує перший НЕК-рецептор у неактивному стані, у результаті чого не може відбуватися димеризація першого НЕК-рецептора з другим НЕК-рецептором з утворенням білкового комплексу перший НЕК-рецептор - другий НЕК-рецептор. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу відсутність здатності утворювати білковий комплекс перший НЕК -рецептор - другий НЕК-рецептор перешкоджає активації трансдукції сигналу. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу перший НЕК вибирають з групи, що включає НЕКІ, НЕК2, НЕКЗ і НЕКА4. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу другий НЕК вибирають з групи, що включає НЕК, НЕК2, НЕКЗ і НЕК.
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який розпізнає конформаційний епітоп НЕКЗ-рецептора, де конформаційний епітоп містить амінокислотні залишки, що входять у домен 2 і домен 4 НЕКЗ-рецептора, де зв'язування антитіла або його фрагмента з НЕКЗ-рецептором у відсутності ліганда НЕКЗ знижує незалежне від ліганда утворення білкового комплексу НЕК2-НЕКЗ у клітині, у якій відбувається експресія НЕК? і
НЕКЗ. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент стабілізує НЕКЗ-рецептор у неактивному стані, у результаті чого не може відбуватися димеризація НЕКЗ-рецептора з НЕК2-рецептором з утворенням білкового комплексу НЕК2-
НЕКЗ. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу відсутність здатності утворювати білковий комплекс НЕК2-НЕКЗ перешкоджає активації трансдукції сигналу. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент стабілізує НЕКЗ-рецептор у неактивному стані, таким чином, що усе ще може відбуватися димеризація НЕКЗ-рецептора з
НЕКЗ2, але при цьому утворюється неактивний білююовий комплекс НЕН2-НЕКЗ. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу утворення неактивного білкового комплексу НЕК2-НЕНЗ заважає активації трансдукції сигналу.
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який розпізнає конформаційний епітоп першого НЕК-рецептора, де конформаційний епітоп містить амінокислотні залишки, що входять у домен 2 і домен 4 першого НЕК-рецептора, де зв'язування антитіла або його фрагмента з першим НЕК-рецептором у присутності ліганда НЕК знижує залежне від ліганда утворення білкового комплексу перший НЕК-рецептор - другий. НЕК- рецептор у клітині, у якій відбувається експресія першого НЕК-рецептора і другого НЕК- рецептора. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент бо стабілізує перший НЕВ-рецептор у неактивному стані, у результаті чого не може відбуватися димеризація НЕК-рецептора з другим НЕК-рецептором у присутності ліганда першого НЕК з утворенням білкового комплексу перший НЕК-рецептор - другий НЕК-рецептор. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу відсутність здатності утворювати білковий комплекс перший НЕК-рецептор - другий НЕК-рецептор перешкоджає активації трансдукції сигналу.
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу ліганд НЕК вибирають з групи, що включає нейрегулін 1 (МКО), нейрегулін 2, нейрегулін З, нейрегулін 4, бетацелюлін, гепаринзв'язувальний епідермальний фактор росту, епірегулін, епідермальний фактор росту, амфірегулін і трансформуючий фактор росту альфа. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу перший НЕК вибирають з групи, що включає НЕК1, НЕК2, НЕКЗ і НЕК.
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу другий НЕК вибирають з групи, що включає НЕК, НЕК2, НЕКЗ і НЕКА4.
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який розпізнає конформаційний епітоп НЕКЗ-рецептора, де конформаційний епітоп містить амінокислотні залишки, що входять у домен 2 і домен 4 НЕКЗ-рецептора, де зв'язування антитіла або його фрагмента з НЕКЗ-рецептором у присутності ліганда НЕКЗ знижує залежне від ліганда утворення білкового комплексу НЕК2-НЕКЗ у клітині, у якій відбувається експресія НЕК? і
НЕКЗ. Ліганд вибирають з групи, що включає нейрегулін 1 (МКС) і нейрегулін 2. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент стабілізує НЕКЗ-рецептор у неактивному стані, у результаті чого не може відбуватися димеризація НЕКЗ-рецептора з
НЕНВ2-рецептором у присутності ліганда НЕКЗ з утворенням білкового комплексу НЕК2 - НЕНЗ.
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу відсутність здатності утворювати білковий комплекс НЕК2 -НЕКЗ перешкоджає активації трансдукції сигналу.
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який розпізнає конформаційний епітоп НЕКЗ-рецептора, де конформаційний епітоп містить амінокислотні залишки, що входять у домен 2 і домен 4 НЕКЗ-рецептора, і де антитіло або його фрагмент інгібує фосфорилювання НЕКЗ за даними аналізу незалежного від ліганда НЕКЗ фосфорилювання. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу в аналізі незалежного від ліганда НЕКЗ фосфорилювання застосовують клітини, у яких відбувається ампліфікація
НЕК, при цьому клітини, у яких відбувається ампліфікація НЕК2, являють собою клітини лінії
ЗК-ВГІ-3.
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке/який розпізнає конформаційний епітоп НЕКЗ-рецептора, де конформаційний епітоп містить амінокислотні залишки, що входять у домен 2 і домен 4 НЕКЗ-рецептора, і де антитіло або його фрагмент інгібує фосфорилювання НЕКЗ за даними аналізу залежного від ліганда НЕКЗ фосфорилювання. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу в аналізі залежного від ліганда НЕКЗ фосфорилювання застосовують клітини лінії МСЕ7, стимульовані нейрегуліном (МАС).
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, для якого характерне значення константи дисоціації (Ко), що становить щонайменше 1 х 107М", 108М7И, 109М7, Т109мМИ, Том, 102М7, 1093М7. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент інгібує фосфорилювання НЕКЗ за даними зв'язування іп міго з людським НЕКЗ, отриманим за допомогою аналізу фосфорилювання, який вибирають з групи, що включає фосфо-НЕКЗ і фосфо-АКІ.
Іншим об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, яке/який перехресно конкурує з антитілом, представленим у таблиці 1; антитіло або його фрагмент, яке/який взаємодіє (наприклад, шляхом зв'язування, утворення стеричної перешкоди, стабілізації/дестабілізації просторового розподілу) з тим же епітопом, що й антитіло, представлене в таблиці 1. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент являє собою моноклональне антитіло. Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу антитіло або його фрагмент являє собою гуманізоване антитіло. Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу антитіло або його фрагмент являє собою химерне антитіло. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент містить константну область людського важкого ланцюга і константну область людського легкого ланцюга. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент являє собою одноланцюгове антитіло. Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу антитіло або його фрагмент являє собою ЕРабр-фрагмент. Згідно з ще одним варіантом здійснення винаходу антитіло або його фрагмент являє собою 5сЕм. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується як з людським НЕКЗ, так і з НЕКЗ мавпи циномолгус. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його бо фрагмент відноситься до ізотипу до. Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу антитіло або його фрагмент містить каркасну ділянку, у якій амінокислоти в каркасній ділянці антитіла були замінені на амінокислоти з відповідних послідовностей МН або Мі. людської зародкової лінії.
Одним з об'єктів цього винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ або його фрагмент, яке/який містить 1, 2, 3, 4, 5 або 6 СОР, визначених на основі системи Кебота або Хотіа, кожного з антитіл, представлених у таблиці 1.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, яке/який містить СОКЗ важкого ланцюга, обраний з групи, що включає 5ЕО ІО МО: 4, 5ЕО ІЮ
МО: 10, 5ЕО ІО МО: 22, 5ЕО ІО МО: 28, 5ЕО ІО МО: 40, 5ЕО ІЮО МО: 46, 5ЕО ІО МО: 58, 5ЕО І
МО: 64, 5ЕО ІЮ МО: 76, 5ЕО І МО: 82, 5ЕО ІО МО: 94, 5ЕО ІО МО: 100, 5ЕО ІО МО: 112, 5ЕО І
МО: 118, 5ЕО ІЮО МО: 130, 5ЕО ІО МО: 136, 5ЕО ІЮ МО: 148, 5ЕО ІЮ МО: 166, 5ЕО ІО МО: 184,
ЗЕО ІО МО: 202, 5ЕО ІО МО: 220, 5БЕО ІЮ МО: 238, 5ЕО ІЮ МО: 256, 5ЕО І МО: 274, 5ЕО ІЮ МО: 292, ЗЕО ІЮО МО: 310, 5ЕО ІЮ МО: 328, 5ЕО ІЮО МО: 346 і 5ЕО ІЮ МО: 364.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 15, і Мі, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 14, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить ЗЕО ІО МО: 33, і Мі, яка містить ЗЕО ІО МО: 32, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить ЗЕО ІО МО: 51, і Мі, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 50, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить ЗЕО ІО МО: 69, і Мі, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 68, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 95.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить ЗЕО ІО МО: 87, і Мі, яка містить 5ЕО І МО: 86, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент,
Ко) де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 105, і Мі, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 104, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 123, і МІ, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 122, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕНКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 141, і МІ, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 140, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 159, і Мі, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 158, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 177, і МІ, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 176, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 195, і МІ, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 194, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 213, і Мі, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 212, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 231, і МІ, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 230, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 249, і Мі, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 248, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 95.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 267, і МІ, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 266, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, 60 де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 285, і Мі, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 284, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 303, і МІ, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 302, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 321, і МІ, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 320, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 339, і Мі, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 338, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 357, і МІ, яка містить ЗЕО ІЮ МО: 356, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, де антитіло включає МН, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 375, і Мі, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 374, або амінокислотну послідовність, ідентичну їм на 97-99 965.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить варіабельну область важкого ланцюга, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 493.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить варіабельну область легкого ланцюга, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 494.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить варіабельну область важкого ланцюга, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 493 і варіабельну область легкого ланцюга, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 494.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло до НЕКЗ-рецептора або його фрагмент, яке містить/який містить варіант варіабельної області важкого ланцюга, який містить СОМ,
СОК2 і СОКЗ, де варіант включає щонайменше 1-4 амінокислотних змін в одному з СОК'1,
Зо СОР або СОКЗ.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 2; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 3; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЗЕО ІЮ МО: 4; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'І, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 5; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮО МО: 6; і
СОКЗ послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 7.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 20; СОК2, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 21; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮО МО: 22; у варіабельній області легкого ланцюга СОК!І, послідовність якого представлена в ЗЕО ІО МО: 23; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮО МО: 24; і СОКЗ послідовність якого представлена 5ЕО ІЮ МО: 25.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 38; СОК2, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 39; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 40; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'І, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 41; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮО МО: 42; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 43.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 56; СОК2, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 57; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮО МО: 58; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'І, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮО МО: 59; СОК2, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮО МО: 60; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 61.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 74; СОК2, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 75; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮО МО: 76; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'І, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 77; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮО МО: 78; 60 і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 79.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 92; СОК2, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 93; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮО МО: 94; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'І, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮО МО: 95; СОК2, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮО МО: 96; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 97.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 110; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 111; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО І МО: 112; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ1, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 113; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 114; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 115.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 128; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 129; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 130; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 131; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 132; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 133.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 146; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 147; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 148; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 149; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 150; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 151.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 164; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 165; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО І МО: 166; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'І, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 167; СОК2, послідовність якого представлена в
Ко) ЗЕО ІЮ МО: 168; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 169.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 182; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 183; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 184; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'І, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 185; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 186; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 187.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 200; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 201; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 202; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'І, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 203; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 204; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 205.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 218; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 219; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 220; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'І, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 221; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 222; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 223.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 236; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 237; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 238; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'І, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 239; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 240; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 241.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 254; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 255; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО І МО: 256; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'І, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 257; СОК2, послідовність якого представлена в 60 ЗЕО ІЮ МО: 258; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 259.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 272; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 273; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 274; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'І, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 275; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 276; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 277.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 290; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 291; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 292; у варіабельній області легкого ланцюга СОМ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 293; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 294; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 295.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 308; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 309; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 310; у варіабельній області легкого ланцюга СОМ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 311; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 312; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 313.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 326; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 327; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 328; у варіабельній області легкого ланцюга СОМ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 329; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 330; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 331.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 344; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 345; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 346; у варіабельній області легкого ланцюга СОМ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 347; СОК2, послідовність якого представлена в
Ко) ЗЕО ІЮ МО: 348; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 349.
Наступним об'єктом винаходу є виділене антитіло або його фрагмент, яке містить/який містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 362; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 363; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 364; у варіабельній області легкого ланцюга СОМ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 365; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 366; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 367.
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу фрагмент антитіла, що зв'язується з
НЕКЗ, вибирають з групи, що включає Раб, Е(абхг), Е(аб)г», зсЕм, МНН, МН, МІ, адр.
Наступним об'єктом винаходу є фармацевтична композиція, яка містить антитіло або фрагмент і фармацевтично прийнятний носій. В одному з варіантів здійснення винаходу фармацевтична композиція містить також додатковий терапевтичний засіб, такий як антитіло, мала молекула, інгібітор ттоОкК або інгібітор РіЗ-кінази. В одному з варіантів здійснення винаходу фармацевтична композиція містить антитіло або його фрагмент, запропоноване/запропонований у винаході, та інгібітор НЕКТ, який включає (але не обмежений тільки ними) матузумаб (ЕМО72000), ЕгрйихФуУцетуксимаб, Месііріхв/панітумумаб, МАт 806, німотузумаб, Ігеззавугефітиніб, СІ-1033 (РО183805), лапатиніб (СУУ-572016),
ТукегьФфулапатинібу дитозилат, Тагсемавєуерлотиніб: НСІ (051-774), РКІ-166 и ТомокФ).
В одному з варіантів здійснення винаходу фармацевтична композиція містить антитіло або його фрагмент, запропоноване/запропонований у винаході, та інгібітор НЕК, який включає (але не обмежений тільки ними) пертузумаб, трастузумаб, ММ-111, нератиніб, лапатиніб або лапатинібу дитозилат/Тукегоф).
В одному з варіантів здійснення винаходу фармацевтична композиція містить антитіло або його фрагмент, запропоноване/запропонований у винаході, та інгібітор НЕКЗ, який включає (але не обмежений тільки ними) ММ-121, ММ-111, ІВ4С3, 201012 (фірма ШЗ Рпапта АС), АМО888 (фірма Атдеп), АМ-203З(фірма Амео), МЕНО7945А (фірма Сепепіесп); малі молекули, які інгібують НЕКЗ.
В одному з варіантів здійснення винаходу фармацевтична композиція містить антитіло або його фрагмент, запропоноване/запропонований у винаході, та інгібітор НЕКА.
В одному з варіантів здійснення винаходу фармацевтична композиція містить антитіло або бо його фрагмент, запропоноване/запропонований у винаході, та інгібітор РІЗ-кінази, який включає
(але не обмежений тільки ними) СОС 0941 ВЕ7235, ВМК120 і ВУ 719.
В одному з варіантів здійснення винаходу фармацевтична композиція містить антитіло або його фрагмент, запропоноване/запропонований у винаході, та інгібітор ттТОК, який включає (але не обмежений тільки ними) темсиролімус/Тогізе|?), рідафоролімус/дефоролімус, АР23573,
МК8669, еверолімус/Айіпйогя. Наступним об'єктом винаходу є спосіб лікування раку, що полягає в тому, що відбирають індивідуума, який має рак, що відрізняється експресією НЕКЗ, вводять індивідуумові в ефективній кількості композицію, яка містить антитіло або його фрагмент, зазначене/зазначений в одному з попередніх пунктів. В одному з варіантів здійснення винаходу індивідуум являє собою людину.
Наступним об'єктом винаходу є спосіб лікування раку, який полягає в тому, що відбирають індивідуума, який має рак, що відрізняється наявністю експресії НЕКЗ, вводять індивідуумові в ефективній кількості композицію, яка містить антитіло або його фрагмент, зазначене/зазначений в одному з попередніх пунктів, у якому рак вибирають з групи, що включає рак молочної залози, колоректальний рак, рак легені, множинну мієлому, рак яєчника, рак печінки, рак шлунку, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, гострий мієлолейкоз, хронічний мієлолейкоз, остеоаркому, плоскоклітинну карциному, пухлини оболонки (піхви) периферичних нервів, шваному, рак голови і шиї, рак сечового міхура, езофагеальний рак, гліобластому, світлоклітинну саркому м'якої тканини, злоякісну мезотеліому, нейрофіброматоз, рак нирки, меланому. В одному з варіантів здійснення винаходу рак являє собою рак молочної залози.
Наступним об'єктом винаходу є спосіб лікування раку, який полягає в тому, що відбирають індивідуума, який має рак, що відрізняється наявністю експресії НЕКЗ, вводять індивідуумові в ефективній кількості композицію, яка містить комбінацію антитіл або їх фрагментів, зазначених у таблиці 1, які зв'язуються з НЕКЗ.
Наступним об'єктом винаходу є спосіб лікування раку, який полягає в тому, що відбирають індивідуума, який має рак, що відрізняється наявністю експресії НЕКЗ, вводять індивідуумові в ефективній кількості композицію, яка містить антитіло або його фрагмент, яке/який зв'язується з
НЕКЗ та інгібує залежну від ліганда НЕКЗ трансдукцію сигналу і незалежну від ліганда трансдукцію сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є застосування антитіла або його фрагмента, зазначеного в
Зо кожному з попередніх пунктів, для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу, де рак вибирають з групи, що включає рак молочної залози, колоректальний рак, рак легені, множинну мієлому, рак яєчника, рак печінки, рак шлунка, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, гострий мієлолейкоз, хронічний мієлолейкоз, остеоаркому, плоскоклітинну карциному, пухлини оболонки периферичних нервів, шваному, рак голови і шиї, рак сечового міхура, езофагеальний рак, гліобластому, світлоклітинну саркому м'якої тканини, злоякісну мезотеліому, нейрофіброматоз, рак нирки та меланому.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в 5ЕО ІЮ
МО: 15, ії послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 14, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 33, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 32, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 51, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 50, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 69, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 68, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 87, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 86, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ 60 МО: 105, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 104, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 123, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 122, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 141, і послідовність МІ, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 140, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність МН, представлену в 5ЕО ІЮ
МО: 151, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 158, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 177, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 176, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 195, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 194, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 213, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 212, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в 5ЕО ІЮ
МО: 231, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 230, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або
Зо незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 249, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 248, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 267, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 266, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 285, і послідовність МІ, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 284, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в 5ЕО ІЮ
МО: 303, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 302, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 321, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 320, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 339, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 338, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 357, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 356, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ 60 МО: 375, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 374, призначене для застосування при лікуванні раку, опосередковуваного залежним від ліганда НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганда шляхом трансдукції сигналу.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 15, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 14, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 33, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 32, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в 5ЕО ІЮ
МО: 51, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 50, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 69, і послідовність МІ, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 68, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 87, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 86, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 105, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 104, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в 5ЕО ІЮ
МО: 123, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 122, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 141, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 140, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 159, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 158, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 177, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 176, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 195, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 194, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 213, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 212, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 231, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІО МО: 230, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 249, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 248, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 267, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 266, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в 5ЕО ІЮ
МО: 285, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 284, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 303, і послідовність МІ, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 302, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 321, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 320, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 339, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 338, призначене для застосування як лікарський засіб. 60 Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в 5ЕО ІЮ
МО: 357, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 356, призначене для застосування як лікарський засіб.
Наступним об'єктом винаходу є антитіло, яке має послідовність УН, представлену в ЗЕО ІЮ
МО: 375, і послідовність МІ, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 374, призначене для застосування як лікарський засіб.
Короткий опис креслень
На кресленнях показано: на фіг. 1 - репрезентативні криві, отримані за допомогою 5ЕТ (титрування врівноваженого розчину), для антитіла МОК10701 при використанні НЕКЗ людини, миші, пацюка і мавпи циномолгус (супо); на фіг. 2 - результати оцінки зв'язування з клітинами лінії 5К-ВІ/-3, отримані за допомогою
ЕАС5-титрування; на фіг. З - отримані за допомогою ЕГІЗА результати, що стосуються домену зв'язування
НЕНВЗ; на фіг. 4 - результати епітопного картирування на основі обміну водню на дейтерій (заміщення водню дейтерієм). А) Пептиди ЕСО НЕКЗ, виділені після НОХ-М5-аналізу (МО- аналіз обміну водню на дейтерій), позначені штриховими лініями. Потенційні сайти М-зв'язаного глікозилювання виділені яскравим кольором. Б) Дані про відносний ступінь дейтеризації, виявленої в пептидах, які ідентифікували за допомогою МС. В) Захищені залишки, картовані в опублікованій кристалічній структурі НЕВЗ; на фіг 5: А) - зображення поверхні кристалічної структури НЕКЗ/МОКО9823 і
НЕКЗ/МОКО9825 у рентгенівських променях. НЕКЗ (пофарбований більш світлим сірим кольором) перебуває в закритій конформації, а МОКО9823 або МОКО9825 (пофарбовані більш темним сірим кольором) зв'язуються з обома доменами 2 і 4. Б) - зображення поверхні НЕКЗ зі структури НЕКЗ/МОКОЗ9У823, представлене в такій же орієнтації, що й (А). МОКО9823 для простоти не показаний. В) - структура НЕКЗ/МОКОЗ9823, проілюстрована у вигляді стрічкової структури, поверненої на кут 907 відносно панелей (А), (Б) і (Г). Г) - стрічкове зображення неактивної конформації НЕКЗ, що розпізнається Гар-фрагментом МОКО9823, зі збільшеним зображенням поверхні розділу домена 2/домена 4, яскравим кольором виділені залишки НЕКЗ,
Зо розташовані в межах 5А від Бар. Д) - результати зв'язування мутантного НЕКЕЗ/МОК 10703, отримані за допомогою ЕГІЗА-титрування; на фіг. 6 - дані про інгібування фосфорилювання НЕКЗ, що індукується лігандом (А) або незалежне від ліганда (Б); на фіг. 7 - дані про інгібування залежних від НЕКЗ розташованих у прямому напрямку шляхів передачі сигналу в клітинних лініях, у яких відбувається ампліфікація НЕК2; на фіг. 8 - дані про вплив інгібування НЕКЗ на ріст клітин; А) ВТ-474-клітини і Б) стимульовані нейрегуліном МСЕ 7-клітини; на фіг. 9 - дані про вплив МОКО9823 і МОКО9825 на зв'язування нейрегуліна з МСЕ 7- клітинами; на фіг 10 - дані про вплив зв'язування МОКО9823 на утворення комплексу НЕКЗ/ нейрегулін при оцінці за допомогою Віасоге М. Без антитіл (чорні прямокутники), МОКО9823 (білі прямокутники, 105,5 (сірі прямокутники), і застосовуваний як контроль дО (заштриховані прямокутники); на фіг. 11 - дані про опосередковане МОКО9823 інгібування (А) незалежної від ліганда (ВТ- 474) і (Б) залежної від ліганда (ВХРОЗ) передачі сигналу НЕКЗ іп мімо; на фіг 12 - дані про вплив МОК10701 і МОК10703 на ріст пухлини лінії ВТ-474; на фіг. 13 - дані про вплив МОК10701 і МОК10703 на ріст пухлини лінії ВХРОЗ; на фіг. 14 - ізоболограми, що описують вплив іп міго комбінації МОК1070О3 з лікарськими засобами (А) МОКО9823/ трастузумаб, (Б) МОКО9823/ лапатиніб, (В) МОК10703/ ВЕ7235, (Г)
МОМ10703/ ВКМ120, (ДУ МОК10703/ ВМ1719, (Е) МОМК10703/ КАБОО1, (Ж) МОК10703/ цетуксимаб і (3) МОК10703/ ерлотиніб; на фіг. 15 - дані про вплив іп мімо комбінацій МОК10701 або МОК10703 з (А) трастузумабом і (Б) ерлотинібом на клітини ВТ-474 і І 3.3.
Докладний опис винаходу
Визначення
З метою кращого розуміння цього винаходу попередньо представлене визначення деяких понять. Додаткові визначення представлені в докладному описі винаходу.
Поняття "шлях трансдукції сигналу" або "сигнальна активність" відноситься до біохімічного причинного взаємозв'язку, як правило, який ініціюється білок-білююовою взаємодією, такою як бо зв'язування фактора росту з рецептором, що приводить до передачі сигналу від однієї частини клітини до іншої частини клітини. У випадку НЕКЗ передача сигналу включає специфічне фосфорилювання одного або декількох залишків тирозину, серину або треоніну в одному або декількох білках, що беруть участь у каскаді реакцій, які обумовлюють трансдукцію сигналу.
Передостанні процеси, як правило, включають пов'язані з ядром події, які приводять до зміни експресії гена. "НЕВН-рецептор" являє собою рецепторну протеїнтирозинкіназу, що відноситься до сімейства НЕК-рецепторів і включає рецептори ЕСЕК, НЕК2, НЕКЗ і НЕК4 та інших представників цього сімейства, які будуть ідентифіковані в майбутньому. НЕК-рецептор, у цілому, містить позаклітинний домен, який може зв'язуватися з лігандом НЕК; ліпофільний трансмембранний домен; консервативний внутрішньоклітинний тирозинкіназний домен; і розташований на карбоксильному кінці сигнальний домен, який несе кілька залишків тирозину, які можуть фосфорилюватися. Краще НЕК-рецептор має нативну послідовність людського НЕК- рецептора.
Поняття "НЕКТ1", "ЕгрВ1", "рецептор епідермального фактора росту" і "ЕСЕК" у контексті цього опису застосовують взаємозамінно, і вони відноситься до ЕСЕК, описаного, наприклад, у
Сагрепієег та ін., Апп. Кем. Віоспет. 56, 1987, сс. 881-914, включаючи його мутантні форми, що зустрічаються в природних умовах (наприклад, делеційний мутант ЕСЕК, описаний у Нитрпгеу та ін., РМАБ (О5А) 87, 1990, сс. 4207-4211). Поняття "ЕгоВ1" відноситься до гена, що кодує білковий продукт, який представляє собою ЕСЕК.
У контексті цього опису поняття "НЕК2" ії "ЕгрВ2" застосовують взаємозамінно, і вони відносяться до людського білка НЕК2, описаного, наприклад, в Зетрбва та ін., РМА5 (ОА) 82, 1985, сс. 6497-6501 і Мататоїйо та ін., Маїшге 319, 1986, сс. 230-234 (реєстраційний номер
Сеперапк хХо3363). Поняття "ЕгОВ2" відноситься до гена, що кодує людський ЕгЬбВ2, "пеи" відноситься до гена, що кодує щурячий білок рів5геч,
У контексті цього опису поняття "НЕКа4" і "ЕгЬВ4" цього опису відносяться до рецепторного поліпептиду, описаного, наприклад, у заявці на європейський патент Мо 599274; в Ріошмтап та ін., Ргос. Маїй!. Асад. сі. О5А, 90, 1993, сс. 1746-1750; і у Ріомтап та ін., Майиге, 366, 1993, сс. 473-475, включаючи його ізоформи, описані, наприклад, в УМО 99/19488, яка була опубліковано 22 квітня 1999 р.
Зо Поняття "НЕКЗ" або "НЕКЗ-рецептор", а також "ЕгрВ3З", у контексті цього опису відноситься до білка НЕКЗ ссавців, а поняття "пег3" або "егоВ3" відноситься до гена Ппег3 ссавців. Кращий білок НЕКЗ являє собою людський білок НЕКЗ, який присутній у клітинній мембрані клітини.
Людський ген пег3 описаний в О5 Мо 5480968 і у Ріомтап та ін., Ргос. Май. Асад. сі. О5А, 87, 1990, сс. 4905-4909.
Людський НЕКЗ, реєстраційний Мо МР 001973 (людський), має послідовність, представлену нижче в ЗЕО ІЮО МО: 1. Уся номенклатура представлена для повнорозмірного незрілого НЕКЗ (амінокислоти 1-1342). Незрілий НЕКЗ розщеплюється між положеннями 19 і 20 з утворенням зрілого білка НЕКЗ (амінокислоти 20-1342). тгапаа!|дмі аІнеІагдб5 емдподамср аіпдіємю даєпдудну Кіуетсеуут дпівїмідн падієтдмі гемідуміма тпеїзіїрір пігуугуїдм удуктаймит
Іпупін55На Ідна ейзадмуїє Кпакісптаї ідупаїмнаг давімукапд гвсррспемс Кагсжмордзе асашкійс ардспдупсегу рпрпдоспде садасзарда
Тастастнтп аздасмргср дрімупкІк діерпрпїКу дуддисмавс рипіумадів смгасрраКт емакпдіКтс ерсддісрКа седідз5двії дімаззпіду пеїкіїдн
Іалйдіпо аржйкіраїа реКіІпмінм гейдуїпід змуррптнНпів мізпіндса "вІупгуїві ПтКлїпмів ІдітеІКеї5 адпуїзапг дісупизіпм ІКкмікдрієє паїкАпгрг гасмавеокКмс дрісззддсу ардрддсівс гпузгддмисм (спіпдер гетапеаєсї зспресдрте аіаїспд5дв дісадсанії ддрисув5ср памідакарі укурамдпес греспепсіддо сКкореїдасі аддіміідк пктайміа діммїттід дшумгтатт ідпКтатіту Іегдевієері арзеКапкмі апіКеїеіїк КІКМІЗ5ДМ діинКдум/ір едевзікірмс ІКмівєаКзаг дзїдаміднт Іаідзіянанй іпідісра 55ІДІМІду! рід а Нмг дпгдаїдраї! Ппжомдіак дтууієендт мптіаатм
ІКзрздмудм аагдмадіїр раакдіїузе акірікмитаї! езіпнокукй дзамумзудхмі умеітідає руадіпаєм раїПекадет! адрдісіам утмтуксм/ті депітрикКе
Іапейнтаг арргуїміКг ездрдаіардр ерпоуПокКкКІ еємеїІереїа ІдіаІєаееа піатідва Ізірмайпг ргдзд5ії5р зздутртпдуд підезсдеза мизаззетгтерг рувіпртрго сіазез5еді мдзеав!де Кибтсетевгвг 5І5ргргдаз аупзагнвії
Ірміріхрра Ієевєдупдум траїпікаїр 55гедіїз5м дібвзмідієє еєдедеєувут (510) птин5рр ррірззівєї дуеутамаза Ізазідвід5 сріпрурітр їаднпраєду еутпгдгада драддауаатоу асразеддує етгаїддроай дарнмпуаг!! Ккикзієаїа загапраумй зпркапад п (ЗЕО ІО МО: 1)
Поняття "ліганд НЕК" у контексті цього опису відноситься до поліпептидів, які зв'язуються і активують НЕК-рецептори, такі як НЕК, НЕК2, НЕКЗ ї НЕК4. Прикладами лігандів НЕК є (але не обмежуючись тільки ними) нейрегулін 1 (МКС), нейрегулін 2, нейрегулін 3, нейрегулін 4, бетацелюлін, гепаринзв'язувальний епідермальний фактор росту, епірегулін, епідермальний фактор росту, амфірегулін і трансформуючий фактор росту альфа. Поняття включає біологічно активні фрагменти і/або варіанти поліпептиду, що зустрічається в природних умовах.
Поняття "ліганд НЕКЗ" у контексті цього опису відноситься до поліпептидів, які зв'язуються та активують НЕКЗ. Прикладами лігандів НЕКЗ є (але не обмежуючись тільки ними) нейрегулін 1 (МКО) і нейрегулін 2, бетацелюлін, гепаринзв'язувальний епідермальний фактор росту та епірегулін. Поняття включає біологічно активні фрагменти і/або варіанти поліпептиду, що зустрічається в природних умовах. "Білюювий комплекс НЕК-НЕК" являє собою нековалентно асоційований олігомер, що містить корецептори НЕК у будь-якій комбінації (наприклад, НЕК1-НЕН2, НЕНВ1-НЕНЗ, НЕНВ1-
НЕН4, НЕН2-НЕНЗ, НЕНЗ-НЕКА і т.п.). Цей комплекс може утворюватися, коли клітину, яка експресує обидва зазначених рецептори, обробляють лігандом НЕК, наприклад, МКС, або коли
НЕВ-рецептор є активним або коли відбувається його надекспресія. "Білюювий комплекс НЕК2-НЕКЗ" являє собою нековалентно асоційований олігомер, що містить НЕК2-рецептор і НЕКЗ-рецептор. Цей комплекс може утворюватися в тому випадку, коли клітину, яка експресує обидва зазначених рецептори, обробляють лігандом НЕКЗ, наприклад, МКС, або коли НЕКЗ2 є активним/надекспресується.
Поняття "активність НЕКЗ" або "активація НЕКЗ" у контексті цього опису відноситься до підвищення олігомеризації (наприклад, збільшенню кількості комплексів, що містять НЕКЗ), фосфорилювання НЕКЗ, конформаційних перегрупувань (наприклад, таких, що індукуються лігандами) і опосередковуваної НЕКЗ передачі сигналу в прямому напрямку.
Поняття "стабілізація" або "стабілізований" у контексті НЕКЗ відноситься до антитіла або його фрагмента, яке/який безпосередньо підтримує (замикає, прив'язує, утримує, краще зв'язує,
Зо "має схильність до") неактивний стан або неактивну конформацію НЕКЗ, не блокуючи при цьому зв'язування ліганда з НЕКЗ, але таким чином, щоб зв'язування ліганда вже не могло активувати НЕКЗ. Описані в прикладах аналізи, наприклад Віасоге-аналіз, можна застосовувати для оцінки зв'язування ліганда зі стабілізованим НЕКЗ-рецептором.
Поняття "залежна від ліганда передача сигналу" у контексті цього опису відноситься до активації НЕК (наприклад, НЕКЗ) за допомогою ліганда. Активація НЕКЗ проявляється по підвищеній олігомеризації (наприклад, гетеродимеризації) і/або фосфорилюванню НЕКЗ, у результату чого активуються розташовані в прямому напрямку шляху передачі сигналу (наприклад, РІЗК). Антитіло або його фрагмент може статистично значимо знижувати кількість фосфорильованих НЕКЗ у стимульованій клітині, обробленій антигензв'язувальним білком (наприклад, антитілом), у порівнянні з неопрацьованою (контрольною) клітиною, при оцінці за допомогою аналізів, описаних у прикладах. Клітини, що експресують НЕКЗ, можуть являти собою клітинну лінію, що зустрічається в природних умовах (наприклад, МСЕ7), або їх можна одержувати рекомбінантно шляхом інтродукції нуклеїнових кислот, які кодують білок НЕКЗ, у клітині-хазяїні. Стимуляцію клітини можна здійснювати або шляхом екзогенного додавання активуючого НЕКЗ ліганда, або шляхом ендогенної експресії активуючого ліганда.
Антитіло або його фрагмент, яке/який "знижує індуційовану нейрегуліном активацію НЕКЗ у клітині" відноситься до антитіла або його фрагмента, яке/який статистично значимо знижує фосфорилювання тирозину НЕКЗ у порівнянні з неопрацьованою (контрольною) клітиною, при оцінці за допомогою аналізів, описаних у прикладах. Визначення цього може грунтуватися на рівнях фосфотирозину в НЕКЗ після обробки НЕКЗ МЕ і антитілом, що представляє інтерес.
Клітина, що експресує НЕКЗ, може являти собою клітину, що зустрічається в природних умовах, або клітинну лінію (наприклад, МСЕ7) або її можна одержувати рекомбінантно.
Поняття "незалежна від ліганда передача сигналу" у контексті цього опису відноситься до клітинної активності НЕКЗ (наприклад, фосфорилювання), для якої не потрібне зв'язування з лігандом. Наприклад, незалежна від ліганда активація НЕКЗ може бути результатом надекспресії НЕК2 або активуючихмутацій у партнерах НЕКЗ по гетеродимеризації, таких як
ЕСЕК і НЕК2. Антитіло або його фрагмент може статистично значимо знижувати кількість фосфорильованих НЕКЗ у клітині, обробленій антигензв'язувальним білком (наприклад, антитілом), у порівнянні з неопрацьованою (контрольною) клітиною. Клітина, що експресує бо НЕКЗ, може являти собою клітинну лінію, що зустрічається в природних умовах (наприклад, ЗК-
ВІі-3), або її можна одержувати рекомбінантно шляхом інтродукції нуклеїнових кислот, які кодують білок НЕКЗ, у клітину-хазяїна.
Поняття "блокує" у контексті цього опису відноситься до зупинки або запобігання взаємодії або процесу, наприклад, припинення залежної від ліганда або незалежної від ліганда передачі сигналу.
Поняття "розпізнає" у контексті цього опису відноситься до антитіла або його фрагмента, яке/який виявляє і взаємодіє (наприклад, зв'язується) з його конформаційним епітопом.
Поняття "конкурентно зв'язується" у контексті цього опису відноситься до ліганда НЕК, який може зв'язуватися з сайтом зв'язування ліганда на НЕК-рецепторі нарівні з антитілом до НЕК.
Це означає, що і ліганд, і антитіло можуть одночасно зв'язуватися з НЕК-рецептором.
Наприклад, тільки з метою ілюстрації, ліганд НЕКЗ МКО може зв'язуватися з НЕКЗ-рецептором поряд з антитілом до НЕКЗ. Аналіз, призначений для оцінки конкурентного зв'язування ліганда і антитіла, описаний у розділі "Приклади" (наприклад, Віасоге-аналіз).
Поняття "що не має здатності" у контексті цього опису відноситься до антитіла або його фрагмента, яке/який не можуть здійснювати конкретну функцію. Наприклад, антитіло або його фрагмент, яке/який "не має здатності активувати трансдукцію сигналу", являє собою антитіло або його фрагмент, яке/який не запускає трансдукцію сигналу; антитіло або його фрагмент, яке/який "не має здатності індукувати конформаційну зміну", являє собою антитіло або його фрагмент, яке/який не викликає структурної зміни НЕК-рецептора; антитіло або його фрагмент, яке/який стабілізує НЕК-рецептор у неактивному стані, такому, що НЕК-рецептор "не має здатності до димеризації", являє собою антитіло або його фрагмент, яке/який не утворює білок- білкові комплекси.
Поняття "антитіло" у контексті цього опису відноситься до повних антитіл, які взаємодіють (наприклад, шляхом зв'язування, створення стеричної перешкоди, стабілізації/дестабілізації, просторового розподілу) з епітопом НЕКЗ та інгібують трансдукцію сигналу. "Антитіло", що зустрічається в природних умовах, являє собою глікопротеїн, який містить щонайменше два важкі (Н) ланцюги і два легкі () ланцюги, зв'язані один з одним дисульфідними містками.
Кожний важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (скорочено позначена в контексті цього опису як МН) і константної області важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга складається з трьох доменів, тобто СНІ, СН2 і СНЗ. Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (скорочено позначена в контексті цього опису як МІ) і константної області легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга складається з одного домену, тобто Сі. МН- і Мі-області можна додатково підрозділяти на області гіперваріабельності, які називають гіперваріабельними ділянками (СОМ), які перемежовуються з більш консервативними ділянками, які називають каркасними ділянками (ЕК). Кожна з МН і МІ. складається із трьох СОК і чотирьох ЕК, які розташовані в напрямку від амінокінця до карбоксикінця в наступному порядку: ЕК!1, СОКІ, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОРЗ, ЕКА.
Варіабельні області важких і легких ланцюгів містять зв'язувальний домен, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами хазяїна, у тому числі з різними клітинами імунної системи (наприклад, ефекторними клітинами) і першим компонентом (Сід) класичної системи комплементу. Поняття "антитіло" відноситься, наприклад, до моноклональних антитіл, людських антитіл, гуманізованих антитіл, камелізованих антитіл, химерних антитіл, одноланцюгових Ем (5сЕм), зв'язаних дисульфідним містком Ем (зам), ЕРар-фрагментів, Е(аб)-фрагментів і антиідіотипових (анти-ій4) антитіл (включаючи, наприклад, анти-і4 антитіла до антитіл, запропонованих у винаході), і до епітопзв'язувальних фрагментів кожного з них. Антитіла можуть відноситься до будь-якого ізотипу (наприклад, дес, ЧЕ, ІМ, до, ІдА ї Ід), класу (наприклад, Іде, Ідс2, аз, да, ІДА1 і Аг) або підкласу.
Як легкі, так ії важкі ланцюги підрозділяють на області структурної та функціональної гомології. Поняття "константна" і "варіабельна" застосовують для визначення функції. При цьому прийнято вважати, що ділянки варіабельних доменів легких (МІ) і важких (МН) ланцюгів визначають розпізнавання антигену і специфічність. | навпаки, константні домени легкого ланцюга (СІ) і важкого ланцюга (СНІ, СН2 або СНЗ) обумовлюють важливі біологічні властивості, такі як секреція, проходження через плаценту, зв'язування Ес-рецептора, зв'язування комплементу і т.п. Прийнято, що нумерація доменів константних областей зростає в міру їх віддалення від антигензв'язувального центру або амінокінця антитіла. М-кінць являє собою варіабельну область, а на С-кінці перебуває константна область; СНЗ- і СІ -домени фактично містять карбоксикінець важкого і легкого ланцюга відповідно.
Поняття "фрагмент антитіла" у контексті цього опису відноситься до однієї або декількох бо ділянок антитіла, яка(ї) зберігає(ють) здатність специфічно взаємодіяти (наприклад, шляхом зв'язування, стеричної перешкоди, стабілізації/дестабілізації, просторового розподілу) з епітопом НЕКЗ та інгібувати трансдукцію сигналу. Прикладами зв'язувальних фрагментів є (але не обмежуючись тільки ними) Габ-фрагмент, одновалентний фрагмент, що складається з Мі-,
МУН-, СІ- ї СНІ-доменів; Е(аб)г-фрагмент, двовалентний фрагмент, який складається з двох ЕРар- фрагментів, зв'язаних дисульфідним містком у шарнірній області; Ба-фрагмент, що складається з МН- ії СНІ-доменів; Еум-фрагмент, що складається з Мі- і МН-доменів одного плеча антитіла; аАрБ-фрагмент (Умага та ін., Маїшге 341, 1989, сс. 544-546), який складається з МН-домена; і виділена гіперваріабельна ділянка (СОК).
Крім того, незважаючи на те, що два домени Ем-фрагмента, тобто МІ і МН, кодуються різними генами, їх можна з'єднувати за допомогою методів рекомбінації синтетичним лінкером, який дозволяє створювати з них один білковий ланцюг, у якому пара Мі - і МН-областей формує одновалентні молекули (відомі під назвою одноланцюговий Ем-фрагмент (зсЕм); див., наприклад, Віга та ін., Зсіепсе 242, 1988, сс. 423-426; і Нивіоп та ін., Ргос. Маї!. Асай. 5сі. 85, 1988, сс. 5879-5883). Такі одноланцюгові антитіла також підпадають під поняття "фрагмент антитіла". Зазначені фрагменти антитіла одержують за допомогою загальноприйнятих методів, відомих фахівцям у цій галузі, і фрагменти піддають скринінгу відносно можливості їх застосування, аналогічного застосуванню інтактних антитіл.
До фрагментів антитіла відносяться також однодоменні антитіла, макситіла, мінітіла, інтратіла, диантитіла (диабоди, димерні) антитіла, тримерні антитіла, тетрамерні антитіла, м-
МАК і біс-5сЕм (див., наприклад, Ноїїїпдег і Нидзоп, Майге Віоїесппоїіоду, 23, 9, 2005, сс. 1126- 1136). Фрагменти антитіл можна трансплантувати у каркаси, основою яких є поліпептиди, такі як фібронектин типу Ш (Рп3) (див. 5 Мо 6703199, у якому описані моноантитіла, основою яких є поліпептид фібронектину).
Фрагменти антитіл можуть входити також в одноланцюгові молекули, які містять пару розташованих у вигляді тандема Ем-сегментів (МН-СНІ-МН-СНІ), які у комбінації з комплементарними поліпептидами легкого ланцюга формують пару антигензв'язувальних областей (7араїа та ін., Ргоївіп Епод. 8(10), 1995, сс. 1057-1062; і О5 Мо 5641870).
Поняття "епітоп" означає будь-яку білкову детермінанту, яка має здатність специфічно зв'язуватися з імуноглобуліном або іншим способом взаємодіяти з молекулою. Епітопні детермінанти, як правило, складаються з хімічно активних поверхневих груп молекул, таких як амінокислоти або бічні ланцюги вуглеводів або цукрів, і, як правило, мають специфічні характеристики тривимірної структури, а також специфічні характеристики заряду. Епітоп може бути "лінійним" або "конформаційним".
Поняття "лінійний епітоп" відноситься до епітопу, у випадку, коли всі крапки взаємодії між білком і взаємодіючою молекулою (такою як антитіло) розташовані лінійно уздовж первинної амінокислотної послідовності білка (безупинно). Якщо необхідний епітоп антигену визначений, то можна створювати антитіла до цього епітопу, наприклад, за допомогою методів, описаних у цьому винаході. В альтернативному варіанті в процесі пошуку, створення і характеризації антитіл можна одержувати інформацію про прийнятні епітопи. Потім на основі цієї інформації можна здійснювати конкурентний скринінг антитіл відносно зв'язування з тим самим епітопом.
Підхід, що застосовується для цієї цілі, включає здійснення дослідів з перехресної конкуренції для пошуку антитіл, які конкурентно зв'язуються з іншим антитілом, наприклад, антитіл, які конкурують за зв'язування з антигеном. Високопродуктивний процес групування ("бінінгу") антитіл на основі їх перехресної конкуренції описаний у міжнародній заявці на патент МО 2003/48731. Як повинно бути очевидно фахівцеві в цій галузі, практично все, з чим може специфічно зв'язуватися антитіло, можна розглядати як епітоп. Епітоп може містити ті залишки, з якими зв'язується антитіло.
Поняття "конформаційний епітоп" відноситься до епітопу, що складається 3 не розташованих безупинно амінокислот, які об'єднані у тривимірну конформацію. У конформаційному епітопі точки взаємодії розташовані на амінокислотних залишках білка, які відділені один від одного. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу епітоп являє собою епітоп, зазначений у прикладах у цьому описі. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу конформаційний епітоп складається з (І) амінокислотних залишків НЕКЗ 265-277 і 315 (з домену 2) і (ІІ) амінокислотних залишків НЕКЗ 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (з домену 4), які представлені в ЗЕО ІЮО МО: 1, або являє собою їх піднабір. Як повинно бути очевидно фахівцеві в цій галузі, простір, зайнятий залишком або бічним ланцюгом, який визначає форму молекули, допомагає визначати, що являє собою епітоп.
Як правило, антитіла, специфічні відносно конкретного антигену-мішені, повинні головним чином розпізнавати епітоп на антигені-мішені в складній суміші білків і/або макромолекул. 60 Області даного поліпептиду, які включають епітоп, можна ідентифікувати за допомогою кожної з методик епітопного картирування, які добре відомі в цій галузі (див., наприклад, Ерйоре
Марріпа Ргоїосоїв іп Меїпосдз іп МоїІесшіаг Віоіоду, за ред. Сіепп Е.Могті5, вид-во Нитапа Ргез5,
Тома, Мем/ дегзеу, т. 66, 1996). Наприклад, лінійні епітопи можна визначати, зокрема, здійснюючи одночасний синтез великої кількості пептидів на твердих носіях, де пептиди відповідають ділянкам молекули білка, і піддаючи пептиди взаємодії з антитілами, залишаючи пепиди прикріпленими до носіїв. Зазначені методики відомі в цій галузі і описані, наприклад, в
ОЗ Мо 4708871; у Сеузеп та ін., Ргос. Май). Асай. Зсі. О5А 8, 1984, сс. 3998-4002; Сеузеп та ін.,
Ргос. Маї!. Асад. зсі. ОБА 82, 1985, сс. 78-182; Сеузеп та ін., Мої. Іттипої. 23, 1986, сс. 709-715.
Крім того, конформаційні епітопи легко ідентифікувати шляхом визначення просторової конформації амінокислот, наприклад, таким методом, як обмін водень/дейтерій, рентгенівська хроматографія і двовимірний ядерний магнітний резонанс (див., наприклад, Ерйоре Марріпд
РгоїосоЇ5, вище). Антигенні області білків можна ідентифікувати також з використанням стандартних кривих антигенності і середньої гідрофобності залишків, для розрахунків яких можна застосовувати, наприклад, пакет програм Отіда, версія 1.0 фірми Охіога МоїіІесшіаг
Сгоимр. У цій комп'ютерній програмі використаний метод Хоппа/Вудса (Норр та ін., Ргос. Маї).
Асад. Зсі ОБА 78, 1981, сс. 3824-3828) для визначення профілів антигенності та метод Кайта-
Дуліттла (Куїе та ін., У.Мої. Віої. 157, 1982, сс. 105-132) для визначення профілів гідрофобності.
Поняття "паратоп" у контексті цього опису відноситься до загальної структури зв'язувальної області, яка визначає зв'язування з епітопом. Ця структура впливає на те, чи зв'язується або не зв'язується, і яким чином зв'язувальна область може зв'язуватися з епітопом. Паратоп може відноситися до антигенного центру антитіла, який відповідаєза зв'язування антитіла або його фрагмента з антигенною детермінантою. Паратоп відноситься також до ідіотопу антитіла і до області гіперваріабельної ділянки (СОР), яка зв'язується з епітопом. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу паратоп являє собою область антитіла, яка зв'язується з конформаційним епітопом, що містить (І) амінокислотні залишки НЕКЗ 265-277 і 315 (з домену 2) і (ІЇ) амінокислотні залишки НЕКЗ 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (з домену 4), які представлені в ЗЕО ІЮ МО: 1, або їх піднабір. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу паратоп являє собою область антитіла, яка містить послідовності СОК. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу паратоп містить послідовності, представлені в таблиці 1.
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу паратоп містить щонайменше один амінокислотний залишок, який зв'язується з наступними залишками НЕКЗ: Аз5п266, Іуз267,
ІЇец268, Тпг269, Сіп271, Сіш273, Рго274, Авп275, Рго276, Нібз277, Авп315, Авр571, Рго583,
Ніз584, АІа596, І уз597. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу паратоп містить щонайменше один амінокислотний залишок, який зв'язується з наступними залишками НЕКЗ:
Тугеб5, І уз267, І ец268, Рпе270, Спіуб82, Рго583, І уз597, МПебоб, І узбог2, 1609, Аг9дб11, Ргоб12,
Сувзб13, Нізб14, СІйб615. Як повинно бути очевидно фахівцеві в цій галузі паратоп будь-якого антитіла або його варіант можна визначати методом, викладеним у цьому описі.
Поняття "моноклональне антитіло" або "композиція моноклонального антитіла" у контексті цього опису відноситься до поліпептидів, включаючи антитіла, фрагменти антитіл, біспецифічні антитіла і т.д., які мають практично ідентичну амінокислотну послідовність або які виведені з того самого генетичного джерела. Це поняття включає також препарати молекул антитіл однакової молекулярної сполуки. Композиція моноклональних антитіл має однакову специфічність зв'язування і афінність у відношенні конкретного епітопа.
Поняття "людське антитіло" у контексті цього опису відноситься до антитіл, що несуть варіабельні області, у яких як каркасні, так ії СОК-ділянки виведені з послідовностей, що мають людське походження. Крім того, якщо антитіло містить константну область, то константна область також виведена з таких людських послідовностей, наприклад, послідовностей людської зародкової лінії або мутантних версій послідовностей людської зародкової лінії, або антитіла, що містить консенсусні каркасні послідовності, виведені на основі аналізу людських каркасних послідовностей, який описаний у Кпаррік та ін., У Мої Віо! 296, 2000, сс. 57-86. Структури і локалізацію варіабельних доменів імуноглобуліну, наприклад, СОР, можна визначати за допомогою добре відомих систем нумерації, наприклад, системи нумерації Кебота, системи нумерації Хотіа або комбінації систем Кебота та Хотіа (див., наприклад, Зедцепсез ої Ргоїеїп5 ої
Іпттітипо!одісаї! Іпіегеві, вид-во Ш.5. Оерагітепі ої Неакй апа Нитап зегмісев, за ред. Карбаї та ін., 1991; І аікапі та ін., У. Мої. Віо. 273, 1997, сс. 927-948); Кабраї та ін., Зедоепсез ої Ргоїеїп5 ої
Іттипоіодісаї! Іпіегеві, 5-те вид., МІН Рибіїсайоп Мо 91-3242 0.5. Юерапйтепі ої Неайй апа Нитап
Зегмісе5, 1991; Споіа та ін., У. Мої. Віої. 196, 1987, сс. 901-917; Споїпіа та ін., Майшге 342, 1989, со. 877-883 і АІ-І аліКапі та ін., У. Мої. Віої. 273, 1997, сс. 927-948).
Людські антитіла, запропоновані у винаході, можуть включати також амінокислотні залишки, бо які не кодуються людськими послідовностями (наприклад, у результаті мутацій,
інтродуційованих шляхом неспецифічного або сайтнаправленого мутагенезу іп мйго або соматичної мутації іп мімо, або консервативної заміни, здійсненої з метою підвищення стабільності або полегшення процесу одержання).
Поняття "людське моноклональне антитіло" відноситься до антитіл, що мають однакову специфічність зв'язування, які мають варіабельні області, у яких як каркасні, так і СОК-ділянки виведені з людських послідовностей. В одному з варіантів здійснення винаходу людські моноклональні антитіла одержують за допомогою гібридоми, яка включає В-клітину, отриману з трансгенної тварини крім людини, наприклад, трансгенної миші, у геномі якої міститься трансген людського важкого ланцюга і трансген людського легкого ланцюга, злиту з імморталізованою клітиною.
Поняття "рекомбінантне людське антитіло" у контексті цього опису відноситься до всіх людських антитіл, які одержують, експресують, створюють або виділяють за допомогою методів рекомбінації, наприклад, до антитіл, виділених з тварини (наприклад, миші), яка є трансгенною або трансхромосомною завдяки інтродукції генів людського імуноглобуліну, або які отримані з гібридом, до антитіл, виділених з клітини-хазяїна, трансформованої з метою експресії людського антитіла, наприклад, з використанням трансфектоми, до антитіл, виділених з рекомбінантної комбинатарної бібліотеки людських антитіл, і до антитіл, отриманих, експресованих, створених або виділених будь-якими іншими шляхами, які включають сплайсинг усього гена людського імуноглобуліну або його частини за допомогою лігування з іншими послідовностями ДНК. Зазначені рекомбінантні людські антитіла несуть варіабельні області, у яких каркасні і СОК-ділянки виведені з послідовностей імуноглобуліну людської зародкової лінії.
Однак у деяких варіантах здійснення винаходу зазначені рекомбінантні людські антитіла можна піддавати мутагенезу іп мійго (або, коли для одержання людських послідовностей Ід використовують трансгенних тварин, соматичному мутагенезу іп мімо), і в результаті амінокислотні послідовності Мн- і Мі-областей рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які хоча й виведені і є спорідненими послідовностям Мн і Мі людської зародкової лінії, можуть не зустрічатися в природних умовах у популяції антитіл людської зародкової лінії іп мімо.
Специфічне зв'язування між двома субстанціями означає зв'язування, що характеризується
Зо значенням константи рівноваги (Ка) (Коп/Кої), яка складає щонайменше 102М", щонайменше 5х102М", щонайменше 109М", щонайменше 5х103М", щонайменше 10"М", щонайменше 5х102М7, щонайменше 105М", щонайменше 5х105М", щонайменше 1056М", щонайменше 5х1056М7, щонайменше 10/М", щонайменше 5х10/М", щонайменше 108М", щонайменше 5х108М7, щонайменше 109М-, щонайменше 5х109М", щонайменше 10'єМ"7, щонайменше 5х10'0М7, щонайменше 10'"М", щонайменше 5х10'М", щонайменше 10'-М-, щонайменше 5х1012М7, щонайменше 10'З3М7, щонайменше 5х10!3 М", щонайменше 10'М-, щонайменше 5х1017М7, щонайменше 10!М" або щонайменше 5х10!5М7.
Поняття "специфічно (або вибірково) зв'язується" з антитілом (наприклад з НЕКЗ- зв'язувальним антитілом) відноситься до реакції зв'язування, яка дозволяє визначати присутність спорідненого антигену (наприклад, людського НЕКЗ) у гетерогенній популяції білків та інших біологічних субстанцій. Крім зазначеної вище константи рівноваги (Ка), зв'язування антитіла, запропонованого у винаході, з НЕКЗ, як правило, характеризується також значенням константи швидкості реакції дисоціації (Ко) (Коє/Коп), що становить менше ніж 5х102М, менше ніж 102М, менше ніж 5х10З3М, менше ніж 103М, менше ніж 5х107М, менше ніж 102М, менше ніж 5х105М, менше ніж 105М, менше ніж 5х10-М, менше ніж 10-М, менше ніж 5х10-7М, менше ніж 107М, менше ніж 5х108М, менше ніж 108М, менше ніж 5х109М, менше ніж 109М, менше ніж 5х1079М, менше ніж 1079М, менше ніж 5х10-"М, менше ніж 10-7М, менше ніж 5х10-2М, менше ніж 10-2М, менше ніж 5х10-3М, менше ніж 10-3М, менше ніж 5х1077М, менше ніж 1077М, менше ніж 5х1075М або менше ніж 10795М або менше, і антитіло зв'язується з НЕРЗ з афінністю, щонайменше в 2 рази більш високою, ніж афінність зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад, з людським сироватковим альбуміном (ЛСА)).
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу для антитіла або його фрагмента характерне значення константи дисоціації (Ка), що становить менше ніж 3000, менше ніж 2500, менше ніж 2000, менше ніж 1500, менше ніж 1000, менше ніж 750, менше ніж 500, менше ніж 250, менше ніж 200, менше ніж 150, менше ніж 100, менше ніж 75, менше ніж 10, менше ніж 1пМ при оцінці за допомогою методу, представленого в цьому описі, або відомого фахівцеві в цій галузі методу (наприклад, ВіІАсоге-аналізу, ЕГІЗА, ЕАС5, 5ЕТ) (фірма Віасоге Іпіегпайопаї! АВ,
Уппсала, Швеція). Поняття "Кавєсосї або "Каг у контексті цього опису відноситься до швидкості асоціації взаємодії конкретних антитіла-антигену, а поняття "Ка" або "Ко" у контексті цього опису 60 відноситься до швидкості дисоціації взаємодії конкретних антитіла-антигену. У контексті цього опису мається на увазі, що поняття "Ко" відноситься до константи дисоціації, яку одержують зі співвідношення Ка до Ка (тобто Ка/Ка) і виражають у вигляді молярної концентрації (М).
Значення Ко для антитіл можна визначати за допомогою методів, добре відомих у цій галузі.
Метод визначення значення Ко антитіла являє собою метод, заснований на резонансі поверхневого плазмона, або метод, заснований на застосуванні біосенсорної системи, такої як система Віасогеф)
У контексті цього опису поняття "афінність" відноситься до сили взаємодії між антитілом і антигеном в одному з антигензв'язувальних центрів антитіла. У кожному антигензв'язувальному центрі варіабельна область "плеча" антитіла взаємодіє за допомогою слабких нековалентних сил з антигеном у численних сайтах; чим сильніше взаємодії, тим більше афінність.
У контексті цього опису поняття "авідність" відноситься до інформативного критерію загальної стабільності або силі комплексу антитіло-антиген. Вона контролюється трьома основними факторами: афінністю зв'язування антитіла з епітопом; валентністю як антигену, так і антитіла; і структурною організацією взаємодіючих ділянок. Ці три фактори визначають в остаточному підсумку специфічність антитіла, тобто ймовірність того, що конкретне антитіло буде зв'язуватися з точним антигенним епітопом.
У контексті цього опису поняття "валентність" відноситься до кількості потенційних зв'язувальних мішень сайтів у поліпептиді. Кожний сайт, що зв'язує мішень, специфічно зв'язується з однією молекулою-мішенню або специфічним сайтом (тобто епітопом) на молекулі-мішені. Коли поліпептид містить більше одного сайту, що зв'язує мішень, то кожний сайт, що зв'язує мішень, може специфічно зв'язуватися з однією і тіє ж молекулою або різними молекулами (наприклад, може зв'язуватися з різними молекулами, наприклад, з різними антигенами або різними епітопами на одній і тій же молекулі).
У контексті цього опису поняття "антагоністичне антитіло" відноситься до антитіла, яке зв'язується з НЕКЗ і нейтралізує біологічну активність НЕКЗ, пов'язану з передачею сигналу, наприклад, зменшує, знижує і/або інгібує сигнальну активність, що індукує НЕКЗ, наприклад, за даними аналізу фосфо-НЕКЗ або фосфо-АКІ. Приклади аналізів описані більш докладно нижче в розділі "Приклади". Таким чином, мається на увазі, що поняття "інгібування" антитілом однієї або декількох зазначених функціональних властивостей НЕКЗ (наприклад, біохімічної, імунохімічної, клітинної, фізіологічної або іншого виду біологічної активності або т.п.), яке визначають на основі методологій, відомих у цій галузі і представлених у цьому описі, відноситься до статистично значимого зниження конкретної активності відносно активності, виявленої у відсутності антитіла (або, наприклад, у присутності контрольного антитіла неспорідненої специфічності). Дія антитіла, яка інгібує активність НЕКЗ, полягає в статистично значимому зниженні оцінюваного параметра щонайменше на 10 95, щонайменше на 50 95, 80 95 або 90 95, а деяких варіантах здійснення винаходу антитіло, запропоноване у винаході, може інгібувати більш ніж на 95 95, 98 95 або 99 95 функціональну активність НЕКЗ, яка оцінюється по зниженню рівня фосфорилювання клітинного НЕКЗ.
Поняття "виділене антитіло" у контексті цього опису відноситься до антитіла, яке практично вільне від інших антитіл з іншою антигенною специфічністю (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з НЕКЗ, практично вільне від антитіл, які специфічно зв'язуються з антигенами, відмінними від НЕКЗ). Однак виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з
НЕКЗ, може давати перехресну реакцію з іншими антигенами. Крім того, виділене антитіло може бути практично вільне від іншого клітинного матеріалу і/або хімічних речовин.
Поняття "консервативно модифікований варіант" відноситься як до амінокислотних, так і до нуклеотидних послідовностей. Відносно конкретних нуклеотидних послідовностей поняття "консервативно модифіковані варіанти" відноситься до таких нуклеїнових кислот, які кодують ідентичні або практично ідентичні амінокислотні послідовності, або у випадку, коли нуклеїнова кислота не кодує амінокислотну послідовність, до практично ідентичних послідовностей. Через виродженість генетичного коду будь-який конкретний білок кодується більшою кількістю функціонально ідентичних нуклеїнових кислот. Наприклад, кодони ОСА, зСС, Со і СИ усі кодують амінокислоту аланін. Таким чином, у кожному положенні, у якому аланін кодується кодоном, кодон можна заміняти на будь-які відповідні відомі кодони без зміни поліпептиду, що кодується. Такі варіанти нуклеїнової кислоти є "мовчазними варіантами", які являють собою один з видів консервативно модифікованих варіантів. У контексті цього опису мається на увазі, що кожна нуклеотидна послідовність, яка кодує поліпептид, включає також усі можливі мовчазні варіанти нуклеїнової кислоти. Фахівцеві в цій галузі повинно бути очевидно, що кожний кодон нуклеїнової кислоти (за винятком АОС, який, як правило, є єдиним кодоном метіоніну, і То, який, як правило, є єдиним кодоном триптофану) можна модифікувати з одержанням бо функціонально ідентичної молекули. Таким чином, мається на увазі що кожна описана послідовність включає всі мовчазні варіанти нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид.
Відносно поліпептидних послідовностей "консервативно модифіковані варіанти" включають індивідуальні заміни, делеції або додавання в поліпептидну послідовність, які приводять до заміни амінокислоти на хімічно подібну амінокислоту. Перелік консервативних замін, що забезпечують одержання функціонально подібних амінокислот, добре відомий у цій галузі. Такі консервативно модифіковані варіанти є додатковими і не виключають поліморфні варіанти, міжвидові гомологи та алелі, запропоновані у винаході. Кожна із зазначених нижче 8 груп містить амінокислоти, які є консервативними замінами одна одної: 1) аланін (А), гліцин (0); 2) аспарагінова кислота (0), глутамінова кислота (Е); 3) аспарагін (М), глутамін (0); 4) аргінін (К), лізин (К); 5) ізолейцин (І), лейцин (У), метіонін (М), валін (М); 6) фенілаланін (Р), тирозин (У), триптофан (МУ); 7) серин (5), треонін (Т); і 8) цистеїн (С), метіонін (М) (див., наприклад,
Стгеіднпіоп, Ргоївеіп5 (1984)). У деяких варіантах здійснення винаходу поняття "консервативні модифікації послідовностей" застосовують для позначення амінокислотних модифікацій, які не суттєво впливають або змінюють характеристики зв'язування антитіла, що містить амінокислотну послідовність.
Поняття "перехресно конкурує" або "перехресна конкуренція" у контексті цього опису використовують взаємозамінно для позначення здатності антитіла або іншого зв'язувального агента виявляти інтерферуючий вплив на зв'язування інших антитіл або зв'язувальних агентів з
НЕКЗ при оцінці за допомогою стандартного аналізу конкурентного зв'язування.
Здатність або ступінь, з якою антитіло або інший зв'язувальний агент може чинити інтерферуючий вплив на зв'язування іншого антитіла або зв'язувальної молекули з НЕК, і, отже, чи можуть вони розглядатися як перехресно конкуруючі згідно з винаходом, можна визначати за допомогою стандартних аналізів конкурентного зв'язування. В одному з прийнятних аналізів застосовують Віасоге-технологію (наприклад, з використанням приладу
ВІАсоге 3000 (фірма Віасоге, Упсала, Швеція)), за допомогою якої можна визначати ступінь взаємодій з використанням методу на основі резонансу поверхневого плазмону. Іншим аналізом, який можна застосовувати для оцінки перехресної конкуренції, є підхід на основі
ЕПЗА.
У контексті цього опису поняття "оптимізована" означає, що нуклеотидна послідовність змінена з позицій кодування амінокислотної послідовності за допомогою кодонів, кращих для продуктивної клітини або організму, як правило, еукаріотичної клітини, наприклад, клітини
Ріспіа, клітини Тгісподегта, клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО) або клітини людини.
Оптимізовану нуклеотидну послідовність створюють так, щоб вона повністю або максимально можливо зберігала здатність кодувати амінокислотну послідовність, яка кодується спочатку вихідною нуклеотидною послідовністю, яку називають також "батьківською" послідовністю.
Стандартні аналізи, що застосовуються для оцінки здатності антитіл зв'язуватися з НЕКЗ різних видів відомі в цій галузі, ії вони включають, наприклад, ЕГІЗА, вестерн-блотінг і РІА.
Прийнятні аналізи описані докладно в розділі "Приклади". Кінетичні характеристики зв'язування (наприклад, афінність зв'язування) антитіл, можна оцінювати також за допомогою стандартних аналізів, відомих у цій галузі, таких як Віасоге-аналіз, або ЕАС5-аналіз для оцінки афінності (аналіз Скетчарда). Аналізи оцінки впливу антитіл на функціональні властивості НЕКЗ (наприклад, аналізи зв'язування рецептора, модуляція шляху Нег) додатково більш докладно описані в розділі "Приклади".
Поняття "ідентичність у відсотках" або "відсоток ідентичності" у відношенні двох або більшої кількості нуклеотидних або поліпептидних послідовностей відноситься до двох або більшої кількості послідовностей або підпослідовностей, які є однаковими. Дві послідовності є "практично ідентичними", якщо дві послідовності мають певний відсоток однакових амінокислотних залишків або нуклеотидів (тобто ідентичність на рівні 60 95, необов'язково ідентичність на рівні 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 або 99 95 у певній області або, якщо вона не зазначена конкретно, у повній послідовності) при зіставленні та вирівнюванні з метою виявлення максимальної відповідності у вікні порівняння або в призначеній для цього області, що встановлюють з використанням одного з перерахованих нижче алгоритмів порівняння або шляхом порівняння вручну і візуального аналізу. Необов'язково ідентичність має місце в області довжиною приблизно 50 нуклеотидів (або 10 амінокислот) або ще краще в області довжиною щонайменше від 100 до 500 або 1000 або більше нуклеотидів (або 20, 50, 200 або більше амінокислот).
При порівнянні послідовностей, як правило, одна послідовність являє собою послідовність, з якою проводять порівняння (референс-послідовність) послідовностей, що тестуються. При використанні алгоритму порівняння послідовностей дані про послідовність, що тестується, і бо референс-послідовність вводять у комп'ютер, при необхідності задають координати підпослідовності та параметри алгоритму, що використовується в програмі порівняння послідовностей. Можна використовувати параметри програми, що задаються за замовчуванням, або можна створювати альтернативні параметри. Після цього за допомогою алгоритму порівняння послідовностей розраховують з використанням заданих параметрів програми відсоток ідентичності для послідовностей, що тестуються, і референос-послідовності.
У контексті цього опису поняття "вікно порівняння" відноситься до фрагменту, що містить будь-яку кількість положень, що безперервно слідують одне за одним, обраних з групи, що містить від 20 до 600, краще від приблизно 50 до приблизно 200, ще краще від приблизно 100 до приблизно 150 положень, у яких можна порівнювати послідовність з референс- послідовністю, що має таку ж кількість безперервних положень, після оптимального вирівнювання двох послідовностей. Методи порівняльного аналізу первинної структури послідовностей, придатні для порівняння, добре відомі в цій галузі. Оптимальний порівняльний аналіз послідовностей можна здійснювати, наприклад, з використанням алгоритму на основі методу локальної гомології, розробленого тій і Умаїептап, Аду. Аррі. Май. 2, 1970, с. 482, алгоритму порівняльного аналізу гомології, розробленого Меедієтап ії УУцп5сп., У. Мої. Віо!. 48, 1970, с. 443, методу пошуку подібності, розробленого Реаг:хоп і Гіртап, Ргос. Маг. Асай. 5бі.
ЗА 85, 1988, с. 2444, з використанням комп'ютерних реалізацій цих алгоритмів (ЗАР, ВЕЗТРІТ,
ЕАБЗТА і ТЕАБТА програм, що входять у пакет, фірми Умізсопвзіп Сепеїіс5, фірма Сепеїйіс5
Сотршег сгоцмр, 575 Зсіепсе Огіме, Медісон, Вісконсин, США) або шляхом порівняння вручну та візуального аналізу (див., наприклад, Вгепі та ін., Ситепі Ргоїосої!5 іп МоіІєсшцаг Віоіоду, 2003).
Двома прикладами алгоритмів, які можна застосовувати для визначення відсотка ідентичності послідовностей і подібності послідовностей, можуть служити алгоритми ВІ АВТ і
ВІ АЗ5Т 2.0, описані в Ак5сапйиі та ін., Мис. Асій Ке5. 25, 1977, сс. 3389-3402 і в Ай5спці та ін., У.
Мої. Вісі. 215, 1990, сс. 403-410, відповідно. Програмне забезпечення для здійснення аналізів за допомогою ВІАЗТ може бути надане Національним центром біотехнологічної інформації (Майопа! Сепієг Тог Віоїєснппоіоду Іптоптайоп). Згідно з цим алгоритмом спочатку здійснюють виявлення пар послідовностей з високими балами (НОР) шляхом ідентифікації коротких "слів" довжини УМ у розглянутій послідовності, які або збігаються, або задовольняють певній позитивній граничній оцінці (балу) Т при порівнянні зі "словом" такої ж довжини в послідовності з
Зо бази даних. Т називається граничною оцінкою (балом) близького "слова" (Ай5спці та ін., вище).
Ці вихідні вибірки близького "слова" використовуються як "запал" для ініціації пошуку, призначеного для знаходження більш довгих НОР, що включають їх. Потім вибірки "слова" подовжуються в обох напрямках уздовж кожної послідовності доти, поки відбувається збільшення кумулятивного (накопичувального) бала при порівняльному аналізі. Кумулятивні бали для нуклеотидних послідовностей обчислюють з використанням параметрів М (призовий бал за пару залишків, що збігаються; завжди 20) і М (штрафний бал за залишки, що не збігаються; завжди «0). Для амінокислотних послідовностей для обчислення кумулятивного бала використовують матрицю балів. Подовження вибірки "слова" у кожному напрямку припиняється в тому випадку, якщо кумулятивний бал при порівняльному аналізі знижується на величину Х від свого максимального досягнутого значення; якщо кумулятивний бал знижується до нуля або нижче через нагромадження одного або декількох негативних балів при порівняльному аналізі залишків; або якщо досягається кінець якої-небудь послідовності.
Параметри МУ, Т і Х алгоритму ВГА5Т визначають чутливість і швидкість порівняльного аналізу.
У програмі ВГАЗТМ (для нуклеотидних послідовностей) як параметри, що задаються за замовчуванням, використовуються довжина "слова" (ММ), рівна 11, очікування (Е), рівне 10, М-5-,
М-4, при цьому проводиться порівняння обох ланцюгів. Для амінокислотних послідовностей у програмі ВГСАЗТР використовуються як параметри, що задаються за замовчуванням, довжина "слова" (М/), рівна 3, очікування (Е), рівне 10, і використовується матриця балів В О5ИМб2 (див.
Непікоїй і Непікоїй, Ргос. Май. Асай. сі. ОБА 89, 1989, с. 10915) параметр вирівнювання (В), рівний 50, очікування (Е), рівне 10, М-5, М- -4, при цьому проводиться порівняння обох ланцюгів.
За допомогою алгоритму ВГАБТ проводять також статистичний аналіз подібності двох послідовностей (див., наприклад, Кагіїп і Ай5спиці, Ргос. Майї). Асад. сі. ОБА 90, 1993, сс. 587 3- 5787). Одним з критеріїв ступеня подібності, який дозволяє одержувати алгоритм ВІ А5Т, є найменша сумарна ймовірність (Р(М)), яка дає оцінку ймовірності, з якою може відбутися у випадковий спосіб збіг між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями.
Наприклад, вважається, що нуклеотидна послідовність, яка тестується, є подібною з референс- послідовністю, якщо найменша сумарна ймовірність при порівнянні нуклеотидної послідовності, що тестується, з нуклеотидною референс-послідовністю менше приблизно 0,2, ще краще 60 менше приблизно 0,01 і найкраще менше приблизно 0,001.
Відсоток ідентичності двох амінокислотних послідовностей можна визначати також за допомогою алгоритму, розробленого Е. Меуегз і МУ. МіПег (Сотриї. Аррі. Віовсі., 4, 1988, сс. 11- 17), який включений у програму АГІСМ (версія 2.0), з використанням таблиці зважених залишків
РАМ120, штрафу за довжину пролому 12 і штрафу за пролом 4. Крім того, відсоток ідентичності двох амінокислотних послідовностей можна визначати за допомогою алгоритму Мееадіетап і
Умип5сй (9. Мої, Вісі. 48, 1970, сс. 444-453), який включений у програму САР, що входить у пакет програм СО (яка доступна на сайті пер:/Лумли.дсд.сот), з використанням матриці Віоз5от 62 або матриці РАМ250 і ваги пролому 16, 14, 12, 10, 8, 6 або 4 і ваги довжини 1, 2, 3, 4, 5 або 6.
Крім визначення зазначеного вище відсотка ідентичності послідовностей, іншим показником того, що дві нуклеотидні послідовності або два поліпептиди є практично ідентичними, є той факт, що поліпептид, який кодується першою нуклеїновою кислотою, має імунологічну перехресну реактивність з антитілами, що утворилися проти другого поліпептиду, який кодається другою нуклеїновою кислотою, як буде описано нижче. Так, поліпептид, як правило, є практично ідентичним другому поліпептиду, наприклад, якщо два пептиди відрізняються тільки консервативними замінами. Іншим показником того, що дві нуклеотидні послідовності є практично ідентичними, є той факт, що дві молекули або їх комплементи гібридизуються один з одним у строгих умовах, що буде описано нижче. | ще одним показником того, що дві нуклеотидні послідовності є практично ідентичними, є той факт, що для ампліфікації послідовностей можна використовувати ті самі праймери.
Поняття "нуклеїнова кислота" у контексті цього опису використовують взаємозамінно з поняттям "полінуклеотид", і воно відноситься до дезоксирибонуклеотидів або рибонуклеотидів і їх полімерів або в їх одноланцюговій, або у дволанцюговій формі. Під це поняття підпадають нуклеїнові кислоти, які містять відомі нуклеотидні аналоги або модифіковані каркасні залишки або зв'язки, які є синтетичними, що зустрічаються в природних умовах і не зустрічаються в природних умовах, які мають таку ж здатність до зв'язування, що й нуклеїнова кислота, з якої проводиться порівняння (нуклеїнова референсо-кислота), і метаболізуються аналогічно референс-нуклеотидам. Прикладами таких аналогів є (але не обмежуючись тільки ними) фосфоротіоати, фосфороамідати, метилфосфонати, хіральні метилфосфонати, 2-0- метилрибонуклеотиди, пептидні нуклеїнові кислоти (ПНК).
Зо Якщо не зазначено інше, то мається на увазі, що конкретна нуклеотидна послідовність включає також її консервативно модифіковані варіанти (наприклад, заміни кодонів у рамках виродженості генетичного коду) і комплементарні послідовності, а також спеціально зазначену послідовність. Так, як це буде описано нижче, заміни вирожденних кодонів можна здійснювати, створюючи послідовності, у яких третє положення одного або декількох (або всіх) кодонів замінене змішаною основою і/або дезоксиінозиновими залишками (Ваїлег та ін., Мисієїс Асій
Кев. 19, 1991, с. 5081; ОпізикКа та ін., 9. ВіоЇ. Спет. 260, 1985, сс. 2605-2608; і Сав55о0ї та ін., 1992;
Коззоїїпі та ін., Мої. СеїІ. Ргобрез 8, 1994, сс. 91-98).
Поняття "функціональне зв'язаний" відноситься до функціонального взаємозв'язку між двома або більшою кількістю сегментів полінуклеотиду (наприклад, ДНК). Як правило, воно відноситься до функціонального взаємозв'язку транскрипціональної регуляторної послідовності з послідовністю, що транскрибується. Наприклад, промоторна або енхансерна послідовність функціонально пов'язана з кодуючою послідовністю, якщо вона стимулює або модулює транскрипцію кодуючої послідовності у відповідній клітині-хазяїні або іншій системі експресії. Як правило, промоторні транскрипціональні регуляторні послідовності, які функціонально пов'язані з послідовністю, що транскрибується, є фізично суміжними з послідовністю, що транскрибується, тобто вони мають цис-активність. Однак для деяких транскрипціональних регуляторних послідовностей, таких як енхансери, не є обов'язковим, щоб вони були фізично суміжними з кодуючими послідовностями, транскрипцію яких вони підсилюють, або були локалізовані в безпосередній близькості від них.
Поняття "поліпептид" і "білок" у контексті цього опису використовують взаємозамінно для позначення полімеру, що складається з амінокислотних залишків. Поняття застосовне до амінокислотних полімерів, у яких один або кілька амінокислотних залишків являють собою штучний отриманий хімічним шляхом міметик відповідної амінокислоти, який зустрічається в природних умовах, а також до амінокислотних полімерів, що зустрічаються в природних умовах, та амінокислотних полімерів, що не зустрічаються в природних умовах. Якщо спеціально не зазначено інше, то мається на увазі, що конкретна поліпептидна послідовність включає її консервативно модифіковані варіанти.
Поняття "Індивідуум" відноситься до людині і тваринам крім людини. До тварин крім людини відносяться всі хребетні тварини, наприклад, ссавці і тварини, що не відносяться до ссавців, у бо тому числі примати крім людини, вівці, собаки, корови, кури, амфібії та рептилії. Якщо спеціально не зазначено інше, у контексті цього опису поняття "пацієнт" та "індивідуум" застосовують взаємозамінно.
Поняття "протираковий засіб" означає будь-який засіб, який можна застосовувати для лікування пов'язаного з клітинною проліферацією порушення, такого як рак, у тому числі цитотоксичні засоби, хіміотерапевтичні засоби, променеву терапію і засоби для променевої терапії, протиракові засоби спрямованої дії та імунотерапевтичні засоби.
Поняття "пухлина" відноситься до росту і проліферації неопластичних клітин, злоякісного або доброякісного, і до всіх передракових і ракових клітин і тканин.
Поняття "протипухлинна активність" означає зниження ступеня проліферації, життєздатності або метастатичної активності пухлинних клітин. Можливим шляхом демонстрації протипухлинної активності є зменшення швидкості росту аномальних клітин, яке підсилюється в процесі терапії, або стабільність або зниження розміру пухлини. Зазначену активність можна оцінювати за допомогою прийнятних для аналізу іп міго або іп мімо моделей пухлин, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) моделі на основі ксенотрансплантатів, моделі на основі алотрансплантатів, моделей на основі ММТУ (вірус пухлини молочних залоз мишей) та інших моделей, які застосовують у цій галузі для вивчення протипухлинної активності.
Поняття "злоякісне захворювання" відноситься до недоброякісної пухлини або раку. У контексті цього опису поняття "рак" включає злоякісне захворювання, що відрізняється нерегульованим або неконтрольованим ростом клітин. Прикладами раку є: карциноми, саркоми, лейкози і лімфоми. Поняття "рак" відноситься до первинних злоякісних пухлин (наприклад, до тих клітин, яких не мігрували в області організму пацієнта, відмінні від області локалізації вихідної пухлини) і вторинним злоякісним пухлинам (наприклад, таким, що виникають у результаті метастазів, міграції пухлинних клітин у вторинні області, які відрізняються від області локалізації вихідної пухлини).
Різні об'єкти винаходу описані більш докладно в наведених нижче розділах і підрозділах.
Структура і механізм активації НЕК-рецепторів
Усі чотири НЕК-рецептора мають позаклітинний ліганзв'язувальний домен, один трансмембранний домен і цитоплазматичний, що містить тирозинкіназу домен.
Внутрішньоклітинний тирозинкіназний домен НЕК-рецепторів є висококонсервативним, хоча в
Зо кіназному домені НЕКЗ присутні заміни амінокислот, що мають критичне значення, і тому відсутня кіназна активність (Зцу та ін., РМАБ 91, 1994, сб. 8132-8136). Димеризація НЕК- рецепторів, що індукується лігандом, приводить до активації кінази, фосфорилювання рецептора на залишках тирозину в С-кінцевій області, з наступним рекрутментом і активацією ефекторів внутрішньоклітинної передачі сигналів (Магдеп і Бім/кому5Кі, Маїиге Кем 2, 2001, сс. 127-137; Уогіззеп та ін., Ехр СеїЇ Кез 284, 2003, сс. 31-53).
Вивчення кристалічних структур позаклітинних доменів НЕК-рецепторів дозволяє в деякій мірі пролити світло на процеси активації рецептора, що індукується лігандом (ЗспіІеззіпдег, СеїЇ 110, 2002, сс. 669-672). Позаклітинний домен кожного НЕК-рецептора складається з чотирьох субдоменів: субдомен І ї І спільно беруть участь в утворенні лігандзв'язувального сайту, а субдомен І (і можливо також субдомен ІМ) бере участь у димеризації рецептора через безпосередні взаємодії типу рецептор-рецептор. У структурах пов'язаного з лігандом НЕК р- шпилька (позначення петлі димеризації) у субдомені І взаємодіє з петлею димеризації рецептора-партнера, опосередковуючи димеризацію рецептора (Саїтей та ін., Сеї!І 110, 2002, сс. 763-773; Одізо та ін., СеїІ 110, 2002, сс. 775-787). На противагу цьому в структурах неактивних
НЕК!Т, НЕКЗ ї НЕК4 петля димеризації бере участь у внутрішнмолекулярних взаємодіях з субдоменом ІМ, що перешкоджає димеризації рецептора у відсутності ліганда (Спо і І еайу, зЗсіепсе 297, 2002, сс. 1330-1333; Регдихоп та ін., Мої СеїІ 12, 2003, сс. 541-552; Вопцуап та ін.,
РМАБб 102, 2005, сс.15024-15029). Структура НЕК2 є унікальною серед НЕК-рецепторів. У відсутності ліганда НЕК2 має конформацію, що нагадує активований лігандом стан НЕК! з виступаючою петлею димеризації, яка доступна для взаємодії з іншими НЕК-рецепторами (Спо та ін., Майиге 421, 2003, сс. 756-760; Сатей та ін., Мої Сеї! 11, 2003, сс. 495-505). Це може бути поясненням підвищеної здатності НЕКЗ2 до гетеродимеризації.
Хоча кристалічні структури НЕК-рецептора являють собою модель огомо- (|і гетеродимеризації НЕК-рецептора, залишаються не повністю вивченими причина превалювання гомо- і гетеродимерів деяких НЕК у порівнянні з іншими (Егапкіїп та ін., Сапсег
Се 5, 2004, сс. 317-328), а також конформаційна роль кожного домену у димеризації та самоінгібуванні рецептора (Вигдев5 та ін., Мої! СеїЇ 12, 2003, сс. 541-552; Майнооп та ін., РМА5 101, 2004, сс. 923-928). Як буде описано нижче, вивчення кристалічної структури НЕКЗ у рентгенівських променях дозволяє одержувати більш точні дані. бо Структура НЕКЗ і конформаційні епітопи
У цьому винаході описаний конформаційний епітоп, з яким зв'язуються антигензв'язувальні білки, наприклад, антитіла до НЕКЗ. Уперше визначена тривимірна структура вкороченої форми (залишки 20-640) позаклітинного домену НЕКЗ у комплексі з антитілом. Структури комплексів
НЕВЗ-Рар МОРБ09823 і НЕБ3-МОБ09825 виявлено з роздільною здатністю 3,2А і 3,4 А відповідно, і вони показані на фіг. БА. У цьому описі вперше описані також антитіло або його фрагмент, яке/який зв'язується з НЕКЗ у неактивному стані і стабілізує рецептор у неактивному стані. Антитіла, запропоновані у винаході, також забезпечують конкурентне зв'язування ліганда
НЕКЗ, такого як нейрегулін, з НЕКЗ-рецептором.
Не вдаючись у яку-небудь теорію, можна припустити, що однією з можливих моделей механізму дії є те, що НЕКЗ перебуває в неактивному (закритому, "скованому") або активному (відкритому) стані. Зв'язування з лігандом індуціює конформаційну зміну, у результаті чого
НЕКЗ перебуває в активному (відкритому) стані, у якому він має здатність зв'язуватися з партнерами, що беруть участь в утворенні гетеродимерів, що приводить до активації передачі сигналів у прямому напрямку. Антитіла, такі як МОКО9823, зв'язуються з НЕКЗ у його неактивному ("скованому") стані, але не блокують сайт зв'язування ліганда. Антитіла, такі як
МОКОЗ9823, інгібують НЕКЗ, перешкоджаючи індукованим лігандом структурним перегрупуванням, які необхідні для переходу НЕКЗ в активну конформацію, перешкоджаючи тим самим трансдукції сигналу. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, або їх фрагменти зв'язуються з НЕКЗ у неактивному ("скованому") стані, але не блокують сайт зв'язування ліганда. Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу антитіла або їх фрагменти інгібують НЕКЗ шляхом попередження індукованих лігандом структурних перегрупувань, необхідних для переходу НЕКЗ в активну конформацію, перешкоджаючи тим самим трансдукції сигналу. Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу антитіло або його фрагмент стабілізує НЕКЗ-рецептор у неактивному стані або конформації (тобто безпосередньо підтримує, закриває, "сковує", утримує, краще зв'язує або "має схильність до нього"). Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу неактивний НЕКЗ-рецептор може мати чутливість до кращої інтерналізації або розщеплення, що приводить до зниження кількості розташованих на клітинній поверхні НЕКЗ-рецепторів. Ці варіанти здійснення винаходу підтверджені біологічними даними, наведеними в розділі "Приклади".
Кристали НЕКЗ можна одержувати шляхом здійснення експресії нуклеотидної послідовності, що кодує НЕКЗ або його варіант, у прийнятній клітині-хазяїні і подальшій кристалізації очищеного(их) білка(ів) у присутності відповідного Бар, мішенню якого є НЕКЗ. Краще поліпептид НЕКЗ містить позаклітинний домен (амінокислоти 20-640 людського полипепида або його вкорочену версію, яка краще містить амінокислоти 20-640), але в нього відсутні трансмембранний і внутрішньоклітинні домени.
Поліпептиди НЕКЗ можна одержувати також у вигляді злитих білків, наприклад, для екстракції та очищення. Приклади білків, які є партнерами по злиттю, включають глутатіон-5- трансферазу (О5Т), гістидин (НІ5), гексагістидин (6НІ5), СА 4 (ДНК-зв'язувальні і/або домени, що активують транскрипцію) і бета-галактозидазу. Може виявитися доцільним також включати сайт протеолітичного розщеплення між білком-партнером по злиттю і білковою послідовністю, яка представляє інтерес, що дозволяє видаляти відповідні послідовності зі злитого білка.
Після експресії білюи можна очищати і/або концентрувати, наприклад, за допомогою афінної хроматографії з іммобілізованим металом, іонообмінної хроматографії і/або гель-фільтрації.
Білок(и) можна кристалізувати за допомогою методів, представлених у цьому описі. Як правило, у процесі кристалізації краплю, що містить розчин білка, змішують з буфером для кристалізації і дають зрівноважитися в запечатаному контейнері. Для досягнення рівноваги можна застосовувати відомі методи, такі як метод "висячої краплі" або "сидячої краплі". У цих методах краплю підвішують над або "саджають" поруч з резервуаром, що містить набагато більший об'єм буфера для кристалізації і досягають рівноважного стану в результаті дифузії парів. В альтернативному варіанті для досягнення рівноважного стану можна застосовувати інші методи, наприклад, з використанням олії, здійснюючи дифузію через напівпроникну мембрану або через вільну поверхню розділу (див., наприклад, Спауеп та ін., Маїшге Меїпод3з 5, 2008, сс. 147-153).
Після одержання кристалів можна визначати їхню структуру за допомогою відомих методів дифракції рентгенівських променів. У численних методиках можна застосовувати хімічно модифіковані кристали, наприклад, модифіковані шляхом дериватизації важким атомом до одержання близьких фаз. На практиці кристал замочують у розчині, що містить солі атомів важких металів або металорганічні сполуки, наприклад, хлорид свинцю, тіомалат золота, тімеросал або уранілацетат, які можуть дифундувати через кристал і зв'язуватися з поверхнею бо білка. Потім локалізацію(ї) зв'язаного(их) атома(ів)у важкого металу можна визначати за допомогою аналізу дифракції рентгенівських променів на замоченому кристалі. На основі отриманих картин дифракції монохроматичного пучка рентгенівських променів (центри розсіювання) на кристалі можна за допомогою математичних рівнянь одержувати математичні координати. Дані про дифракцію застосовують для розрахунків карти електронної щільності повторюваної одиниці в структурі кристала. Інший метод одержання інформації про фази заснований на застосуванні техніки, відомої як молекулярна заміна. У цьому методі застосовують алгоритми повороту і переносу для пошуку моделі, виведеної зі спорідненої структури, що дозволяє одержати приблизну орієнтацію білка, що представляє інтерес (див.,
Коз5тапп, Асіа СтгузіаїЇ5 А 46, 1990, сс. 73-82). Карти електронної щільності використовують для визначення положень індивідуальних атомів в елементарній комірці кристала (Вішпаеї та ін.,
Ргоївіп Сту«чаІодгарпу, вид-во Асадетіс Ргез5, 1976).
У цьому описі вперше представлена тривимірна структура НЕКЗ і Рар-фрагмента антитіла до НЕКЗ. Приблизними границями доменів позаклітинного домену НЕКЗ є наступні: домен 1: амінокислоти 20-207; домен 2: амінокислоти 208-328; домен 3: амінокислоти 329-498 і домен 4: амінокислоти 499-642. Тривимірна структура НЕКЗ ї антитіла дозволяє ідентифікувати також сайти зв'язування-мішені для потенційних модуляторів НЕКЗ. Кращими сайтами зв'язування- мішенями є сайти, що беруть участь в активації НЕКЗ. Відповідно до одного з варіантів здійснення сайт зв'язування-мішень локалізований у домені 2 і домені 4 НЕКЗ. Таким чином, антитіло або його фрагмент, яке/який зв'язується або з доменом 2, або з доменом 4 і краще з обома доменами, може модулювати активацію НЕКЗ, або перешкоджаючи дисоціації доменів один від одного, або модифікуючи відносні положення доменів. Таким чином, зв'язування антитіла або його фрагмента з амінокислотними залишками в домені 2 або домені 4 може приводити до того, що білок приймає конформацію, яка перешкоджає активації. У цьому описі вперше також представлене антитіло або його фрагмент, яке/який може одночасно зв'язуватися з лігандом НЕКЗ, таким як нейрегулін.
У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло або його фрагмент розпізнає специфічний конформаційний стан НЕКЗ, у результаті антитіло або його фрагмент перешкоджає взаємодії
НЕКЗ з корецептором (включаючи (але не обмежуючись тільки ними) НЕК, НЕКЗ2 і НЕК4). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло або його фрагмент перешкоджає взаємодії
Зо НЕКЗ з корецептором шляхом стабілізації НЕКЗ-рецептора в неактивному або закритому стані.
В одному з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент стабілізує НЕКЗ- рецептор шляхом зв'язування з амінокислотними залишками в домені 2 і домені 4 НЕКЗ. У зазначеному неактивному стані петля димеризації, локалізована в домені 2, не виставляється (експонується) і відповідно є недоступною для димеризації з іншими корецепторами (включаючи (але не обмежуючись тільки ними) НЕК!, НЕК2 і НЕК4). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується з людським білком НЕКЗ, який несе конформаційний епітоп, що містить (І) амінокислотні залишки НЕКЗ 265-277 і 315 (з домену 2) і (ІЇ) амінокислотні залишки НЕКЗ 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (з домену 4), які представлені в ЗЕО ІЮ МО: 1, або їх піднабір. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується з амінокислотами, які входять у фрагмент, що включає амінокислотні залишки 265-277 і 315 (з домену 2), або амінокислотними залишками, що перекриваються, і (ІЇ) амінокислотними залишками НЕКЗ 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609- 615 (з домену 4), які представлені в 5ЕО ІЮО МО: 1. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується з амінокислотами, які входять у фрагмент, що включає (/або амінокислотними послідовностями, які складаються 3) амінокислоти 265-277 і 315 (з домену 2), їі (ІІ) амінокислотними залишками НЕКЗ 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (з домену 4), які представлені в ЗЕО ІЮ МО: 1, або їх піднабором. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується з конформаційним епітопом таким чином, що обмежує рухливість домену 2 і домену 4, стабілізуючи їх у неактивній або закритій конформації.
Неможливість формування активної конформації приводить до неможливості активувати трансдукцію сигналу. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується з конформаційним епітопом таким чином, що закриває петлю димеризації в домені 2, тим самим роблячи її недоступною для взаємодії типу рецептор-рецептор. Неможливість формування гомо- або гетеродимерів приводить до неможливості активувати трансдукцію сигналу.
В одному з об'єктів винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується з конформаційним епітопом НЕК-рецептора, такого як НЕКЗ-рецептор. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент стабілізує НЕКЗ-рецептор у неактивному стані. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується з НЕКЗ-рецептором в бо активному стані і перетворює його в неактивний стан. Таким чином, антитіло або його фрагмент може зв'язуватися з НЕКЗ в активному або неактивному стані і перетворює активний стан НЕКЗ у неактивний стан, що приводить до неможливості активувати шлях трансдукції сигналу.
В іншому об'єкті винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується з конформаційним епітопом НЕК-рецептора, такого як НЕКЗ-рецептор, при цьому зв'язування антитіла або його фрагмента стабілізує НЕКЗ-рецептор у неактивному стані, у результаті чого НЕКЗ-рецептор не може димеризуватися з корецептором з утворенням комплексу рецептор-рецептор.
Неможливість утворювати комплекс рецептор-рецептор перешкоджає активації як залежної від ліганда, так і незалежної від ліганда трансдукції сигналу.
В іншому об'єкті винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується з конформаційним епітопом НЕК-рецептора, такого як НЕКЗ-рецептор, при цьому зв'язування антитіла або його фрагмента з НЕКЗ-рецептором дозволяє відбуватися димеризації з корецептором з утворенням неактивного комплексу рецептор-рецептор. Формування неактивного комплексу рецептор- рецептор перешкоджає активації незалежної від ліганда трансдукції сигналу. НЕКЗ може перебувати в неактивному стані, однак надекспресія НЕК2 дозволяє утворюватися комплексу
НЕН2-НЕКЗ, при цьому ці комплекси, що утворилися, є неактивними і попереджають активацію незалежної від ліганда трансдукції сигналу.
Зазначена структура також дозволяє ідентифікувати специфічні корові амінокислотні залишки НЕКЗ в області контакту, у якій відбувається взаємодія антитіла або його фрагмента (наприклад, МОРБО9823) і НЕР3. Встановлено, що ці залишки перебувають у межах 5А від МН- ланцюга більа МОКО9823. Коровими залишками є наступні залишки: Азп266, І уз267, І ец268,
Тиг269, Сіп271, Сін273, Рго274, Азп275, Рго276, Нів277, Авп315, А5р571, Рго583, Ніз584, Аіа596,
І уз597.
Зазначені структури можна використовувати також для ідентифікації пограничних амінокислотних залишків НЕКЗ області контакту, у якій відбувається взаємодія з антитілом або його фрагментом (наприклад, МОКО9823). Ці залишки можуть являти собою залишки НЕКЗ, розташовані на відстані 5-8ВА від МН-ланцюга білюьа МОБО09823. Прикордонними є наступні залишки: Рго262, МаІ264, Туг265, Рпе270, І еи272, Тпг278, І уз314, СІуЗ316, СІи321, Азп566,
Зегоб8, Сіу569, бЗего70, Тиг572, Ага580, Авр581, СІу582, Сіуб95, Сіубо8, Пебоб.
Зазначена структура дозволяє також ідентифікувати специфічні корові амінокислотні
Зо залишки НЕКЗ області контакту, у якій відбувається взаємодія антитіла або його фрагмента (наприклад, МОРБО9823) з НЕВЗ3. Встановлено, що ці залишки перебувають у межах 5А від Мі - ланцюга білла МОКО9823. Коровими залишками є наступні залишки: Туг265, Гуз267, І ец268,
Рпе270, Сіу582, Рго583, І уз597, Пебоб, І узб02, СПиб609, Аг9611, Ргоб12, Сузб13, Нізб14, СИПиб615.
Зазначені структури можна застосовувати також для ідентифікації пограничних амінокислотних залишків НЕКЗ області контакту, у якій відбувається взаємодія з антитілом або його фрагментом (наприклад, МОКО9823). Ці залишки можуть являти собою залишки НЕКЗ, розташовані на відстані 5-8ВА від Мі-ланцюга білсьа МОРО9823. Пограничними є наступні залишки: А5п266, Тпг269, А5р571, Агд580, Авзр581, Ніб584, Рго590, АІа596, Рго599, ТугбО1,
Тугб03, АзрбОоБ5, С1пбО7, Сузб10, Азпб16, Сувзб17, Сузб21, Спуб2г3, Ргобг4.
Як можна бачити з таблиць 11 і 12 (МОКО9823) і таблиць 13 ї 14 (МОКО9825) відповідно, важкий ланцюг бере участь головним чином у зв'язуванні антигензв'язувального білка з амінокислотними залишками в домені 2 епітопа і меншою мірою бере участь у взаємодіях з амінокислотними залишками в домені 4, у той час як легкий ланцюг головним чином бере участь у зв'язуванні з амінокислотними залишками в домені 4 епітопа та меншою мірою бере участь у взаємодіях з амінокислотними залишками в домені 2.
Фахівець у цій галузі на основі цього опису може передбачити, які залишки і області антигензв'язувальних білків можна варіювати без надмірного впливу на здатність антигензв'язувального білка зв'язуватися з НЕКЗ.
Як корові амінокислоти області контакту, у якій відбувається взаємодія, розглядаються всі амінокислотні залишки, щонайменше один атом яких перебуває на відстані, меншій або рівній 5А, від білка-партнера (по зв'язуванню) НЕРЗ3. 5А обрано як гранична відстань в коровій області, що дозволяє атомам перебувати в радіусі дії сил Ван-Дер-Ваальса, а також можливого опосередковуваного водою водневого зв'язку. Як пограничні амінокислоти області контакту, у якій відбувається взаємодія, розглядаються всі амінокислотні залишки, щонайменше один атом яких перебуває на відстані, меншій або рівній 8А, від білка-партнера (по зв'язуванню) НЕВЗ, але які не входять в групу корових залишків, що беруть участь у взаємодії.
У деяких варіантах здійснення винаходу будь-який антигензв'язувальний білок, який зв'язується, перекриває або перешкоджає взаємодії МОКО9823 з кожним з вищевказаних залишків, можна застосовувати для зв'язування або нейтралізації НЕКЗ. Згідно з деякими бо варіантами здійснення винаходу антитіла або їх фрагменти зв'язуються або взаємодіють щонайменше з одним з наступних залишків НЕКЗ (5ЕО ІЮ МО: 1): Азп266, І уз267, І ец268,
Тиг269, Сіп271, Сін273, Рго274, Азп275, Рго276, Ніз277, Азп315, Авр571, Рго583, Ніз584, АІа596,
Гуз597. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу антитіла або їх фрагменти зв'язуються або взаємодіють щонайменше з одним з наступних залишків НЕКЗ (ЗЕО ІЮО МО: 1):
Тугеб5, І уз267, І ец268, Рпе270, Спіу5в82, Рго583, І уз597, Пебоб, І узб602, СІиб609, Агоаб11, Ргоб12,
Сузб13, Нібб14, СІшб15. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу антитіла або їх фрагменти зв'язуються або взаємодіють щонайменше з одним з наступних залишків НЕКЗ (ЗЕО
ІО МО: 1): Авп2бб, І уз267, І ец268, Тпг269, Сіп271, Сіц273, Рго274, Авзп275, Рго276, Нів277,
А5п315, Авзрбо71, Рго583, Ніз584, АІаб96б, І уз597, Туг2б5, І уз267, І ец268, Ріпе270, Спіубв82,
Рго583, І уз597, Пебоб, І ух602, СІиб609, Агдб11, Ргоб12, Сузб613, Нібзб614, сІш615. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу антитіла або їх фрагменти зв'язуються або взаємодіють щонайменше з комбінацією наступних залишків НЕКЗ (ЗЕО ІО МО: 1): А5п266, І уз267, І ец268,
Тиг269, Сіп271, Сін273, Рго274, Азп275, Рго276, Нів277, Авп315, А5р571, Рго583, Ніз584, АІа596,
Ї уз597, Туг2б65, І уз267, І еш268, Рпе270, Сіу582, Рго583, І уз597, Пебоб, І уз602, СИиб609, Агоб11,
Ргоб12, Сузб13, Ніб614, СІ0615. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу антитіла або їх фрагменти зв'язуються або взаємодіють із усіма наступними залишками НЕКЗ (ЗЕО ІЮО МО: 1): А5п266, І ув267, І ец268, Тиг269, Сіп271, сіц273, Рго274, Авп275, Рго276, Ніз277, Авп315,
Авр571, Рго583, Ніз584, Аіа596, І уг597, Туг265, І уз267, І ен268, Рпе270, Спу5в82, Рго583, І уз597,
Пебоб, І уз602, СІшбОЗ, Аг9611, Ргоб12, Сузб613, Нізб14, сІиб15. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу антитіла або їх фрагменти перебувають на відстані в межах 5 ангстремів від одного або декількох вищевказаних залишків. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу антитіла або їх фрагменти перебувають на відстані в межах 5-8 ангстремів від одного або декількох вищевказаних залишків. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу антитіло або його фрагмент взаємодіє, блокує або перебуває на відстані в межах 8 ангстремів від 1,2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або 50 вищевказаних залишків.
Наявність відомостей про ЗО-структури НЕКЗ і комплекс НЕКЗ:МОКО9823, наприклад, є основою для більш детального вивчення інших антитіл до НЕКЗ. На основі ЗО-структури НЕКЗ можна картирувати епітопи для моноклональних антитіл і робити висновок про їхній механізм дії, оскільки деякі з них інгібують, деякі з них стимулюють, а інші не чинять впливу на клітинний ріст. Конформаційний епітоп для МОКО9823 локалізований у доменах 2 і 4 НЕКЗ. Наявність відомостей про З3О-структури цього рецептора повинна полегшувати визначення точного механізму дії зазначених агентів, що мають інгібуючу дію, і створювати нові підходи для впливу на функцію НЕКЗ-рецептора. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, зв'язуються з тим же конформаційним епітопом, що й МОКО9823.
Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу найбільш прийнятним є конформаційний епітоп, з яким зв'язуються будь-які антитіла, перераховані в таблиці 1. Згідно з конкретними варіантами здійснення винаходу конформаційний епітоп НЕКЗ можна застосовувати для виділення антитіл або їх фрагментів, які зв'язуються з НЕКЗ. Згідно з конкретними варіантами здійснення винаходу конформаційний епітоп НЕКЗ можна застосовувати для створення антитіл або їх фрагментів, які зв'язуються з НЕКЗ. Згідно з конкретними варіантами здійснення винаходу конформаційний епітоп НЕКЗ можна застосовувати як імуноген для створення антитіл або їх фрагментів, які зв'язуються з конформаційним епітопом НЕКЗ. Згідно з конкретними варіантами здійснення винаходу конформаційний епітоп НЕКЗ можна вводити тварині і потім одержувати з тваринного організму антитіла, які зв'язуються з НЕКЗ.
Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу домен(и)/галузь(і), що містить(ять) залишки, які перебувають у контакті з антитілом або "захоплені" антитілом, можна ідентифікувати шляхом здійснення мутації специфічних залишків НЕКЗ (наприклад, в антигені дикого типу) і визначення того, чи може антитіло або його фрагмент зв'язуватися з мутантом або варіантом білка НЕКЗ, або оцінюючи зміни афінності у порівнянні з варіантом дикого типу.
Шляхом створення ряду індивідуальних мутацій, таких як мутації, які можуть впливати на зв'язування між антитілом і антигеном, можна ідентифікувати залишки, які беруть безпосередню участь у зв'язуванні або які перебувають у достатній тісній близькості до антитіла, На основі відомостей про ці амінокислоти можна виявляти домен(и) або область(ії) антигену (НЕКЗ), які містять залишки, що мають контакт з антитілом або, що перекриваються антитілом. Мутагенез на основі відомих технологій, таких як скануванням аланіном, може сприяти виявленню функціонально прийнятних епітопів. Можна застосовувати також мутагенез, заснований на застосуванні протоколу сканування аргініном/глутаміновою кислотою (див., наприклад, Мапеміс; та ін., У. Віої. Спет. 270(37), 1995, сс. 21619-21625 і 2ирпіскК та ін., у. Віої. Спет. 281(29), 2006, бо со. 20464-20473). Як правило, амінокислоту в поліпептиді дикого типу заміняють (як правило,
окремо) на аргінін і глутамінову кислоту, оскільки ці амінокислоти є зарядженими і мають великий об'єм і тому мають здатність порушувати зв'язування між антигензв'язувальним білком і антигеном в області антигену, у яку інтродуційована мутація. Залишки аргініну, які присутні в антигені дикого типу заміняють на глутамінову кислоту. Можна одержувати широку різноманітність індивідуальних мутантів і аналізувати узагальнені результати зв'язування, визначаючи, які залишки впливають на зв'язування. Можна створювати серії мутантних антигенів НЕКЗ, у яких кожний мутантний антиген несе одну мутацію. Можна оцінювати зв'язування кожного мутантного антигену НЕКЗ з різними антитілами до НЕКЗ або їх фрагментами і порівнювати здатність відібраного антитіла або його фрагмента зв'язуватися з
НЕКЗ дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1).
У контексті цього опису мається на увазі, що зміна (наприклад, зменшення або збільшення) зв'язування антитіла або його фрагмента з мутантом або варіантом НЕКЗ свідчить про зміну афінності зв'язування (наприклад, для вимірювання якої використовують відомі методи, такі як
Віасоге-аналіз або заснований на застосуванні гранул аналіз, який описаний нижче в розділі "Приклади"), значенні ЕСво і/або зміні (наприклад, зниженні) загальної сили (здатності до) зв'язування антигензв'язувального білка (наприклад, оціненої за зниженням значення Втлах на графіку залежності зв'язування від концентрації антигензв'язувального білка і концентрації антигену). Істотна зміна зв'язування свідчить про те, що підданий мутації залишок бере участь у зв'язування з антитілом або його фрагментом.
У деяких варіантах здійснення винаходу наявність зниження зв'язування означає, що афінність зв'язування, ЕСво і/або сила (здатність) зв'язування між антитілом або його фрагментом і мутантним антигеном НЕКЗ знижена більш ніж на 10 95, більш ніж на 20 95, більш ніж на 40 95, більш ніж на 50 95, більш ніж на 55 95, більш ніж на 60 95, більш ніж на 65 95, більш ніж на 70 95, більш ніж на 75 95, більш ніж на 80 95, більш ніж на 85 95, більш ніж на 90 95 або більш ніж на 95 95 відносно зв'язування антитіла або його фрагмента з НЕКЗ дикого типу (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 1).
Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу зв'язування антитіла або його фрагмента з мутантним білком НЕКЗ, який має одну чи декілька (наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або більше мутацій), суттєво знижується або зростає у порівнянні з білюм НЕКЗ дикого типу
Зо (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 1).
Хоча форми варіантів розглядаються відносно послідовності дикого типу, яка представлена в ЗЕО ІЮ МО: 1, повинно бути очевидно, що в алельних або сплайсингових варіантах НЕКЗ амінокислоти можуть різнитися. Під обсяг винаходу підпадають також антитіла або фрагменти, для яких виявлена істотна зміна зв'язування (наприклад, знижене або підвищене зв'язування) з такими алельними формами НЕКЗ.
Крім загальних структурних аспектів антитіл на основі структурних підходів можна оцінювати більш специфічні взаємодії між паратопом і епітопом. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу структура СОК-ділянок визначає паратоп, за допомогою якого антитіло може зв'язуватися з епітопом. Форму зазначеного паратопа можна визначати різними шляхами.
Можна використовувати традиційні засновані на вивченні структури підходи, такі як ЯМР або рентгенівська кристалографія. За допомогою таких підходів можна оцінювати форму індивідуального паратопа або паратопа, зв'язаного з епітопом. В альтернативному варіанті можна створювати молекулярні моделі шляхом комп'ютерного моделювання (іп віїйсо).
Структуру можна створювати за допомогою моделювання за гомологією за допомогою пакета програм, що надходить у продаж, таких як програма моделювання Іпзідні фірми Ассеїгуз (Сан-
Дієго, шт. Каліфорнія). У цілому, метод полягає в наступному; можна застосовувати послідовність антитіла, що підлягає вивченню, для пошуку в базах даних білків з відомими структурами, таких як банк даних білків (Ргоїєїп ОСага ВапкК). Після ідентифікації гомологічних білків з відомими структурами ці гомологічні білки застосовують як матриці для моделювання.
Кожну з можливих матриць можна вирівнювати, здійснюючи тим самим заснований на структурі порівняльний аналіз послідовностей між матрицями. Потім послідовність антитіла з невідомою структурою можна вирівнювати з цими матрицями для створення молекулярної моделі антитіла з невідомою структурою. Як повинно бути очевидно фахівцеві в цій галузі, існує багато альтернативних методів створення таких структур іп 5ійсо, можна застосовувати кожну з них.
Наприклад, можна застосовувати процес, аналогічний описаному в Нагатап та ін., в ОБ Мо 5958708 (публікація включена в цей опис як посилання), у якому застосовують програму
ОПАМТА (фірма Роїудеп Согр., Уолтхем, шт. Масачусетс) і програму СНАКМ (Вгоокз та ін., 9.
Сотр. Спет. 4, 1983, с. 187).
Не тільки форма паратопу важлива для вирішення питання про те, чи буде мати місце бо зв'язування і наскільки успішне буде зв'язуватися можливий паратоп з епітопом, але також і сама взаємодія між епітоп і паратопом є джерелом важливої інформації при розробці варіантів антитіл. Як повинно бути очевидно фахівцеві в цій галузі, існують різні шляхи вивчення зазначеної взаємодії. Одним зі шляхів є створення структурних моделей, у тому числі описаних вище, і наступне застосування програми, такої як Іп5зідннц! (фірма Ассеїгу5, Сан-Дієго, шт.
Каліфорнія), яка має стикувальний модуль, який, серед іншого, дозволяє здійснювати пошук методом Монте Карло в конформаційному і орієнтаційному просторі між паратопом і його епітопом. У результаті можна визначати, де і як епітоп взаємодіє з паратопом. В одному з варіантів здійснення винаходу тільки фрагмент або варіант епітопу застосовують для оцінки відповідних взаємодій. В одному з варіантів здійснення винаходу для моделювання взаємодії між паратопом і епітопом застосовують повний епітоп.
Шляхом застосування цих змодельованих структур можна передбачати, які залишки є найбільш важливим для взаємодії між епітопом і паратопом. Так, відповідно до одного з варіантів здійснення можна легко визначати, які залишки потрібно змінювати для зміни характеристик зв'язування антитіла. Наприклад, зі стикувальних моделей може бути зрозуміло, що бічні ланцюги визначених залишків у паратопі можуть стерично перешкоджати зв'язуванню епітопа, тому заміна цих залишків на залишки з меншими бічними ланцюгами може чинити сприятливу дію. Це можна визначати різними шляхами. Наприклад, можна просто візуально оцінювати дві моделі і визначати взаємодії на основі функціональних груп і їх близькості. В альтернативному варіанті можна здійснювати повторні спарювання епітопу і паратопу відповідно до описаного вище методу, для одержання ще кращих з погляду енергії взаємодій.
Можна також визначати ці взаємодії для широкої різноманітності варіантів антитіл для виявлення альтернативних шляхів, за допомогою яких антитіло може зв'язуватися з епітопом.
Можна також поєднувати різні моделі для вирішення питання про те, як слід змінювати структуру антитіл для одержання антитіла з конкретними необхідними характеристиками.
Зазначені вище моделі можна тестувати за допомогою різних методів. Наприклад, можна визначати енергію взаємодії за допомогою описаних вище програм для виявлення варіантів для додаткової оцінки. Крім того, оцінюють кулонівські (електростатичні) взаємодії і взаємодії Ван-
Дер-Ваальса для визначення енергії взаємодії епітопу та варіантів паратопів. Крім того, застосовують сайтнаправлений мутагенез для вирішення питання про те, чи можуть
Зо передбачені зміни в структурі антитіла фактично приводити до необхідних змін характеристик зв'язування. В альтернативному варіанті зміни можуть торкатися епітоп для підтвердження того, що моделі є коректними або для визначення загальних основ зв'язування, які можуть мати місце між паратопом і епітопом.
Як повинно бути очевидно фахівцеві в цій галузі, хоча ці моделі повинні являти собою керівництво, необхідне для створення антитіл і їх варіантів, що представляють собою варіанти здійснення винаходу, усе ще може бути необхідним здійснювати рутинне тестування моделей іп зійсо, імовірно, за допомогою дослідів іп міо. Крім того, як повинно бути очевидно фахівцеві в цій галузі, будь-яка модифікація може виявляти також додаткові побічні дії на активність антитіла. Наприклад, хоча деякі зміни, які як очікується, повинні приводити до посилення зв'язування, можуть приводити до підвищеного зв'язування, це може також викликати інші структурні зміни, які можуть знижувати або змінювати активність антитіла. Розв'язок питання про те, чи має це місце в конкретному випадку, є рутинним у цій галузі, і для цього можна застосовувати різні шляхи. Наприклад, активність можна оцінювати за допомогою методу
ЕГІЗА. В альтернативному варіанті зразки можна оцінювати за допомогою пристрою, який є детектором резонансу поверхневого плазмону.
Антитіла до НЕКЗ
Цей винахід відноситься до антитіл, які розпізнають конформаційний епітоп НЕКЗ. При створенні винаходу несподівано було встановлено, що клас антитіл до НЕКЗ блокує як залежні від ліганда, так і незалежні від ліганда шляхи трансдукції сигналу НЕКЗ. Клас антитіл, які зв'язуються з конкретним конформаційним епітопом НЕКЗ, представлений в таблиці 1.
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіла інгібують як залежну від ліганда, так і незалежну від ліганда передачу сигналу НЕКЗ. Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу антитіла зв'язуються з НЕКЗ і не блокують зв'язування ліганда НЕК з лігандзв'язувальним сайтом (тобто і ліганд, і антитіло можуть зв'язуватися з НЕКЗ одночасно).
У цьому винаході запропоновані антитіла, які специфічно зв'язуються з білком НЕКЗ (наприклад, з НЕКЗ людини і/або мавпи циномолгус), зазначені антитіла містять МН-область, яка має амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357 і 375. У цьому винаході запропоновані антитіла, які специфічно зв'язуються з білюоюом НЕКЗ (наприклад, з НЕКЗ людини бо або мавпи циномолгус), зазначені антитіла містять Мі -область, яка має амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356 і 374. У цьому винаході запропоновані антитіла, які специфічно зв'язуються з білюм НЕКЗ (наприклад, з НЕКЗ людини і/або мавпи циномолгус), зазначені антитіла містять СОК МН, який має амінокислотну послідовність кожного з СОК МН, представлених нижче в таблиці 1. Зокрема, у цьому винаході запропоновані антитіла, які специфічно зв'язуються з білюм НЕКЗ (наприклад, з НЕКЗ людини і/або мавпи циномолгус), зазначені антитіла містять (або в альтернативному варіанті складаються з) один, два, три, чотири, п'ять або більшу кількість СОМ МН, які мають амінокислотну послідовність кожного з
СОК МН, представлених нижче в таблиці 1.
Інші антитіла, запропоновані у винаході, включають піддані мутації амінокислоти, але їх
СОВ-ділянки ще щонайменше на 60, 70, 80, 90, 95 або 98 95 ідентичні СОК-ділянкам, які мають послідовності, представлені в таблиці 1. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу вони включають мутантні амінокислотні послідовності, у яких не більш 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислот в
СОВ-ділянках були піддані мутації у порівнянні з СОК-ділянками, послідовності яких представлено в таблиці 1, при цьому усе ще зберігається їхня специфічність у відношенні вихідного епітопу антитіла.
Інші антитіла, запропоновані у винаході, включають піддані мутації амінокислоти, але їх каркасні ділянки ще щонайменше на 60, 70, 80, 90, 95 або 98 95 ідентичні каркасним ділянкам, які мають послідовності, представлені в таблиці 1. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу вони включають мутантні амінокислотні послідовності, у яких не більше 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислот у каркасних ділянках були піддані мутації у порівнянні з каркасними ділянками, послідовності яких представлено в таблиці 1, при цьому усе ще зберігається їхня специфічність у відношенні вихідного епітопу антитіла. У цьому винаході запропоновані також нуклеотидні послідовності, які кодують МН, МІ, повнорозмірний важкий ланцюг і повнорозмірний легкий ланцюг антитіл, які специфічно зв'язуються з білюоом НЕКЗ (наприклад, з НЕКЗ людини і/або мавпи циномолгус).
Антитіла до НЕКЗ, запропоновані у винаході, зв'язуються з конформаційним епітопом НЕКЗ, який містить амінокислотні залишки з домену 2 і домену 4 НЕКЗ.
Таблиця І: Приклади арням до НЕК, запронововазхих у цьому винаході 5БОШУМО: С ТоОблаєть Ат пиІІІІІІІІИІІИИІІпиИІиИииИиИОоооОоОоОоВООВВВОВОВВЯ
МмОНюя23
Г8БОШОМО:2 ОНСОВРО 1Т8УАМ5 ОЇ Що ШИ ! : «(Кебот) | : : «БО Ід мога снСрюЮ Що ХТОхувЕТИВВВУКО (Кебот) : /(5Бо МО: 4 | НСоВЗ ЖОБЕСЕрІ : (Кебох) І і
ЗВО НУМЩО: З ЕСОКІ КАБОСІВМУА (Кебот)
ЕОР МО: 6 ІСрд СА8ВЯТО5 (Кебот) | !
Зо ко)
«БОЇ МО: 7 00 Ср ООУ5ЕРТТ (Кебот)
ЗЕОО МО: 8 | НСОВІ ОРТЕВВУ (Хотів) !
Г5БОТО МО: о НерКЮ бАХОК (Хобіа)
БЕ МО: б Нерю МОрЕОБО й Щ (Хогій) : ї
ВОЛО МО: СОЮ ОСІБ ! (Хотів : «БОШ МО: 1? ІС 05 (Хотів) : яБОоЛМО: 1ІЄВВУ О1УЄЯЕК ОЇ 00000000 (Хотів) 13 : нн нн | ст
БО МОЯ Мі РІЮМТОВРУЗІ ЗАЗУСОВУТІТСВАЗОСІЗМУТА : ЖЖООКРОКАРКІХО
АБЕГОВОУРЕВЕВИВОВОСТОЕТІТІЗЯСОРЕОВАУ
: ТУСООУЯБЕРТТЕСО
Ї : сткУнк «ОТО МО: 15 Їчяй ОХОГУКВОООГУОРОЯВІ ВІ ВСААБОГРТЕЯВУХ : І МЕЖУВОАРОКОГЕЖУВУ
ТОАУОКТУУРОВУКСВЕТІЗВОМКМТЕУТОММ
! ! ІП ВІЖАБОТАУУУСАК МОВ 1 ї Н 1 Н : : ІЗ Н : | 'вЕОгОГУСОСТЬУТУЄЯ і І
ЗБОЮ МО: 16 | ДНК МІ. ОАТАТССАБАТИАСССАБАССССОТСТАВССТ
Е Я !
ССТОСАСАОСВАЧОСАОООТАТТЕСТААТТОС
СТООСТТОСТАССАОСАСАААССАОСТАААОС
АССБАААСТАТТААТТТАТОСТОСТІСТТСТІТ
ОСАКАОСОСОСТОСОЧТСОСОТТТТАССВОСТ
СТОСАТССООСАСТОСАТТТТАСССТОАССАТТА
ЄСАСССТОСААССТОЛАСАСТТТОСООТТТАТ і | ТАТТВССАССАаЙТАТТСТІСТТТТОСТАСТАСС ' | ТІРВОССАСОСТАССАААСТТОДААТТААА ! птн ТО ТДНКУН ТСАбСТОСААТТОдТОСАЛАОСОВСООСООССТ " ватослассовосоосАОССТОССТСТОЛОСТ : : : есасайсстосовАТТТАССТТТАОССАОСТАТ
ОСОАТОАОСТОСОТОСОССААОССОСТООВАА
ОООТСТООАСТООСТОАОСОТТАСТОСТОСТО
ТТаСТСОТАСТТАТТАТССТОАТТСТОТТААОЄ
СТОСТТТТАССАТТТСАСОТОАТААТТСОЛААА
АСАСССТОТАТСТОСАЛАТОААСВОССТОСОГ
ОСОБААСАТАСОВОССОТОТАТТАТТОСОСОСО
ТІОООСТОАТОАСОСТТ ТТ ОАТАТТТООвОСС лАпвосАСОСТОСТОАСООТТАОСТСА 5БОТОМО ТЕ Лепкий Гвідмтовевві ЗАЗУСВКУ ТИ СКАЗОВІВМКХ і хапта- МЖУООКРОКАРКМЛТО ши АВТ. О5ОМРЕВКУОВОВОТОЕТІТІЗВІОРНОВАМ
УХСООУББЕРТТЕОО
ОТКУВІКВТУААРУЗУ ВЕР ВО КУОТАВМУСІ.
ІХМЕУРЕБАКУОЖКУ днкооБаМмОокУТРОрБКОБТУМ ВИТЬ А : ВУЕКНКУХАСЕУТНОС
ГБЕОШУМОЇ ТббластьАТ 00000000 п пи ев зо т а
Г5ЕОЇОМО:19 |Важкий ОМУОГУВЗОООГУОРСОБІ КІ ЗСАЛАБОВТЕУБУА : жіншесівОї МеМУУКОАРОКСІЕЖУВУ
ТОАУСЕТУУРОЗУКОВЕТІВВОМВКМТІ ХОМ
ЗІВАБРТАУХУСАВЖМСЮ
ЕСРОГЖСОСТЕУТУВВАВТКОРБУКРІАРЕЯКУТВ
: СОТАЛІОСТУКРрУЄР ! !
ЕРУТУЄЖМООАТТУЧУНТЕРАУТОЗВСЬУВІ ВХ
УТУРББВІ ОТО СМ
" УМНКЕРЕКТКУКАУРЬКХСТКТИТСРРСРАРЕС /"бОРБУРІ ЕРРЕРКОТІ.
МІБЄВТРЕУТСУУУВУЄНЕОРЕУКЕУУУВОУВУ
: НМАКТЕРЕРЕОУМЕТУВ ! і ; І
УУБУЇЛУНОрЖЬМОКЕУКСКУЗМКАРАРІВК / ТІВКАКООРВЕРОУУ ТІ, " РРЕВЕНМТКМОУВЕТСІУКИКУРЕОІАУВУВЕМО /' ОРЕММУКТТРРУБОВО "ЯБЕБІГУЯКСТУОКІВЖОООМУБВСЯУМНЕАЕНМ : ПУТОКВЕВІЯРОК
МОЮ 0100000
ВБОЇВ МО 30 НСОКІ ОО 5УАМУ ОО (Кебот)
ВБО1 Моз | НСОКО СОДВАЖОНУКУХУАРЕУКО НИ (Кебот)
ГЕО МО: 22 еВ УОСОБОРОІ Щ І
ЗБОМОМО: Область Ат
ПОП ЗІ НИМ
БОЮ МО ОСОБІ ГВАКОСВАУГА мин р 5БОТ16 МО: 24 сою САКВІОЄ (Кебат)
ГБЕОТБ МО 35 СВБ 0 СООХБЕЕРІТ і (Кобот) : :
БЕОІВ НО Зб нер СОРТЕБВУ ! (Хопа)
СВЕОІВ МО: 27 | НСОВа ОО ВАЖОНУ (Хотів)
ЗБОШО МО: 28 0 НСОВ ЖООБОКОЇ що (Хома)
БОЮ МО: 29 | ШСОКІ. | ФОСІ5К ЩІ (Хотів)
ЗБОЇ МС 30 1 1СОВ? Щі гфюоЕчТчТчТчьнннни (Хана)
Г5БОЛЮМО: ЗІ | поріут Нед (Хотів) і І
І5БОШшУМО: 32 МО ПМОМТО5РУЗІЗАЗУСОВУТТСВАБОСІЗМУА : ЖУООКРОКАРКОЛУ С ' : АВТІ О5СУРВНКОВО ОТО ЦОРБОВАУ З : : І ; : УУСООУВУЕРТТЕСО стКУВІК ші о: ОЮласть Ат і пниинннннижжнНнжтнтпиннппиииииии ! ! попи ОО ПП и ! (ВБОТО КО: 3 ун ПОУОГУВЗСОСІ УОРОСВІВІЗСЛАЗОКТРУЗУА : І МЕЖУВОАРОКОГЕЖ УВУ : | ІВАЖОНУКУТАОЗУКСВЕТІВВОМВКМТ ОМ
МБІДАЕОТАУТУСАВМО
! : | ОЕОБОРЖСОСТІХТУХВ :
О8ВОЛО МО: 34 ДНКУЮ 0 ОАТАТССАСАТОАСССАбАОСССОТСТАОССТ аАОСОСбАОСОТОВОТОАТОСТОТОАССАТТА ' ССТОСАСАбСОАОССАОООТАТІТСТЛАТТОЄЮ
СТОбСТІТОСТАССАОСАСАЛАССАСОТАЛАЮС : АССОАААСТАТТААТТТАТОСТОСТТСТТСТТТ ослАлОСосСатосеатоссоттттАОССОсТ
СТОВАТССООСАСТОАТТТТАСССТОАССАТТА
! ОСАВССТОСЛАССТОААСАСТТТОСОСТТТАТ
ТАТТОССАОСЛатАТТСТЕСТТТТССТАСТАЄС
ТТТООССАСОСТАССАААСТТОАААТТААА
5БО1О МО: 35 | ДНКУНО 0 САССТОСААТТОСТОЧААЛОСООСОССООЄСТ, чатослассавасоюсАОсСстТоСотствАОСТ
СОСООССТеСОпАТТТАССТІТТАССАОСТАТ
ОСОАТОАОСТОСОТОСОССААОССССТОВОАА оботстсоАОТСОСТОАОСОТТАТІТСТОСТТО
ОбОТСАТОТТААОТАТТАТОСТОАТТСТОТТАА
ООСТСОТТТТАССАТТТСАСОТОАТААТТСОАА
АААСАСССТОТАТСТОСАААТОААСАОССТОС
СТОСабААСАТАСООСООСТОТАТТАТТОСИсо свттобастОАТОАОООТТТТОАТАТТТООбО ссААсОСАСССТООТОАСОИТТАОСТСА і
БЕОЇЮ МО; 36 | Йсткий | ПІОМ'ТО5РЕВІ БАЗУЯОКУТІТСВАБОСІВМ МА : р хавлас ї УУОСОКРОКАРКЛЛУ о даю : ! АЗВІОБОУРЕВРЕОВО5СТОР ТС ТІВВСОРЕОРАУ
БОЮ СС от нини УУСООХВВЕТО 00000000 ! " ОТКУВІКЕТУЛАРКУТЕРРУРЕОЇКООТАВУУСІ, і ІУММЕУРЕВАКУОШКУ
ДИКСОБОМЕОКУТВОрУКОКТУЧІ ЕТ ТІВКА
ПУБКВКУУАСВУТНОЮ
І55РУТКУЕМВОВС
БОЇ МО 37 Важкий 00 ОУОГУБЕОССІУОРОСУ НІ ЯСААЕСЕТЕНЕУА ланцюомівбї Ме УКОАРОКОГЕЖУВУ
ІБАЖОНУКУТАВОУКОКЕТВКОМЗКМТ УМ
МВІДАЕРТАМТУСАЮ КО
! ОБОРОГУСОСТІ/ТУВЗАЗТКОРЕУ КЕРІ АВК
І ТЗОСТААТОСІУКОУЕ
" РЕРУТУЄЖКУОАТТ5ОУНТЕРАМІ ОВОЧІВ / УУТУРХЄВЕОТОТУ ТС
МУМНЕРЯМТЕУПКАУВРКЕЗСОКТНТСРРСРАРЕ
ГОРУ ЕРРКРКОТ
ІМІБЕТРЕУТСУУУВУВНЕРРЕУКЕНУ У рОМ В
УНМАКТЕРАЕОХМ5ТУ
ВУУЗУГТУГНОРЖІЛОКЕУКСКУЗМКАЇ РАВІБ
КТІЗКАКООРЕЕРОУУТ
ЕРРУВЕЕМТКМОУВІТСЬУКОРУРОІАХЕ МВ аОРЕММУКЮТТВРУТОВ
ПОБЕКГУЗКГОТУОКУВ КОООМУРУСВУМИБАЦН
МНУТОКВІХІ РОК жна плн п п нн
ЗВО НО о ббатьк у
ГЕО МО: 5 НСрВІ ЗЖАМЕ ТТ ШИ : (Кебот)і !
ГяБОЇр МО: 35 НСБ АІМБОСКеТУУАВВУКЮО 000 (Кебот)
ЖЕО МО 4 1НЄБАЯ 01 ЖБОБаВ 00000000 (Кебої)
БО МОЯ 1СОКІ ПЕАВОСІЯМ КУТА Що (Кебот) ! Ї
БО МО: 45 ПоСрво ОАББІО5 в ! (Кебоз)
БО МО: 43 ІС ООХУББЕРТТ (Кебоз) й "ББОїЮ МО: 44 0 НОЮ ГОвТЕБ5У (Хотів)
ББОМУМО: Я5 НС Бл: юн
ОК і "ВБОЇЮ МО: 46 | НСрЮ МУПОЕСЕРІ "(Хотів їдкі шк 5БОЇЮ МО: 47 | ЦСК 5ОС5КЖ (Хотів) !
ЗБОТо мо: 5 СБ ШИ дення (Хотів)
БОЛЮ МО: 49 ПОВЗ Х5ВЕРТ НН ! (Хотів)
В5ЕОШПМО: 50 М, ООМТОБРЗБІБАБУСОКУТІТСКАЗОСІВМАУСА
5БОЇЮ МО: 0 Облістьйт в Що
ГТ АКООКРОКАРКУО
"АБВІХУЖОУРБВЕО5О5СТО ТІЛІ ГОРЕОВАХ
УУСООУБ5БЕРТТЕСО
Н І тку
ЗБОЇВ МО: ОУН О 00 ОМОСУЕЗабОТг УОРООБІКІЯЗСААВСВТЕВЯХА "МОЖУ УКОАРОКОМЕМ УВА : / ІК5ОСКУТУУАОВУКОВЕТІЕВОМЕКМТУТОМ.
Й
М5ІЖАБОТАУТУСАВМО
ОБОБОБУСОСТІ УТУ я
І
5БО НУМО: 53 ДНК 0 ОАТАКОСАСАТОАСССАСАОСОСОТСТАОССЇ "бАОСОСОАОСОТООСТОАТСОТОТОАССАТТА
ССТОСАСАССОАОССАОООСТАТТТСТААТТОСЄ
СТООСТТОбТАССАЙСАСАЛАССАОСТАААОС У
АССОЛААСТАТТААТТТАТОаСТОСТІСТТСТТТ вСАААОСОбОоСТеССОТССССтТТТТАОсСоОСТ
СТавАтТСеаОсСАСТОАТТТТАСЄСТОАССАТТА
ОСЛОССТОСААССТОААСАСТІТОСОСТІТАТ
"ТАТТОССАОСАСТАТЕСТІСТТТТЄСТАЄТАСЄ З "ТГТООССАСОСТАССАААСТТОАААТТААА ! | !
ГБО МО: 5 |ДНЕУНО ССАБОТИСКАТОЮТОВАААОССЮСОССООСТ сатослаесаааесосАвсстасотетолост і ососасСстосопАТТТАССТТТАОСАОСТАТ ! ОСбАТОАОСТООСТОСОССААСССССТООбАА ! бОСТСТСОАОТОСОТОАОСОСТАТТААТТСТО
АСОСТААОТСТАСТТАТТАТОСТОАТТСТИТТА
АОООТСИТТТТАССАТТТСАСОТОАТААТТОВА
ААААСАСССТОТАТСТОСАААТОААСАОССТО і СЕТОСбОЛАСАТАСООССОТОТАТТАТТОСОС
БО 10 МО: Область А Що
ОСОТТОССОТОАТОАООСТИ ТОАТАТТТОСЮ
ОССААООСАСССТОСТОАСОСТТАОСТСА
5БОШО МО: 54 о Лежин о 00 ПЮМТО5РЕЗІ ЗАЗУОВВУТТСВАБОСІЗМУА карпа ЖУООКРОКАРКІУЄ ланНю
АВВІО5БОУРВЕВОВО5СТОРТІ ТІВ ОРЕВКАМ З : ХЖСОСУУ5ЕРТТЕОО : СТКУВІКЕТУЛАРЗУРІЕРРЗ І ВОГ КОТАЗУУСЬ : ПІАМЕУРАБАКУО МКУ !
Н І В
Я І . Ї " ДНКГОбОМБОБяУТЕОрекоету ІТТ ВКА
ОХЕКНКУХАСЕУТНОС
ІЯБРУТКУРМАОВС
БЕОІЮМО:55 Важкий 0 ГОМУОГУБВООССМОРООВІВІВСААЗОРІРВУХА
ЗаНШЮРІНОЇ | МУЖУВОАРОКОБЕЖУВА
МеОСКУТУХАРЗУКОВЕ ТЕМІ ОМ і ІП М5ЕВАЕВТАУУУСАВ ЖИ ' :
БЕСРОГУСОСТІ УТУЗБАВТКОРВУБЕРІАРБЕКУ
" Т8ОСТААГОСТУКОУЕ " РЕРУТУВЖМЕСАТТЯСУНТЕВАУТОЗ801 78158 ! | УМТУРЕВБІСТОТУЮЄ : | МУМНКРЯУКТКУРККУВРКУСОКТИТОРРОРАРЕ.
ПДБОРЕУВІРРЕКРКОТ
1МЕБЕТРЕУТСУМУРУЯНЕПРЕУКЕМЖУХУЮОМЕ
УНМАКТКРЕВЕОУКУТУ
КУУВУБТУ НОЖІ АОКЕУКСКУВМКАТРАРЕ
: | КТІЗКАКСОРЕЕРОУ УТ
5ЕОЮКО: Область Ат і ши СП ВРЕВВЕМТКМОУВІ СТ УКСЕХРЕТАХУЕМЕВМ
СОРЕММУКТТРРУЦОВ ! 1 :
ПО5ЕРІУЗКІ УКВ МООСМУЄВСЗУМНЕАСНМНУТОКІЧІВ5РОК
МОВОВУЗЯ | тт 5БОТО МО: 56 ГНСрВІ ЗУАМ8 т (Кебот) :
Г8БОО МО: 57 ГНСОВО ХІМРЕОМЕТМУАрРВУКО : (Кебозх)
БНО МО: В НСОВУ 1 ЖОВЕВЕВІ : (Кебот)
БОЇВ МОЇ 5 ІСОВІ 00 ВАБОСІЕМУТА і і (Кобот) 5БОПУМО 80 1СОКО С бАБВГОВ І в (Кебої) :
ББОТОМО І СОКУ 0 ООУВБЕРТ
ЇКебот) :
ЗЕОЇВБ МО ба НСБ ООбЕРБУ схотів) і :
БОМ МО: а НСоВІ МРЯСМЕ тт (Хотів)
ЗБОІр МО: 64 | НСОКЗ МОРЕСЕРІ (Хопа) "ВБО1О МО: 65 | СВІ 00 Т5ОсІВКУ ! (Хотів) ! ' !
я и
ЗОШ МО: БЕ ШСВКІ 0 Г6А800000000 ШЕ (Хотів) : і 5ЕОТЮ МО: 67 | СЮ УЗ5ЕЕТ (Хотів) нні ОО 1ТДЮМТО5РУБІВАБУСОКУ ТТ ОКАБОСІВММСА
УКООКРОКАРКЬМУО
А55ГО5ИУРЗКЕНОВОВОТОЕМСТІЯЗІОРЕОРАХУ "УУСООХВ5ЕРТТЕСО : "аІЖУвіК з Шумогсвб ун " ОУОЕУВ5ОООТУОРООЗІ КІ ЗСААЯСЕТЕВЯУХ
МЕЖУВОАРОКОЕЖ УВУ
ІМРУОМЕТМУАРБУКОКЕТІВКОМВКМТІ МОМ
ЗІВАБОТАУХУСАВМО
: | ОЕСЕОПУСОСТІУТУЄВ
СБЕОЬ МО: В ДНК ОО бАТАТССХОАТОАСССАБАССОСОТСТАВССТ !" ОАССОСОАОСОТООСТОАТОСТОТСАССАТТА
ССТОСАБАОСОЛОССАСОСТАТТТСТААТТОО і і і ' " СТООСТТОСТАССАОСАСАЛАССАОСТАААОС
АСОБАЛАСТАТТААТТТАТОСТОСТІСТТСТТТ З
ОСАААлОСООСОСОТОССОТСОСОТТТТАОСООСТЇ ! СТОБАТОСООСАСТОАТТТТАСССТОАССАТТА
ОСАОССТОСААССТОААСАСТТТОСОСТТТАТ
ТАТТОССАОСАЮТАТТСТТСТТТТОСТАСТАСС
ТІТООССАВОСТАСОАЛАСТТОДАВТТААА
БЕОТО МО ЛІ |ДНЕУНО | САСОТОСААТТООТООААЛОСОССОООВОССТ
ООТОСААССОООСООСАОССТОСОТСТОАОСТ
ОСОСООССТССОбАТТТАССТТТАЮСЬОСТАТ
Кінний. лтхалтхаттатт літати
5БО1Ю МО: Область Ак енстчяннтте ' НИ ПТ ОСбАТОЛОСТОбОТОСОССАЛОССССТОООАА
ПООТСТООАСТООСТОАОСОТТАТТААТОСТТ
СТОСТААТТТТАСТААТТАТОСТОАТТСТОТТА
І АдОСТСОТТТТАССАТТТСАЄСТОАТААТТОСА
АКААСАСССТОТАТСТОСАЛАТОААСАСССТО
ССТОСООААСАТАСОСССОТОТАТТАТТОСОЄ
' | ОССТТОВООТОАТОАООСТТТТОАТАТТТООС : | ОССААСОСАСССТОСТОАСОЯТТАОСТСА ! "БЕОТО КО; ше В ПІОМТОБРОВІ ЗАХУДОКУТТСКАХОСІМАТА і халіта ЖУООКРОКАРКІХО ! ланцюг ! й і АБВІОВОУРБВРВОЗОЄОТОРТІТІВВІОРБОБАХМ
УУСООУ5БРРТТЕСО : : ОТКУБІКЕТУААРЯУВІЕРРЗОБОЇ КУСТАЗУУСІ, : : ІУМЕУРКРАКУОЖУКУ ! : ДНКСОБаМЗОВчУТЕОРяКОВТУ З СЗЯТЬТ ЯКА : ОЖЕКНКУУАСЕУТНОС
ІХ9РУТКУЕМЕСЕС і
БОЇ МО: 73 | Важкий ГОУОГУВБОСОГУОРООБІ ВІВСА ОРІРВЯА ланшог вд | МеЖУВОАРОКОТЕЖУВУ
ІРЗСМЧЕТМУАВЕУКОКЕТЗЕОМКВАМТУ СОМИ
ВІЖАВОТАУУУСАЮУО рРЕСГОГЖОСЄТСУТУЗВАЗТКОРБУЕРІ. АРК : ТеОСТААСОСІУКОУЕ : ! РЕРУТУЗЖМЯСАТТЗОУНТЕРАУЦОЗСТ Уч : УУТУРВІВІОТОТМІС : | МУМНКРЕМТКУРКАУБРКУСОКТНТСРРСРАРЕ
5БОЇО МО: Область Ат Щ ше Я Що : п : ! ГІОСРУУВІЕРРЕРКОТ
І.МІЗВТРЕУТСУУУРУЗНЕОРЕУКЕМУХУрОМЕ
УНКАКТКРАВЕОУМУТУ
ВУХУЗУЄТУТ НОГУ МОКЕХКСКУВМКАТРАРІЕ
І Н
КТІБКАКСОРЕЕРОМУТ
БРРХВЕЕМТКМОХУЬТСІ УКОЕУРУВІАУЕМЕУМ
СОРЕММУКТІТРРУЦЮВ
ООБРЕГУВКІ ТУКА ООСМУРЕСВУМНЕАТН
: | МНУТОКБІ ВІР.
Пмевцяю 7777
ЗБОЇВ Мо: т НСБВІ «ТАМ т ши (Кеботі) р нина аа
І5ЕОІВ МО: 75 НСОВО ІГМТ5РІСУТУХАСВУКИ («Кебот) : :
ЗБОЮ МО: Я нев ГТ ЖбВИТИ 00000 «Кебот) :
СВБОТЮ МО 77 ШСВВЕ ОО ОКАБОЇВММА 0000 (Кебоз) Ї і ЕЕОв МО сою БАБШОЮ 00000000 нн (Кеботі «БОЮ МО: 75 ев ОДЖ5ЕЕРТ ОО 000 (Кебот) :
ЗОВ МО: ВО НСБВ ДШЕТЯУ 0000 іХепа) 5ЕОТО МО: ВІ НС 5рРІайУ
Й Область Ат тт
Г5ЕОТЬ МО: 82 | НСОВЗ ЖОРЕОЕОІ Щ (Хот) «БОЇВ МО: 83 ССО «ОСІВМУ (Хопа) ! І
ЗБОЮ МО: ВА 1бОВО 00бАЯ т ! (Хопа) ші
О5ЕОТЮ МО: 85 ССрАЗ УВБЕРТ (Хонів) «БО МО: Кб АТ ВІЮОМТОБРБІЗАБУВОКУ ТИ СКАВОЧІЕММСА / УУООКРОКАРКТЛУ Є ' " АУВГОВСУГЗВЕВ ОВО ЕТО ПІЯЕСОРЕОКАХ
Н 1 !
УЖСООУВ5ЕРТТЕОО аТКУВІК
ЕОШУМО 87 УН ОХОГУКЕОООІУОРОСВІВІСААХСЕТЕОЯКТА
МБЖУКОАРОКОГЕМУВМ
! ТУРІСУТУУАОБУКОКЕТІКОМеКМТІ У СОМ ! І2АБОТАУУУСАВТОЮ !
ВОКООМСОСТІМТУВ5
Г5БОТО: МО ЖЕО ДИКУ 0 бАТАТССАСАТОАСССАВАОСССОТСТАВССТ пАЙСОСбАССОТаВатодтоатотТОАССАТТА
ССТОСАОАОСОАОССАСОСТАТТТСТААТТОО
СТОБСТТОСТАССАОСАОЛАЛОСАЙСТАЛАОС
АССОАААСТАТТААТТТАТОСТОСТТСТТЄТТ
ЗслАлосооссТоССотТеСсотттТАОСобсТ
Ї СТОБАТССООСАСТОАТТТТАСССТОАССАТТА
Кос. 111 дітдлілііллттті сота
5БОНОМО: 00 Область Ат 1 !
ПОСАОССТОСЛАССТОААСАСТТТОСОСТТТАТ
ТАТТОССАОСАСТАТТСТТСТТТТОСТАСТАСС
"ТТТОбССАОООТАСВАААСТІВАЛАТТА ЛА
Г5ЕО УМО: 89. | ДНК УНІ САЙСТОСААТТОСТОВАААССОВСООСООСС
ООТОСААССОбОСОВБСАОССТОСОТСТаАОСТ
ОСОСООССТССОбАТТТАСЄСТТТАОСАОСТАТ
ОССАТОАОСТОООТОСОССААОССССТОВОАА вастотовАбтТаватолосААТАСТТСТОСТА
ТТОСТТАТАСТТАТТАТОСТОСТТСТОТТААОО
СТСОТТТТАЄСАТТТСАСОТОАТААТТОВАААА
АСАСССТОТАТСТасСАААТОААСЛОССТОССТ
СОПИААСАТАСООССОТОТАТТАТТОСОСОСО
ТТОБООТОСАТОАСОСТТТТОАТАТТТОбСОСС
ААСОСАСССТОСТОАСОСТТЛОСТСА
ЗБОЮ МО: 90 | Легкиії ПІОМТОЗРУЗГ АВУСОВУ ТТ СКАЗОСІВМУМТА кацна- ЖУООКРОКАРКЦЯХ
Заникм си н коту й
АББІО5ОУРЕВЕЗОЧО8ОТОЕТІ ЛІЗЕ ОРБОБАУ
ТУСООТ55ЕРТТРОО
ОТКУБІКЕТУДАРЗУВІЕРРЗРЕОЇ КЯОТАВУМСІ,
ІХМЕХРВЕАКУОТКУ
!
ДУКГОЗОМ5ОБВУТКОО5КОЕТУВЕ ВЕ ТІТЬЯКА З
ПУБЕКНЕУУАСЕУТНОС :
І5УРУТЕЗЕНЕСЕА
ОВБОТМО9Ї Важкей 0 СОУОБУРБВОСОБУОРОСОСВІ ВІ ЯСААЗОГТЕВЯЖА ланцюг 00 М5УУКОАРОКОМИМ УМ (йльки УНої ТеРІЗУТУУАОВУКОВЕТВОМеКМТУТОМКЕ лені | ГВАБОТАУУУСАЮМОЮВ :
ГЕРОЇВ ЧОЇ ТОбаєь Ах 000 ' Е
С домени) 00 БОБВММСОСТІУТУХБАВЗТКОРУУКРЕАРЕВКОЇВ ! ОСТААГОСЬУКОХЕР
БРУТУЄУМОАІТяОУНТЕРАМІ ОБЯСЬУВІ У
У'ЕУРВЗ5ЦИТОТУ СМ ! | Н / УМНКРЕМІКУПККУТВРКУ ! інш нн
ВБОЇШОМОГ9І НСРКЕО Ї5УАМЕОО0000000000000000000 (Кебот) !
ЕБОТМО: 93 НСОКО йду СКаТУУВОВУЮО (Кебот)
ВЕОЇО МО 9 НеОКУ 0ОМУСВЕЕЕР 000
І (Кеботі | !
ПОЕМИ ПО п о о он,
ОББОІЮ МО: 95 ГОРІ "ВАЗОСІВММБА : (Кебет) 5ЕОЇЮ МО: 96 ШСрВо з. (Кебот)
ЗБОЮ МО 97 СОЮЗ с: хна (Кебот)
ІвБОТВ НО ЗК НЕБЕЗ дЕТЕЕИ (Хотів)
ББО1О М ОгЮ СНЕБВО 00 ЯАМОДЯ 000 (Хотів) | !
ЗБОРОМ оно 00 ЖОБЕЕЕО ОО
ІбО(Хотк '
ЗЕОШУМОЇ о ГбблальАє | 00000 НИ
СББОШУМО: СОЮ 001 оА5 т іб(Хон звів ПІСВКУ 1 УББЕРІ Щ Що ооо пи ши п
ЯКО МО: 104 | М, ПІОМТОВРЕВІЗАЗУЧОКУТТСКАОСТВМИА
МУООКРОКАВКИ УЮ
: І АББГСОБОУРЯНЕЗСВОЗОТОЕТІЛІЗ5ЕОРЕОВБАТ 1
УУСООУВВЕРТТЕОО
ОКУ !
ЕОШМОЇ УЯО000007БУСІТЕЗООСГУОБООВІВТБСЛАВОВТЕВВТАМ. 105 | ВЖУВОАРОКОТЕЖУВУ
ТОАХСВЕТУХРОУКОВЕТІКОМКМТОМ
МБІВАВОТАУТУУСАВТО
Й
РЕСЕОПУСОСТЬУТУЧВ
5БОЇБКО ОДНУ ОС бАТАТОСАБАТОАСОСАОАВССССАОСАВССТ тов | ОАОСОССАОСИТОООСбАСАВАВТОАССАТС С ! АССТОТСОСОССАВССАОООСАТСАОСААСТО
ВсТаССссСтТОСТАТСАТАЧВААВССССОСАлОЮ
СССССААЄСТОСТОАТСТАСООСОССАОСТОС
СТОСАВАВСООСОТОССААОСАОАТТСАОСОЮ
САОСбОСТОСВБОСАССОАСТТСАСССТОАССА
ТСАОСАООСТОСАССОССОАОСАСТТООССАСС
"ТАСТАСТОССАЧСАОТАСАОСАОСТТССССАС "САССТТСООССАОООСАССААЙСТОВАЛАТСА
КЗ
ЗБОЇЬМО | Область Ат І Щі 5БОЇО МО: Дикун ПАОСТИСААТТОСТОБАЛАЄСООСОСАЧОССТ 107 СетОСАОССТООСОБСАОССТОАВАСТОТСТІ асоссоссАОСО0СТТСАССТТСАОСАОСТАЄ
ОССАТОАОСТОПОТССОССАООССССТООСЛА двоАСТОВбААТОвОТОТеСОтТоАСАООСОССС
ТОООСАВААОСАССТАСТАСОССВАСАССОТО
! ААБОбОСОСТТСАССАТСАСССОООАСААСАО
СААОААСАСССТОТАЄСТОСАВАТОАЛАСАОСС
ТаСбОобССбАВСАСАССОСООТИТАСТАЄТОТ ! СССАСАТОСЙООСОСАСОАСООСТТССАСАТСТО обасСсАОООСАСОСТООТСАССОТСАОСТСА
БЕОТО МО: Леккнй РІЮМТО5РУЗІЗАЗУСОКУТІТСКАБОСІВМ МА 108 капа- УМООКРОКАРКЕИХО лацтг
АБЕГОЗОСУРБКЕВОЗО5ОТОЕТІТІВГОРЕЮБАТ
ЖУСООХУБЕРТТЕОО
ОТКУБІКАТУААРЗУВІЕРРЕОВОЇ КОТАВУУСТ, ! ІМЕУРЕВАКУОЖКУ
ДНКІОБСМЗОБ5УТЕОРЗКОВТУВІ З5ТІТІ ЯКА
ОУВКНКУХАСЕУТНОВ
І85РУТКЕМНОВС 5БОЇЬ МО: 109 Важкий ТЕУФОІІВЗОСОТ УОРСОВІКІЗСААВОРІЕВВТАМ о данцюгівсй УЖУКОАРОКОЦЕЖУВУ ' : /ТОАУСЯЗТУУРОВУКОВЕТІВЩОМЗКЧТЬМОМ : | М5ІЛАБРТАУТУСАВ МО." ОБОРОГУСОСТІ УТУВБАВТКОРВУКРІАРЯЯКЯ " Т5ОСТААТОСІУКрУг
РЕРУТУВУМУСАГТСУНТЕРАУБОВВСТУ ВВЕ
00 знкноноютюмитмцватяя,
БОЮ МОЇ о ТОблаєвАЄ 000
УУТУРВВІ ОТО
!
МУМКНКРЕМТКУОКАУЕРКУСОКТИТСРРСТАРЕ
ГСОбРЯУРІЕРРЕРКОТ 1МІ5БЕТРЕУТСУУУРУВНЕЮРЕУКЕМ МУ УООУК "УНКАКТКРЕБЕОУМЕТУ : ВУУВМІТУЄНОР'МІ МОКЕУКСКУЗМКАТРАРІВ : : | КТІВКАКООРВЕРОМ УТ
ТРРЗВЕЕМТКМОУЗІТСІУКОВУРВВІАУЕМЕМ
: СОБЕККХУКТТРРУЄВВУ : РОБЕРТ УЗКІ ТУВКВЕЖООСМУР5СЯУМНЕАТН : МНУТОКВІ ВІ 5РОК моні; 1 Щі | пн
ЗБОЇ МО НС яЖУАМ п Кевой і
Поп КИМ КОКО
ЗОВ МО: 1НСрЮ УБАЖОНУКУУАОЗУКО
ПФ) 1
ГБО МОЇ Не ОВЕС 0 ШИ
Пофебод і !
Г5ЕОТО МОЇ ОС ВВ ГЕАЧОСІВКАМА
Н 1
И15 (Кебот) :
ЗБОЮ МО: ЇВ ОО 6АВНШОЄ 000 114 (Кеботі : «БОЇВ МО ІЄВЕУ 0 ОбОУБЕЕ 00000000
ГПІ5 (Кебот)
СВО МОЇ Не БВКО СЕТІ5ЯУ ни
ЗЕОДО МО: Область Ат Щ ШІ
Піка 000 | НШ
ЗРО МО: Нею 5АЖОНУ ши 117(Хотів)
БОЇ хО НСБ 0 ЖОББОРОЇ Щі що 118 (Хотів)
СВБОЇВКОЇ СОН БОСИ5М й в опе яБоїв мо: ІБ СПАВ хотів) 5БО1ОМО: Сб У й 121 (Хотів)
Е Н жи
БОЇ МО: Оу ТІЮМТО5РЕВІЗАВУЄВКУТТСКАВОСІЯМАУСА ї22 ГЖУООКРОКАРКІЦХО / АВ8ГО5СУРЯВЕЗО5О8СТОЕТІТІВВІОРБОВАТ
ХУСОСУЯУЕРТТЕСО
: і і і сТКУБІК 5БОаМОЇ МА БУОГТЕЗООСГУО РОВІ ВІ ЯСЛАВОРТЕВБУАМ 123 | ЗЖУУВОАРОКОТЕЖ УВУ і І
ІБАЖОНУКУУАРЗУКОВРТЕВОМВЕМТЬИСОМ /
МУІААЕВТАУТУСАВЖКО
РБОГОГУСОСТі ТУ
І
5БОМО: | ДНК. ОАТАТССАВАТОАСССАОАВССССАОСАОССТ 124 ЧАОСОССАССОТОООСОАСАСАСТОАССАТС
АССТОТСВООССАОССАОООСАТСАОСААСТа
ОСТООССТОСТАТСАОСАвАЛОСССбОСААОС ! ' " СССОСААОСТОСТОАТСТАСООСОССАОСТСС
БО
580 МО: Область Ат
СТИСАВАОССОСОТОССААОСАОАТТСАОСОС
САПЙСИОСТОСООСАСССАСТТСАСССТОАССА теАОСАИССТОСАЧСОСбАОСАСТТСОССАСС : ! ГП ТАСТАЄТОССАОСАЙТАСАОСАОСТТССССАЄ : ; | САССТТСООССАСОССАССААОСТОСАААТСА а зно ДНК УН ОАОСТОСААТТОСТОВАЛАСЄЧаСОвАаОЯССТ. і : 125 : ватТоСсАоСсСсТОСОоОСсАОаССтТалаАсСТОТеТ : : : асассассАОСООаСТТСАССТТСЛОСАОСТАС : : : ОССАТОАОСТООСТССОССАСОССССТОВСАА С : : | ФОАСТОСЛАТОСОТОТОСОТОАТСАОСОССТ : : І! ООООССАСОТОААСТАСТАСОСОвАСАОСОТО : : | ААОООССОСТСАССАТСАОССОПОАСААСАЮ ! : СААЙААСАСССТОТАССТИСАСАТОДАСАЮСС тасовассоловАСАССОСССТаТАСТАСТИТ
ОССАСАТООИОСОАСОЗОБОСТТСОАСАТСТО
БООССАОпаСАСССТОСТСАССОТСАОСТСА
ЗЕО1МО МО: Легкий 0 РІОМТОВРУВІЗАУМУСРКУПТСКАБОСІВММСА 126 капа» УУООКРОКАРК УЮ дадхцюг
АЗ5ГО5ОУРЕВЕЗО5О5ОТОЕТІТІВ5СОРЕОРАТ
УХУСООУ5ВЕРТТЕОО
І Н
: ОТКУВІКЕТУААРЯУВІЕРРЗРЕОГКЗОСТАЗУУСІ.
ІКЕУРАВАКУЮМКУ
ДОКСО5СМеОВ5У ТОК ТУЯ ТЕКА
ПУБКНКУХАСЕУТНОСЇ
! ! 155РУТК5ЕМАСЕС ю ЩО МО: 127 | Важкий Буді ввоюсі МОРОСВІНЕВСААВОЕТЕВУАМ занпюс ІСІ МКУ МУВОАРЕКСЬЕМ УВУ шк Її. шк ЗВ-БШВЩШЩВЩ Й 4
Б1
БО МОЇ ГОбаєьАю ЇЇ 000
БАЖОНУКУТАрЕУКОВЕТІОКОМУКМІСУОМ
МІЖАВОТАУТУСАВМЄ
: ОЕСРОГУСОСТІ УТУЗВАЗТКОРЕУКРІАРВЗКЯ
Н
ТеОСТААІОСІУКОУ
ПРЕРУТУВММУОАІЛЯСУНТЕРАУТО58б УВІ я
МУТУРВЕВІОТОТУ С
МУКНЕРБМТКУРКЕУЕРКБСОКТНТСРРОСВРАГЕ
ГОббРБУРСЕРРКРКВ
І МІЗВТРЕУТСУУУВУЗНЕВРЕУКЕМ У УУПОМЕ
УНМАКТЕРЕБЕОХ МТУ ' і І
ВУУЗМІ ТУТ НОПМТМСКЕУКСКУЗМКАЦРАРІЕ
КТІЗКАКООРКБРОМУТ
ЕРРЕВЕЕМТККОУЧІ ТСІЛКОКУРВОГАУВУНЯМ С
: : СОРЕММУКТТРРУЦОЯ :
РОБЕРІ УК УОКУВУООСММЕЗСВУМНЕАТН
' МНУТОКВЕВІЯРОК.
МОВІЮМІ | тт і ; ' «БОЮ МО: НОВІ яУАМЕ ' 128 (Кебот) і 5ЕОЇБ МО ОО НеРВУ 00 АЇМЗООКУТУУАВЯУКаИ 00 ши
Т294Кебот) 5ЕОЇО МО: НСБ 00 МОББОРОІ т
ІЗОКебот)
ЗБОЇВ МО: ТПІСрВі ВАОСІБМЖА т 1131 (Кебот) | !
Б2
БОМ Обнатьят пи:
ББОПУМО | БЄрЕ "аАВЯГОЇ т 133 (Кев)
БОЮ МО: (БС0З ООТЗБЕРТТ
ОІ33(Кебо
ЗБОІВО: 1 НЄрвьо 1 о5У 0000 134 (Хотів)
ЗЕОО МО: НСОВО 0 МБООКЕ т 1354Хопа)
ЗО МО: нерві ЖОВЕОЕВІ нин 136 (Хотів) : 5БОШМО: СВІ ВОІВ 137 (Хот) :
ЗБОїо мо: СОЮ ГбАВ й ши
ІЗ Хо) : 5ЕОТО МО: ССркЗ СУВЕРЕТ 139 (Хотів) : 5БО Ю МО; У. "ВІОМТОВРЕВІ ЗАБУВ У ТИ СКАВОСІВМАТА ї4о ГП МХООКРОКАРЮЦИМО ! ' АЯВІ О5ОУРЯВЕВОВОВСТОЕТЬТІЗЯЬОРЕВЕАТ ! : ГП УХСООУВБЕРТТЕСО тку 5БО 5 МО: УН ЕМО ЕВОСОГУОРОСВІ ВІ ЗСААЗОРТРЕУАМ їв ЗЖУКОАРОКОГЕЖМ УВА пОСКУТУХУАРЯУКОВЕТІВВ ЧЕК УСОМ
МЗЕВАБОТАУТУСАВМУО пд 10 00-ЦСН4 НО х А А А
ЗЕО О МО: ОваєтьАт ОО ш-к ши БЕОКРІЖОСОСТІУТУВЬ нини пабів КО ДНКУГ САТАТЕСАБАТОАСССАОАООСССАОСАВОСТ 1 | | ОАОСОССАОССТОООСОАСАСАОТОАССАТС
Ї | | АССТОТСОСОССАОССАВООСАТСАОСКАСТО : ОСТООССТООТАТСАОСАСАЛИСССООСААЛОЮ
СССССАЛОСТОСТОАТСТАСОбСОССАОСТСС : СТОСАСАОСООССТОССААОСАСАТТСАССОЮ
САЧСООСТОСООСАССВАСТТСАСССТОАССА
: ТОАОСАОССТОСАОСССОАВОАСТТСОССАСОС
ТАСТАСТОССАОСАСТАСАССАОСТТССССАЄ
САССТТСВОССАОООСАССААОСТОВАААТСА хв
БОЮ КО: | ДНКУНО | САССТОСААТТЯСТОВААЛАОСООСОВАСОССТ 143 | ОСТОСАОССТООСООСАООССТОАВАСТОТСТТ ! асоссосскасаосттсАСстТсАОСАОСТАЄ
ОССАТОАОСТаастосассАвОСССстТОосСсАА : СОБАСТОБААТООСТОТССОССАТСААСАОСО
АЗОССААСАССАССТАСТАСОССОАСАСССТО
: ААСООССОСТТСАССАТСАВССООбАСААСАЄ
САДОЛАСАСССТОТАССТОСАСАТОААСАОСС
ТОСООбССОАБСАСАССОСССТОТАСТАСТОТ : ЯССАСАТИПИаайСпАСОИаСОСТІ А САТСТО
ОбоссласасАссстостСАССОТОЛастТсА "БЕОІВКО: Легкий РІОМТОФРУВІ ЗАБУСОВУТИСВАОСТВМАМА 144 каїтпа- жМчУООКРОКАРЮ ТО ши АБВГОЗОУРЗВЕОВОЗСТОКТ ЛІЗІ ОРБОБАТ
УЖСООУ5ВЕРТТЕОО : Я СОСТКУЕЖКТУААРЕУТЕРРЗОВОЇ КЕСТАУМСТ,
ЕММЕУРВВАКУЮТКУ і 8ЕО1Ь МО: Область Ат т ДНКГОБОМОКУУТВОЮЗКОВТУВІ ВТ ТІ ВКА
ВУЕКНКУХУАСЕУТНОС
Ї5РУТКЗЕМАСЕС
БО МО: 145 Важкий 00 ЕУОББеОССТУОРООВЕКЕВСЛАБОРТЕВОУАМ. ландшює С | УМ УВОАРОБИБЕМ УВА
ІМБОСКУТУТАВУУКОВЕТІЕОМКМТСОМ
! МВЕДАБОТАУУХСАЮКО і
ЮВЕСБОГУСОСТІУТУЗАВТКОРУУЕРЕАРЯВКУ
Т5СОТААГОСІУКРУК
РЕРУТУЗЖМЗОАІТЯОУНТЕРАУГО5501У51 88 /УУТУРВВЕЦОТОТМІС :
МУМНКРЯМТКУП КА УВРКВСОКТНСТРСРАТЕ
Л.ОСРБУТЬЕРРКРКОТ
І МІ5ВТРЕУТСУУМУВУЄНЕОРЕУКЕМ У УУрОМЕ
УНКАКТКРЕВБОУМЕТУ
І КУУБУТЛ МІ. НОБУСМОКЕККСКУВМКАБРАРТЕ
КТІЗКАКООРВЕРОУХТ
ГРРУЕБЕМТКМОУВІТСІУКОРУРЗРІАУЕМЕВМ бОРБАХМУКТТРРАИТОВ '
РОБРЕІ УВКТТУТКУВЖООСМУРЗСЗУМНЕА Я
І
МАУТОКВІБІ РОК.
Ммешеню т
М5і8
ВБОТо МОгіЯ6 НСБ ВЖАМЕ 00 (Кебов)
С5ЕО МО: бблатАт плиииТиитТТлтТтллианнни
ВЕСТ МО: 147 НРК? | АІВБОСКВТУТАрВУКО(Кебот) 5БО3О МО: 148 | НОСОК. ХСОЕОЕрІ ! (Кебот)
БОЮ МО МО 1СОВЬО ВАБОЮБВИМА 00000000 (Кебот) ! «БОМ МО:150 103 0 | САБЯГОВ. Що п (Кеботї "БЕО ТВ МО: БІ СІСОКЗ У : (Кебот) і "во І МО:152 НС | бЕТЕБВУ в (Хотів) : :
ШВА О Р С 0 ШЩЩШЩЦ «ЛА 000 /:« «62 О З 5ЕО У МО: 153 | НСОЮ БОКУ (Хе)
С5ЕОТЬ МО: Ба. НСОКІ ЖДОБОВОЇ 00000 : (Хотів) : ! ! (БЕОТО МО: 155 ПОРКІ БОС ! (Хетіа) | : : вЕОіБ НО ОВ АЮ : (Хотіа) :! "ВЕО1Ю МО: 157 ЕСОВЗ УБВРРТ. т ! (Хотів) !
ОВО МО: М. ПІОМТОБРУВГЗАБУООКУ ПТСКАЗОСІВМУА : 58 ЖУООКРОКАРКІРУСАЗВЬОБОУРЕАРВОВОВО
ТОЕТІЛІЗ5СОРЕВБАТУУСООУ5ЕРТТЕСОСТК
СуВ ї і Й
ГЕЕОІВ МО УНО 0000 ТЕУОГЕВООСІУОРООВЕ КІ ЗСААБОГТЕВ5УАМ 159 ЯМУКОАРОКОГ ЕМ УЗА ВОСКУ УАОВУКО
КРТІБКОМ5КМТІСУ ОМА АЕОТАУТУСАВМ :
ООБаКРВГУСОСТІ УТУ Ва 5БОШОМО: ДНК М. САТАТССАСАТИАСССАСАСССССАОСАОССТ 160 САССОССАОСОСТОПОСОАСАСАСТОАССАТС
АССТОТООООССАОССАОСОСАТСАОСААСТО
ОСТОСССТаСТАТСАОСАСААОСССООСААОС : : СССССАЛОСТОСТОАТСТАСОССОССАССТОС
СТОСАОАОСООСОТОССАЛОСАбАТТСАОСОО
САВСООСТОСООСАСОВАЄТТСАСОСТОАССА
ТСАВСАСССТОСАОСССВАСОАСТТСОССАСС
ТАСТАСТОССАВСАСТАСАССАОСТТССССАЄ
САССТТОВОССАОВОСАССАДОСТОСАААТСА
! іа тат прут Кох скнтноехоотч кат в |! ватосАвостооСобсСАОССТОАвАСТОТСТТ / ОСОССОССАОСООСТТСАССТТСАССАОСТАС
ОССАТОАОСТОбСТОСОССАСОССОСТООСАА ! | |" ОбОАСТООААТОВОТОТССОССАТСАОСАОСС : : | АЙООСЛАВАОСАССТАСТАСОСОВАСАЙСОТО
ААЙЙОСОООСТТСАССАТСАОССОЧСАСААСАВ
СААОААСАСССТОТАССТОСАОАТаААСАССС " ТОСОбОСОбАБОАСАССОССОТОТАСТАСТОТ
ПОСАСАТИВПОСПВАССАОСОСТТОвАСАТСТО пИКМЕ Кт
БЕ МО оЛевий 001 ОІЮМТОБРОВІЗАЗУОВУ ПТ СКАВОСІВММА 162 | каппа- Ї жеоокРОКАРКІІУСАВУЦО5ОУРЕКЕВОКОВО ланшюг: ТОБЕТСТІЗ5СОРЕРЕАТУУСОСУВЗЕРТТЕСОСТК. : : УБІКЕТУАЛАРБЗУВІЕРРЗРЕОГК5СТАБУУЄТММ г
ГЗОїВКО С Тобласть Ат т
С Шин
ТУЗІЗ5ТІТІЗКАВУВКНЕУТАЄВУТНОСІ ЗВРУ
ГТКБЕМвОВе
ВБФ МО: 5 Вежа |на іп кимнайнно нів ланцюгівої УЖ УКОАРОКСТЕМУВАІВВОСКВТУУАОВУКО .- ВЕТІЗВОМУКМТІ У СОММВІВАВРТАУУХСАВМУ
СОБОКРІНООТІ У ТУВВАВТКОРВУЕРЬ АРК
ВТВОЮТААНОСІУКОУТРЕРУ ТУ ВУНВОМТВЮ
УНТЕРАУГОВВОІУВЬЯБУУТУРУВВСТОТУЮМ
УМНКРЕМІКУКЕУЕРКУСОЕТНТСРРСРАРЕНІ
ОСРВУКІЕРРЕРКОТІ МІБВТРЕУТСУУУРУВНЕ
ВРЕУКЕМЖ УУЮСУВУНМАКТКРЕРЕОУМЕТУВ. : МУВМІ ТУ НОЖІ ЛОКЕУКСКУВМКАТРАРІЕК
ТІЕКАКСОРАВРОУУТІРРЗЕЕЕМТКМОУВІ ТОЇ.
УКСЕЖРВОТАУЕЖЕ5МООРЕММУКТТРРУЦОВЮ
О5ЕГІ УВК УРКЕВМООЄМУРВСВУМНЕА
І , ! ПУТОКВІ ЗІРОК лляні тн я квродвшвТннчнинжотминннннномччннинншшо
МОВІ07о03 ЩІ мс
БО МО: 164 НСОВІ 15ЖАМ5 С Шо НИ пе
БЕоів носу НСОЮ | АІЄ5ОСКУТУТАВВУЮЮ 0 (Кебет3 ! 5БОТоМмо та НерЕУ 000 ЖОбОБОВОГ ШИ Ще іКебот)
ЗЕОТОМО 67 СІВ ОО ВАВОСВММА 000000 (Кеботі
Г8вО1р МО:І165 1СрюЮ похввідя
5ЕОТО МО: | Область Ат
ЗБОТо МОЮ ШО ООУБЕЕВТ (Кебот) :
ТЕО» МО: 170 | НСОВІ ЕТ 0000 (Хотів)
ЗБОЮ МО: ТЯГ НерВо С5ООКе т (Хотів)
І по пока ан шишки и 5БО1МО:172 НОСОВ ГЖОРЕОРРІ (Хотів) : : (Хот) | : : Е
ГВрОЛЬ КО: ВІ АВ : (Хотій) 580 ЩО МО:175 | 1СОВЗ УББЕРТ ! (Хотів) '
Н і
ПММ НИН НИ ПІНА КОКО, 5БОО МО: ОМ ТОМТО5РУЗІ ЗАБУСОВУ ТІТСВАВОСІЗММТА 176 | ЖУООКРОКАРКИГУСАЯВІОЗОУРУВЕВООИ5О ! ТОЕТІТІЗГОРЕОБАТУТСООУЗХЕРТТЕбОСТЕ.
УБІК
Г5БО ТО МО: ун ЕУОГЕЕООССУОРООЧ ВІ ЗСААОВТЕУТАМ р ХУУКОАРОКОЇ ЕЖУЗАВЮВОСЕЗТУХ АрУУКО : ВЕТІЗКОМЗК МТУ ОМ ВАБОТАУУУСАВИ : СОБСЕПЖСОСТЕУ ТУ
ЗБОїОМО: ДНК О | бАТАТССАбАТОАСССАВАСССССАОСАВОСТ
І78 | САССОССАОСОТИВОСОАСАВАСТОАССАТС і
АССТОТСООБОССАОССАВООСАТСАОСААСТО
ОСТОбЕСТОСТАТСАВСАВААВСССООСААОЮ
Ї5ЕОТО МО: 0 ГОбластвАт | ситет нене і і ни ронний
І СТОСАВАЙСООСОТОССАЛОСАВАТТСАВОСО
САОСООСТСОБОСАСОБАСТТСАСССТОАССА
ГТСАОСАСССТОСАООССОАОСАСТТСОССАСС С
ТАСТАСТОССАССАСТАСАОСАОСТТССССАС
: САССТТОООССАОООСАССААОСТОВААЛАТСА ла
ЗОЇ МО: |ДНКУН 0 ГОАбОТОСЛАТТОСТОСАААОСООСОбАВОССТ 179 бОТОСАОССТООСООСАСССТОАОАСТОТСТТ
ПСбССбССАЧСООСТТСАССТТСАВСАОСТАС бесАтТоЛОСТОвВатТССОИССАСОССССТОбСАА ! СБСАСТОСААТИвИтаТОсОССАТОСОСАОСС ! | / АОООСААСАОСАССТАСТАСООСОВАСАОСОТО
АЛОСОССЦИтТТСАССАТСАВССООВАСЛАСАЙ
СААОААСАСССТОТАССТОСАСАТОЛАСЛОСС
ТОСОООССОСАВОСАСАССОССОТОТАСТАСТОТ
ОССАбАТООЙООСОАСОАООСОСТТОвАСАТСТО
ОООССАОООСАСССТОСТСАСССТСАОСТСА
5БО1О МО: Легкий ПІЮМТОВРЕВІКАВУВБКУТ КАВОВА 18 | ханіа- ЖУООКРОКАРКИ ГУСАВСОВОУРЗВЕ5О5050
Ї заяцює ЯОРГЛІХЯСОРБОРАТУУСООУЗВЕРТТЕОСОСТК.
УВА ТУАЛАРВМЕТЕРРЕЗ ВО КУСТАВУУЄТЬММ
ЕУРЕБАКХОЖКУДНКГОЗОМУОВ5УТЕОЮВКОХ ! ТУ ТПЛІЗКАОТУЕКНКУХУАСЕУТНОСИ ВРУ
ТКБЕМАСВС
5БО1О МО: ІІ | Важкий ЕМО ЕЗООСІХОРООЗІВІЗСААЗОЕТЕЗ5УАМ ланцюг гц | 5УУВОАРОКОГЕМУУВАТОсКаТУХАОВУКОИ
ВЕТЕВОМЗКМТЕУСОММВІВАВЕОТАУУУСАВИ
ПОКОЕОГУСОСТІ УТУВЗАВІКОРВУЄРІАРЕВК
/5ТУООТААКОСІУКОХЕРЕРУТУЄЖМУСАТВО бо
БО ме: | Область Ат
Ст ГУНТЕРАХТОВБОГ УВІ ВУ УТУРЗБЕСОТО МК : |" УМВКРЕМТКУРКАУВВКУСОКТНТСРРСРАРВ,
ООРБУКЕЕРРЕРКОТІМІБВТРЕУТСУУУрУВНЕ
ОРЕУКЕМЖУУУООУВУНМАКТКРАЕНОУМУТУВ
! УУВУТТУБНОД'ЖСМОКЕУКСЕУЄУКАГРАМЕК : ТІЗЕКАКСОРЕЕРОУУТЕРРЕВЕЕМТКМОУВІТСІ,
УКОЕУРУВІАУЄУЕМООРЕММУКТТРРИУТОХО
! ОЗЕРІ ЯКІ ТУОКВЮМООСМУВЗСЗУМНЕАСНМ
БУТОК5ЕВІ АРОК: сменівяи я тт
Мк25 552ап 1 і 5БОШшМО: нер БУАМ5 182(Кебот)
ОББОЇБМОЇ 0 Нерю АШМООКЕТУТАВЯУКИ 00000000
ЯЗ (Кобот)
БОЇВ МО: СНерЕ ЖаВЕаВВ 0000
ІвН(Кобот) :
БО МО: ССОВі "КАВОСІЕМЖТА : 18541Кебот) 5БОШМОЇ ЕВ СБАВОЮЮ 0000000 : ВБ(Кебох
МО: 000 "ООУББРРТТ (187 (Кебот) !
СВБОТ МО ІВЕ НСОВІ г оБтяЕХ 00 (Котів)
СВБОТО МО ІВ. НСБ? 0 8ЩОбК5О0000 (Хотів) и
БО МО: о |Облаєьйт | 00000
БОЇВ МО 190 нер маввової 00000 (Хотів) !
ГЕО МОЮ: Сб БОСІЗММ що (Хотіш) 5БОТВМО:192 Сб я (Хотів)
ЖБОТЬМО193 СБК3 0 УББЕРТ (Хотіг)
С5ЕОО МО 194 У. 000 | ОЮМТОБРЕВІЗАВУСОВУТІТСКАВОСІЗМ МА .
М УООКРОКАРКІЛТУСАВБІ ОО УРЕВЕКИВОВО
ТБЕТІТІВІОРЕОБАТУХУСООУЗУЕРТТЕСОСТК
УБІК
5ЕОТО МО: МУ ЕУОГЕЗОООВІ ЖОРОСБІ КІ ЯСААЗОЕТЕ5ЕТАМ
П195 і УЖУВОАРОКОГСЕМУБЛІВМОСКОТУ УАОБУКО
ГВЕТІВКОМУКМТІ У БОММВІЛАБОТАУУУСАВМ
ООБОКОГУОСТЬУТУЄ
І
55010 КО:196 ДНК МІ. САТАТОСАСАТСАСССАОАВССССАОСАСССТ
САОСОССАОСИтТОбОСОАСАСАСТОАССАТС С:
АССТОТСПООССАСССАВОВСАТСАОСААСТО астаасстостАТСАОСАОААОСССООСААОС
СССССАЛОИСТОСТОАТСТАСООСОССАОСТОС
СТОСАВАВСООССТОССАЛОСАСАТТСАОВСИС
І
САОСООСТОСООСАССОАСТТСАСССТОАССА
ТСАБСАОССТОСАВСССОАОСАСТТСОССАСС
! ТАСТАСТОССАОСАСТАСАОСАОСТТССССАС "САССТТОПИССАСООСАССААИТОВАЛАТСА /5БО1Ю МО:197 | ДОК УВ | САОСТОСЛАТТОСТОСАААбСООСОСАСОССТ рон троха
І
ОСОССОССАОССОСТТСАССТТСАОСАОСТАС
ОССАТОАОСТООСТССОССАВОСОССТОССАА
СОСАСТООААТООСТОТОСОССАТСАОСААСС
АОБОСЛАСАОСАССТАСТАСОСССАСАОСОТО
ААОСООССООТТСАССАТСАОССООВАСААСАЙ
СЛАВЛАСАСОСТОТАССТОСАбАТалАСАССС
ТОСбОСбССОАОВАСАССОСССТОТАСТАЄТОТ
ОССАСАТООПОСВАСОАСООСТТСОАСАТСТО бОССАСООСАСССТООТСАЄСОТСАОСТСА.
ЗБОЇ МОСІЮ5 Лежий 0 БІОМТОЗРЕЗІЗАВУОРКУТИСКАВОСІВММТА кала: ЖТООКРОКАРКІ УС АЯВІОБСУРУВКВОВО5О оленшюв | ТОБТІЛІЗ5КОРЕОБАТУХСОЮУВБЕРТТЕООСТК
УБІКЕТУААРЕУРІЕРРХРЕО КВОТАВУУСТИММ
ГУРЕВАКУСУКУДНКІ ОХИМБОБУТВОЮЯКОВ
ТУВІЗ5ТІТІЗКАВУВКНКУУАСЕУТНОСТ ВРУ
І ТКеЕМВОвС
БЕОІВ МО 199 Жіний БИКОВА Ві КК ланфюгє ТЕО ірон киніній
ВЕТІХВОМУКМТІ УГОММВІДЛЕОТАУУУСАЮ
СПЕСЕОПУСОСТІУТУВВАВТКОРЕУЕРЬАРЯВК. мих і І УНТЕРАМЕГОББОСУВьОХ МЕРІВ ОТОТУСМ
УМНКРЕКТКУРКЕУЕРКУСОКТНТЄРРСРАРЕГІ.
ОБРБУРІСЕРРКРКОТІ МІЕКТРЕУТСУУУВУВНЕ
ОРЕУКЕМ КУ УрОУБУНМАКТКР КвЕОУМ ЗТУК ! УВУ НОЖЕМ ОКЕХКСКУВМКАГРАРІЕК. !
ТІЗКАКООРЕЕРОУУТІ РРЕЗЕЕЕМТКК УВС.
УКОРУРУРІАУЮУЕЗМООРЕММУКТТРРУТЮВО ши ш ОВИУБКС Ток к кодом твОвумнкатню
«БО МО: 0 Област Ат | т
ТНЕУ ТОКУ ВІ РОК
МмОНІ0703 и
АБУ М528
БО МО: 200 ВСОВі "5ВУАМ5 і (Кебот) ! і і
СВЕОП МО: 201 НСОВО УЇБ5ОСКОТУТАрВУКО (Кебет)
БО МО ! НС МООЕСЕРБІ (Кебоз) ! 5БО1О МО: 203 | ТСОКЕ ВАВОСІЗМЖТА. пи (Кебоз) 5БО1В МО: 204 1СОБ2 УЖ (Кейт) 5БОТО МО: 205 1СОВА ООУБЕРРТІ нин (Кебот)
ББОШУМОЮ НСБКРО РТ 00000 (Хепа) «БО МО: 207 НОСОВ ВОСКУ тт
Хотів) і
СВО МО В ВСЯ робвавг (Хотів)
ЗЕОЇО МО: 209 1СОВІ ОСІБ ни (копа)
ЗБОЮ МО: 210 БСОВО АВ (Хотів)
ВО ШІМО: 0 |Облаєт Ат |. пи висять - я (Хе) | | і 5БОТО КО:213 М скойспінно ні іокннннй
ЖУООКРОКАРКИТУСАВВІСО5ОУРВКЕВОВОВО
ТОЕТІ ТІ5УГОРЕОЕАТУУСОСУБЕЕРТТРООСТК ші
ВБОВКОЇ УВО БУОИЕВВОСІМОРОСБІНІВСААБОКТЕБВУАМ. 3 | Ж УВОАРОКОС ВЕУ УВУ ВНООКОТУХАрЕУКО
ВЕТІЗКНО МУК МТ УОММВІВАЕОТАМУУСАВЮМ
ООБаКрГУЄОСТІ ТУ ян ЗНАЧ НЕК КН КК»
Ех /сасроюсвоговоюювсасчнотомснте
АССТОТСОБОССАОССАОООСАТСАИСААСТО
ОСТООССТОСТАТСАОСАСААОСССВОСААОЮ
/ессосалостастодтетАсоюЮвюсно Ст ! | "СТОСАСАОСООСОТОССААОСАВАТТСАОСОЮ
САОСООСТССОбСАССОАСТТСАСССТОАССА
ТСАОСАОССТОСАОСССОАОСАСТТСООСАСС
ТАСТАСТаССАОСАЄСТАСАОСАОСТТССССАЄ
САССТТСООССАСОбСАССААОСТОВАААТСА
ЗБОТВНО ДНЕЙ (аАОСТОЄКАТТОСТОВАААОСООСОВАВВССТ 215 | | остослОССТОССооСАОССТОАСАСТОТСТЯ ! " аСасСоСсСАССООСТТСАССТТСАОСАОСТАСОССАТОЛОСТОСОТОСОССАООССССТООСАА ! | | СОбАСТООЛАТОВОТОТОСОТСАТСАЮСАОСС
АОБОСААСАОСАССТАСТАСОСОСАСАОСОТО
ААИСОССОСТТСАССАТСАОСССОСАСЛАСАВ
СХАСЛАСАСССТОТАССТаСАОАТОААСАВСС поспооссолосАСАСОоСсотОтАстАстот ни | ОССАСАТОСОБССАСОАОООСТТСОАСАТСТО
СООССАОООСАЄССТОСТСАСССТСАОСТОА
«БОЮ МО: ший 0 БЮМТОЗРЕУЕЗАХУЄОВУ СВ АВОСІВММА 216 капоа- Ж УООКРОКАРКЮТ ГУ ОАУВІО5ОУВУВЕВОВОВО ланог ТОЕТЕТІВВГОРЕОРАТУ УСООХУВЕРТТКСООТК , : УБІКЕТУДАРЯУВІЕРРЯПЕОг КБОТАВУУСЬСКМ : ЕУРВЕАКХОМКУДНКІО5ОМ5ОВБУТЕООВКОВ
ТУВІ5УТЕЛІЗКАВУВКНКУУАСЕУТНОСТЯКВМ
ТКБЕМАОВС
ЗБОЇВ МО: 217 | Важкий ЕТОЇЛВВОИСІ УОРОСБІЛІЗСААБОЕТЕВВ ТАМ, ланцюг вд | УМУУВОАРОКИГ У УЗУТОСКВТУУАрУКО
ВЕТІБВОМ5К ТІ ОМ МІ ВАНОТАУХУСАВМ
ОББОКОГИООЮТІХТУВВАВТКОРЕУРРІ АРЗЕК
" 5Т5ООТААТОСІУКОУРРЕРУТУВ ЖУКА
УНТЕРАУГОУВОЇ УВІ ЗУ УТУРЗУВОТОТМСМ
! | УМиКРЯМТЕУРКАУВРКЕУСОКТНТСРРСРАРЕГЬ
СОРЗУСЕРРЕРКОТІ МІБЕТРЕУТСУУУВУВНЕ
ОРЕУКЕМУУУРОМЕУНМАКТКРАНВОУМТУК
УМГ ТУТ ЛОВУ МОКЕУКСКУЗМКАРАРІЕК
ТІВКАКООРЕЕРОУУ ТІ.РРЕКЕВМТКМОУ ВТС,
УКОРХРЯОІАМЕЖЕЗМОСОРЕММУКТТРРУГВЯВ
' | "О5РЕМУВКОТУр КВУ ОООМУЄВСВУМНЕАІ НМ
НУТОКВІДІ РОК.
Мені нн
Ав МІ
ЗЕОІБ МОВ пс 5удмЕТ ебею
М М УК5ОСКТУТУАРЗУКО не
ВЕОМОЇ мил
ПЕ ПІН ПОМ ООООО В ОН
БО МО МО: 220 | НСОКЗ ЖООЕСКОІ (Кебот)
ББОЛО МОГО БО реБобівнутА
Ї (Кебот) Я «ОІВ МО 5 СВО 0 бАВШОЄ «Кебої)
Н
ЗБОЇВ МО 233 ЦСК: 0 ООУББРИТТ (Кебої)
ВЕОЮ МО 224 НеВКІ Петру 000
Хома) ! і 5БОЩОМО:225|НСОКО 0 ТО5О0КЕО (Хезіа) :
БЕОШОМОг226 НСбКЗ ОО МУООБОРОЇ
Хотів) !
БО мет ВІ ООТБОЄВНМ 000 (Хотів) :
ЗЕО1О МО: 228 1СОВО і бАВ (Хотів) 5ЕО1Ь МО: 229 | Ср ун (Хотів) : ! ! і і | '
ВЕ МО: ПАТ оюЮМТОБРУБІЗАВУЄВВУТИСКАВОВІМЖА 230 | МУООКРОКАТКІЇ ГИОАВВІОЗОУРЕВРБОВОВО
ТОРТІ ТІЗ5БОРЕОГАТУУСОСУ5БЕРТТЕСОСТК
ЕК
8БОШНМО: ОТУНО 0 ГЕУОШЕЗООСІУОРООЗГ КІ ЗСАЛАВОКТЕЯТАМ з | ЗЖУКОАРОКОСЕМУЧУТСЗОСКОТУХУАПЗУКО
ПОН ПО Вин - дн
СВБОЛО МО: Область Ат шшшшшшшш нини нин КСТІЗЕОМБКМТУТОММВІКАВОТАХУУХСАВМ
ООБОБОГХСОСТЬУТУВВ
ЕОР МО: 232 ДНК У, | БАТАТОСАБАТОАСССАСЛОСОССАОСАОССТ
АССаССАОСОТОбОСОАСАСАСТОАССАТС
АССТОТСОООССАОССАСИОСАТСАССААСТО асЄтеОоССтОСтТАТСАССАСАЛОСССООСлЛАЮЮ
СССССАЛОСТОСТОАТСТАСООСОССАОСТОС С
" СТОСАСАОСВОСОТОССАЛОСАОАТТСАОСОб
САССООСТОСООСАСССАСТТСАСССТвАССА
ТСАОСАОССТОСАОбСОССОАОВАСТТОВССАСС
ТАСТАСТОССАОСАСТАСАВСАССТТССССАС С
САССТОВОССАБОССАССААОСТОВАААТСА
Ав
ЗБОЮ МО 33 |ДНКУЙ 00 бАЧСТОСААТТОСТОВААЛОСООСОбАВОССТ
ОбТасАОССТООСООСАОССТОАбАСТОТСТТ
ОСОССОССАВСООСТТСАССТТСАОСАОСТАС
! ! ССАТОАбСТОООТССОССАВОССОСТООСАА
СОбАСТОВААТОСОТОТОСОТСАТОСОСАВвСС
АПИССААСАССАССТАСТАСОСОСВАСАОСОТО
ААОСОССООТТСАССАТСАБОСОООАСААСАС слАОААСАСОСТОТАССТОСАЧАТОААСАОСЄ тасопоссбАОСАСАССОССОТаТАСТАСТОТ
ОССАПАТОССИСОАСОАБОбСТТСОАСАТСТО
ОООССАСОССАСССТОЧТСАССОТСАОСТСА
!
ВЕ МО: сін пом окрЕЕСчАВУСОВ УТ СВАВОЇ ІБМСА капа | ЖХООКРОКАРКЬМУ ОАЕВІО5ОУРВАРеО5О8б6 ! | завнюг Г ТОРТІВ ОРЕОКАТУУСООУБЕРТТЕОСОСТК
УЕЖКЕТУААРОУВІЕРРЗОВОГКЗСТАЗУУСЬЯМ
РУРВЕАКУСУКУДНКГОВОМ5ОГВУТЕОВяКОВ З
ТУВЗІ5ТІТІЗКАВТЕКНКУТАСЕУТНОСТЯБЕМ
5ЕО ЇМО: Області сет БЕ 00000
ЗБОЮ МО: 235 1 Важкий ЕОМ ЕБОБОГУОРОСВІ ЛІ ВСААВОГТРВОТАМ ланюгіебї | ВЖУКОАРОКОЇ ВЖУЗУВОСКЕТУУАЮЄУКО
ВЕТІЗКОКВК МТУ ОММВІВАЕРТАУХУХСАКМ
І і "ЧОБОЕВГУСОСТУТУВВАБІКОРЗУКРІАРЯВК.
ГеТОСТААТОСІУКОУЕРЕРУТУЄЖМЯСАЬТВО
УНТЕВАУГОВБОСУ ВІЗУ ТУРЕХЗЬСТОГМ СМ
/ УМНКРЕМТЕУОКЕУВРКОСОКТНТСРРОРАРЕ, /" ОбРЕУВІЕРРКТКОТІ МІЗВТРЕУТСУХУУВУВНЕ ! ! | пРЕУКЕКЛУУУОСУВУНМАКТКРКЕВОУКТУК
УМ ТУ ВОВЖЬМОКЕУКСКУВМКАПВАРІВК ОС
/ ТІЗКАКСОРЕЕРОУУТЕРРЯВЕЕМТКМОУ ВІСІ; ! | УКОЕУРВІЛАУЕМВЗМООРЕММУКТТРРУВОВО овекіуВКЕТУ ОК АЗК всвУМНЕях
НУТОКВІБІЯРОК
"МОВІто3 пн шн "Ява ! ши 8БОї» МО:236 ПСО ЗУАМУ (Кебої) | :
ГББО1О МО-337 | НСЮВО 0 АМАОСКУТУТАВЯУЮ 000 ші (Кевот) і | ! "5БОЮ МО: 235. НСОНЗ ОМОБЕОКОї "(Кебот)
ВБОЇВ МОВІ ІСВВІ 0 ВАЗОСВММА 000000 (Кебоз)
ГеБОТВ КО о ШСВВУ 0 1БАВЕОЄ 700000 (Кебот)
С8ЕОЇО МО: 0 Область Ат : і і 5ЕО В МО: 241 | 1СОКЗ ООУББЕРТТ (Кебот)
ЗЕОПО МО: 242 | НСОКІ У (Хотів)
ЗЕОТО МО: 243 | НСД МАК 00000 (Хетів)
ЗБО1р КО: 244 | НСОЮЗ ОЖМОВВОВИ (Хоїв) !
І о ж тя пит О« « « « «« « «З « «З «З З
ЗВО10 МО:245 ІСОВІ | ВОСІяМм : (Хотів) Я "ВЕОТО МО: 246 1 ЦСОВО ОАВ : (Хотів) :
С5БОТЮ МОЯ? І ШОЮВЯ 015500 : (Хотів) : ншшшнинишинннМииишН
СОЮ МО: М ОМТОВРУБІЗАБУСОКУТТСВАБОСІВМКМСА. 248 МХООКРОКАРКІМТУ САВВСОБОУРАВРБОВОВО
ГТОЕТЕІБ5СОРБОБАТУУСООХУВБЕРТТЕСОСТК.
УВК
(ББЕОНУМО:Ї ОУН О 00 ТЕУОГЕРЗОСОгУОРОБВІКССААЛВОЕТЕЗАТАМ 349 ! | ЗУУВОАРОКОГ ЕМ УВАЙАОСКВТУУАОВУКО
ВЕТІБАОМЗКМТУСОММВІДАЕРТАУУУСАВУ
! ! ,бРЕСЕОРУСОСТЬУТУЄВ 5БОТО МО: ДВК 0 ОАТАТССАОСАТОАСССЛОАВОСССАОСАОССТ 250 | | САССОССАОСОТавОСОАСАОВОТСАССАТС С,
АССТатТСОпОССАОССАОСОСАТСАОСААСТО
ОСТООССТОСТАТСАОСАСААОСССООСААСО
СССССААОСТОСТОАТСТАЄООСОССАВСТОС
Б с пн
САССООСТОСИССАССОАСТТСАСССТОАССА
: ТтТСАССАБССТОСАПСССОАОСАСТІСОССАСС
ТАСТАСТКЄ АЙСАСТАСАаЙСАССТІССССАЄ ! САССТТССССАВООСАССААИПСТОСАААМСА ! Ай вн ни 251 | ОСТОСАСССТОбСОССАЙССТОАНАСТОТЕТТ
ОСОССОССАССОВОСТТСАССТТСАОСАССТАЄ
СССАТОЛОСТИТТ ССО ССАСОССССТОССАА,
СОПАСТОСААТЯСОТОТОСОССАТСААСОССС
ХабОсСААСАССАССТАЄТАСОСССВАСАССТО
ААИСОССОСТТСАССАТСАОСССОСАСААСАЄ
СААПААСАСССТОТАССТОСАВАТОДАСАОСС
! ТасОпассбСАОСАСАССИССОТТАСТАСТОТ
ОССАСАТОСООСОАСОАОООСТТСОАСАТСТО
ОССССАССОСАСССТИИТСАСССТСАОСТСА
ГЕО МО: 00 Легкий ПІОМТОБРУВІ ЗАБУСОКУ ПТСКАВОБІЗМАМА 2372 хатів- ЖУЖУООКРОКАРКІ ТУСАЗБОБОУРБЕКЕ5ОВОСВО лакннюг ТРЕТГЛІБВ ОРЕОБАТУУСОСУВЗЕЕТ ТЕСТ : УБІКЕТУААРЯУКІЕРРЗОВОЇ КОСТА УУСИ ММ
ЕУРЕБАК ХО ЖКУДНКГОЗаМОБЗУТЕОПЕКОВ
ТУЗІ55ТІТІЗКАВУЕКНКУХАСЕУ НОСІ КРУ І
ТКВЕМЕОЕС
ЕЕОТ КОВІ Вижини ТЕО ТЕВОССТУОРООВІЛІЕСААВСВІТЕЕУАМ ланвюгівої ГУЖУДОАРОКОГЕМУЗАТМАООКУТУУАРЗУКО : | ВЕТІЗКОМВАМТЬ У ОММУКАВВТАУХУСАКМ !
ООБСРОЛУСОСТУТУБАВТКОРОУРРІАРЗБК, 5БТБОСТААКОСТІУКОХУКРЕРУТУКУМВОИАІ ТО
ЕОМ ОблаєтьАє 000000
НИ ТТГУМОКРЕКТЕУОККУВРКОСОКТНТСТРСРАВНОЬ
ОРЗУВЦЕРРКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУУрУВНЕ
ПРЕУКЕМЖУУВСУВУНМАКТКРЕЕВОУМЕТУВ
УУЧУТУТНОВМІМСКЕУКСКУЗМКАГРАРІВКТІВКАКООРВЕРОУУТІРРЕВЕЕМТКМОУВЬТСЬ
МКОГУРЕОТАУВУВУМООРЕММУКТТРРУВОВО
О5ЕБСУЗКІЛ ОКА МОООКУРВСВУМНВАВНМ
НУТОКВІ ЗІ ЗРОК
Ммок10703 т і База
ЗБОЇВ МО: 334 НС ЗУАМ5 т (Кеботу
ГЕО МО: 255 СОЮ АІМТООКУТУХАРЗУКО ! ' (Кебот) !
ЗБОїВ МО 6 нСрва ОО ЖОВ 000 (Кебот)
ЯЕОПУМО:257 СВК ОО 1КАБОБІЗММЕА 000 (Кебот)
УЕОТВ МО: 258 ерюю окт (Кеботу
БОЮ МОг259 ШСВЕЗ 0 ОДБ 000000 (Кебсї)у 5010 МО: 360 НС бЕТЕВУ (Хотів) (ВЕОТЮ МО: 261 НС МТОСКУ гХотіа)
БО МОМ о ббласєьвАт 000
Бо І МО:262 ою СТ ЖОВЕОВО 00 Що ЩЕ (Хотів)
БО Іс 0 БОбАК Шо що (Хотій)
БОЮ МО:364 СОБІ |бАБ шо Дошки ши птн 580 МО: 265 | 1С0К3 УБЯБРТ (Хотів) !
БОЮ МО 1777 ОМТО5РЕВІХАЗУСОВУТИСВАЧОСІЯММА С 266 Ж УООКРОКАРКІ СТУ САЗЯСО5ОУРВВЕКОВОВО
ТОЕТІ ТІЗБІСОРЕОРАТУУСООУ5ЕРТТЕООЮТК :
УБІК
СВЕОО МО: У ОО05 ЕУОСІНВОСОСКОРООВІ ВІ БСЛАВОРТЕВВХАМ зе ЖУВОАРОКОСЕЖУУЗАМТООКЕТУТАЮВВУКО
КЕТІБЕОМК МТ УГОММВІЖАЕРТАУУУСАЮМ
: : ОПОР ОООТЬУТУ ВЕ 5БО Ю МО: к у. | САТАТССАБАТОАСССАСАСОСССАОСАОСОСТ
С268 | ГП ОАбСОССЛОССТОООССАСАСАСТОАССАТС : г АОСТОТОВаОССлОоССАВООСАТСАОСААСТО
ОСТООССТОСТАТСЛАОСАЧВААасссСОСсСААСО
І СССССААОСТОСТОАТСТАСООСОССАОСТОС І
! ! СТИСАСАОСООСОТОССААОСАСАТТСАОСОС : : САССООСТОСООСАССОСАСТТСАСССТОАССА і ТСАЙСАСССТОСАБСССПАССАСТТСОССАСС : : : ТАСТАСТОССАОСАСТАСАОСАОСТТССССАЄ С:
САССТТСОСССАЙООСАССААССТОВАДАТСА
! | Ай
ЗБОЮ МО: ДВК ОУН ОАССТОСААТТОСТООАААОСООСОБАСОССТ.
СВОЮ МОЄ бблаєтьАт ОО
ОСОССОССАССООСТТСАССТТСАОСАЯСТАЄ
"ОССАТОАОСТОВОТССОССАВОССОСТООСАА
ОббАСТОСААТООСТОТОСОССАТСААСАССС ' АОСОСААСЛОСАССТАСТАСОССОАСАОСОТО
ХАСОПССОСТТСАССАТСАВССООСАСААСАЮ
СААВААСАСССТОТАЄСТОСАВАТОААСАВСС С
ТеСВбоссоАОПАСАССОССОТОТАСТАЄТТ
ОССАСАТОВОВСОАСОЛОВОСТТСОАСАТСТО
' ВОБбОСАСООСАСССТОСТСАССОТСАЧСТСА
БиБН я РІОМТОЗРЕВІ ЗАУСОКУТТСВАВОСІЯ ММА 270 | капла- | МУООКРОКАРКІ ЛУСЛЯВІОЗОУРВККООКО ланшюг ТЮЕТЕТІ55СОРЕОБАТУУСООУУ5ЕРТТЕСОСТК " УВІКЕТУААРУУРІЕРРЗ ОВО КВОТАВУЧСТІ ММ
ЕУРЕБАКУСЖУКУДНКІО5ОМОБ5УТЕОрУКОЇ ' | тУвІеТі ТІ5КАРУЕКНЕУУАСЕУТНОСІ Х8РУ
ТК5ЕМВОКС
ВЕОІР МО: | Вахосий. н- ї лавцює Твої ! ЗУУКОАРОКОГ ЕМ УВА ІМТООКВТУУАПВУКО
ВЕТІЗЕОМК КТ ОМКВІЛЛЕОТАХУУСАВУ
! | | ОрБОКОГУООСТІ УТУЗВАЗТКОРЯУЄВІАРЕЯК «Т5ООТААТОСЬУКОУЕРЕРУТУВЖУМОА ТО
УНТЕРАМІ ОБО УКСяВУМ ТУР СТО УС !
УМНКРУКТКУВКАУВРКУСПЕТНІТСРРСРАРЕІІ, : | | ОБбРЕУРСЕРРКРКІУ МІЗВТРЕУТСУУУрУЄНЕ оРЕУКЕМ ХУ УОВУВУНМАКТКРЕЕНОУ МТУ
УУЗУБТУСНОРЖІМОКЕУКСКУЄМКАТРАВЕК
ТІЗКАКООРВЕРОУУТІРРЗВВЕМТКМОУВІЛТС,
УКОКУРУВІАУЕЖЕВМСОРЕММУКТТРРУТОВО
Що | БРУСУ КІ ТУРКА ОМ РВСВУМНАННМ
«БОШІМО: 0 ОбластьАт ни рат ее о ІІ
Мовна 7 8555 5БО1О жо и :2Т3(Кебою ! Я ;
ГЕО МО |НСБК? 0 ГУТОАУОВБТУУРОВУКО оз (Каб ответ ев СТЛДББОВОІ т 74 (Кебої)
С5ЕО ВМО С ен 2754Кебот) | і ! "ВЕОїВ МО: Сов? ГЕКЕЕЦОВ 7 Й | | ! оСбкево :
ТЕО МО: ІСВЕІ ння 277 (Кобот) рожа І СИ ння 1.278(Хотів) "5БОр Мо: НСОКО 1бАУОЮВВ - 2794(Хопія) 5РОШМО: НС що шишннни 250 (Хе) | !
ЗЕоТб КО сеБКг вові тт
ОВ (хотів) 282(Хоїг) | | !
ЕОР МО: ІСВЕЗ ХЯБЕРТ 283 (Хот)
ЗБОЮ МОЯ МСС (рюмтови вв вАвусов КАВОВА
ММООКРОКАЇРКТЇ ГУСАВВОВОУРЯНРЗОВОВО
ТОЕТІ ЛІЗУСОРЕОБАТУУСООУУ5ЕРТТЕСОСТК ми і і і
ВЕОТБ'яО ун | ЕУОГІЕЗОССІ МОРОЗІ ВІ ВСЛАВОВТЕЗВУАМ (зе | БЖУВОАРОКОГЕЖУЗУТОАУОВЕТУХРОВУКО
ВЕТІЗВОМЯКМТІУТОММІВАЕВТАУУУСАВМ
ОПЕСЕОГУСОСТІ УТ і
БЕ МО ІДНКУВ | АТАТССАОАТОАСССАСАВССССАОСАОСОСТ 286 ! САЙСОССАОСОТОБОСОАСАСАСТаАССАТС
АССТИатсвобссАОССАОООСАТСАОСААСТО
І бСТаОССТОабтТАТСАОСАСААОСССООСААцЮ
СССОСААОСТОСТОАТСТАСВОСОССАОСТСС
СТОСАСАССООСОТОССААОСАОАТТСАОСОС
/ САВСООСТССООСАССОАСТТСАСССТОАССА
ТСАОСАСССТОСАССССОАООАСТТСОССАСС
ТАСТАСТОССАОССАЧТАСАОСАОСТТССССАС
! САССТТОВОССАСООСАССААООТОВАЛАТСА
БО МОЇ | ДВКУПО | бАбОТОСААТТОСТОВАААССООСОбАСОССТ їн | ЄбтосАбССТОССОбСАОССТОАВАСТОТСТТ
ОСБССОССАВСООСТТСАССТТСАОСАОСТАЄ
ОССАТОАОСТОвОТССОССАООССССТИОСАА
ПОбБАСТОПААТОВОТОТОССТОАСАООСОССО "ГБОВСАОСАОСАСЄСТАСТАССОСВАСАОССТО
АКЦОПаССООТТСАССАТСАОССОВИАСААСАЄ ! СААОААСАСССТОТАССТОСАСАТИААСЛОСО
ТОСОБОССПАООАСАССОССОТОТАСТАЄТОТ
5БО ТО МО: ж пн пос Ого Кос сстен ! : | ВОбОССсАаСасСАСССтоатсАССютТСАОсСтТСА зЕбтбх Ной БібМтОвРЕВі Ав орі СК АКОСіЕкЖтх пз І капмас | УУООКРОКАРКІУСАЗВІ ОБОУРЗКЕЗОВО8О с лейюг ТОЕТІТІЗХГОРЕОТАТЖСОСУЗЯРРТТЕСОСТЕ : | МУЕІКЕТУААРУУЕТЕРРУВЕОЇ КЗОТАВУХУСТІММ
ЕХРЕБАКУОМКУДНКСОВОМОК5УТЕОЮВЯКРВ
ТУВІЗУТЛІЗКАВУЕКНКУУАСЕУТНОСТ 557 : | ТК5ЕМЕОВС
Т5БО Бо вікні що |нодинфлнанйнікниніноці ! явицюстОі С ЄМУВОАРОКОСПУУУТОАМОВУТУХРОВУКО
ВЕТІХВОМ5КМТІ КОМІ КАБОТАХУХСАН ! ООЕСКОММООСТІУТУВЗАВТКОРУУВРЕАРЯВК.
ЯТВСОТААКИСІУКОЖЕРЕРУТУВИМЯЧА ТВО
! УНТЕРАУТОВ5О1 У5І58УУТУРЗВВІЯТОТУЮМ
УМНКРУМТКУТКЕУВЕРЕВСІЖТНТСРРСРАРЕЦ,
ОПОРЕУКЬЕРРКРКОТІ МІЗЕТРЕУТСУУУ УНН
НИКА
УУЗУЇЛУГНОБЖМІ МОКЕУКСКУЗМКАМРАРІБК
"ТвКАКаоР ЕК ПЛЕВАЕМТКМО Мт
УКОРУРУВІАУЕМЕЗМООРЕММУКТТРЕМІ ОВО: і :
О5ЕБЕЛВКУТАУ ТКУ ВОСКУРЕСВУМНЕАТИМ
НУТОКТІ ВІЗОК ма пиши она
Ебтко тевЕі ЗБЖАМЕ ОО
З90їКебогу і
ЗОШ МО: НСКУ 1 МТОАУОЄВТУУРОЗУКО 0000 291 (Кебет)
ОО ТИ поп
Еотвхоневів" став 000 292 (Кебої)
Н 3 зму ГО ВАБОСІВММА ТТ 293 (Кеботі | І
Й Н , зоівно пою яЕЕЕЕЖТТТТТТТТТТТТТТТТТТ под(Кебот «ВОІВ КОЇ СБ ДОХБЕРТ 0000 з95(Кебог
ШИ ши шшшншшишш 5ЕОТО МО: 296 НСД СеттеБу (Хоїїв) ! : і евотвкос Те УА АЖ 297 (Ховів)
ВЕОІВ МО вовк вони 298Хотіа) ! /5Бо п МО: Ток 5ОСЕМУ ни г 2994Хочів) ' воно Тер 7 ІшШш і 300(Хотіа) (яко юс р ние: пр
І З01Хото | | : як Пб-КО: 302 ННЯ ВІОМТО5РУВІ ЗАЗУСОВУТИСВАБОСТМНМ.
Гве й За УЮ ! и) З 5ЗА АБО А: ! | | МЖООКРОКАРКІЛТУФАЗВСО5ОУРЕВЕЗОО5И ! .ТОЕТІІ5ВІСОРЕОРАТУХСООХУВЕРТТЕООЮТК. хв : ввів ЕМОСЕСОООГУОРООВІ ВІ ЗСЛАБОКТЕЗУЖАМ 303 | УУУКОАРОКОТЕМУУЄУТОАУСОВТУУРОВУКО ше ши. пнншншшшшнишн
СО А
0 ТВЕПЕКОМУКМТІ УПТОММВІКАБВТАУХУУСАВМ
ОБЕОКОРМООСТІЛТУВ
ЗБОЮ МО: ДНК УЮ | бАТАТОСАСАТОАСССАСАОССССАОСАОССТ зо4 ГБАССОССАОССТОВОСОАСАСАСТИАССАТС
АССТОТСОООССАОССАОООСАТСАОСЛАСТО
ОСТООССТООТАТСАОСАСЛАОСССООСААОЮ
ЕССССААбСТОСТОАТСТАСОССОССАОСТОЄ
СТОСАСАССОССОТОССААОСАВАТТСАОСОО
САБСПОСТОСООСАССОАСТТСАСОСТОАССА
! ПСАССАВССТОСАВСССОАОСАСТІСВОСАСС
ТАСТАСТОСОЛОСАЄТАСАОСЛОСТТССОСЬС
"САССТТСПОССАСООСАССААВОТОВАААТСА ж
ЗЕотехог ЛИТИХ ожоотосАх тост осняое вес Жевост, (305 | дотосАосстаасооСАООСТаАСАСТОТСТІ осассоссАОСООСТТСАССТТСАОСАОСТАС ! | оссАТОАОСТООСТООбОСАВОССОСТООСАА
СОСАСТОСААТОВОТОТОСОТОАСАВОСОССО
" ТОВОСОСААССАССТАСТАССССбАСАОСОТО
АЛОВОССООТТСАССАТСАОССВОВАСАЛСЛО
! | СЛАОААСАСССТОТАССТОСАСАТОЛАСАОСС осопосеоловасАОСВСтВ ТТ АСТМИ " ООСАВАТОССОСОАСОАСООСТТООАСАТСТО
ОСОССАСООСАСССТОСТСАССОТСАОСТСА
ЗНОТБ НО внию ВІОМ'ОВ ВВА ОВК ХВОСТИ 06 | кашоа- | Ж УООКРОКАРКІУСАВВ О8СУРВКЕВОВО8О яанщюк | ТОРТІЛІВВІОРЕОКАТУУ СОУ ЗЕРТТВООСТ. "МВІКЕТУААРБУЕІЕРРЗОРОГКеСТАЗУМСТ ММ
РУРКРАКУОЖКУДНКІ. ОВО МОЗ УТЕОЮУКОВ
Шо Що ТУБІЗ5ТІЛІЗКАВУЕКНКУ АС БУТНОСІ В8РУ
ГЇБЕОЇВ МОЇ о ОблаєвАт ЇЇ 0000 і і Й : шини ГІТКЯРМКСВС ни
ГУБО1Б МО 30 инші ВИК КОВВг ВВ КЕ ААЕОЄКНЕЕАН
Н НИ й й . . ! ланрогІнб1 УЖ УВОАРОКОМЕЖУВУТОАУССВТУУРОВУКО ! | КЕТІЗВОМЗКМТЬУТОММВІВАБОТАУХУСАВУ
ЗОБСКОГУСОСТІУТУВБАВТКОРУУР АРОВК
ВТВОСТААОСТУКОУРРЕВУТУВ ЖВАВО
"УНТЕРАУТОВ5СЇ НУ УТУРЗВЯІ ОТОТУСМ
УМИКРЕМТКУПКВУЕРХЗСЮКТИТСРРСРАРВИ, "ОбехУРІЕРРКРКОТІМІ5ЕТРЕУТСУУУВУЗНЕ пееУкекжУУОЄУВУВМАКТКРВЕВОУМТУХ :
УУВУТЛ УМОВІ КОКВУКСКУВМКАТРАРІЕК
! | "ТІЗКАКООРВЕРОУУТЕРРЕВРЕМТКМОУВЬТСІ,
УКОРУРІАУЕМЕМСОРЕККУКТТРРУЦВО
О5ЕЕСУЗКІТУРКЗАЖООСМУВ5СЗУМНЕАТНМ !
НУТОКВІЗЕЗРОК ши нина НН нн
МОВО
КК і
І
(аБо т КО: -сбкі ГВЖАМ5 308 (Кебот) | ЄБО МО: ОО |НОрю УТОАМОКВТУТРОБУКО г 309 (Кебот)
БОЇВ МО: ОІНСОКО звовветатт 310 (Кебоз) : :
ГевОїО мо: ІСІ ВАЗОбІЗМ АГА
ЗМ (Кебот) | !
ЕоіБно ПЕВ в
ЗЗ(Кобою | І ни ишнншшнииишшшиншн й МО: | обсть А 550 мхосов ТД 000 Й
ЗІЗ(КебУЮ | ! .
ВБО ОКО: НСБ 0ОФОБТ55У 000
КУ (Хотів) | !
ЗОШ МОЇ НС "бАМОК315 (Хотів)
С8БО1О МО: 1 НСОВЗ | мСОБОКОЇ ребе : ее ви т п зізохетву
ВБОТВ МО: ОБ жи
ЗІв(хотій пи о ду
ВОЮ МО: СВ УСРРзіб(Хотів | !
І5БОїЮ МО: ме У 0000 ТОЮМТО5РЯВІЗАБУСОВУ ПТСВАЗОСІВМУКА
ЖУООКРОКАРКІ ЛУ САУ О5ОУРЗВЕВОВОВО
ТОЕТІ ЛІВ ОРЕОРАТУУСООУВВЕРТТРООСТК
: УВК зов 1 БОГ БОС ОБОВ ВСААУСЕТЕВВУАМ
Гзл | ЗМУКОАРОКОЇ ЕЖУЯУТОАУОКЕТУУРОЧУКО
ЕРТЕЕВОМЯКНТІ ЛІ ОММВІЛАБОТАУТУСАВ аовОогогудОстіутує
СВВОТЮМО: ДНК 0 ППАТАТОСАСАТОАСССАОАСССССАОСАВССТ )
Із» | влососслосотовосоАсАолото ССО ! / АССТОТСПОбССАОССАССОСАТСАВСААСТО : | | астоссстостАТелосАСААССССООСАЛОЮ І : | СОСССАЛОСТОСТОАТСТАСОВСОВССАОСТОС зво МО: 0 ГОбласть Ат і нини ни ЄТОСАОАОСВОССТОССААОСАОКТТСАОСОВ
САЙСООСТОССОБСАССВАСТТСАСССТОАССА ї ТСАОСАООСТОСАВСССОАОСАСТТСОССАЄС гАстАСТОССАССАСТАСАССАОСТТОСССАС
САССТТСООССАСООСАССААССТОВАААТСА
(юю
ВИМИ ИН ПИ
ГБО ШКО ОДНКУА | бАОСТОСЛАТТОСТОСАААОСОВСООАВОССЇ (33 | /" ОСТОСАОССТОВОООСАОССТОВАВАЄТОТСТЬ ! ососсоссАОСООСТТСАССТТСАОСАЮСТАС оЄсАТОАОСТОЯОТОСОССАСОССССТООСАА
ЗОСАСТОСААТОСОТОТССОТОАСАООСОССО
' | | ТОООСААЛАОСАССТАСТАССССБАСАОСОТО : АЛОСОССОСТТСВОСАТСАОССООВАСЛАСАО слАФААСАСССТОТАССТОСАСАТОААСАОСС
ТИСОппОСОАОСАСАССОССОТОТАСТАСТОТ ! | ї ОССАСАТОООСССАСОАОООСТТССАСАТСТО
ОООССАООСАСССТООТСАССОТСЛИСтТСА
БОБ МО ясен 7 ВІОМТОВРЕВІ ЗА ВУЄ В СКАВОСІЕМИХ ззА капна- | ЖУООКРОКАРКИ ЛУ ОАВЗ5 ОО УРЕНЕВОВО5О ланцюг | ТОРТІІ5ЄДОРЕОКАТУУСООУВЕЕРТТЕСОСТЕ
УВІКЕТУААРЕУ ГЕРХ ВВОГ КВОТАВУУСТИММ
ЕУРАБАКУОУКУДНКІ ОВаМВОКВУТЕОЮВКОВ ; іТУ5ІЗМІЛІЗКАВПУЕКНКЕУХАСЕУТНОСТВВГУ
ТКБЕМАОВС
Н
І ЗБОЇБМО 55 Вижий С БУОГІ КОСІ ТОРОВВЕ ЕСААБОЕТЕЕТАК заншог Іс БУЖУВОАРОКОТЕМУВУТОАХСКУТУУРОУКО
ВЕТІЗКОМУК НТ УОМКВІВАБОТАУУУСАЮХ врБовргУсОЄтіУТУВЕАВТКОРВУЕРІАРЯК : | | УТеСОТААІОСЬУКОХЕРЕРУТУЄЖМВОАЬТВО й Що | УНТЕРАУОВВОМУВІВ5УУ ТУРБОТОЮ
ЗБОЇВ МО: Область; р од юн п о нн
ОСТУМВКРУМТКУПККУВТЕЗСВКТНТСРРОРАРНІЇ,
ЗаРБУВКІЕРРКРКОТІ МІ5ВТРЕУТСУМУВУЗНЕ
ГрРЕУКРМЖУУВОУВУНМАКТКРВРКОУМЕТУВ ! УУУЕТУ НОВУ МОКЕУКСКУЗМКАЇ РАРІЕК /"ТІВКАКООГВЕРОУУТІ РРОДЕЕМТКЕМОУКЬТСЬ. ; /" УКОБУРБОІАУЕУВВМСОРЕММУКТТРРУТОВО
І О5ЕБІУВКЕТУ ВКА ЖОООМУРВСЗУМНЕА ЯК
НУТОКБІ ДІРОК і дн тв пою
МОВІ т дФаецеп 556
І.
БОЮ | НСБ ЯЖАМУЇО000 / 3264Кебот) нн нн ши ше
ЗБОЮ МО ВСрЮ | УТОАУСВТУХРОБУКО 327 (Кебот) ! бін Небі обЕЕВИ : !
Зо8Кебот)
Н
ПИпии и и по оо
Зоо СВК "КАБОСІЇМАУ ТА 399(Кебот) шини
ГеБОТВ Мо: Ср ГЕАБЕГОВ ! ' 3304 Кебот) ї р
ГЕБОБ'МО: їебіц ГООУБВЕРТТ !
І ззі(Кебах)
ПОМ Пн Пн
ГЕО Ю МО: 332 НСОКІ 0 ОБІР55У : (Хотів) | ' в Я !
МА ми Я НА В и В НН /8БОТЮМО:333 | НОСОК | САУ ! і |й 1
Ту Н ! (Хобі) нн нншишишшишишнии
«БО ШО МО: Область Ат рт
І
ЗВО МО НеБв СТ ЖебБо 000
За (Хопа
БО Ю МО: (сові ВОСКУ тт мб ' ! і вБОТМО: об БА. -- т т
З36(хотів) на по В нн 5БОТО МО; 1СОВа | УВВЕРЕ 337 (Хотів) ; | !
БЕФІБ КОЮ У С ТЮМТОВМІ ВАВУВОКУТИСИАВОСІВКА і і і ЖХООКРОКАРКТ І ЖОАВВІОВОУРЗКЕКОВИВО
ТОЕТІЛІЄВСОРЕВРАТЖУСООХЗБЕРТТЕСОСТК: ! | чек
МИ ПН ИН
І5ЕОО МО: С ГУН КУОІТЕКОООГОРоВі Ж СКАВОРТЕВЕУКК (339 БА УВОАРОКОТЕЖУВУТОСАУСЕТУУРОВУКОВ
РТІЗВОМЕКМТІ ОМ КАВОТАХУТУСАВИО
ПЕСЕОГУСОСТІ УТУ5У
ЕОїБно ДНК ОАТАТССАОАТОАСССАВАОСОССКОСАВССТ 340 | САОСОССАССОТОО ОСА САСАИТОСАССАТС І
АССТатеовоссАаСсАОООСАТСАОЙСКАСТа ! | ОСТООССТОСТАТСАССАСАЛОСОСпОСаААСО
ССОССААаИСТОСТОАТСТАСОИЬСИИССАОСТОС
СТОСАСАбСОбССТОССААССАВАТТСАОСОоВ "аогооСтеспосАССОАСТТСАСССТОАССА
ТСАОСАВССТОСАОСССОАОВАСТТООССАСС
: | ТАСТАСТаССАССАСТАСАССАССТТССССАЄ
СслОСтТОООССАОЗОСАССАЛОСТОВАЛАТСА ше
БОтно: ОДНУ О олОбТОСААТТОСТОсАААОСВОСООАНОССТ пп ПО По
ВО КО: фббатАТ дет есе овех вето еТете ососсоСсАССООСТТСАССТТСАССАОСТАС
ОССАТОАОСТООСТССОССАСОССССТООСАА
ООСАСТОбААТОСОТОТССОТвАСАвОСОССС
ТОПОСАВААССТАСТАСССССАСАССОТОААО
! БОССОСТТСАССАТСАОССОООАСААСАОСАА
ГОААСАСССТОТАССТОСАСАТОААСАОССТОС
Ї вбоссвАОВАСАССОСОСТОТАСТАСТОТОСС
АСАТОбСОСОАСОАСООСТТСОАСАТСТОВОО
СВАбОбСАСССТОСТСАЄСОТСАОСТСА "БЕОТО МО: Легкий і ВІОМТОВРЗБІ ЗАВУСОІЕУТІТСВАВОВІЇМАИЬА і343 | каппа- | ЖУВОКРОКАРКІГГУСАЗВО5ОУРЗНЕО5О8О ланцюг ТРЕТІ ЛІВ ОРЕОБАТУУСОВУЗВЕРТТЕСОСТЕ
УВІКВТУААРУУВТЕРРЗ ОВО КЕСТАБУУСИММ
ЕУРАРАКУОЖКУДНКЕОВОМОВВУТЕОЮЯКИВ
ТУВІЗ5ТІЛІЗКАОТЕКНКУУАСЕУТНОСЇ БЕРУ
ТКБЕМВСВС
ЗВО МОЯ видні РКОТСЕВОСГ ХОРОВЕ КВЕБЕК ланнює ОЇ | ЗМ УВОАРОКОТМЛУУВУТСАУСВТУУРОВУКОЕ
РТТ5ВОМУКМТІ У СОМ КАБКОТАУТУСАВУО
ВеокОгцеєт у УКБАВТКСРЕУТРЕАРЕУКЕ
ТХОСТААЦОСІМКОУЕРЕРУТУЗЖМБОАЦТОУ: : | І! НТЕРАМІОВ5СІУБІЗ5УУТУРЗЗБЕЯТОТУІЮСМУ
МНЕРЕМТКУРКЕУВРКХСОКТНТСРРОРАРЕНО
СРБУРІЕРРЕРКОТЬМІВЕТРЕУТСУУУВУВНЕР
РЕУКЕМУУХУОСУЕХНМАКТКРАВВОУКВТУКУ
УБУТЛУБНОВУТМОКВУКСКУЗМКАЇРАРІВКТ
ІЗКАКООРЕБЕРОХУУТІРРЗВКЕМТКМОМЧТСТУ
! | КОКУРЕЛІАМЕУВЯМООРЕММУКТТРРУТО5ОС8
МИМИ МИ сснненнннк
/Бво Ю МО: | Область Ат : "ГУТОКВІ ВІ 5РОК пиши нн Пн і: МОКІ12609 ! : еебтбхютя небю З УдМЕ й 'ББОЮ МО: 345 і НСОВО УМО ОУТТЕТАрЗУКа ! і т Х з ЩО ково)
ЗО МОгЗа6 НСКУ 0 ЖаОБОВОЇ 00000 І (Кебої) Й ;
ЗБОЮ МО 347 ЦЄІ, ун (Коботі вотвночи те ние т нин г Н Н (кебої). о ІБ МО: 349 1СВАЗ /ОоуБвиТІ І і (Кевої) Й шин нев: Тай 00000 осн
ГзЕО то Ме: з НеВК "Тнагоут й
ГЕРОЇВ МОЗ НерЕУ 001 ЖОоБЕеВ 0000000 хотів)
Гео п МО: 333 | СОМ ЗОБУ (Хотіа) піл І НО ен у ен ен нн цу Я
Г5БО1О МО: 354 СОЮ оба их : ! уохона)
Ї. одн т дод І "ВЕОО МО: 353 СОЮЗ | УБЕЕРТ і паші о ой ПЛ соня нини пон
Р Ммхжккмкиловалвюютннск
УУДОКРОКАРКИТУСАВЕТОБОУРЗКРОВОВО
' | третстІкеТ ОРЕОГАУУУСООУЄВЕРТТКОЮОТК увік
Фів У ОУОИВОООІХ ОРВК ВЕРН | | МБУУВОАРОКОГ ЕМ УВУІМОТОУТТЕТАрВУК "ОБЕТІЗВОМБКМТІ УКОММБІВАКОТАМУУСАВ С ! І мОСрЕОРІУСОстьУтТУВВ пиши шини "ВЕбіВ МО: | ЙНКУЄ ОО БАТАТОСАСАТОАСССАбАОССОВІСТАВОСТ 358 | ОАбСОСОАОСОТООСТОАТОСТОТОАССАТТА
ССТОСАОАОСОАОССАОООТАТТІСТААТТОСТ
СТООСТТООТАССАОСАСАЛАССАОСТАЛАСС
АСсбАААСТАТТААТТТАТОСТОСТТСТІСТТТ
ОСААЛОСООВОТОССОТСССОТТТТАОСОЮСТ
СТОСАТССООСАСТОАТТТТАСССТОАССАТТА
ГОСАОССТОСААССТОААОАСТТТОСОСТІТАТ
ГАТТОССАОСАСТАТТСТТСТТТТОСТАСТАЄС
: ТТТООССАОООТАСОАААСТТОАААТТААА шшшшш нших
ББОЇЮ МОЇ ІДНКУНО 1 САБОТОСААТТОбСТОвАЛАССТОСООСОВОСТ, 359 | СТ ОСААСОССИИИСООСАОССТОСОТСТОАОСТ
ГОСОСООССТОСОбАТТТАССТІТАОСАССТАТ : | | ЯСОБАТОАОСТОООТОСОССАЛОССОСТОСОКА
ОСОТСТОСАСТОООТСАОСОТТАТТААТООТС і тОсттАТАСТАСТТ ТТ ТАТОСТОМЧСТОЮТА
АСОСТСОТТТТАССАТТТСАССТОАТААТТСВА
ААДАСАСССТОТАТСТИСАААТОАЛАСАСССТО
СОИТОСОВААСАТАСОСССОСТаИтАТТАТТОСОС 00010 жопожюююкюооютомьтиоое
ЕК бе! нини рьстькссвм щ тш Ех 360 | капа» | ЖЖООКРОКАРКТ ОА СОЗОУРЗВЕВО5ОИ5О лаклює ТОЕТЕТІЗ5РОРЕРЕАУХУСООУ5ЯЕРТТЕООСТЕ.
УВІКАТУАаРЕУНЕРРБОВО КВОТАВУУСТ ММ
ЕУРВБАКУЄЖМКУДНКОКБОМОБХУТвОЮВК ОВ ! ТУВІЯВТЛІЗКАВУЕКОКУТАСЕУТНОСІ ББРУ
ТКБЕМКОге
Ши яаншог ТО | МУЖУВОАРОКОГЕ МУ УЗУЇМОГ СУТТЕХАРЗУК
СВЕТІ5ВОМУКМТЬХ ТОМІВ АВОТАМУУХ СА,
МЖООБСЕВЛМСОСТІ А ТУВЗАЗТКОРЕУЄРІАРЯВ
КУТУООТААЦОСІЛКОУЄРЕРУТУУМУСАСТЯ
СУНТЕРАУТ ОВУ ВБУМУТУРВБІ СТО ТУ
МУМНКЕРУМТКУВКАХЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕ
МСООРБУВІЕРРКРКОТІМІБАТРЕУТСУУУВУЯ
НЕОРЕУКРИЖ УУДСУВУНМАКТКГА ВО УМЕТ
УВУУЗУМ УСНОЮ МОКЕУКСЕУЯМКАЇ АРІ
ЕКТІЗКАКСОРПЕРОУУТІ "РЗАВЕМТКМОУВІТ
СІУКОРУРЗТАХВИУВМОСОРЕММУКТТРЕУЦОВ
РО5ЕРСУВКІТУРКУВМООСМУРЗСЗУМНЕА СН
МНУТОКІ5ІЯРОК тв НН нин вчи НСОКІ ОО О15УАМБ нин 363 (Кебот)
Уа шко. ша хе (Кебох) ни шини пи бокова нев /ЖОБЕОКОЇ
ГВЕОТОМО: о ГОбляєть Ат | нин
Н 1 миша Не ПО в
ГКебею ! і і
Ї протя тюки к кт о о он пн в в и "5ЕО1О МО: 365 1СОКІ 7 ВАВОСТІЯММА (Кебот)
ПОКИ ПИВ ПОН
Г5ЕОТО МО: 366 ПСОЮ САВВЗГОВ ! і /(Кебот) | Ї ! | ! "ББОї МО Зб 1СбА ОДУ 0000000
ЩІ ! ! (Кебоз) !
БО. ші В и І ! ! (Хотів),
МИ ОН НА НА НН
ВБОТБ МОГ 36 "нер г бБтов ; (Хотів) ! ! ! 4
Г8БО Ю МО: 370 |нсою п нан (Хотій)
Ї. чт пи
ГЗБО1О МО: зл пов ії Об
Н ї і і (Хотіа) | і і ! ; !
ВОЮ КО: 17 Іс ТолВ : (Хотів)
І : і
Ж жетон мн ав инн ин шо и ие и ЗА
БКОО МО: 373 Г1СОВ3 і УЄ5ЕРТ 1
І! (Хотів) ! ! на а
Г5БОТО МОЗМ ГРЮМТОБРУВІБАВУСОКУ ТТ СНАВОСІВМСА і | | ЖУООКРОКАРКТІТУСАВВГОЗОУРЕВЕВОВОВО
ТОРТІЛІВБІОРЕОКАУУУСОЮУВЕЕРТТРООДТК
ГУК !
Кеті ПНО З ВЕ
Г5ЕОТО МО: УН ГОМОГУвВОВа МОРС АЗСААВОЕТЕВЯУА 375 | | МЕЖМУКОАРОКСІЕЕЖУВОТОРУОСТУУРОВУКО ї ! -к ер ; зер
ПИ НН інно
БОЮ: обсте нн пиши сн
ЗЕбІБКО ДНЯ ОАТАТССАСАТВАСССАОАОСССОТСТАОССЇ зте і вАОСОССАОСОТОООТОАТОСТОТОАССВТТА
ССТасАСАСОСЛОССАООСТАТТТСТААТТОО
І. СТООСТТОбТАССАОСАВААЛАССАВОТАААОС , | АССОАЛААСТАТТААТТТАТОСТОСТІСТТСТТТ
ГОСАААОСОСОСТОССОТОСОСТТТТАОСОЮСТ
СТОСАТССООСАСТОАТТТТАСССТВАССАТТА
ОСАЛОССТОСААССТОЛАСАСТТТОСОСТІТАТТАТТОССАОСАВТАТТСТІСТТТВСТАЄТАСС
ТІТОбССАДОСТАСВАААСТІСАААТТАЛА І вфвної ОСІДНКУНО | САООТОСАЛАТТОСТООААЛОСОВСОССООССТ ри | ботасААССЦОССВОСАОССТОСОТСТОАОСТ
ОСОСООССТеСОаАТТТАССТТТАОСАОСТАТ
ОССАТОАОСТОбИТОСаССААВССССТОВОАА
ООСТСТСОАСТООСТОАОСбОТАСТОСТОСТІ
АТООТОСТАСТТАТТАТССТОАТТСТОТТААОО
! | ОТСОТТТТАССАТТТСАССТОАТААТТСИААЛА
АСАСССТОТАТСТОСАААТОДАСАОССТОСОТ
ОСОбЛАСАТАСООССОТОТАТТАТТОСОСОСО
ТТООбОТОАТОАООСТТТТОАТАТТТОВООСС
ААСИСАСОСТООТОАСОСТТАОСТСА
Іевотвне леж РІОМТОБРЕБІ ЗАБУСПВУТІТСВАВОСІВМУТА 378 канна. УЖООКРОКАРКІ ТИСА ОВОУРЯВЕВОВОВО і Ї ланцюг ТОРТІ ПІЄВІОРЕОВАХУТУСООУВУРРТТКООСТК /УБІКВТУААРЯУВІЕРРЕРВОГСКУСТАЗУУСИ ММ
ЕУРЕВАКУОСМКУДНКООБОМеОвБУТЕОВКОВ
ТУВІЗЕТІТІЗКАПУВКИКУТАСЕУТНОСТ ВБР тквуМКОве
КО ПА в ЗАВ НИ А ин
БО Мо: Область Ат й ши "ЕБОТ КО Я ВШ 7. внесення, ханцюг ис МУЖУУВОАРОКОЇ ЕМУЗОТОРУСОТУУРрЯУКО : ВЕТІБВОМЕКМТУГОММІВАВОТАУТХСАВМУ
ООЕСЕОТУВОСТІУТУ5ЗБАБІКОРУУКРІАРБЕК
ЗТ5ООТЛАБОСЬУКОУЕРЕРУТУВ УМОВИ : УПТЕРАУГОВБОЇГУВІ5БУУТУРБЕЦОТОТХСМ : УМНЕРУМТКУрРКЕУЕРКЗСОІКТНТСЕРСРАРЕНІ, : СОРКЕУВІЕРРЕРКОТЬМІ5ВТРЕУТСУУУВУВНЕ
ОРЕУКЕМЖУУВОУВУНМАКТКРАБЕОУМВТУХ
! УУВУЦТУБНОВЖСМОКЕУКСКУВМКАТРАРІЕК і ТІАКАКОСОРВЕРОУУТІРОВЕЕМТКМО Уч ТС,
УКОЕХРЕТТАУЕЖЕЗМООРЕМКУКТТРРУЦОВО
О5РРІУБЗКІТУВКВАЖМООСМУКУСУУМНЕА ТИМ
НУТОКВІ І ХРОК,
Інші антитіла, запропоновані у винаході, являють собою антитіла, у яких амінокислоти або нуклеїнові кислоти, що кодують амінокислоти, піддані мутації, але послідовності яких ще щонайменше на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 і 99 95 ідентичні послідовностям, представленим у таблиці 71. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу вони включають мутантні амінокислотні послідовності, у яких не більше 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислот у варіабельних областях були піддані мутації у порівнянні з варіабельними областями, послідовності яких представлені в таблиці 1, при цьому усе ще зберігається їх практично така ж терапевтична активність.
Оскільки кожне/кожний із зазначених антитіл або їх фрагментів може зв'язуватися з НЕКЗ, то послідовності МН, МІ, повнорозмірного легкого ланцюга і повнорозмірного важкого ланцюга (амінокислотні послідовності та нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності) можна "змішувати і сполучати" для створення інших зв'язувальних НЕКЗ антитіл, запропонованих у винаході. Зв'язування з НЕКЗ зазначених отриманих у результаті "змішання і сполучення" антитіл можна оцінювати за допомогою відомих у цій галузі аналізів зв'язування (наприклад, ЕГІЗА та інших аналізів, описаних у розділі "Приклади"). Коли ці ланцюги змішують і сполучають, то послідовність МН з конкретної пари МНЛ/І. слід заміщати структурно подібною послідовністю УН. Аналогічно цьому, повнорозмірну послідовність важкого ланцюга з конкретної пари повнорозмірна послідовність важкого ланцюга /повнорозмірна послідовність легкого ланцюга слід заміщати структурно подібною повнорозмірною послідовністю важкого ланцюга.
Аналогічно цьому, послідовність МІ. з конкретної пари МНЛ/І. слід заміщати структурно подібною послідовністю МІ... Аналогічно цьому, повнорозмірна послідовність легкого ланцюга з конкретної пари повнорозмірна послідовність важкого ланцюга/повнорозмірна послідовність легкого ланцюга слід заміщати структурно подібною повно розмірною послідовністю легкого ланцюга.
Таким чином, одним з об'єктів винаходу є виділене моноклональне антитіло або його фрагмент, яке/який має: варіабельну область важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність, обрану з групи, що включає ЗЕО ІЮ МО: 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357 і 375; і варіабельну область легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність, обрану з групи, що включає 5ЕО ІЮ МО: 14, 32, 50, 68, 86, 104,
Зо 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356 і 374; при цьому антитіло специфічно зв'язується з НЕКЗ (наприклад, людини і/або мавпи циномолгус).
Іншим об'єктом цього винаходу є НЕКЗ-зв'язувальні антитіла, які містять СОКІ, СОК2 і
СОМКЗ важкого ланцюга і легкого ланцюга, представлені в таблиці 1, або їх комбінації.
Амінокислотні послідовності СОКІ1 МН антитіл представлені в ЗЕО ІЮО МО: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 і 368. Амінокислотні послідовності
СОР МН антитіл представлені в 5ХЕО ІЮ МО: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 і 369. Амінокислотні послідовності СОКЗ МН антитіл представлені в ЗЕО ІЮ МО: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 і 370. Амінокислотні послідовності СОКІ Мі. антитіл представлені в ЗЕО ІЮ
МО: 5, 11, 23, 29, АТ, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 і 371.
Амінокислотні послідовності СОК2 Мі. антитіл представлені в зЕО ІЮ МО: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 і 372. Амінокислотні послідовності СОК2 МІ. антитіл представлені в зЕО ІЮО МО: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 і 373. СОМК-ділянки описують за допомогою системи Кебота (КаБбаї Е. А. та ін., Зедоепсез ої Ргоївїп5 ої Іттипоїодісаї Іпіегеві, 5-те вид., вид- во Ш.5. ЮОерагітепі ої Неакй апа Нитап 5егуісев5, МІН Рибіїсайоп Мо. 91-3242, 1991; Споїпіа та ін., У. Мої. Віої. 196, 1987, сс. 901-917; Споїпіа та ін., Мафиге 342, 1989, сс. 877-883; і АГІ-І а/ікапі та ін., У. Мої. Віої. 273, 1997, сс. 927-948).
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 2; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 3; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЗЕО ІЮО МО: 4; у варіабельній області легкого ланцюга СОМ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 5; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮО МО: 6; і
СОКЗ послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 7.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 20; СОК2, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 21, СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 22; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'1, послідовність якого представлена в ЗЕО ІО МО: 23; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮО МО: 24; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮО МО: 25.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
Ко) ІО МО: 38; СОК2, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 39; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 40; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'І1, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 41; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮО МО: 42; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 43.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 56; СОК2, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 57; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮО МО: 58; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'1, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮО МО: 59; СОК2, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮО МО: 60; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 61.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 74; СОК2, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 75; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮО МО: 76; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'1, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 77; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮО МО: 78; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 79.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 92; СОК2, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 93; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮО МО: 94; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'1, послідовність
БО якого представлена в ЗЕО ІЮО МО: 95; СОК2, послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮО МО: 96; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 97.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 110; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 111; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО І МО: 112; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ1, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 113; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 114; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 115.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО 60 ІОЮО МО: 128; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 129; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 130; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ1, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 131; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 132; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 133.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 146; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 147; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 148; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ1, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 149; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 150; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 151.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 164; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 165; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО І МО: 166; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ1, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 167; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 168; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 169.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІО МО: 182; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 183; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 184; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ1, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 185; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 186; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 187.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 200; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 201; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО І МО: 202; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ1, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 203; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 204; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 205.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
Ко) ІО МО: 218; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 219; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО І МО: 220; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ1, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 221; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 222; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 223.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 236; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 237; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 238; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ1, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 239; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 240; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 241.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 254; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 255; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО І МО: 256; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ1, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 257; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 258; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 259.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 272; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 273; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО І МО: 274; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ1,
БО послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 275; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 276; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 277.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 290; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 291; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО І МО: 292; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ1, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 293; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 294; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 295.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО 60 ІОЮО МО: 308; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 309; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 310; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 311; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 312; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 313.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 326; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 327; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО І МО: 328; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ1, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 329; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 330; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 331.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 344; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 345; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО І МО: 346; у варіабельній області легкого ланцюга СОКІ, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 347; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 3148; ії СОРКЗ послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 349.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить у варіабельній області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якого представлена в ЗЕО
ІОЮО МО: 362; СОК2, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 363; СОКЗ, послідовність якого представлена в 5ЕО І МО: 364; у варіабельній області легкого ланцюга СОК'І, послідовність якого представлена в 5ЕО ІЮ МО: 365; СОК2, послідовність якого представлена в
ЗЕО ІЮ МО: 366; і СОКЗ послідовність якого представлена в ЗЕО ІЮ МО: 367.
Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить МН, послідовність якої представлена в 5ЕБО ІЮ МО: 15, і МІ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮО МО: 14. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить УН, послідовність якої представлена в ЗЕО ІО МО: 33, і МІ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 32. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить УН, послідовність якої представлена в ЗЕО
ІО МО: 51, і МІ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮО МО: 50. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить МН, послідовність якої
Ко) представлена в ЗЕО ІО МО: 69, і МІ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮО МО: 68. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить МН, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 87, і МІ, послідовність якої представлена в 5ЕО
ІО МО: 86. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить МН, послідовність якої представлена в 5ЕБЕО ІЮО МО: 105, ї МІ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 104. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить УН, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 123, ї МІ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 122. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить УН, послідовність якої представлена в ЗЕО
ІЮО МО: 141, ії МІ, послідовність якої представлена в 5ЕО І МО: 140. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить МН, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮО МО: 159, і МІ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮО МО: 158. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить МН, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 177, і МІ, послідовність якої представлена в ЗЕО
ІЮО МО: 176. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з
НЕВЗ, містить МН, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮО МО: 195, і МІ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮО МО: 194. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить УН, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 213, Її МІ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 212. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить УН, послідовність якої представлена в ЗЕО
БО ІЮО МО: 231, ії МІ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 230. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить МН, послідовність якої представлена в 5ЕО ІО МО: 249, і МІ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮО МО: 248. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить УН, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 267, і МІ, послідовність якої представлена в ЗЕО
ІЮ МО: 266. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з
НЕКЗ, містить МН, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮО МО: 285, і МІ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮО МО: 284. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить УН, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 303, і МІ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 302. Згідно з конкретним варіантом здійснення 60 винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить УН, послідовність якої представлена в ЗЕО
ІЮО МО: 321, і МІ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІО МО: 320. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить МН, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮО МО: 339, і МІ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮО МО: 338. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, містить МН, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 357, і МІ, послідовність якої представлена в ЗЕО
ІЮ МО: 356. Згідно з конкретним варіантом здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з
НЕКЗ, містить МН, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮО МО: 375, і МІ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 374. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіла до НЕКЗ являють собою антагоністичні антитіла. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з НЕКЗ, являє собою антитіло, яке описано в таблиці 1.
У контексті цього опису людське антитіло містить варіабельні області важкого або легкого ланцюга або повнорозмірні важкі або легкі ланцюги, які є "продуктом" або "виведені з" конкретної послідовності зародкової лінії, якщо варіабельні області або повнорозмірні ланцюги одержують з системи, у якій як джерела послідовностей використовують гени імуноглобуліну людської зародкової лінії. Для створення однієї з таких систем здійснюють імунізацію трансгенної миші, що несе людські гени імуноглобулінів антигеном, що представляє інтерес, або здійснюють скринінг фагової дисплейної бібліотеки людських генів імуноглобулінів з використанням антигену, що представляє інтерес. Людське антитіло, яке "є продуктом" або "виведене з" послідовності імуноглобуліну людської зародкової лінії, можна ідентифікувати індивідуально шляхом порівняння амінокислотної послідовності людського антитіла і амінокислотних послідовностей імуноглобулінів людської зародкової лінії та відбору послідовності імуноглобуліну людської зародкової лінії яка є найбільш близькою за послідовністю (тобто має найвищий 95 ідентичності) з послідовністю людського антитіла.
Людське антитіло, яке "є продуктом" або "виведене з" конкретної послідовності імуноглобуліну людської зародкової лінії, може мати відмінності в амінокислотах у порівнянні з послідовністю зародкової лінії, наприклад, у результаті соматичних мутацій, що зустрічаються в природних умовах, або штучних сайтнаправлених мутацій. Однак у каркасних ділянках МН або Мі. амінокислотна послідовність відібраного людського антитіла, як правило, щонайменше на 90 95 ідентична амінокислотній послідовності, що кодується геном імуноглобуліну людської зародкової лінії, і містить амінокислотні залишки, які свідчать про те, що людське антитіло є людським, при порівнянні з амінокислотними послідовностями імуноглобулінів зародкових ліній інших видів (наприклад, послідовності мишачої зародкової лінії. У визначених випадках амінокислотна послідовність людського антитіла може бути щонайменше на 60, 70, 80, 90 95 або щонайменше на 9595 або навіть щонайменше на 96, 97, 98 або 9995 ідентична амінокислотній послідовності, що кодується геном імуноглобуліну зародкової лінії. Як правило, рекомбінантне людське антитіло повинне мати не більше 10 амінокислотних відмінностей у порівнянні з амінокислотною послідовністю, що кодується геном імуноглобуліну людської зародкової лінії, у каркасних ділянках МН або Мі. У деяких випадках антитіло може відрізнятися не більш ніж на 5 або навіть не більш ніж на 4, 3, 2 або 1 амінокислоту від амінокислотної послідовності, що кодується геном імуноглобуліну зародкової лінії. Різні отримані з зародкових ліній версії з використанням послідовностей зародкової лінії МН і МІ для репрезентативної кількості антитіл до НЕКЗ представлено в таблиці 2, де нумерація відповідає системі Кебота.
Положення СОК виділені жирним шрифтом. Умовні позначки, застосовані в таблицях для послідовностей зародкових ліній, являють собою: МОН10701-МН 3-07 позначає СОК-петлі
МОКІ10701 у каркасних ділянках послідовності зародкової лінії МН 3-07 (номенклатура згідно
Мразе), МОН10703-УК 11 позначає СОК з МОК10703 у зародкових каркасних ділянках з УК 11, де МК позначає легкий каппа-ланцюг.
Таблиця 2: Різні отримані з зародкових ліній версії відібраної групи репрезентативних антитіл
ВБОЇЮ о Познажння 001000 ; Амінокислотна послідовність
МО: послідовності
УН-облаєть
МОКІвтві
КО ГЕУОЇГАВОООТУОРОСЗЕВІЗСААБОВТКЯВУаМЕ
МО: 380 0 МОВІОТН-УН 3- | МУВОАРОКССЮУУАУТСАУСВВТХУУРОЗУКСВЕ 07 ТІЗВДНЕКМВІ М ОММБІЖАВОТАУУУСАВАСЮЕ ! ОК
СВЕОІВ С ТБУОІМВВООБІУОРОВВІВІ ЗСААВОВТКОВУАМО
(МО: 38І МОВО УН.З. УУВОАРОКОЬЕМУВУТОСЛУСИВТХУУРВУКОВЕ 09 "ТПЕКДВККМВЕ У ОММВІКАЕОТАСУУСАКМСВЕ сер
БОЮ ГОМОЇ МЕССІ УКРООВІ ВІ ЗСААБОКТЕЯ5УАМЕ 1. й : Я : - . (МО: З 0 МОВІФІ-УН 3 МІВОАРОКОГЕЖУВУТСАУЄВУТУУРОВУКСНЕТ
І / 15ЕДЕККМВІ МІОМІ КАВОТАУУУСАВУЄВЕС в
ВО "ЕУСІМЕ5ООСІУОРОСВІ КІ ЯСААВОРТЕЗВУАМХ
МО: 383 |МОВІЮІ-УН 3- / ЖУВОАТОКОІ ЕЖУВУТСАУЄВЯТУУРЮОВУКСВЕ / в / ТІБВЕМАКМ ГОМ МВІВАСОТАУУХСАВУСОВ
Бе ша кн Ан
ОВО "ВМОГХУВЕОООІ УКРОСЗВІЗСААВОЕТРОВУАМе
ІМмо: 384 00 МОВІ0Т01-УН, 3- | МУВОАРОКОМЛЖУСУТСАУСВУТУУРОВУКСВЕ !
І |" ТІБВООБКМТІУТОММВІКТЕОТАУХУЄСТТУСЮВ (сто
БОЮ | /КУФІМЕВООСУХВРООЗІ АТ ЗСААОЕТЕВВУАМУ
МО: 385 | МОВІЮТІ-УН 3. ЖУКОАРОКССВУУВУТСАУЄНУТУУРОВУКСЕЕ
Н | й . | ПВДНККМВІ ОМ МІ КАТА УНСАВЖ СЮ
КН
УЕОЩО 001 Позначення І і ; Амінокислотна посліловність
МО послідовності 501 ЕМОГУБЯОСОГУКРОСВІКІЗСААЗСЕТЕВ5МАМВ
МО; ЗВ МОВІ -УН З ЖУВОАРОКОГЕЖУВУТСАУСИЗТХУХУРОУКСОСВЕ 2 ТІБЕДНЕКМУ КУТОМ МІ ВАВОТА М УЖСАВЛИУЄСТЕ
СЕ пиомаацаненьсеяинннни Іо оп п п пп пп пп пп пп З й ій опти у и п ро дин о о плов ово оо чали плин
БОЮ |! | ВУОГЕВООСІ УОРСОБІКТУСААВОКТЕВВУАМ
МО: 387 | МОВІЮЖН-КН 8: ГГ ЖУВОАРОКОСЕМУВУТОСАМУСНЗТУХУРОВУКСВЕ 23 ТІВВОМКМТІ У ГОМ ВАВОТАУУТСАК СО скрі
ХО | І ГОУОГУЕБООСУМОРОВВІ НІ ЗСААХОЕТЕЕВУАМУ
МО: 388 0 МОВюХН-УН. З3- : МУВОАРОКОССЕЖУАУТСАУСЕУТУХУРОИЧУКСВЕ (30 | ТІВВОХУКМТІ ТОМ ВАБЕОТАУУУСАКУСОЕ : | сЕрІ
ВО ГОУОЕУВЕООСУМОРОВІ НІ ОСААЧОРТЕВЕКАМЕ
МО:389 МО ВіОТІ-УН 3- | МУКОАРОКОЇБЖУЛУТСАУСНТУУРОБУКСВВ 30.3 ТІБВОМЕКМТІ УТОММВЕКАВОТАМУХОСАВУСВЕ
ОСЕВІ
БО ГГ ОУОГУЕБОССУМОРОНУГ КІ ЗСААЗОЕТЕЗВ КАМ
МО: 390 : МОВІОЛТИ-ХЖН 3 ЖУВОАРОКОЬЕМУАУТСАУЄСВяТУУРОВУКСВЕ (305 | ТІЕВОМеКМТІУТОММЗЕВАВОТАУУУСАК МСЕ скпі в т ГОМОГУВЕОООУТОРОКЗІ КІ УСЛАБОКТЕВУКАМЯ
ГМО: 391 І МОК10701-УН. з- | МУВОАРОКОІ КЕ УУАУТСАУЄСНТУХРОЗУКОВЕ (за ТІВВОМУКМТІЛТОММЕВАВОТАУУУСАВ УСЕ
СЕ
БОШ |Позиачення 00 днокнелотаюслідовність ! мо: пон Амінокислотна послідовність: Ї (ББОЮ Й ЕУОГМУЕЗОСУУУОРОСОВІ КІ СААБОГТРУЗУАМУ
МО: о | МОВі07-УН 3: | МУВОАРОКОГЕМУВУТСАУСИТУУРОБУКСЕЕ 43 ТІВВОМЕКМВІ І ОММІЕТЕОТАГУУСАКУСВЕ
СВІ
БОЮ | ЕУОГУЕЗОО СГ УОРОСЗІ ЛИ ЗСААХОРТЕЗБХАМЕ
Мо: 393 І МОВ1021-УН 3- Її МУВОАРОКОТЕЖУЗУТСАХУСВ5ТУУРОИВУКСКЕ48 | ТІЗЕДНККМВІ У ОММЗЕВОБРТАУУУСАВМУСВЕ
Іі сЕоІ яви пвослвооосу ово хеткоиенн 5БО ЕУОГУВКЗИСОГУОРОВОІ КІ УСТАБОРТЕ55ХАМУ
Мох 394 мови | ЖЕКОАРОКОСЬЕМУСУТСАУЄНЯТУУРОЗУКСВЕ
Ех | ТІБКрРОЗКАТАУОММБІКТЕОТА ХУ УСТА АСВ : СЕМ
ЖЕО 07 БУОІУЕТОбОПОРООВІ ВІЗСААЗОЕТЕВБУАМУ (МО: 395 | МмОщІатоі-УН з- | ЖУВОАРОКОТЕЖУЗУТСАУСКЕРУХРОВУКСЯ Є 53 | ТІБВОМВККТІУТОММЕІКАБОТАУХУТСАВУСОВ ст бо "ВЕУ УБЗСОСУОРОСЗІВІЗСААВОКТЕВЯКАМУ
Мо: 396 МОН 1ТО701-УН, з» | ЖУВОАРОКОСТЕХУЗУТСАУЄСНВТУКРОЗУКСТ ва Ї ТІБЕОМВКМТІ У ОМОБІДАЕОМАХУУСАНМСОЕ
ГЕО й ВУОГУБВОСОСІ МОРОЗІ НІ ЗСААВО ЕТЕЕЕЖАМЕ
Ме: 397 МОКІО701-УН. 35 | ЖУВОАРОКО ЕЖУВУТСАУСВяТУУРОУКСКЕ ов ТІЗВО МКМ УТОММВІВАВОТАХУУСАВЖСОЕ сти
ЗБОЇ 0 Позначення | ЩЕ і Амінокислотна послідовність
МО: | послідовності
ЗБОЇВ | ЕУОІЛ'ЕВО ОСІ МОРСОБІКЕЯСААСЕТРЯБУАМУ
МО: 398 | МОКІОТ0І-УЮ. 3- ЖУВОАРОКОГЕЖУВУТСАУСВУТУХРОБУКСВЕ 72 | ТІЗКрОЗКМВІ У ОММВІКТЕрТАУХУСАВМСОЕ ! | | ско 75БО Ю ПФ ОГУЕВООСТМОРООІКІХСААВОРТЕОУАМУ (МО: 399 | МОВ10701-УН 3- ЖМУКОАВОКО ЕЖУСУТСАУСНЯТУУРОВУКСВЕ 73 ТІЗВКОРОЗКМТАХСОММВІКТЕОТАУУУ СТЕ ЖОВ
СЕВІ
ТЕО ! | ЕУОМУВВООСІ УРОК ВСААБОТТЕВВТАМВ '
МО: 400 | МОВІ01-УН 3. МУКОАРОКОТУЖУВУТСАУСВВТУХУРОВУКСТЕ т ТІЗАДНЕКМТ УТ ОММУСВАБВТА У УСАВЖСВЕ
СЕР
ТЕО БМОГУВВЗКОМІ ОРОС КІ ЗСААБОРТТЗЯУАМ ЕС
- (МО: 401 | МОВО У 35 МУВОАРОКОГСЕЖУВУТСАУСКЕКУХУРИУКСВЕ -4 ТІЗКОМВКМТЬВІОММВІЖАВОТАУХУСКА СВК.
ГЄКоІ
УН-область
МмОй7о3 /8ЕО | ЕУОГУВВОССТМОРООВІ ВІ ЗСААЗОРТЕЗУХАМ І
ЩМО:А02 0 МОВ10703-ХН 3- | ЖУВОАРОКОГЕЖУААІМОСКВТУУАОЗУКСНЕ і Н 0 ТІЗВДНКК МІОМІ КАКОТАХУУСАВ СК
ОСЕВІ
І5БОВ ЕУОГУВУСССЇ УОРОКВІ КІ 5СААНОРТРЕЯКАМЕ З
МО: 403 | МОВІ0703-УН, 3» ЖУВОАРОКО ЕМУЗАЇМОСКЕТУХУАВУКСЕВ (оо / ТІЗЕДНЕК МЕ ОММЯКАВОТА ТА САКЕ о сЕрі
/5БО1о Мезначення 000000 ко: послідовності Амінвокисттна послідовність Е в 00 полиння
МО: 404 0 МОКІОЮЗ-УН, 3. | МЛВОАРОКСІ ВЕЖУ УЗАТМВОСКУТУУАОВУКСЕКТІ ше | ЗВДИККМІЛ ОМ КАБОТАУУУСАВЛУЄОКИ
Ер 5ЕОЮ ЕУОГУЕЗОСОБУОРСОЗЕВІЯСААВОРТЕЯВХАМ
МО: 405 |МОДНОЗ-УН 3- | МУВОАТОКСІ ЕЖУЗАІМБОСКЕТУХУАОВУКСВК 13 | ТІБЕВМАКМВІ ГОМ МВІВЛОВТАУУУСАКМСВЕ сти
ОТ ЕУОЇМЕЗОССІ УКРООВІВІБСААООСЕТЕУВУАМХ
МО: 406 мово. МУКОАРОКОМЛУУСАТЧ5ОСКТУХАЮВУКСНЕ | ТІВКРОВКМТЕУОММВІКТЕОТАУУУСТТМСО о сЕРІ
МО: 407 | МОВТОТ03-УН. 3- | ЖУКОАРОКОЦЕМУЗАІМВОСКУТУХУАРКУКСВЕ | ТІЕЕДНКК МІХ ОММВІЛАВОТАСУНСАВ МСЕ сем 5ЕОї ши Я ре 408 МОКІОТОЗ-МУН. 3- | УУКОАРОКОЦЕМУВАІМВОСКВТУХУАЮВУКСВЕ 21 | тізАДНККАВІЛОМКВІ КАЕОТАУУУСАЮТСЮВ сти вот т ФОТЕБООБГУОРООВІЛТЕСААЕОРТ ВЕ АМЕ
МОЮ |МОК103-УН 3. МУКОАРОКОЦЕМУВАТМВОСКУТУУАОВУКСИР 23 | ТІЕКОМУКМ ТЕ У СОММВІКАВОТАУУУСАК УСЮ
СЕВІ
БОЮ ДПюжажния мінова ель і І Амінокислотва послідовність :
ЩО: і послідовності : 5БО Юр ОМОБУЕЗООСУХУОРОВВІ ВІ ЯСААЗОСТЕЗВКАМЕ
Мо; 410 | МОК10703-МН. 3- ЖУВОАРОКОГЕМУМААШОСКУТУХУАРВУКСВЕ
ТІБВОМУКМТІ УБОММВЕКАВОТАУУУСАКУЄВЕ,
СЕ
БО р т ОС ТОМОГУЕЗОООУУОРОВ ВІ ЯСЛАОСРТЕЗ5УАМЕ
МОЯ 0 МОВІО73:УН 3-. | МУВОАРОКОГЕЖУААТОСКТУУАВЯУКСВЕ : 303 РККОК5КМТЕУСОММБІВАЕОТА ХУ УСАВУСОК : Те 5БОВ т ОУОГУЕВООСУМОРОКЗ КІ ЯСЛАБОРТЕОяХАМЕ ко 412 ІМОК10703-УН 3- МУКОАРОКОЇ ЕЖУААІМВОСКВТУУАВВУКСНЕ
Н ! Н ! 30.5 | ТЕКДМЕМТЕУ СОМ ВАВОТАУУ АК СОК
СЕ І
5БОЇВ | пон ВВЕ ННЯ ко 313 | МОК0703 ун, 3» | МУВОАРОКОІ НМ УАЛІМВОСКУТУМАЮЕУКСИК г33 /ТІЕВОМеКМТЕУГОММВІКАБОТАУТУСАВТСОЕ (око вн УК ОРООВВСКАВОТВНАМЕ (МО: 414 | МОВІОТ03-УН 3- | ЖУВОАРОКОТ ЕЖУЗАІМВОСКУТУТАРВУКСВЕ : 43 ТЕЗЕВРВМУКМІ ТОМІ ВТВОТАГ УСАКСВЕ
СЕ став: | СОТ ЕКОЇ УБВООСІУОРОСВІВІЗСААЕСЕТЕЯУАМЕ
МО: 415 | МОВІ0О703-УН. 3- УУВОАРОКОТУУЗАІОСКТУХАОВУКСОВЕ ; | 4к ТІЗВДНКЕМІ УСОММЯ ЕВЕВТАУТУСАВУЄСВЕ бЕрі
ІВБОТЮ о Позвачення 0000оінокастта еліт
Мо: | послідовності | АмжнНнОоКИслОотТна пословВніСсть сосли нин с
Мово МОК10703-УН 3» | УЕВОАРОКОЦ Ж УСАТМОСКЗТУХАРВУКСЕС 49 ТІЧВрОЗКУАЖОММВІКТЕРТАУХ СТЕ УСВЕС
КР
БО. | ТИН Нвкн (МО: 417 0 МОВІ0703-УН 3- ЖУВОАРОКОГЕУМУВАТМКОСКТУУАЮВУКСВКЕ 53 ТІЗВОМеКМТІ У СОМ КАВОТАМУУСАВУСОВЕ : СЕ яти НКослоов Вес КТ ВЕК ВТР НЕК
МО: ЯЕ 0 МОКІО3МИ 3. /"МУВОАРОКОЇБУУЗАІЧОСКУТУТАВВУКСВЕТ
Ба | ІБДОМУКМТЕУТОМОІВАБОМАУТУСАВЖУСОВ ке
Ба НИМИ ін піде оикі нічне внйнонікниЙ
МО: 419 те /"ЖУКОАРОКОЦЕМУВАІМВОСКУТУУАОВУКСВЕ 56 ТІБЕОМЗКМТСУТОММВІВАВОТАУУХУСАВУСОК се пла шини БУОГУВВООСІУОРОСВІ КІ ЗСЛАВОГТРЕЯУАМУ
Мом митно, пок нкомедеютте ке 72 | ТІБКООБКМСТОММВІКТЕРТАУХУСАКУСОВЕ ши і пакет п ЕВ ОСТ ЕТ ЕЕААВВЕ НЕК
Мо: яз | МОВІЮЛЗ.ХН 3. ЖУВОАВОКО ЕЖУСАІМВОСКУТУУАОВУКС 73 Іі ПІБЕВОЗКМУТАХБОММУКТЕОТАУ т УСТЕСоЕ (ст
ПЕН ЗОН НН НН ПНО НИ А о оо
ГБО О Аозначенняїд 0000 й | Амінокислотна послілоннієть
МО: : послідевнасті і
Б ПАНЕ РНЕ НтВеКАВО ННЯ
МОСЯ29 1 МОВІ10703-УН 3. МУКОАРОКОСУЖМУВАІНОСКЯТУУАВВУКСКЕ 74 ТІБЕДНКК МТУ СОМ ВАТА УУУСАВЖСОЕ
СЕ
БО | ЕМОГУБЗВОУГУОРОСВІ КІ ЗСААВОЕТЕУУУАМУ
МО: 423 | МОВІОТ03-УН. 3- | УУВОАРОКСТ ЕМ УЗАІМЗОСКУТУУАВЕУКСНЕ 4 | ТІЗКОМУККТ ІН ОМКБІВАВОТАУХУСККМСОЕ
СЕ
- ш сп ччЧТнчТнТтТнТнннншшии моніто ів Ір Шо 070 | рюмтовевВІ ВАК УТ СВАВОСІВНМК : 424 УК) Оі»бакаж УООКРОКАРКИЛУСАВВІОВОУРБАКЗОЗОБОТОК як МОКТО701 хм) | ТІТІЗВГОРЕОБАТУУСООУВБЕРТТ
Н : ПОВ ОО ВОНА хво мом ото "ОЮМТОБРЕБІЗАЗУСОВУ ПТСКАБОСІВМУАМ
Мо: 425 Ї уки ги І | УООКРОКАРКІЛУСАБЯІОВСУРЗКЕВОЗОО ТО ши С ТЕПеВСОРВОРАТУХСООУВВЕРИ
ЗБОЮ МОВО ЛЮМТОБРУВІ ЗАБУВ ТТСКАБОСІВМУАМ
Ме дн. : :
МОЯ Ук ОїВ | ЖООКРОКАРКТЛУСАВЯСОЗОУРЕВЕЗОВОВИТОЕ : І . ши | ТЕТІБ5ЬОРІЧНАТУУСООУВЕЕРТТ
ГяБО о ! МОВІ ГОЮМТОБРБЗЕВАВУООКУ ПЕСНАВОСІВМУБАМ
МО: 427 | кі ни | ЖООКРОКАРКИЛУСАВЧЬОБСУРБВЕОВООТОЕ т І ТРТБ5ГОРБІМАТУ УСОСУВЕЕРТТ :
БОЮ | Мовіоти І ВІЮМТОБРУБІЗАЗУСОВУ ТТ СВАБОСІВМ БАХ
МО: 8 кі дай | ЖООКРОКУРКІ У САБЕГОЗОУРЗПЕВСВОВСТОЕ р І ГЕРІВ81ОРЕОУАТУХСООХ5ЕРТТ
ЗБОЮ 0 ПозначенняїД 0000000 . . Аміцокислотна послІДОВНІСТЬ. і
МО: послідовності !
ГБО | МОВИТИ | РІОМТОВРОВІЗАУСОВУ ПЕСКАЗОСІЗМУЖКАМ
Мо: 429 і Укі Аз | | ЖООКРОКАРЕВІИУСА5В ОВО УРБКЕЗОВОЯОТЕЕ
Пк АЗИ й | ТІЛІЗ5ОРЕОРАТУУСОСТУВЕКРГТ Е шини
ЗО МОВИЙ Ї МОМ тТО5РЕАМЕАВУЧОВУТТСКАБОСІВМУУВА
МО: 830 І укі па | УкООКРОКУРКНІ ПИСАВ. О5ОУРВКРБОБОВОТ -т | ЕЕТІ.ТІ5СОРБОБАТУУСООУВБЕРЕТ !
ЯКОЮ | ів | ПІОМТО5РУЗЕВАЗУСОКУТСКАЗОСІВМУБАМ
МО: 431 Ук п І | РООКРОКАРКВІГУСАЗВСОБСУРЕАРБОВОВОТОЕ
І ї, р | ТІЛІЗБСОРЕВЕАТУУСООУЗБЕРТТ
ЗБОЮ МОВ "ОЮМТОБРЗВІЗАЗУОВКУТТСКАВОСІЗМ МАХ
МО: 432 ук щ |! УдОКРЕКАРКЗІЛУСАВБІОЗОХРУВЕЗО5О5ОСТОЕ ши | ТІЛІЗВСОРЕОБАТУУСООУЗВЕРТТ
ВБФ о овіюю о 00 ЮСТОВБВБІВАВУ ВОК ТСВАВОСІВНУ ТАМ й
Мо: 433 | УКІ Щі | ХООКРОКАРКЕУбАВВІОВОУРЗВКЗОКООТОР 7-7 | ТЕТІВБСОРЕОРАТУУСООУВВКРІТ
БОЇВ ооовіютют 00 ОСТОБРБВВАВУВТІТТСВАВО СІНА
Мо: 434 кі тів | ХУООКРОКАРКІ У САБВІОБОУРЗКЕЗОЗО5СТОЕ шк | ТІЛІБ8ГОРЕРРАТУУСООУЗВЕРТТ
ІзБОю м Ов1от0 ПООМТОБРУВУВАВУЄОКУТТСКАЗОСІВМИТАМ
Мо: 435 ук і | | УООКРОКАРКІЛУСАВВІОВОУРЯВРЗОВОВСТОЕ ши | ТІТІВВІОРКОВАТУ УСООУВНКРТТ
ЗО МОВО | РІОМТОБРОВУВАВУСОНУТІТСВАБОСІБК УТА і
ПН у; - |!
МО: ав Укр | ЖООКРОКАРКІ У САВВІОЗОУРЗКЕЗОЗООТОК шк ТІЛІБВЦОРЕПРАТУУСОСУВУЕРТТ ! ше ин НВ ов
ГБЕОЇВО о Пезначенняї/ 00100001 : І | Амінокислотна послідовність
І МО: і послідовності ! | і
БОР МОКІОТО РІЮГЛОВРКІ ЗАБУСЮКУТІТСКАВОСІВМУКАМ
Мо ат | Ук! щ | ХООКРОКАРКТ ГУОАБЕБОВОУРЯНЕОВОВОТЕЕ7 | ТЕСТІВ ОРЕОРАТУУСООТЕВЕРТЕ
ЗО Мово ГАІЕМТОВРЕВІВАВУВ РЕ ТТ СКАВОСІВНУ САМ
МО: 438 | Укі ще | ТООКРАКАРКІТУСАБВЦОВОУРЕКЕВОВООТОУ т | ТІВ ГОРЕОВАТУтУСООУВеЕРТЕ в МОВ. АЇВМІТОБРЕЯРВАВТСОВУТТСКАВОСІВК А
Мого що УООКРОКАРКІЛ ЛУ САВКІ.ОВОУРЕАЕЗОВОВОТОК ши ТІЛІЗСТОЗЕОКАТУХУСООУЯВЕРТТ шини вн А А 5ЕОЮ МОКІдлИ УМУМТОБРБІІ ЗАТОКУ ТІВСКАВОСІВМ МАМ
МО» як ук га УООКРОКАРЕЕІУСАВВКОВОУРЗКРВОВОВСТОЕ т ТІЛІВСІО5ЕРЕАТУУСООУ5ЕЕРТТ
ПОКИ ПИКА птнкіт дн ен нентів нтів 5БОВ МОВІ АТЮМТОЗРЯВІБАЗУООКУТИ СВАЗОСІВАУГАМХ
МО: я | й З УООКРОКАРКІ ЛУ САВВІОБОУРБВЕОвОВОСТОГ
З ТІЛІВУГОРЕОБАТУУСООУЧВЕРТТ
ЗБОЇ | МОКІол РІОМТОЗРУТІЗАЗУСОВУ ПТСВАБОСІЗМУБАМ т01-
МО: 443 шк це ХООКРОКАРКІЛЛУСАВВІО5ОУРУВЕЗОО5ОТЕЕ р ТІЛІВХГОВОРАТУУСООУВУЕВТТ ян шк і УК-область і мевтоти вив мвнтеяк ВЮМТОЗРУВІБАВУСОКУ ПІСВАВОСІЗМУКАМ .
МО: 443 |УКІ Оідітакаж | УООКРОКАРКІ ТУ САВНОВОУРЕВЕОВОВОТО як МОВО) | ТЕТІЗ5ГОРЕОБАТУУСООУВВЕРТТ
ПИ ПИ ПО,
ГВЕСІЮ і МокІотов ВІЮМТОЗРУВІБАЗУСОВУ ПІСКАЗОСТЯМУСАМ
І мо: 444 уко? | ХООКТОКАРКІ ТУ САВЗБЬОБСУРЕВЕВОБОВОТЬЕ : й | ТІТІВ5СОРЕОГАТУУСООУВВЕРТТ шшшншшишнии и кеВ) Позначення | і й | Амівокислотна послідовність і
Ма: | послідовності !
ПАН А ОХ
ГвЕбтв і Мовій оз | РІЮМТОВРЕВІЗАБУСЮВ У ПТОНАВОСІВКУ САМ :
Н їх Ті дія
Мо: 445 Ук! вів І ХООКРОКАРКЕ У САВЯІО5ОУРЕВЕВСВОВОТОЄ о | тЕТІЗ8ІОРБОТАТУУСООУВВЕРТТ ! і пн (яБо Ір І мовіотоз ПЮМТОРЯ5Е ВАЗУ СОКУТТСКАБОСІВМУУВА М : МО: 446 Ук ов й ТООКРОКАРКІЛУСАЗЕСОВОУРЕВЕОЗОВИТОЕ ши ТЕТІЗВІОРЕТАТУУСОО УВКР п а ПО
Гео І | мовіотов РЮМТОБРЯБІВАВУСОВУТІТСКАВОСТЗМУЬАМ ме: 447 ЧК АХ Й ЖООКРОКУРКИ ТУ САУ ОБОУРОВЕБОЗО5ОТО
Х с7о Н щ ТІТІЗ5ОРЕГМАТУУСОСУЕЕРТУ ; ЗБОЮ ж БІОМТОБРЕВ ХАЕС ОВНУТТСКАВОСІТАВАМ
З К1О07О3- і
МО: 448 іл Аз УООКРОКАРКВІ ЛУ САЗВІОВОУРБНЕЧООВОТЕЕ 2 Н т ТІТІБ5ЕОРЕОВАТУУСООУЯУКЕТТ ш- ША в Ю | модтотоз МЮМТОБРЕАМАЗУЄСОКУ ПІСКАБОСІВММУВА 7 - Н
МО: 449 Ук МЖБООКРОКУРКНІТУСАВБІ ОХОУРЗКЕВОВОВОТ 7 ЕЕТЬТІБ5ІОРБЕОБАТУУСООУВБЕРТТ
ПОН ПИ ОА А А
І БОБ МОВ0тоЗ ЇОМТОБРЕБІ БАБУСОВУ ПТСКАБОСІВМУАМ
МО: 450 й Щі РООКРОКАРКУЦУСАБВІО5ОУРЗНЕВОЗОВОТОЕ - ТІЛІ ОРЕОБАТУУСООЖВЕРТТ нн
Г5БО ТО | МОВ10тОз ПОМ ТОРЕЗ БАЗУСОВУ ПТСКАТОСІВМУМ САМ
Мк) 4- Н
Мо: 451 Ї ук їв ХООКРЕКАРКОНУСАБЯІО5СУРЗВЕБОВООТОВ
Ш ТІ ТІВЕГОРЕОРАТУХУСООУВЯУЕРТТ !
ЗВО Мові. лісові сет 703-
МО: 452 УК 14 ХООКРОКАРКІИЛУСАВНІОВСУРЕКЕВОВОВОТОК й | ТІЛЕЕВГОРЕРЕАТУХСООХУБВЕРТТ киш М шо шк
ОВБОШОУ | Позначення 00100000 : ! . Амінокислотна посліловність і Ме: | послідовності
Ї шифр /ЗБОб і МОвІов АЇОЇТОЗРУВІ ЗАХУСОКУ ПІТСВАВОСІЗММБАМ (МО: 453 | Ук! | я УООКРОКАРКІЇТУСАВЯГОЗОУРЗВРУСВОСТОВ о 7 ТЕТІ55ГОРЕОБАТУХСООХ5ВЕРТТ Е
ГБО о Ї МОВІвтбя ГОТОМТОВРББУВАБУСОКУ ПТСВАБОСІЯ МУКАХ
І мак ТО Н Ше - : Н мо УК | УООКРОКАРКІТТУСАБЯЬОВОУРЗКРВИВОВОТОВ -7 | ПСТІВВЕЬОРБОКАТУУСООУВЕРТТ
ПИ ПОЛО ПИ нин,
ЗБОЮ Мовіото ГОІОМТОЗРЕВУВАЗУЄРВУТИСКАБОСІЕМУУ ВАМ
МО: 455 Ук ци 7 УООКРОКАРКТІУСАЗЯСОВОУРЧВЕБОБИВИТОЕ | ТЕТІЗ5ГОРЕОРАТУУСОСТУВКВТТ
БОЮ мовіою: 00 ПОСТОВРВКІЗАБУСОКУ ПТСВАВОСІВМУТАМ
Я у, пз Н Н
МОЯ КІВ І ООКРОКАРКТІЛУСАВЯСОХОУРЕКЕВСВОВИТЕК що | ТІЛІ5ВІОРЕОРАТУУСООТУ5УЕРТТ
БО | мовірля. 000 КМТОВРЕВІВАВУЧОКУ ПТ СКАВОСІЗМА
І О703- і !
Мокрі | ХООКРАКАРКІ ЕГУСАЗВСОВОУРЗКЕВОЗОВОТО М -7 Ї плія8СОРЕОБАТУУСООУЄБЕРТТ пишне шини нн а аа и іо їв мовю й | АТМТОБВБ5ЕЗАТОРКУТТСКАБОСІВМУАМ 703. ' мо: 458 мкг | ХООКРОКАРКІТТУЄ АВ ОЗСУРБЕРЕОВОВОТОЕ шо | тілІзбТО5БОРАТУТУСОЮУВЯЕРТТ
І М Н п В ПО л 5БО1р дитя АПЖМІТОВРЕІ ЗАБТОВКУ ПЕСВАНОСТВММСАМ
НЯ Н 3- : І мо: 45 І Укіїм | УООКРОКАРЕІЛУСАВВІОВСУРВВРЕОБОВО ТЕ ! - | ПІЛІБСГОЗЕОКАТУУСООУВВЕРТТ і | ;
ГЗБбів І мові ГАЮМТОБРОЗІЗАЗУСОКУТІТСКАБОСІВМУТАМ
Мо: 460 і Ук щ Й | ХООКРОКАРКІЛІУСАБВІОБОУРЕВЕООВОТОВ р І КЕТІ ОРБОБАТУУСООУВВЕРТТ ши шини и ни а
Г5БОЛО Печеня 0
Ї й І | Амінокислоїна послідовність
МО: послідовності шини
З Ю мОоВІвт | ВЮМТО5РУ ТВА УСОВУТТОКАВО ІЗ МВАМ уд !
МО: 461 Ук щи І УООКРОКАРКІ ТУ САЗВІОВСУРБВЕКИВОВОТЕЕ 7 | ТІЛІХВІОРРОБАТУУСОЮУВУЗЕВТТ ши шишшшшишишишишшшшиш
Табляця 3; ЛН-сетменти
ВБОВМО плолотоютове
Що ІН ЖООСТІУтУВя 462 шо шшшишшшиши /5БО ТО МО: ЩО шЩ
І кри | жавОтАТУВЬ 463
ГЕО МО
І ІН | жОоОстМУтТМ55 я
ВЕОЇБНО еилпят кн
З па УсСОбтІУгува 463 й
ОПО и ПО
ЗВО ще виш е в еу а ж 466 що шк пиши
БО МО: о Іще УЧчОСсТІУТУВВ 467 "Таблиця 4: /Косегменти
ІББОНІМО | Що
МІКОО КООСТКУВІК. 43685
Гете пн пон "БОЮ Ме: п сь
І ІК СОСКІВ
469 ше
НИ і ня ЗІ ло указ кОРОТКУЮ ! 470 ше
І Н Н
ІЗЕОМО: | | ! : |К4 ЕСОСТКУВІК.
Ще і ! ше
ОЗЕО МО: ЩІ
ШИ Ок ЕбООтТКЕ ІК (47
Можна використовувати будь-яку комбінацію послідовностей, отриманих із зародкових послідовностей МН, з ОН-сегментами. Репрезентативні приклади комбінацій представлені в таблиці 5.
Таблиця 5: Репрезентатнаві приклади комбінацій послідовностей, етримавих їз зародконих послідовностей УНІ, з У сегментами.
ЕС. Мр пУосВовоги КРООВІВІВСААВОРІТРВВМА 473 | мовотої. | МежУуВОАРОКСІКУМОУУСАУСВВТУХРОВ
УНН 3-15 НІ | УКОКЕТВКВОВЕМ ТС СОМ ЕТЕВТАМ У. ! | СТІУСРЕСЕВСУСОСТЬУТУЄВ ! виш В Мн (55 ШО: | -ЕМОГУББОСОІУКРООВІВІХСААВОКТЕВВУА і
Ї ! й . ект Ї 474 | МОКІФШОЇ- | МУЖУВОАРОКОТЕЖУСУТСАУСКВТУХРОВ
ГУНо 315 зн | УКСКЕПВВООБК МТ ЛІОММВІКТЕОТАУУУ ! ! | , щ
СТІЖСРЕСЕрІ ЖОООТМУТУ8У ! | і
Гево; Ма ТП ЕФ ТВВООБІАКРООБТАТВСААВОРТЕВВКА
І 475 МОВ10703. | МЯЖУКОАРСКОГЕУУСАЇМВОСКеТУУАВВУ і УН 3-15 ЗНІ | КСХРТІаВООБКМТУСОММ5КТЕВТАУ КУЄ і і І ї ; ТРАВ ЕВлЛУСОСтТІ ТУ ! і ня ктукакюуююиии ліва ую скюкж в нн нн а носа пе пови овалом втововт оман вав оввовютовісювовоснвівниї зво ІЮ МО: г "ЕМОГАЕЗООСІУКРОСВІ ВІ ЗСААВОГІТРБЗУА ! І 476 Ії мОовл1о703- і МЕАЖУКОАРОКСТ ЕМ УСАТМОСКТУ КАВУ я Ї вне і ! ! ГУН 3-15. ЛЗ КОКЕПЕВООЗЕМЕСУГ ОМ КТЕОТАМУУС С
І і тутУуУсрЕСКОІ ЖООСТМУТУВ
ВОМ ПОМ ПО о
Можна використовувати будь-яку комбінацію послідовностей, отриманих із зародкових послідовностей МІ, з ОК-сегментами. Репрезентативні приклади комбінацій представлено в таблиці 6.
таблиця є: Репрезентативні приклади комбінацій послідовностей, отриманих із зародкових послідовностей УК, з ІК-сесментами
ОБЕОІВ МО: ГООМТОБРЕЗІЗАБУСОКУТТСВАБОСТВУМТА ат МОВІО70І- | ЖУООКРОКАРКІУСАВВІОВОУРУВЕВОВО8
Ук О2 КІ І ЄТОЕГІЛІЄ5СОРЕОВАТУУСООУЗВКРТТЕСОС
ТКУВІК
! і шини
ГБО МО: | ОЮМТОЧРЕЗІЗАЧУСОКУТТСКАБОСТВМАУА сито 47 МОоБА- | ЖУООКРОКАРКІЛЛУСАВВІОВОУРЕКЕВОВОВ і і , ; ,
УКІ Со Кая СТОВЕТЕ ВО ОРЕОВАТУ СООМЕТ КООО !
ТКУ
: дід дю т тат сто о дятли в
ЗБОЮ МОГ | : ІНОМТО5РЕБІ БАЗУСІК УТ ТСКАОСІВА УМСА. ! : | : 479 ії МОКТО7Оз- жеЖОЮКРОКУРКТ ГУ САЯВГОБИУРУКЕВОВОВ
УКІ Аг0 Ка СТОЕТ ЛВ ОРЕ УАТУ УСОСУЗВЕРТТЕОаСИ
ТКУВІК
Н І
Бити ти 022202
ГБО ТО КО: 7 ТОМТОРБІБАБУСРЕМ ТТ СКАВОСТЬКМИКА ; і 450 | МОКТОозе жЖООКРОКУРКІ ЛРУ САБВСОБОУРККЕВОВОВ ! : !
МК АгО КІ | ОТОРТТВЗСОРЕОМАТТУСООУВВЕРТТКООЮ : Н
ТКУВІК тити
При об'єднанні МН з УН, ї МК з УК, можна використовувати будь-яку комбінацію УН або ОН з
МК або ХК. В одному з варіантів здійснення винаходу для кожного антитіла кожну з отриманих із зародкової лінії областей МН можна поєднувати з кожною з отриманих із зародкової лінії областей МК (МІ). Деяка кількість репрезентативних прикладів комбінацій представлена в таблиці 7.
Таблиця 7: Репрезентативні приклади комбінацій отриманих із зародкових ліній послідовностей
ПТ комбінація 00
Н І
ЇЇ... : | І ШО тертю 1 Гижко ву пиши А див
ГББОТВ КО: ГЕМОГУВВСОСІ УКРОСВІ ВІ БСААБОЕТРЕВУА і | : Ї гав Мов - | Ме УВОАРОКОСЕУУСУТСАУЄСНЕТУХРОІВУ
ІВ 3-15 ЛН3. / КСВРТБЕВОБКМТІ УБОММВІЖТЕОТАУТУСТ
ТАСрЕСКЖОСОСТМУТУВУ
Н й чин п її
РО о МО: ООМТОВРВБІ ХАВУСОВУТІТСВАВО СІМКА ! 482 | мовіотої- | ЖУООКРОКАРККІДУвАВЕИСОВОУРВКЕВОВОВ
МК) АЗО КА ОТБЕТОТІЗ5ІОРЕВБАТУУСОЮУВУЕРТТРОСО тКУВІК !
ГО жемфінаніяй 000
Н г
Т5ВОЇБ МО ГОСОХЕВОбОУУОРОКВІКСВСЛАБОЕТЕВВКА 483 ПМОВІШТОІ- | МЕМУКОАРОКОГІУХАУТСАУЄСНЕТУХРОВУ
ІЗ Н
(ОУН 3-30 ТІНІ | КСВЕТІВВОМеКУТІ УГОММВІВАБОТАМУ ТУ СА)
КЖСОЕСКВІ МОСТІ УТУВУ
І і Н : Й еЕВДСПДЕДТТ и В тт прое пп ет
ВБОТОМО мовіот. ГОТОМТОБРВВІ БАБУСОКУ ПТ СВАВОСІВК УА (484 оукріл уко | ЖРООКРОКАРКВІУСАВЗЕЕОВОУРБКРБОВОВ ' | ОТОРТІЛІВ5ОРЕОВАТУУ СОУ ВВЕРТТКОЮС ! ІТК
Н | і : !
Комбінація 3
НИМИ КИ КОН
ГБЕО МО: ТОХоГУвВОСО ува ВІ СААБОВТЕВНУХ Її 485 МОВІ. | МеЖУУВОАРСКОГЕЖУАУТСАУЄВЕТУУРОВУ
УВ За Но | КСВЕТІВВІЗМВКМТІ У ОМ СВАБОТАХУУСА
КУ сВЕСЕКВІЖОВОТІУТУЄВ
ИН ПОН ПАННА в 8ЕОЮМО: мові ото. | ПІОМТОБРУБСВАЗУСОВУТТСМАВОСІЗМЖБА (186 Гукрможю | МРООКРОКАРКВІЛУСАВВНОВОУРЕНКОВОВ
ОТОЕТЕЛІВЕОРЕОРАТУУСООУЗЯЕРТТЕСОЮ отківк виш пан п
Комбівацін З пшшнОн п
ГВЕОТО МО: мові. ЕМО УЕВООбУУКРОСВІ КІ ЗСААВОРТЕВВУА 487 І ун 3.20 ня МУ УВОАРОКОГ ЕМ УВАІНВОСКУТУХАВУ рУпоюя УМ
КОКЕТЗКДНЕКМОУ ГОМ КАКВТАБЖНОСХ
ГАМ СОЕСКОРУСОСТІ УТУЄВ
ПЕН «ОН ВИН кн
ЗО КО: ! МОВІО703- ПЮМТОБРЯВІЯАЧУСОКУТІТСКАБОСІВМУВА; ях й . й Я лК АВС ях. зичу тки де 488 | укі 115 /к3 | УУООКРЕКАРКВІЛУ САВБІО5СУРБЕРЕОВОВ
ОСТрРЕТІ ЛІВ ОРБОРАТУУСООУБВВЕРТТЕОРИ тку
ВИХ ПН НК
Ї Жеамбінація 5 7
І
ЗЕО ТО МО МОВІпоЗ- ОУОГУЕБССОУХУООРСВО ВВА А у489 я 3-33 Но | МУЖУВОАРОКОТ ЕМ УАЛІЧВОСКЕТУУАЮВУ
КСКЕТІ5ВОМУКМ ГІ. ОМ ВАГАХ УМСА, вУСпЕСЕРІЖОКОТЬУТУВУ ншшшшишшшшшиишииш
ГЕО КО МОВО. | ОМТОБРЯН БАВУСІК УТ ТСКАВОСТВА УВА (о КІ Або ЗК | ЖУООКРОКУРКИ ЛУ СА5ВГО5ОУРЯКЕЗО5О8 !
ОТОБРЕЛ5ЕОРБОХАТУУСООУВЯКР ЕТО ткУвіК : І дише пис сш ші у, і Н
Гкімійнинін є
Н : !
ЖБОЇБ КО мовіютх | ОМОГУЕВОВСУ УРОК ВСААВОЕТИВВУХ
Гі м 3.43 ЗНЗ | МЕЖУКОАРОКОГЕМ УААТМБОСКЕТУУАОВУ
КСВЕТІБВОМЗЕ МТУ ОМ ВАБОТАХУУХСА ї | куСсоЕсСКиЖсОооІМУ ТУ 5БОТО МО о мовіотох. 0 ЮМТОВРУВІЗАЗУСВВУ ТТ СВАВОСІЗММСА. 492 | «КІ АзО КО | МУООКРОКУРЮТІ ЗУ САН ОВОУРКРЕІОВОВ
СТОГІН ОРЕВУАТУ СО КВВЕРТТ РОС
ТК БІК виш ан ПА А в в
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу варіабельна область важкого ланцюга містить послідовність Хаа--НСОН1-Хаа--НСОН2-Хааз-НСЮОВЗ-Хаах, у якій НСОМКІ, НОСОК,
НСОКЗ важкого ланцюга являють собою будь-які СОК важкого ланцюга, обрані з представлених у таблицях 1 і 2. Послідовність може являти собою наступну послідовність, наведену тільки з метою ілюстрації:
Хаа-ЗУАМ5-Хааг-АІМЗ5ОСКОЗТУМАрБУКО-Хааз-МСОБСЕОІ-Хаах (5ЕО І МО: 493), у якій
Хаа: позначає каркасну ділянку, що складається з будь-яких 30 амінокислот;
Хаа» позначає каркасну ділянку, що складається з будь-яких 14 амінокислот;
Хааз позначає каркасну ділянку, що складається з будь-яких 32 амінокислот;
Хаах позначає каркасну ділянку, що складається з будь-яких 11 амінокислот.
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу варіабельна область легкого ланцюга містить послідовність Хаа:-І СОВ1-Хаа»-І СОВ2-Хааз-І СОВЗ-Хаах, у якій ІСОМК1, І СОК2, І сок легкого ланцюга являють собою будь-які СОМ легкого ланцюга, обрані з представлених у таблицях 1 і 2. Послідовність може являти собою наступну послідовність, наведену тільки з метою ілюстрації:
Хаа-ВАБОСІЗМУМІ А-Хааг-ССА5ЗБ5І 0О5-Хааз-ООУ55ЕРТТ-Хаах (5ЕО ІЮ МО: 494), у якій
Хаа: позначає каркасну ділянку, що складається з будь-яких 23 амінокислот;
Хаа: позначає каркасну ділянку, що складається з будь-яких 15 амінокислот;
Хааз позначає каркасну ділянку, що складається з будь-яких 32 амінокислот; і
Хаах позначає каркасну ділянку, що складається з будь-яких 10 амінокислот.
Антитіла, представлені в цьому описі, можна виводити з одноланцюгових антитіл, димерних антитіл (диабоді), доменних антитіл, нанотіл (нанободі) і юнібоді (антитіла, створені за допомогою технології Опіроду"м) "Одноланцюгове антитіло" (5СЕм) складається з одного поліпептидного ланцюга, що містить Мі -область, пов'язану з МН-областю, у якій пара МіІ- область і МН-область утворюють одновалентну молекулу. Одноланцюгове антитіло можна одержувати за допомогою методів, відомих у цій галузі (див., наприклад, Віга та ін., Зсіепсе 242, 1988, сс. 423-426 і Нивіоп та ін., Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА 85, 1988, сс. 5879-5883). "Димерне с(аізриа") антитіло" складається з двох ланцюгів, при цьому кожний ланцюг містить варіабельну область важкого ланцюга, з'єднану з варіабельною областю легкого ланцюга на одному і тому ж поліпептидному ланцюзі, які зв'язані коротким лінкером, при цьому дві області на одному і тому ж ланцюзі не спарені одна з одною, але спарені з комплементарними областями на іншому ланцюзі з утворенням біспецифічної молекули. Методи одержання димерних антитіл відомі в цій галузі (див., наприклад, Ноїїдег та ін., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 90, 1993, сс. 6444-6448;
РоЦак та ін., бігисіийге 2, 1994, сс. 1121-1123). Доменні антитіла (да) являють собою невеликі функціональні зв'язувальні одиниці антитіл, що відповідають варіабельним областям або важких, або легких ланцюгів антитіл. Доменні антитіла легко експресувати у системах клітин бактерій, дріжджів і ссавців. Додаткові відомості про доменні антитіла і методи їх одержання відомі в цій галузі (див., наприклад, 5 МоМо 6291158; 6582915; 6593081; 6172197; 6696245; європейські патенти 0368684 і 0616640; МО 05/035572, МО 04/101790, МО 04/081026, МО 04/058821, МО 04/003019 ії УМО 03/002609. Нанотіла виводять з важких ланцюгів антитіла.
Нанотіло, як правило, складається з одного варіабельного домену і двох константних доменів (СН2 ї СНЗ) і зберігає антигензв'язувальну здатність вихідного антитіла. Нанотіла можна одержувати за допомогою методів, відомих у цій галузі (див., наприклад, 5 Мо 6765087, ОБ Мо 6838254, МО 06/079372). Юнібоді складаються з одного легкого ланцюга і одного важкого ланцюга антитіла ізотипу Ід054. Юнібоді можна одержувати шляхом видалення шарнірної області антитіла ізотипу Їд04. Додаткові відомості про юнібоді і методи їх одержання можна
Зо почерпнути з УМО 2007/059782.
Гомологічні антитіла
Згідно з ще одним варіантом здійснення цього винаходу антитіло або його фрагмент містить амінокислотні послідовності, гомологічні послідовностям, які представлені в таблиці 1, і антитіло зв'язується з білюоюм НЕКЗ (наприклад, з НЕКЗ людини і/або мавпи циномолгус) і зберігає необхідні функціональні властивості антитіл, представлених у таблиці 1.
Наприклад, у винаході запропоноване виділене моноклональне антитіло (або його функціональний фрагмент), яке містять варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, де: варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 956, щонайменше на 9095 або щонайменше на 9595 ідентична амінокислотній послідовності, обраній з групи, що включає 5ЕО ІЮ МО: 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357 і 375; варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 95, щонайменше на 9095 або щонайменше на 9595 ідентична амінокислотній послідовності, обраній з групи, що включає ЗЕО ІО МО: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356 і 374; антитіло зв'язується з білюом НЕКЗ (наприклад, з НЕКЗ людини і/або мавпи циномолгус) і нейтралізує сигнальну активність НЕКЗ, що можна вимірювати за допомогою аналізу фосфорилювання або за іншими показниками, що свідчать про передачу сигналів НЕК (наприклад, аналізи фосфо-НЕКЗ, аналізи фосфо-АКІ, аналізи клітинної проліферації і блокади ліганда, які описані в розділі "Приклади"). Під обсяг винаходу підпадають також нуклеотидні послідовності варіабельних областей важкого і легкого ланцюга батьківського антитіла; і послідовності повнорозмірних важких і легких ланцюгів, оптимізовані для експресії в клітинах ссавців. Інші антитіла, запропоновані у винаході, містять амінокислоти або нуклеїнові кислоти, змінені в результаті мутацій, але які усе ще ідентичні щонайменше на 60, 70, 80, 90, 95 або 9895 зазначеним вище послідовностям. Деякі варіанти здійснення винаходу включають мутантні амінокислотні послідовності, у яких не більше 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислот змінені в результаті мутацій, таких як делеція, інсерція або заміна амінокислот, у варіабельних областях у порівнянні з варіабельними областями, представленими в зазначених вище послідовностях.
В інших варіантах здійснення винаходу амінокислотні послідовності МН і/або МІ. можуть бути 60 на 50 95, 60 95, 70 95, 80 Зо, 90 9, 95 96, 96 95, 97 90, 98 95 або 99 95 ідентичні послідовностям,
представленим у таблиці 1. В інших варіантах здійснення винаходу амінокислотний послідовності МН і/або Мі можуть бути ідентичні за винятком амінокислотних замін, що зачіпають не більш ніж 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних положень. Антитіло, що містить УН- і МІ - області, що мають високу (тобто 80 95 або більше) ідентичність до МН- і Мі -областей антитіл, описаних у таблиці 1, можна одержувати шляхом мутагенезу (наприклад, сайтнаправленого або опосередковуваного ПЦР мутагенезу) з подальшим тестуванням зміненого антитіла, що кодується, відносно збереження функції за допомогою наведених у цьому описі функціональних аналізів.
В інших варіантах здійснення винаходу нуклеотидні послідовності варіабельних областей важкого ланцюга і/або легкого ланцюга можуть бути на 60 95, 70 95, 80 95, 90 95, 95 95, 96 9, 97 ЗУ», 98 95 або 99 95 ідентичні зазначеним вище послідовностям.
У контексті цього опису "відсоток ідентичності" між двома послідовностями є функцією кількості ідентичних положень у послідовностях (тобто 9о ідентичності позначає кількість ідентичних положень/загальну кількість положень х 100), беручи до уваги кількість проломів і довжину кожного пролому, який необхідно інтродуціювати для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Порівняння послідовностей і визначення відсотка ідентичності двох послідовностей можна здійснювати за допомогою описаного нижче в прикладах математичного алгоритму (але не обмежуючись тільки ним).
В іншому або додатковому варіанті білкові послідовності, запропоновані в цьому винаході, можна застосовувати також як "запитувану послідовність" при здійсненні пошуку в доступних науковій громадськості базах даних, наприклад, відносно ідентичності зі спорідненими послідовностями. Такий пошук можна здійснювати з використанням програми ВІ А5Т (версія 2.0), розробленої АїЇї5сепиї та ін., У.Мої. Віої. 215, 1990, сс. 403-410.
Антитіла з консервативними модифікаціями
У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіло, запропоноване у винаході, має варіабельну область важкого ланцюга, який містить послідовності СОКІ, СОМК2 і СОКЗ, і варіабельну область легкого ланцюга, який містить послідовності СОК1, СОК2 і СОКЗ, де одна або декілька зазначених послідовностей СОК являють собою специфічні амінокислотні послідовності, характерні для антитіл, запропонованих у цьому винаході, або їх консервативні
Зо модифікації, і де антитіла зберігають необхідні функціональні властивості НЕКЗ-зв'язувальних антитіл, запропонованих у винаході.
Таким чином, винахід відноситься до виділеного моноклонального антитіла до НЕКЗ або його фрагмента, що складається з варіабельної області важкого ланцюга, який містить послідовності СОКІ, СОМК2 ії СОРЗ, і варіабельної області легкого ланцюга, який містить послідовності СОКІ, СОК2 і СОКЗ, де: амінокислотні послідовності СОКІ1 варіабельної області важкого ланцюга вибирають з групи, яка включає 5ЕО ІЮ МО: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 2712, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 і 368 і їх консервативні модифікації; амінокислотні послідовності СОМК2 варіабельної області важкого ланцюга вибирають з групи, яка включає 5ЕО ІО МО: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 і 369 і їх консервативні модифікації; амінокислотні послідовності СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга вибирають з групи, яка включає ЗЕО ІЮ МО: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 і 370 і їх консервативні модифікації; амінокислотні послідовності СОМК1 варіабельної області легкого ланцюга вибирають з групи, яка включає ЗЕО ІЮО МО: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 і 371 і їх консервативні модифікації; амінокислотні послідовності СОК2 варіабельної області легкого ланцюга вибирають з групи, яка включає 5ЗЕО
ІО МО: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 і 372 і їх консервативні модифікації; амінокислотні послідовності СОМЗ варіабельної області легкого ланцюга вибирають з групи, яка включає 5ЕО ІЮО МО: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 і 373 і їх консервативні модифікації; де антитіло або його фрагмент специфічно зв'язується з НЕКЗ і нейтралізує активність НЕКЗ шляхом інгібування шляху передачі сигналу НЕК, що можна вимірювати за допомогою аналізу фосфорилювання або за іншими показниками, що свідчать про передачу сигналу НЕК бо (наприклад, аналізи фосфо-НЕКЗ, аналізи фосфо-АКІ, аналізи клітинної проліферації і блокади ліганда, які описані в розділі "Приклади").
Антитіла, які зв'язуються з тим же епітопом
Цей винахід відноситься до антитіл, які взаємодіють (наприклад, шляхом зв'язування, створення стеричної перешкоди, стабілізації/дестабілізації, просторового розподілу) з тим же епітопом, що і НЕКЗ-зв'язувальні антитіла, представлені в таблиці 1 і зазначені на фіг. 7. Так, додаткові антитіла можна ідентифікувати за їхньою здатністю до перехресної конкуренції (наприклад, до статистично значимого конкурентного інгібування зв'язування) з іншими антитілами, запропонованими у винаході, за допомогою аналізів зв'язування НЕКЗ. Здатність антитіла, що тестується, інгібувати зв'язування антитіл, запропонованих у цьому винаході, з білком НЕКЗ (наприклад, НЕКЗ людини і/або мавпи циномолгус) свідчить про те, що антитіло, що тестується, може конкурувати із зазначеним антитілом за зв'язування з НЕКЗ; відповідно до однієї з можливих теорій таке антитіло може зв'язуватися з тим же або спорідненим (наприклад, структурно подібним або таким, що перебуває у просторовій близькості) епітопом на білку
НЕКЗ, що й антитіло, з яким воно конкурує. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло, яке зв'язується з тим же епітопом на НЕКЗ, що й антитіла, запропоновані в цьому винаході, являє собою людське моноклональне антитіло. Зазначені людські моноклональні антитіла можна одержувати і виділяти згідно з представленими у цьому описі методам.
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується як з доменом 2, так і з доменом 4 НЕКЗ, підтримуючи тим самим НЕКЗ у неактивній конформації, яка перешкоджає експонуванню петлі димеризації, що присутня у домені 2. Це перешкоджає гетеродимеризації з іншими представниками сімейства, такими як НЕК, НЕК? і
НЕКАЯ. Антитіла або їх фрагменти інгібують як залежну від ліганда, так і незалежну від ліганда трансдукцію сигналу НЕКЗ.
Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується як з доменом 2, так і з доменом 4 НЕКЗ, але не блокує одночасне зв'язування ліганда НЕКЗ, такого як нейрегулін. Не вдаючись у яку-небудь теорію, можна припустити, що антитіло або його фрагмент зв'язується як з доменом 2, так і з доменом 4 НЕКЗ, підтримуючи тим самим НЕКЗ у неактивній конформації, але не блокуючи сайт зв'язування ліганда на НЕКЗ. У результаті ліганд
НЕКЗ (наприклад, нейрегулін) має здатність зв'язуватися з НЕКЗ одночасно з антитілом або
Зо його фрагментом.
Антитіла, запропоновані у винаході, або їх фрагменти інгібують як залежну від ліганда, так і незалежну від ліганда активацію НЕКЗ, не перешкоджаючи зв'язуванню ліганда. Це розглядається як перевага з наступних причин:
І) терапевтичне антитіло може знайти клінічне застосування відносно більш широкого спектра пухлин, ніж антитіло, спрямоване тільки на один механізм активації НЕКЗ (тобто залежної від ліганда або незалежної від ліганда), оскільки кожний механізм обумовлює різні типи пухлин; (ІІ) терапевтичне антитіло може мати ефективність відносно різних типів пухлин, при яких одночасно беруть участь обидва механізми активації НЕКЗ. Антитіло, спрямоване тільки на один механізм активації НЕКЗ (тобто залежної від ліганда або незалежної від ліганда), повинно мати меншу ефективність або не мати ефективність відносно цих типів пухлин; (ІП) на ефективність антитіла, яке інгібує залежну від ліганда активацію НЕКЗ, не перешкоджаючи при цьому зв'язуванню ліганда, з меншою ймовірністю буде чинити шкідливий вплив на зростаючі концентрації ліганда. Це може приводити або до підвищеної ефективності відносно типу пухлини, що викликається дуже високими концентраціями ліганда НЕКЗ, або до зниженої схильності до розвитку стійкості до лікарських засобів у тому випадку, коли стійкість опосередкована підвищувальною регуляцією лігандів НЕКЗ; (ІМ) антитіло, яке інгібує активацію НЕКЗ шляхом стабілізації неактивної форми, повинно бути менш схильним до стійкості до лікарських засобів, пов'язаних з альтернативними механізмами активації НЕКЗ.
Отже, антитіла, запропоновані у винаході, можна застосовувати для лікування станів, у відношенні яких терапевтичні антитіла, існують в цей час, є клінічно неефективними.
Сконструйовані і модифіковані антитіла
Антитіло, запропоноване у винаході, можна одержувати також з використанням антитіла, яке має одну або декілька зазначених у цьому описі послідовностей МН і/або Мі, як вихідний матеріал для створення модифікованого антитіла, де модифіковане антитіло може мати змінені властивості у порівнянні з вихідним антитілом. Антитіло можна створювати шляхом модифікації одного або декількох залишків в одній або обох варіабельних областях (тобто МН і/або МІ), наприклад, в одній або декількох СОК-ділянках і/або в одній або декількох каркасних ділянках. У бо додатковому або альтернативному варіанті антитіло можна створювати шляхом модифікації залишків у константній(их) області(ях), наприклад, для зміни ефекторної(их) функції(ій) антитіла.
Для здійснення одного з типів конструювання варіабельної області можна застосовувати трансплатацію СОК. Антитіла взаємодіють з антигенами-мішенями в основному за допомогою амінокислотних залишків, локалізованих у шести гіперваріабельних ділянках (СОК) важкого і легкого ланцюга. З цієї причини між амінокислотними залишками в СОК індивідуальних антитіл існують ще значніші відмінності, ніж в послідовностях поза СОК. Оскільки послідовності СОК відповідальні за більшу частину взаємодій антитіло-антиген, можна експресувати рекомбінантні антитіла, які імітують властивості конкретних антитіл, що зустрічаються в природних умовах, шляхом конструювання експресійних векторів, які містять послідовності СОК з конкретного антитіла, що зустрічається в природних умовах, отримані шляхом трансплантації в послідовності каркасних ділянок з інших антитіл з іншими властивостями (див., наприклад,
Кіесптапп та ін., Маїшге 332, 1998, сб. 323-327; допе5 та ін., Майшге, 321, 1986, сс. 522-525;
Оцееп та ін., Ргос. МаїЇ. Асай. ее. О.5.А. 86, 1989, сс. 10029-10033; О5 Мо 5225539 на ім'я
УмМіптег і О5 МоМо 5530101; 5585089; 5693762 і 6180370 на ім'я Оцееп зі співавторами).
Таким чином, наступним варіантом здійснення винаходу є виділене НЕКЗ-зв'язувальне моноклональне антитіло або його фрагмент, яке/який містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає послідовності СОКІ, які мають амінокислотні послідовності, обрані з групи, що включає ЗЕО ІО МО: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 і 368; послідовності СОК2, які мають амінокислотні послідовності, обрані з групи, що включає ЗЕО ІО МО: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 і 369; послідовності СОКЗ, які мають амінокислотні послідовності, обрані з групи, що включає 5ЕО ІЮ МО: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 і 370 відповідно; варіабельну область легкого ланцюга, що включає послідовності СОМ, які мають амінокислотні послідовності, обрані з групи, що включає ЗЕО ІЮ
МО: 5, 11, 23, 29, АТ, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 і 371; послідовності СОК2, які мають амінокислотні послідовності, обрані з групи, що включає ЗЕО ІЮ
МО: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 і 372; і послідовності СОМКЗ, які мають амінокислотні послідовності, обрані з групи, що включає ЗЕО ІЮ
МО: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367і 373 відповідно. Таким чином, зазначені антитіла містять послідовності СОК МН і МІ. моноклональних антитіл, крім того, вони можуть містити різні послідовності каркасних ділянок зазначених антитіл. Зазначені послідовності каркасних ділянок можна одержувати з публічних баз даних
ДНК або опублікованих посилань, які містять послідовності генів зародкової лінії антитіл.
Наприклад, послідовності ДНК генів зародкової лінії варіабельних областей людських важких і легких ланцюгів можна знайти в базі даних послідовностей людської зародкової лінії "Мравзе" (доступної в Інтернеті на сайті м/млу.тго-сре.сат.ас.ик/у/разе), а також в Кабаї Е. А. та ін.,
Зедиєпсез ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодісаї Іпіегеві, 1991, 15-те вид., вид-во О.5. Оерагітепі ої Неайй апа Нитап 5егуісез, МІН Рибіїсайоп Мо. 91-3242; Споїпіа та ін., У. Мої. Віої. 196, 1987, сс. 901- 917; Споїпіа та ін., Майшге 342, 1989, сс. 877-883; і АГ-І агікапі та ін., У. Мої. ВіоїЇ. 273, 1997, сс. 927-948; Тотіїп5оп та ін., 9. 0. Віої. 227, 1992, сс. 776-798; і Сох та ін., Єиг. У Іттипої. 24, 1994, сс. 827-836; зміст кожної з публікацій спеціально включено в цей опис як посилання.
Прикладом послідовностей каркасних ділянок, призначених для застосування в антитілах, запропонованих у винаході, є послідовності, структурно подібні до послідовностей каркасних ділянок, які входять у відібрані антитіла, запропоновані у винаході, наприклад, консенсусні послідовності і/або послідовності каркасних ділянок, які входять у моноклональні антитіла, запропоновані у винаході. Послідовності СОКТ, 2 ї З МН їі послідовності СОКІ, 2 і З МІ можна трансплантувати у каркасні ділянки, які мають послідовність, ідентичну послідовності гена імуноглобуліну зародкової лінії з якого виведена послідовність каркасної ділянки, або послідовності СОМ можна трансплантувати у каркасні ділянки, які містять одну або кілька мутацій у порівнянні з послідовностями зародкової лінії. Наприклад, було встановлено, що в визначених випадках доцільно змінювати за допомогою мутації залишки в каркасних ділянках для підтримки або підвищення здатності антитіла зв'язуватися з антигеном (див., наприклад, О5
МоМо 5530101; 5585089; 5693762 і 6180370 на ім'я Оцееєп зі співавторами). бо Іншим типом модифікації варіабельної області є мутація амінокислотних залишків в СОК'І,
СОК2 (або СОМКЗ МН- і/або Мі -областей, яка підвищує одну або кілька здатностей до зв'язування (наприклад, афінність) антитіла, яке представляє інтерес, що називають "дозріванням афінності". Для інтродукції мутаціїїй) можна застосовувати сайтнаправлений мутагенез або ПЦР-опосередковуваний мутагенез, і впливи на зв'язування антитіла або на іншу функціональну властивість, що представляє інтерес, можна оцінювати за допомогою аналізів іп мійго або іп мімо, представлених у цьому описі і описаних у розділі "Приклади". Можна інтродуціювати консервативні модифікації (зазначені вище). Мутації можуть являти собою амінокислотні заміни, додавання або делеції. Крім того, як правило, змінюють не більше 1, 2, 3, 4 або 5 залишків в СОК-ділянці.
Таким чином, іншим варіантом здійснення винаходу є виділені НЕКЗ-зв'язувальні моноклональні антитіла або їх фрагменти, які включають варіабельну область важкого ланцюга, що містить: СОК1-ділянку МН-області, яка має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що включає 5ЕО ІЮО МО: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134,146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 і 368, або амінокислотну послідовність з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з «ЕО ІЮ МО: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 і 368; СОК2-ділянку МН-області, яка має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що включає 5ЕО ІЮ МО: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 і 369, або амінокислотну послідовність з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з 5ЕО ІЮ
МО: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 і 369;
СОВЗ-ділянка МН-області, яка має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що включає
ЗЕО ІЮО МО: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 і 370, або амінокислотну послідовність з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з зЗЕО ІЮ МО: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94,
Зо 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 і 370; СОКІ1-ділянку МІ -області, яка має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що включає 5ЕО ІЮ МО: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 і 371, або амінокислотну послідовність з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з ФЕО ІЮО МО: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 і 371; СОК2-ділянку МІ -області, яка має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що включає 5ЕО ІЮ МО: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 і 372, або амінокислотну послідовність з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з хЕО ІЮО МО: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 і 372; і СОКЗ-ділянку Мі -області, яка має амінокислотну послідовність, обрану з групи, що включає ЗЕО ІЮ МО: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 і 373,або амінокислотну послідовність з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з ФЕО ІЮО МО: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 і 373.
Трансплантація фрагментів антитіл в альтернативні кістяки або каркаси
Широку різноманітність кістяків або каркасів антитіл/муноглобулінів можна застосовувати, якщо поліпептид, що утворився, включає щонайменше одну зв'язувальну ділянку, яка специфічно зв'язується з НЕКЗ. Такі кістяки або каркаси включають 5 основних ідіотипів людських імуноглобулінів або їх фрагментів, і включають імуноглобуліни інших видів тварин, які краще мають гуманізовані аспекти. Фахівці в цій галузі продовжують відкривати і створювати нові кістяки, каркаси та фрагменти.
Одним з об'єктів винаходу є створення антитіл на основі неімуноглобулінових кістяків з бо використанням неімуноглобулінових каркасів, у які можна трансплантувати СОЕ, запропоновані у винаході. Можна застосовувати відомі або ті, які можуть бути відкриті в майбутньому, неімуноглобулінові кістяки і каркаси, якщо вони містять зв'язувальну ділянку, специфічну для білка-мішені НЕКЗ (наприклад, НЕКЗ людини і/або мавпи циномолгус). Відомі неімуноглобулінові кістяки або каркаси включають (але не обмежуючись тільки ними) фібронектин (фірма Сотроцпі Тпегарешіс5, Іпс., Уолтем, шт. Массачусетс), анкірин (фірма
Моїесціаг Рагіпег5 АС, Цюріх, Швейцарія), доменні антитіла (фірма Юотапіїх, Ча. (Кембридж, шт. Масачусетс і фірма Аріупх пм (Цвінаарде, Бельгія)), ліпокалін (фірма Ріегі5 Ргоїеоіїар АС,
Фрейзінг, Німеччина), невеликі модульні імунологічні фармацевтичні агенти (фірма Тгиріоп
Рпаптасешііса!5 Іпс., Сієтл, шт. Вашинітона), макситіла (фірма Аміадіа, Іпс. (Маунтін-В'ю, шт.
Каліфорнія), білок А (фірма Айібоду АС, Швеція) і афілін (гамма-кристалін або убікітин) (фірма зсіЇ Ргоївіп5 тб, Галле, Німеччина).
Основою фібронектинових каркасів є домен фібронектину типу І (наприклад, десятий модуль фібронектину типу І (домен 10 ЕРп3). Домен фібронектину типу Ії несе 7 або 8 бета- ланцюгів, які розподілені між двома бета-складками, які самі упаковані одна напроти одної з утворенням ядра білка, і додатково містять петлі (аналоги СОК), які з'єднують бета-ланцюги один з одним і є доступними для розчинника. Відомо щонайменше три такі петлі на кожному краї бета-складчастого "сендвіча", при цьому край є границею білка, перпендикулярною до напрямку бета-ланцюгів (5 Мо 6818418). Ці каркаси, основою яких є фібронектин, не являють собою імуноглобулін, хоча загальна укладка дуже схожа на укладку найменшого фрагмента антитіла, що має функціональну активність, тобто варіабельної області важкого ланцюга, який містить повний компонент, що розпізнає антиген, в (до представників верблюжих і лам. Завдяки зазначеній структурі антитіло, що не представляє собою імуноглобулін, імітує антигензв'язувальні властивості, які нагадують за природою і афінністю властивості антитіл. Ці каркаси можна застосовувати для стратегії рандомізації і перестановки петель іп міо, що подібно до процесу дозрівання афінності антитіл іп мімо. Такі молекули, основою яких є фібронектин, можна застосовувати як каркаси, у яких області петель молекули можна заміняти на СОК, запропоновані у винаході, за допомогою стандартних методів клонування.
Технологія анкіриновання заснована на застосуванні білків, що несуть виведені з анкірину повторювані модулі як каркаси для варіабельних областей, які можна використовувати для
Зо зв'язування з різними мішенями. Повторюваний анкіриновий модуль являє собою поліпептид, що складається з 33 амінокислот, який містить дві антипаралельні а-спіралі і Д-петлі.
Зв'язування варіабельних областей максимально оптимізують за допомогою рибосомального дисплею.
Авімери одержують з білка, що зустрічається в природних умовах, який містить А-домен, такого як НЕКЗ. Ці домени використовуються в природних умовах для білок-білкових взаємодій, і у людини структурною основою більш ніж 250 білків є А-домени. Авімери складаються з декількох різних мономерів "А-домену" (2-10), зчеплених за допомогою амінокислотних лінкерів.
Можна створювати авімери, які можуть зв'язуватися з антигеном-мішенню, з використанням методології, описаної, наприклад, у публікаціях заявок на патенти США МоМо 20040175756; 20050053973; 20050048512; і 20060008844.
Ліганди фірми Айіроду, що мають афінність, являють собою невеликі прості білки, що складаються з трьохспірального пучка, основою якого є каркас одного з ІдбсС-зв'язувальних доменів білка А. Білок А являє собою поверхневий білок бактерії Єтарпуіососси5 айгеив. Цей каркасний домен складається з 58 амінокислот, 13 з яких довільно використовували для створення бібліотек Айіроду з великою кількістю варіантів ліганду (див., наприклад, ОБ Мо 5831012). Молекули Айбоау нагадують антитіла, їх молекулярна маса становить 6 кДа, для порівняння молекулярна маса антитіл становить 150 кДа. Незважаючи на невеликий розмір, сайт зв'язування молекул Айіроду подібний до сайту зв'язування антитіла.
Антикаліни являють собою продукти, розроблені компанією Ріегіз Ргоїеоіаб дО. Їх одержують з ліпокалінів, широко розповсюдженої групи невеликих і ефективних білків, які, як правило, беруть участь у фізіологічному транспорті або зберіганні чутливих до хімічних агентів або нерозчинних сполук. Декілька ліпокалінів, що зустрічаються в природних умовах, виявлено у тканинах або загальній воді організму людини. Їхня білкова архітектура нагадує структуру імуноглобулінів з гіперваріабельними петлями на вершині твердого кістяка. Однак на відміну від антитіл або їх рекомбінантних фрагментів ліпокаліни складаються з одного поліпептидного ланцюга, що містить 160-180 амінокислотних залишків, тобто дещо більшої, ніж один домен імуноглобуліну. Набір з чотирьох петель, які утворюють зв'язувальну кишеню, має виражену структурну пластичність і допускає широку різноманітність бічних ланцюгів. Таким чином, при використанні відповідного процесу сайту зв'язування можна надавати нову форму, призначену бо для розпізнавання з високою афінністю і специфічністю заздалегідь визначених молекул-
мішеней різної форми. Один з білків сімейства ліпокалінів, а саме зв'язувальний білін білок (ВВР) з Рієтіз Бгаззісає (капустяна білявка), використовували для створення антикалінів шляхом мутагенезу, що зачіпає чотири петлі. Однією із заявок на патент, у яких описані антикаліни, наведеної як приклад, є опублікована заявка РСТ МО 1999/16873.
Молекули афілінів являють собою невеликі неімуноглобулінові білки, які розроблені з метою досягнення специфічних афінностей до білків і невеликих молекул. Нові молекули афілінів можна дуже швидко відбирати з двох бібліотек, основою кожної з яких є різні отримані з людського організму білки-каркаси. Молекули афілінів не мають якої-небудь структурної гомології з білками імуноглобулінів. У цей час застосовують два афілінівих каркаси, одним з яких є гамма-кристалін, людський структурний білок кришталика ока, а іншим є білки суперсімейства "Уубікітинуї Обидва людських каркаси мають дуже малий розмір, характеризуються високою теплостійкістю і практично стійкі до змін значень рН і дії денатуруючих агентів. Зазначена висока стабільність головним чином є результатом розширеної бета-складчастої конформації білків. Приклади виведених з гамма-кристаліну білків описані в УМО 2001/04144, а приклади "убікітиноподібних" білків описані в УМО 2004/106368.
Міметики білкових епітопів (РЕМ) являють собою циклічні молекули, що мають середній розмір, і нагадують пептиди (ММ 1-2 кДа), які імітують вторинні структури білків типу бета- «шпильок", тобто основну вторинну структуру, що бере участь у білок-білкових взаємодіях.
У деяких варіантах здійснення винаходу Гар-фрагменти перетворюють у мовчазний дос 1- формат шляхом зміни Ес-області. Наприклад, антитіла, представлені в таблиці, можна перетворювати в ІдДб-формат.
Людські або гуманізовані антитіла
Цей винахід відноситься до повністю людських антитіл, які специфічно зв'язуються з білком
НЕКЗ (наприклад, НЕКЗ людини і/або мавпи циномолгус/миші/лпацюка). У порівнянні з химерними або гуманізованими антитілами людські НЕКЗ-зв'язувальні антитіла, запропоновані у винаході, мають також знижену антигенність при введенні людині.
Людські НЕКЗ-зв'язувальні антитіла можна створювати за допомогою методів, відомих у цій галузі. Наприклад, технологію "гуманування" застосовують для перетворення нелюдських антитіл у сконструйовані людські антитіла. У публікації патенту США Мо 2005/0008625 описаний
Зо метод іп мімо заміни варіабельної області нелюдського антитіла на варіабельну область людського антитіла зі збереженням або навіть поліпшенням характеристик зв'язування у порівнянні з нелюдським антитілом. Метод заснований на залежній від епітопу заміні варіабельних областей нелюдського референс-антитіла на повністю людське антитіло. Людське антитіло, що утворилося, як правило, має неспоріднену структуру відносно нелюдського референс-антитіла, але воно зв'язується з тим же епітопом на тому ж антигені, що й референс- антитіло. У цілому, метод полягає в наступному: серійний заснований на залежній від епітопа комплементарній заміні підхід здійснюють шляхом створення конкуренції в клітинах між "конкурентом" і бібліотекою різноманітних гібридів референс-антитіла ("антитіла, що тестуються") за зв'язування з кількостями антигену, що лімітують, в присутності репортерної системи, яка реагує на зв'язування антитіла, що тестується, з антигеном. Конкурент може являти собою референс-антитіло або його похідне, таке як одноланцюговий Ем-фрагмент.
Конкурент може також являти собою ліганд антигену, що зустрічається в природних умовах або штучний, який зв'язується з тим же епітопом, що й референс-антитіло. Єдині вимоги, що пред'являються до конкурента, полягають у тому, що він повинен зв'язуватися з тим же епітопом, що й референос-антитіло, і що він повинен конкурувати з референс-антитілом за зв'язування з антигеном. Антитіла, що тестуються, мають одну антигензв'язувальну М-область, спільну з М-областю нелюдського референс-антитіла, і іншу М-область, довільно обрану з іншого джерела, такого як бібліотека набору людських антитіл. М-область, спільна з М-областю нелюдського референс-антитіла, служить як "провідник", що позиціонує антитіла, які тестуються, на той же епітоп антигену і у тій же орієнтації, у результаті чого селекція йде в напрямку найбільш високої спорідненості до референс-антитіла.
Для виявлення необхідних взаємодій між антитілами, що тестуються, і антигеном можна застосовувати велику кількість типів репортерних систем. Наприклад, комплементуючі репортерні фрагменти можна зв'язувати з антигеном і антитілом, що тестується, відповідно, так що активація репортера в результаті комплементації фрагментом відбувається тільки тоді, коли антитіло, що тестується, зв'язується з антигеном. Коли злиття антитіло, що тестується, - і антиген-репортерного фрагмента, спільно експресують з конкурентом, активація репортера починає залежати від здатності антитіла, що тестується, конкурувати з конкурентом, яка пропорційна афінності антитіла, що тестується, до антигену. Інші репортерні системи, які можна бо застосовувати, включають реактиватор репортерної системи реактивації, що самоінгібується
(КАК), описаний у заявці на патент США сер. Мо 10/208730 (публікація Мо 2003/0198971), або конкурентну систему активації, описану в заявці на патент США, сер. Мо 10/076845 (публікація
Мо 2003/0157579).
За допомогою серійної системи, заснованої на залежній від епітопа комплементарній заміні, здійснюють селекцію з метою ідентифікації клітин, що експресують індивідуальне антитіло, яке тестується, у комбінації з конкурентом, антигеном і компонентами, що представляють собою репортер. У цих клітинах кожне антитіло, що тестується, конкурує "один-на-один" з конкурентом за зв'язування з лімітуючою кількістю антигену. Активність репортера пропорційна кількості антигену, зв'язаного з антитілом, яке тестується, що, у свою чергу, пропорційно афінності антитіла, що тестується, до антигену і стабільності антитіла, що тестується. Антитіла, що тестуються, спочатку відбирають на основі їх активності відносно активності референс-антитіла, коли воно експресується аналогічно антитілу, що тестується. У результаті першого циклу селекції одержують масив "гібридних" антитіл, кожне з яких включає ту саму нелюдську М- область з референс-антитіла і людську М-область з бібліотеки, і кожне з яких зв'язується з тим же епітопом на антигені, що й референс-антитіло. Одне або кілька гібридних антитіл, відібраних у першому циклі, повинні мати афінність до антигену, що порівняна або перевищує афінність референс-антитіла.
На другій стадії заміни М-області застосовують людські У-області, відібрані на першій стадії, як "провідники" при відборі замін на людські області М-області, що залишилася, нелюдського референс-антитіла, використовуючи іншу бібліотеку споріднених людських У-областей. Гібридні антитіла, відібрані в першому циклі, можна застосовувати також як конкуренти для другого циклу селекції. У результаті другого циклу селекції одержують масив повністю людських антитіл, що структурно відмінні від референс-антитіла, але мають здатність конкурувати з референс-антитілом за зв'язування з тим самим антигеном. Деякі з відібраних людських антитіл зв'язуються з тим же епітопом на тому ж антигені, з яким зв'язується референс-антитіло. З цих відібраних людських антитіл одне або декілька зв'язується(ються) з тим же епітопом з афінністю, що порівняна або перевищує афінність референс-антитіла.
Використовуючи одне з мишачих або химерних НЕРВЗ-зв'язувальний антитіл, описаних вище, як референс-антитіло, цей метод легко адаптувати для створення людських антитіл, які
Зо зв'язуються з людським НЕНЗ з такою ж специфічністю зв'язування і з такою ж або з поліпшеною афінністю зв'язування. Крім того, зазначені людські НЕНЗ-зв'язувальні антитіла можна також одержувати на комерційній основі від компаній, які роблять людські антитіла з метою продажу, таких, наприклад, як фірма КаїпшоВіов, Іпс. (Маунтін-В'ю, шт. Каліфорнія).
Верблюжі антитіла
Білки антитіл, отримані з представників сімейства двогорбих і одногорбих верблюдів (Сатеїиз Басігпапиз і СаІєЇн5 аготадегіив), включаючи представників тварин Нового Світу, таких як різні види лам (Гата рассов, І ата діата і І ата місцдпа), охарактеризовані у відношенні їх розміру, структурної комплексності та антигенності відносно людини. Встановлено, що деякі антитіла типу Їдс з цього сімейства ссавців у природних умовах позбавлені легких ланцюгів і тому відрізняються за структурою від типової четвертинної структури, що складається з чотирьох ланцюгів, з двома важкими і двома легкими ланцюгами, характерної для антитіл з організму інших тварин (див. РСТ/ЕРО3/02214 (МО 94/04678, опубліковано З березня 1994 р.)). часток верблюжого антитіла, що представляє собою невелику індивідуальну варіабельну область, позначену як МНН, можна створювати за допомогою генної інженерії з одержанням невеликого білка, що має високу афінність до мішені що приводить до одержання низькомолекулярного виведеного з антитіла білка, який позначають як "зерблюже нанотіло" (див. О5 Мо 5759808, виданий 2 червня 1998 р.; див. також ЗщЩетапв та ін., У ВіоЇ Спет 279, 2004, сс. 1256-1261; Юитошіп та ін., Майте 424, 2003, сс. 783-788; Ріезспрегдег та ін.
Віосопіддаге Спет 14, 2003, сс. 440-448; Сопе;-Кегато7о та ін., Іпї У Сапсег 89, 2002, сс. 456-
БО 462; і | ашмегеуз та ін., ЕМВО У 17, 1998, сс. 3512-3520). Створені бібліотеки верблюжих антитіл і фрагментів антитіл доступні на комерційній основі, наприклад, від фірми Абіупх, Гент, Бельгія (например, 5 Ме 2006/0115470; фірми Юотапііїз (05 Ме 2007/0065440, 005 Мо 2009/0148434).
Аналогічно іншим антитілам, отриманим з видів крім людини, амінокислотну послідовність верблюжого антитіла можна змінювати рекомбінантно з одержанням послідовності, що в більшій мірі нагадує людську послідовність, тобто нанотіло можна "гуманізувати". Таким шляхом можна додатково знижувати природню низьку антигенність верблюжих антитіл для людей.
Верблюже нанотіло має молекулярну масу, що складає приблизно 1/10 від молекулярної маси людського до, а фізичний діаметр білка становить лише кілька нанометрів. Однією з пов'язаних з малим розміром особливостей є здатність верблюжих нанотіл зв'язуватися з антигенними бо сайтами, які є функціонально непомітними для великих білкових антитіл, тобто верблюжі нанотіла можна застосовувати як реагенти, що виявляють антигени, які залишаються схованими при використанні класичних імунологічних методів, і можливо як терапевтичні агенти. Таким чином, іншою особливістю верблюжого нанотіла, пов'язаною з його малим розміром, є здатність інгібувати зв'язування зі специфічним сайтом у борозенці або вузькій щілині білка-мішені, і тому їх можна застосовувати як субстанцію, що більше нагадує за своєю функцією класичний низькомолекулярний лікарський засіб, ніж класичне антитіло.
Невелика молекулярна маса і компактний розмір обумовлюють також дуже високу термостабільність, стабільність при екстремальних значеннях рН і стабільність до протеолітичного розщеплення і низьку антигенність верблюжих нанотіл. Ще одним наслідком зазначених особливостей є те, що верблюжі нанотіла легко проникають з кровоносної системи в тканини ії навіть проникають через гематоенцефалічний бар'єр і їх можна застосовувати для лікування захворювань, що вражають нервову тканину. Нанотіла можуть полегшувати також транспорт лікарських засобів через гематоенцефалічний бар'єр (див. заявку на патент США Мо 2004/0161738, опубліковану 19 серпня 2004 г). Ці особливості у комбінації з низькою антигенність у відношенні людей свідчать про їхній великий терапевтичний потенціал. Крім того, ці молекули можна повністю експресувати у прокаріотичних клітинах, таких як БЕ. сої, і експресувати у вигляді злитих білків з бактеріофагом, і вони є функціонально активними.
Таким чином, характерною ознакою цього винаходу є верблюже антитіло або нанотіло, що має високу афінність до НЕКЗ. У конкретних варіантах здійснення винаходу верблюже антитіло або нанотіло одержують у природних умовах у тварині з сімейства верблюдових, тобто воно продукується в організмі представника верблюдових після імунізації НЕКЗ або його пептидним фрагментом з використанням методів, представлених у цьому описі для інших антитіл. В іншому варіанті верблюже зв'язувальне НЕКЗ нанотіло конструюють, тобто одержують шляхом відбору, наприклад, з фагових дисплейних бібліотек у відповідний спосіб мутованих білками верблюжих нанотіл, за допомогою методу пенінгу з використанням як мішені НЕКЗ, як описано в наведених в цьому описі прикладах. Сконструйовані нанотіла можна додатково вдосконалити за допомогою генної інженерії таким чином, щоб час їх напівжиття в реципієнті становив від 45 хв до 2 тижнів. У конкретному варіанті здійснення винаходу верблюже антитіло або нанотіло одержують шляхом трансплантації послідовностей СОК важкого або легкого ланцюга людських антитіл, запропонованих у винаході, у нанотіло або в послідовності каркасних ділянок, що має один домен антитіла згідно з методами, описаними, наприклад в РСТ/ЕРОЗ3/02214. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу верблюже антитіло або нанотіло зв'язується щонайменше з одним з наступних залишків НЕКЗ: Аз5п266, І уз267, І ец268, Тпг269, СІп271,
Сіш273, Рго274, Авзп275, Рго276, Нів277, Авзп315, Авр571, Рго583, Ніз584, Аїаб96, Іуз597.
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу верблюже антитіло або нанотіло зв'язується щонайменше з одним з наступних залишків НЕКЗ: Туг2б65, І ув267, І ец268, Рпе270,
Сспіуб82, Рго583, І уз597, Пебоб, І уз602, С1и609, Агаб11, Ргоб12, Сузб13, Нізб14, 11615.
Біспецифічні молекули і багатовалентні антитіла
Наступним об'єктом цього винаходу є біпаратопні, біспецифічні або мультиспецифічні молекули, що містять НЕКЗ-зв'язувальне антитіло або його фрагмент, запропоноване/запропонований у винаході. Антитіло, запропоноване у винахід, або його фрагмент можна дериватизувати або зв'язувати з іншою функціонально активною молекулою, наприклад, іншим пептидом або білком (наприклад, іншим антитілом або лігандом рецептора), з одержанням біспецифічної молекули, яка зв'язується щонайменше з двома різними сайтами зв'язування або молекулами-мішенями. Антитіло, запропоноване у винаході, фактично може бути дериватизироване або зв'язане більш ніж з однією іншою функціонально активною молекулою з утворенням біпаратопних або мультиспецифічних молекул, які зв'язуються більш ніж з двома різними сайтами зв'язування і/або молекулами-мішенями; мається на увазі, що в контексті цього опису зазначені біпаратопні або мультиспецифічні молекули також підпадають під поняття "біспецифічна молекула". Для створення біспецифічної молекули, запропонованої у винаході, антитіло, запропоноване у винаході, можна функціонально зв'язувати (наприклад, шляхом хімічної комбінації, генетичного злиття, нековалентної асоціації або іншим способом) з однією або декількома іншими зв'язувальними молекулами, такими як інше антитіло, фрагмент антитіла, пептид або зв'язувальний міметик, з одержанням біспецифічної молекули.
Додаткову терапевтично сприятливу дію можна одержувати шляхом зв'язування з одним антитілом двох або більшої кількості антигенів (СоЇота та ін., 1997; Мегсвапі та ін., 1998; Ак та ін., 1999; 2цо та ін., 2000; и та ін., 2004; І и та ін., 2005; Магміп та ін., 2005; Магміп та ін., 2006;
Зпеп та ін., 2007; УМи та ін., 2007; Оітаві та ін., 2009; МіспаєїЇзоп та ін., 2009; Моттізхоп та ін.,
Майшге Віоїесі. 15, 1997, сс. 159-163; АК та ін., ЕЕВ5 І ецЦег5 454, 1999, сс. 90-94; 4цо та ін., 60 Ргоїєїп Епдіпеегіпу 13, 2000, сс. 361-367; І и та ін., УВС 279, 2004, сс. 2856-2865; І и та ін., УВС
280, 2005, сс. 19665-19672; Магміп та ін., Асіа Рпаптасоїодіса 5іпіса 26, 2005, сс. 649-658; Магміп та ін., Сшт Оріп Огид бізс ЮОемеїор 9, 2006, сс. 184-193; ЗПеп та ін., У Іттип Меїпоа5 218, 2007, сс. 65-74; УММи та ін., Маї Віогїесппої. 11, 2007, сс. 1290-1297; Оітаві та ін., У Мої Віої. 393, 2009, сс. 672-692 і Міспає І50оп та ін., табрз 1, 2009, сс. 128-141).
Біспецифічні молекули, запропоновані в цьому винаході, можна одержувати шляхом кон'югації компонентів, що представляють собою специфічності, які мають здатність до зв'язування, за допомогою методів, відомих у цій галузі. Наприклад, кожну специфічність біспецифічної молекули, що має здатність до зв'язування, можна створювати окремо і потім кон'югувати одна з одною. Коли специфічності, що мають здатність до зв'язування, являють собою білки або пептиди, для ковалентної кон'югації можна використовувати цілий ряд агентів для зв'язування або перехресного зшивання. Прикладами перехреснозшиваючих агентів є білок
А, карбодиіїмід, М-сукцинімідил-5-ацетилтіоацетат (ЗАТА), 5,5'-дитіобіс(2-нітробензойна кислота) (ОТМВ), орто-фенілендималеїмід (ОРОМ), М-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат (5РОР) ї сульфосукцинімідил-4-(М-малеімідометил)циклогексан-І-карбоксилат (сульфо-ЗМОС) (див., наприклад, КагроухкКу та ін., У. Ехр. Меа. 160, 1984, с. 1686; Пи М.А. та ін., Ргос. Маї!. Асаа.
Зсі. ОБА 82, 1985, с. 8648). Інші методи являють собою методи, описані уРацшіи5, Вепйгіпд Іп5.
Мій. Мо. 78, 1985, сс. 118-132; Вгеппап та ін., зсіепсе 229, 1985, сс. 81-83) і СіІеппіє та ін., ).
Ітітипої. 139, 1987, сс. 2367-2375). Такі призначені для кон'югації агенти, як ЗАТА їі сульфо-
ЗМСС, обидва надходять у продаж від фірми Ріегсе Спетісаї! Со. (Рокфорд, шт. Іллінойс).
Коли специфічності, що мають здатність до зв'язування, являють собою антитіла, то їх можна кон'югувати за допомогою сульфгідрильного зв'язку С-кінцевих шарнірних областей двох важких ланцюгів. У конкретному варіанті здійснення винаходу шарнірну область модифікують таким чином, щоб вона до кон'югації містила непарну кількість сульфгідрильних залишків, наприклад, один.
В альтернативному варіанті обидві специфічності, що мають здатність до зв'язування, можна кодувати в тому самому векторі і експресувати і збирати в одній і тій же клітині-хазяїні.
Цей метод є найбільш доцільним, коли біспецифічна молекула являє собою злитий білок, такий як МАт х МАт, МАт х Раб, Раб хЕК(аб)г2 або ліганд х Раб. Біспецифічна молекула, запропонована у винаході, може являти собою одноланцюгову молекулу, яка містить одноланцюгове антитіло і
Зо зв'язувальну детермінанту, або одноланцюгову біспецифічну молекулу, яка містить дві зв'язувальні детермінанти. Біспецифічні молекули можуть містити щонайменше дві одноланцюгові молекули. Методи одержання біспецифічних молекул описані, наприклад, в 5
Мо 5260203; 005 Мо 5455030; 05 Мо 4881175; 05 Мо 5132405; 05 Мо 5091513; О5 Мо 5476786; 05
Мо 5013653; 05 Мо 5258498 і 05 Мо 5482858.
Зв'язування біспецифічних молекул з їхніми специфічними мішенями можна підтверджувати, наприклад, твердофазним імуноферментним аналізом (ЕГІ5А), радіоїмуноаналізом (РІА), ЕАС5- аналізом, біологічним аналізом (наприклад, аналізом інгібування росту) або аналізом методом вестерн-блоттінга. Кожний із зазначених аналізів дозволяє виявляти присутність конкретних комплексів білок-антитіло, що представляють інтерес, при використанні міченого реагенту (наприклад, антитіла), специфічного у відношенні комплексу, що представляє інтерес.
Іншим об'єктом цього винаходу є багатовалентні сполуки, що містять щонайменше два ідентичні або різних фрагмента антитіл, запропонованих у винаході, які зв'язуються з НЕКЗ.
Фрагменти антитіл можна з'єднувати разом шляхом білкового злиття або ковалентного або нековалентного зв'язку. Чотиривалентні сполуки можна одержувати, наприклад, шляхом перехресного зшивання антитіл, запропонованих у винаході, з антитілами, які зв'язуються з константними областями антитіл, запропонованих у винаході, наприклад, з Ес або з шарнірною областю. Домен, що тримеризується, описаний, наприклад, у патенті ЕР 101228081 на ім'я
Вогеап. Модулі, що пентамеризуються, описані, наприклад, в РСТ/ЕРОУ7/05897.
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу біпаратопні/біспецифічні антитіла зв'язуються з амінокислотними залишками в домені 2 і домені 4 НЕКЗ.
Іншим варіантом здійснення винаходу є двофункціональні антитіла, для одержання яких індивідуальне моноклональне антитіло модифікують таким чином, щоб антигензв'язувальні центри зв'язувалися більш ніж з одним антигеном, у результаті чого одержують двофункціональне антитіло, яке зв'язується як з НЕКЗ, так і з іншим антигеном (наприклад,
НЕКТ, НЕКЗ ї НЕК4Я). Іншим варіантом здійснення винаходу є двофункціональне антитіло, мішенями якого є антигени, що мають однакову конформацію, наприклад, антиген, який має таку ж конформацію, що й НЕКЗ в "закритому" або "неактивному" стані. Прикладами антигенів з такою ж конформацією, що й НЕКЗ в "закритому" або "неактивному" стані, є (але не обмежуючись тільки ними) НЕК! і НЕК4. Таке двофункціональне антитіло може зв'язуватися і з 60 НЕКЗ, ї з НЕКТ; і з НЕКЗ, ї з НЕКА4, або з НЕК! їі ЕК4. Подвійна специфічність зв'язування двофункціонального антитіла може приводити також до двох видів активності або інгібуючої активності (див., наприклад, Уеппу Вовігот та ін., Зсіепсе: 323, 2009, сс. 1610-1614).
Антитіла з подовженим часом напівжиття
Цей винахід відноситься також до антитіл, що специфічно зв'язуються з білююм НЕКЗ, які мають подовжений час напівжиття іп мімо.
На час напівжиття білка іп мімо можуть впливати багато факторів. Наприклад, ниркова фільтрація, метаболізм у печінки, розщеплення протеолітичними ферментами (протеазами) і імуногенні відповіді (наприклад, нейтралізація білків антитілами і поглинання макрофагами та дендритними клітини). Для подовження часу напівжиття антитіл, запропонованих у цьому винаході, можна застосовувати різні стратегії. Наприклад, це можна здійснювати за допомогою хімічного зв'язку з поліетиленгліколем (ПЕГ), КеСООЕ-ПЕГ, з використанням каркасів антитіл, полісиалової кислоти (ПСК), гідроксиетилюрохмалю (ГЕК), що зв'язують альбумін лігандів і вуглеводних покриттів; шляхом генетичного злиття з білками, що зв'язують сироваткові білки, такі як альбумін, Ід, ЕсВп, і їхнього переносу; шляхом зшивання (генетичного або хімічного) з іншими зв'язувальними фрагментами, які зв'язуються з сироватковими білками, такими як нанотіла, Бар-фрагменти, САКРІіп, авімери, молекули фірми Айібоду і антикаліни; шляхом генетичного злиття з рПЕГ, альбуміном, доменом альбуміну, альбумінзв'язувальними білками і
Ес; або шляхом включення в наноносії, препаративні форми з повільним вивільненням або медичні пристрої.
Для подовження часу циркуляції антитіл у сироватці іп мімо інертні полімерні молекули, такі як високомолекулярний ПЕГ, можна приєднувати до антитіл або їх фрагментів за допомогою багатофункціонального лінкера або без нього або за допомогою сайтспецифічної кон'югації ПЕГ з М- або С-кінцем антитіл, або через епсилон-аміногрупи, що присутні на залишках лізину. Для пегілювання антитіла, як правило, антитіло або його фрагмент піддають взаємодії з поліетиленгліколем (ПЕГ), таким як реакційноздатний складний ефір або альдегідне похідне
ПЕГ, в умовах, при яких одна або декілька ПЕГ-груп приєднується(ються) до антитіла або фрагмента антитіла. Пегілювання можна здійснювати за допомогою реакції ацдилювання або реакції алкілювання з реакційноздатною молекулою ПЕГ (або аналогічним реакційноздатним водорозчинним полімером). У контексті цього опису мається на увазі, що поняття
Зо "поліетиленгліколь" відноситься до будь-яких форм ПЕГ, які використовують для дериватизації інших білків, таких як моно(Сі-Сі)алкокси- або арилоксиполіетиленгліколь або поліетиленглікольмалеїмід. У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіло, що підлягає пегілюванню, являє собою агліколізоване антитіло. Можна застосовувати дериватизацію за допомогою лінійних або розгалужених полімерів, яка приводить до мінімальної втрати біологічної активності. Ступінь кон'югування можна постійно визначати за допомогою ДСН-ПААГ і мас-спектрометрії для гарантії правильної кон'югації молекул ПЕГ з антитілами. ПЕГ, що не прореагував, можна відокремлювати від кон'югатів антитіло-ПЕГ шляхом гель-фільтрації або іонообмінної хроматографії. Дериватизовані за допомогою ПЕГ антитіла можна оцінювати відносно зв'язувальної активності, а також ефективності іп мімо, за допомогою методів, добре відомих фахівцям у цій галузі, наприклад, за допомогою представлених у цьому описі імуноаналізів. Методи пегілювання білків відомі в цій галузі, і їх можна застосовувати до антитіл, запропонованих у винаході (див., наприклад, ЕР 0154316 на ім'я Мізпітига зі співавторами і ЕР 0401384 на ім'я І5пікаула зі співавторами).
Інші модифіковані технології пегілювання включають відновлювальну технологію конструювання, спрямовану на створення хімічних ортогональних зв'язків КеСООЕ-ПЕГ), яка дозволяє включати специфічні з хімічної точки зору бічні ланцюги в одержувані біосинтезом білки за допомогою відновлювальної системи, яка включає тРНК-синтетазу і тРНК. Ця технологія дозволяє включати більше 30 нових амінокислот у білки, одержувані біосинтезом у клітинах Е.соїї, дріжджів і ссавців. ТРНК включає амінокислоту, що не зустрічається в природних умовах, в будь-яке місце в амбер-кодоні, перетворюючи амбер-кодон зі стоп-кодону в кодон, що забезпечує включення специфічної з хімічної точки зору амінокислоти.
Для подовження часу напівжиття в сироватці можна застосовувати також технологію, засновану на застосуванні рекомбінантного пегілювання (рПЕГ). Ця технологія включає генетичне злиття, що складається з 300-600 амінокислот неструктурованого білкового "хвоста" з існуючим фармацевтичним білком. Оскільки уявна молекулярна маса такого неструктурованого білкового ланцюга приблизно в 15 разів вище, ніж його фактична молекулярна маса, час напівжиття білка в сироватці значно зростає. На відміну від традиційного пегілювання, для якого потрібна хімічна кон'югація і повторне очищення, процес виробництва значно спрощується і продукт є гомогенним. бо Полісиалювання являє собою іншу технологію, у якій застосовують полімерну полісиалову кислоту (ПСК), що зустрічається в природних умовах, для пролонгування часу активного життя і підвищення стабільності терапевтичних пептидів і білків. ПСК являє собою полімер сиалової кислоти (цукор). При її застосуванні для введення лікарських засобів у вигляді білка і терапевтичного пептиду полісиалова кислота забезпечує захисне мікрооточення при кон'югації.
Це підвищує тривалість активного життя терапевтичного білка в кровотоці і перешкоджає його розпізнаванню імунною системою. Полімер ПСК зустрічається в природних умовах в організмі людини. Він адаптований деякими видами бактерій, у яких у результаті еволюції протягом мільйонів років розвилася здатність використовувати його в покритті їх оболонки. Ці полісиальовані бактерії, що зустрічаються в природних умовах, у результаті мають здатність завдяки молекулярній мімікрії "обійти" захисну систему організму. ПСК, що є природним компонентом розробленої 5ієеак-технології (технологія створення "невидимки"), можна легко одержувати із зазначених бактерій у великих кількостях і з попередньо визначеними фізичними характеристиками. Бактеріальна ПСК є зовсім неімуногенною навіть при зшиванні з білками, оскільки вона хімічно ідентична ПСК, що присутня у людському організмі.
Інша технологія заснована на застосуванні похідних гідроксиетилкрохмалю ("ГЕК"), пов'язаних з антитілами. ГЕК являє собою модифікований природний полімер, отриманий з воскоподібного кукурудзяного крохмалю, і він може метаболізуватися ферментами організму.
Розчини ГЕК, як правило, вводять для заміщення дефіциту об'єму крові і для поліпшення реологічних властивостей крові. Гекілювання антитіл може пролонгувати час напівжиття в кровотоці шляхом підвищення стабільності молекули, а також у результаті зниження ниркового кліренсу, що приводить до підвищення біологічної активності. Змінюючи різні параметри, такі як молекулярна маса ГЕК, можна створювати широку різноманітність кон'югатів ГЕК-антитіло.
Антитіла з подовженим часом напівжиття іп мімо можна створювати також шляхом інтродукції однієї або декількох амінокислотних модифікацій (тобто замін, інсерцій або делецій) у константну область (ДС або в його ЕсКп-зв'язувальний фрагмент (краще Ес або фрагмент шарнірної області Ес) (див. міжнародну публікацію М/О 98/23289; міжнародну публікацію УМО 97/34631 і О5 Мо 6277375).
Крім того, антитіла можна кон'югувати з альбуміном для підвищення стабільності антитіла або фрагмента антитіла іп мімо або для подовження їх часу напівжиття іп мімо. Методи добре відомі в цій галузі (див., наприклад, міжнародні публікації М/О 93/15199, УМО 93/15200 і УМО 01/77137; і європейський патент ЕР 413622).
Антитіло до НЕКЗ або його фрагмент можна зливати також з одним або декількома поліпептидами людського сироваткового альбуміну (ЛСА) або їх фрагментами. ЛСА являє собою білок, що перебуває в зрілій формі з 585 амінокислот, він відповідає більшою мірою за осмотичний тиск сироватки, а також функціонує як носій ендогенних і екзогенних лігандів. Роль альбуміну як молекули-носія і його інертна природа є сприятливими властивостями з позицій його застосування як носія і транспортера поліпептидів іп мімо. Застосування альбуміну як компонента злиття альбумін-білок як носія для різних білків запропоноване в М/О 93/15199, УМО 93/15200 і ЕР 413 622. Запропоноване також застосування М-кінцевих фрагментів ЛСА для злиття з поліпептидами (ЕР 399666). Таким чином, шляхом генетичного або хімічного злиття або кон'югації антитіл або їх фрагментів з альбуміном можна стабілізувати або подовжувати тривалість життя і/або зберігати активність молекули протягом більш тривалих періодів у розчині, іп міо і/або іп мімо.
Для злиття альбуміну з іншим білююом можна застосовувати генетичні маніпуляції, такі як злиття ДНК, яка кодує ЛСА, або її фрагмента з ДНК, яка кодує білок. Потім прийнятного хазяїна трансформують або трансфектують злитими нуклеотидними послідовності, розташовуючи їх на прийнятної плазміді таким чином, щоб експресувати злитий поліпептид. Експресію можна здійснювати іп міо, наприклад, з використанням прокаріотичних або еукаріотичних клітин, або іп мімо, наприклад, з використанням трансгенного організму. Додаткові методи, придатні для здійснення злиттями з ЛСА, представлені, наприклад, в УМО 2001077137 і ММО 200306007, які включені в цей опис як посилання. У конкретних варіантах здійснення винаходу експресію злитого білка здійснюють у лініях клітин ссавців, наприклад, лініях СНО-клітин. Під обсяг цього винаходу підпадає також змінене диференціальне зв'язування антитіла з рецептором при низьких або високих значеннях рН. Наприклад, афінність антитіла можна модифікувати таким чином, щоб зберігалося його зв'язування з рецептором при низьких значеннях рН, наприклад, при значеннях рН, характерних для лізосом, шляхом модифікації антитіла, що передбачає включення додаткових амінокислот, таких як гістидин, в СОК антитіла (див., наприклад,
Тотоуикі Ідамла та ін., Маїиге Віоїесппоіоду; 28, 2010, сс. 1203-1207).
Кон'югати антитіл бо Цей винахід відноситься до антитіл або їх фрагментів, які специфічно зв'язуються з білком
НЕКЗ, рекомбінантно злитим або хімічно кон'югованим (включаючи як ковалентні, так і нековалентні кон'югації) з гетерологічним білюом або поліпептидом (або його фрагментом, краще з поліпептидом, що складається зі щонайменше з 10, щонайменше з 20, щонайменше з 30, щонайменше з 40, щонайменше з 50, щонайменше з 60, щонайменше з 70, щонайменше з 80, щонайменше з 90 або щонайменше зі 100 амінокислот), у результаті чого утворюються злиті білки. Зокрема, у винаході запропоновані злиті білки, що містять фрагмент антитіла, представлений у цьому описі (наприклад, Баб-фрагмент, Ба-фрагмент, Ем-фрагмент, Е(абр)»- фрагмент, МН-область, СОК МН-області, Мі -область або СОК Мі -області), і гетерологічний білок, поліпептид або пептид. Методи злиття або кон'югування білків, поліпептидів або пептидів з антитілом або фрагментом антитіла відомі в цій галузі (див., наприклад, ОЗ МоМо 5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851 і 5112946; європейські патенти ЕР 307434 і ЕР 367166; міжнародні публікації УМО 96/04388 ії УМО 91/06570; АзпКепа?і та ін., Ргос. Май. Асай. 5сі. ОБА 88, 1991, сс. 10535-10539; 7пепд та ін., У. Ітітипої. 154, 1995, сс. 5590-5600; і Мі та ін., Ргос. Май).
Асай. Зсі. ОБА 89, 1992, сс. 11337-11341).
За допомогою методів перестановки генів, перестановки мотивів, перестановки екзонів і/або перестановки кодонів (які разом позначені як "перестановка ДНК") можна створювати додаткові злиті білки. Перестановку ДНК можна здійснювати для зміни активності антитіл, запропонованих у винаході, або їх фрагментів (наприклад, антитіл або їх фрагментів, що мають більш високі афінності і більш низькі швидкості дисоціації) (див. загальний опис в ОЗ МоМо 5605793, 5811238, 5830721, 5834252, і 5837458; РацЦеп та ін., Си. Оріпіоп Віосїесппої. 8, 1997, сб. 724-733;
Нагауата, Тгепаз Віотесппої. 16(2), 1998, сс. 76-82; Напззоп та ін., У. Мої. Віої. 287, 1999, со. 265-276; і Гогеп2о і Віазсо, Віоїесппідсое5 24(2), 1998, сс. 308-313 (усі зазначені патенти і публікації повністю включені в цей опис як посилання)). Антитіла або їх фрагменти або антитіла, що кодуються, або їх фрагменти можна змінювати, піддаючи їх перед рекомбінацією неспецифічному мутагенезу за допомогою ПЦР зниженої точності, неспецифічній інсерції нуклеотидів або обробці іншими методами перед здійсненням рекомбінації. Полінуклеотид, що кодує антитіло або його фрагмент, яке/який специфічно зв'язується з білююом НЕКЗ, можна поєднувати шляхом рекомбінації з одним або декількома компонентами, мотивами, сегментами, частинами, доменами, фрагментами і т.д. однієї або декількох гетерологічних молекул.
Зо Крім того, антитіла або їх фрагменти можна зливати з маркерними послідовностями, такими як пептид, призначений для полегшення очищення. У кращих варіантах здійснення винаходу маркерна амінокислотна послідовність являє собою, серед іншого, гекса-гістидиновий пептид, такий як мітка, яка присутня у векторі РОЕ (фірма ОІАСЕМ, Іпс., 9259 Еоп Амепиеє, Чатсуорт, шт.
Каліфорнія, 91311), багато таких міток надходить у продаж. Як описано у Сепіз та ін., Ргос. Маї!.
Асай. сі. ОБА 86, 1989, сс. 821-824, наприклад, гекса-гістидин зручно застосовувати для очищення злитого білка. Іншими пептидними мітками, які можна застосовувати для очищення, можуть служити (але не обмежуючись тільки ними) гемагглютинінова ("НА") мітка, яка відповідає епітопу, виведеному з білка гемагглютиніну вірусу грипу (УмМізоп та ін., Сеї! 37, 1984, с. 767), і Пад»-мітка.
В інших варіантах здійснення винаходу антитіла, запропоновані в цьому винаході, або їх фрагменти кон'югують з діагностичним або агентом, що виявляється. Зазначені антитіла можна застосовувати для моніторингу або прогнозування виникнення, розвитку, прогресування і/або серйозності захворювання або порушення як частини процедури клінічної оцінки, такої як визначення ефективності конкретної терапії. Такі діагностування і виявлення можна здійснювати шляхом зшивання антитіла з субстанціями, що виявляються, такими як (але не обмежуючись тільки ними) різні ферменти, такі як (але не обмежуючись тільки ними) пероксидаза з хріну, лужна фосфатаза, бета-галактозидаза або ацетилхолінестераза; простетичні групи, такі як (але не обмежуючись тільки ними) стрептавідин/біотин і авідин/біотин; флуоресцентні матеріали, такі як (але не обмежуючись тільки ними) умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїну ізотіоцианат, родамін, дихлортриазиніламін флуоресцеїну, дансилхлорид або фікоеритрин; люмінісцентні матеріали, такі як (але не обмежуючись тільки ними) люмінол; біолюмінісцентні матеріали, такі як (але не обмежуючись тільки ними) люцифераза, люцеферин і аекворин; радіоактивні матеріали, такі як (але не обмежуючись тільки ними) йод (1, 1251, 129| и 121, у, вуглець (77С), сірка (355), тритій(ЗН), індій (1 5Іп, 9, ПІ ї п, ), технецій (Тс), талій (Ті), галій (68(3а, 5(за), палладій (3Ра), молібден (Мо), ксенон (33Хе), фтор С8Б), "з5т, 177) у, 159034, м9Ррт, 149) а, 175ур, 166Но, 90у, 4750, 186Де, 188Де, п2ру, 105ДВН, 97Ви, б8(36, 57Со, 657п, в5Б, гр, 15303, 169Ур, б, Ми, бе, "З35п і 77/Тіп; і метали, що випускають позитрони, із застосуванням різних варіантів позитронно-емісійної томографії, та іони нерадіоактивних парамагнітних металів. 60 Крім того, під обсяг цього винаходу підпадає застосування антитіл або їх фрагментів,
кон'югованих з фрагментом, що має терапевтичну активність. Антитіло або його фрагмент можна кон'югувати з фрагментом, що має терапевтичну активність, таким як цитотоксин, наприклад, цитостатичний або цитоцидний агент, терапевтичний засіб або іон радіоактивного металу, наприклад, з емітерами альфа-випромінювання. Цитотоксин або цитотоксичний засіб може являти собою будь-який засіб, що викликає загибель клітин.
Крім того, антитіло або його фрагмент можна кон'югувати з фрагментом, що має терапевтичну активність, або фрагментом лікарського засобу, який модифікує цю біологічну відповідь. Фрагменти, що мають терапевтичну активність, або фрагменти лікарського засобу не обмежені класичними хімічними терапевтичними агентами. Наприклад, фрагмент лікарського засобу може являти собою білок, пептид або поліпептид, що має необхідну біологічну активність. Такі білки можуть включати, наприклад, токсин, такий як абрин, рицин А, екзотоксин
Рзейидотопах, холерний токсин або дифтерійний токсин; білок, такий як фактор некрозу пухлини, а-інтерферон, В-інтерферон, фактор росту нервів, тромбоцитарний фактор росту, тканинний активатор плазміногену, проапоптозний агент, антиангіогенний агент; або модифікатор біологічної відповіді, такої, наприклад, як лімфокін.
Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло до НЕКЗ або його фрагмент кон'югують з фрагментом, що має терапевтичну дію, таким як цитотоксин, лікарський засіб (наприклад, імунодепресант) або радіотоксин. Такі кон'югати позначені в контексті цього опису як "імунокон'югати". Імунокон'югати, які містять один або кілька цитотоксинів, позначають як "імунотоксини". До цитотоксинів або цитотоксичних агентів відноситься будь-який агент, який ушкоджує (наприклад, знищує) клітини. Їхніми прикладами є таксон, цитохаласин В, граміцидин р, етидію бромід, еметин, мітоміцин, етопосид, тенопосид, вінкрістин, вінбластин, ї. колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксиантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин О, 1-дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин і їх аналоги або гомологи. Терапевтичні засоби являють собою, наприклад, антиметаболіти (наприклад, метотрексат, б-меркаптопурин, 6-тіогуанін, цитарабін, 5-фторурацил, декарбазин), деструктуруючі агенти (наприклад, мехлоретамін, тіотепа, хлорамбуцил, мієфалан, кармустин (В5М) і ломустин (ССМО), циклотосфамід, бусулфан, дибромманіт, стрептозотоцин, мітоміцин
С ї цис-дихлордиамін платини(іІї) (СОР), цисплатин, антрацикліни (наприклад, даунорубіцин
Зо (колишня назва дауноміцин) і доксорубіцин), антибіотики (наприклад, дактиноміцин (колишня назва актиноміцин), блеоміцин, мітраміцин і антраміцин (АМС)) і антимітотичні агенти (наприклад, вінкрістин і вінбластин) (див., наприклад, Ш5 Мо 20090304721 на ім'я фірми Зеаше
Сепеїісв).
Іншими прикладами терапевтичних цитотоксинів, які можна кон'югувати з антитілом, запропонованим у винаході, є дуокарміцини, каліхеаміцини, майтансини та ауристатини і їх похідні. Наприклад, у продажі є кон'югат антитіла з каліхеаміцином (Муїоїагд "м: фірма Умуеїй-
Ауе!ві).
Цитотоксини можна кон'югувати з антитілами, запропонованими у винаході, з використанням відомої в цій галузі технології, що передбачає застосування лінкерів. Прикладами типів лінкерів, які можна використовувати для кон'югації цитотоксину з антитілом, є (але не обмежуючись тільки ними) гідразони, складні тіоефіри, складні ефіри, дисульфіди і лінкери, що містять пептид. Можна вибирати лінкер, який, наприклад, чутливий до розщеплення при низькому значенні рН у компартменті лізосоми або чутливий до розщеплення протеазами, наприклад, протеазами, які краще експресуються в пухлинних тканинах, такими як катепсини (наприклад, катепсини В, С, 0).
Додаткові дані про типи цитотоксинів, лінкери і методи кон'югації терапевтичних агентів і антитіл наведені також в Зайо та ін., Адм. Огид Оеїїм. Кем. 55, 2003, сс. 199-215; Тгаї та ін.,
Сапсег Іттипої. ІтттипоїНег. 52 2003, сс. 328-337; Раупе, Сапсег Сеї! 3, 2003, сс. 207-212; АйІеп,
Маї. Кему. Сапсег 2, 2002, сс. 750-763; Разіап і Кгтейтап, Сигг. Оріп. Іпмевід. Огид5 3, 2002, со. 1089-1091; Зепіег і Зргіпдег, Адм. Огид Оеїїм. Кем. 53, 2001, сс. 247-264.
Антитіла, запропоновані в цьому винаході, можна кон'югувати також з радіоактивними ізотопами з одержанням цитотоксичних радіоактивних фармацевтичних агентів, які називають також радіоіїмунокон'югатами. Прикладами радіоактивних ізотопів, які можна кон'югувати з антитілами для застосування в діагностичних або терапевтичних цілях, є (але не обмежуючись тільки ними) йод"!', індій!""!, ітрій?о ії лютецій!""7, У цій галузі розроблені методи одержання радіоїмунокон'югатів. Прикладами наявних на ринку радіоімунокон'югатів є 2емаїйп"мМ (фірма
РЕС РПаппасешіса!І5) і Веххаг "м (фірма Согіха Рпаптасецшіїса!5), і аналогічні методи можна застосовувати для одержання радіоіїмунокон'югатів антитіл, запропонованих у винаході. У конкретних варіантах здійснення винаходу макроциклічний хелатор являє собою 1,4,7,10- бо тетраазациклододекан-М, М",М",М'"-тетраоцтову кислоту (0ОТА), яку можна приєднувати до антитіла через лінкерну молекулу. Зазначені лінкерні молекули добре відомі в цій галузі і описані у Оепагао та ін., Сіїп Сапсег Кез. 4(10), 1998, сс. 2483-2490; Реїгегзоп та ін., Віосопіца.
Спет. 10(4), 1999, сс. 553-557; і гіттептап та ін., Мисі. Мед. Віої. 26(8), 1999, сс. 943-950, кожна публікація повністю включена в цей опис як посилання.
Методи кон'югування фрагментів, що мають терапевтичну активність, з антитілами добре відомі (див., наприклад, Атоп та ін., "Мопосіопа! Апіїбодіе5 Рог Іттипоїагдеїйпуд ОЇ Огид5 Іп
Сапсег Тпегару", у: Мопосіопа! Апіїбодієх Апа Сапсег Тпегару, за ред. Кеїзгтеїйа та ін., вид-во АІап
К. Іі55, Іпс., сс. 243-56, 1985; Неїївігот та ін., "Апіїродієз Рог Огид Оеїїмегу", у: СопітоПей Огиа
Оевїїмегу (2-ге вид.), за ред. Кобріпзоп та ін., за ред. Магсеї! ОеккКетг, Іпс., сс. 623-53, 1987; Тпогре, "Апіїбоду Сагтієг5 ОЇ Суїохіс Адепі5 Іп Сапсег Тпегару: А Кеміем/", у: Мопосіопа! Апіїбодіез "84:
Віоіодіса! Апа Сіїпіса! Арріїсайоп5, за ред. Ріпопега та ін., 1985, сс. 475-506; "Апаїувів, Невиїїв,
Апа Ешиге Ргозресіїме ОЇ Тпе Тпегарешіс Озе ОЇ Кадіоїабеїєй Апіїбоду Іп Сапсег Тегару", у:
Мопосіопа! Апіібодіе5 Рог Сапсег ЮОегесіоп Апа ТНпегару, за ред. Ваїдм/іп та ін., вид-во Асадетіс
Ргев55, 1985, сс. 303-316 і ТПогре та ін., "пе Ргерагайоп Апа Сушюіохіс Ргорепієз ОЇ Апііроду-
Тохіп Сопійдагїев", Іптипої. Кем., 62, 1982, сс. 119-158).
Антитіла можна зв'язувати з твердими носіями, які можна застосовувати, зокрема, для імуноаналізів або очищення антигену-мішені. Такі тверді носії включають (але не обмежуючись тільки ними) скло, целюлозу, поліакриламід, нейлон, полістирол, полівінілхлорид або поліпропілен.
Комбінації антитіл
Іншим об'єктом винаходу є антитіла до НЕКЗ або їх фрагменти, запропоновані у винаході, що застосовуються 3 іншими терапевтичними засобами, такими як інші антитіла, низькомолекулярні інгібітори, інгібітори ттов. або інгібітори РіІЗ-кінази. Їхніми прикладами є (але не обмежуючись тільки ними):
Інгібітори НЕК: Антитіла до НЕКЗ або їх фрагменти можна застосовувати у комбінації з інгібіторами НЕКІ, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) матузумаб (ЕМО72000),
ЕгойихФфуУцетуксимаб (фірма Ітсіопе), Месііріхв/панітумумаб (фірма Атодеп), тА 806 і німотузумаб (фірма Тпегасім), Ігеззафбфугефітиніб (фірма Авігалепеса); СІ-4-033 (РО183805) (фірма Ріїгег), лапатиніб (5УУ-572016) (фірма СіахозтійнКіїпе), Тукегобф/лапатинібу дитозилат
Зо (фірма ЗтіїйКіїпеВееспат), ТагсемаФ/ерлотиніб. НСІ (051-774) (фірма О5І РІПапта) і РКІ-166 (фірма Момагіів) і /М-(4-(З-хлор-4-фторфеніл)аміно|-7-((3"5"7)-тетрагідро-3-фураніл|окси|-6- хіназолініл|-4-(диметиламіно)-2-бутенамід, який надходить у продаж товарним знаком ТомокКФ фірми Воепгіпдег Іпдеїйпеїт).
Інгібітори НЕН2: Антитіла до НЕКЗ або їх фрагменти можна застосовувати у комбінації з інгібіторами НЕК2, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) пертузумаб (надходить у продаж товарним знаком ОтпійагаФ фірми Сепепіесі), трастузумаб (надходить у продаж товарним знаком Негсеріїп?? фірми Сепепіесп/Коспе), ММ-111, нератиніб (відомий також як
НКІ-272, (2Е)-М-І4-(З-хлор-А-|((піридин-2-іл)уметокси|фенілі|аміно|-3-ціан-7-етоксихінолін-б-іл|-4- (диметиламіно)бут-2-енамід, і описаний у публікації РСТ УУО 05/028443), лапатиніб або лапатинібу дитозилат (надходить у продаж товарним знаком Тукегоф фірми СіахозпійнКіїпе).
Інгібітори НЕНВЗ: Антитіла до НЕКЗ або їх фрагменти можна застосовувати у комбінації з інгібіторами НЕКЗ, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) ММ-121, ММ-111, ІВАСЗ, 201012 (фірма ОЗ Ррагта АС), АМО888 (фірма Атдеп), АМ-203 (фірма Амео), МЕНО7945А (фірма Сепепіесі) і малі молекули, які інгібують НЕКЗ.
Інгібітори НЕН4: Антитіла до НЕКЗ або їх фрагменти можна застосовувати у комбінації з інгібіторами НЕКА.
Інгібітори РІЗ-кінази: Антитіла до НЕКЗ або їх фрагменти можна застосовувати у поєднанні з інгібіторами РіІЗ-кінази, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) 4-(2-(1Н-індазол-4-іл)-6-
І((4-(метилсульфоніл)піперазин-1-іл|метилугієно/3,2-4|піримідин-4-ілїіморфолін (відомий також як ре 0941 і описаний у публікаціях РСТ УМО 09/036082 і УМО 09/055730), 2-метил-2-(4-ІЗ-метил- 2-оксо-8-(хінолін-3-іл)-2,3-дигідроїмідазо(4,5-с|хінолін-1-ілІфеніл|пропіонітрил (відомий також як
ВЕ 235 або ММР-ВЕ2 235 і описаний у публікації РСТ УМО 06/122806), ВМК120 і ВМІ 719.
Інгібітори тТОВ: Антитіла до НЕКЗ або їх фрагменти можна застосовувати у поєднанні з інгібіторами ттТОВ, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) темсиролімус (надходить у продаж товарним знаком Тогізекю фірми Рії2ег), рідафоролімус (колишня назва деферолімус, (18, 28, 45)-4-(28)-2 (18, 95, 125, 158, 16Е, 188, 198, 218, 235, 24Е, 26Е, 287, 305, 325, 358)- 1,18-дигідрокси-19,30-диметокси-15,17,21,23, 29,35-гексаметил-2,3,10,14,20-пентаоксо-11,36- диокса-4-азатрицикло/30.3.1.04,9|гексатриаконта-16,24,26,28-тетраен-12-іл|пропіл)|-2- метоксициклогексилдиметилфосфінат, відомий також як дефоролімус, АР23573 і МК8669 бо (фірма Агіай Ріагт.), і описаний у публікації РСТ УУО 03/064383), еверолімус (КАБОО1)
(надходить у продаж товарним знаком АїйпйогФ фірми Момагіі5). Один або кілька терапевтичних засобів можна вводити або одночасно, або до, або після введення НЕКЗ або його фрагмента, запропонованого в цьому винаході.
Методи одержання антитіл, запропонованих у винаході (І) Нуклеїнові кислоти, що кодують антитіла
Винахід відноситься до практично очищених молекул нуклеїнових кислот, які кодують поліпептиди, що містять сегменти або домени ланцюгів НЕКЗ-зв'язувальних антитіл, які описані вище. Деякі нуклеїнові кислоти, запропоновані у винаході, містять нуклеотидну послідовність, яка кодує варіабельну область важкого ланцюга, і/або нуклеотидну послідовність, яка кодує варіабельну область легкого ланцюга НЕКЗ. У конкретному варіанті здійснення винаходу молекули нуклеїнових кислот являють собою молекули, які наведено в таблиці 1. Деякі інші молекули нуклеїнових кислот, запропоновані у винаході, містять нуклеотидні послідовності, які практично ідентичні (наприклад, щонайменше на 65 95, 80 95, 95 95 або 99 95) нуклеотидним послідовностям, які представлено в таблиці 1. При експресії з використанням відповідних експресійних векторів поліпептиди, що кодуються цими полінуклеотидами, мають здатність зв'язуватися з антигеном НЕКЗ.
Винахід відноситься також до полінуклеотидів, які кодують щонайменше одну СОК -ділянка і, як правило, усі три СОК-ділянки важкого або легкого ланцюга представленого вище НЕКЗ- зв'язувального антитіла. Деякі інші полінуклеотиди кодують усю або практично усю послідовність варіабельної області важкого ланцюга і/або легкого ланцюга представленого вище НЕКЗ-зв'язувального антитіла. Через виродженість генетичного коду кожну з амінокислотних послідовностей імуноглобуліну можуть кодувати різні нуклеотидні послідовності.
Молекули нуклеїнових кислот, запропоновані у винаході, можуть кодувати як варіабельну область, так і константну область антитіла. Деякі нуклеотидні послідовності, запропоновані у винаході, містять нуклеотиди, що кодують послідовність варіабельної області зрілого важкого ланцюга, який практично ідентичний (наприклад, щонайменше на 80 95, 9095 або 99 95) послідовності варіабельної області зрілого важкого ланцюга антитіла до НЕКЗ, представленого в таблиці 1. Деякі інші нуклеотидні послідовності містять нуклеотиди, що кодують послідовність
Зо варіабельної області зрілого легкого ланцюга, який практично ідентичний (наприклад, щонайменше на 8095, 9095 або 99 95) послідовності варіабельної області зрілого легкого ланцюга антитіла до НЕКЗ, представленого в таблиці 1.
Полінуклеотидні послідовності можна одержувати де помо твердофазним синтезом ДНК або за допомогою ПЦР-мутагенезу існуючої послідовності (наприклад, послідовностей, описаних нижче в прикладах), що кодує НЕКЗ-зв'язувальне антитіло або його зв'язувальний фрагмент.
Прямий хімічний синтез нуклеїнових кислот можна здійснювати методами, відомими в цій галузі, такими як фосфотриефірний метод, описаний у Магапд та ін., Ме(й. Еп7гутої. 68, 1979, с. 90; фосфодиефірний метод, описаний у Вгом/п та ін., Меїй. ЄЕплутої. 68, 1979, с. 109; диетилфосфорамідитний метод, описаний у Веаийисаде та ін., Теїга. І ей., 22, 1981, с. 1859; і метод, заснований на застосуванні твердих носіїв, який описано в ОЗ Мо 458066. Введення мутацій у полінуклеотидну послідовність за допомогою ПЦР можна здійснювати, наприклад, згідно з методами, описаними в: РСК Тесппоіоду: Ргіпсіріез апа Арріїсайоп5 їог ОМА
Атрійісацйоп, за ред. Н.А. Епісп, вид-во Егеетап Ргев5, МУ, МУ, 1992; РСЕК Ргоїосої5: А Сціде 1
Меїподз апа Арріїсайопв5, за ред. Іппі5 та ін., вид-во Асадетіс Ргез5, Зап Оіедо, СА, 1990; Маша та ін., Мисієїс Асій5 Кез. 19, 1991, с. 967; і ЕсКегі та ін., РОК Меївпоадв5 апа Арріїсайопз5 1, 1991, с. 17.
Винахід відноситься також до експресійних векторів і клітин-хазяїв, що продукують НЕКЗ- зв'язувальні антитіла, які описані вище. Для експресії полінуклеотидів кодуючі ланцюги НЕКЗ- зв'язувального антитіла або їх зв'язувальні фрагменти, можна застосовувати різні експресійні вектори. Для одержання антитіл у клітинах-хазяях ссавців можна застосовувати як вірусні, так і невірусні експресійні вектори. До невірусних векторів і системам відносяться плазміди, епісомальні вектори, як правило, з касетою експресії, призначеною для експресії білка або РНК, і людські штучні хромосоми (див., наприклад, Наггіпудїоп та ін., Маї Сепеї 15, 1997, с. 345).
Наприклад, як невірусні вектори, які можна застосовувати для експресії НЕКЗ-зв'язувальних полінуклеотидів і поліпептидів у клітинах ссавців (наприклад, людини), можна використовувати рТпіоніз А, В ї С, рсОМАЗ.1/Ні5, рРЕВМНІ» А, В і С (фірма Іпмігодеп, Сан-Дієго, шт. Каліфорнія),
МРОМ-вектори і численні інші вектори, відомі в цій галузі, які експресують інші білки.
Прийнятними векторами є вектори на основі ретровірусів, аденовірусів, аденоасоційованих вірусів, вірусу герпеса, вектори на основі 5М40, вірусу папіломи, НВР-вірусу Епштейна-Барра, бо вектори на основі вірусу коров'ячої віспи і вірусу лісу Семлікі (ЗЕМ) (див. Вгепі та ін., вище;
Зтіїй, Аппи. Веу. Містобіо!. 49, 1995, с. 807; і Козепгеїйй та ін., Сеї! 68, 1992, с. 143).
Вибір експресійного вектору залежить від клітини-хазяїна, призначеної для експресії вектора. Як правило, експресійні вектори містять промотор і інші регуляторні послідовності (наприклад, енхансери), функціонально пов'язані з полінуклеотидами, які кодують ланцюг
НЕВЗ-зв'язувального антитіла або його фрагмент. У деяких варіантах здійснення винаходу застосовують індуцибельний промотор для того, щоб попереджати експресію вбудованих послідовностей у всіх випадках за винятком випадку, коли мають місце індуціюючі умови.
Індуцибельними промоторами є, наприклад, промотор арабінози, Іас/7, промотор металотіонеїну або промотор білка теплового шоку. Культури трансформованих організмів можна розмножувати в неіндуціюючих умовах, при цьому не потрібно здійснювати зрушення популяції у бік послідовностей, що кодують, продукти експресії яких краще переносяться клітиною. Крім промоторів для ефективної експресії ланцюга або фрагмента НЕКЗ-зв'язувального антитіла можуть вимагатися або бути бажаними також й інші регуляторні елементи. Ці елементи, як правило, включають ініціюючий кодон АТО і сайт зв'язування рибосоми, що примикає, або інші послідовності. Крім того, ефективність експресії можна підвищувати шляхом включення енхансерів, які відповідають застосовуваній клітинній системі (див., наприклад, 5спаїгї та ін.,
Везиїйв5 Ргобі. Се! Оійег. 20, 1994, с. 125; і Війпег та ін., Ме. Еплутої., 153, 1987, с. 516).
Наприклад, енхансер 5М40 або енхансер СММ можна застосовувати для підвищення рівня експресії у клітинах-хазяях ссавців.
В експресійні вектори можна вбудовувати також сигнальну послідовність, що секретується, для одержання злитого білка з поліпептидами, що кодуються вбудованими послідовностями
НЕВЗ-зв'язувального антитіла. Частіше вбудовані послідовності НЕКЗ-зв'язувального антитіла зв'язують з сигнальними послідовностями перед включенням у вектор. Вектори, які можна застосовувати для одержання послідовностей, що кодують варіабельні області легкого і важкого ланцюга НЕКЗ-зв'язувального антитіла, у деяких випадках можуть кодувати також константні області або їх ділянки. Такі вектори дозволяють також експресувати варіабельні області у вигляді злитих з константними областями білків, що дозволяє тим самим продукувати інтактні антитіла або їх фрагменти. Як правило, зазначені константні області є людськими.
Клітини-хазяї, які несуть або експресують ланцюги НЕКЗ-зв'язувального антитіла, можуть
Зо являти собою або прокаріотичні, або еукаріотичні клітини. Мікроорганізм Е. соїї є одним з прокаріотичних хазяїв, які застосовують для клонування і експресії полінуклеотидів, запропонованих у цьому винаході Іншими прийнятними для застосування хазяями- мікроорганізмами є бацили, такі як Васіїйи5 5и,иБбійїй5, й інші представники сім. Епіегорасієгіасеає, такі як ЗаіІтопеїІа, зЗегтайа і різні види Рзендотопаб5. Для цих прокаріотичних хазяїв можна створювати такі експресійні вектори, які, як правило, містять контролюючі експресію послідовності, сумісні з клітиною-хазяїном (наприклад, сайт ініціації реплікації). Крім того, повинні бути присутні будь-які з широкої різноманітності добре відомих промоторів, такі як промоторна система лактози, промоторна система триптофану (ігр), промоторна система бета- лактамази або промоторна система фага лямбда. Промотори, як правило, контролюють експресію, необов'язково в комбінації з послідовністю оператора, і мають послідовності сайту зв'язування рибосоми і т.п., призначені для ініціації та завершення транскрипції і трансляції. Для експресії НЕКЗ-зв'язувальних поліпептидів, запропонованих у винаході, можна застосовувати також інші мікроорганізми, такі як дріжджі. Можна застосовувати також клітини комах у комбінації з бакуловірусними векторами.
У деяких кращих варіантах здійснення винаходу для експресії і одержання НЕКЗ- зв'язувальних поліпептидів, запропонованих у цьому винаході, застосовують клітини-хазяї ссавців. Наприклад, вони можуть являти собою або лінію клітин гібридоми, що експресує ендогенні гени імуноглобуліну (наприклад, описаний у прикладах клон гібридоми, отриманий у результаті злиття з мієломою, наприклад, 106.С9), або лінію клітин ссавців, яка несе екзогенний експресійний вектор (наприклад, описані нижче в прикладі клітини мієломи 5Р2/0). Вони включають будь-яку клітину тварини або людини, що характеризується звичайною смертністю, або звичайні або аномальні імморталізовані клітини. Наприклад, розроблено кілька прийнятних ліній клітин-хазяїв, що мають здатність секретувати інтактні імуноглобуліни, включаючи лінії
СНО -клітин, різні лінії Со5-клітин, Неї а-клітини, лінії клітин мієлом, трансформовані В-клітини і гіоридоми. Застосування культур клітин з тканин ссавців для експресії поліпептидів описане в цілому, наприклад, у У/іппаскег, Егот Сепез (о Сіопе5, вид-во МСН Рибії5пегв, М.У., М.У., 1987.
Експресійні вектори для клітин-хазяїв ссавців можуть включати контролюючі експресію послідовності, такі як сайт ініціації реплікації, промотор і енхансер (див., наприклад, Оцееп та ін., Іттипої. Кем. 89, 1986, сс. 49-68), необхідні для процесінгу інформаційні сайти, такі як сайт 60 зв'язування рибосоми, сайти РНК-сплайсингу, сайти поліаденілювання і послідовності термінаторів транскрипції. Ці експресійні вектори, як правило, містять промотори, виведені з генів ссавців або з вірусів ссавців. Прийнятні промотори можуть бути конститутивними, специфічними для типу клітин, специфічними для стадії розвитку і/або можуть бути модульованими або регульованими. Прийнятними промоторами є (але не обмежуючись тільки ними) промотор металотіонеїну, конститутивний головний пізній промотор аденовірусів, промотор ММТУ, що індукується дексаметазоном, промотор 5М40, промотор МКР рошШіІ, конститутивний промотор МРБМ, помотор СМУ, що індукується тетрацикліном (такий як людський негайно-ранній промотор СММУМ), конститутивний промотор СММУ і комбінації промотор- енхансер, відомі в цій галузі.
Методи інтродукції експресійних векторів, що містять полінуклеотидні послідовності, що представляють інтерес, слід вибирати залежно від типу клітини-хазяїна. Наприклад, трансфекції з використанням хлориду кальцію, як правило, застосовують для прокаріотичних клітин, у той час як обробку фосфатом кальцію або електропорацію можна застосовувати для інших типів клітин-хазяїв (див. загальні положення у Затрьгоок та ін., вище). Інші методи являють собою, наприклад, електропорацію, обробку фосфатом кальцію, опосередковувану ліпосомою трансформацію, ін'єкцію і мікроін'єкцію, балістичні методи, застосування віросом, імуноліпосом, кон'югатів полікатіон: нуклеїнова кислота, "оголеної" ДНК, штучних віріонів, злитого з вірусом герпесу структурного білка МР22 (ЕїШої і О'Наге, Сеї! 88, 1997, с. 223), агента, що полегшує проникнення ДНК, і трансдукцію ех мімо. Для тривалого виробництва з високим виходом рекомбінантних білків часто є бажаною стабільна експресія. Наприклад, клітинні лінії, які стабільно експресують ланцюги НЕКЗ-зв'язувального антитіла або його зв'язувальні фрагменти, можна одержувати, використовуючи експресійні вектори, запропоновані у винаході, які містять вірусні сайти ініціації реплікації або ендогенні експресійні елементи та маркерний ген, що селектється. Після інтродукції вектора клітин можна давати рости протягом 1-2 днів у збагачених середовищах, після чого переносити їх у селективні середовища. Маркер, що селектується, вносять з метою надання стійкості до фактора селекції, і його присутність забезпечує ріст клітин, у яких відбувається успішна експресія інтродуційованих послідовностей у селективних середовищах. Стійкі стабільно трансфектовані клітини можна розмножувати за допомогою методів культивування тканин, прийнятних для конкретного типу клітин.
Зо (ІІ) Створення моноклональних антитіл, запропонованих у винаході
Моноклональні антитіла (МАт) можна одержувати за допомогою різних методів, включаючи загальноприйняті методи одержання моноклональних антитіл, наприклад, за допомогою стандартного методу гібридизації соматичних клітин, описаного у Копіег і Міїсїеїп, Маїиге 256, 1975, с. 495. Для одержання моноклональних антитіл можна застосовувати численні методики, наприклад, трансформацію В-лімфоцитів вірусами або онкогенами.
Система тваринного походження, що застосовується для одержання гібридом, являє собою систему, засновану на використанні мишей. Створення гібридоми в миші є добре відомою процедурою. Протоколи імунізації і методи виділення імунізованих спленоцитів, призначених для злиття, відомі в цій галузі. Відомі також компоненти, що беруть участь у злитті (наприклад, клітини мишачої мієломи), і процедури злиття.
Химерні або гуманізовані антитіла, запропоновані в цьому винаході, можна створювати на основі послідовності мишачого моноклонального антитіла, отриманого відповідно до описаного вище методу. ДНК, що кодує важкі і легкі ланцюги імуноглобулінів, можна одержувати з мишачої гібридоми, що представляє інтерес, і створювати так, щоб вона містила немишачі (наприклад, людські) послідовності імуноглобулінів, за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Наприклад, для створення химерного антитіла можна зв'язувати мишачі варіабельні області з людськими константними областями з використанням відомих у цій галузі методів (див., наприклад, 5 Мо 4816567 на ім'я СабріПу зі співавторами). Для створення гуманізованого антитіла мишачі СОК-ділянки можна вбудовувати в людську каркасну ділянку за допомогою відомих у цій галузі методів (див., наприклад, ОБ Мо 5225539 на ім'я Міпіег і 05 МоМо 5530101; 5585089; 5693762 і 6180370 на ім'я Оцееп зі співавторами).
У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, являють собою людські моноклональні антитіла. Такі людські моноклональні антитіла до НЕКЗ можна створювати з використанням трансгенних або трансхромосомних мишей, що несуть фрагменти людської, а не мишачої імунної системи. До цих трансгенних і трансхромосомних мишей відноситься миші, позначені в контексті цього опису як НиМАр-миші і КМ-миші відповідно, і мишей обох зазначених ліній позначають у контексті цього опису як "миші, що несуть людський
Ід".
Миші лінії НиИМАБб (НиМАБ тоизеф, фірма Меаагех, Іпс.) несуть мінілокуси генів людського бо імуноглобуліну, які кодують неперегруповані послідовності людського важкого (Н і у) і легкого к-
ланцюга імуноглобуліну, у комбінації з цільовими мутаціями, які інактивують ендогенні локуси н- і к-ланцюга (див., наприклад, І опбего та ін., Маїшге 368(6474), 1994, сс. 856-859). Таким чином, у миші знижена здатність експресувати мишачий ІДМ або к-ланцюг, і у відповідь на імунізацію інтродуційовані трансгени людського важкого і легкого ланцюга піддаються перемиканню класу і соматичній мутації з утворенням людського моноклонального (Док, що має високу афінність (Гопрегод та ін., 1994, вище; оглядова стаття І опрего, Напароок ої Ехрегітепіа! Рпаптасоїоду 113, 1994, сс. 49-101; Гопрегуд і Низ7аг, Іпіегп. Кем. Іттипої. 13, 1995, сс. 65-93 і Нагаїпа і
Гопрегу, Апп. М. М. Асай. 5сі. 764, 1995, сс. 536-546). Одержання і застосування мишей лінії
НиМАБ ї геномні модифікації, які несуть такі миші, описані також у Тауїог та ін., Мисіеїс Асіавб
Кезеагсп 20, 1992, сб. 6287-6295; Спеп та ін., Іпіегпайопаї! Іттипоіоду 5, 1993, сс. 647-656;
Тиайоп та ін., Ргос. Маїй. Асай. 5сі. ОБА 94, 1993, сс. 3720-3724; Спої та ін., Майшге Сепеїйісз5 4, 1993, сс. 117-123; Спеп та ін., ЕМВО .. 12, 1993, сс. 821-830; Тцайоп та ін., У. Іттипої. 152, 1994, сс. 2912-2920; Тауїог та ін., Іпїегпайопа! Іттипоїіоду, 1994, сс. 579-591; і Рі5пм/йа та ін.,
Маїшиге Віоїесппоіоду 14, 1996, сс. 845-851, зміст усіх публікацій спеціально повністю включено в цей опис як посилання (див. також 05 МоМо 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 і 5770429, усе на ім'я І опрегу і Кау; О5 Мо 5545807 на ім'я зиМгапі зі співавторами; опубліковані заявки РСТ УМО 92103918, УМО 93/12227, МО 94/25585, МО 97113852, УМО 98/24884 і УМО 99/45962, усе на ім'я І опрего і Кау; і опубліковану заявку РСТ МО 01/14424 на ім'я Когтап зі співавторами).
В іншому варіанті здійснення винаходу людські антитіла, запропоновані у винаході, можна одержувати з використанням миші, яка несе трансгенні і трансхромосомні послідовності людського імуноглобуліну, наприклад, миші, яка несе трансген людського важкого ланцюга і трансхромосому людського легкого ланцюга. Такі миші, позначені в контексті цього опису як "КМ-мишії", описані докладно в публікації РСТ УМО 02/43478 на ім'я Іхпіда зі співавторами.
У цій галузі відомі також й інші альтернативні системи на основі трансгенних тварин, що експресують гени людського імуноглобуліну, і їх можна застосовувати для одержання НЕКЗ- зв'язувальних антитіл, запропонованих у винаході. Наприклад, можна використовувати іншу трансгенну систему, позначену як Хепотоизе (фірма АбБдепіх, Іпс.); такі миші описані, наприклад, в ЮШ5 МоМо 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 і 6162963 на ім'я Киспегіараїйї зі
Зо співавторами.
Крім того, у цій галузі відомі також інші трансхромосомні системи, створені на основі тварин, для експресії генів людського імуноглобуліну, і їх можна застосовувати для одержання НЕКЗ- зв'язувальних антитіл, запропонованих у винаході. Наприклад, можна використовувати мишей, що несуть як трансхромосому людського важкого ланцюга, так і трансхромосому людського легкого ланцюга, які позначені як "ТС-миші"; такі миші описані, наприклад, у Тоті?2икКа та ін.
Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 97, 2000, сс. 722-727. Крім того, у цій галузі відомі корови, що несуть трансхромосоми людського важкого і легкого ланцюга (Кигоїума та ін., Маїшге ВіоїесппоЇоду 20, 2002, сс. 889-894) і їх можна застосовувати для одержання НЕКЗ-зв'язувальних антитіл, запропонованих у винаході.
Людські моноклональні антитіла, запропоновані у винаході, можна одержувати також з використанням методів фагового дисплея для скринінга бібліотек генів людських імуноглобулінів. Такі методи фагового дисплея, призначені для виділення людських антитіл, відомі в цій галузі (див., наприклад, ОЗ МоМо 5223409; 5403484 і 5571698 на ім'я І адпег зі співавторами, 5 МоМо 5427908 і 5580717 на ім'я ЮОоуег зі співавторами, О5 МоМо 5969108 і 6172197 на ім'я МсСайепу зі співавторами, і 05 МоМо 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 і 6593081 на ім'я Сгіййне зі співавторами) або вони описані в наведених нижче прикладах.
Людські моноклональні антитіла, запропоновані у винаході, можна одержувати також з використанням ЗСІЮ-мишей (миші з важким комбінованим імунодефіцитом), у яких відновлювали людські імуноцити для того, щоб при імунізації можна було одержувати людську гуморальну імунну відповідь. Такі миші описані, наприклад, в Ме 05 5476996 і 5698767 на ім'я
Уумізоп зі співавторами. (ПП) Конструювання каркасних ділянок або Ес
До сконструйованих антитіл, запропонованих у винаході, відносяться антитіла, у яких зроблені модифікації в залишках каркасних ділянок в МН і/або Мі, наприклад, з метою поліпшення властивостей антитіла. Як правило, такі модифікації каркасних ділянок здійснюють для зниження імуногенності антитіла. Наприклад, один з підходів являє собою "зворотне мутування" одного або декількох залишків каркасної ділянки з одержанням відповідної послідовності зародкової лінії. Більш конкретно, антитіло, яке було піддано соматичній мутації, 60 може містити залишки каркасної ділянки, що відрізняються від послідовності зародкової лінії, З якої виведено антитіло. Такі залишки можна ідентифікувати шляхом порівняння послідовностей каркасних ділянок антитіла з послідовностями зародкової лінії, з якої виведено антитіло. Для повернення послідовностей каркасної ділянки до вихідної конфігурації зародкової лінії можна піддавати соматичні мутації "зворотному мутуванню" з одержанням послідовності зародкової лінії, наприклад, за допомогою сайтнаправленого мутагенезу. Такі антитіла, отримані шляхом "зворотного мутування", також підпадають під обсяг цього винаходу.
Інший тип модифікації каркасної ділянки включає зміну шляхом мутації одного або декількох залишків у каркасній ділянці або навіть в одній або декількох СОК-ділянках для видалення Т- клітнних епітопів з метою зниження потенційної імуногенності антитіла. Цей підхід позначають також як "деімунизація", і він описаний більш докладно в опублікованому патенті 05 Мо 2003/0153043 на ім'я Саїт зі співавторами.
У додатковому або альтернативному варіанті крім модифікацій у каркасних ділянках або
СОВ-ділянках антитіла, запропоновані у винаході, можуть включати модифікації в Ес-фрагменті, як правило, для зміни однієї або декількох функціональних властивостей антитіла, таких як час напівжиття в сироватці, фіксація комплементу, зв'язування Ес-рецептора і/або антитіло- обумовлена клітиннозалежна цитотоксичність. Крім того, антитіло, запропоноване у винаході, можна модифікувати хімічно (наприклад, до антитіла можна приєднувати один або кілька хімічних фрагментів) або можна модифікувати для зміни його глікозилювання, і в цьому випадку з метою зміни однієї або декількох функціональних властивостей антитіла. Кожний із зазначених варіантів здійснення винаходу буде додатково описаний нижче. Нумерація залишків в Ес-фрагменті відповідає нумерації БО за Кеботом.
В одному з варіантів здійснення винаходу модифікують шарнірну область СНІ так, щоб змінювати, наприклад, збільшувати або знижувати, кількість цистеїнових залишків у шарнірній області. Цей підхід описаний також в О5 Мо 5677425 на ім'я Водтег зі співавторами. Кількість цистеїнових залишків у шарнірній області СНІ змінюють, наприклад, для полегшення складання легких і важких ланцюгів або для підвищення або зниження стабільності антитіла.
В іншому варіанті здійснення винаходу шарнірну область Ес-фрагменту антитіла можна змінювати за допомогою мутації для зменшення біологічного часу напівжиття антитіла. Більш конкретно, інтродуціюють одну або кілька амінокислотних мутацій в область контакту СН2-СНЗ-
Зо доменів шарнірної області Ес-фрагмента для погіршення зв'язування антитіла з білком А золотавого стафілокока еїарпуіососсу! (Зра) у порівнянні зі зв'язуванням нативної шарнірної області Ес-фрагмента з 5рА. Цей підхід описаний більш докладно в Ш5 Мо 6165745 на ім'я УМага зі співавторами.
В інших варіантах здійснення винаходу Ес-фрагмент змінюють шляхом заміни щонайменше одного амінокислотного залишку на інший амінокислотний залишок для зміни ефекторних функцій антитіла. Наприклад, один або кілька амінокислотних залишків можна заміняти на інший амінокислотний залишок таким чином, щоб у такого антитіла змінювалася афінність до ефекторного ліганда, але зберігалася антигензв'язувальна здатність батьківського антитіла.
Ефекторний ліганд, афінність до якого змінюють, може являти собою, наприклад, Ес-рецептор або С1-компонент системи комплементу. Цей підхід описаний більш докладно в 5 МоМо 5624821 і 5648260, обоє на ім'я Уміпітег зі співавторами.
В іншому варіанті здійснення винаходу один або кілька амінокислотних залишків амінокислотної послідовності можна заміняти іншим амінокислотним залишком так, щоб антитіло мало змінену здатність до Сід-зв'язування і/або знижену комплементзалежну цитотоксичність (СОС) або щоб у нього була відсутня СОС. Цей підхід описаний більш докладно в 05 Мо 6194551 на ім'я Ідизодіє зі співавторами.
В іншому варіанті здійснення винаходу один або кілька амінокислотних залишків модифікують, змінюючи тим самим здатність антитіла до фіксації комплементу. Цей підхід описаний також у публікації заявки РСТ УМО 94/29351 на ім'я Воатег зі співавторами.
Ще в одному варіанті здійснення винаходу Ес-фрагмент модифікують для підвищення здатності антитіла викликати антитіло-обумовлену клітиннозалежну цитотоксичність (АЮСС) і/або для підвищення афінності антитіла до Есу-рецептора за допомогою модифікації однієї або декількох амінокислот. Цей підхід описаний більш докладно в публікації заявки РСТ УМО 00/42072 на ім'я Ргевіа. Крім того, були картовані сайти зв'язування людського ДС з ЕсукІ,
ЕСУКІЇ, ЕсуКІ ії ЕсКп, і описані варіанти з поліпшеною здатністю до зв'язування (див. Зпівїав5 та ін., У. ВіоІ. Спеп. 276, 2001, сс. 6591-6604).
У наступному варіанті здійснення винаходу модифікують глікозилювання антитіла.
Наприклад, можна створювати аглікозильоване антитіло (тобто антитіло, у якому відсутнє глікозилювання). Глікозилювання можна змінювати, наприклад, для підвищення афінності 60 антитіла до "антигену". Такі вуглеводні модифікації можна здійснювати шляхом, наприклад,
зміни одного або декількох сайтів глікозилювання в послідовності антитіла. Наприклад, можна здійснювати одну або кілька амінокислотних замін, які приводять до елімінації одного або декількох сайтів глікозилювання каркасної ділянки варіабельної області, усуваючи тим самим глікозилювання в цьому сайті. Зазначене аглікозилювання може підвищувати афінність антитіла до антигену. Цей підхід описаний більш докладно в ОЗ МоМо 5714350 і 6350861 на ім'я Со зі співавторами.
У додатковому або альтернативному варіанті можна створювати антитіло зі зміненим типом глікозилювання, наприклад, гіпофукозильоване антитіло, яке має знижену кількість фукозильних залишків, або антитіло з підвищеним вмістом дворозсікаючих (ІсМас-структур. Було продемонстровано, що такі змінені схеми глікозилювання підвищують АЮОСс -активність антитіл.
Зазначені вуглеводні модифікації можна здійснювати, наприклад, шляхом експресії антитіла в клітині-хазяїні зі зміненим механізмом глікозилювання. Клітини зі зміненим механізмом глікозилювання відомі в цій галузі, і їх можна застосовувати як клітини-хазяї, у яких експресують рекомбінантні антитіла, запропоновані у винаході, для одержання тим самим антитіл зі зміненим глікозилюванням. Наприклад, в ЕР 1176195 на ім'я Напд зі співавторами описана лінія клітин з функціонально порушеним геном РОТ8, який кодує фукозилтрансферазу, у результаті чого антитіла, що експресуються в такій клітинній лінії, характеризуються гіпофукозилюванням. У публікації заявки РСТ УМО 03/035835 на ім'я Ргезіа описаний варіант лінії СНО-клітин, а саме
І есіЗ-клітини, які характеризуються зниженою здатністю приєднувати фукозу до зв'язаних з
Авп(297) вуглеводів, що приводить також до гіпофукозилювання антитіл, що експресуються у цій клітині-хазяїні (див. також ЗпієеЇй5 та ін., У. ВіоЇ. Спет. 277, 2002, сб. 26733-26740). У публікації заявки РСТ УМО 99/54342 на ім'я Штапа зі співавторам, описані лінії клітин, сконструйовані для експресії глікозилтрансфераз, що модифікують глікопротеїн (наприклад, бета(1,4)-М- ацетилглюкозамінілтрансферази ПШ (СпТІ)), у результаті чого антитіла, які експресуються в сконструйованих лініях клітин, характеризуються підвищеним вмістом дворозсікаючих СісМас-структур, що приводить до підвищеної АЮОСсС-активності антитіл (див. також тапа та ін., Маї. Віотеспі. 17, 1999, сс. 176-180).
В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло модифікують для подовження біологічного часу напівжиття. При цьому можливе застосування різних підходів. Наприклад, можна
Зо інтродуціювати одну або декілька з наступних мутацій: Т252І, Т2545, Т256Е, описаних в О5 Мо 6277375 на ім'я УМага. В іншому варіанті для подовження біологічного часу напівжиття можна змінювати антитіло в СНІ1- або Сі -області шляхом інтродукції, що зв'язується з рецептором- «рятувальником" епітопу, отриманого з двох петель СН2-домену Ес-фрагмента Ідс, як описано в 05 МоМо 5869046 і 05 6121022 на ім'я Ргезіа зі співавторами. (ІМ) Методи конструювання змінених антитіл
Як зазначено вище, НЕКЗ-зв'язувальні антитіла, які мають послідовності МН і МІ або послідовності повнорозмірного важкого і легкого ланцюга, представлені в цьому описі, можна застосовувати для створення нових НЕКЗ-зв'язувальних антитіл шляхом модифікації послідовностей повнорозмірного важкого ланцюга і/або легкого ланцюга, послідовностей. МН або МІ або приєднаної(их) до них константної(их) області(ей). Таким чином, згідно з іншим об'єктом винаходу структурні особливості НЕКЗ-зв'язувального антитіла, запропонованого у винаході, використовують для створення структурно споріднених НЕКЗ-зв'язувальних антитіл, які зберігають щонайменше одну з функціональних властивостей антитіл, запропонованих у винаході, таких як зв'язування з людським НЕКЗ, а також здатність інгібувати одну або кілька функціональних властивостей НЕКЗ. Наприклад, одну або декілька СОК-ділянок антитіл, запропонованих у цьому винаході, або їх мутантів можна поєднувати рекомбінантно з відомими каркасними ділянками і/або іншими СОжК для одержання додаткових, створених з використанням рекомбінантної ДНК НЕКЗ-зв'язувальних антитіл, запропонованих у винаході.
Інші типи модифікацій включають модифікації, описані в попередньому розділі. Вихідним матеріалом для конструювання є одна або кілька послідовностей МН і/або МІ, представлених у цьому описі, або одна або декілька їх СОК-ділянок. Для створення сконструйованого антитіла не є необхідним фактичне одержання (тобто експресія у вигляді білка) антитіла, яке має одну або декілька з послідовностей МН і/або МІ, представлених у цьому описі, або одну або декілька їх СОК-ділянок. Краще інформацію, що міститься в послідовності(ях), використовують як вихідний матеріал для створення послідовності(ей) "другого покоління", виведеної(их) з вихідної(їих) послідовностісей), і потім одержують послідовність() другого покоління і експресують у вигляді білка.
Таким чином, ще одним варіантом здійснення винаходу є спосіб одержання НЕКЗ- зв'язувального антитіла, що складається з: послідовності варіабельної області важкого ланцюга 60 антитіла, який містить послідовність СОКІ1, обрану з групи, що включає 5ЕО ІЮО МО: 2, 8, 20, 26,
38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 і 368; послідовність
СОР, обрану з групи, що включає 5ЕО ІЮ МО: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 і 369; і/або послідовність СОКЗ, обрану з групи, що включає ЗЕО ІО МО: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 75, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 і 370; і послідовності варіабельної області легкого ланцюга антитіла, який містить послідовність СОКІ, обрану з групи, що включає ЗЕО ІЮ МО: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 215, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 і 371; послідовність СОК2, обрану з групи, що включає 5ЕО ІЮ МО: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 і 372; і/або послідовність СОКЗ, обрану з групи, що включає 5ЕО ІО МО: 7, 13, 25,
З1, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 і 373; що полягає в тому, що змінюють щонайменше один амінокислотний залишок у послідовності варіабельної області важкого ланцюга антитіла і/або варіабельної області легкого ланцюга антитіла, створюючи щонайменше одну змінену послідовність антитіла, і експресують змінену послідовність антитіла у вигляді білка. Змінену послідовність антитіла можна створювати також шляхом скринінгу бібліотек антитіл, які мають фіксовані послідовності СОКЗ або мінімальні зв'язувальні детермінанти, що мають вирішальне значення, описані в 5 Мо 20050255552, і різноманітні послідовності СОКІ ії СОК2. Скринінг можна здійснювати з використанням будь- якого методу скринінгу, прийнятного для скринінгу антитіл з бібліотек антитіл, такого як технологія фагового дисплея.
Для одержання і експресії зміненої послідовності антитіла можна застосовувати стандартні методи молекулярної біології. Антитіло, що кодується зміненою(ими) послідовністю(ями), являє собою антитіло, яке зберігає одну, декілька або всі функціональні властивості НЕКЗ- зв'язувальних антитіл, представлених у цьому описі, де функціональні властивості являють
Зо собою (але не обмежуючись тільки ними) специфічне зв'язування з НЕКЗ людини і/або мавпи циномолгус; при цьому антитіло зв'язується з НЕКЗ і нейтралізує біологічну активність НЕКЗ шляхом інгібування сигнальної активності НЕК за даними аналізу фосфо-НЕВ.
Функціональні властивості змінених антитіл можна оцінювати за допомогою стандартних аналізів, відомих у цій галузі і/або представлених у цьому описі, таких як описані в розділі "Приклади" (наприклад, ЕГІ5А).
У конкретних варіантах способів створення антитіл, запропонованих у винаході, мутації можна інтродуціювати довільно або вибірково у всю або в частину кодуючої послідовності
НЕВЗ-зв'язувального антитіла і отримані в результаті модифіковані НЕКЗ-зв'язувальні антитіла можна піддавати скринінгу відносно зв'язувальної активності і/або інших описаних вище функціональних властивостей. Методи інтродукції мутацій відомі в цій галузі. Наприклад, у публікації заявки РСТ УМО 02/092780 на ім'я Зпогі описані методи створення і скринінгу мутацій антитіл за допомогою мутагенезу, що насичує, синтетичного складання лігуванням або за допомогою комбінації цих методів. Альтернативно цьому в опублікованій заявці РСТ УМО 03/074679 на ім'я І агаг зі співавторами описані методи, засновані на комп'ютерному скринінзі, для оптимізації фізико-хімічних властивостей антитіл.
Характеризація антитіл, запропонованих у винаході
Антитіла, запропоновані у винаході можна характеризувати за допомогою різних функціональних аналізів. Наприклад, їх можна характеризувати за їхньою здатністю нейтралізувати біологічну активність шляхом інгібування передачі сигналу НЕК на основі аналізу фосфо-НЕК, який представлений у цьому описі, за їхньою афінністю до білка НЕКЗ (наприклад, НЕКЗ людини і/або мавпи циномолгус), за епітопним групуванням, за їхньою стійкістю до протеолізу і за їхньою здатністю блокувати передачу сигналу НЕКЗ у прямому напрямку. Різні методи можна застосовувати для оцінки опосередковуваної НЕКЗ передачі сигналу. Наприклад, шлях передачі сигналу НЕК можна визначати шляхом (І) оцінки фосфо-
НЕКЗ; (ІЇ) оцінки фосфорилювання НЕКЗ або інших білків, розташованих у шляху передачі сигналу (наприклад, АК), (І) за допомогою аналізів блокади лігандів, які представлені в цьому описі, (ІМ) за утворенням гетеродимерів, (М) за схемою НЕКЗ-залежної експресії генів, (МІ) за інтерналізацією рецептора і (МІЇ) за клітинним фенотипам, що визначаються НЕКЗ (наприклад, за проліферацією). 60 Здатність антитіла зв'язуватися з НЕКЗ можна виявляти шляхом безпосереднього мічення антитіла, що представляє інтерес, або антитіло може перебувати в неміченій формі, а зв'язування можна виявляти непрямими методами, використовуючи формати сендвіч-аналізів, які відомі в цій галузі.
У деяких варіантах здійснення винаходу НЕКЗ-зв'язувальні антитіла, запропоновані у винаході, блокують зв'язування або конкурують за зв'язування поліпептиду або білка НЕКЗ з референс-антитілом, що зв'язуються з НЕКЗ. Вони можуть являти собою повністю людські
НЕВЗ-зв'язувальні антитіла, описані вище. Вони можуть являти собою також інші мишщшачі, химерні або гуманізовані НЕКЗ-зв'язувальні антитіла, які зв'язуються з тим же епітопом, що і референс-антитіло. Здатність блокувати зв'язування референс-антитіла з епітопом або конкурувати за зв'язування з референс-антитілом свідчить про те, що НЕКЗ-зв'язувальне антитіло, яке тестується, зв'язується з тим же або подібним епітопом, який розпізнається референс-антитілом, або з епітопом, який розташований у достатній близькості від епітопу, з яким зв'язується референс-антитіло, що зв'язується 3 НЕКЗ. Зазначені антитіла з великою долею ймовірності будуть мати переваги, виявлені у референс-антитіла. Здатність блокувати зв'язування або конкурувати з референс-антитілом можна визначати, наприклад, за допомогою аналізу конкурентного зв'язування. При здійсненні аналізу конкурентного зв'язування визначають здатність антитіла, що тестується, інгібувати специфічне зв'язування референс- антитіла із загальним антигеном, таким як поліпептид або білок НЕКЗ. Антитіло, що тестується, конкурує з референс-антитілом за специфічне зв'язування з антигеном, якщо при застосуванні в надлишковій кількості антитіло, що тестується, в значній мірі інгібує зв'язування референс- антитіла. Поняття "у значній мірі інгібує" означає, що антитіло, яке тестується, знижує зв'язування референс-антитіла, як правило, щонайменше на 10 95, 25 Фо, 50 95, 75 95 або 90 95.
Відомо кілька конкурентних аналізів зв'язування, які можна застосовувати для оцінки конкуренції НЕКЗ-зв'язувального антитіла і референс-антитіла, що зв'язується з НЕКЗ, за зв'язування з білком НЕКЗ. До них відноситься, наприклад, твердофазний прямий або непрямий радіоїмуноаналіз (РІА), твердофазний прямий або непрямий імуноферментний аналіз (ІФА), конкурентний "сендвіч»-аналіз (див. (апії та ін., Меїпоав іп Епгутоїіоду 9, 1983, сб. 242-253); твердофазний прямий ІФА з використанням біотину-авідину (див. КігкКіапа та ін., У. Іттипої. 137, 1986, сс. 3614-3619); твердофазний прямий аналіз з використанням мітки, твердофазний
Зо прямий "сендвіч»-аналіз з використанням мітки (див. Нагпом/ і Гапе, вище); твердофазний прямий РІА з використанням як мітки 1725 (див. Могеї та ін., Моїес. Іттипої. 25, 1988, сс. 7-15); твердофазний прямий ІФА з використанням біотину та авідину (Спешцпоа та ін., Мігоїоду 176, 1990, сс. 546-552); і прямий РІА з використанням мітки (МоІдеппацег та ін., Зсапа. 9У. Іттипої. 32, 1990, сс. 77-82). Як правило, такий аналіз передбачає застосування очищеного антигену, пов'язаного з твердою поверхнею, або клітин, що несуть будь-які з них, неміченого НЕКЗ- зв'язувального антитіла, що тестується, і міченого референс-антитіла. Конкурентне інгібування оцінюють, визначаючи кількість мітки, пов'язаної з твердою поверхнею або клітини, у присутності антитіла, що тестується. Як правило, антитіло, що тестується, застосовують у надлишковій кількості. До антитіл, ідентифікованих за допомогою конкурентного аналізу (конкуруючі антитіла), відносяться антитіла, які зв'язуються з тим же епітопом, що і референс- антитіло, і антитіла, які зв'язуються з сусіднім епітопом, розташованим у достатній близькості від епітопа, з яким зв'язується референс-антитіло, щоб це створювало стеричну перешкоду.
Для вирішення питання про те, чи зв'язуються відібрані моноклональні НЕКЗ-зв'язувальні антитіла з унікальними епітопами, кожне антитіло можна біотинілювати з використанням реагентів, що надходять у продаж (наприклад, реагентів фірми Ріегсе, Рокфорд, шт. Іллінойс).
Аналізи конкурентного зв'язування з використанням немічених моноклональних антитіл і біотинільованих моноклональних антитіл можна здійснювати, застосовуючи сенсибілізовані поліпептидом НЕКЗ планшети для ЕГІЗА. Зв'язування біотинільованого МАт можна виявляти за допомогою зонда стрептавідин-лужна фосфататаза. Для визначення ізотипу очищеного НЕКЗ- зв'язувального антитіла можна застосовувати специфічні для ізотипу ЕГІ5А. Наприклад, лунки титраційних планшетів можна сенсибілізувати з використанням узятого в концентрації 1 мкг/мл антитіла до людського ЇдС протягом ночі при 4 "С. Після блокування за допомогою 1 95 БСА вміст планшетів піддають взаємодії з моноклональним НЕКЗ-зв'язувальним антитілом або з очищеними антитілами, що застосовуються для контролю ізотипу, в концентрації 1 мкг/мл або менше протягом 1-2 год. при температурі навколишнього середовища. Потім вміст лунок можна піддавати взаємодії з кон'юЮгованими з лужною фосфатазою зондами, специфічними у відношенні або людського ІдОЇ, або людського (ЯМ. Потім планшети проявляють і піддають аналізу, за допомогою якого можна визначати ізотип очищеного антитіла.
Для демонстрації зв'язування моноклональних НЕКЗ-зв'язувальних антитіл 3 живими бо клітинами, що експресують поліпептид НЕКЗ, можна застосовувати проточну цитометрію. У цілому, метод полягає в наступному: лінії клітин, що експресують НЕКЗ (вирощені в стандартних умовах культивування), можна змішувати з НЕКЗ-зв'язувальним антитілом, узятим у різних концентраціях, у ЗФР, що містить 0,1 95 БСА і 10 95 фетальної телячої сироватки, та інкубувати протягом 1 год. Після відмивання клітини піддають взаємодії з міченим флуоресцеїном антитілом до людського дос у таких же умовах, які застосовують для фарбування первинним антитілом. Зразки можна аналізувати за допомогою пристрою типу
ЕАСбсап, заснованого на використанні світла і властивостей бічного розсіювання, встановлюючи дискримінаційне вікно на індивідуальні клітини. В альтернативному варіанті для аналізу можна використовувати флуоресцентний мікроскоп (на додаток до проточної цитометрії або замість неї). Клітини можна офарблювати повністю відповідно до описаного вище методу і оцінювати за допомогою флуоресцентного мікроскопа. Цей метод дозволяє візуалізувати індивідуальні клітини, але може мати знижену чутливість залежно від щільності антигену.
Реактивність НЕКЗ-зв'язувальних антитіл відносно поліпептиду НЕКЗ або його антигенного фрагмента можна оцінювати також за допомогою вестерн-блоттінгу. У цілому, метод полягає в наступному: можна одержувати очищені поліпептиди НЕКЗ або злиті білки, або можна приготовлювати клітинні екстракти з клітин, що експресують НЕКЗ, і піддавати гель- електрофорезу в присутності додецилсульфату натрію. Після електрофорезу розділені антигени переносять на нітроцелюлозні мембрани, блокують 10 95 фетальної телячої сироватки і зондують моноклональними антитілами, що тестуються. Зв'язування людського |Ї40 можна виявляти за допомогою антитіла до людського ДО, кон'юЮютгованого з лужною фосфатазою, і проявляти, використовуючи таблетки субстрату ВСІР/МВТ (фірма Зідта Спет. Со., Сент-Луїс, шт. Міссурі).
Цілий ряд вихідних даних можна застосовувати для оцінки ефективності і специфічності антитіл до НЕКЗ з використанням аналізів у клітинах утворення гетеродимеру, що індукується лігандом. Активність можна оцінювати за допомогою одного або декількох наступних методів: (І) Інгібування гетеродимеризації НЕК2, що індукується лігандом, з іншими представниками сімейства ЕСЕ у лінії клітини-мішені, наприклад, лінії клітин раку молочної залози МСЕ-7.
Імунопреципітацію комплексів з НЕКЗ2 з клітинних лізатів можна здійснювати з використанням специфічного для рецептора антитіла, і відсутність/присутність інших ЕСЕ-рецепторів і їх біологічно відповідних лігандів у комплексі можна аналізувати за допомогою електрофорезу/вестерн-блоттінгу шляхом зондування антитілами до інших ЕСЕ-рецепторів. (ІЇ) Інгібування активації шляхом передачі сигналу за допомогою активованих лігандом гетеродимерів. Асоціація з НЕКЗ, імовірно, має вирішальне значення для інших представників сімейства рецепторів ЕСЕ відносно утворення максимальної клітинної відповіді після зв'язування з лігандом. У випадку НЕКЗ з дефіцитом кіназної активності НЕК2 є джерелом функціонального тирозинкіназного домену, що забезпечує передачу сигналу після зв'язування з лігандами фактора росту. Таким чином, клітини, у яких відбувається спільна експресія НЕК2 і
НЕКЗ, можна обробляти лігандом, наприклад, херегуліном, у відсутності і у присутності інгібітору, і вплив фосфорилювання тирозину НЕКЗ оцінювати різними шляхами, включаючи імунопреципітацію НЕКЗ з оброблених клітинних лізатів і наступний аналіз методом вестерн- блоттінгу з використанням антитіл до фосфотирозину (див. більш докладно у Адиз5 ор. сії.) В альтернативному варіанті можна здійснювати широкомасштабний аналіз, заснований на треппінзі НЕКЗ з солюбілізованих лізатів у лунках 96-ямкового планшета, сенсибілізованого антитілом до НЕКЗ-рецептора, і оцінювати фосфорилювання тирозину з використанням, наприклад, мічених европієм антитіл до фосфотирозину, згідно з методом, описаним у умуадаеюп та ін., Апаї. Віоспет. 309, 2002, сс. 150-157.
У більш широкому сенсі зазначений підхід полягає в тому, що ефекторні молекули, які, як відомо, повинні активувати в прямому напрямку активовані рецепторні гетеродимери, такі як протеїнкінази, що активуються мітогеном (МАРК), і АКї, можна аналізувати безпосередньо шляхом імунопреципітації з оброблених лізатів і блоттування з використанням антитіл, які виявляють активовані форми цих білків, або шляхом аналізу здатності цих білків модифікувати/активувати специфічні субстрати. (ПІ) Інгібування клітинної проліферації, що індукується лігандом. Відомо, що в цілому ряді клітинних ліній відбувається спільна експресія ЕГОВ-рецепторів, наприклад, у багатьох клітинних лініях раку молочної залози і передміхурової залози. Аналізи можна здійснювати в 24/48/96- ямкових форматах, у яких як вихідні дані використовують синтез ДНК (включення тритованого тимідину), збільшення кількості клітин (фарбування кристалічним фіолетовим) і т.д.
Для оцінки ефективності і специфічності антитіл до НЕКЗ з використанням аналізів незалежного від ліганду утворення гетеродимера в клітинах можна застосовувати цілий ряд 60 вихідних даних. Наприклад, надекспресія НЕК2 запускає незалежну від ліганда активацію кіназного домену в результаті спонтанного утворення димеру. При його надекспресії НЕК2 створює або гомо-, або гетеродимери з іншими молекулами НЕК, такими як НЕКІ, НЕКЗ і
НЕНА.
Можна оцінювати здатність антитіл або їх фрагментів блокувати іп мімо ріст пухлинних ксенотрансплантатів людських пухлинних ліній клітин, онкогенний фенотип яких, як відомо, щонайменше частково залежить від активації лігандом клітинної передачі сигналу гетеродимером НЕКЗ, наприклад, клітин раку підшлункової залози лінії ВХРОЗ і т.д. Це можна оцінювати на мишах з ослабленим імунітетом, використовуючи антитіла або індивідуально, або в комбінації з відповідним цитотоксичним агентом для розглянутої клітинної лінії. Приклади функціональних аналізів представлені також нижче в розділі "Приклади".
Профілактичне і терапевтичне застосування
Цей винахід відноситься до способів лікування захворювання або порушення, асоційованого зі шляхом передачі сигналу НЕКЗ, що полягає у тому, що вводять індивідуумові, який потребує цього, в ефективній кількості антитіла, запропоновані у винаході. Конкретним варіантом здійснення цього винаходу є спосіб лікування або попередження раку (такого, наприклад, як рак молочної залози, колоректальний рак, рак легені, множинна мієлома, рак яєчника, рак печінки, рак шлунку, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, гострий мієлолейкоз, хронічний мієлолейкоз, остеоаркома, плоскоклітинна карцинома, пухлини оболонки периферичних нервів, шванома, рак голови і шиї, рак сечового міхура, езофагеальний рак, гліобластома, світлоклітинна саркома м'якої тканини, злоякісна мезотеліома, нейрофіброматоз, рак нирки і меланома), що полягає в тому, що індивідуумові, який потребує цього, вводять в ефективній кількості антитіла, запропоновані у винаході.
Деякими варіантами здійснення цього винаходу є способи лікування або попередження раку, асоційованого зі шляхом передачі сигналу НЕК, що полягають у тому, що індивідуумові, який потребує цього, вводять в ефективній кількості антитіла, запропоновані у винаході.
Конкретним варіантом здійснення цього винаходу є способи лікування або попередження раку, асоційованого зі шляхом передачі сигналу НЕРЕ, такого як (але не обмежуючись тільки ними) рак молочної залози, колоректальний рак, рак легені, множинна мієлома, рак яєчника, рак печінки, рак шлунку, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, гострий мієлолейкоз,
Зо хронічний мієлолейкоз, остеоаркома, плоскоклітинна карцинома, пухлини оболонки периферичних нервів, шванома, рак голови і шиї, рак сечового міхура, езофагеальний рак, гліобластома, світлоклітинна саркома м'якої тканини, злоякісна мезотеліома, нейрофіброматоз, рак нирки і меланома.
Антитіла до НЕКЗ можна застосовувати також для лікування або попередження інших порушень, асоційованих з аберантною або порушеною передачею сигналу НЕК, включаючи (але не обмежуючись тільки ними) респіраторні захворювання, остеопороз, остеоартрит, полікістоз нирок, діабет, шизофренію, судинне захворювання, хворобу серця, неонкогенні проліферативні хвороби, фіброз і нейродегенеративні захворювання, такі як хвороба
Альцгеймера.
Прийнятними засобами для комбінованої терапії з використанням НЕКЗ-зв'язувальних антитіл є стандартні лікарські засоби, відомі в цій галузі, які можуть модулювати шлях передачі сигналу ЕГОВ. Прийнятними прикладами стандартних лікарських засобів для НЕКЗ2 є (але не обмежуючись тільки ними) герцептин і тайкерб. Прийнятними прикладами стандартних лікарських засобів для ЕСЕК є (але не обмежуючись тільки ними) іресса, тарцева, ербітукс і вектібікс. Іншими засобами, які можна застосовувати для комбінованої терапії з використанням
НЕВЗ-зв'язувальних антитіл є (але не обмежуючись тільки ними) засоби, які модулюють рецепторні тирозинкінази, рецептори, пов'язані з (з-білюом, шляхи трансдукції сигналів росту/виживання, рецептори ядерних гормонів, шляхи апоптозу, клітинний цикл і ангіогенез.
Діагностичне застосування
Одним з об'єктів винаходу є діагностичні аналізи, призначені для виявлення білка НЕКЗ іл або експресії нуклеїнової кислоти, що кодує НЕКЗ, а також функції білка НЕКЗ у біологічному зразку (наприклад, у крові, сироватці, клітинах, тканині) або в організмі індивідуума, ураженого раком або що має ризик розвитку раку.
Діагностичні аналізи, такі як конкурентні аналізи, засновані на здатності міченого аналога
Сіндикатор") конкурувати з аналізованою речовиною тест-зразка за обмежену кількість сайтів зв'язування на загальному партнерові по зв'язуванню. Як правило, здійснюють інсолюбілізацію партнера по зв'язуванню до або після конкурентного аналізу і потім індикатор і аналізовану речовину, зв'язану з партнером по зв'язуванню, відокремлюють від незв'язаного індикатора і аналізованої речовини. Такий поділ здійснюють шляхом зціджування (коли партнер по бо зв'язуванню попередньо був інсолюбілізований) або шляхом центрифугування (коли партнер по зв'язуванню осаджений після реакції конкурування). Кількість аналізованої речовини в тест- зразку зворотно пропорційна кількості зв'язаного індикатора при оцінці за кількістю маркерної субстанції. Одержують криві дозової залежності з використанням відомих кількостей аналізованої речовини і порівнюють з результатами тесту для кількісної оцінки рівні аналізованої речовини, що присутня в тест-зразку. Такі аналізи називають аналізами на основі
ЕПІЗА-систем, коли як маркери, що виявляються, використовують ферменти. В аналізі такого формату конкурентне зв'язування між антитілами і НЕКЗ-зв'язувальними антитілами приводить до зв'язування з білюм НЕКЗ, краще епітопами НЕКЗ, запропонованими у винаході, який є мірою рівня антитіл у зразку сироватки, найкраще нейтралізуючих антитіл у зразку сироватки.
Важливою перевагою аналізу є те, що можна здійснювати безпосереднє вимірювання титру нейтралізуючих антитіл (тобто антитіл, які чинять інтерферуючу дію на зв'язування з білком
НЕКЗ, зокрема його епітопами). Такий аналіз, насамперед у форматі ЕГІ5А, звичайно використовують у клінічних умовах, і він є рутинним при здійсненні скринінгу зразків крові.
Іншим об'єктом винаходу є способи визначення рівня експресії нуклеїнової кислоти, що кодує НЕМКЗ, або активності білка НЕКЗ у індивідуума з метою вибору відповідних терапевтичних або профілактичних засобів для індивідуума (позначені в контексті цього опису як "фармакогеномні способи"). Фармакогеномні дослідження дозволяють здійснювати вибір агентів (наприклад, лікарських засобів), призначених для терапевтичного або профілактичного лікування індивідуума, на основі генотипу індивідуума (наприклад, генотипу індивідуума, дослідженого для визначення здатності індивідуума реагувати на конкретний агент).
Ще одним об'єктом винаходу є моніторинг впливу агентів (наприклад, лікарських засобів) на експресію або активність білка НЕКЗ у клінічних дослідженнях.
Фармацевтичні композиції
Для приготування фармацевтичних або стерильних композицій, що містять НЕКЗ- зв'язувальні антитіла (інтактні або зв'язувальні фрагменти), НЕКЗ-зв'язувальні антитіла (інтактні або зв'язувальні фрагменти) змішують з фармацевтично прийнятним носієм або ексципієнтом.
Композиції можуть додатково містити один або декілька інших терапевтичних засобів, які можна застосовувати для лікування або попередження раку (рак молочної залози, колоректальний рак, рак легені, множинна мієлома, рак яєчника, рак печінки, рак шлунку, рак підшлункової залози,
Зо рак передміхурової залози, гострий мієлолейкоз, хронічний мієлолейкоз, остеоаркома, плоскоклітинна карцинома, пухлини оболонки (піхви) периферичних нервів, шванома, рак голови і шиї, рак сечового міхура, езофагеальний рак, гліобластома, світлоклітинна саркома м'якої тканини, злоякісна мезотеліома, нейрофіброматоз, рак нирки і меланома).
Препаративні форми терапевтичних і діагностичних агентів можна приготовлювати шляхом змішання з фізіологічно прийнятними носіями, ексципієнтами або стабілізаторами у формі, наприклад, ліофілізованих порошків, густих суспензій, водних розчинів, лосьйонів або суспензій (див., наприклад, Нагітап та ін. СбСоодтап апа Сійтапе Те РВаптасоїодіса! Вабвіб ої
Тпегареціїс5, вид-во Меосгам/-НІЇЇ, Мем мок, М.М., 2001; Сеппаг, Ветіпдіюоп: Тне 5сіепсе апа
Ргасіїсе ої Рпаптасу, вид-во Гірріпсой, УміШатв»х, апа УміКіп5, Мем/ МогК, М.М, 2000; Рнаптасеціісаї
Бозаде Еопт5: Рагепіега! Медісайоп5, за ред. Амі5 та ін., вид-во МагсеІ ЮОекКег, МУ, 1993;
Рпаптасешіса! Оозаде Еогтве: Табієїв5, за ред. Гіерептап та ін., вид-во Магсеї! ЮОекКег, МУ, 1990;
Рпагтасецшіїйса! Созаде Роптв: Оіврегзе Зувієтв», за ред. ІГіерегтап та ін., вид-во Магсе! Оеккег,
МУ, 1990; УМеїіпег і Коїко5Кіє, Ехсіріепі Тохісйу апа Загїейу, вид-во Магсе! ОеккКег, Іпс., Мемж/ МогкК,
М.У., 2000).
Вибір схеми введення терапевтичного засобу залежить від декількох факторів, включаючи швидкість циркуляції субстанції в сироватці або тканині, рівень симптомів, імуногенність субстанції і доступність клітин-мішеней у біологічному матриксі. У конкретних варіантах здійснення винаходу схема введення передбачає введення пацієнтові терапевтичного засобу в максимальних кількостях, що відрізняються прийнятним рівнем побічних дій. Таким чином, кількість біологічного агента, що вводиться, залежить частково від конкретної субстанції і від серйозності стану, що підлягає лікуванню. Відомі керівництва з вибору відповідних доз антитіл, цитокінів і малих молекул (див., наприклад, Умамглупс:ак, Апібоду ТПпегару, вид-во Віов5 зсіепійіс Рир. Ца, Охіогазпіге, ОК, 1996; Мопосіопаї! Апіїродіє5, СуїюКіпе5 апа Агійгйй5, за ред.
Кгезіпа, вид-во Магсе! ОекКег, Мем/ Хогк, М.У., 1991; Мопосіопа! Апііродієз апа Реріїде Тпегару іп
Ашоіттипе Оізеазев, за ред. Васі, вид-во Магсе! ОекКег, Мем/ МоОгК, М.У., 1993; Ваєгі та ін., Мемж/
Епо!. У. Меа. 348, 2003, сс. 601-608; Міїдгот та ін., Мем Еподі. У. Мей. 341, 1999, сс. 1966-1973;
Зіатоп та ін., Мем/ Епаі. У. Мей. 344, 2001, сс. 783-792; Вепіатіпомії; та ін., Мем/ Еподї. У. Мед. 342, 2000, сс. 613-619; Спо5п та ін., Мем/ Епаді. У. Мей. 348, 2003, сс. 24-32; ІІр5Ку та ін., Мем/
Епо)ї. 9. Меа. 343, 2000, сс. 1594-1602). 60 Визначення відповідної дози здійснює лікар-куратор, наприклад, на основі параметрів або факторів, які як це відомо або передбачається в цій галузі, впливають на лікування, або передбачається, що вони повинні впливати на лікування. Як правило, введення доз починають з рівня, трохи більш низького, ніж оптимальна доза, і потім підвищують з невеликими інкрементами до досягнення необхідної або оптимальної дії, беручи до уваги будь-які негативні побічні дії. Важливими діагностичним критеріями є зазначені симптоми, наприклад, запалення або рівень вироблення запальних цитокінів.
Фактичні рівні доз діючих речовин у фармацевтичних композиціях, запропонованих у цьому винаході, можна варіювати таким чином, щоб одержувати кількість діючої речовини, ефективну для досягнення необхідної терапевтичної відповіді у конкретного пацієнта при використанні конкретної композиції і шляху введення, і вони не повинні бути токсичними для пацієнта.
Обраний рівень доз повинен залежати від різних фармакокінетичних факторів, включаючи активність застосовуваних конкретних композицій, запропонованих у цьому винаході, або складного ефіру, солі або аміду, шляху введення, тривалості введення, швидкості виділення конкретної застосовуваної сполуки, тривалості лікування, інших лікарських засобів, сполук і/або матеріалів, застосовуваних у комбінації з конкретними використовуваними композиціями, віку, статі, ваги, стану, загального стану здоров'я і попередньої історії хвороби підлягаючого лікуванню пацієнта і аналогічних факторів.
Композиції, що містять антитіла або їх фрагменти, запропоновані у винаході, можна вводити шляхом безперервної інфузії або з інтервалами між введеннями доз, що становлять наприклад, один день, один тиждень або 1-7 разів на тиждень. Дози можна вводити внутрішньовенно, підшкірно, місцево, орально, назально, ректально, внутрішньом'язово, внутрішньоцеребрально або шляхом інгаляції. Конкретний протокол введення доз включає застосування максимальної дози або частоти введення доз, при яких вдається уникнути виражених небажаних побічних дій.
Загальна тижнева доза може становити щонайменше 0,05 мкг/кг ваги тіла, щонайменше 0,2 мкг/кг, щонайменше 0,5 мкг/кг, щонайменше 1 мкг/кг, щонайменше 10 мкг/кг, щонайменше 100 мкг/кг, щонайменше 0,2 мг/кг, щонайменше 1,0 мг/кг, щонайменше 2.0 мг/кг, щонайменше 10 мг/кг, щонайменше 25 мг/кг або щонайменше 50 мг/кг (див., наприклад, Мапод та ін., Мем Епаї. 9.
Меа. 349, 2003, сс. 427-434; Негоїй та ін., Мем ЕпаЇї. У. Мед. 346, 2002, сс. 1692-1698; ім та ін., 9.
Меигої. Меигозигуд. Русі. 67, 1999, сс. 451-456; Ропіеїй| та ін., Сапсег Іттипої. ІттипоїНег. 52,
Ко) 2003, сс. 133-144). Необхідна доза антитіл або їх фрагментів є приблизно такою ж, що й доза О їх фрагментів є приблизно такою ж, що і при перерахуванні у вигляді кількості молей/кг ваги тіла. Доза може становити щонайменше 15, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 55, щонайменше 60, щонайменше 65, щонайменше 70, щонайменше 75, щонайменше 80, щонайменше 85, щонайменше 90, щонайменше 95 або щонайменше 100 мкг. Дози можна вводити індивідуумові щонайменше 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12 разів або більше.
Доза антитіл або їх фрагментів, запропонованих у винаході, може становити від 0,0001 до 100 мг/кг ваги тіла пацієнта. Доза може становити від 0,0001 до 20 мг/кг, від 0,0001 до 10 мг/кг, від 0,0001 до 5 мг/кг, від 0,0001 до 2 мг/кг, від 0,0001 дої1 мг/кг, від 0,0001 до 0,75 мг/кг, від 0,0001 до 0,5 мг/кг, від 0,0001 до 0,25 мг/кг, від 0,0001 до 0,15 мг/кг, від 0,0001 до 0,10 мг/кг, від 0,001 до 0,5 мг/кг, від 0,01 до 0,25 мг/кг або від 0,01 до 0,10 мг/кг ваги тіла пацієнта.
Дозу антитіл або їх фрагментів, запропонованих у винаході, можна розраховувати на основі ваги тіла пацієнта в кілограмах (кг), помножуючи на кількість доз, що підлягають введенню (у мг/кг). Доза антитіл або їх фрагментів, запропонованих у винаході, може становити 150 мкг/кг або менше, 125 мкг/кг або менше, 100 мкг/кг або менше, 95 мкг/кг або менше, 90 мкг/кг або менше, 85 мкг/кг або менше, 80 мкг/кг або менше, 75 мкг/кг або менше, 70 мкг/кг або менше, 65 мкг/кг або менше, 60 мкг/кг або менше, 55 мкг/кг або менше, 50 мкг/кг або менше, 45 мкг/кг або менше, 40 мкг/кг або менше, 35 мкг/кг або менше, 30 мкг/кг або менше, 25 мкг/кг або менше, 20 мкг/кг або менше, 15 мкг/кг або менше, 10 мкг/кг або менше, 5 мкг/кг або менше, 2,5 мкг/кг або
БО менше, 2 мкг/кг або менше, 1,5 мкг/кг або менше, 1 мкг/кг або менше, 0,5 мкг/кг або менше або 0,5 мкг/кг ваги тіла пацієнта або менше.
Стандартна доза антитіл або їх фрагментів, запропонованих у винаході, може становити від 0,1 до 20 мг, від 0,1 до 15 мг, від 0,1 до 12 мг, від 0,1 до 10 мг, від 0,1 до 8 мг, від 0,1 до 7 мг, від 0,1 до 5 мг, від 0,1 до 2.5 мг, від 0,25 до 20 мг, від 0,25 до 15 мг, від 0,25 до 12 мг, від 0,25 до 10 мг, від 0,25 до 8 мг, від 0,25 до 7 мг, від 0,25 до 5 мг, від 0,5 до 2,5 мг, від 1 до 20 мг, від 1 до 15 мг, від 1 до 12 мг, від 1 до 10 мг, від 1 до 8 мг, від 1 до 7 мг, від 1 до 5 мг або від 1 до 2,5 мг.
Доза антитіл або їх фрагментів, запропонованих у винаході, може забезпечувати титр у сироватці індивідуума, що становить щонайменше 0,1, щонайменше 0,5, щонайменше 1, щонайменше 2, щонайменше 5, щонайменше б, щонайменше 10, щонайменше 15, 60 щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 50, щонайменше 100, щонайменше 125,
щонайменше 150, щонайменше 175, щонайменше 200, щонайменше 225 щонайменше 250, щонайменше 275, щонайменше 300, щонайменше 325, щонайменше 350, щонайменше 375 або щонайменше 400 мкг/мл. В альтернативному варіанті доза антитіл або їх фрагментів, запропонованих у винаході, може забезпечувати титр у сироватці індивідуума, що становить щонайменше 0,1, щонайменше 0,, щонайменше 1, щонайменше 2, щонайменше 5, щонайменше б, щонайменше 10, щонайменше 15, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 50, щонайменше 100, щонайменше 125, щонайменше 150, щонайменше 175, щонайменше 200, щонайменше 225, щонайменше 250, щонайменше 275, щонайменше 300, щонайменше 325, щонайменше 350, щонайменше 375 або щонайменше 400 мкг/мл.
Введення доз антитіл або їх фрагментів, запропонованих у винаході, можна повторювати і інтервал між їхнім введенням може становити щонайменше 1 день, 2 дні, З дні, 5 днів, 10 днів, днів, 30 днів, 45 днів, 2 місяця, 75 днів, З місяця або щонайменше 6 місяців.
Ефективне для конкретного пацієнта кількість може варіюватися залежно від таких факторів як стан, що підлягає лікуванню, загальний стан здоров'я пацієнта, шлях введення і доза, що 15 вводиться, і серйозність побічних дій (див., наприклад, Маупага та ін., А Напароок ої Зорв5 ог
Сооа Сіїпіса! Ргасіїсе, вид-во Іпіегрпагт Ргез5, Воса Наюп, Ніа.; Оєпі, Соодй І арогаїогу апа Соса
Сііпіса! Ргасіїісе, вид-во Огсп Рибі., Гопаоп, ОК, 2001).
Шлях введення може являти собою, наприклад, місцеве або шкірне нанесення, внутрішньовенну, внутрішньоочеревинну, інтрацеребральну, внутрішньом'язову, внутрішньоочну, внутрішньоартеріальну, всередину спинного мозку, всередину ушкодження ін'єкцію або інфузію, або введення за допомогою систем з уповільненим вивільненням або за допомогою імплантату (див., наприклад, 5іатап та ін., Віороїутегз 22, 1983, сс. 547-556; І апдег та ін., У. Віотей. Маїег. Кев5. 15, 1981, сс. 167-277; І апдег, Спет. Тесі. 12, 1982, сс. 98-105;
Ерзієїп та ін., Ргос. Маї). Асай. сі. ОБА 82, 1985, сс. 3688-3692; Нулапод та ін., Ргос. Маї0. Асад.
Зсі. ОБА 77, 1980, сс. 4030-4034; 05 МоМо 6350466 і 6316024). При необхідності композиція може включати також солюбілізуючий агент і місцевий анестезуючий засіб, таке як лідокаїн, для полегшення болі в області ін'єкції. Крім того, можна застосовувати також легеневе введення, наприклад, за допомогою інгалятора або розпилювача, і препаративної форми з агентом, що створює аерозоль (див., наприклад, ОЗ МоМо. 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064,
Зо 5855913, 5290540 і 4880078; і публікації РСТ УМО 92/119244, МО 97/32572, МО 97/44013, УМО 98/31346 ії УМО 99/66903, кожний з документів повністю включений у цей опис як посилання).
Композицію, запропоновану в цьому винаході, можна вводити також за допомогою одного або декількох шляхів введення з використанням одного або декількох різних методів, відомих у цій галузі. Як повинно бути очевидно фахівцеві в цій галузі, шлях і/або механізм введення повинен варіюватися залежно від необхідних результатів. Обрані шляхи введення антитіл або їх фрагментів, запропонованих у винаході, являють собою внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, внутрішньошкірний, внутрішньоочеревинний, підшкірний, спінальний або інші парентеральні шляхи введення, наприклад, за допомогою ін'єкції або інфузії. Під парентеральним введенням мають на увазі шляхи введення, відмінні від ентерального і місцевого застосування, як правило, шляхом ін'єкції, і вони включають (але не обмежуючись тільки ними) внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоартеріальну, внутрішньооболонкову, внутрішньокапсульну, внутрішньоочноямкову, внутрішньосерцеву, внутрішньошкірну, внутрішньоочеревинну, транстрахеальну, підшкірну, підкутикулярну, внутрішньосуглобну, підкапсульну, підпавутинну, інтраспинальну, епідуральну і надчеревинну ін'єкцію та інфузію. В альтернативному варіанті композицію, запропоновану у винаході, можна вводити непарентеральним шляхом, таким як місцевий, епідермальний шлях застосування або нанесення на слизову оболонку, наприклад, інтраназально, орально, вагінально, ректально, підязично або місцево. В одному з варіантів здійснення винаходу антитіла або їх фрагменти, запропоновані у винаході, вводять шляхом інфузії. В іншому варіанті здійснення винаходу мульспецифічний епітопзв'язувальний білок, запропонований у винаході, вводять підшкірно.
Якщо антитіла або їх фрагменти, запропоновані у винаході, вводять за допомогою системи з контрольованим вивільненням або вповільненим вивільненням, то для досягнення контрольованого вивільнення або вповільненого вивільнення можна застосовувати насос (див.
Іапдег, вище; зейоп, СКС Стії. Кеї Віотей. Епд. 14, 1987, с. 20; Виспулай та ін., Зигдегу 88, 1980, с. 507; Зацаек та ін., М. Епаі. У. Мей. 321, 1989, с. 574). Для досягнення контрольованого або вповільненого вивільнення терапевтичних засобів, запропонованих у винаході, можна використовувати полімерні матеріали (див., наприклад, Меаїса! Арріїсайоп5 ої Сопігоїеа
Кеїєеазе, за ред. Гапдег і М/зе, вид-во СКС Рге5., Воса Каїоп, БРіа. 1974; СопігоПей Огид
Віоамайарішу, Огид Ргодисі ЮОезідп апа Репоптапсе, за ред. Зтоїеп і ВаїЇ, вид-во УмМіеу, Мем/ 60 УогК, 1984; Каподег і Реррав, У. Масготої. 5сі. Кем. Масготої. Спет. 23, 1983, с. 61; див. також
Ї ему та ін., зсіепсе 228, 1985, с. 190; Оигіпу та ін., Апп. Меигої. 25, 1989, с. 351; Ноулага та ін., х).
Меигозигу. 71, 1989, с. 1055 005 МоМо 5679377; 5916597; 5912015; 5989463; 5128326; публікації
РСТ УМО 99/15154 і УМО 99/20253). Прикладами полімерів, що застосовуються у препаративних формах з уповільненим вивільненням є (але не обмежуючись тільки ними) полі(2- гідроксиетилметакрилат), полі(метилметакрилат), полі(акрилова кислота), співполімер етилену і вінілацетату, полі(метакрилова кислота), полігліколіди (РІС), поліангідриди, полі(М- вінілпірролідон), полі(вініловий спирт), поліакриламід, полі(етиленгліколь), полілактиди (РіА), співполімер лактиду і гліколідів (РІ. СА) і складні поліортоефіри. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу полімер, що застосовується у препаративній формі з уповільненим вивільненням, є інертним, вільним від домішок, що вилужнюються, стабільним при зберіганні, стерильним і здатним до біологічного розкладу. Систему з контрольованим або вповільненим вивільненням можна поміщати поблизу профілактичної або терапевтичної мішені, при цьому потрібна тільки частина дози, необхідної для системного введення (див., наприклад, соойзоп, в: Медісаї! Арріїсайоп5 ої СопігоПейа Кеїєазе, вище, т. 2, 1984, сс. 115-138).
Відомості про системи з контрольованим вивільненням обговорені в огляді у І апдег, 5сіепсе 249, 1990, сс. 1527-1533). Для одержання препаративних форм з уповільненим вивільненням, що містять одне або кілька антитіл або їх фрагментів, запропонованих у винаході, можна застосовувати будь-який метод, відомий фахівцеві в цій галузі (див., наприклад, О5 Мо 4526938, публікацію РСТ УМО 91/05548, публікацію РСТ УМО 96/20698, Міпод та ін., Кадіоїпегару 8. ОпсоЇоду 39, 1996, сс. 179-189, опа та ін., РОА дошгпаї! ої Рпаптасеціїса! Зсіепсе 5 ТесппоїІоду 50, 1995, сс. 372-397, Сіеек та ін., Рго. Іпг!. Зутр. Сопігої. Кеї. Віоасі. Маїег. 24, 1997, сс. 853-854іїЇ ат та ін., Ргос. ІпгІ. Зутр. Сопігої!. Кеї. Віоасі. Маїег. 24, 1997, сс. 759-760, кожна публікація повністю включена в цей опис як посилання).
Якщо антитіла або їх фрагменти, запропоновані у винаході, застосовують місцево, то їх можна приготовлювати у формі мазі, крему, трансдермального пластиру, лосьйону, гелю, шампуню, спрею, аерозолю, розчину, емульсії або іншої форми, добре відомої фахівцеві в цій галузі (див., наприклад, Кетіпдіоп'є Рпагтасецшійса! Зсіепсе5 апа Іпігодисіоп о РПагтасешіса!
Бозаде Богпт5, 19-те вид., вид-во Маск Риб. Со., Еазіоп, Ра.,1995). У випадку місцевих лікарських форм, що не розпиляються, як правило, застосовують форми від в'язких до напівтвердих або тверді форми, які містять носій або один або декілька ексципієнтів, придатних для місцевого нанесення, і які мають в деяких випадках динамічну в'язкість, ще вищу, ніж вода.
Прийнятними препаративними формами є (але не обмежуючись тільки ними) розчини, суспензії, емульсії, креми, мазі, порошки, лініменти, цілющі мазі і т.п., які при необхідності стерилізують або змішують з допоміжними агентами (наприклад, консервантами, стабілізаторами, змочувальними агентами, буферами або солями) для впливу на різні властивості, наприклад, осмотичний тиск. Іншими прийнятними місцевими лікарськими формами є аерозольні препарати, що розпорошуються, у яких діючу речовину, у деяких випадках у комбінації з твердим або рідким інертним носієм, упаковують у суміші з летучою речовиною, що перебуває під тиском (наприклад, газоподібним пропелентом, таким як фреон) або у флакон, що перебуває під тиском. У фармацевтичні композиції і лікарські форми можна додавати також при необхідності зволожувачі або змочувачі. Приклади таких додаткових інгредієнтів добре відомі в цій галузі.
Якщо композиції, що містять антитіла або їх фрагменти, вводять інтраназально, то їх можна приготовлювати у вигляді аерозолю, спрею, аерозолю, що утворює туман, або у формі крапель.
Зокрема, профілактичні або терапевтичні засоби, призначені для застосування згідно з цим винаходом, зручно застосовувати у формі аерозольного спрею, що утворюється з упаковок, що перебувають під тиском, або розпилювачів, з використанням прийнятного пропеленту (наприклад, дихлордифторметану, трихлорфторметану, дихлортетрафторетану, діоксиду вуглецю або інших прийнятних газів). У випадкуаеррозолю, що перебуває під тиском, стандартну дозу можна визначати, використовуючи клапан для введення відміряної кількості.
Капсули і картриджі (що складаються, наприклад, з желатину), призначені для застосування в інгаляторі або інсуфляторі, можна приготовлювати так, щоб вони містили порошкоподібну суміш сполуки і прийнятну порошкоподібну основу, таку як лактоза або крохмаль.
Методи спільного введення або лікування з використанням другого терапевтичного засобу, наприклад, цитокіну, стероїду, хіміотерапевтичного засобу, антибіотика або випромінювання, відомі в цій галузі (див., наприклад, боо4йтап апа Сійтапе Те РІаптасоїіодіса! Вавіб ої
Тпегарешііс5, за ред. Нагатап та ін., 10-те перероблене і доповнене вид., вид-во Меосгам/-НІЇЇ,
Мем мок, М.У., 2001; РпаптасоШегарешісв Тог Адмапсей Ргасіісе:-А Ргасіїса! Арргоасі, за ред.
Рооїе і Реїегхоп, вид-во Гірріпсой, УМіШатве 8 УМІКіп5, Рпйа., Ра., 2001; Сапсег Спетоїпегару апа 60 Віоїпегару, за ред. Спарпег і Гопдо, вид-во ІГірріпсой, УмМіПате 5 УМіІКіп5, РПйа., Ра., 2001).
Ефективна кількість терапевтичного засобу може зменшувати симптоми щонайменше на 10 95; щонайменше на 20 95; щонайменше приблизно на 30 95; щонайменше на 40 95 або щонайменше на 50 95.
Додаткові лікарські засоби (наприклад, профілактичні або терапевтичні засоби), які можна застосовувати у комбінації з антитілами або їх фрагментами, запропонованими у винаході, можна вводити з інтервалом між їхнім введенням і введенням антитіл або їх фрагментів, запропонованих у винаході, що становлять менше 5 хв, менше 30 хв, 1 год., приблизно 1 год., від приблизно 1 до приблизно 2 год., від приблизно 2 до приблизно З год., від приблизно З до приблизно 4 год., від приблизно до приблизно 5 год., від приблизно 5 до приблизно 6 год., від приблизно б до приблизно 7 я, від приблизно 7 до приблизно 8 год., від приблизно 8 до приблизно 9 год., від приблизно 9 до приблизно 10 год., від приблизно 10 до приблизно 11 год., від приблизно 11 до приблизно 12 год., від приблизно 12 до 18 год., від 18 до 24 год., від 24 до 36 год., від 36 до 48 год., від 48 до 52 год., від, 52 до 60 год., від 60 до 72 год., від 72 до 84 год., від 84 до 96 год. або від 96 до 120 ч. Пацієнта можна піддавати впливу двох або більшої кількість терапій під час одного візиту.
Антитіла або їх фрагменти, запропоновані у винаході, і інші терапевтичні засоби можна вводити циклічно. Циклічна терапія передбачає застосування першої терапії (наприклад, першого профілактичного або терапевтичного засобу) протягом деякого періоду часу, після чого застосування другої терапії (наприклад, другого профілактичного або терапевтичного засобу) протягом деякого періоду часу, необов'язково з наступним застосуванням третьої терапії (наприклад, профілактичного або терапевтичного засобу) протягом деякого періоду часу і т.д. і повторення зазначеної послідовності введення, тобто циклу, для зниження розвитку стійкості до однієї з терапій, для запобігання або зниження побічних дій однієї з терапій і/або підвищення ефективності терапій.
У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіла або їх фрагменти, запропоновані у винаході, можна приготовлювати у вигляді форм, що гарантують відповідний розподіл іп мімо.
Наприклад, гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ) не пропускає багато сполук, що мають високу гідрофільність. Для гарантії того, що сполуки, що мають терапевтичну активність, запропоновані у винаході, перетнуть ГЕБ (якщо це потрібно), їх можна включати, наприклад, у ліпосоми.
Методи приготування ліпосом описані, наприклад, в О5 МоМо 4522811; 5374548 і 5399331.
Ліпосоми можуть містити один або кілька фрагментів, які вибірково транспортуються в певні клітини або органи, що підвищує спрямоване введення лікарського засобу (див., наприклад,
Кападе, 9. Сіпе РІагтасої. 29, 1989, с. 685). Прикладами, що забезпечують спрямований перенос молекул є фолат або біотин (див., наприклад, ОБ Мо 5416016 на ім'я І ом/ зі співавторами); манозиди (Штпелама та ін., Віоспет. Віорпу5. Ке5. Соттип. 153, 1988, с. 1038); антитіла (Віоетап та ін., РЕВ5 І ей. 357, 1995, с. 140; Омаї5 та ін., Апійтісгор. Адепі5 Спегпоїпег. 39, 1995, с. 180); рецептор білка А, що має поверхневу активність (Вгієсое та ін., Ат. у.
Рпузіо!.1233, 1995, с. 134); р120 (Зспгеїег та ін., у. Віої. Спет. 269, 1994, с. 9090); (див. також К.
Кеіпапеп; М.І. СашККапеп, Рерзхіей. 346, 1994, с. 123; 9.9. Кіпоп; 1.9. РіаІег, Іттпипотеїйнодіз 4, 1994, с. 273).
У винаході запропоновані протоколи введення фармацевтичної композиції, що містить антитіла або їх фрагменти, запропоновані у винаході, індивідуально або у комбінації з іншими терапевтичними засобами, яких потребує індивідуум. Лікарські засоби (наприклад, профілактичні або терапевтичні засоби), які застосовують у комбінованих терапіях, запропонованих у цьому винаході, можна вводити індивідуумові спільно або їх можна застосовувати послідовно. Лікарські засоби (наприклад, профілактичні або терапевтичні засоби), які застосовують у комбінованих терапіях, запропонованих у цьому винаході, можна застосовувати циклічно. Циклічна терапія передбачає застосування першої терапії (наприклад, першого профілактичного або терапевтичного засобу) протягом деякого періоду часу, після чого застосування другої терапії (наприклад, другого профілактичного або терапевтичного засобу) протягом деякого періоду часу і повторення зазначеної послідовності введення, тобто циклу, для зниження розвитку стійкості до однієї з терапій (наприклад, до агента), для запобігання або зниження побічних дій однієї з терапій (наприклад, агентів) і/або підвищення ефективності терапій.
Окремі терапевтичні компоненти (наприклад, профілактичні або терапевтичні засоби) комбінованих терапій, запропонованих у винаході, можна застосовувати для обробки індивідуума спільно (конкурентно). Поняття "спільно" не обмежене застосуванням терапій (наприклад, профілактичних або терапевтичних засобів) точно в один і той же час, а ймовірніше означає, що фармацевтичну композицію, яка містить антитіла або їх фрагменти, запропоновані 60 у винаході, вводять індивідуумові в такій послідовності і з таким часовим інтервалом, що антитіла, запропоновані у винаході, можуть діяти спільно з іншою(ими) терапією(ями), що забезпечує підвищену сприятливу дію у порівнянні з варіантом, коли їх вводять якось по іншому. Наприклад, кожну терапію можна застосовувати для обробки індивідуума в один і той же час або послідовно в будь-якому порядку у різні моменти часу; однак, якщо їх не застосовують в один і той же час, їх слід застосовувати в досить близькі моменти часу, так, щоб забезпечувати необхідну терапевтичну або профілактичну дію. Кожній терапії можна піддавати індивідуума окремо, у будь-якій прийнятній формі і будь-яким прийнятним шляхом. У різних варіантах здійснення винаходу терапії (наприклад, профілактичні або терапевтичні засоби) можна вводити індивідуумові з інтервалом, що становить менше 15 хв, менше 30 хв, менше 1 год., приблизно 1 год., від приблизно 1 до приблизно 2 год., від приблизно 2 до приблизно З год., від приблизно З до приблизно 4 год., від приблизно 4 до приблизно 5 год., від приблизно 5 до приблизно 6 год., від приблизно 6 до приблизно 7 год., від приблизно 7 до приблизно 8 год., від приблизно 8 до приблизно 9 год., від приблизно 9 до приблизно 10 год., від приблизно 10 до приблизно 11 год., від приблизно 11 до приблизно 12 год., 24 год., 48 год., 72 год. або 1 тиждень. В інших варіантах здійснення винаходу пацієнта можна піддавати впливу двох або більшої кількість терапій (наприклад, профілактичних або терапевтичних засобів) під час одного візиту.
Профілактичні або терапевтичні засоби, що застосовуються у комбінованих терапіях, можна вводити індивідуумові в одній і тій же фармацевтичній композиції. В альтернативному варіанті профілактичні або терапевтичні засоби, що застосовуються у комбінованих терапіях, можна вводити індивідуумові спільно у вигляді різних фармацевтичних композицій. Профілактичні або терапевтичні засоби можна вводити індивідуумові з використанням одного і того ж або різних шляхів введення.
Повністю описаний вище винахід додатково проілюстрований у формулі винаходу, а також за допомогою наведених нижче прикладів, які служать тільки для ілюстрації винаходу і не спрямовані на його додаткове обмеження.
Приклади
Приклад 1: Методи, матеріали і скринінг антитіл (І) Клітинні лінії
Ко) Клітинні лінії ВХРО-3, 5К-ВІ-3, ВТ-474, МОА-МВ-453, Раби і МСЕ-7 одержували з АТСС і підтримували стандартним способом у ростових середовищах, доповнених 10 96 фетальною бичачою сироваткою (ЕВ5). (І) Одержання рекомбінантних векторів, що включають НЕКЗ людини, мавпи циномолгус (Супо), миші і пацюка
Позаклітинний домен мишачого НЕКЗ ампліфіціювали за допомогою ПЦР з кКДНК головного мозку мишей (фірма Сіопіесі) і послідовність підтверджували шляхом порівняння з референс- послідовністю (Кеїзед ММ 010153). ЕСО щурячого НЕКЗ одержували шляхом зворотної транскрипції з мРНК клітин лінії Каї-2 і послідовність підтверджували шляхом порівняння з
ММ 017218. КДНК-матрицю НЕКЗ мавпи циномолгус створювали, використовуючи РНК з різних тканин мавп циномолгус (фірма 7уадеп ГІ арогайюгієв5) і отриманий за допомогою ЗТ-ПЦР продукт клонували у векторі ЯСВО-ТОРО-ХІ (фірма Іпмйгодеп) перед секвенуванням обох ланцюгів.
Людський НЕКЗ одержували з бібліотеки КДНК головного мозку людського ембріона (фірма зоигсе) і послідовність підтверджували шляхом порівняння з МІМ 001982.
Для створення мічених рекомбінантних білків НЕКЗ людини, миші, пацюка і мавпи циномолгус ампліфіціювали за допомогою ПЦР з використанням Рмжо Тад-полімерази (фірма
Коспе Оіадпобіїс5). Ампліфіційовані ПЦР-продукти очищали на гелі і клонували у векторі рОопк201 (фірма Іпмігодеп), що входить в систему СагемлауФ), який попередньо модифікували так, що він включав у рамці зчитування М-кінцеву лідерну послідовність СОЗЗ ії С-кінцеву мітку, наприклад, Р АС-мітку. Мітка дозволяла здійснювати очищення мономерних білків за допомогою моноклонального антитіла до мітки. Гени-мішені фланкували АйЙВІ і АНКВ2, що дозволяло здійснювати рекомбінацію в адаптованих спеціальних запатентованих Саїеу/ау- векторах (наприклад, рсОМАЗ.1), призначених для застосування з використанням технології клонування Саїемжау?т (фірма Іпмігодеп). Реакції рекомбінації здійснювали з використанням застосовуваної в технології Саїемжау реакції з І К-клоназою (1ЖК --реакці) за допомогою запатентованих спеціальних векторів, які містили промотор СМУ, для створення експресійних векторів для мітки, хоча можна використовувати будь-який вектор, що надходить у продаж.
Крім того, одержували рекомбінантні біли НЕКЗ, у яких зливали ЕСО НЕКЗ проти ходу транскрипції відносно С-кінцевого сайту розщеплення фактора Х і шарнірної області людського дО і Ес-області, для створення білка з міченої Ес. Для цієї мети різні ЕСО НЕКЗ піддавали ПЦР- бо ампліфікації і клонували у векторі (наприклад, рсоОМАЗ.1), модифікованому таким чином, що він містив у рамці зчитування С-кінцеве злиття: сайт фактора Х-шарнір-пЕс. Створену відкриту рамку зчитування фланкували сайтами АЇЖВІ і АЧЩВ2 для подальшого клонування згідно з технологією рекомбінантного клонування Саїемжаутєю (фірма Іпмігодеп). Застосовували ІК- реакцію (заїемжау для переносу НЕКЗ-Ес у спеціальну експресійну конструкцію, що містить промотор СММУ. Створювали експресійні конструкції для НЕКЗ, що несе точкову мутацію, за допомогою стандартних протоколів сайтнаправленого мутагенезу і підтверджували послідовності отриманих векторів.
Таблиця 8
Створення експресійних векторів НЕКЗ. Нумерація амінокислот НЕКЗ відповідає МР 001973 (людський), МР. 034283 (мишачий) і МР. 058914 (щурячий) (І) Експресія рекомбінантних білків НЕКЗ
Необхідні рекомбінантні білюи НЕКЗ експресували в отриманих з НЕК293 клітинних лініях, попередньо адаптованих до культивування в суспензійній культурі і вирощували в запатентованому фірмою Момагіх безсироватковому середовищі. Для підтвердження маломасштабної експресії здійснювали аналізи короткочасної трансфекції на основі ліпофекції в б-ямкових планшетах. Для великомасштабного виробництва білка застосовували короткочасну трансфекцію в системі, заснованій на використанні 20-літрових біореакторів
УМаме "м (фірма У/аме Віоїесіп). Як носій ДНК у плазміді використовували поліетиленімін (ПЕЇ) (фірма Роїузсіепсез) у співвідношенні 1:3 (мас/мас). Супернатанти культури збирали через 7-10 днів після трансфекції і концентрували до очищення шляхом фільтрації в перехресному потоці та диафільтрації. (ІМ) Очищення міченого білка
Рекомбінантні мічені білюим НЕКЗ (наприклад, мітка-НЕКЗ) очищали, збираючи супернатант клітинної культури і 10-кратно концентруючи за допомогою фільтрації в перехресному потоці з використанням фільтра з молекулярною масою 10 кДа, що номінально відсікається (фірма
Егезепіи5). Колонку з антитілом до мітки приготовляли, зшиваючи моноклональне антитіло до мітки з активованою СМВг сефарозою 4В у кінцевому співвідношенні 10 мг антитіла на 1 мл смоли. Концентрований супернатант вносили в З35-мілілітрову колонку з антитілом до мітки зі швидкістю потоку 1-2 мл/хв. Після вихідного відмивання за допомогою ЗФР зв'язаний продукт елюювали за допомогою 100мМ гліцину (рн 2,7), нейтралізували і стерилізували фільтрацією.
Зо Концентрації білка визначали, вимірюючи абсорбцію при довжині хвилі 280 нм, і перетворювали за допомогою теоретичного коефіцієнта, рівного 0,66 АШ/мг. Очищений білок остаточно характеризували за допомогою ДСН-ПААГ, М-кінцевого секвенування і РХ-МС. (М) Очищення на основі Ес-мітки
Концентрований супернатант клітинної культури вносили в 50-мілілітрову колонку з білком
А-сефарозою типу Равзі Біом/ зі швидкістю потоку 1 мл/хв. Після вихідного відмивання за допомогою ЗФР колонку відмивали МанНегРО/30 об. 95 ізопропанолу, рН 7,3, використовуючи об'єм, рівний 10 об'ємам колонки, а потім ЗФР, використовуючи об'єм, рівний 5 об'ємам колонки.
І, нарешті, зв'язаний продукт елюювали за допомогою 50мМ цитрату/140мМмМ масі (рн 2,7),
нейтралізували і стерилізували фільтрацією. (МІ) Одержання клітинних ліній, що надекспресують
Для створення клітинної лінії з високими рівнями експресії НЕКЗ на клітинній поверхні конструювали експресійний вектор ссавців, що містить вставку, яка кодує лідерну послідовність
СО33 у зворотному напрямку відносно амінокислотних залишків 20-667 людського НЕКЗ, злиту в рамці зчитування з амінокислотними залишками 669-1210 людського ЕСЕК. При експресії в клітинах ссавців химерний білок, що утворився, містив на М-кінці позаклітинний і трансмембранний домен НЕКЗ, а на С-кінці цитоплазматичний домен ЕСЕК. Вектором НЕКЗ/1 трансфектували клітини лінії СНО-5 (фірма Іпмігодеп) і після селекції за допомогою антибіотика одержували стабільні пули. Для отриманої клітинної лінії (СНО НЕКЗ/1) характерні високі рівні експресії позаклітинного домену НЕКЗ на поверхні клітин. (МІ) Пенінг з використанням бібліотеки НиСАЇ СОЇ ОФ
Для відбору антитіл, що розпізнають людський НЕКЗ, застосовували кілька стратегій пенінгу. Терапевтичні антитіла до людського білла НЕКЗ створювали шляхом селекції клонів, що мають високу афінність зв'язування, використовуючи як джерела варіантів білків антитіл фагову дисплейну бібліотеку, що надходить у продаж (людська комбінаторна бібліотека антитіл)
НисСАГ СОГОбж (фірма Могрпобувзх). Фагмідна бібліотека заснована на концепції НиСАЇФ (КпаррікК та ін., У Мої Віої! 296, 2000, сс. 57-86) і в ній застосовують технологію Сузрізріау? для презентації Раб на поверхні фагу (М/О 01/05950 на ім'я І оппіпод).
Для виділення антитіл до НЕКЗ використовували стандартний пенінг, а також КармАТ- стратегії пенінгу, використовуючи такі підходи як твердофазний пенінг, пенінг у розчині, пенінг цілих клітин і диференційований пенінг цілих клітин. (МІ) Твердофазний пенінг
Для ідентифікації антитіл до НЕКЗ застосовували різні стратегії твердофазного пенінгу з використанням різних рекомбінантних білків НЕКЗ. Для здійснення кожного циклу твердофазного пенінгу сенсибілізували Махізогр- планшети (фірма Мипс) білюоюм НЕКЗ. Мічені білки іммобілізували з використанням планшетів, попередньо сенсибілізованих антитілом до Ес (козяче або мишаче антитіло до людського Ідс, фірма Чдаскзоп Іттипо Кезеагсі), антитілом до мітки, або за допомогою пасивної адсорбції. Сенсибілізовані планшети відмивали ЗФР і блокували. Сенсибілізовані планшети двічі відмивали ЗФР перед додаванням протягом 2 год. при кімнатній температурі на шейкері пов'язаних з фагами антитіл з бібліотеки НисСАЇ ЗО ОФ).
Зв'язані фаги елюювали, додавали до клітин Е. соїї ТИ-1 та інкубували для зараження фагом.
Потім заражені бактерії виділяли і висівали на агарові пластини. Колонії зскрібали з пластин і фаги вивільняли ("процедура порятунку") і ампліфіціювали. Кожна зі стратегій пенінгу НЕКЗ включала індивідуальні цикли пенінгу, і для неї застосовували унікальні антигени, концентрації антигенів і строгість відмивання. (ІХ) Рідкофазний пенінг
Кожний цикл рідкофазного пенінгу здійснювали з використанням різних біотинільованих рекомбінантних білків НЕКЗ і нейрегуліна 1-81 (фірма К8УО Зувзіет5) або без нього. Білки біотинілювали за допомогою набору для біотинілювання Е7-ІіпК 5ийо-МН5-Ї С (фірма Ріегсе) згідно з інструкціями виробника. 800 мкл зшитих зі стрептавідином магнітних гранул (Оупабеадв5, фірма Бупаї) відмивали однократно ЗФР і блокували протягом ночі за допомогою реагенту
Спетіріоскег (фірма СПетісоп). Пов'язані з фагами антитіла з бібліотеки НиСсСАЇ ОГО і відповідний біотинільований НЕКЗ інкубували в реакційній пробірці. Стрептавідинові магнітні гранули додавали протягом 20 хв і збирали за допомогою сепаратора магнітних частинок (фірма Бупаї). Зв'язані фаги елюювали з гранул ОСупабеад», додаючи буфер, що містить ДТТ, у кожну пробірку, і додавали в клітини Е. соїї Т2-1. Зараження фагом здійснювали аналогічно до методу, описаного для твердофазного пенінгу. Кожна зі стратегій пенінгу НЕКЗ включала індивідуальні цикли пенінгу, і для неї застосовували унікальні антигени, концентрації антигенів і строгість відмивання. (Х) Клітинний пенінг
Для клітинних пенінгів пов'язані з фагами антитіла з бібліотеки НиСАЇ СОЇ ОФ інкубували приблизно з 107 клітин на ротаційному шейкері протягом 2 год. при кімнатній температурі з наступним центрифугуванням. Клітинний дебрис ізолювали, фаги елюювали з клітин.
Супернатант збирали і додавали в культуру Е. соїї Та-1 за допомогою описаного вище процесу.
Для ідентифікації антитіл до НЕКЗ застосовували дві стратегії, засновані на застосуванні клітин: а) Пенінг цілих клітин: У цій стратегії різні інтактні клітинні лінії застосовували як антигени. б) Диференційований пенінг цілих клітин: У цій стратегії послідовно використовували антигени, що складаються з клітин і рекомбінантних білків НЕКЗ (див., наприклад, 1981.09). 60 Засновані на застосуванні клітин пенінги здійснювали відповідно до описаного вище методу,
але у випадку, коли як антигени застосовували рекомбінантні білки, використовували протоколи твердофазного пенінгу. Для відмивання застосовували ЗФР (2-3х) і РВ5Т (2-3х). (ХІ) Створення бібліотеки КармАТ "мМ і здійснення циклів пенінгу
Для підвищення афінності зв'язування антитіл зі збереженням диверсифікованості бібліотек продукти, отримані в результаті другого циклу як пенінгу в розчині, так і твердофазного пенінгу, використовували при здійсненні технології КармАТ "м (технологія "швидкого дозрівання"), у той час як для третього циклу використовували продукти, отримані у результаті пенінгу цілих клітин і диференційованого пенінгу цілих клітин (Ргаззієг та ін., Іттипоїпегару; 1, 2009, сс. 571-583).
ВармАТ М-бібліотеки створювали шляхом субклонування фагів, які містять Бар вставки, що кодують, відібраних за допомогою пенінгу, у дисплейному векторі РМОКРНФІ25 Біа І НС, і їх додатково розщеплювали для створення або бібліотек Н-СОК2 КармАТ "М, або бібліотек І-
СОВЗ КармАТтТ "М за допомогоюферментів, що забезпечують специфічну рестрикцію. Вставки заміняли з використанням касет для дозрівання ТКІМ (МмігпекКаз та ін., Мисіевїс Асід5 Кезеагсі 22, 1994, сс. 5600-5607) для Н-СОК2 або І-СОМКЗ залежно від сполуки пулу. Встановлено, що розміри бібліотек становили від 8х105 до 1х1089 клонів. Одержували комплекс КармАТ-антитіло- фаг і піддавали двом додатковим циклам пенінгу в розчині, твердофазного або клітинного пенінгу з використанням описаних вище експериментальних методів.
Приклад 2: Короткочасна експресія антитіл до НЕКЗ ІдО-типу
Адаптовані для вирощування у вигляді суспензійної культури клітини НЕК293-6Е культивували в середовищі Віоумаме20 до досягнення щільності приблизно 2х109 життєздатних клітин/мл. Клітини короткочасно трансфектували відповідною стерильною сумішшю ДНК: ПЕЇ і додатково культивували. Через 7 днів після трансфекції клітини видаляли шляхом фільтрації в перехресному потоці, використовуючи фільтри Егезепіи5 (0,2 мкм). Вільний від клітин продукт концентрували за допомогою фільтрації в перехресному потоці з використанням фільтра з молекулярною масою 10 кДа, що номінально відсікається (фірма Егезепій5), і концентрат стерилізували фільтрацією через ЗіегісирФ-фільтр (0,22 мкм). Стерильний супернатант зберігали при 4 "С.
Приклад 3: Очищення антитіла до НЕКЗ ІдО-типу
Очищення дО здійснювали з використанням повітряної хроматографічної системи АКТА
Зо 100, що застосовується для дослідницьких цілей, при 6 "С у приміщенні з охолодженням, використовуючи самонабивну колонку ХК16/20 з 25 мл смоли 5еї-РаскФ Мабзеїесї ЗикКе (усі фірми СЕ НеаїНсаге). У всіх випадках швидкість потоку становила 3,5 мл/хв за виключення стадії завантаження, тиск був обмежений величиною 5 бар. Колонку врівноважували ЗФР, використовуючи об'єм, рівний трьом об'ємам колонки, перед завантаженням профільтрованого супернатанту після ферментації зі швидкістю 2,0 мл/хв. Колонку промивали ЗФР, використовуючи об'єм, рівний 8 об'ємам колонки. Ї00 елюювали за допомогою градієнта рн, використовуючи як вихідну суміш 50мММ цитрат//ОмМмМ масі (рн 4,5), лінійно його знижуючи з використанням 12 об'ємів колонки до 50мМ цитрат//0мМ Масі (рн 2,5), після чого здійснювали постійну стадію обробки буфером з використанням 2 об'ємів колонки при такому ж значенні рн 2,5. Фракції, що містять до, поєднували, відразу ж нейтралізували і стерилізували фільтрацією (Мійроге е(егійїр, 0,22 мкм). Вимірювали ОП?гво і розраховували концентрацію білка на основі даних про послідовність. Пули тестували окремо відносно агрегації (ЗЕС-МАЇГ 5 (гель-фільтрація - багатокутне лазерне світлорозсіювання) і чистоти (ДСН-ПААГ і МО).
Приклад 4: Експресія і очищення антитіл НиСсСАГ 2-РаБб в Е. соїї
Експресію Рар-фрагментів, що кодуються рМоОКкРНЯЕХО Бар МН в о То-1-клітинах, здійснювали в культурах, що струшуються, з використанням 500 мл середовища 2хХУТ, доповненого 34 мкг/мл хлорамфеніколу. Культури струшували при 30 "С до досягнення ОПвоо нм, рівної 0,5. Експресію індукували додаванням 0,75мМ ІПТГ (ізопропіл-В-ЮО-тіогалактопіранозид) протягом 20 год. при 30 "С. Клітини руйнували лізоцимом. Мічені Нізє Гар-фрагменти виділяли за допомогою ІМАС (афінна хроматографія з іммобілізованим металом) (фірма Віо-Над).
Здійснювали обмін буфера на їх ЗФР Дульбекко (рН 7,2), використовуючи колонки РО10.
Зразки стерилізували фільтрацією (0,2 мкм). Концентрації білків визначали за допомогою УФ- спектрофотометрії. Чистоту зразків аналізували за допомогою 15 96 ДСН-ПААГ у денатуруючих відновдлювальних умовах. Гомогенність препаратів Гар визначали в необробленому стані за допомогою гель-фільтрації (НР-5ЕС) з використанням каліброваних стандартів.
Приклад 5: Вимірювання афінності (Ко) антитіл до НЕКЗ методом титрування врівноваженого розчину (ЗЕТ)
Визначення афінності в розчині здійснювали, у цілому, згідно з методом, описаним у літературі (Егідчцеї та ін., у Іттипо!ї Меїтоаз 77, 1985, сс. 305-319). Для підвищення чутливості і бо точності методу ЗЕТ цей метод змінювали, використовуючи замість класичного ЕГІ5ЗА-аналізу технологію, засновану на застосуванні електрохемілюмінісценції (ЕСІ) (Наеєпеї! та ін., Апаї
Біоспет 339, 2005, сс. 182-184).
Для визначення афінності за допомогою 5ЕТ застосовували описані раніше конструкції немічений НЕКЗ-мітка (людський, щурячий, мишачий або мавпи циномолгус).
Дані оцінювали за допомогою програми ХІїйї (фірма ІЮ Вивзіпе55 ЗоІшіоп5), застосовуючи загальноприйняті моделі підбору. Для визначення величини Ко для кожного до застосовували наступну модель (модифіковану згідно з методом, описаним у Ріепіег зі співавторами (Ріепіег та ін., У Іттипої! Меїпоаз 201, 1997, сс. 189-206). 2 хІяс| КУ, Їх вс Кк; «Іво о 2Вих | Івсі 2 4 "7 Гвс| 2 з|/ес
По): загальна концентрація Ідс, що застосовується, х: загальна концентрація розчинного антигену (сайти зв'язування), що застосовується,
Втах: максимальний сигнал дос без антигену,
Ко: афінність.
Приклад 6: Визначення зв'язування антитіла з клітинами за допомогою ЕАС5
Зв'язування антитіл з ендогенним людським антигеном, що експресується на людських ракових клітинах, оцінювали за допомогою ЕАС5. Для визначення значень ЕСбо для антитіл 5К-
Ві-З-клітини збирали з використанням акутази і розводили до концентрації 1х105 клітин/мл в
ЕАС5-буфері (ЗФР/З 95 ЕВ5/0,2 95 МамМз). Додавали по 1х105 клітин у кожну лунку 96-ямкового планшета (фірма Мипс) і центрифугували при 210 х д протягом 5 хв при 4 "С перед видаленням супернатанту. До пелетованих клітин додавали серійні розведення антитіл, що тестуються (фактор розведення 1:4 в РАС5-буфері) і інкубували протягом 1 год. на льоду. Клітини відмивали і пелетували тричі, використовуючи по 100 мкл ГАС5-буфера. У клітини додавали кон'югований з РЕ (фосфатидилетаноламін) козячий антилюдський ІдсС (фірма Часкзоп
ІтітипоКезеагсії), розведений у співвідношенні 1/200 РАС5-буфером, і інкубували на льоду протягом 1 год. Здійснювали додаткові стадії відмивання, використовуючи тричі 100 мкл ЕАС5- буфера з наступними стадіями центрифугування при 210 х д протягом 5 хв при 4 "С. І, нарешті, клітини ресуспендували в 200 мкл ЕБАС5-буфера і рівні флуоресценції вимірювали за
Зо допомогою пристрою РАСЗАтау (фірма ВО Віозсіепсе5). Кількість пов'язаного з клітинною поверхнею антитіла до НЕКЗ визначали, вимірюючи середній рівень флуоресценції в каналі.
Приклад 7: Зв'язування домена і мутанта НЕКЗ 9б-ямкові Махізогр- планшети (фірма Мипс) сенсибілізували протягом ночі при 4 "С з використанням 200 нг відповідного рекомбінантного людського білка (НЕНЗ-мітка, О2-мітка, 02- мітка, 04-мітка, О4-мітка, НЕКЗ К267А-мітка, НЕКЗ І 268А-мітка, НЕКЗ К267А/ 2684А і мічений контроль невідповідного ізотипу). Потім усі лунки відмивали тричі ЗФР/О,1 95 Твін-20, блокували протягом 1 год. за допомогою ЗФР/1 95 БСА/О,1 95 Твін-20 і відмивали тричі ЗФР/О,1 95 Твін-20.
Додавали антитіла до НЕКЗ у необхідні лунки аж до кінцевої концентрації 10 мкг/мл і інкубували при кімнатній температурі протягом 2 год. Планшети відмивали тричі ЗФР/ 0,1 95 Твін-20 перед додаванням відповідного зв'язаного з пероксидазою ідентифікуючого антитіла, розведеного у співвідношенні 1/10000 у ЗФР/1 95 БСА/О,1 95 Твін-20. Застосовувані ідентифікуючі антитіла являли собою козяче антимишаче (фірма Ріегсе, Мо 31432), кроляче антикозяче (фірма Ріегсе,
Мо 31402) і козяче антилюдське антитіло (фірма Ріегсе, Мо 31412). Планшети інкубували при кімнатній температурі протягом 1 год. перед трикратним відмиванням ЗФР/О,1 95 Твін-20.
Додавали в усі лунки по 100 мкл розчину субстрату ТМВ (3,3", 5,5'-тетраметилбензідин) (фірма
Віогх) протягом 6 хв, після чого реакцію припиняли, додаючи 50 мкл 2,5 95 Н25Ох. Ступінь зв'язування антитіла до НЕКЗ з кожним рекомбінантним білком оцінювали за ОПаво за допомогою планшет-рідера бресігаМах (фірма Моїесшаг Оемісе5). При необхідності криві дозової залежності аналізували за допомогою програми сСгарпрай Ргізт.
Приклад 8: Епітопне картирування НЕКЗ за допомогою мас-спектрометричного визначення обміну водню на дейтерій
Матеріали ргО-буфер одержували шляхом розчинення 25мМ ТВ5 (буферний розчин триетаноламіну) (рн 7,5уУ500мМ Масі у важкій воді (фірма бідта). Відновлювальний розчин являв собою 50ММ форміатний буфер (рН 4), доповнений 500мМ ТСЕР, і розчин для припинення реакції являв собою 0,5 об. 95 трифтороцтової кислоти (ТФК) у воді. Буфер А включав 0,25 95 мурашиної кислоти/10 96 метанолу/10 95 етиленгліколю у воді, а буфер Б включав 0,25 95 мурашиної кислоти в ацетонітрилі. Усі хімічні сполуки одержували від фірми бідта, у розчинники, що мають чистоту, придатну для РХВР, одержували від фірми Різпег зсіепійіс.
Маніпуляції з рідинами і хроматографія
Експерименти з використанням автоматичного мас-спектрометричного визначення обміну водню на дейтерій (НОХ М5) розробляли на основі методів і устаткування, які описані у УмаЇе5 та ін., Апа). Спет. 78, 2006, сс. 1005-1014). У цілому, при проведенні всіх операцій, пов'язаних з роботою з рідинами, використовували маніпулятор для роботи з рідинами типу Раї НТЗ (фірма
ГЕАР Тесппоіодіез), поміщений корпус, що охолоджується, у якому підтримували температуру на рівні 220. На корпусі маніпулятора для роботи з рідинами були змонтовані клапан з 6 ін'єкційними портами і промивальна станція, що полегшують здійснення ін'єкції зразків у хроматографічну систему і відмивання шприців. Хроматографічна система включала додатковий клапан з 10 портами, Рого52утеФф-колонку (2,1 мм х 30 мм) (картридж Рого5Ф з іммобілізованим пепсином) (фірма Арріїейд Віозузіетв5), картридж Сар Тгар для хроматографії зі зверненою фазою, 0,5 мм х 2 мм (фірма Міспгот Віогезоцгсеб5) і самонабивний еміттер електроспрею як аналітичну колонку (100 мкм х -60 мм, КіпеїФех 2,6 мкм С18, фірма
Рпепотепех). Голівку клапана з 10 портами, сорбційний картридж і аналітичну колонку поміщали в окремий кожух, зроблений з алюмінію, і підтримували температуру на рівні -59С за допомогою пакетів термоелектричних елементів Пельтьє. Клапани і колонки розташовували таким чином, щоб можна було здійснювати послідовно розщеплення білків, знесолення пептидів і хроматографію зі зверненою фазою до внесення зразка в джерело іонізації в електроспреї (Е5І) мас-спектрометра (типу СТО-Огріїгар, фірма Тпегпто зсієепійіс).
Потоки рідини, необхідні для роботи, забезпечували за допомогою двох окремих насосів для
РХВР. Перший насос для РХВР (насос Зигмеуог М5, фірма Тпегто 5сіепіййс) подавав буфер А з постійною швидкістю 125 мкл/хв і його використовували для переносу зразка через картридж з іммобілізованим пепсином на сорбційний картридж зі зверненою фазою, встановлений за клапаном з 10 портами. Після здійснення завантаження і знесолення клапан з 10 портами
Зо перемикали для елюції зразка за допомогою градієнтного насоса (типу АЛОШІТМ ОРІ С, фірма
Умаїег5) з сорбційного картриджа зі зверненою фазою через аналітичну колонку у джерело іонів мас-спектрометра. Картридж з іммобілізованим ферментом видаляли після виснаження в процесі градієнтной елюції. Градієнтний насос створював ділянки лінійного градієнта від 0 до 40 95 рухливої фази Б протягом 35 хв при швидкості 5 мкл/хв і від 40 до 95 95 рухливої фази Б при швидкості 5 мкл/хв протягом 10 хв. Градієнтний потік, що виходить з насоса, розділяли в клапані з 10 портами з використанням пасивного дільника (спліттера) таким чином, щоб фактичний потік через сорбційний картридж і аналітичну колонку при градієнтній елюції становив «1 мкл/хв. Увесь хроматографічний цикл займав 70 хв, включаючи стадії відмивання і зрівноважування.
Мас-спектрометрія
Для ідентифікації протеолітичних фрагментів, отриманих шляхом здійснюваного в режимі онлайн (у ході експерименту) розщеплення, проводили декілька залежних від даних МС/МС- експериментів. Для збору цих даних здійснювали реєстрацію тандемних МеС-спектрів за допомогою аналізатора ТО гібридного мас-спектрометра ГТО-Огбйгар. Попередній поділ мас здійснювали на основі результатів МО-сканувань, які реєстрували за допомогою аналізатора
Огріїгар. Збір даних після проведення однієї МОС-стадії для визначення рівнів дейтерування, здійснювали при розширенні 60000 за допомогою аналізатора Огбріїгар (у діапазоні величин Іп/7 400-2000).
Приготування зразків білків і комплексів білок:Рар
Зразки білка НЕКЗ приготовляли, розчиняючи 50 мкг пов'язаного з міткою НЕКЗ (НЕКЗ- мітка) в 25мМ ТВ5 (рН 7,53/500мМ Масі, з одержанням кінцевого об'єму 50 мкл. Для приготування комплексів білок"бар змішували 50 мкг НЕКЗ-мітка в молярному співвідношенні 171 з досліджуваним Раб. Потім суміші білок"'бар розводили до кінцевого об'єму 50 мкл 25мММ твб (рн 7,5уУ500мМ Масі.
Після одержання комплексів білок:Раб їх витримували щонайменше протягом 2 год. при 496.
Перед початком кожного експерименту чотири 9б-ямкових планшета, що містять зразок, розріджувач, агент для припинення реакції і відновлювальні розчини вносили в пристрій для роботи з рідинами. В експериментах з обміну 50 мкл НЕКЗ або комплексу НЕКЗ:Рар розводили 150 мкл О2О-буфера. Суміш відновлювали, додаючи 200 мкл відновлювального буфера за 1 хв бо до припинення реакції, яку зупиняли за допомогою 600 мкл буфера для припинення реакції.
Загальний об'єм після всіх стадій роботи з рідинами становив «1 мл. Після змішання розчин для припинення реакції ін'єкіювали в хроматографічну систему, за допомогою якої його автоматично розщеплювали, розділяли і аналізували методом РХ-МС. Розраховували середню зміну дейтаризації між зразком і контролем у вигляді відмінності між рівнями поглинання дейтерію зразком і контролем.
Обробка результатів
Файли неопрацьованих даних (КАМУ-файли), отримані за допомогою Огбіїгар, перетворювали у файли т2ХМіІ за допомогою розробленої для цієї мети на фірмі програми (Кам/Хігас). Потім зібрані результати тандемної МО аналізували за допомогою ЗЕОШЕ5Т (фірма Уаїез Гар, Зсгірр5 Кезеагсп Іпзійше, Ла-Джолла, Каліфорнія) і результати дослідження піддавали автоматичній фільтрації за допомогою програми ЮТАзеїесі 2.0 (фірма Маїез І аб, зсгірр5 Кезеагсп Іпзійше, Ла-Джолла, Каліфорнія). З використанням результатів ідентифікації пептидних послідовностей застосовували розроблену на фірмі програму для автоматичного виділення одноїонних хроматограм для кожної ідентифікованої послідовності і створення усереднених спектрів в області хроматографічного піка. Усереднені спектри згладжували і центрували. Рівень поглинання дейтерію оцінювали за різницею між масою, що відповідає дейтерированному зразку, і масою, що відповідає недейтерованому еталону. Оброблені дані валідували вручну і коректували для виправлення неточностей і помилок, обумовлених автоматизованими стадіями обробки. Кожному залишку в білковій послідовності приписували рівні поглинання дейтерію шляхом делокалізації вмісту дейтерію по довжині кожного пептиду (тобто шляхом розподілу виявленого рівня дейтеризації на кількість амінокислот у пептиді). У тому випадку, коли залишок входив в (перекривався) більш ніж в один пептид, робили усереднення стандартизованих рівнів поглинання дейтерію усіма пептидами, що перекривають цей залишок.
Приклад 9: Визначення кристалічної структури комплексів люодський НЕКЗ/МОКО9823 Раб і людський НЕКЗ/МОКО9825 Раб за допомогою рентгенівської кристалографії
У цьому прикладі описані кристалічні структури комплексів, що включають повнорозмірний
НЕКЗ, пов'язаний з Рар-фрагментом МОКО9823 і з Рар-фрагментом МОКО9825, отримані з дозволом 3,2А і 3,4 А відповідно. Мічений людський НЕБЗ додатково очищали на колонці
Зо Нісоайа 26/60 Супердекс 200 РгероОгаде (фірма СЕ Неайсаге), урівноваженої в ЗФР (рН 7,3).
Еаб-фрагменти МОНО9823 і МОНО9825, що були експресовані в Е. Соїї, виділяли шляхом лізису клітин за допомогою лізоциму і мічені Нізв6 Рар-фрагменти іммобілізували на колонці НізТгар. НР (фірма СЕ Неайсаге). Рар-фрагменти МОКО9823 додатково очищали шляхом гель-фільтрації з використанням колонки Супердекс 75 16/60 (фірма СЕ Неайвсаге), урівноваженої 25мМ Трис (рН 7,5), 150мм Масі.
Комплекси НЕКЗ-Рар одержували, змішуючи надлишок Раб з міченим НЕКЗ у молярному співвідношенні 1,3-1,8:1 (концентрацію визначали за абсорбцією при 280 нм, використовуючи розраховані коефіцієнти екстинкції що становлять 0,9 і 1,44 (мг/мл)у'см'" для НЕРЗ і Рар відповідно) і здійснюючи очищення комплексів на колонці Супердекс 200 10/300 (фірма СЕ
Неаїсаге), урівноваженій 25мМ Трис (рН 7,5), 150мМ. Пікові фракції аналізували за допомогою
ДСН-ПААГ і РХ-МС. Для кожного комплексу фракції, що містять і НЕКЗ, і баб приблизно в еквімолярному співвідношенні, поєднували і концентрували. Кристали НЕКЗ/МОКО9823 вирощували при 293К методом сидячої краплі шляхом дифузії пар з крапель, що містять 150 нл комплексу НЕКЗ/ МОКОЗ9823, і 150 нл розчину в резервуарі (100мМ цитрат натрію, рН 5,6, 20 Фо
ПЕГ 4000 ї 20 95 ізопропанолу). Кристали переносили в розчин у резервуарі, що містить додатково 8 95 гліцерину, і швидко прохолоджували в рідкому азоті. Кристали НЕНЗ/МОНОЗВ25 вирощували при 293К методом сидячої краплі шляхом дифузії пар з крапель, що містять 150 нл комплексу НЕКЗ/МОКОЗ9825, і 150 нл розчину в резервуарі (100мМ біс-Трис, рН 6,5, 16 95 ПЕГ 10000). Кристали переносили в 100мМ біс-Трис, рН 6,5, 18 95 ПЕГ 10000 ії 22 95 гліцерину і швидко прохолоджували в рідкому азоті.
Дані збирали на осі пучка 17-ІО удосконаленого рентгенівського джерела фотонів (Адмапсей
Рпоїоп Боигсе) (фірма Агдоппе Маїйопа! Гарогаїогу). Дані, виміряні для комплексу НЕКЗ/Рар
МОВО9823, обробляли і одержували структуру з дозволом 3,2А з використанням НКІ 2000 (фірма НКІ. Кезеагсп Іпс) у просторовій групі І222 з розмірами гнізда а-124,16, р-139,44, с-180,25 А при високому рівні статистичної вірогідності. Структуру НЕБЗ/Бар. МОРБО9823 визначали методом молекулярного заміщення за допомогою програми РІазег (Месоу та ін., 9.
Аррі. Сгуві. 40, 2007, сс. 658-674) з використанням Рар-фрагментів і опублікованої структури
ЕСО НЕКЗ 1тбрБб як пошукових моделей. Кінцеву модель, яка містила 1 молекулу комплексу
НЕКЗ/РГар МОКО9823 на асиметричну одиницю, будували за допомогою програми СООТ 60 (СтувіаІІоагарпіс ОБіесі-огіепівй Ток (набір "інструментів", призначених для роботи з кристалографічними об'єктами), ЕптеІеу і Соулап, Асіа Сгубі. 60, 2004, сс. 2126-2132) і уточнювали до величин К і Нгее, щО становлять 19,0 і 24,5 95 відповідно при величинах гтз5а, що становлять 0,010 А і 1,377 для довжин зв'язків і кутів зв'язків відповідно, за допомогою програми
ВиИ5ТЕК (фірма сСіоба! Ріахзтіпо, ГТО). Залишки НЕКЗ, які містили атоми, що перебувають на відстані в межах до 5А від кожного з атомів Еаб МОРБО9823 за результатами ідентифікації за допомогою програми РУМОЇ|. (Зспгбаїподег, ГІ С), наведено в таблицях 11 і 12. Дані, виміряні для комплексу НЕКЗ/Еар МОБ09825, обробляли і одержували структуру з дозволом 3,4А за допомогою програми ашоРКОС (фірма СіІобра! Рпазіпду, СТО) у просторовій групі 1222 з розмірами гнізда а-124,23, р-140,94, с-180,25 А при високому рівні статистичної вірогідності.
Структуру НЕКЗ/БГар МОКОЗ9825 визначали методом молекулярного заміщення за допомогою програми Ріазег (МесСоу та ін., У. Аррі. Сгуві. 40, 2007, сс. 658-674) з використанням структури
НЕКЗ/Рар МОКО9823 як пошукової моделі. Кінцеву модель, яка містила 1 молекулу комплексу
НЕКЗ/Ргар МОКО9825 на асиметричну одиницю, будували за допомогою програми СООТ (ЕтвіІеу і Соулап, Асіа Стгувзі. 60, 2004, сс. 2126-2132) і уточнювали до величин К і Вкгеєе, ЩО становили 18,8 і 24,9 95 відповідно при величинах пт5а, що становили 0,009 А їі 1,212 для довжин зв'язків і кутів зв'язків відповідно, з використанням програми ВОЗТЕК (фірма сСіобаї!
Рпавзіпо, ІТ). Залишки НЕРЗ, які містили атоми, що перебувають на відстані в межах до 5А від кожного з атомів бар МОКО9825 за результатами ідентифікації за допомогою програми РУМОГ. (Зспгбаїпдег, ГІ. С), наведено в таблицях 13 і 14.
Приклад 10: Аналізи фосфо-НЕКЗ іп міїго у клітинах
Клітини лінії МСЕ-7 підтримували стандартним методом у середовищі ОМЕМ/Е12, 15ММ
НЕРЕХ, І -глутамін, 10 95 ЕС5, а клітини лінії 5К-ВІ-3 у середовищі МакКоя 5а, 10 95 ЕС5, 1,5мММ
І-глутамін. Вирощені в повному середовищі до субконфлюентності клітини МСЕ7 або ЗК-Вг-3 збирали з використанням акутази (фірма РАА І аброгаїйогіех) і ресуспендували у відповідному середовищі для росту в кінцевій концентрації 5х105 клітин/мл. Потім по 100 мкл суспензії клітин додавали в кожну лунку 96-ямкового плоскодонного планшета (фірма Мипс) з одержанням кінцевої щільності 5х107 клітин/лунку. МСЕ7-клітин давали прикріпитися протягом приблизно З год., після чого середовище заміняли на мінімальне середовище, що містить 0,5 96 ЕВ5. Потім усі планшети інкубували протягом ночі при 37 "С, після чого обробляли взятими в необхідній
Зо концентрації антитілами до НЕКЗ (розведеними у відповідних середовищах) протягом 80 хв при 37 "Сб. МСЕ7-клітини обробляли 50 нг/мл нейрегуліну!-В1, що містить домен ЕСЕ (фірма КО зузіет5), протягом останніх 20 хв для стимуляції фосфорилювання НЕКЗ. Усі середовища обережно аспірирували і клітини промивали охолодженим на льоду ЗФР, який містив 1мМ Сасіг і 0,5мММ МасСі» (фірма сірсо). Клітини лізували, додаючи 50 мкл охолодженого на льоду лізуючого буфера (20мМ Трис (рН 8,0/137мМ Масі/10 95 гліцерину/ 2иМ ЕДТК/1 925 МР-40/1 мМ ортованадат натрію/апротінин (10 мкг/мл)/ лейпептин (10 мкг/мл)), і інкубували на льоду при струшуванні протягом 30 хв. Потім лізати збирали і центрифугували при 1800 д протягом 15 хв при 4"С для видалення клітинного дебрису. У попередньо підготовлений планшет для іммобілізації додавали по 20 мкл лізату.
Для створенні планшетів для іммобілізації НЕКЗ використовували планшет з вуглецевого волокна (фірма Мезхозсаїе Різсомегу), сенсибілізований протягом ночі при 4 "С 20 мкл (4 мкг/мл) іммобілізованим антитілом МАВ3481 (фірма КУО Зувзієт5), яке розводили в ЗФР і потім блокували за допомогою 395 бичачого сироваткового альбуміну в їх Трис-буфері (фірма
Мезозсаїе Оівсомегу)/0,1 96 Твін-20. НЕКЗ іммобілізували з лізату, інкубуючи планшет при кімнатній температурі протягом 1 год. при струшуванні, після чого лізат аспірирували і лунки відмивали їх Трис-буфером (фірма МезозсаїІе Оівзсомегу)/0,1 95 Твін-20. Фосфорильований
НЕКЗ виявляли, використовуючи 0,75 мкг/мл біотинільованого антитіла до фосфотирозину (фірма КО Бувхіетв5), приготовленого в 1 95 БСА/1х Трис/0,1 95 Твін-20, шляхом інкубації при струшуванні при кімнатній температурі протягом 1 год. Лунки відмивали 4 рази за допомогою 1х
Трис/0,1 95 Твін-20 і біотинільовані білюи виявляли шляхом інкубації з міченим 5-міткою стрептавідином (фірма Мезозсаіе Оізсомегу), розведеним в 1 95 БСАЛ хТрис/0,1 95 Твін-20, протягом 1 год. при кімнатній температурі. Вміст кожної лунки аспірирували і відмивали 4 рази
ТІхТрис/0,1 956 Твін-20 перед додаванням 20 мкл Т-буфера для зчитування з сурфактантом (фірма Мезозсаїе Різсомегу) і кількісно оцінювали сигнали за допомогою пристрою Мезозсаїе зесіог Ітадег. Антитіла МОКО6391 або МОКОЗ3207 включали в експерименти по оцінці передачі сигналу як контролі ізотипів.
Приклад 11: Аналізи фосфо-АКІ (5473) іп міїго у клітинах
Вирощені в повному середовищі до субконфлюентності клітини ліній ЗК-ВІ-3 і ВТ-474 збирали з використанням акутази (фірма РАА І арогайогіе5) і ресуспендували у відповідному бо середовищі для росту в кінцевій концентрація 5х105 клітин/мл. Потім по 100 мкл суспензії клітин додавали в кожну лунку 96-ямкового плоскодонного планшета (фірма Мипс) з одержанням кінцевої щільності 5х107 клітин/лунку. Потім усі планшети інкубували протягом ночі при 37 "С, після чого обробляли взятими у необхідній концентрації антитілами до НЕКЗ (розведеними у відповідних середовищах) протягом 80 хв при 37 "С. Усі середовища обережно аспірирували і клітини промивали охолодженим на льоду ЗФР, який містив 1мМ Сасі» і 0,5мМ Маосіг (фірма сірсо). Клітини лізували, додаючи 50 мкл охолодженого на льоду лізуючого буфера (20мМ Трис (рН 8,0/137мМ Масі/10 95 гліцерину/2ММ ЕДТКЛ 95 МР-40/1мММ ортованадат натрію/апротінин (10 мкг/мл)/лейпептин (10 мкг/мл)), і інкубували на льоду при струшуванні протягом 30 хв. Потім лізати збирали і центрифугували при 1800 д протягом 15 хв при 4 "С для видалення клітинного дебрису. По 20 мкл лізату додавали в багатоточковий 384-ямковий планшет з вуглецевого матеріалу, призначений для оцінки фосфо-АКІ (фірма МезозсаІе Оібсомегу), який попередньо блокували З 95 БСА/їх Трис/0,1 95 Твін-20. Планшет інкубували при кімнатній температурі протягом 2 год. при струшуванні, після чого лізат аспірирували і лунки відмивали 4 рази їх
Трис-буфером (фірма МезозсаЇІе Оізсомегу)/ 0,195 Твін-20. Фосфорильовану АК виявляли, використовуючи 20 мкл антитіла до фосфо-АКІ (5473) (фірма МезозсаІе Оізсомегу), яке несе сульфо-мітку, розведеного у 50 разів в 1 95 БСА/І хТрис/0,1 95 Твін-20, здійснюючи інкубацію при струшуванні при кімнатній температурі протягом 2 год. Лунки відмивали 4 рази ІхТрис/0,1 95
Твін-20 перед додаванням 20 мкл Т-буфера для зчитування з сурфактантом (фірма Мезозсаїе
Оібсомегу) і кількісно оцінювали сигнали за допомогою пристрою МезозсаІе Зесіог Ітадег.
Антитіла МОКО6391 або МОКО3207 включали в експерименти по оцінці передачі сигналу як контролі ізотипів.
Приклад 12: Аналізи проліферації клітинних ліній
Клітини лінії 5К-ВІ-3 культивували стандартним методом у модифікованому середовищі
МакКоя 5А, доповненому 1095 фетальної телячої сироватки, а клітини лінії ВтТ-474 культивували в середовищі ОМЕМ, доповненому 10 95 ЕВ5. Субконфлюентні клітини обробляли трипсином, відмивали ЗФР, розводили до 5х107 клітин/мл середовищами для росту і висівали в 9б-ямковий чорний планшет з прозорим дном (Совзіаг 3904) зі щільністю 5000 клітин/лунку.
Клітини інкубували протягом ночі при 37 "С, після чого додавали взяте в необхідній концентрації антитіло до НЕКЗ (як правило, кінцеві концентрації становили 10 або 1 мкг/мл). Планшети
Зо повертали в інкубатор, де витримували протягом 6 днів перед оцінкою життєздатності клітин за допомогою набору СеїТйетг-Ссіо (фірма Рготеда). Додавали по 100 мкл розчину СеїїТПетг-Сіо у кожну лунку і інкубували при кімнатній температурі при обережному струшуванні протягом 10 хв. Рівень люмінісценції визначали за допомогою планшет-рідера 5ресігаМах (фірма МоїІесшіаг
Ремісев5). Ступінь інгібування росту при застосуванні кожного антитіла розраховували шляхом порівняння рівнів люмінісценції, отриманих при використанні кожного антитіла до НЕКЗ, з рівнями, отриманими при використанні стандартного ізотипу контрольного антитіла, що застосовується для контролю (МОКОб391).
Для аналізів проліферації МСЕ-7 культивували стандартним методом у середовищі
ОМЕМ/Е12 (1:71), що містить 4мММ І-глутамін/и 5мМ НЕРЕ5/10 95 ЕВ5. Субконфлюентні клітини обробляли трипсином, відмивали ЗФР, розводили до 1х107 клітин/мл сумішшю середовищ
ОМЕМ/Е12 (1:11), що містить 4мМ І-глутамін/ 15мМ НЕРЕ5/10 мкг/мл людського трансферину/0,2 96 БСА. Клітини висівали в 9б-ямковий чорний планшет з прозорим дном (Созіаг) зі щільністю 5000 клітин/лунку. Потім додавали взяте в необхідній концентрації антитіло до НЕКЗ (як правило, кінцеві концентрації становили 10 або 1 мкг/мл) У відповідні лунки додавали також для стимуляції росту 10 нг/мл МКО1-В1, що містить ЕСЕ-домен, фірма (КО
Зузіет5). Планшети повертали в інкубатор, де витримували протягом б днів перед оцінкою життєздатності клітин за допомогою набору СеїїПнег-сіІо (фірма Рготеда). Ступінь інгібування росту при застосуванні кожного антитіла розраховували шляхом вирахування фонових рівнів люмінісценції (без нейрегуліну) і порівняння рівнів, отриманих при використанні кожного антитіла до НЕКЗ, з рівнями, отриманими при використанні стандартного ізотипу контрольного антитіла, що застосовується для контролю (МОКОб391).
Приклад 13: Клітинні аналізи блокування ліганда
Клітини лінії МСЕ-7, які культивували в середовищі МЕМ, доповненому 10 95 ЕВЗ5 і 1 мкг/мл інсуліну (фірма Зідта), змивали і збирали в невеликому об'ємі буфера для клітинної дисоціації
ЕАСЗтах (фірма Сепіапії5), після чого додавали 5 мл ЕАС5З-буфера (ЗФР/ 95 ЕВ5/0,1 95 азиду натрію). Визначали щільність клітин і доводили до кінцевої концентрації 1х106 клітин/мл.
Додавали по 100 мкл клітинної суспензії в кожну лунку 96-ямкового планшета і клітини пелетували центрифугуванням (220 9, З хв, 4 "С). Клітинний дебрис ресуспендували в 100 мкл відповідних антитіл, що тестуються, розведених в БАС5-буфері (як правило, кінцеві бо концентрації антитіл становили від 100 до 0, 1нМ), і планшет інкубували на льоду протягом 45 хв. Антитіло МАВЗ481, що блокує ліганд (фірма К8О бЗузіетв5), включали в долід як позитивний контроль. Клітини відмивали двічі буфером для фарбування, після чого додавали ТОнМ МКО1-
В1, що містить ЕСЕ-домен (фірма КУО бувзіетв5), розведений в РАСЗ-буфері, і інкубували на льоду протягом 45 хв. Клітини відмивали двічі буфером для фарбування і зв'язаний нейрегулін виявляли шляхом інкубації клітин з ТОНМ антитілом до ЕСЕ-домену людського МКС1-В1 (фірма
КУО Бузіетв5), на льоду протягом 45 хв. Клітини відмивали двічі буфером для фарбування і інкубували на льоду протягом 45 хв зі зв'язаним з РЕ-антикозячим антитілом (фірма Часкзоп
ІтітипоКезеагсі), розведеним у співвідношенні 1/500 РАС5З-буфером. Потім клітини пелетували шляхом центрифугування і дебрис ресуспендували в 200 мкл ЕАС5-буфера. Для кількісної оцінки кожного зразка по 10000 живих клітин оцінювали за допомогою проточного цитометра ЗК І (фірма ВО Віозсіепсе5) і кількість зв'язаного з клітинною поверхнею нейрегуліна визначали, вимірюючи середній рівень флуоресценції в каналі.
Приклад 14: Біохімічний аналіз блокування ліганда
Цей метод включає використання біосенсора (Віасоге"М. СЕ НеаїйнНсаге, Уппсала, Швеція), що застосовується для вимірювання резонансу поверхневого плазмона (5РЕК) для визначення здатності комплексів антитіл до НЕКЗ зв'язуватися з нейрегуліном.
Метод Віасоге"М заснований на явищі резонансу поверхневого плазмона (5РЕ) для виявлення і кількісної оцінки взаємодій при зв'язуванні. У типовому Віасоге-експерименті одну з взаємодіючих молекул (нейрегулін) іммобілізують на матриксі, а партнер по взаємодії (НЕКЗ) протікає по поверхні. Взаємодія при зв'язуванні приводить до збільшення маси на поверхні сенсора і відповідній безпосередній зміні показника переломлення середовища поблизу поверхні сенсора. Зміни показника переломлення або сигналу зчитують у вигляді одиниць резонансу (К.0О.). Моніторинг зміни сигналу, комплексів, що зв'язані з асоціацією і дисоціацією, здійснюють неінвазивним шляхом, безупинно і у реальному часі, отримані результати виражають у вигляді сенсограм.
Пристрій Віасоге"М Т100 (фірма СЕ Неайпсаге, Уппсала, Швеція) використовували для здійснення всіх описаних експериментів. Підготовку сенсорної поверхні і аналіз взаємодії здійснювали при 2590. Буфер і реагенти для Віасоге-аналізу купували у фірми СЕ Неайсаге. В аналізі використовували рухливий буфер, що містить 10мМ Нерез, рН 7,4/150мМ Масі, 0,05 95
Коо) Р2О, 0,5 95 БСА.
Позаклітинний домен МКО-1р1 (фірма КУО Зувіетв) інкубували на льоду протягом 45 хв з реагентом для біотинілювання Е7-ІіпкФ Зипо-МН5-І С-І С-біотин (фірма Ріегсе) у молярному співвідношенні 5:11. Реакцію припиняли, додаючи надлишок етаноламіну, і незв'язаний біотин видаляли з біотинільованого МКО за допомогою знесолюючих обертових колонок (фірма 2ера).
Біотинільований МАКС іммобілізували на сенсорному чипі САР, попередньо іммобілізованому за допомогою приблизно 3000 К.О. 55ДНК-стрептавідину (набір Віоїїп САРІШшгє), з одержанням поверхневої щільності нейрегуліну, що становить 400 - 600 К.О. Проточну референс-комірку приготовляли, виключаючи зі стадій ін'єкції ін'єкцію біотинільованого МКС, у результаті чого на поверхні проточного гнізда був присутній тільки 55ДНК-стрептавідин.
Комплекси НЕКЗ/антитіло створювали, інкубуючи 1О0нМ людський НЕКЗ-Ес з узятим у зростаючих концентраціях (0 - 5ОнНМ) відповідним антитілом, що тестується, протягом 15 хв при кімнатній температурі, перед інкубацією в Віасоге"М при 10 "С. Для аналізу взаємодії ін'єціювали комплекси НЕКЗ/антитіло на поверхню референс-комірки і на поверхні, що містять нейрегулін, у вигляді серій по 180 с швидкістю потоку 60 мкл/хв. Здійснювали моніторинг дисоціації комплексів протягом 180 с при швидкості потоку 60 мкл/хв. Наприкінці кожного циклу аналізів здійснювали регенерацію поверхні шляхом ін'єкції протягом 120 з суміші 8М гуанідин- !М Маон (3:11) з наступною ін'єкцією протягом 120 с суміші 30 95 ацетонітрилу/0,25М Маон зі швидкістю потоку 30 мкл/хв.
Приклад 15: Фармакодинамічні (ФД) дослідження іп мімо
Клітини лінії ВХРСЗ і ВТ-474 культивували та імплантували самкам безтимусних мишей пи/пи Ва!р/С (фірма Нагіап І абогаогіє5) згідно з методом, описаним у прикладах 16 і 17.
Після досягнення пухлинами необхідного розміру у тварин оцінювали якість пухлин. Тварин з укритими виразками пухлинами або тварин із заповненими рідиною пухлинами виключали з експерименту. Тваринам, що залишилися, вводили внутрішньовенно дози антитіл. шляхом ін'єкції в латеральну хвостову вену. У зазначені моменти часу тварин умертвляли за допомогою асфіксії, викликаної СО», і одержували зразки цільної крові шляхом серцевої пункції і поміщали їх в 1,5-мілілітрові пробірки Еппендорфа для збору зразків. Пухлинну тканину негайно висікали, поміщали в пропіленову пробірку для зразків з кришкою, що закручується, і швидко заморожували в рідкому азоті. Тканину зберігали при -80 "С до приготування лізатів. бо Приклад 16: Вивчення ефективності іп мімо з використанням клітин лінії ВТ-474
Клітини лінії ВТ-474 культивували в середовищі ЮОМЕМ, що містить 10 95 інактивованої тепловою обробкою фетальної бичачої сироватки без антибіотиків, аж до моменту імплантації.
За 1 день до інокуляції клітин самкам безтимусних мишей пи/пи ВаїЇБ/С (фірма Нагіап
І абогагогіех) імплантували підшкірно гранулу, що забезпечує постійне вивільнення 17р- естрадіолу (фірма Іппомайме Кезеагсп ої Атегіса)У для підтримки рівнів сироваткового естрогену. Через 1 день після імплантації гранули, що містить 17 В -естрадіол, ін'єціювали ортотопічно в 4-у "жирову подушку" грудної залози 5х105 клітин у суспензії, що містить вільний від 50 96 фенолового червоного матрігель (фірма ВО Віозсіепсе5) у збалансованому сольовому розчині Хенкса. Загальний ін'єкційний об'єм, що містить клітини у суспензії, становив 200 мкл.
Через 20 днів після імплантації клітин тварин, об'єм пухлин у яких досягав приблизно 200 мму3у, включали в дослід з дослідження ефективності. Усього в дослідах з дослідження ефективності використовували по 10 тварин на групу.
Для досліджень з використанням одного агенту тваринам вводили шляхом ін'єкції в латеральну хвостову вену дози або МОК10701, або МОК10703. Початкову ударну дозу 40 мг/кг застосовували як першу дозу. Після введення початкової дози тваринам вводили 20 мг/кг через день протягом усього часу експерименту. Для вивчення ефективності комбінацій тваринам вводили дози або МОК10701, або МОК10703 (20 мг/кг, ім, д24) і субоптимальну дозу трастузумаба (1 мг/кг, їм, 2дм/).
Протягом усього досліду об'єм пухлини вимірювали двічі на тиждень за допомогою кронциркуля. Відсоток величин, виявлений в оброблюваній групі/контрольній групі (Т/С), розраховували за допомогою наступної формули:
Чо Т/С-100х АТ/АС, якщо АТ 50 у якій:
Т позначає середній об'єм пухлин в обробленій лікарським засобом групі в останній день досліду;
АТ позначає середній об'єм пухлин в обробленій лікарським засобом групі в останній день досліду мінус середній об'єм пухлин в обробленій лікарським засобом групі в перший день дозування;
С позначає середній об'єм пухлин у контрольній групі в останній день досліду; і
Зо АС позначає середній об'єм пухлин у контрольній групі в останній день досліду мінус середній об'єм пухлин у контрольній групі в перший день дозування.
Вагу тіла визначали двічі на тиждень і дозу перераховували, виходячи з ваги тіла. Зміну ваги тіла («у Уо) розраховували у вигляді (ВМуУ поточний - ВМУ початковий)//ВММ початковий) Х100. Дані представлені у вигляді зміни ваги тіла у 95 відносно ваги в день початку обробок.
Усі дані виражали у вигляді середнього значення хх стандартне відхилення середнього (ЗЕМ). Різницю в об'ємах пухлин і вазі тіла використовували для статистичних аналізів.
Порівняння між групами здійснювали за допомогою однобічного дисперсійного аналізу з використанням апостеріорного критерію Тьюкі. При всіх статистичних оцінках приймали, що відмінності є значимими при р « 0,05. Представлені дані про значимість відмінностей відносно обробленої наповнювачем контрольної групи.
Приклад 17: Вивчення ефективності іп мімо з використанням клітин лінії ВХРСЗ
Клітини лінії ВХРСЗ культивували в середовищі КРМІ-1640, що містить 10 95 інактивованої тепловою обробкою фетальної бичачої сироватки без антибіотиків, аж до моменту імплантації.
Самкам безтимусних мишей пи/пи ВаіБ/С (фірма Нагіап Іарогайогіеб5) імплантували підшкірно 10х105 клітин у суміші 50 95 забуференного фосфатом фізіологічного розчину ії 50 95 матрігелю. Загальний ін'єкційний об'єм, що містить клітини в суспензії, становив 200 мкл. Коли об'єм пухлин досягав приблизно 200 мм3, тварин включали в дослід з дослідження ефективності. Усього в дослідах з дослідження ефективності використовували по 10 тварин на групу. Тварин не включали у дослід, якщо в них були виявлені незвичайні характеристики росту пухлин перед включенням у дослід.
Тваринам вводили дози шляхом ін'єкції в латеральну хвостову вену. Початкову ударну дозу 40 мг/кг застосовували як першу дозу. Після введення початкової дози тваринам вводили 20 мг/кг через день протягом усього часу експерименту (25 днів обробки). Об'єм пухлин і значення
Т/С розраховували згідно з докладно описаним вище методом.
Приклад 18: ФД-аналізи іп мімо фосфо-АКІ (5473)
Приблизно 50 мм3 замороженої тканини пухлини (наприклад, ВТ-474 або ВХРО-3) піддавали відтаванню на льоду і у кожний зразок додавали 100-300 мкл Т-РЕНК-буфера (фірма Ріегсе), що містить інгібітори фосфатази (фірма Коспе) і протеази (фірма Коспе). Об'єм буфера для лізису, що додається, залежав від розміру зразка пухлини. Тканину руйнували за допомогою 1,5- бо мілілітрової маточки (фірма Різпег Зсіепійіс) і отримані суспензії інкубували на льоду протягом
15 хв, після чого заморожували протягом ночі при -80 "С. Зразки піддавали відтаванню і центрифугували протягом 15 хв при 13000 д, 4 "С, після чого вимірювали в супернатанті концентрацію білка за допомогою ВСА-аналізу (фірма Тпегто 5сіепійіс). Супернатанти тканин розводили лізуючим буфером (фірма Мезозсаіє Оібсомегу) і додавали по 25 мкг у багатоточковий 96-ямковий планшет з вуглецевого матеріалу для аналізу фосфо-АКІ (фірма
МезозсаІе Оібсомегу), який попередньо блокували за допомогою блокувального розчину-А (фірма Мезозсаїе різсомегу). Планшет інкубували при кімнатній температурі протягом 1 год. при струшуванні, після чого лізат аспірирували і лунки відмивали 4 рази відмивальним Трис- буфером (фірма МезозсаІе Оізсомегу). Фосфорильовану АКІ виявляли за допомогою 25 мкл міченого за допомогою сульфо-мітки антитіла до фосфо-АКІ (5473) (фірма Мезозса|е
Рівсомегу), розведеного в буфері для розведення, шляхом інкубації при струшуванні при кімнатній температурі протягом 1 год. Лунки відмивали 4 рази відмивальним Трис-буфером, після чого додавали 150 мкл Т-буфера для зчитування (з сурфактантом) (фірма Мезозсаїе
Оібсомегу) і кількісно оцінювали сигнали за допомогою візуалізуючого пристрою Мезозсаїе Бесю.
Приклад 19: ФД-аналізи іп мімо фосфо- НЕВЗ (У1197)
Приблизно 50 мм? замороженої тканини пухлини (наприклад, ВХРО-3) піддавали відтаванню на льоду і у кожний зразок додавали 100-300 мкл Т-РЕВ-буфера (фірма Ріегсе), що містить інгібітори фосфатази (фірма Коспе) і протеази (фірма Коспе). Об'єм буфера для лізису, що додається, залежав від розміру зразка пухлини. Тканину руйнували за допомогою 1,5- мілілітрової маточки (фірма Ріхпег Зсіепійіс) і отримані суспензії інкубували на льоду протягом 15 хв, після чого заморожували протягом ночі при -80 "С. Зразки піддавали відтаванню і центрифугували протягом 15 хв при 13000 д, 4 "С, після чого вимірювали в супернатанті концентрацію білка за допомогою ВСА-аналізу (фірма Тпегто 5сіепійіс). Супернатанти тканин розводили лізуючим буфером (фірма Мезозсаіе Оізсомегу) і додавали по 150 мкг у багатоточковий 96-ямковий планшет з вуглецевого матеріалу (фірма Мезозсаїе Оізсомегу), який попередньо сенсибілізували протягом ночі 4 мкг/мл антитіла МАВ3481 (фірма К8О 5Зубвіетв) і блокували З 95 молока. Планшет інкубували при кімнатній температурі протягом 2 год. при струшуванні, після чого лізат аспірирували і лунки відмивали 4 рази відмивальним Трис-
Зо буфером (фірма Мезозсаіе Оізсомегу). Фосфорильований НЕКЗ зв'язували за допомогою антитіла до НЕКЗ ру1197, розведеного у співвідношенні 1/8000 у блокувальному буфері. Після інкубації при кімнатній температурі протягом 1 год. лунки відмивали відмивальним Трис- буфером і антитіло до рУ1197 виявляли з використанням міченого за допомогою 5-мітки антикролячого антитіла (фірма МезозсаІе Оізсомегу), розведеного у співвідношенні 1/1000 блокувальним буфером, шляхом інкубації при струшуванні при кімнатній температурі протягом 1 год. Лунки відмивали 4 рази відмивальним Трис-буфером, після чого додавали 150 мкл розведеного у співвідношенні 1/4 Т-буфера для зчитування (з сурфактантом) (фірма Мезозсаїе різсомегу) і кількісно оцінювали сигнали за допомогою візуалізуючого пристрою.
Приклад 20: Вивчення іп міїго комбінації лікарських засобів
Для оцінки можливості комбінації антитіл, мішенню яких є НЕКЗ, з терапевтичними засобами спрямованої дії поєднували МОКОЗ9825 або МОК10703 з трастузумабом, лапатинібом, ВЕ2235, ВКМ120, ВУ 719, КАБОО1, ерлотинібом і цетуксимабом і здійснювали аналізи життєздатності клітин. Приблизно 1000-1500 клітин ліній 5К-ВІ-3 (середовище МаккКоя),
МОА-МВ-453 (середовище КРМІ), Раби (середовище ЕМЕМ) або 13.3 (середовище ЕКРМІ) висівали в 384-ямкові планшети з відповідними культуральними середовищами, доповненими 2 96 ЕВ5, і давали їм прикріпитися протягом ночі при 37 "С. Потім у лунки додавали відповідні комбінації лікарських засобів (як правило, кінцеві концентрації лікарських засобів становили: для лапатинібу, ВКМ120 ії ВЖМІ 719 від ЗмкМ до 1З3нМ; для КАБОО1 від 27 до 0,0041нМ; для ерлотинібу від їмкм до 0,0025нМ; для МОК1073 від 100 до 0,01нМ; для цетуксимабу від 100 до 0,0015нМ; і для трастузумабу від 300 до 0,046нМ)), так, щоб у кожному планшеті лікарські засоби були присутні в концентраціях, що дозволяють побудувати криву дозової залежності для кожного лікарського засобу у двомірній матриці. Планшети повертали в інкубатор, де їх витримували протягом 3-6 днів, після чого оцінювали життєздатність клітин за допомогою набору СейПТйетг-СіІо (фірма Рготеда). Додавали в кожну лунку розчин СеїЇТіег-сіо і інкубували при кімнатній температурі при обережному струшуванні протягом 10 хв. Рівень люмінісценції визначали за допомогою планшет-рідера ЗресігаМах (фірма МоїІесшіаг Оемісе5). Розраховували ступінь інгібування росту при застосуванні кожної комбінації і оцінювали активність комбінації за допомогою моделі аддитивної дії Леві.
Приклад 21: Вивчення іп мімо комбінації лікарських засобів на клітинах лінії І 3.3 бо Клітини підшлункової залози лінії 3.3 культивували в середовищі ОМЕМ, що містить 10 95 інактивованої тепловою обробкою фетальної бичачої сироватки, до моменту імплантації.
Самкам "голих" мишей лінії Гохп1 (фірма Напап І арогайгіе5) імплантували підшкірно 3х105 клітин у середовищі ОМЕМ, що не містить ЕВ5. Загальний ін'єкційний об'єм, що містить клітини в суспензії, становив 100 мкл. Через 12 днів після імплантації клітин тварин, середній об'єм пухлин у яких у кожній групі досягав приблизно 100 мм", включали в дослід з дослідження ефективності. Усього в дослідах з дослідження ефективності використовували по 8 тварин на групу.
Тварин не включали в дослід, якщо в них були виявлені незвичайні характеристики росту пухлин перед включенням у дослід.
Тваринам вводили внутрішньовенно МОК10703 шляхом ін'єкції в латеральну хвостову вену дози 20 мг/кг через день протягом усього часу експерименту (обробка протягом 14 днів).
Ерлотиніб застосовували в дозі 50 мг/кг (РО) щодня як індивідуальний засіб або в комбінації з
МОКІ10703. Об'єм пухлин і величини Т/С розраховували згідно з докладно описаним вище методом.
Результати і їх обговорення
У цілому, отримані результати свідчать про створення класу антитіл, які зв'язуються з амінокислотними залишками в домені 2 і домені 4 конформаційного епітопу НЕКЗ і стабілізують
НЕКЗ у неактивній або закритій конформації. Зв'язування зазначених антитіл інгібує як залежну від ліганду, так і незалежну від ліганду передачу сигналу. Ці антитіла мають також здатність зв'язуватися одночасно з лігандом НЕКЗ. (І) Визначення афінності
Афінність антитіл визначали на основі титрування врівноваженого розчину (ЗЕТ) відповідно до описаного вище методу. Результати узагальнено в таблиці 9 і приклад кривих титрування для МОК10701 представлений на фіг. 1. Дані свідчать про те, що ідентифікований ряд антитіл, які відрізняються вираженою здатністю до зв'язування з НЕКЗ людини, мавпи циномолгус, пацюка і миші.
Таблиця 9:
Значення Ко антитіл до НЕКЗ ІдО-типу за даними титрування врівноваженого розчину (ЗЕТ). Ни (людський), Су (циномолгус), Ми (мишачий) і га (щурячий) оооомоям | невдала тсунева т Ву та т тапеву тт пи Сх Ух ВИ ПО: Я ПО ПО ЗО ПО Ле НОЯ 11717 098205.777 17772517 56 | 2 ...ю юам|.7171196 1 10701. ї1777117117141111111117141 11111716 | ло 010702. ї17771117817111111113 1111115 | 6 0703 м52я 17777711601117111111111па |Ї7171711спа |77717171спа1 (ІЇ) Визначення значень ЕСово для клітин лінії зК-ВІ-3
Зо Здатність ідентифікованих антитіл зв'язуватися з клітинами, що експресують НЕКЗ, оцінювали, розраховуючи значення ЕСвзо, що характеризують зв'язування з лінією клітин ЗК-ВІ-
З, що ампліфікує НЕК (див. фіг. 2 і таблицю 10).
Таблиця 10:
Визначені за допомогою ЕАС5 значення ЕСво антитіл до НЕКЗ ІдО-типу для клітин лінії ЗК-
ВІ-3. (п.4. позначає: не визначали) мов лМме | ЗК-В-ЗРАСЗЕСво(пМ) (ПП) Зв'язування з доменами НЕКЗ
Піднабір антитіл до НЕКЗ характеризували за допомогою ЕЇ І5А-аналізу за їхньою здатністю зв'язуватися з різними позаклітинними доменами людського НЕКЗ. Для цієї цілі позаклітинний домен НЕКЗ підрозділяли на його 4 конститутивних домени, і різні комбінації цих доменів клонували, експресували і очищали залежно від білків відповідно до описаного вище методу. За допомогою зазначеної стратегії були створені наступні домени у вигляді розчинних білків: домени 1 і 2 (01-2), домен 2 (02), домени З ії 4 (03-4) і домен 4 (04). Ряд створених при створенні винаходу мишачих антитіл до людського НЕКЗ (807, 1Е5 і 8Р2) оцінювали також як позитивний контроль для демонстрації цілісності виділеного домену.
Як продемонстровано на фіг. З, ії МОКО9823, і МОКО9825 успішно зв'язуються з позаклітинним доменом НЕКЗ, але в цьому аналізі з використанням зазначених антитіл виявлено їхнє слабке зв'язування з виділеними доменами. Є кілька можливих пояснень такої картини зв'язування: а) МОКО9823 і МОКО9825 можуть зв'язуватися з лінійним епітопом, який простирається в мікрооточення домену, таким чином, частково зв'язування епітопу може губитися, коли домени експресують у вигляді виділених білків. б) МОКО9823 і МОКО9825 можуть зв'язуватися з нелінійним епітопом, у якому зв'язані декілька доменів. Отже, поділ НЕКЗ на одиничні структури, що його складають, може руйнувати сайт зв'язування. в) Форма/конформація НЕКЗ може являти собою елемент зв'язування МОКО9823 і
МОКОЗ9825 з НЕКЗ, так що тільки повнорозмірний позаклітинний домен НЕКЗ має здатність адоптувати цю форму/конформацію, у той час як виділені домени не можуть повністю приймати цю конформацію. (МІ) Епітопне картирування НЕКЗ за допомогою мас-спектрометричного визначення обміну водню на дейтерій
Епітоп НЕКЗ досліджували також за допомогою НОХ-М5-аналізу ЕСО НЕКЗ у присутності версій Раб МмМОкКО9823, МОКО9824, МОМКО9825 і МОКО9974 і без них На фіг. 4А
Зо продемонстровано, що у відсутності зв'язаного аб приблизно 69 95 послідовності ЕСО НЕКЗ перекривається щонайменше одним пептидом. Проломи в покритті можуть бути результатом глікозилювання залишків у цих областях або недостатнім відновленням дисульфідних зв'язків у багатих цистеїном областях, що, зокрема, виявлено в домені 2. Важливо відзначити, що хоча для кожного Еар характерні індивідуальні схеми захисту, одна область сильного захисту виявлена у всіх МОКО9823, МОКО9824, МОКО9825 і МОКОЗ9974 (див. фіг. 4Б), що свідчить про те, що це сімейство антитіл, що відрізняються високою подібністю, зв'язується з НЕКЗ ідентичним способом. Найбільш сильний захист виявлений для залишків 269-286 домену 2 (ТРОГЕРМРНТКУОУСЄСОМС) (5ЕБО ІЮО МО: 146), що свідчить про те, що залишки в цій області можуть бути важливими для зв'язування з МАт. Картирування захищених залишків Бар в опублікованій кристалічній структурі НЕКЗ (Спо і І еапу, Зсіепсе 297, 2002, сс. 1330-1333) продемонструвало, що залишки 269-286 перебувають у функціонально важливій петлі р- шпильки в домені 2 або поблизу неї (див. фіг. 4В). (МІ) Кристалічна структура НЕКЗ/МОКОЗ9823
Дослідження з дозволом 3,2А кристалічної структури в рентгенівських променях Еар- фрагмента МОКОЗ9823, пов'язаного з позаклітинним доменом НЕКЗ, дозволило одержати додаткові дані про епітоп НЕКЗ, що розпізнається сімейством споріднених антитіл (див. фіг. 5А).
Крім того, визначали з дозволом 3,4А структуру Баб-фрагмента МОБО09825, зв'язаного з людським НЕКЗ. У кристалічних структури обох комплексів МОКО9823/НЕКЗ і МОКО9825/НЕНЗ
НЕКЗ перебуває у зв'язаній (неактивній) конформації (див. фіг. 5А, Б, У и Г). Ця конформація характеризується вираженою областю контакту, у якій відбувається взаємодія між доменами 2 і 4, опосередкована петлею димеризації ВД-шпильки в домені 2. Виявлена конформація НЕКЗ подібна до описаної раніше у Спо зі співавторами (Спо і І еапу, Зсіепсе 297, 2002, сс. 1330- 1333), що опублікували дані про кристалічну структуру позаклітинного домену НЕКЗ у відсутності нейрегуліну. Оскільки нейрегулін може активувати НЕКЗ, то зв'язана конформація
НЕКЗ, імовірно, повинна бути неактивною. Подібні зв'язані конформації виявлені також при кристалізації представників спорідненого сімейства ЕСЕК НЕКА (Вопуаїп та ін., Ргос. Май). Асай. збі. ОБА, 102, 2005, сс. 15024-15029) і НЕК! (Регдизоп та ін., Моїес. Сеїї 11, 2003, сс. 507-517).
Просторові взаємодії між доменами 1-4 НЕКЗ у неактивному ("скованому") стані сильно відрізняються від взаємодій у витягнутому (активному) стані. Ці дані базуються на кристалічних структурах представників спорідненого сімейства ЕСЕК НЕКАЗ і пов'язаного з лігандом НЕК! (Спо та ін., Майиге 421, 2003, сс. 756-760; Одізхо та ін., Сеї!І 110, 2002, сс. 775-787; Заїтей та ін.,
Сеїї 110, 2002, сс. 763-773), які обоє перебували у витягнутому (активному) стані. У витягнутому стані петля димеризації ВД-шпильки домену 2 звільняється від інгібуючої його взаємодії з доменом 4 і в результаті стає вільною для взаємодії з білками-партнерами по димеризації.
Таким чином, петля димеризації В-шпильки домену 2 є функціонально важливою як для підтримки зв'язаного (неактивного) стану, так і для опосередкування димеризації ЕСБЕ- рецепторів у витягнутому стані, що приводить до активації внутрішньоклітинного кіназного домену. Таким чином, кристалічні структури комплексів МОКО9823/ НЕКЗ і МОКО9825/ НЕКЗ (див. фіг. 5) дозволяє припустити, що і МОКО9823, і МОКО9825 функціонують, стабілізуючи неактивну конформацію НЕКЗ.
Кристалічна структура свідчить також про те, що епітоп НЕКЗ, що розпізнається і МОКО9823 і МОКО9825, являє собою нелінійний епітоп, який включає залишки з обох доменів 2 і 4 (див. фіг. 5У и 5Г, таблиці 11, 12, 13 ї 14). Таким чином, епітоп НЕКЗ, що розпізнається антитілами з цього сімейства споріднених антитіл, можна описати як: домен 2: залишки 265-277, 315,
Ко) домен 4: залишки 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615.
Отже, зв'язування обох доменів 2 і 4 з МОКО9823 або МОКО9825 повинно стабілізувати зв'язану конформацію НЕКЗ, що приводить до антагоністичної дії здатності передавати сигнал.
Механізм зв'язування МОКО9823/МОКОЗУ825, виявлений при вивченні кристалічної структури, узгоджується з проведеними при створенні винаходу дослідженнями з епітопного картирування. Зокрема, здійснені за допомогою ЕГІЗА експерименти з вивчення зв'язування доменів продемонстрували, що афінність МОКО9823 ії МОКО9825 суттєво вище у відношенні інтактного позаклітинного білка НЕКЗ, ніж у відношенні виділених доменів (наприклад, 01-, 01- рг-, 03- або 03-04-фрагментів) (див. фіг. 3). Це узгоджується також з оцінкою НЕКЗ за допомогою методу НОХ-М5 (див. фіг. 4Б), який дозволив ідентифікувати ВД-шпильку домену 2 як частину епітопу, що розпізнається антитілом. !, нарешті, обидві кристалічні структури демонструють, що лігандзв'язувальна поверхня НЕКЗ, яка була картирована за аналогією з доменами 1 і З НЕК! (Одізхо та ін., СеїЇ, 110, 2002, сс. 775-787; Сатей та ін., СеїЇ, 110, 2002, сс. 763-773), не закривається при зв'язуванні з МОКО9823 або з МОКО9825 (див. фіг. 5Б). Це узгоджується з отриманими при створенні винаходу даними про те, що ні МОКО9823, ні
МОКО9825 не блокують зв'язування нейрегуліну з МСЕ? -клітинами (див. фіг. 9), і що комплекси
НЕКЗ/МОКО9823 можуть зв'язуватися з іммобілізованим нейрегуліном за даними Віасоге- аналізу (див. фіг. 10).
Таблиця 11:
Взаємодії між важким ланцюгом Бар МОКО9823 і людським НЕКЗ. Залишки УН Бар пронумеровані відповідно до лінійної амінокислотної послідовності (ЗЕО ІЮ МО: 15). НЕКЗ- залишки пронумеровані відповідно до МР 001973. Представлені НЕКЗ-залишки, які мають щонайменше один атом у межах 5А від атома бар МОМО9823
Раю МОНОЗВ2З Людський НЕКЗ
Залишок | Номер | Ланцюг | Залишок | Номер | Домен
Бе 31 УН
Тує 58 ун
Тер ун
Авр поши й
Таблиця 12:
Взаємодії між легким ланцюгом бар МОКО9823 і людським НЕКЗ. Залишки МІ. Бар пронумеровані відповідно до лінійної амінокислотної послідовності (ЗЕО ІЮО МО: 14). НЕКЗ- залишки пронумеровані відповідно до МР 001973. Представлені НЕКЗ-залишки, які мають щонайменше один атом, що перебуває в межах 5А від атома аб МОБО9823
Раю МОНОЗВ2З Людський НЕКЗ
Залишок | Номер | Ланцюг | Залишок | Номер | Домен ви Їм а- 5 65 А | 52 -
Ше 77117129. ЇМ 7777777 |Рю | 612 Й Щ | 4
Зег зо о
Те 32 М.
Ше | 1600 | 4 су 7/7 66 ЇМ 7777777 (См | 65 Щ | 4 бі | 789 2 2 щ |М- ов | 268. | 2
Тує 91 Мі
Бег 92 Мі. ве | м вай- 5 5685 1 2 5 пе за М. я 77177771 96 ЇМ 77777 єн | 1268. | 2
Таблиця 13:
Взаємодії між важким ланцюгом Бар МОКО9825 і людським НЕКЗ. Залишки МН ЕРар пронумеровані відповідно до лінійної амінокислотної послідовності (ЗЕО ІО МО: 51). НЕКЗ- залишки пронумеровані відповідно до МР 001973. Представлені НЕКЗ-залишки, які мають щонайменше один атом, що перебуває в межах 5А від атома аб МОБО9825
Раю МОНО9В25 Людський НЕКЗ
Залишок | Номер | Ланцюг / Залишок | Номер | Домен
Авп 52 МН
Ту 59 МН
Тер МН пер тв
Таблиця 14:
Взаємодії між легким ланцюгом ар МОКО9825 і людським НЕКЗ. Залишки МІ. Бар пронумеровані відповідно до лінійної амінокислотної послідовності (ЗЕО ІЮ МО: 50). НЕВЗ- залишки пронумеровані відповідно до МР 001973. Представлені НЕКЗ-залишки, які мають щонайменше один атом, що перебуває в межах 5А від атома аб МОБО9825
Залишок | Номер | Ланцюг / Залишок | Номер | Домен
Ше 77 Ї717117129 ЇМ 7777 РО | 62 | 4 ет ши
Авп 31 М. те м щи
Ше 77 17111600 | 4 бу 17171717 6611 МЕ 77777 б | 65 | 4 бій | 7789 ЇМ 77777 леи | 1268. | 2
Туг 91 М. ет ши ще еф вм ей-- 1 65 | 52 5
Рпе 94 М. яб 777 Ї777171796 ЇМ 77777львєи | 1268 | 2
Візуальна оцінка кристалічних структур. МОКО9823/МОКОЗ9825 продемонструвала, що залишки НЕКЗ ГГ уз267 і І ец268 беруть участь у численних взаємодіях з різними СОК антитіл, що дозволяє припустити, що вони можуть бути важливі для зв'язування з антитілом. Тому
І уз267 і/або І ец268 заміняли на аланін, експресували і отримані рекомбінантні білки очищали для оцінки їх впливу на зв'язування з антитілом. Аналізи по оцінці зв'язування, проведені за допомогою ЕГІ5БА, продемонстрували, що мутація або Іуз267, або Іец268 елімінувала зв'язування МОК10703 з НЕКЗ (фіг. БЕ), що дозволяє припустити, що обидва залишки являють собою інтегральну частину епітопу НЕКЗ і, ймовірно, вносять вклад у взаємодії між
МООЗ9823/МОКО9825 і НЕКЗ. (МІ) Інгібування передачі сигналу в клітині
Для оцінки впливу антитіл до НЕКЗ на залежну від ліганда активність НЕКЗ клітини лінії
МСЕ інкубували з дб перед стимуляцією нейрегуліном. Приклад кривих інгібування проілюстрований на фіг. бА, і дані узагальнено в таблиці 15. Досліджували також вплив антитіл до НЕКЗ на опосередковувану НЕКЗ2 активацію НЕКЗ з використанням клітинної лінії 5К-ВІ-3, у якій відбувається ампліфікація НЕКЗ (фіг. 6Б и таблиця 15).
Таблиця15:
Значення ІСводдля РНЕВЗ і ступінь інгібування антитілом до НЕКЗ ІдС-типу в клітинах ліній МСЕ7 і ЗК-ВІ-3 оомовм со я уваніят 698243. | 77181 177777771789111 11111156 |Ї1117111591СщС 09825. | .-..юЙз399 77777777 807 | 71169 | 7777766 с 09974 | 30667777 697 |77119208. | --:/(ЕИ67 10703. | ...юю.333.7777 177780 |. 167 | щ-:(м 69...Й:С( 12609 Її 5 щЩщБГ7/786 11112 Її
Для вирішення питання про те, чи впливає інгібування активності НЕКЗ на кіназу АК, розташовану в прямій напрямку шляху передачі сигналу в клітині, її фосфорилювання оцінювали також у клітинах, що ампліфікують НЕК2, після обробки антитілами до НЕКЗ (див. фіг. 7 і таблицю 16).
Таблиця 16:
Значення ІСвзо для рАКІ (5773) і ступінь інгібування антитілом до НЕКЗ ІдО-типу в клітинах ліній
ЗК-ВІ-3, ВТ-474 і МСЕ7
Мов ке сн овайя ну вування 09825 | 156 | 9 | /769 | 294 | 7 щЗ 10703 | 70. | щКмвВе | юрба | 449 | 7
У цілому, встановлено, що кожне з антитіл МОКО9823, МОКО9824, МОКО9825, МОКО9974,
МОК10701, МОК10702 МОК10703, МОК12609 і МОК12610 має здатність інгібувати клітинну активність НЕКЗ як залежним від ліганда, так і незалежним від ліганда способом. (ІХ) Інгібування проліферації
Оскільки всі антитіла МОКО9823, МОКО9824, МОКО9825, МОКО9974, МОМ10701,
МОК10702 і МОК10703 інгібують активність НЕКЗ і передачу сигналу в прямому напрямку, вивчали їхню здатність блокувати залежний і незалежний від ліганду ріст клітин іп мйго (наведені як приклад дані представлені на фіг. 8 і узагальнені в таблиці 17). Усі вивчені антитіла до НЕКЗ ефективно інгібували клітинну проліферацію.
Таблиця 17:
Інгібування проліферації після обробки взятими в дозі 10 мкг/мл антитілами до НЕКЗ ІдС-типу клітин ліній ЗК-ВІ-3, ВТ-474 і МСЕ7. мово 00 | вевд---т- о леж 0 (ртт-- (Х) Оцінки блокади ліганду
Здатність описаних антитіл до НЕКЗ блокувати зв'язування ліганду досліджували, оцінюючи зв'язування нейрегуліну з клітини лінії МСЕ7, попередньо обробленими або МОКО9823, або
МОКОЗ9825. Присутність як МОКО9823, так і МОКО9825 не виявляла істотного впливу на здатність нейрегуліну зв'язуватися з МСЕ7-клітинами, у той час як застосовуване в цьому експерименті як позитивний контролю антитіло (Мабр3481) мало здатність помітно впливати на зв'язування нейрегуліну (див. фіг. 9). Ці результати узгоджуються з даними про кристалічну структуру, з яких випливає, що МОКО9823 взаємодіє з доменами 2 і 4, у той час як основні точки контакту при взаємодії НЕКЗ з нейрегуліном, як передбачається, згруповані в основному в доменах 1 і 3. З урахуванням того, що нейрегулін має здатність зв'язуватися з неактивною конформацією НЕКЗ (Капі та ін., Віоспетібзігу 44, 2005, сс. 15842-15857), можливо, що
МОКкО9823 і МОКО9825 функціонують, попереджаючи перегрупування доменів НЕКЗ, необхідну для передачі сигналу, або виявляючи вплив на димеризацію рецептора. (ХІ) Оцінка блокади ліганду (біохімічна)
Для вирішення питання про те, чи можуть МОКО9823 і нейрегулін одночасно зв'язуватися з
НЕКЗ, проводили біохімічний аналіз з використанням Віасоге"М-технології. Аналізи взаємодії здійснювали шляхом іммобілізації біотинільованого нейрегуліну на поверхні сенсорного чіпа
САР (фірма СЕ Неайпсаге), що застосовується в Віасоге"М, використовуючи набір Віоїїп САРІіШшге (фірма СЕ Неайпсаге). Одержували комплекси НЕК з антитілами шляхом інкубації людського
НЕВЗ-Ес з узятими в зростаючих концентраціях МОКО9823, 105.5 (фірма Тпегто Зсіепійіс) або людським дб. Попередньо отримані комплекси НЕКЗ/ антитіло ін'єкіювали на референс- поверхню і активну поверхню та оцінювали взаємодію НЕКЗ з нейрегуліном.
Контрольний дО не чинив впливу на формування комплексу НЕКЗ/нейрегулін, у той час як антитіло 105.5 суттєво інгібувало здатність НЕКЗ зв'язуватися з нейрегуліном, що узгоджується з відомими відомостями про те, що воно являє собою антитіло, яке блокує ліганд (фіг. 10). На відміну від цього при утворенні комплексів НЕКЗ/МОКОЗ9823 мало місце зв'язування нейрегуліну, що демонструє, що МОКО9823 не перешкоджає зв'язуванню ліганду. Важливо відзначити унікальне залежне від дози збільшення значень КО при ін'єкції комплексів
МОКОЗ9823/НЕКЗ. Ці дані свідчать про утворення на поверхні чіпі тримерного комплексу, що містить нейрегулін, НЕКЗ ії МОКО9823. Можливість утворення цього тримерного комплексу передбачена за кристалічною структурою НЕКЗ/МОКО9823, оскільки зв'язування МОКО9823 не закриває сайт зв'язування ліганду на НЕКЗ, це дозволяє припустити, що зв'язування нейрегуліну і МОКО9823 не є взаємно виключаючими.
Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу антитіло або його фрагмент зв'язується як з доменом 2, так і з доменом 4 НЕКЗ і не блокує конкурентне зв'язування ліганду НЕКЗ, такого як нейрегулін. Не вдаючись у теорію, можна припустити, що антитіло або його фрагмент зв'язується як з доменом 2, так і з доменом 4 НЕКЗ, підтримує НЕКЗ у неактивній конформації, не блокуючи сайт зв'язування ліганду на НЕКЗ. У результаті ліганд НЕКЗ (наприклад, нейрегулін) може зв'язуватися з НЕКЗ одночасно з антитілом.
Антитіла, запропоновані у винаході, або їх фрагменти інгібують як залежну від ліганду, так і незалежну від ліганду активацію НЕКЗ, не перешкоджаючи зв'язуванню ліганду. Це розглядається як перевага з наступних причин:
І) терапевтичне антитіло може знайти клінічне застосування відносно широкого спектра пухлин, ніж антитіло, спрямоване тільки на один механізм активації НЕКЗ (тобто залежної від ліганду або незалежної від ліганду), оскільки кожний механізм опосередковує різні типи пухлин; (І) терапевтичне антитіло може мати ефективність відносно різних типів пухлин, коли одночасно залучені обидва механізми активації НЕКЗ. Антитіло, спрямоване тільки на один механізм активації НЕКЗ (тобто залежної від ліганду або незалежної від ліганду), повинно мати меншу ефективність або не мати ефективності відносно цих типів пухлин; (ІП) на ефективність антитіла, яке інгібує залежну від ліганду активацію НЕКЗ, не перешкоджаючи при цьому зв'язуванню ліганду, з меншою ймовірністю буде чинити шкідливий вплив на зростаючі концентрації ліганду. Це може приводити або до підвищеної ефективності відносно типу пухлини, що викликається дуже високими концентраціями ліганду НЕКЗ, або до зниженої схильності до розвитку стійкості до лікарських засобів у тому випадку, коли стійкість опосередкована підвищувальною регуляцією лігандів НЕКЗ; (ІМ) антитіло, яке інгібує активацію НЕКЗ шляхом стабілізації неактивної форми, повинно бути менш піддане стійкості до лікарських засобів, пов'язаних з альтернативними механізмами активації НЕКЗ.
Отже, антитіла, запропоновані у винаході, можна застосовувати для лікування станів, у відношенні яких існуючі в цей час терапевтичні антитіла є клінічно неефективними. (ХІЇ) Інгібування іп мімо активності НЕКЗ і вплив на ріст пухлин
Для оцінки активності іп мімо описаних антитіл до НЕКЗ антитіло МОКО9823 оцінювали на моделях пухлин як ВхРО-3, так і ВТ-474. Встановлено, що МОКО9823 інгібує активність НЕКЗ, про що свідчить істотне зниження рівнів РНЕКЗ у пухлинах (фіг. 11). Інгібується також передача сигналу НЕКЗ у прямому напрямку, що продемонстровано по зниженню рівнів рАКІ як при використанні ВхРОС-3, так і ВТ-474 (фіг.11). У досліді з оцінки опосередковуваної НЕК2 ефективності при використанні ВТ-474, встановлено, що повторна обробка МОК10701 приводила до інгібування на 74 95 росту пухлин (див. фіг. 12А), а обробка МОК10703 приводила до інгібування на 8395. При вивченні росту пухлин на моделі ВХхРСЗ встановлено, що і
МОКІ10701, і МОК1070О3 дуже ефективно інгібували опосередковуваний лігандом ріст пухлин (див. фіг. 13). (ХІЇ) Вивчення іп міо комбінацій лікарських засобів і їх вплив на ріст клітин
Оскільки ріст пухлинних клітин часто запускається декількома шляхами передачі сигналу,
Ко) досліджували, чи мають комбінації МОКО9823 або МОК10703 різними засобами цілеспрямованого впливу сприятливою дією відносно блокади клітинної проліферації. Обрані засоби цілеспрямованої дії інгібують головним чином НЕКЗ2 (трастузумаб, лапатиніб), ЕСЕК (цетуксимаб, ерлотиніб), РІЗК/ЛТОК (ВЕ7235), РІЗК (ВКМ120), РІКЗСА (ВХ 719) і ток (КА0ООТ1), оскільки ці мішені, як правило, активуються в людських пухлинах. Аналіз ізоболограм (див. фіг.14) продемонстрував, що для МОКО9823 ії МОК10703 характерна синергетична дія при їх застосуванні в комбінаціях з трастузумабом, лапатинібом, ерлотинібом, цетуксимабом,
ВЕ7235, ВКМ120, ВУ 719 і КА0ОО1. Ці дані дозволяють припустити, що інгібування передачі сигналу НЕКЗ є особливо сприятливим при застосуванні інгібіторів, мішенню яких є рецепторні тирозинкінази або шлях передачі сигналу РІЗК. (ХІМ) Вивчення іп мімо комбінацій лікарських засобів їі МОК1070О3
Оскільки іп міо встановлена наявність спільної дії інгібіторів НЕКЗ із засобами, мішенню яких є рецепторні тирозинкінази, то при створенні винаходу досліджували вплив іп мімо, застосовуючи або МОК10701, або МОМК10703 у комбінації з трастузумабом і ерлотинібом. Як встановлено з використанням ксенотрансплантатів ВТ-474 (див. фіг. 15А), комбінація або
МОМ10701, або МОК10703 (20 мг/кг) з узятим у субоптимальній дозі (1 мг/кг) трастузумабом мала дію, достатню для індукції регресу пухлин (9571/С- -50 і -37 відповідно). При застосуванні ксенотрансплантатів клітин раку підшлункової залози 13.3 встановлено, що комбінація
МОКІ10703 (20 мг/кг) із застосовуваним щодня ерлотинібом (50 мг/кг) привела до стазу пухлин (967/С-3, див. фіг. 15Б). На обох моделях встановлено, що комбінація двох лікарських засобів мала суттєво більш високу ефективність, ніж індивідуальне застосування кожного з лікарських засобів, що підтверджує отримані раніше при створенні винаходу дані іп міго про сприятливу дію комбінації антитіл, мішенню яких є НЕКЗ, з антитілами, мішенню яких є ЕгОВ.
У цілому, можна зробити висновок про те, що унікальна здатність цього сімейства антитіл стабілізувати неактивну конформацію НЕКЗ приводить до вираженої ефективності іп мімо на моделях, у яких НЕКЗ активується або залежним, або незалежним від ліганду способом. Крім того, інгібування НЕКЗ цим сімейством антитіл чинить сприятливу дію у комбінації з широкою різноманітністю цілеспрямованих терапій.
Включення як посилання
Усі процитовані в цьому описі посилання, включаючи патенти, заявки на патент, статті, бо керівництва і т.п., а також посилання, процитовані в зазначених публікаціях, повністю включені в цей опис як посилання.
Еквіваленти
Наведений опис винаходу розглядається як достатній для практичного втілення винаходу фахівцем у цій галузі. Наведений опис і приклади деталізують конкретні кращі варіанти здійснення винаходу і демонструють найкращий шлях здійснення винаходу. Однак повинно бути очевидно, що незалежно від того, наскільки докладно він був викладений вище в цьому описі, винахід можна здійснювати на практиці багатьма шляхами, і винахід слід трактувати відповідно до прикладеної формули винаходу і її еквівалентів.
ПЕРЕЛІК пОСЛІДОВВОСТЕЙ «110 Вовартіє В «020 к Ачнтитіпе до сбецезтора епісгврмальното фактору росту: 3 ІНЕКЗЇ «150» ЗзаЗА5 «150з САВА кІ70У Батепоівз, версія 3 «і10з 1 «2112 1342 «в12п5 рт «В13в» ово Барісп «добув
Мес ага лій Авт о двроАТа їж піп оУаї Бей Бу рей Бей ве ех ей 1 Б 10 ї5 кіз Аку С1іУ Бег Сів уві сту деп бек біп діа узі Сув Бо бРу ТЕ що 25 35 їжи два обі ти бЗеї 31 тає біу Авр Ата І Аве Зап о Тух біб ТЕ а «5 ви туї пув ої Ту ПМ АБа Сув о Я) уаї ві Мек бі Ав олеа Бій ві 55 2 ті мах цеч ТВкобіу Ні вва Аза Авро лев бек Бпе ев біп Тур лів 70 7 во дха Яма Ма1ї УпПо Зіу Тут ав лей уггі АТа мет Вел сій Пе век хвг во зо 25
Мо отуо вм Бо АвпоБецодтга уаї Маї дха сіу Твгозтй уаї тух ар 05 їа5 їхо о1у був вве дів Її рБє маї Меб цей Авп туту Вот Тк дяк Бех бек її 1259 125 нів Аіа йем АкЗ зЗіп ем Ака Меп тс обі їв Тв біб т1іе пе; Бех
ІЗ ї35 зай сіу дту уді Тук 11іе біб Пув АвпоАнюроїув Без був Нів Меб дер ТБ їєУ ВО 135 ї550 тіє Авр тТкродку Авр Ії Уаії Бту АвБродуЯ АБроАта біз І3Зе чаї УВА 165 179 175 зув авр Ап Зіу Ата Бех оСузв рго ко Сув ВіБ 53ю Хаї Сув був о щіу ї50 т85 ї90 «Ака сСув Ттгросту Рко бйху бек сів АвроСув біпотвуУ цед ТК обу Те 135 а 205 11іе с Сув Аза Бхо Зіп Сук Авп о сіу Ніво'сСув Бце ЗУ Бро дви ото Ав 315 215 220
Зіп о Сув Сук Нів Авр сій Су Аза біу бЗі1у сСув Беж піу рго біповдяр 225 239 235 дей
Твгоаво Су Бе вів Сув' вка Ні Рле АБп Авгробех п1іу Віа Сув Заї х45 25 вах
Ркосвуч Сувоско Оїп о рео їсей Мах Тух дей Був тей Тпх пе біп цех ва 7е5 зла біцовко авп ово Ні Тит пув ТУЮК сп ТУЮ СБУ Ру Ма1ї Сув'чаї ха
У 285 зах
ЖвЕ Су ржоснів Ав Ре Уаз Уах Авр сі» ТБу бек Сув маї Ак А1їа
З а зоб
Сув о рхо вхо АБр о Суш Ме бі) уаії Вар о тув Взлпосту їжу був Меї су за5 Зла зі зо
Чі Бкгб був 01у сіу Шев Сув Бко Був Аза Сувозіц З1іу Тк бу бех 325 335 335 сіу Бек Бк пе біп тис Ууаї АкроЗек Бек Авпохіе Авр о ЗхУу рів чаї за зав ау вав осСув Такоцув 118 Бец 01у АБп їв Аврорце ї1веу 118 БйиЕ о біУ дез з55 зво зе аЕп о піу дер ркб тто ів ув хі Бо Аза їв АВР Бе вій Пув о пей зло ЗБ ана
Авт оМак Бе вхо Ту Уаї Агу 30 жіє ТЕ Біу стук ей АвпоЇіє зів» зв аа ан 0
Бех тТжр о рРго Рко нів Мер Нів Ай БрЕ Баг Маї РМ Беж Авпоцец ТЕХ
НЯ Я аї5 їптоїїб6 5Зіу щ1у Вуч Бех опеч туї Ап овкоа спт1іу пе ех цей оспей тіє 420 25 АЗИ
Мекспує Анлоцем Вапо уві Тс бет їз б1у Бе ЗАКО дех Пен ув БІ 45 за 445
Іїе Вех Аа1а СЕУ Ахя іє Тут ті Ветк йТа дяц Акч сіп рем Суд тут зво ав чо нів нів ек цеч Ави ТЕр о ТаЕ пу Уа) єм Ак біу же тик осів 1 465 470 АВ 4ве дту цеч дер оЇіїє Був Нів АВ оАкЧ хо дуга дка АБроСув Маї діа ссій ап 135 85 сБіу Був маї Сув АвБр РЕ цец Сук бех Беє сіуУу Зі» Сув тур Ту рко
ВІ вав зі у веб біу іп Сувобви бег Сув Аха Акп Хух Бетг аку біу ху ма р, 525 сув уаї ТВх нів Сув АзпоБнє їєр Аво Зі 33 рко АкЯ сіб ре діа
Ба вад нів с) Біа сій був вве Бек осСув о Ців вко 10 Сув с бій ро Меб 1 ав БО 555 КО біу ТВі Аза Тв осСув вв о 01у Бех Зіу бек Азротйк Суд Азасбів Суб ве вл 575 діа нів Рпє дхо Аврозлу рує ХВ Сук уаї бек бе Су вгоснін о біх вас 585 5ЗО уаїг ге: піу діа уз Фу РКО ї1е Тух Ппув тТук вто двроЧаї спіо ВБя
535 вас вах сій сСув Ака РКО Сув Нівос5ій Ап оСув ТІ о біпо-1у був оцув о З1у вхо ву 615 62 бів ве с1п оляр Су пен сту бібл бїюк о їва Маї пеб хів Пру був отих
ЗО яв вас
Нівсьеа ТпЕ Ме Віз сей Твх УЗ) Хі діа бі рей Маї таї тїМе о впе 545 ув 655
Мес ме еч с1іу с1у Тк оРаяч пей о ТУух ТкроАга ОЛУСАгУ Ахо її сів «во «65 Е70
Зно) оБув Акч АїТз Меб Ач оАхо Тук опе 1 Ага сій Зіш Зеж ті спе
Бл ва вва ргб їм дер рус бек Піч сМув іа Ав був уві те віза дта тів о Рпе. 620 69 7
Був оптіо Такобіб Бей дкя Був Вб Бук ді їе» б3Зіу Бек біу чай Риа
7іЗ 715 то сту їх Угіонів Був бСіу Уві) Тер о тіє Все зізо5Іїу м; Бек тів цув та и; 755
Хе бо аз Сувоїїів Був баії Тіє пІіб Авробув ет сіу дка бій ве тай 745 тай пе бів Аза чаї тне АБооМівВ Мей Пеа діа 116 Фу Зех ей деронів 755 тв ев діаснів тів Уа) дкч Пец бе біу Бена оСув Бгс З31іу бек Бех їєв бід 7 ле 78о ред уаї так осіо тую во вхо ем біу бек цем їжа Авронів Маї Ва 75 то тв5 воб
Зіп нів Ага З1у Аїа цей біу Рто сій реа йец їжа Ав оїкрозіу чаї ов дата тів
Зій І1а Віа був піу Мес Тук ТтТУЄ Бей біз Зій ків о бЗіу Мебє уві нів
82о 825 во вАксоАжЖОа Зеио Аза вів Аа ав Мі їм оре був о Бек во бек сій Уа 35 або вже біп Узі Аза АБО РБіпе піу Уа дів Авроїе Тед оБко Рго ВБроАвр пу 859 855 або сій їм реч Тук бет ЗІій Аза іже лиж вк ї1є Був Ткромеї Аіа Тем в'й 75 ВВ бів Зет ї3е НівсРйе сту ув Тук Тк нів бій Вет бер аз ттр Вех веб ав нУ5 тух піу Маї ТВж бар о Тхр бій цей мМеБ тру Рпаеозіу Ата сь вто Тукг зао вих Зо.
Аїа 15 їси Вка їй Аза обі) Уві Бо свБр Бей меш 3 Бувосту 15 з азо 25
Ака пе» віз сів РІО сій отїіе Су жЖйх І16 АвроМаї Тук Ме. Уді Ме.
930 Зах зай уві був Сук тЕр Мес х185 АвБр обія Ав оїте дека Ро Тмк Вде Був ТО зав зво з55 зо пейо дів Ап осі. вав тТнг Ака Меї Аза дса Авр ро Ро Ака тує зе 955 576 ал таї тіє руз дхч п1й Чекодіу ро біу Щ16 віз орто бЗ1у ро сб1іо вто зво з83 зай
Нів сіу пбепстік лЛеп ув Був йемш. бі бі» Маї сім рей бій Вко су
Зав 1005 Мк ей Авро Бец Авроївч Авропетпо їм оАза сім 030 АвросАвп о їей Аїа ї919 Іп15 тазо тис тах ТВ бей біу Зекодіа пей бек пен Бко Уві у ТК опеш то25 1130 12535 внпоАха орхо Ако 0Ху Бек 3) Бех ей Мша бек оБюх бек бек оту оо. ї045 10590 тут Ме Бха Месодви сі оЗіу АвВо Бей осіу бій Бек сСув Бі» шви ла55 13650 1055
Щек Аза сумі Зеюк біу Бех бек бів Ак Су рко Дюка сркЕС Уау Бех 1079 1075 1285 ес нів рко Меб ро дуз бСіу був без дів бек ЗТ бет ех 1 1085 1пва 1095 сіу нів Уаії тах СІУу Бет біб лЛіа пім оре) сзіп сім ІТув о уаії веї т1бо 1105 Т110 вт Сув о Аку ЗекоАко Бед одта Бег Ака Зат рго Аха ро Ака б1уУ 13185 з179 їїх5
АвооБеш дів Тухк БІ Бек Зімй АкКча Нів Бек орвч тей ТПЕ Ртго те 1136 1135 1140
ТНЕ о Бкс спвбе бековБко Ро сту ев обі З1п о біч о АБро Уаї Авпобіє
1145 1150 її55
Тут ущі Меїх Рго Аво оте Якхв о їжа тув Сіу ТБЕ рто дек обек АкФ 1150 1165 Та сін бім так оїев бетхт Шек ак с1у Пей оЗек бак уві би Чіу тТвЕ
Ел тв8о лід
Зі лі» із сАвр обі: АВО бі ЗМ тТУю Зій Ту Меб о АвпобгЯ да 1150 1135 І205
Аку Ах нів бек рго ро нія БЕО рхо Аку ртб ВЕЖ ББЖ гей -Ф. 1205 1713 19515 січ рей сту тТукобтй тук Мебї Авроуді Оїу Бек Аяр о рем бек Ата 1575 ххх 1230
Жек оце) ЗХУ бек Таж бій вет о Сув рро пев Нів о РЕО Чаї схо де 1235 1236 1245
Меї Рхе тах Ас сіу Тьк ответ вхо ввробій ввіотут обро Тут Мек
1250 1:55 17250
Аве Вга бій АхЯ АвроЗіу шіу фу ро біу ЗІту ДюЕр Тут Аїа Аа 1255 1270 їа75
Ме оіу Аїа сСув бо Віа вет біз бій ху Тук с3ім сін Мебо ов 1259 із іт віз ве ЗІп у рго шу нів іп: Віа вто Ні мазі Ле тТух Аха 1295 41380 1385
Акта Вер о Був Трк Бен дк Бего їжц бі Дії тво дбвро Яеє віз вве 1310 ІЗ і1з20 двродяпо Рго двротук Тер Нія бек Аку зей Ре рхо був Аїа Авт їза5 УЗИ 1335 вій Зіп о сАхя тв іза0 «пт»
«Вії 5 «217» БЕТ «811» Но варієцй «пов» й бек Тук Діа Мек дек 1 5 «Во» й «11 15 «шіїм РКТ «13» Нопо варівн «ад з чуаї тн сіє Ата уаї Зі ру ТвВЕотТухк тує вхо Авробег уаі цуво'о3у 1 8 10 Ех «п1О0х 4 «813» В кІуїув ВЕЖ «2152: НОото варіп кЗ002 4
Тер зіу дврозіш сіу вве Аврот1е 1 5 «10» 5 «2112» 41
Ей БАХ «3» Мово варієй «а0Ооз 05 дка А1а БЕК сів обіу ї13Ле бек Ав тхрогей Аза 1 5 10 «вій 6 «7115 7 сиї2» ВЕТЕ «3» Мом; варієї «Щ0й» б
З1у вів Бех бет Бей сіті ЗчК 1 5 «й 7 «2112 З
«12 рРКЕТ «йі3з Ношо варівй «вп» 7 сут оЗівп Тук Зех еко Бл ро Зк тах 1 К-я «Вій» В «Ті 7 етїйз ВАТ «13» домо зарієй кЗ00х В
Зіу вВре тТНжк бле Бек Дек Тук
Е 5 «Вібх я «711їз 5 «йї1й РБК «93М3з Мото варізп «асо» В сту Віа уаз іш Ат
1 5 «їй «і В «Вій» ВБТ «із» Вото варуєл «абз 16
Тур Зіу авробів біу Рпе дир 11є ї 5 «2105 1 «811з 7 «їй» РК «ВЗ» Вощо варієї «й 1
Звк ій бі1у 512 бек бвпоткр в я «210» 17 «вії» 8 едійв БНЕ
«213» Нащо вархев «айппх 2
Ту вів БЕХ 1 «30 КЗ «211з 6 «їх ОРЕ «813ж Ното завів: «00» 13 тТУук Бек бек рпе РгОо тпе 1 5 «10» 14 «ліз 107 «ВІТА вет «13» нот зарієй «вод» 14
Авротівз сбіп мех тв біп Бех вкб Бет Бек рем бек АТїа бек чаї 1у 1 З їО 15 дер дк жі твж оті тик оСув АкЯ4 Аїа Ваг о Сій сбіу п1є Вєї дво тр 25 зо їв АТ тТкротух біл Вуд буз Ро 1у руб Аїа Рго йуб5 Пемотев Ще «о ще
Тук шіу дів Вех бек пец біп Бех сіу Маї то бЗех Аку Кпе Яет бі 5о 5 Ей
БетоЗіу бек З1у тиж АвроБНе ТК ої ТБ (Те бвк Вес пев сій ВКФ
БЕ 7а 75 во чі Авр о рнНе Аза чаї Тут тую Сув біб бій Тук обБеї бек РБе Бо тп 85 зо 25
Тпковпе бім їв біу Три Буш уаі Са діє ув то 405 «10» 15 «й1ї1и 1156
«й1из ЕТ «813» Непосваріви «ох Сх бів хаї сів печ маї біз Бех біу Біу Піу песо уві бій Бко сіу Щіу 1 5 16 ї5
ЕК узєп дхчЧ Бе) бек був діа Аза Бет (Ту Бе тах роє Бех бек тує 759 25 Зо віз Мет Бех тТкр Уві Ака біп о А1а гбжо ЗІу руш о стіу цей біз ткр оХаї
З 20 а бЗет о уаз тт сіу Атїв чаї СІУу АжуУ Тк отук Туш Вжо Авробел ді Був
БО В я: сіу всу пе Ті 112 Бех Аргу Дер о Анповек ву Бвп стає Без отух ей
Б те 5 во бів Мес Автобек Пец АїЯ Ата сі Ввротпу вача Уа) Тух тує Су А18,
І зо ЗЕ дгч тр ос1у Авр ах пВіУу Бапе Дер ої1їе Тер біу біп бі Тпк оре МВУ 190 хаб 115
Ти оУуві Чех Бех
З пЕї0з КЕ «211з 351 хЕіїши дик «213» Номо варівл «80» 16 часасссача сачасссачає соссяєхацс сечауєсзеча чеоізузєса тсчезаасо БО астасссоуса заопспадсса зусяракьосо васбдуєтчє ссваатасса дсачавасся 130 чясавацсас счвзазастаєс авззіІстаєаас: чсЕссткесеру кдсавачеяу запсссассс 180 сУшівксачсея Зсесточвис ссасасучЧає грзассссяа Совісвусач ссвеасзаєсех зад чаазасеісся сезбтсасеа Содссазасад Завроссвось рроссаскає сусбавесза па пабсасдлаза сЕЗаавсква а зві
«йду 7 «8112 388 «кри» ОДНЕ «9132 Нотпо барієй «ка0бв 17 сазугасаає содсодазаа суадсоцечас стадуссвас ссточечосає сесосУвеку. в ачстеесцсчч секссччао сассьсстасо астасосча ласо чечсеваеЗсс ТУ сосчоддаауч сссссчадто дасдачсвос асбоачьосса срЯзісатас сквсваєссь НД зчастссчстта азччассцвск саседсктуса счсвакааєс сцававзасаєс сскчусвоогу а савасчнаса чосуусуєас дчаззакаєч десяєоатаєт астдсясаов стае чає за? сгззвісва асаіссуцча содаугсасо вкчцечасоя срацсвса зв «к8ї0з 18 «Му МА чиїх РЕТ «2135 Ношо варівт «ЧчОйїх ІВ днрої1іе Сів Меб тн біп о Бек рого Бех сбеж їєз Беж Аїа Бек уа1ї Оу. 1 5 10 У ввроАха Чаї Тахо ї(е Тит о Сув Аху Аза бе біп білу лів Беє Авп Тер 20 25 зе їн АБ Ттротух іп обіп о цувовщо су цув Аів рто мув пев ої 118 зе жо 45 тут бту діа ЧЕг Бек ївб сіп Бех бЗіу уа1 веб о вех Аку рРпе Бех у 55. 50 дет біу бет бли тре дверовде тик зей тах ті Бек Євк рей зв ро
Ж хо 75 во із дюр о рре діа уаї Тук Тук суї біп обіп Тухк Бжшт Бех Бр Рго тн. 85 за зу їв: Ве сіу Бій сту жвх Був чаї Зіц тів Був дкч ТП оУжі Віа АТа спо 155: то
Еко весроУуаї ВКне Бі Біре Рго рго ВвгодЕр? ІЙ піп олзеєж ув Бек оажу. 115 125 125 тв АМа Бек Уаї уаї сСув йем ї-о Ави два пе Тук ро Ат Зі АТа 136 35 ід пу уві ЗІБ ОтТкв пув Уах Авр о АвБоАїа пеш бійовек Зіу Авпочек з їа5 155 155 лев
ЗУ бек ма1ї Тк бі: Сіп АвроБет Бу Авробек тНг о тух Беж цеб бек 155 178 175 вет тс Беу Тв без ех був дів звротуУуюК са мУв Бі був уаї ТУЮ 180 18 їй вів о сув. січ уді ТвЕ нів дів сЗРу пеп Бех деко рРшхо хХві ТИЖ Був Бег 195 202 та5
Не салі два біу сій був 21 «ВІЙ 13 «211» 885
«вів ОБЕтТ «2135 Нощо варівп «065 18 біз маї піп рем оуа! біо бах біУу с1іу сіу ре уаї Зіп Ро зу ЇХ х 5 їй 15
Бек цей вка їжа Бек Сув Аза Віз бек бім Бе таж РНЄ Бех бек тух хо ш ЗУ діа Мес бек Тгр о Уві Ару біп ді Рго сіу Був сту пем біц тк оуді з5 49 35 вах УВІ тиг о піу ів уві сіуУу Аа Твж туго туш вБго АБО Бех оМаз зуб о 5 о су Вкч оре Ток тів Берк Вка Аво ав бек був АБп тах рБенстує лев 70 те ва ств оМмес ве Бех цей Ахо Ат 10 АвБротах Аїв уаї Ту тух Сун дія. 85 о 35 вка тхропу Авроціц с1у ВБпе АБо їїє Тгтроолу іп Олу тат Меп мжу ї09 їа5 тій
Тиг Уві бет цех Ав ЯеУ ТНх ув ох вхо бЯех ма1і вабе рхо цвй Вів
ІЄ УВО їх
Рго век Ббед ув деко Ту бек біу сп1у ТНх Аза Аза Бе СХу Сув їе 135 із ет чаї пуб АБО о тук вБе о рго с піж рго уві ТвгоМві Нет тТероАвт Бек з1у 145 1508 5 зо діа цей Тих бвг Зіу Майї нів ТВ овпе Бко А1їа Ма) Без бІй бек Вех 1655 ї7о 178 «у би тТух Бек цец беж бек Уай улі ТикоМаї Рго ЗБ о БегоЗеюк пец 180 з85 150 бу тТвк Осій ТЕХ ТУЄ ІїЄ Сув Авпоувь Аве ЗіБ пу рко Вет Зп отих
Та по Я
Був Маі Ав омув дк Ууацх ЗІ орто Бук шет був Авр Був о тні нія тну
СО ЗЕ 220 сув Еко вто Сув Бга Аза Бо ід цез меча ТУ Біу Боб Бек уд) Бре ба5 ВУ 235 К 3, рес ва Рко то уз ро зу дви Тахо Пес Меб лів дет вка Тв ОвКе
ТАБ 250 55 біз хаї Зк Сув Узі Чаї Ма) Авроуяаї бек нів зі Аввобго С Уві й 55 27
Тув'рнє Авпотер отут тУа1ї двроспіу Маї сбіц маї Вів дав діа був ТЕ 75 Во ан уч рто Ата Зі суп біл отук Авпобех тах тТук АтТЯ Чаї Уві Бех паї 90 795 305 їжи Тех Маї фей Нів бій дер отуроієц дво обіу пув бі) тТук Був СУуВ
ЗО 10 з15 зей ув хаї бекон пу Віа перу Рго АТВ обто Щ1івОсСТів БУВ ОТНУ Хіє Бек
ЕКЗ за Ж пув'АтТа Був осіу біп Вко Ага 10 ро стіп чаї тут ву ей око срее 340 зав зва бек дхя сій с3доМеб тпт Був Ава бій Уві Бех рем тик Сув хви Маї
ЗУ зва за
Був 3Зіу Бпестут Бко Вех Авр о Т1іє Дів уаї Зі ткро біз Век да О3у
Зло 375 зано бів го с АБи АВ ТУЮ Пув ТЕ Тв РУ Ехо Уа) Пезч АБюЮ Бек оДаХ:
ЗБ ва з35 Зо
Зіу бек ве вре сіні ТУуж ех пує цем тс УЗ) АвВр обу Яви АкКч ОККО 495 410 415 іп біп б1у Аа туаї ЕБсес бек Сук бер обаї Месбонія бій Аза їжи Бі ак аши 439 двпомів Тук оту сіпорбув беї ре мех Пе» Бек БкЕс о біу Був 435 аз 445 «818» 0 «їх ОСЬ -212з ВЕКК -213х НЦото варієй «400м т
Зак о Тух Віз Межб Бек «пло» 31 «1 17 «Відх ВКТ «213х Нотос варієй «00» йХ чаї хїе бет вта їхробіу нів уаії Буд ТУ ух вла Акробех Уаз пуб ії 5 10 15
Ку
«аз йХ «115 8 «крах ОБЕТ «В13х Нощо варієт кедах а
Тгр щу двр осі ху рре Авроїіє ї ВІ «дп» жа «іх і «їй» КЕКтТ ст3х» Ното верієй «400 23 дкч АТїа чек бій бсіу Ї165 дек Або Тер єп ліз ї а хо «Й А кві «219» РТ
«Вій» БОощОо варієй «дз ХА зіу діа векобек бец сів оБих ії З «10 75 «211 З «22 ВИТ «вїЗ» Ното вартєй «ап а сіб Зі) Тук Бех Веї кивсрко УВУ ТПЕ 1 5 ха то «її 7 «їж ВЕКТ «йиї3з Ното зарівв. «005 76
ЗіУ рре Те о бБе Бек БЕК тує 1 5
«дій 27 «Уїїз 6 иа» ОРЕЖ «2132 Нато варієй «ой и бек о Аіа Ттросіу нів Уві 1 З «010» В «Щі В «12 ОБНт «йї3х Ноше варієц «Я» 8 тро а1у Аврошін сХу рре даю хі ї 5 «пі» ха «її» 7 «їй» ОРЕт «813» цебо варієй
«асп» 25 бЕКООЗіп сіу Ї16 бБет двпоткр х к «80 30 «йіїв З «айв о рВт «211» пою варієй хай» 30
ОІУАТа век 1 квїО» 31
АД ОВ
«ях» БЕТ «із» Ношо варієй там 31
Тук Бех Бек о впе ввоО Тиг ї 5
«Від 38 «Вії 197 «кїйз» ВЕЖ -2135 Ношо варіги «ви» СМ дЕр тіє іп Меї Тнпгоозів Бек орко БшЕ Зех пт Беж А12 бек Маї З1у
З 5 то 15
Авр Аку чаї Три: ІТе Тк Схва Вкоз діа бек Біп СіУ тіє бех вп о Тхр о 25 зо івн Ага Твоїх іпосСій пув орто біу Мпув дів Ехо Був їяи Без олів о 45 тух Зіу АхТа Беїг Зеу о пез бЗій Бех біу Ущі РІС Беж АкЧ вЦце бек біу:
ЗО З Ще век піу век о спіу Тв Лнровре ТНК опей ТБ о Іїв Бар о бех пев обіп Бго ва 79 та 88 піз ар оре діа Уві тук Тух Сув о біп Зіп тує Бех бЯех Ре Бус Тву 85 зо з5 тВеосВце б1У ЗІ сіу Тих Вуз уаї їй Ії Був оз 1535 кЕій» 33 «Ах» 117 «ВхУрз РЕТ каїаз Ното напій «Ой» 3
Сбіп Уаї бід їм хаї сід Бех фу Біж Біу ем ба іп рхо 1у ОїУ і 5 19 15
Бек зей Ак те бек сСув Аїа вів зе піу риє ТВх ріє дек беж Тух 26 6 30 іа месобек Ткр хаї Ата Сіп Аза Бко біу Бу З1у їйец бі Тто маї
ЗБ а а
Бест Ууйь тіє Зет Азв Тхо бі нів уаї мув Ту Тух Ата бвр бек Уві ва ек ай пу сту веб Бе тн її8 век одго Авр дай Чеж руб АБО отТвт беа тує 55 тк 75 ну
Ше сбіп Меси бес рес Ак лів ій Авротву Аїа уві Тух Туг був н5 що ВВ
Атіа Ак ткЕр бОТу дйвробіз п1у ре Авр оті Тур ЗІУ біпосбіу Тв мех
ЇЛО ії25 115 уаї тк Маї Бек Вех «єтоз За «8112 З кпвит не «аХі3а Нопо варієй «айо» за часвуссаца кдасосадад сесогстадс сстчадцсяасяв зсасачзсса бепкотозое 50 ацвостуса здчасосуацеса Уч оассочцскзе сесзччрасса чсадаавсса алхо часахацсаєс сузавстасє ваїсгакеус адсбісстссо Касазачсаа чесссавес но сессссацсз чокесодаєо соссасьсає стбассосда ссаївьаздсая сссповаєссе 845 чазчасттса сечсскаєта Беоссаусає баєбсвЕсвв гбосрассвос сгебовосад Зоо чі ассаваз псСсозаабтай в. зі
«аб» 35
«її ВЗ
«2322 ДЯК
«Віа» Нопо варієй
«ай х 35 садесчсває сччеадазаз сессдасччс ссдобусаас саадсдесяя вокасЧЕсо во азечзчечсовза сскссязавї рассссгаде азустастсза севассзоає зспесвавуєе їжо сечоесааоу чсобсодазев зчедацетоь аскретасьх заассаває свачеаєсає 180 четчасЬсутя ствачучеся СЕскассясє тсасасчаса актсдалава сасостатає 745 ссцпезаастк асадсстодся Єзсучазчає асучосаєзі: ебсавсосас чечсезааа Во часчзазавеь ссчасактувч чузссвачас асссьочьса садьбачесве а з51
«ВХ» 38 «21їз 1 «в12з РТ «В13з Нопо зварієп «4002 з5
Аврогле білдомеї ТІ сСіп Беж біс БЕЖ беж Бео Бек Аза мех уаї ху ї З 15 ї5 авоОсАха чаї так Її1є ТВ Су: джУ дув беєс віп сіу ї15 Шех два Тго 72 в зо пе) Діва Тер отук шви сів Був Риб Біу бує ВБіа рто Був Сем оївц Лів з 40 45
Тук Щіу Ата пек йШех пе) Чій Чекобіу ді роз Бех Акя вве бек сі1у вЕ бо
Зах піу век ошіу Тпх Аввобоє Тдт ом ТИ т1е бех бет пев бій вБго їз то 75 о зів Аврорне Аза уаї Ту Тук сСув о саїй біпотук бек Бек Бе ро ТВ 85 що 95
Тих вве зіу бля сі їпЕ ру аз біз фі був Агу Та Уві Аза йтя ї0о їа5 ї10
Рто Шет Хаї жїпе о Хія риє вгору чес Аврозіц біп Ппей БУВ Бех сіу 115 129 їз5
Тих діа Бех уві Уаї Суд цей Гей Авїй депоРйе Тук РКО Втхч бій А1а і35 135 140 пцуз уві З) Тор опув У! Авроано Діз тей біл бет біу ДвпоЯат Зідй їя5 158 ї55 тес
СКЗ Бек аз Трх сій СіпоАвроЗек ув о АБо Бех тів Хук о бет цео» вехг 165 ї70 175
Зех ТИЖ Пец Тк іі ех цу вів дир Тук Ід рув Нів гув Уві тує 80 185 за віз Сув біш'уаї Ти: нів пі Бі БЕо Бек бех Рго Уві БЕ пуб 58 495 210 245
Упе аАви Ата оту ій Су 210 кам 7 «8115 447 «йіїз БИит «шіз» лото варіча «00 біп Уві біястївцй Чаї бій оЗек іу Біу Оу гей чаї біп Вко о1у щу ї їй 10 15
Бек це; Акцоре) бех Суб дія А1з бяк Зі риє ту РОБ бет пек тух 29 25 зо
А1їа мМеї Бех Ттр уз1 дія сіп дій руб о Зту ув сіу це) бід о ткроУа1 ет Ууаї Ії Яетх дів Тур обіу Ніво Уві Був Тух Туг Аза Авровех таї
Бо вЗь 5 іїУв фу ка Бпе Тьх ті Бек Ак Ар бяп Веж цув АБи Тих Бей туг 7 75 о реч Фій Мексдєп бех меб Аве 15 ЯМ Авротне Аїа баї тує Тук о Сув не о 5 із ака тЕрозіу Авв сіз с1у Бе Авр оті ткросіу біп з1у тьх гех хо а 10 чаї тв уві Зек дек Аза Бу Тахо цув пі Бто Бек Уві рве Бо цей 115 120 125
Аіа жо Бек бБеї Був бБег Тож Беж щу бі ЗвЕСАТа дія їж соту Сук їі30 135 і4й їжа мя) Був о Авр оТух ВНє Бо пли рто уаі Тнпх Уа) бер ТТ АвБповекх 145 ї50 І55 ТЕ ст Аїх бе ТП Бех сьу уаї Нія тк Бе Бко А1їа Уаї рей хе Зах і55 то ї75
Бех Зїу рез Тує Бек Бей Бех Бех узі Мві Тйх За! Бус Бех бет Бех 180 185 1580 їжа Щ1у Тк біо Тв Тук 116 Сує дей Чаї Ав Ні був ро сек дет 355 хо тхп5
ТБ Був уаз Авр о Буз Аге туаї січ во був Зах Сув ввр Був о тнх нів 71 я 2 бас Су РЕО РЕо Сув Ро АїворЕсо бій їх Без З1у піУ Рго Бех узі 355 230 735 245
Внеосїпец Бне рго БкКо муворго був дер Так їв Меї тів Бек Ака те ах о п
Бко зі уві тво Сук уаї уах чаї АвроМаї Зек Нв обі Авровко 3 во 255 270 туаї пу вре- АВ Ктротук Ма) веробіу узі бій Уаз вів дви Аїн бук та гне за
Тк цпув орго дка біз З1ц сів ТукоАщп бех так оТугє дує маї маї бек 290 255 вай
Таї Бей тн Ухі рез Нв шій АБротер оцей деп о Зіу вув озій тук Був зов зло зі а
Сув дув уаї ех давл Був о дія зей фко Ат Бро Ії бід пу тис зв за5 я ЗЕ
Бек Пук Аїа Був СІУу бСТв бує вк бій сорке Біп Ууаї ух ТИЖ ей вто з45 ув зо тко Чер о дхга сбіз Зіц мМеб тн оцув ДЕ біп Маї ет пем тн оСув їжи за зва За чУуаї мує ЗІУу рРпе Тух РКО бек сАвроїзе АТ Узі сь тур обі; век оАва а 375 ЗВО піуУу Зіп ре сів двлодеп Тух мув Тахо ТВЖ БЕО рго Уа) цен одер швЕ зва зо зав дО
Вр озіу бек рре Бцє Пез тук Бех Був пен о тву узі Звропцув бегодує от ву 415 тЕр бід бів біу дво чаї бе Бех був бех Маії Месснів арио Авіа пед ко Ал 430
Ні ав нів Тук ТВк бій Був бах бео оВеу Пе бек Бжо З1у пу хх ав ут «ваз й «й115 5 «Вій» ВНТ «2135: Нощо Барівцй «або ав
Бех Тут Аіа Меб Бех 1 з «-83П2 39 «Вії» 17
«ти» ВЕТ еВ1З» ното варієй «ї9йз за під тіє Авц оЯет бін бЗіу був Зех Хпє Тук Тут Віа АвроБеЕг ХА Був 1 Б 18 15
Оу «МІ» ай «и115 В «дій» РВУ «2135 Ното варісп «30» 40 укр обі Аврозм: З1у це двв отіє ї 5 «піз ду «ді» М «125 вНЕ «213 Нопо вБвравп
«фс 51 дгч Аза бек біп біу її8е Бех Анп Тер оїечз Аїа 1 Е 10 «ТО а ка ОО «1?» РЕТ ких» сНОото взвріт «АП» а? с1у аа Бек беж Бе; сій бек 1 В «обр» 4 «т 9 «213» рЕтТ кдій» НоОошто Бархепй «ай» а сів біл отТук дек Ввк Рве Бо ТвУ тн. ло З
«АП» ай «її 7 «ій ОРЕЛ «гії Нотмо нарієп «002 «4 ру ре Ту Бре Бех одех Тук 1 5 «ід» 45 «я 6 «ут ВЕТ «813» НоОто вврієп «абз же
Ав беж іп піу МуБоват х З «Та» А «яз 8 «йі2з ОБЕТ. «213» ЖНошо ваЮїер
«бах 45
Ттр о З1у вйвроЗБо с1у Рів С Авроїа ї х «ТО Я «ВО «Віз» рЕт «2ї3з Ното варівй «00» 47
Бву п о Ожу діє бек АвпотЕкр ї 5 «Ех а київ З «Е1бе ВВЕ «їЗ» Мопюо варієц «8002: 48 оту ва ек 4
«10: 43 «Ж1їз Є кхній» ВК «2135 Ношо вартец «пй» а стук Бек Вех Рпе Рко Таж
М зх «ВТО 5 «їх ній ВБЕТ «РК» сНошо бартвт «00» Но дер о'тіс сіб Мес тТипж Сіп Бек рхз Бех Зеї Це век АТїа Бех Уаї соку ї 5 хо 15 двродко хаї Тах сів БлЕ Суб Ага Аза бег біп біу їЇї8 бек Ав оТер
РН 25 Зо їн Аба Ткрожух бід Зіп му реко сту Був да рюз був с веч гей ТІїЄ да «5 тук йЗ1у Аза Зєк бек бео сій бех щіу Уаї Бо беє Вк Брав Ббег зі1у
ЗО 55 50
Бек Зі Бех сту Тих о вар рре ТМНЖ Ми тв Х15 Бе бех Бей обСіп рко то 15 ко сі» Ав оре віз Уаї Тук отут ше зЗібй стій Тук веж бек риє бує ТВк зх 20 5 тах вче діу сп овіу УП Був Уа са дів Пух 190 155 «10 51 «їх І? «Ві» ВВЕ «813» Мото варісй «ай 91 сіб таї с3й о цец мі б)ч Бег с 1у віу с31у рез ув) бій ро ОЩУ щІ1У 13 З 19 15 бек еп АгаЯ їєц бек о Сув йіо лів Яех біу Бпесотве ББе Явоеобек Тук
За 5 З
Ата ме Бек о ткр уві Аху біп Віа вко біу був 'біу цем сів тв оМаї «0 45
Яек Ата се АБП Чек біп о б-іу цу Бетх ТП Тух Тук Від Авр о бек Уаї
ШО Ва во
Пуз 51у Аа Бие ТНК тує Зег Ака обер Ана Зех дув ВВ б їв тую вк же 75 во їПемпобсівп мес: Авп бек гей Аг діа сію АБротнж дія уг1 тую тух Сув ак зо вв вів Ага Тер осіу двр о ЗіМ ЗІіу Бпе ово тів ТюЕр о біу шій соту ТВЕж Бе зай т05 Іо тУаі1 ТнЕ Уа)» бек чек 115 низ» За жАМІ ЗИ
«пійж ДЕК
«733» Вопо зарієй
«400з БЕ часатссвуз ссасотадвна сесзгстаде ссзадсісяа зсасоадевза ссобовоаосо ри ассасскуся чдадсдачесз сзабагоссх вассдчесяя сі чарасоа ясадаассса 155 тзсавазсас ссазастакс сасітасуче зеБЕсусоБЕ їдсвазоусцо сбасрсесавоо їни сеттсаде даесссадайт ссосастуву сггасстстроча ссасєсзуєсая ссбсавест 249 звзачасессса сезєсвасса ссчссазсвн басссесосе Єссосгассас себе часса за зчзасасчнава сСгсвавосава а Зх
«рій» са
«Ті ап
«йрл» ОБНЕ
«2135 Ното зарівт
«ас» 53 сацисяасаві Есасодавач садсачсосс сіЗОБасвас сузщчсчоасаз ссвасахеку бо ацсокесчечу сскссачвес хасссесаче аспстасЗсча счадсєеечс чдедосвачес 70 посчадавЗЗу дЕсгсувостЯ дагдачсост автвасеЕскос взузчсєваяьс Кастверкає 180 чекаакссту єсаазцучися ССрсассатс ссасосзаса асссвадава сассскдувух. 7489 стосвайкча вогцеєтаса сосезавоає асезссово асезеспсяс чсаседаЗає 305 чабсчазаясЕ ствзасаєскч сдодссазчас асосбачесдю сеУскачсво са зі «ЕОМ БЕ «й» вій кій ВНТ «813: Нота ваЮруєп «а» БА їврот1іе'сів Меб о тьх бія Зех ро деу бек реє Беговіяа Бех уді ду ї 5 16 я
Азр о Ахз Ууаї тих хіп так Сув вжс Аза Бех 1 бі 116 Бек Авйотеф 20 25 30 цем діа Тгр Тукобів Зіпогув рРто Ст1у Був діа Рко Пуз їеч Пец ше 2 45 тук с1у діа Беї бек Пец с3п обої у уаї ро Бех АКчЧ о РБЕ ще Ку
За - 0
Вк б1у Веї З1у тпхгодвровне тіж опец тТпк Т1іє Бе Беж бе БІ Рго ви Я 75 во сіз дер ве Аїа узі ту тУуК Сув бій сіл тук Зеї векорНе вхо ТНУу
ВУ за я таке овнесосіу Зіп бу Тик Був Уаїф ЗУБ Ліз ув діб дк УВІ АТа АТа 106 105 110
Рко Бек Уаі рре їХе рРре ко рРкро- век Авв от: Зп Пес пцув Бек З1У 115 шйО їй5 тпу Аїа Бек уаї ові Су Бей де) дя Ав Бає тТук вхо Вк сі: Віа 130 135 120 пу: чаї біп Ткр оБуз Уаї бер Ай Аїв рей осію Бек обіу Дай овех уп 155 155 155 їв іш свєх тах тн Зі пі»сАБр бек був дер о бет тат Тує Векссвп вет їв 179 ї75 беж тнЕ реп те печу Зех Бу Аїа Авротук сій Був Нів бує УВХ ТУЮ 382 185 180
Віз Сув пі; хуаї те нів бів сіу пед ояЯек Беж ро суві Тасобув Бех 195 220 оо
РресАви Вкч с1у зії Суб 210 «їй» 5 «в14хв 547 «Рай РЕТ «ВЕ» Ноййю варієп «ай» 55 сі маї сії сєм маі 10 бек о сіу бБіу біу цез увЬ ій ВЕС ТУ ту 1. З 19 їх
Зек їй Арго оїей беє був діа Аівобех Сб1у Бе тт ре бак Бехг ТУук хо 25 30 віз Меє Бек Тер Ууаї ВХ с3п дів Бро біу Був біу Ме 53 ТсроМаї 4 45
Бах фа 112 АБпобВек сів Зту Був Вес так Тук о Тух Аїа АБр о бек чВі1
БО 55 о йпуз 5іу Аха реє ТЕ сів Бет аку Авр од Бек опцув Ав тат опе тую
Бк 7 ть во їех бій Меїб Аз обет пев Аку Аза сій Авроїпх Аза уді ТукоТук сук де во 5
Аіа Ага ТгроЗіу Аврозіз З1у впв о Ар ге тро З1у пі Зіу Твкотрей 02 то8 132
Маї тр Ущі дех бер Віз Бех Тзх Сув суу Рій Бех Ма1і Бпе рий Сей 315 120 тв
213 рко дет обек Був обЗес Тк Бех зіу біу ТБ Ата ліз цер) Зіу Суб 130 135 145 із Уаї пув Дер о тТук Брє бто Пі» рто Маї Тзкоуаї бек ТкроВвл дек 145 150 55 зай зі віз пе) Тахо бек біу чаї НівотТиаг Рре рго діа Маї Гей Сів Бех 155 17 ї75
Чеє му пеу Хухк веж їз Зег Бек уді уаї тах Маї Бк бет ВЕЖ веж ї1ва ї85 480 пемосіу Типкобіп ТЕЖ Тук діє Суво Ана уві Меп овів був Бк бек Ав. 155 00 205
Твж рув Узі Азр пу Ася тай П310 ро цув о БекосСув йврогув Тах ів 18 ЗіБ 226
ТЬЕ Сув Бко РібоСує Еко дія хо біц бе ошбей діу сту рго бек узі 225 230 35 245
Ейе мей Бра рго Ро Пує Ро пув Авзр Тих ей Меб Іі Бек Ака Тпх ва 25 255 то біз ува) тних Сув уаї мі Уаї дер уві Бес Нівобіз АБО ро 1 269 255 то
Уа1і цув впе дБ Ткр тТух уві Ар сту мап Бо хі вів АвповІа Був а 250 85
Так омБув Рго дж Вій ст бій Тук дб Бек ТЬс тут одкчЯ Маі Удії Бек 80 З5 300
УЗ ев тих уаї цес Нік біп Авроїхроїец Аво З1іу ув Зі Тухобув 305 зі 315 ЖЖ
Сув цув Уа Бет Ав БУВ Аїа без рго Аза Бго 118 ск цуз так отів ї25 зар зав
Бек цпув Авіа Був С(1у бій вто Ака Зі Бхо ідо уві Тук ТЕ Гез. Бко 345 4 359
Бто чек одро біс оЗро Мес тТну ув Аза зіп оугі Бек ем ТвЕ о Сув Бе з59 зей звЕ тах був З1у ве тут бто бБет Авр Це Аза укі біа ТКроБіо Зах вв 870 ал з8ао зу сів вко сли АвпоАБИ Тує був Тит ТНК вВуб Бк баї рез олвросве зв 390 395 300
АБросіу бек Рцпе рРпе цес тТух бек Ппув лев ТВх чаї вБр обу бек Ахв аа 419 15
Ткр бів бій СБУ Авд Уаі рБе Заг був о Зеї чаї Меб Ні бі Аїа бе ай 455 «35 нів'Аши ків ту тнє бСіп їув ек їв) Чек реч век Бро щіт Му і35 дай 45 «ій» 56 «Зм Б «ій БЕТ
«213» Носто варієй «чашок ЗЕ
Вехт Тут Вів Меб Бег 1 5 «йїй» 57 «Вії СК «2125 РЕ «йїЗх от варієц «аз св хмаї їі Ав ро Бек сіу ані РНе ТВї дви Тут Віз Авробек уді Був ї 5 б 15
ТУ
«їй» Б «и1ки 8 «Вій ВУ. «ші13» МОто варієї;
«дай БЕ тТхр о аїу двр Зі СІ рРБе Аво їїє 1 В «710: 59 яхзїз лі хиїй» БЕХ. «2ї3в пото варієі «й са дта Авіа Бек біб З1у т1іе Бех АБпоТкро жи Аїа і 5 19 «10 Бо «ВЕ «таз КЕ «213» Ноше варзівн капйх 60 су ліа Бек бек ге стїх БЕХ ії В
«10» Б «112 З «Війх ЖЕКУ «8213». Войе варієпй «аб» ві віл піп тую Бех Бек рое Бр тт ТВ
ХЕ 5 «8305 5; «тії «лих ВКЕ ях» ПоОшо варієй «ай» 8 зуу с впа тих РЦце бек бе тТук п 5 егійв 03 хх1Ех «Війх РЕЖ «215» МОоше Барісєй каппж 3 ап орЕо Чех 51у АвпорРНа х З «2ї0т- Ба -Ж1ї15 В єВ3б» ЕТ «213» Но вархеи «Фах и тр обБіу Аверобій ліу РП АБ ТІє 1 5 хо» БВ
У жае «а1ідз СрРШЕ «ЖіЗ» Номо зарієй «Айова бек Оп сіу тліє БЕХ Аеп Тур ї ЕІ «2102 56
«21їз: З «-и12з РН «135 Ново варієт «4005 55 сіу та ВВЕ 1 «210з 67 «11» 5 «від РЕ -2135 Ботпо варієп «ай» 7
Тук Вех Бак Бпе рко ТВЕ ї 5 «а10х 68 каз 107 «212» КТ «ХіЗз вожо Баріє! «Або БВ
Авзр ї1е б5іп Мек твг обі Бек Ро бек бех їн бег Афіа бек уаї П1у нЗ 5 1 15
Аво» вка уаї Так 118 ВЕ Су5 АтЯя віа бет сіл с01іу хіє Вех де» Тер 7 25 зо тем Ава Тер тує Бій піп Був Ро сбіу Був Аза Рко Пуворим цем о Хів 59 5
Тук піу дів Вех Бек без сіб Бех с1у Маї то бес Ак Рде бек Щ3)У «о бек слтіу ше біу ТВ Ар оВле Тпх рей Тпх ІїІЛе бек бек лес з1п вКо е5 7 тв У сів АвровБие вія Маі Тук Тук був СІ Ей о Тук бек Ддех Бвя рко ТБх 85 за 5
ТЕ ОБпе біу піц бу ТБХ Шув уай біб тіе Був в їв
-01йп2 59 «еЄйдіз «102 РЕТ «213» Ношо вавієт «ой же
Сіп Ма1ї сій рей Уві біз Бест біу Зі (іу рез Чаї бів орто бі 1 ні ГЯ 16 ї5
Не їжи Аа ей вет був дій віза Бех зЗ1іу ре таж рОє бет беж ук 85 за віз Меє Беї тТкр уаї Ата сій аія рхб обіу пу БІ пе сі) Їїхр тах
Бек Ха) ї1е Авіа оБуо Бех біу деп орла ТИХ Авп Тух віз Авр бек чаї че йо цув біу дка Бе тнЖ о тів ВекоАжо дер дп чех Був Авп ТНК Теги ТУуЖ ке 70 7а Во
Ппемосій Мес Аві бек Сеа ВкхЯ лів біз Аво ТвВУ вів Маїс тух Тк су в ва зе діа вто Ткробіу авр обі: 01у рРне Аврої1ів Тур 01у біп зу Ту їй 159 105 410 маї тк оаі бек Бег
115 «-йій» 70 «Віїз 01 свій ДЕК «213з Ното зарівтв коп» 70 чакакссадеа гзасссвавч сссзестацс сечацечсза чсзсазуєза сезвсезасе 55 аквассссса задсчацеса чзучсассєст вяссоосскау седосасся дсаудавоса ї2о рсваацсає сяваасваєь вабствкосо чсЕвевСссе садсаавосад пуссссцьсе 186 сассстачся ссістусясо садсатсдак КЕбасоссоа сстатсадеач собасаассх 40 чаацуастьхч суаїєЄтаска бЯссвасав беврсусисю Брсстассає сссбаЯссау 350 чацкассаваач ксодаваєкяя є ах
«ах «РІ.» 35 «жа» ДНК «яз3з Ното керів «вйп ті сазчутцсянах г3асосзаво сузодустзс скечсЯсває соочовдасач согусасссо ви ацсрасясоз сссссоадаое бассітсадс адстаслеса єчадесЯдах дезссаачес їго сссздчаазо з-сгесЗачія асезазсчсе ассвакссів стозсавсет інссвавкає їв чесчастекч ЄСвачуЗвеч ссстапсвес ссасувазеа асісдвайаа саєсссувак зо севсввасча асвосссвдсЯ сусозоааачає зсуадссясчє астайтосуєс чечеЕеУЗУЗЕ Зоо часдачзчцЕє кави ВЕссЯ Зудосаваче асоссядкча очарратесо а 351 «ЯТОз 7І «Вір 214 «г12з БЕЖ «їз Ното чаріенй «ца 7 дер хів біп о Ме Тву бір оЗет Бко Зетс чЧеж пен бек ВХа бек Уаї 51 1 5 410 15 вер Ага уаї тик о уіе Тих Су вх Аїа бек оЗіп СТУ Їіз бек вва оттр 29 25 39 їем АтТа Тур Тук бір осів бує Вко біу пув Аза рРуо був цво їй її
ЗБ асо ах тут б)у віз Бет Бек цем С1п дет Оїу Ма! рто бек Ах пе дек щу о ве бо ек З1у Яет Сіу Тит овяр Бе Тк бей Тв ІЄ дет Чек їй біт бо 78 75 во ім оАвроБпе АТ о Уужі гук тТук Сув біп бій Тук дек Бек о БЕпа руо ТК 85 ЗО 55
Тк Рпе Сіу Я1подіу ТБ о їув уві Зі Її був Ах Тррома)ї іа Аїа лов 185 її руо бек Уві БрБ ІТе Ре Бго-орко беж Авр о (1й ЗБй їюлі був Бех бі нен хо 175 тржх діа бек МУаї у) Сув рей бец дап АвпоРПе Тукорхо йха біз лій 130 155 8
Був 81 піп Тер озув УЗі АвроАва іа Пенозівп Бек об)іу Авп дах бій 145 їі Те хо бі; ет Маї Тк Зі біп дер оБег чув Ар Вех ТНК отТук Бех веб дет 85 175 175 ек ТК пем їТБк о гец ех був ака во Тух сім Гув Нів Був чаї Ту 18 хх 199.
Аїа сСув'зіш Маз тру нів біз Зіу Бей бек Бех вВко Уаї Тл йув ее 185 го 255
Рпє Ави дка З1у СТй був жо
«ай 7 к«йїї1з 547 дій» РКК «313» НотшУ варієп «ОЗ
Зійп уві З1іп о йезч Мяї сі» бек Фіу біу зу Без уаї бів Рго Біу 01у : 5 ря ї5
Ват ппео Акч Сес о Век Су вів Аїа Бек Зту Ре тні Бере Бех Бех тує та ХВ 20
Аїа Меє бек тр Уаї Акч іп вія РЕО Ху ув сі пей бів трроУуву щи 45
Бек Уаї тТіє дип обрхо бек 5)у Авп огнНе Тих Ап тут Аза Авробеє Уві що ах во зув біу Аку РЦе тТну КТуе Бекоджу АвроАБи Бех Був Аза Таж Бейотую 59 75 у во
Оецобхп Меб АБпобех тей вка Аїа 5З1В о Авр тк о вАте уз) Тукотук пуя
85 що 25 іа вху тур зву Аа Сів сьу Ра АБрот)ів хр об1іу біп сіу хвх отой 109 їпб 10
Уві Тех Маї дес бек діа Бекотпк Був о бЗіу вхо Сех Уа1 рле бо їжи
Кто ко 5
А1їа Бо бек Зек Був Бех Ті о бжшх Я1у сіу ТВУ Аза бі пей бІу Сув то 135 1Ай їн уві був АБротує РВє бро бім Рго уаї ТНу Ма) бек тур Ав Вех 145 ї5О ів Іо пі вла ства тТву Бех обіу уаї Ні Тв Ра орко Вів Ууді йен о бтвоБек
ЕКЗ Ето ї75 дек о1іу фей Тук ббхж без Бекобер уві Уві Тк уаї рко бах бек ех ів 8 і50
Іжеобіу Твк о зЗій Тйх Туюк їі Суб йвлобах бо ніво був Бо Єву АБИ ів5 шо з0п5
ТПгоСув Заі АБроБув Агс оуаї ЗІ Вко Був Бех був о Авр о Був Такопів о 235 225 ту дув рев руб був рес Аза рко січ пе» їй БІ бТіу хо ех Ух ау За 835 245 це вецп р о БгОо Ртосрув РКО Зув Авр ТК Бей оМек Ті дек вк ТБЕ
ЗА ав 55 кто От уаї тс осСув уві уві Уві дер Уузау бек нів 1 дЕе ЕКО 515 27 яв та чві Був вве АБ оТтротук уві дво ЯМу баї сі) чаї Бів'одви піша Був 275 280 ве тню був Вхо вро Бій бій ій тТук вай бек ТИ тує Аг чаї Чаї вет во 5. з чаї мез тВх Уа) де: нів оЗіп о АвротЕр оБецовво Зі Був БІ тує Був з3а5 зв 15 ЗО був був Уаї бек Авп Був Аза Мей хо діз вБго Іїесбій Буя Тик: І1е за5 з39 зза
Яєк Був діа був 23у Піп рго Ах біз орто бій уві Тух Таж пев овБка зчо зав 355
Бко БекоАхе сіб зі Меб ТНК опцув два оз уаї бек лем ТИХ Су Пе 355 зьо зБ5
Уві був біу ре Тує вро ех Авр ї2е АтТа маї бі тер обл Бек зва
Зо 375 зно сі бід оБхто бБіц Ав ЗБлотут Був тре пк Роб Бко таї Бей дар вет зах зза їз 400
Авробіу Бет рве БКе Пей Тут Беє цу їз Тс ат АвВробув Бех Аку зах 10 аї5
Тер'оків зів оху АБ Уа) рРМе Бет був Бех оуахє Меронов сл; Ата іо а2о ав 450 нів Аа Нів тух ТнЕ біп Був Беж їм Бех їви чек вБко сіу Був
Аз5 449 445 «їй» ЛА «ВАї2 5 яйхит БЕК «ха» Мото варієв «ай» 4
Зєї Тук ді Меї Бег ії 5 «7103 75 «тА ТЕ -232» РТ «Вії» Ното зарієд «Нм
АБ ТнХ бек рхо ї16 біу Тут Три тТукотук с АТа сІу Бек Мі Був діу
Е З 12 15
«2102 76 «пз В «ЕХ» ВЕ «33» Нощео варієв «4боз ле
Ттр азу дер ста бІ1Уу вРпе дар оті1є ї в «Вій 77 «птїж 11 «ві2» РЕТ «8132 Номо варі «ай» 77
Ага Кіа бек біл о біу І1е бех Авп отТкроїєс ВТ 1 5 15 «шЖьОх 78 «БІ 7 «12» НЕ «ій НОшо варіви
«апа» ОУН п1у Аїв бек Бек їй СІБоВевх
У 5 «Фіз СЕЗ «екз З «ей» РЕЖ «533» Нобо зарієй «Я»
Зіп зів Тук Бек Бек риє Рко ств ТВЕ 1 5 «ії» Я «хтів 7 «аїйх ВЕУ «-е13з Бопих вжурієті «Ап» ВО с-1У ре тах ре бек ес Тук 1 5 киїб» Ву «8312 5 «315» РЕЖ «213» Нота варієй «403» Ві
Вет кб ї1с фу Туг 1 В «ВІОз 82 «иїїз В «Ай БКТ «2ї3х Ноо варієй «А» 8
ТпТЕр сту Авр бів З1Уу Ве дЕроІтїе
І з «210: ВЗ «Ж1їз 7 «212 РЕК «хів» Нота варієп «аб» В
Зек зіп боту лів Бек Авпоткр
З в -28102 88 «21ї2 З «Вій» РЕТ «2її». Бойо варівнп «4005 84 51» віасвех 1ї ких ВЕ квіх» Б «афдт РК. -813- Ното зварівл «Фа як
Тух бек Вексрде Вго тах л 5 «йіаз СВБ
«й 147 «таз РЕТ «8135 сНеоше варієт «а0ож Б
Авв їїє Піо Меб тп біб бек Ро Бех Бек їеб дек Аза бех хаї 01у
З є 10 ї5
Авровжха Ммаї ТВ ї118 тТпї Сув Ах А1а бек бів» біб ї18 бек одАвй їхр ях
Печ Аза дхротТут ЗИ бій овув реа Му Був Аів во цу рем о гва 216 з за а
Тут віу Аїа Бех бек Гей біп бек слу уа1ї Бко Бех Атч рНе Бех ду ва 58 5
Бек пу Бех сіу тТагоАвр о РВе ТЬЕ ви ТВ оїїе Бек бек рей білого 79 т. 85
ЗІЗ Ав оре Ата Ууаї ТУуЖ тут Пув змі бій тух бек Век рРБаесрхо Тих ів а 5
Зх оре аі1у біз щ1іу Тк груш Уа) 035 Ії був 120 та5 «2105 87 «Віїж її «вій» ОБЕТ «2135 Бопосвархет «ах ОБУ сів уаї біт реч Узі біз Вет бзіу З1іу сту бей Уві бів бто Ту З 1 5 10 15
Бех їє» Ата Тем» бек Сує діа Аїа Бех с1іу Крестпт ве бек Бех Ту 23 25 35
Аїа Ме: Бех ткромаї аха зЗтл Аза вро спіу зув'єїу цей зі ткд хУаї з5 40 ав
Бех Аві ТвКобек Рто Хі сіу Тух тиж Тук тую Аза З1у бет Маї Гув за За ваг
ЗіусАга Бе Твт Це Бех Ака Ар АБИ онек Буд дво ТВх Гемотую щей 70 т «о сію Меб дБ БЕХ їй Ах Аів о зій ЗБротлЕ Аха маї тує тук Су 5іа в. зва о
Ака тЕр сі Авросіц сіу рРце Аве тіє тр обі сід осіуУ Тит ем ом їпо 105 Іс
СЛькомаї дек дек 715 «піп» 88 «йії» ЗЕ шій» ДНК «різ» Ношпюо зарієїб:ї 0» ВЕ часакесава содсссацчаф ссесоєскадчс сгоаусасяа зсСогччеасза всоагасвЗасе БО «ткасстчсв чачсзачеся сазтактвсс взаттууссоя скбугсасса чевсаавеса їх часваацчеат ссвааставс вастеавачу побсескссо сусвазусаа ечусссавае 180 постстасез зсессззаво судсасічас собасессссв ссаксачдсаз ссрчсдасеї 249 чавчвссссЯ созкосаєса сбуссаєчсау сабосєкске ЕЖжссрастає сереєдоєссва зоб часасчазвиа сгзазаєсва а З21 «їй» в -Віїз За «іш» ДНК 29513» Нота варівй «Ох я свачечсває сгоссодавзач содспасячє ссдабасаво содледусво ссбасоссга а аческусусця сесетссучасе гассбсссазу азстаєзсоа ЄчадекузУє чодссавчсе ї2а сстлоузазчЧа явосгопацса Засчаасває асубсвсска СтоасеЕвасас сесзевакасс їв дасссвзсва асоЗссУсе сасоваЕссса тсусоасваєс совававсяєс себубБасссс 243й сзвавсчааса чсссясуспи зчаачасася сесобасзс аскусуєчся бечачасча з00 чачечівЕсо «бархсачає ссваучсаєс ссцагяаосч ссачевса за «10 50 е«ЗБї» Ята «ит» БКХ «»1ї» оНото заріва «Оп» за
Авр її Зіп Мес Так обіп Чех Бко бек дех лей бек Вія бек хві іу ї Е 10 15
Авровка мах ТНх її: тБе Сув дк Аїв чех біп б5іу тів Бех Ав Тур за 5 За печ Аїа ткрротух сій бі Був жо біу Був діа Бгбобув сем Сей ге
Не 405 25
Тук зіу АТа беж бек без бів Бех ру Маї рхо ех дкя Рпе дек у зу Зо 65
Чекобіу Яек піу тп вро рре Твк рез ТВ Ї16е бетобех ем п) ро
БЕ 7 те 30 сій авр оре вла Уа! Тух Тукопук бл о ави Тук Зк ех Ре ко Тс 85 за ЗЕ тв ре піу Зіп сіу Твсотув Уаі іш гі Був Ак ТНгоуаі іа діа 159 05 110 хо бек маї Рів 112 Рре Рго Бко бек Дер Сі бій рец бувобек Сіу 115 120 25
ЖЕ Аза Вег уаї Маїф Сувобви ей АБ АБИ пе о Тук Бу вка ча Мі 135 ї35 їйо
Був чуаї бій тТко о Був уді Ар АБа діа ба Бій бвЕ бОїу деп беж сів 145 а а те сто Бех Уві ТЕ біс біп АБр обеє ув АБО Бек ТпЕ тує Бек о ген» овах
ЩЕ 170 ї75
Бех тТВжЖ Бей Ток опе бен рув Аїа авротух біз Був ців Був ха) Тук хво ця 130 діа сСує Бій Ууайї ТвІ нів Ох5 4іу ев бек Бех БЕО Уві ТНЕ Ппув Бек 135 ог 205 те Авп о Акта 1 ід вата хо «вро «Бі» дІВ «12 РЕЖ «213» Кощо зарієті «адаз (В спів сві Зі реч узі бі Вет ЗІу 1у Сіу цШео ущі ів рко сту ту 1 5 їб 15 ек опез Ако їз бек сСув діє Аїа бек біу Рпе Тр оБре Бер Бех ТУує 20 25 30
Аїа мес бек Тер оувгі Ак Зіп Аза рко сіу цувосоїу Бей БЕ Стжр хай з5 49 в
Вех Аваи Так о ВЗет бто Хі с1у Тух тах о тух Ту віз 01у Бех чаї був
Б 50
СІМ АКЯ РБе ТЕ х18 Бек Аха Вер АБИ Бех Шпук Ав ТЕ Сем хух тей то 7 о іп Меб деп о бет о цей до Аза хи АБО отТВк Аза Заї тує туї був БІВ. 85 зо з5
Ах Ткр о З1іу АвросСі) п3)3х рРНе Авоу 1е тТюр сіу З1іп б)іу Трх цем о Ууді їжа 105 11
Те Уві бех ех Вів бек Тк Бу ПТУ Бко Вех Уаї Ре хо Бей дута. 115 128 125
Рко Бех Зег Пув'шехг Тнх бек сіу біу їБт Ата Яїа ей ЗІ1у Сув зе 130 135 140 чаї пу с Авротух РП МХв ід Био Мві ТП Маї Зв ТЕр АБИ. Беж 1у 145 хо 155 169
Аїасьси тНж чек бі Маї нів Тнт Ра риє Аза чаї Пец бів бек беж 165 ї7 ї75 сіу Без Тух бек Сей бек Бет Уаї Маї ТБ оУаї Бо бек Беу Бех цей зва 185 їз0 йіу тТйх біп тпш о Туг т11е Сув Авп о уаї Ави Нів Зув Рхо бек Ави ТВЕ 135 20 205
Був уаї Дер огув був Чаї щіз рус сувоБес -ко 5 «920з З кахі» 5 «ай» РАХ «713» БоОоше варієй яаойн З
Жек тух Аза мес бек
А 5 «вібь о «41» 17 «812 РЕТЕ «-213з Мною зарієв
«400з 33
Уві ТНг біу Аза уві б1іу Ага Бех Тйї тую Тук Рюка АЄВ бек мМаї цук ї 5 12 15 сіу «ЕД Зх «йиМі 8 «Йхвх ВЕУ «З НощМо зарієй «800з за тк шІУ дер біз біу Бе двр г18 1 5 «»10з 95 хиїі1» 11 «Бій ЕТ «13 Нопю варієт «400х. 95
БкгЯ Аіа бек бір с1у Її Бек дви ТЕр о Пеловіа: 1 5 ї0 «810: ВЕ -ейїї» 7 епі» ВИТ -1із Ноте варіви «аййх 96 зі та бек бе цеци іп вет 1 її
Ан» ие «й1їз З «ій» ОВУ -3135 Нато варієй «00 сіп іп отук век бек ре Бо ТЇПК тре 1 5 «ЗО ЗВ
«вії 7 «Щ1й» РЕК «піЗ2 оНОото завієп «аб» 8 с зу ве тд бле бек бех Тух і: 5 «810» 88 хб»іїіз 5 «7125 РТ «ІЗ» Нощшо Барієті «400 піу віа чаї піу Акт Бах ї З «вій» 10 «її В «512 рт «813» Нопез варів «005 100
Ткр-сіу вет біз БіУ Ве Авротіє 1 Б «818» 1801 «2112 7 «д12з ВВ «2їі3з ПЦото зарівей «ас То
Ветосів біу діє Бег вп тр 1 5 «710» 109 кали З «йїйз БЕТ
ТАЗ» Носпте варієт «400 107 сіу Азта беж 1 ше ібз дИЗ катів б
«12 РВЕ Ж «жізх Мошо Варій «З00з 105
ТУук Зек шек Риє БЕКО тах ї ї «8102 104 «вії 27 «ей СЕ «213» Ното варієп «200» 104 пЕроїт11е Сіп Мех Так біп о Вер Рко бБет бек Ген бек Аїа Зек Чаї ФУ 1 5 10 ї5
Аве ойту Чаї Тикотїе Тнк обу дту дід дек піп оту Щі Беї дб тур о 25 за йез діа тгр отуд Зі іп Був Бо 0іу Був діа ро Був бен пед її жо 45 тук стіу Кіа Веж БЕК їх ЗІ Бех Зіу уУаї Вко ББЖ Аг Ре вах пу за зх а
Бек бі Бек о блу ТрЕ Дяровпе тя Без о таж Хіє бет бек Бемобік Рг 65 7 В во сій Авр о вле вда тп отук тТух Сув сіб о сзій тТук Зеї Бек рпе ко ПЕ 85 зо 25
ТихоБце бік іп біу Та був уді схо тів Був зо 105 «віз 05 «й11їз 117 «гій» РЕТ «різ» Бошто бБарієп «ваз» ПУ сФМа маіф тп пев дей са Бех сту ЗЖу біу пеїк ба уз со ЗБ СТУ
Хх «а 10 її ек їв дру пес бек Сув Аза Аїа бек сіу Ре Тпс РНЄ Бех Бех тух
2й 25 30
Аїва Ме бех Тхр Узі Ак бій дха рюз З1у Бук. Зту цем Зв ТЕро уві з о за
Бек уаї Ту ос1у ліз уві Зіу Акз Бек Те тую Тук оБто виро вах уас
Мув 'яїу дк рпе ТпІ їіє беж Акч АБр бзпо беж Був Авп тах рей Тут (535 7 75 во емо бій Мес-АбБа Бех Тем дка діа сі Азр оте Азія чах ту тук Сув
Вк зо з5
Ата Акч лхр сіу вВвр Осій ОЩ1у Бе дво Т1іе тТтробіу ки су тла Бе,
Ібй Ма 110
Мт тиж Чаї Беж ях 1ї5 «21Ооз 106
«11 351
«віт» ДНК
«ші 3з онНото варієп
«400 106 узсасосаца Совоссазад ссосазуовяс седазеясся дезсзчоеча сачачедаєст бо апсасстасс Фасосгадеса судсавсачес ваєбзчессач секчесасса чсадавосоо 170 часазачуссс ссзазсбась чабссасчус чосацососо бопачассоза счусусозаці 180 ачасеісацез зпсадсдасіс содсассяво сесассокчяа ссассауода сссосазчеес ХА чачзассссу ссасстаста сіуссвосад тасадевасі соссесассзс спсоуусева ЗО ззсассавчу БадазазЕсяа За еВ» 07
«811» 353 жаїб» ДНК
«Вл» ношйе вкрієй хай ТИ?
чвозсосавзі сс заазч соЗсячачас ссудсчсаце стуосоппсадш ссбпачаєті о врехбсвсся ссадсдаско сасоттсвос яустасчсся Єдачосеуув ссчссовадес. 3 сскоадсавчу частзаласч засокосася асасосясся педосазаач сессваєкає 185 сссчасачеЗ соазалоссч чсссассвзро адссодоаса зсачовацає свособцево 240 птіасачвеза асазусевцоя чусозадчає асозссярче астасіясас сазаєоодає 55) часчаччась Бечасаєссса чсдссачоаус асссгазуса ссвісачосе а 151 «Щіб» 109 е21ї» 214 «Зв ОРЕ «813» Ното зарієй «ад» лов
Авротіє біп мес ТК біб бек рус ес дех бев Век о АТа бвт уві бІУ 1 5 19 15
АБ АхУ аз т вк оті Тв: СУуБ'АгЯ А1а бег ів сіу Ті бек АвпотЕр я 25 Зо іжч діа тТтр тує 10 біп о був роз біу пу вія рто Був рес; рез 116
З що 5 тТук 1у Аіа бех швж Тез Зій бег о Зіу уаї Рго БЕ АКЧ кЕйе Бех ВЕУ 5О ЗУ 80 бБет піУу БВєх С1у Тйх дво ра ТБ 1іжа Тк їїіє век обЗек пБецобіп р ок то 75 ча сій ввр рмпе вів Тит тТух Тух Сув бло піп тує бет йех Біє БкО ХВЕ а5 зо ак трковпе бім Біпобсіу тах овув маї схо ліз пуб вхе тп чаї АтасА1а ї0о т05 110
БкЕоО дет Уаї Ре ї1іе рБе рРтОо рко Беж Авросів бій тех ту Бех щу хї5 120 125
Тни Аїа дет ма1ї Уаї Сув їси обео Авпобви Ре Тукорко Аха Зди Аза хо 35 3а4й
Був май сіфіп Тер їув Узі Авр Ав вала тей біб бетг оп3у Авпобех бів 125 150 155 150 спін бех Маїс Тк обі біп о Авробек Був Дер Збг оТву Тух бек це) век ї55 170 175
Ветотах БейоТаг Гм бек о цув Аїа двротує біц пук нів був о ущі тух 18о та5 ї559
Віа сув сій Уві тТпу нів обівп біУу Сей шеє бех Бгто уаї Твтобув бехт ївн по 205
Епе Авл о АКкЯа сіу 1; Сув аши «-2305 109 «-811х 447 «12» РЕТ «513» Нощшею варієй «айй» 105 ців стві біт бецспеза біз вет віє піу п3)іу без маї біп оре шу пБіж ї 5 їі ї5 чек цей АтЯ Бе» век Сує Аїа дія Бек біу вне Тих Рпе бек Вех ТУук
25 5 зо
Аїа мес Бег Ткр баї йка біпоА1їа рго зіу цувБобіу їєю» бій Укр Хаї 35 5 45
Зек уаї Трт сіу Ата чаї СІ Ат Бе ТНк тує тТух Бго Авровех уві то 55 50 пув 1У вАКУ пе ТНх хів Бек нки йвр Овни Бе пу йвп тах оце тує 73 7 зо
Без піл МекоАБа ех ме Ах Вів с) АЗротве діа уяаі1ї ту тук суд я З я діа Аг тТтросіє Ар ості біу вне Ано х1іє Тер ЗІ ЯМ бьУу тТакоБеу то лев 1365 чУуаї ТЕ узі Бех ВЗетг Аїя Бех от пу біУу Рто Бк оУуді рре ро рей 115 то 125
А1ія Бхо Бех Вес бує Вест так Бек Фу поту твх Аза дія пецос1у Суб
130 135 Ту іє» Уві Пцув дви Тут Бвпе рІто сін орхо уаі тнг уді ет Тер дві вег 125 ї50 ї55 152 с23у Вів їец тах Бех ТУ Уві Нівотак тд РКО ліз ах зви сФіп Бех 165 та 75
Чек сту ей отТух дет цем Зег щеї чаї Уа) ТрЕоМаї ко Зех бех Вк 182 185 132 їз ос3іу тп сова тТнЕ тТух хів» Сув Ап ухі Авпонів був Ро Бек дев ї95 2095 25,
Тих пув мазі сАвроцув вхо Ууаї біс ро Був Бек оСув Авр о був твЕ нів 210 з 235
Зх Су орто рко Сув Бко Вів Буз бій Шец ем Зіу З1уУ рРхо ек Маї за5 239 235 250 вн рез ге РгО БЕО був ово пу о веО тТвт Бей мех зе Бех да ТВЕ
245 255 55
Еко сій чаї тах Суб уві чаї Маії ар чаї Венхонів бій АБрорго ауй 250 255 279 чУуаї Був вне ляп Ттротух ма) вер о піу уаї бій ах нів Аеповів ув 275 два вх так обув Бо Вгя їй сік сій Тук АвпоЗех ТК Тук одку уаї Уаї дех
ВО їа5 зо
Уаі це тих Уаї реп Ні сіл дер Тко ба Ав біу був біб тує оїлев 305 Зі аз: 328 пувоцув Маї Бест Авпобув Аа печ Рто Аза Во Ті ЗР цу ТВ тМ1е
За зЗза з35
БВек Ппуз Вха пув'сїу пів бтго втЯ Біо Ррко біб уяї Туш о Твх їє4 рКо зЗ4о 345 зай
РгО Бек йжчЧ Сто стц Мей ТВі Був АБа діп Уві бах Їй ТвкобСув сте зв 350 з6в5 меії цув біу Биз тую рто ях Бвр хі Біо Ма1і Сім Тер оп) Вех дви
Зло Зх ана піу іп орто Віз дви Ав оТух Був о Тпг ТБЕ Рго Бро Уаії цей Авр пег 85 359 335 4
Ав озіу Бех рпє кре цей Туу Бек пув во ТК уаї дер о пує бек Ага 405 АТ «Б тТЕроЗій сів обі АБИ Угі Бе ек Суд бек Маї Мебс Ні ЗІ Ат їсей 429 425 ізо нів Ап дів тую тТвк ЗІпоБув Бех ій» Бек ЄМ БЕК Рко СІіУу Був за ад зав «ШТ» хо «11 в жквіс» ВЕТ «Ка НІукОо карі
«Ай» 11
Бех тухк Ата Ме бек 1 Б «210 211 «211 17 -йф25 ВЕТ «йі3з НОВО варієт «жо» 111 чаї іє бєк БВія Тер піу нів чаї Пув Тухк Тух А1їа бвр бек чаї Був ї 5 то тв шіх хиїйз 117 «хіх В «тій» ОРЕТ «КІі13З» Нощме варів -а00б5 119 тхвр б3іу вер Сіц біу Рпе йврої18 1 5 «иїї» 1133 «вії 1:11 «кій СВТ -213з Мото Барієм «Сов 313
Ака Аїа Бех сію З1у 116 бек Авпо Тер рес А1а ї 5 їй «й10з ЛЯ «113 7 «Віз ВТ «913» Нощо карієй «800з 114 сзу вів бек Зех їей З1подеК 1 5 «10» 115 «ах З
«12» рРНтТ «віз» Ношо карієп «Оп» 115 чіп зіп тух Бек Зех Епе РКО тах ТпЕ 1 5 «Вій» ЗБ «1їж 7 хай» РЕТ «Ві3» снНома свархеть «Зах 115 сіу впє ТЬХх ве бек бекотук 1 5 «Вібз 117 «-2їїз Б «ВИ ВВЕ «8135 Комо варієй «ам СТУ
Бех діа Ткросху Мі УуДІ ї КІ «Рід» 118 каАївх 8 «пів РЕТ «213з Ното варіви «400» 318 тЕр о сі1У Авр сій З1у Ре вер І12 «105 119 ев в ИН «втіх РЕТ «Вїл» сното варієн «Оп 418 век осбіп З1іу ХЩїе Бе Двпоткр ї з «т71йз 125 «Ей 3 «212 КТ
«ВІЗ» Номо вашіеп «айс» І70 сі АтТа бек «кій» 1951 «Ті б «2125 БТ «хз Зоо варієп «400» пі жтук беї ВЕ Бре БКССТЦцуУ х 5 «І» 127
Ей» 107 «Шйх ОБАТ «вії» Вопто варієй «ОО» с123
АвроїТте ЗБ: Ме тах сів бек бро бер бек Геї Беж Аза Бек оуаї бІу я 1 10 5
БврАха Маї ТКт Хе Тв Сув йбе Аа Бех Зіп бік Тіе бах ввлотТкр 5 хо ев Віа ств о тТуд шій Оз Був Бко біу Суб Віз хо був ем Пе» ї1ег за 5
Тук Ч1іу бів ех бек Ме; Зп о Зех (1у Уві Рхо Бек АтЯ Ре Беж сіу 5О ЗЕ а
Бех п1у Бек піу ТБ вар кре Так Бей Тр оТ18 Бет Зєж це бід БК
Б 7 75 щ) сій АБО Бвпе віз ТЕк о Тук тТух Сув сі сій Тук бек пек Ре Рг тку 85 Зо зе
ТВ оБЦце б1у сі бі тТБк ув узі 610 18 Був 165 155 «21йх 123 хліїз 317
«В1йз РЕтТ «їз Неото варієй «вари 173 сій маї сій Бей пей баб бе зху оту п3у їєо Маї3 Сів Бгто З3у І з 4 їх 5 век печ вхЧ цей Бех Сув діз діа кек Зїу вве ТНУу Ре Бек Бех Тук за
Віа меж Бег Тур. Чаї вхч сп оАїа тто піу ув бім беч вух тТЕе хУаї з5 Уа 45 чек та1і ті Б-К.А1іа ТІ БІіу Нів Уві Пув Тук тут ВТ декрет Чаї
Бо 55 ва пувозіу Акч Ре Тих Х1є Бех аку дБр АБО Бег пуб бо Ттвпх пев отук то 78 80
Без са Ме АБпоБег зво Ахе Аза Зішо вяр ТИХ Аза маї Тук Ту сСув 8 З 5 дів Аха тЕр сіу Авбозій сіу вве авр о стіє ттробіу біп біу тк бе 05 165 10 чаї тр Час дес Бек
1ї15 «2105 154 «гії 52 пеїшз ДК «ЖР3х сНоюо вартей «а00х 5 чзасвіссача совоссазаЗ ссссзугадс сбтаачсчсся чочевоОчссв сачачсочасо в аесассіЧЕс дадссасеса зузсассадс ааосчдегах сссдатасся дсачазвчтес ї25 чеасаачзєсс ссадастчесб пасотасяачо зссазчссссоп кчозаацося сасесоваче то ачасісвост чезпсоавесво соччсасоЧає бссзессіавн ссассоздсзу сстчасассос ка цадсвсввся ссасссвсва ссдссадбає сасабсаюеї Єссссассас сг тсудосяя зт чесасозаая создзааєсав з 381
«210» ав «ії 351 «21йх ДНК «Мах Номо варієдй «Ой» 125 часесаоває тчсссдезаз сячсязЗаччс сеаусвбсвнас стузсдасвя сссузаасеу 50 восссасодпед ссвоочасвї сасстісаче застасдссв свачсрацеє соадссадасе 120 секууєзачу зассодзасоа засос зссадсодсокх зпчассвсяє пазацсасуво Іво зчсеЗасечсс бчаазодсся Чрхсассаєс ачдссздсася всаздсвацва сасесбукає З48 сезсадаєц че асазсскася ззссузазає ассясоуєчв с асуасєцівяс Сачабугас Оу часчазчасс сбсяддсаєссо удепачапс ассстостса содстадесс а зви «йійх 125. «211» 313 «212з РЕ «їй» Ното варі «а» ле вве І1є с5іп Мек їм сій Бех бжо Бех Бек оце) Бек Аз бек о таї СТУ я х 10 15
Взр Ат Маї Так тіє ТЕ См дхс Аза Бех сій обімМ ті пек АБй То то а зо цей Аіа Тер Тут 915. піп був Рго о1у йув Віа Бко мув еп Бей Із 35 аб 5
Тук пу Віа бек Зего це іп бек біу Уаї ВБко бек о дку Бе ех С1Ж що 55 ва
Вес щу Век 41у Ток двр Ре три сви Тиготів Бек беж пев о бім РКО 79 75 82 січ АБр вве Аїз Тих Тук о Тух Ссув бій іп Хуг Вет Бек Бе Бо ТБ вх зо зе тах ре Фіу іт біу твх ву Уаї 10 тіж був Ако Тахо уаї А1а АХта
Зоо 155 110 вко Бех Уві Не тіє Бна БкоО ро чех вер іш бій Бе пув бек щ1у тї5 їХО ї95 три віз Векх Уаї Маї Сув бе) Бей о Ава Ав вне Тут ЕкОосАКУ сіо вів
ЗО КЗ 129 уз уві бій тер обу Ма Ав оАВд Аза бе сів БЕК у вво Бек бій 145 ІЗО її їй сіз Бет маї Жнте шим бій АвробБякК Був Авровек ТпЕК Тух дек Бед бек їі65 170 175 цек Тнжх Іей тТпЕ тез бек був Аїа Авоотуг піз Був нів Пув Уаї ТУк їВО 185 130 вАлв Сую бїч маї Тк Вів С1о біу пец Бех век о вро Мі Тк Пув Бех 155 750 ох
ЕБе Авподка бі сі Сує 516 «Вій» 37 «йТіз Яд
«й» Орит. «Вій» НОтМе вартей «00 бів уві св оцес їжоа бі» век о біу сі зу го уд) бін рко шіу Р; їх в То ї5 веї тез Аа цес Бєх Сув віа Аїа бех сіу впе тиж Ре бек Бек ТУХ 0 в Зо
Вів меє бБекотуо уді Ахч с1б Віз Бко бі був СТУ ец оси тур Мах з5 40 45
Бех мазі ї1їе бег Аза Тер біу нів Уа)! Бу туго тТух АЧча Авр бек хаї во вв 50 рув сіу Акч Бе Трос її Бех Ака Авр АБ бЗех Бу Ав тах їй Тук ве: за те во пеа сов» Меє вп обек Без вкч лі бо Ар отТвХ вів уві тТук Тух су в5 5о зе дід Аг Тер.с1їу вЕвОозІії Бу рпе лвр о їі ткр о О1у БІіп о біу тТпх Ше ок 105. 110 чаї твк Узі Бех Бек Аїа Бех ТНК Був зіу РКО Чек ча1 РПпе Рра тен. 115 їхяо 125 вів ро рек Беж Був Бей тик Бех Віу сіу тТБІ Аіа вів цей біу Су їЗ0 135 140 тецоуаї руз Авротуж бце ргао си ре уві Спромаї Бех тгродвповет ря о і5Б 15 сі; вій зей тн бек осіу уаї МБів тйпк оре вхо вів Мі Бо сі Не 155 ї7о М7Е ак об1іу рей тух Бех іш» пек бек Уві уаї тро оуаї ркб дек бек Бак
Іво 15 196 реч іу твк обід Тв Тух птіє Сув оАхпоуаї дей нів цув Бто бек одева їв апа зв тТЕж цув Мав) дер ру Аха маі сійсорко Був бек сСув Авро Був тат нів
То 215 279 тТвг осСув Ріо вто Сув орро Ата ро ти їже рец щіу зЗіу кто Бех Маї й 75За 2735 240
ЕцЕ Меш РЕБе РКО ЕКО Мув рРЕО Ну АвЕ отих емо меї хів Бех АК ту за зей 955
Ехо с сїн Уві Так Сув Уаї ча) Узі Авроуді бех Вів щіз АБр о вко бій зво 265 27
У«1і пув о рБе АБп Тер оТух уаії Авроаіу Маі бій Угі Ніз Ав) діа Пук ау 289 зе так одув рхо Бгто са сь; сви тТук вви ат Тк Тук до Маї Уаї век
Зо 285 350
Маї рес ТЕ Уві їєї Нів Зій Авороїткроїец зви осіу Був Зі Тук дує зп5 316 І "7326 сув рув ом! бет бр цу вія цей обо Віз ехо лів Ма мує ТВу ХХЕ
Зав 338 335
Беї ув Віа Бу сіх біп в:б5 Ако іп рке зіп очуаї Туг ТУ ем Бко з4б 345 з50 рРюо Бех оАсу Зіш ста ме: так був Авп бій хХаі бек рец тТНу Сук їв зБ5 зе з55 уаї ув аіу ВНе Тук ко беу Авротіє А1їа чаї б)а Тк» обіц ек Ал за ля зві сіу сій рРхо біб АвпоАве ТУує пув Твг ТБ Бхо вго Ууаі ви АвуроБек 385 330 355 апа вро оЗ1іу ет Бре Ра реч Тух Нежх туш Бей) ТНК Уві АвороБув йех АхЗ 405 415 5
Тктв'бтп іп б3іу АБпоуві рве бек сСув бек уві Ммеб нів біо Аіє Пец по 485 230
Ніш дБаонів тТУХ Тркобій Буз бек зва бек їєм Бах Бго ту Був 435 150 443 «102» 198 -Вїхх «-в1й РКК «813» нНото варієй «400 ДЯВ зетг тТух лів Месє бек
І 5 «ви 188 «віл т «й1а2 ВЕТ «їз» пото зарієц «490» 123
Аа ХЄє Ап обех біпозіу Був Бек Тйж ТУг ОТукК Аїх девр.бвр у Був 1 5 18 15 сту
«Вій» 135 шиї» В «1923 БЕЖ жк2ї13з Ното варієй «абз 430 ткрошіу Акр сі) біу рпе двр тів і 5 «иа. ДУ «ВІ» 11 «вій» ККТ «2135 НощОо Барігй «абоз 131
Ага АТа бек щік сіу т1їіє Бех Ави ТЕр Бей та ї 5 ла «вп» ОРЗ «діт» з «ВЛ ОРЕТ
«2133 Вото Зарієй «паб СК ю піу Аїа Бек Бех Бе» бій Бак 1 5 «10 1755 «їж» З «їх ВК «Ві» Нопю варів «апп» 133 сіп бі; ту» бет Бек Бпе БгО ТВжЕ ТБЕ і 5 «210 135 «й112 7 «шій РЕЖ «ШіЗх нойю: варів «во» 134
СсІ1У С впе тнт Ре баг век тТух ї 5
«вій 135 «21і1їз 6 «пІоз ВЕ «713 Нощо дзрієв «пз 135 аБп бе піп б1іу пув Бех ї і «віх ЛЬЗ5 «112 8 «812» ОВТ «0132 Нотпо варієдй «або» 35 туру двросто біу пе дер 116 1 5 «піб» 157 «кіз 7 кхрійз РЕТ «піз» Ношо с варієв
«300з 137 век бівосіу ті Бех Авй ТЕ ї Б «2102 138 «ВК З «війх ВЕ «вал» оте варієт «-ап0з 138
З1у АхХа бах «5102 135 «х1їх є «вх РІ «213» Кото варієв «4005 135 тухк Бек бех Рпе рРкго тах
Е 5 кЕЗИ2 лаб «ВАМ 197 «818 РЕТ «2д3х Ното ваерівн «4005 145
Авроїїе піт Меє Так сів Бех ро ден ех Жака Бех вла Зек уві у ї 5 16 15
Авр Вку Уві ТЬх тіє ТВЕ Сук Акта вла Веб буіп Зіу Хзіє Бек вав їхр о х5 що
Бец діа тер Тут Зі бЗіп туз рко спіу ув Аза Бк був Бей мед 318 чо 5
Тут сіу Віз беж Бек Бей бів Бех сіу маї Бк бег Ас рве бек у 5О Б в бек бі яєт О1У ТВЖ Ар о рпя тах рез Тпк охіе бек бек цей БМ) РКО
СЯ 7о 78 во піч Авровве Аза ТЬк о тук тую був бій біпотук Бек бек ре Бка тре зх зо ЗБ тих вне осіу з)іп ЗіУ тах Був Мазі бій тіє Був 105 хо «вій» 143 «хз 0117 «Ві?» ВБЕТ «2555 їхав вари «або СТА зій уаї іп дей реч бі Бек о сзіу С1уУ піу бе уві іп вро З1Уу піу 1 5 40 5
Бех ге Агя Бей бек Су АтТа Аза Бек Сіу РпЄ Тр рБе Беж Бех тут
Віа Меє бе тТЕр о Уа) Вкч Зі Аза ро сіу Був о з1іу пе сій ЛлюШ Ммаї з Сх 45 ек вів т1Є АБ Зеху Фа бСіу Сує Бех о Тпт Тух ТУЮ Аза дер Зак хау вп БО пуб сту дхй Біне Тпг о їїє Євг йхд сАвровАБИ бвж пу вев Тих ве» тую то 75 ва це й3о Мес взо Бех спец вч діа іа Бер ТВ: бів Уаї тТук отук Сув не ЗИ 5 діз ка тТгрробіуУ двробій пзу РпесдвБр її то біУу піп б1у ТБк пед 105 105 хо
Уаї ТнкК уві бетг Бек 115 «ій» 145 «-213з :351 «від ДИКЕ «хї3» НОмю варієтй «ах 145 цатасссаца часссеазац ссссачеадс сесадедсся чезкодшєся падвоєцаєо 50 айсасстзбос сччссадеса чччсассазс азстодевач осогаасасся псачазеоосо ї70 часаайчссос сегачссосе бЗассезсоцо чсосвоассосс басвзрначсяч содсуссваде ї8а азаєссазчсо чдсадсодссо содсассцає сСтсасоскда совссадсву ссебасадчесо 246 чвоачастяст сеасетасгя ссЗспадчева бабсаусавчсв ггсосдссає ссосцастаз 305 чЧчсассвааєдтя гчоаваксявоя згї «дійж 145 «кій» -35Х кахв ДК «гій» опо варісл «00: 143 асзоачсосвас пасгчсзава соЗсучаччс сочасосазо срдадсапсаз ссгдазаєсу 5а
ЕсесчсодссЯя ссздесаяске сзесіосвос адсграсусов сазесгчааЕ бсуррадасє їзй спрдудсавча чзастучвност зась ссясо абсвасацесс азсцчссаззад сасстасеьяс 185 зчесуасвзс3 СЧавнузуосся чибсвовайєс зсосудчаотв всвоасаачая сасесссосво ко сЕЯсвчабЗа асачосеЗсв пуссяаацає вессбзсочвес асвасечЕче сазасччаЗе з5о пцасаачачес кечасвессЗ чачссяоаяс асоскадоов созбсаоеес са Зяк каї102 144 «вії та «їй КЕ «13» Бото варієй «Об» 144 двроїїв бій МЕК тТрЕ о б3іп бек обго бек бег тей бек о йїа дек маю сту ї 5 В У авр о Ака маї РИХ Хі Тв сСув Бк Атїа ше обі 01у їїе аж дей ТВ 75 Зо. їм діа сттр тую пос Бувовуо сіу Був Аїа Вко цу їец їм Т18 30 й
Тух сіу Аза бет Бек Бен бЗ1іпоБек біу Уві Бхо Чек Аху Рпе бек щ1у
І
«ех у бек зіу ТВХ АврвовНе тво оцей ТОЖ їїє Бех шШек Мей біпорРтб яв то 75 во
ЗІЗ Аврорре Аза ТВр тую Тук Суз сій Білотує Бек дет Рде рРто Трх я Зо 95 так вве сіт біл сіу пк їув уаї бій І1е БуБ Ах Тс уві дів АВ. 109 105 їїа тТтс о бетохМаї БНЕ ї19 Епе орто рко бес дврозтО бій цецоБув век У тт ї2о їзе
ТЕ Аза Яах узі Уві був дей ПемсоАзп дае рРБе тує рго Ат 5із А1в ї35 135 тай пуз чаї біо тТкроСув Майї о аАБроАее Вів Бей бів дек шіу Авп бет бід. 145 15 155 їва бі бек уві Треоспій Ох Авробех ух двр о бе Тпх Тує дек Тем бе 185 Зв 175 їесготах пен Так оїец ЗеБс пув АТа АвротТук осі Був Нів буй Уаі1і Тух ї80 185 Бо
Біз Сув біз уві ТБ Ні Сі Зіу ей Бех Бех Бго баї ТВ дув бат 155 200 за5 та йвп о дка ЗКУ бі Су їй «вій» 415 «21тз 947 вій РЕЖ «213» Нотпо зарівт капа» 145 бів Маі сів їед бен зіс Бех аїу б1у щу з уаї ів рРго 01у ЗУ ї 5 їб їв дет їв духу пе» Бек Сув вїас Аїз Бех біу тпе Тк Бе бек ех Тук о 5 3
Віа Мебє бек тро чаї Бке Щ1поАта гуо с1у Був азу цем ЄТц Ткромяі й 45
Яек Вів 316 Ави бек сій Сіу пу бек ТВУ Тухк Тут овіа дар бек о уді
5О 25 і215) шпув біу Аха рпш ТНК 116 бакодга вар Ав Бак о пув Авіа тн пей тух 65 та 75 во пемосій мес АБп Бек опе дкч А1їз Охо Авротвг АТ Маї Тук Тук Суя зб я зів дхя ТтроВіу Авробі зіу рРае Авротіб тТкр БМ стій сіу твЕ о їєд
КІ 95 110
Ууаї Тит Маї Зек бег АтТа бек отну Був піу ггРО Беж Мазї орзе бе зп 115 136 185
Аїа Рто бех Бек був Бек ток Бек пі Бу тк АТа Аа їєво піУу сувз 138 Іль 145 їжи; уа1ї мув о двр тут РНе ро бі» рус Уві тв Маї Бексткр вве Бятг
Т45 ЕН; 155 155
БІМ вів ївм тпХх дек сіу чаї МНів ТНх Рій Бко діа Уаї реп ФМ Бе ї65 хто кВ
Яеї біу зей Тук бейксїеу пек Бєт Так ухі Твк чаї Ртосвек Бк БЕЖ 186 185 15 цес птіу ТНж біп тих тТУуЄ хіє був 'йвни Маі Ап нія пу БЕОо бек: Авт
Іїн5 оо штп5 тп Був Уаї ввр пув о вка маі спа рхо пувобек Сук вер був о тТрх нів тик оСув рго бто Су ро вла рто бі узи тем біуУу зіу вже Бек Ууаї 225 230 235 А
Епе цей Рпе Бго хо Му рРго Пув дво тйх цей Меб З16 Бек Аг тру 845 25О я
РкбБ осіб ах такс осуз уаї мві Уаї вер Чаї бех Вів 35 Авробко Я ко й ча чаї цув вне вЕЙ ТЕр тут Маї Авр о О1у Маї ЗМ чаї нів дев віз гу
275 2350 285
ТЕЖ дув Бгто ка бі) ЗЯ1Ь бів о тук дво Бех ХВК туї т Мві чаї Бек ан) 295 Зоо уУуаї по ТВх уві їмо мів СаіяоАвр отр пейсавп біу був сій тТук ув 305 З10 зЗ15 зб був Пу чаї дет вв» Мув Аза ви РЕО Віа Жто їв оби пу Ск іє 325 вза 35 чек Був Атїа муж 0Зу сій Рто Ак3 біб вто бій мах бук ТИЖ ем ро зай ЗВ ЗО ро Еко АКУ Бій біз Мес ТВ оБув дви обід Ууаї бек рес Твт сув лви зче зв зав
Уві ув біУ Бе Тут вхо бБеї дер 112 Аїа ув 10 тів Чім Бек АВИ та та ва
О4у біпорЕв ій. Авт вевотую Був Тих ТпЖ БЕ БгО УЕ цей двро вас
БУ 3155 ач5 15 двросіу шек рРце Рпе рем тТук бек Пув цен тп Уаі Авропув Бек Аку 205 310 415
Тра ста сій сім Аби Уаї Бе бек Сук Деу Мей МебЄ нів зи дта рей аз 425 «38
Нів деп нів туї ТБК Осій Був бек рей бдегоїєм бег РгФобіу ув: т35 140 445 «2105. АБ «вії» а «пай ТКУ «ВАЛ» Мото варівп «йЗох лав век тук вка Мек Бек ня КЗ «пБійз 347 «»1із 17
«Вій» ВВЕ «йіЗз Нопю ввриєт «поз Та ді діє Бек бек Фо о сту руш Зехк тмт Жук тує Аза лев еп чні пує ї з. 10 ї5 щу «жі» 448 «жЕР1іж В «ій» ЕТ «2135 ЖЩощо варієвй «4по0зм Ай тТкропіУ Ар одІіа БІУ ве двроліє 1 5 «йій «вії 11 «ами РЕЖ «218» Зойо варічи
«пох 389
Ага Аіа Беж бЗіп П1у її15 бек АвпотТжр Бей діт 1 - 10 «МО» 150 ше «їй РЕТ «213. Немо варті «40бх 155 сту діа Бах Бет ей Зій Бе 1 ї «16» 51 «Ук» 8 «Ваьше РЕТ «В13» Ношосзартієті «во 151 сів біло Тук'обсек бвЕ о рне го Ту ТВЕ
І 5
«йїОв 159 «ва «їх» РК «хіЗ» Мото варієей яд ЬбВ сіу реє тих ре Бех бек Тух 1 5 «іст 153 «ії» 5 «х1їш СРЕТ хвізх Ношо вархег «о» 155
Зек Бех осіп б1у цуво Бек ї 5 «2і0е 154 ш-в11з В «Вій РТ. «513» опе: зарієт
«0пз 155
Тер о біу дДвр сім З1у Ре дврої1е 1 5 «Ба» дев «Віїз 7 «212 РБЕТ «2ізЗ» Ношо варієї «00» 155 бЗех Зіпосзу Ті Бек Ав ЛІр 1 5 -йїй» 156 «211» З «тій» БКТ їй» допо варієй «ФОд Сн іу Аіа Б8Еї хЕ
«10» 157 -Тіїз 5 «тій РЕТ хи» Ново Барієт «ах 7 тТух Зет Шек Ре Бхо тТЬЕ ї 5 «із 158. «231» 197 «ій ВБЕТ сві3з Кото варієч: хапа» 158
Ввр о їТе біз Ммеє Тік білобек рко ет дек би Бех Аїв бдет Маї1 сту 1 5 Кб І5
Авр о Акесуаї ЖОк тів Тато Сув' Авто Вата декобівп б1у ті) беу де тхр
І 5 зо
Іва Аза тк отут біп осіп руя бо с(1у Ббувовія Ба був цез ппем І4е жа ак туї піу дія бек БеЕ тво бЗіп Бех слу Ух1і Еко Звзг о Акч Не век бІ1у у ве БО ет сіу Бех з1іу тру АврорРмя так обеб тТпк Іїе бек вок ПЦеа іп рго 85 за а а біз Авр овре дія тТвсоТуг тує був бій біп Тух беу Бех Біо рхо ТИ: як що 5
Уйх ре б1у сій Зіу Так був Маї бій тіє Був
Ії ких «ТО» 155 «811 317 кій РЕ кі» Ното варів «ап» 155. бів уві сій 16; рейосів дек біу біу щу геу о уаї біпорРгО іх ау х ія 10 ї5
Бек аа оАкЯ пей Бек Сув Аза АтТа БеУу Стіу Бе Бк рве Шек бек Тук ха 25 Зо
Аїа мес бВет тЕр узі Аку БЗіпоАзха рко Шу цув С1у пемостц Ттро Май ря цеї діа тів Бех Бек бїп Біу Був Бек Тиг бух Тук Ата Авробек уаї о з япй ув біу АкЯ Бе ТОК 15 Бех Аха вБр АвапобБег пув Вей Тк Гее тує 65 70 тв во тва сій Меб вепобБек пей Вкч Аза біз Дер отвк лів уаії Тук Ту Су ву за 5
ВІа Адхч Тер піу дер Пт З1у ре дер І11е Тер біу бів зіу ТВгогеч
Ах 105 135
Чаї ти Уаї беж БЕЖ
Еш
Зо5
«8105 160
«ії» 38ї
«ті12У ДНК
«ЖІіЗз нощео варієп
«пох 1850 часакстсозта Ецаєссяаза иссацстіє січассавса часадасм савазкчессо «0 зЕсаєстсьс уууссяаосса чеучовЕсазе зесєсасьяч сорачеаєся дсазаваєсе ї20 часавадчесс ссавасіуєтї дасстасчцєс зпосавсссос сосауацеча сзсчссведє і850 вчвессацчея дсзосузето садсасодас сесапсстча ссаїсадеад сесусаЗеве 2Ай чзачасссса ссасстаста стдссвосач Єврадезчсу Сесосессас себсатсеаз 300 часазссвача сачвавссва З зах «тах 151
«т1іїіз 351
«тівж ДЕ
«81лх Кощо варієп
«з0йх 161 чтачасзсаає госсспдазаз содсачаочс ссадготаче седзєзшсва ссечнойссо С тсгЕдсяссо ссадсочеко сасстссхас асдесвосзсса соаЗставЗЯ сосзссадуєс 150 сскодцусаачя часездаакс сусабеоясс абсаясяссс аддасвацваяа пасобастай зво
Чесавсадея созазцчасся звесассвос вассчочаса зсадсввожа сасссвцдеве то седсачаєдча асачсссоса стссорзуцає ассассзваь асбассзроаєс сазавоаччає 390 чзасчаччссс БозЗзаосвіска бучссзозас асосто3їса бостсвосос а 351 «21» 182 «211 514 «212» ВВ «Вії» Ното Баріва «0 0 Уби
Аврохів бів ме Тр бів Беї Бкєб Бех о Беж Пеу Бек одіа Беїт Уаї ЗТу ї 5 то 15
Авровнкт УБІР Твї їіє Та Сув Ака діа бек Зіп бі діє Бех Дар оТхр й КК пе вата ТЕротух бі сіпоБуз Бко ху ув йіа о рко Пув цем їх її ча 45 ту їЗіу Аза Бек дет зей біп Бет сіу Уаі ро Беж Ага Бе о деїх су
Зо а5 ви
Зет біу Бех біу тк одврорне Тк о пей ТВсохтів бек бек пев сій ро то ПУ во сім АвровВне Аіа тик тує тую Сув сів б3Зп тТук Бех бек Ре ро ТрЖ 85 зо за тТнковйе б1у зів с1Уу ТіК обув Ущі бів ті Був АкЯ б7пк уаї іш АТа 106 ії05 1:05
ЕКО Бег уві Ре Іїе Ре бро Ехо бек ДЕро Зі зівп іже Сук бек З1У 115 шо хи5
Тих Ата Бек Маї чаї Суз цем рей Авх АвдоБце ух бо вхо іш Аїа 135 135 140
Пузв Маї біп ТкроБув Маї Авробвп діа реч О1й Бек З1у дей Бек б15 їв Т5о і55 їко зов
Зі; бек оуаі Тикобій біп Авровек о пуя Ар обек ТБК оТух бек бе Бех 355 ї7а 175
Бек тик цес тв цей Бех Чув ві АвротТук сій був нів уз чаї тух 180 183 980
Аїа буя 1ц чаї Тмйу нів сів ЯБу ев Зех о бех рто уаї ТВт Пув о бех
Ії ща 285 ре Депо овкз бі ба сув 210 х210» 163 «пт 447 «тах СРЕТ «2і35 нНото варіей «б» 163 «їй туаї 5іп лез це сій бек аіу біу сту цебз хві зп Бк у бу
КЯ в 10 ї зо9 бек реп Аку ей бек Су АБ діа бег спіу Бпе тв вве Бех чек оту 8 и за
А15 Мек обБскоттр о Уаі Аа бОїп Аїд руо біу пу біу цем біб тр Уаї 35 40 ак ет Аза Х1е Бек ве ОТв сту Мув'зет Трх Тут тТук вів АвроВек аз ха Ук І ув о біу АтЗ РНЄ ТК Хіє век Ату АБр Ав! Бек Був АВ жТБЖ ТЕМ Тух о 75 о
Пец сів Меї Ап бек Бей дЕсЯ Ата бі Аер отак Віз мах Тух Тук Сує я5 56 з
Аза вкч Туросіу Авросій б1у Ве беротів Тор сту сі Сту Твх їву ідо о 119 уаї Твк УВУ Бек Бех АТча дек ТИПк о МуБ лу РКО Бек уаії РИ РКО цей 115 129 125
Вів Бгто бек бек Був Бех Тпх бек аїу Зіу Тік Вів АРа цем Біу Сув 130 135 140 ем сві Гуд бвр Тух ББе Бу хо о рКОо Чаї Тк ах бек отЕроАно вет 145 150 155 62
Фу діа рез тт одзу Ту Маї нів ТЕЖ рпсе о Бхо Аїз Узі ем ОМ ВЕ 155 179 7
Вет Жту Мевстух ВЄЖ бей Бех Зек чаї Маї ТИХ Маї рто ех Зек бек т89 185 185
Пез віу тик озід тТвЖЕ тую тіЄ був дви Уві АвпоНів їУБожко бег АБ
ЗОВ й 2605 тру цув Маї АвроБув Аха маї сій рго Гу бетх Сув др опув ТНК Мі 15 иа
ТК оСуворго БКБ СУБ вЕо Аза схо сій Пеносец баУ діу Бк Зв Уа 225 2за 235 245 рве цей бе ргосрто пу вго Був лЛеротпг Тез Мес 115 бе Ага тик ах 250 255
Рто сій охві тах Суз маїф уві Уві Аво оуві бет пів 13 АВробко бік
ЕВ, 65 што че1 пув Бе Авпоттр о Туг Чаї Авросіу Уаії бі уаї. нів Авц Діва пу ач на 2и5 тв був Еко вра Ма тн біпоту»к Ал Чек тб тує ага Маі Уаї Ву зво 235 Б чаї пЕО тик оуаї їі бів біп Авр Тс оре Ав обіу був біб Тух Був 305 зо зі; 325
Су Був уві Бех Авп оцув Аїа цем вБжО АТа веб ї1е Зо Був отак ТІ 325 330 зи
Бек був с Аїа був су сіб Бго кдд о піб вто сОїп уві стую ТНЕ БеворКо 359 345 зву
Его бек Ага сію бі Меб ть Сув ле Бій Уах век о їши ТЕ Сув Ме
ЯЗ зо За
Чаї ув спіу Ре тТук РКО дек Аврогіе Аїа уа1ї сів ТЕросаій Бех Аве 370 378 зво сік піп его бум АБп Ані тую Пувотвг Ту ро бе чаї пем АвроБдек зя5 зо 385 «00
Ави осіу Бех впе ББе бен Тух бек рук гей Тпж Маії АвроцубБ Бек Аве п чїа 15
Ткр ра бід бі» двпозе3 ре бек Сув бек уі Меб Вів суб дія Бе» «ка 435 ЗЕ
Вів двл. нів тує тн Зі Муз щетї Бей Бчшж спец Бек ро Сду був з35 ри «АВ «ій» 18545 єдії» 5 «Вій ВИТ
«83» НОощо арієт «пз 54 бдех тух Аїд Меє беж
Я 5 «310 165 «із Ск «їй» КЕ хаї3» Нопе зарієй «кала пак дій ї1е а1іу бек стіп ос1у Був обег Тих Тут Тух Аїа вер бех уві Був ня 5 10 Ні: пу «210» ле «тах 8 «віїх ТЕХ епІїЗ» Воте варі
«Ф00з 156
ТЕв щу верста оту Не Вар її ї із «-21й5 17. «ит 11 «й БЕЖ «ЯЗ ЗЧошпю варіви «еййх ів
Акз Аїа бет біпобіу ї)іе Беж депоткр Гей дій ї 5 іо «тм 1658 вище ж «ВМ ВЕ -31ї1х5 Ното варієп «апп 158
Сіу дів Бех бек Пец оз Вес ї я
«й10х ЛЕ «ії 8 «195 ВЖТ «Вїіхх Мотпо Зарієй «йвож 7169 сіп сіб Тук дес бек рпе Бро тих отих ї 5 «шій» 1750 «й 7 «їй» РКТ «КіЗ» Ното заріст хай» 170
ЗУ вве отіх Бе дек оЗех ТУ 1 В «ій» І «ії» в хро» ОРЕ «-13з. Вощо варівн «Ой сі Бех бід п3у мує век 1 5 «аз 1173 «й1їз 8 «Різ ЕТ «піз» Ношо бвріей «00 172 тер сіу др опія Ту вне двр І1Є ї в «210» 173 «йіїз 7 «йрох СЕТ к2і3» БоМо вардхенй «цйй» ТТЛ дек біпошіу ТТб о деху Ав тер 1 в «епі» 174
«її З «Вій» ЕНТ «ІЗ» Ноже зарієг «апа сіж іа Беї 1 «ій» 175 «ВМ «віз РТ кат3з» Ноше зарієв. «400з 75 тук Беї Щек Рипш рго ТНЕ ї 5 «Віз 25 жар 107 -«212з РЕТ «3138 ното верієй «па 176 аво Ії сій оМес твесбіз бек Ро бер дек рез Бех Аза Бек Уг1 б1У ї 5 15 15 дер да Чаї Таж хі тих Сув Ах Аза ех сі Оїу лів Бех дви Тхр
Зо їй Аз Тр оту піп бів був рр 51іу Був Аа Бра Був їжа Без Те 80 Б
ТУЖ біу діа бек Бек Пец сіп Вех біу Мі Іо Бек о Аку ре Бех піу -к жо бек біу Зет Ту ТБ АБО рОЄ Тпкобе» тТвК тТіе ет Бех їец бій бко
З та ККЗ 5 сій бвр рце АМа ТЕ Тух тТУух Сув ліп сіб Тух бек бех вВпе Рхо ТЕ в о з
ТНИХ вне о сіу ств піу тТвх о пув уаї СІб тіє ув
Тр 105
«Ва» 177 хаїї- І? 218 РЕВТ «813 Ношо зарієй «400» 177 піз чаї бів сви їєу біц бек бі Ф3іу біу Бей чаї біпобко сіу шіу ії в їв я дес репо Ага реп беє Су о А1та Аза бек су Ре тах Рпе бех Бер туї 29 ла Зо діа мес вех ТкроМаі Вхе біпоАзїа роб зЗіу бе Зіу цей бТш ттр о Маї
За «5 5
Бех Аза тіс щу Бек сій біу Був бек Тк отут Тук діва вАвгр обет УВІ
ЗУ 5 5 ув ЗБїу Ах по тТлю Ті Бек Аг Вер АБ бек обув Авіа отТНЕ Тем тує
Б то Чл ва цей біл Меї Ап оВек реп Бжо Аза бій Авроспх ді Увах тує тух був
85 за 5
Аїа Аха Укр оЗіу Авробій сіу ВресАБродіє тІросСіу біп о суу тих ей іа 105 116 уаї тБху Уаї Бек век 115 «То 78 «ші» 81 шкіл СМЦЕ хій» ДНК «13» Номо вараАша «йо» 178
Чаїсвсосада воаасссачез ссссаусачс сссачсяссов сечова савазсдасо бо аксасстзіс чадссосгдсса псрюсавосачє заскузсоча сесузсвсса зседвачессо 120 шасаацассот ссвачстчсс закпсасоЗа десабссрес БесвчачеЗа сесвсааче Іво ацдастсаюся зсаосочасес сотозссаас о тісзсссвда ссассадсаз ссокусаасос ча чаччасстотп ссасссвоса скзосводсаЗ тасзацеацет босссабсво себсудзссая оо зисассазау гууавассай З зі
«21: 179
«ев11» З
215» де
«13» Номо зарієг
«айо» а чаччгосааї сопесудвааєчу сЯязгсучначс срзасасаєс сбучсочсав сссчачастя во рексгадсасся ссачесдасьс сесебссаце оуссзсусста часту содсспоасс іо сссдусазоз зассзчваєч озчсасссзбео асосасаоєсо асчдсааува сассевсгас Іво чЧейпуесадса Кпазадассоа зЕссассасо аассузуала всазсавчав саосссаває аб ссцсачакув асазчостасо чоессязозчассассУусовсяв всгсассаєсас. сапаєзачас зо часузочасу сосасаєску садссвзоздо ассскочоса ссдссачеєе а зві «від 80 клії» З14
«212 УК
«иї3З- Нопо взрієт
«Яйлах ЗВО дЕр гів сСіп Мес ТУ бін о бег Ро его Ббел оїєц Бек Аза дет уні ЩУ 1 зу то 15
Авровхяа Ма) Так сфе стпх: був люд Вуа Бех сій зіу гів свежЖ Авіа тго 29 В ха
Бец діа тТкротук бій зіп Був рхо ху Був А1а РКО Був ем бем ТІіЄ
З 9 а
Тук сіу Авіа бех Бек Тецп бів бек б51іу Уаї рго Бек дхуз пе Бех Фу
ЗО че ва
Чек Зіу Зех СТУ ТНЖж дяр ре Бек оре Тв тїє Веу ЯегкоТєд біп РО в 7та я Во сі) АеровБе віх ТБ тус тук Сув іп сів тук бех бвЕ Бе вого тТпх вх я з5
ТпПЕ ОРНе З1у зів С1У ТБ Ну Мал Осій І116 пув вгя Тк о Уаї Ата Аїа то їа5 115
РІ: Бет Уаї ре Іа вне РТОо Ро Бек Авробіц ій й оПпув бехо З1у 115 320 Ул трпт Аза Бек Уві Усі Сув Бей оре; АВ Ав Ре їмк го Ах Зі; Аїа 1359 іх 14 пцув уві біп Тур був Ма Ав Вей Ата цем с1іп Бех З1у де бек бій 115 до 155 Би сі» вет уаї тп сій бій АБробек Був Авробех ТК ТУук веж пеб о Зех ї65 Ето НА
Бех ТПх Пец Так оїє3з Бек цув Аз дер Тут З) пув нів ув уза тут тво 185 т95 діа був зі Уаї тре онів біп о сСіу ем бекобек Бжоз хяї Тк оПув бек 1835 200 Ра
Рпе вл! Аа о сіу пі Су 210
«102 181 «2115 ва «вія РТ «313» Ното варієї; «ай ЮВІ
Фа Уфі бІпоцеч лез Ма Ве Шу пту фу ем уві піп орхбо Ф1у 01у ї 5 їо 15
Зєх ії вКч їєй Сех Сув Аза Аїз бек біу Бе Тк Юре бет Яск Тух а їх 35
Аїа мес Бех Тгр Уа) Ак тп Аза РКО У був осіу єм ри тер уві
З що 45
Зах Атя 116 біу Бех сій бЗіу ув Бех тпж ХуХ Тух Аїа бер овех Уві о 5 5 вуз зі АкЯ Є Тс ї12 Бек Ага АБО Авповеї Був АВпОотТапЄ цей тує «5 та пре, зо
Без зіп Ме АБИ обЯех Мей Ахо Аів Зі дер о зтіт Аза ві їуу Тук сув вх ва За аїа Аха Тхр З1У АБробій сту рпе дер отіє Тур сіу бвіпосту так Бей 189 195 116 чуаї три уві бек бек дів бек тпх ув пу РКО Яех уаі вве Рхо. цей 115 їза 175 діа Бо Зех Бек пує Яет Тр бек Сіу Ф1у тує Аза Аза їз сту був хо 135 145 ївч уаі Був йшр Тук Епе Во сій Рко Уа1 ТБ о Уаї бЗет Тер оАвп о бех 145 І5О т55 еб бі Аза це їйт Бек обЗіу Ууаї Нів тах БнНа тго Аза ві пев обі Чех 155 їз Р
Бех спіу цей Тух бек це Бек бек узі Уаї Тіг оуаї ро Бек бек вет ва 155 їзо єн біч тйж бій ТНЕ Тут їіє Сув Авв омаї Ап оВів Су ро де Авп
135 206 205 тах пцув о ма! вер бує Ажхо Уаї сф Бхо пув Бек Сув' АвроБув Тих о Нія 210 215 279
Тпк оСув Ро орто Суб рто Аїа рРро бій цей пер 1у 01у рка Бех Чаї йях 235 235 таб ре рей Ре Бто Бко Бук хо Му Авротнх дей Мем ої1є ек Вку Тех 2АБ 25О й
Еко лій чаї ТвроСує уаї У«і Ууаї с Авромаї Бек оНхв о Сзі0 Ар Бк п 255 272 чУуаї ув впе дяк тер тук Мві Авр обіж мах Сів Уа) нів ВЕБ Ата Був ле 280 ав
Так опуворрго Ах біз Зі: біп отухк дБ бек тиж тТук Ага Маї Ма1ї БЕ 250 295 зад
Мат пеа тбх Мк) рей нів п ЗвротжрорезоАвп о піУ цу суп Тужх опув за 10 315 БУ
Сук мув уаї Бек Ап зу вів Би хо Віа рго т1іе ББи пПуш ТВі Ії зав З зЗ35 ек був діа був су Сіп Ріо Ак піш Бко біп Уві Тух Тк їєд РКО жа З5. з вхо Бех АкЗ пі) (10 Меб ту Ббуя йви сїп бі сбеє цЕза твт Сув цех
З ЗЕ ЗБ аї пуз бту вав о тух ко Бек Авр.оТІ1ів Аза Уві бі тТкр о біч ех Авп зп а зва сту іп орро с3Зій Аво Авпотух бувотах ТК орго Рхб Ма1 БИ АвБробек зо 390 395 оч авбозіу пеж ре рРіе шїей тук бБеїт Ппув цей тн Уаї Авропув Бек ду ас а10 я бір обіп пів ЗДУ АвпоУуві бе Шек оСув Бех Уві мес пів с зт вав Певу.
42а 25 230
Нів Ап о Ків Тук ТЕ бСіп був бек ївиа бекодез Чек орго сіу Був да 4) 445 «йо» НІ «Мі» 5 кій КУ «йХ32 Ното Барієїї «ай» 72
Бек тук А1їа Мек Век
Я 5 «210 183 «вії 17 «812» ВЕЖ «71їх ЖотО Варієй «0» СТ
А1а їіїє Бех Авп о іп су цувобек Тс Тук Тук дія АвуроЗех уаї цу 1 З 16 15 пі «вії» 184 «ихіх В «йІїйз БЕКТ «із» Мото варієй «По» 184 тк обіу Авр ось: О1у Бпе Аво тів і в «810» ї85 «е1їх 11 -2125 РЕЖ «7513» Ной; варієт «ай» (185 вка Ат бетобів б1у їїЄ Вет беп ткр ем ВІя ї 5 то «210» 186
«вії 7 «ій» вит «21і3ж Нопо варахієні «Пд таб біу діа бек Бех Грем бЗіп ветг ї 5 «вій» 387 «рії» 8 «82» ВК «2122 пото зарієд «ВО» 187 зіп'оозійп ТуксоБек бер Ере РюЕєс Тит тах ї В «пп» ТЕ «1133 7 «рій» «НЕТ «кій» НощБо варівй «00 188
«Ту ре ТИНУ Бре беж Бек тує
З 5 кий два хаті Б «ЖЕаз» ВЕЖ «8ї3». Мощо Барієр «абс» 89
Вехт дна піп обіу Був 'євВЕ 3 5 -219з 150 «Вхіх В «21йз ОРЕ «213» Бото варів «або» а
ТЕ о Зіу АВб бій шу РП Авор Ії ї 5 «й» 491 «Вії 7
«вій» ВЕК «віз» НОошо варієт «або» 155
Беї зІіп Б1у Із бе АвпотТІр 1 5 кл» УБи «рії» З «иї»з ВЕТ «2І13з Нощ;Оо ворієї «їй 1959 сі іа бах ї ев Ба «2115 б «Ва» РИ «2137 Ното варієт ч«айО» їа3 тут бек Зех Ріє РгО Стрх ї В «ЗО» 135 «їх» ЛУ7 «ай» БЕ «213» Шато варівй «00 на
Авр ї1в зЗіп Меє Тр обі бек о Вко бех Бех Пец бек діа бег Ууді шіу ї З їх ї5
Авр о Ахц чаї ТВ Її тТБу сСув дка Аза Бех віп Біу бів Бех АБпоїтр о 25 30 пезодіз Ткротух сій біп пух Бко піу був ВІВ вус Був дей пе; тІє
За я ах тух о сі1у Аіа вех бек їєм Сію Бек сзіу Майї реб БероАкЯа зпе век (щу 55 за
Бек сіу Бек спіу Т»К о АБр вне тих сво отТву т1е Бек веж ем Зіпоруа 65 7 т но сін АвроБНе Ала Ту Тут отух був о біп б)п тую Бет чек рРНа вхо ПЕ 85 5 Зп тих вав о бТгуУ піп біу тиж опув мі біб Щі ув тво 195 «вій» с щВ5 «вії» 117 «Вій» БЕТ «із» МНоте вартеєт». «пи» 955 зів таф сую ей се біо зек бі біу су бази чаї біб рто ху у 1ї ка 16 15
Бек пеп ДгЯ п ей его Сув с дів дія бех біуУу Бббес тик Бре беж бах Тук о 25 3
Аїа Меб дех Тер Хаз Ауч (3)п від рко біу пуз сСІУ дей Сім о тТЕвоСУДІ
З с 45 бет Аза Х18 бек ба бЗіпос1іУу Пух о бЯвс тТпу тут Тук АТ ввр Бек чаї я 5 5О
Був З1у Агу ре пт ї12 бек Ако Ар дви оБех Був Авпотак Бец Тух іх а 75 ва рез прп Меї Ав Бех о Пео да Аїа сій АБО Тпт оваїа баї Зух тує Су. ве о я
Аза дкч туробсіу Авросіз ЗІу Вре о Аврої1е теросту біз сту тв рей 105 116
Ууаї ТтЬх У) Бек цех т1а «кій» 1856 хиккмМ ВХ «212» ДЕК «213» Ното варів «до» 196 двхвуссаца Ечасссвадад соссадевяє спдайсчссов Ззсагачесоа сачачсзаєсе Ел ассасосоЧчрс дддсосвтоса ддусярсадс вазссопаскач оссадтаєссв зсаздавоссо 129 чаасаауассс ссвачесасе дагстасоддо досачегосст сосачачсуч сосчссваце і80 зчасєсахзсу зсазсядесс о садсассчає Кісасоссуа ссваксазсач ссбусачосс 24 сдеддасьсси ссассвасод свуссясса) басзасазев сососаєсяс ссссозссяа за часпассавзчи Судзчазассав од зії «Моз 137 «жЖ11ї5 351 «тат ДАК «9313» Номо варів «ах 187
Зачесасааі гастззааеч счасудачає сепатосапе ссзчсачеат сстчадчастя о сегедсчосу ссаасоадоке сасссксодос вассводсоса поавчсеоЯЧЯк ссдссадаєт та сестоспоеазао дастечався зас сссасе ассачсвасо ассиасавзає сасосасьве 159 еспасачеа Сзазузчсся дбісассакс вуссозодаса асацсаацая сасесссвкас зай сЕцесазчаєча асазссьсоя дуссавчцає абсо зсувосуюає садаєзєеє паю часозучисі ксуасабсса бодссадоадяи всссгячесв сечйсавстс а зах ах ЗВ «їм й -п1йе ЕТ «ІЗ» Ното варієй «4» 1198 аАвроІ1є біп мес ТНК З10 бек ро бе Бех тео ваг Ала декоуві У і В їй 5 -ВББ Ах Маі тих Хі трж осСув Ах діа Бек бів бту 112. Бек зд др
Зо 2 За ев діа їмо отує Зїп бій Був Руб 21У був Ат оБко бїхув Гей бе ї1Є 45 тТух сіб Аза дек дек цей сії; ех сіу Уві Рїо Бег Ах Рів век О1уУ ко 55 ва
Беж біу бек о біу ТЬх о Авр оре Тргоїем ТНт 1)єЄ бек бек ойва Зіп о врко 7а те б сіб Авроває Аїа Так тую Тук Сувобій сів ТУК Бех бек врде рко сте ве 50 Кс тих впе пу біл о с1іу тТпхоцув Уаї З1з т1е пуб Ага Трах Маї Аза А1в ї0бо 105 119 рто бек чаї впе їІв5 ре РКО ро бех Взр осі біз їей пув о бех Іу і20 125. тТвЕ Аіа Бек ув) хмаї Сув ле» тец Авп Ав РНеоТук Рус дкч січ да хо та5 145
Мув маї біп о тЕр Був Ма1 Азр Беп Аіа рез біп бек біу Депо Бек уп 145 155 153 1650 схо бек уаі Тр сі сів Аяр Бех Був Аво о Беє тТнЕ Тух Бек це» век 155 вто ї7Е дек ТЕЖ ма ТЬх точ бек був Ата авр о ТУук Ба Був нів Був с мщії ТУ хво 185 159 діа сСув сій чеї тпг нів о бЗіп Зфу пе бек Бех Ббго Уаї тт пувовах за 200: 205 вне вна Ака бік Зі: Суз 74 «210» 158 «1ї» 487 «аБаз БЕтТ «аї3» Ното Барієт «воли ува
Пі УВІ СТ сей їец бій бек опіу Фу сту спец уа1 и Бхо бі щу 1 ЕІ 10 ії5:
Вех'їєю; вка Іс) БбегоСув АТа дра беж бі впЄ Тс овРНе бек Бек Тук рон 25 Зо
Аза Маж дах ТкроМаї дк Зв діа рго сЧіу їм щіу пев Зі Теромаї рт а
Бех дія тіє бек АвпоЗіл о чіу лук Чех тТвкЕотух Ту діз Авр Бек Ууаї кп ее же пу ЗРу Ат ре тт хів о вех Бра двр ода бек був Ав тик Бей тут
БА 75 во пеп біп мес два Бек їейп о АгФф Аза біч Авр тк Аза Уаї Тух тук Сук 85 зо а віз Аха Тхр Ру вер бій о1у Бе АБротіє Тер обРу сів БлУу Три ех те її5 ї10 чаї тит Уаї Бет Бег Бій беж тТвху Кубв'єїу рко чего узі ве Бгто цей 115 150 їа5
Аіа го Зеу Бех Був Бех Тих бек пі1у Біу Так о ВівсА1Та цей стіу Суд
ІЗВ 135 і40 сей чаї пу Ан тТух впеорко З3и рго ба) Тйгозаї ет тгр Авй с Бех 145 ї50 155 ї5а
ЗА пТу вів Бец тк обет сім зв) нів Тв ве рго Аза Уаї Пец спій век бах 176 175
Бех зіу зей Тух Беїг Бе; бег Бех уаї Заї тп ув) Ро бек Бех дет тва їя5 ї5о вфеч зву тп бій тТаг отук 116 Суб Авп;о уді Авп Ні Був рко Бех вв 185 0 з7о5 тигогрув уУді АБробув Ака уаїі С1іп Ро був Бек о Сувоввр ув ТВх нів за й1х 270 тих Сув Рго БкЕс Сук Бгто Ата РгОо бів Бей ви піу пху Бура век чаї 225 235 225 4
Бре рей вне рхо РЕО пув рто Був Авр Тих рей Мек Іще ВЗек Ака тнг 245 2595. 255
Еко сін о уаї Тис Сув уаї чаї хаії Авв о Уаї Бех Нів и Аврорхо і 255 270
Чаї був брне АвБпобттр о тук Ма1 Варобім Маї схо уаї Нів Авродта ув 275 но ве
ТрЕ пу орко дха бі ЯТи ОМ Тут Авіл Бек ТАК оТук да раї Уукі бек 5955 25 за
Чаї цей тах уді цеп Нів о Зіп ВвроТур опе два обіу Буд 23 Тух був зп5 зЗіо 315 359.
Су пув ові Беж Ав був Вів Бей реє Аа Бко хів ЗМ руб тк іє 5325 За 335
Зет о пув діа Мун БІ Зіп с вкб йкч са Рко чіп Уві тую ТВЕ ТМ Рез зас зав зна вус Бес Ага сли бЗіа Меї їБг о цує Авіа стіп уві Бек їі сп о Сув ре ее зво 35 чаї пув бСіу Бпе Тук орто Бех Авр їз діа Маї бій Ттробій бек ба. 379 Я зах сі зів рРго- сій дп АБИ тую був отйх ТвЕ вто рко ді геб АвроЗек
За ато 3955 ап
Вврозу бек вне Блде оцей Тук бек о Гув їв тик УаЬ АвроБув бек йкгЗ 305 ато зік
Ттробіл віп бсіу Авиомаї Ре бек Сув бек Маї МеББОнНіІв Я10одхв осей ат 485 39
Нів ап обів туп ТВЕ б1іп Був бет їеч бЗег о йей Беж бхо зу цпув 435 аха зав «Віб» Зп «віз 5 «125 РЕТ -213» Но Барієп «й» 205
Явх тТук діа ме пек 1 5
«10 ад хр4ї2 17 «ній ВК «хів Нощо архієп «дпа» 291 уаї сіє Звук бек сі бху був ел Тйх лук Жук о Аіїа дво обЗек о уаї Су ї Е: ха ї5 5ІУ «103 802 «ШтТіх В «йЖИз ВК «2їі3з Ното варієїг «вдо пи
Ттрошїу Авр Хв о бту Ре аБротів
Кя З -3382 323 «31» М
«12» РЕЖ «8335 Ношпео варів «бле 203 дус Аїв бах Зіп спіу Хзе Век дап оТтТкр оппей Вів 1 В 19 «Вій СОЯ «віх» 7 «хіїх ВБЕтТ «2ї13з Ново варієв «4» ба
Зі ді Чек Бех рей б1п Бех 1 й ейїйз 205 «Вр» 5 «ій» рНТ «віз» Нсопих варіви «аб яп бів 312 Тук Вежх бек Рпє Бо ТНХ ТБЕ
1 З «10 (0 «Вії» 7 «ой» СЕКТ «т1У» Ното варієй «ай» ОБ су ве тих БЦце Бег Бей Тут 1 Б «Мід От «йзіж ов «кій» ВИТ «хіЗ» снНоше варів «Айо» 207
Вет дет ВІв; Я1іу вуя Ве «ій» 308 «т11з 8 «вій «ВНТ
«Вл» оНомо зарієй «ап» 208
Ткр шіу Авр бЗіц сту БпєзАВротіє. ї її «йо» ОЗ «й33» 7 «са» РЕТ «213: Нопйкх варіви «аз б
Бек бій сіу Іч11е Щех вво тТтр
АХ КІ
«210» 210 «Ті З «219 ВБНЕ «ЕТїіз Нова варієв «40 81 біу дій цес ї
«їз» 1 «її 5 айлйв ОБКТ «8132 Бото варієй «00» 21
Тук'ошек Бек Бпе с Рксє тих ї 5 хеї0 з 518 «М» 107 «2ї72з РЕУ «-213» Вюто варієд «а00з 21
Авроїзе Ззій МмеК ої обі бег о бхо Неї обЗек б» Бех А1а бек Увьосіу ї С 15 Ме авроАто чай тпх тів тах су ка лів ЗеЕ біп ЗЕу хті6 вет дев о ткр зо
Гей АТа ТкротТук Зів сб1п був Бро Сіу був діа Рго Гу Меч йей Ї16є з5 50 а5 їук піу А12 Бех бек їец бів Бек йіу уаї ро ех Акт Рреовег у зб 8 ей
Зех Сіу бек С1іу ТВх Авр о рРце Так Меч ти 116 Бек беж рео З3Мй ркКо 55. т тв що сій Авр шме йїа тВх тТук'тух був Вів бій Туг бек Ддех ра рго ТБ 5 зв твЕ бле п1у сіп б1іу тн вув'уаї бій пзе Був до їо5 кхиїїз 515 чить 117 «ваз РЕТ «таз Ноте Барави. «ай 23 біз уаї Зіз пей реа 15 бех б1іу 2іу Сіу бе УВІ ОІВ бто піу Сі
1 5 19 їв тек ве) Аа ви бек о сСув Аїа Азїа Бек біу Бе Тпх Рце бек Бек ОТУТ то 2 за іа Ме Бех Ттр Маї Ат бів Аїа БЕО МТУ цувобБІу пен бі ттро уві 38 аб 45
Бех чаї їзіе Бех Бах сій зіу ГУБ о бет ТВ тТух тут Бін АБЮробеК Уді ве БО їшв сіуУ Акб о рпе тв ІїЄ БК Ак авоодЕи Бек обув дви тв ей отТух в то 75 во їжи; сій МЕС Ай Бек рез Ака віз сій дао ТВ Аза уві ту Тух осув 85 во зе
Афаволта Тер осІіу дер біз біу БНб АвБрої1іє ТВ у бій о б1іу тБх пев іо зав ла
Уу«і жнвх уві дек Бех
«ий 254 кпії» 2 хіх ОДКК «зі13» Ношо варієп «п» 218 чабасссяача тпасосачад сссозасадс стозаасассав зсасодасях сасауєуасе ей ассасскчсс чодссадсса здудсассаче авосозссЗа ссудоабаєса позчаачесе ї2о счасзаццссо ссзачстчех закстасаЗзс зЗесаассосо бусзчансЯв сстосесаачо їка азчаєссазсу ссачсчусес садсассуас сСгсассстда ссассовзусач ссгоасачессо 2450 чЧастчвсссеу ссасессасте содссачовоч тасаусачсе споссассво скссдпссву зво
Часассеовач созахаєсав З. з «10» 215 «8119 З51 киїї» дих «ії» Ното ваврівєл «адйв Я чаданкчсавЕ Едссучазад сяусусадає скчдсдсаче соддочаєсво состдачвосуя 6о ссутасузстч ссапеучевс сассіссацес ачосзвсяасса бодзоасеєцуус ссастсачасо їх пстддсавчя чдасєздваату пасасссосо ассазчсяадес азочозадад свзособаскяс їв зссчасачоЗ бчазчаЗсоу чЕссвсбаєс вассуччаса асадсавова пбассссяває реч сіцсасвтча агачссодса аасспвачас вссдссепуї хсбастяаєос сзвастатато Зао сласцчазУучсс: ссчасаврсса чдузссасоЗс асосувдаєса ссагсаЗсьс в зві «Жій» 415 хиїї» 14 «я? ВЕТ «Рід» НСпє вврієт «400» 816 вВаротів бій Меє тис Зіл о Зек Бо ет бек о део Бек овтая Беж Уаї с31у і 5 10 15
Авр:Ата Уві тТрт лів Ту Суш Ак АЗа бЗеу ів Б1у її бек о АБа тр о би за печа Віа ТкроТул ств Я1й Був БЖО йіу ув ака рко був ес рев ої16
Я жо 5
Тус сФ1у Аїа бек Бек Ге сп) Бех Я1іу уаї РкгособЗек Ака бе бех п19 а за 50
Бех сіу бек зу тв Авр Бпе Тит Мей тв Ії Бек Бех їж Сїп ро
Зо 75 во бій АвровБНе Аіа ТЬК о тТукотук Суб біб Стій Тух бек о Вех Рре рБге тає
Жтнровре Зіу бів піу Тахо Був уві Біо щІ16 був о Ак Тих Узі діа та 905 У їТо рко Бет Ууаї Рпє 18 Рне РКО рго бек двБробій Зк їж; був бжех Бу 115 ї2а із лих Аїа бек уві уві Суб рем опе Вп овал Бпа о тТух Бий вкЯ4 Зі о АТїа 130 135 хіп пув Маї біт отТхроцув Чаї Акродеп оАіа бен бів беж ЗІ Авподек сій 145 Ії59 ї557 1595 біз Бек Маі тик бі бЗ1іпоавр бек Туз Аворобек ТВгоТух бек Пец Бех їб5 їла Кт век Тит Пен тТнт Гей бек пу біз Ар отТук То був нів суя Маї тує 1835 85 то
Віа Сув вій Уаії ТБ нів б3п б1уУ їди Бек бек орго уаї тат був овех 195 295 5
РНе АБП Ака бІУ Б1О сує 210 «зїпз 817 «йїї» аа київ ВКЕ «ві3» Номо варзет «аапх ЗВ с-іа чаї 5ій Геь тей біз) бек зІіу бі Біу пк аї (1 рго У ОбІ1у
1 З та 15
Бег Бей Акч їн Бех Сув Дія Вів ет сбіу рпе ТвЕ РНш Бек Бех тух хо 25 зо
Віва Мек бен Ткр Ма!ї аа бід Аха рко сіу пев осіуУ зе» сід тую Ул1
Зк 49 45
Веху уаї 118 бек Зеку 1) бі Був Бер о Тну Тух Тух дл Авообех Уаї 0 Б во цув З1у Ако Ре Тік ф1їє бек вка Авро АВ Заг ув бвип То яц Туг
Б та 7 во ївцй біп Мей Авпобек цец Зхч Аза біч о Авр Тк дія Уа) ТуУух Тук бук 8: 50 5 діа вт ТкроЗ1іу АБр осі о сі впе авр їі тТхробту зіпосту тлюоцем 165 105 1х5
Уаї Тс Маї ет Бек Аза Шех ТУ ув біу Зго бек Маї Епе РБго пев
115 20 їв вів Бгто Бех Бет пув'бЗех Тих бек чу СТУ т. Аза Аза бев З1у Сув 130 35 149 єм Чаї цу бвротух Бе Бга с3)33 рюо ха3з Тк Маії Нед ТхроАвИи Зех т45 їБ5а 155 6
Зіу Аїа рез тих Бек біу уаї Нів' тик РбБе рко віа узі ем озіп ет їв 178 їз5 бек 31іу Без Тут Чек їсс Яеу бехо Уві Уві ту уаф реа ех Бех дет і80 185 Мо ї- обВіу ТВжЖ б Ту тТук Жіє Су АБла Уаії АвпоНів Бук о рко Щек Аби ї55 то ЯК. тик Був бні Адзроьуя дже Уаї бі) Руо обув Бек суя Ввр. Був с ту Нів 210 ІБ 230
Тих Сув вро орко Суб Ро сАїа Руб ссаіц їеш т8п о сіж ЗІіу Бко Бек уві
125 23 235 235 виє цем Бізе РКО РКО був вхо Буз АвротТнкК Пец Ме 118 бвгодта Тве 45 250. 255 рго Зі Маї Тк Сув уаї уаї уаї Авроуаї ЗехгхоНів дій АБо Бео 01 255 27о уаї був Внесдви Ттр оТукоуаї Азо біу маї піц) хУа1 Нів АвБподіа Був
РЯБА 289 зн5 тт с сцув рхо Ака бло бія бів Тук двп о бетх Тек оТук Аку хуаї Уві Бет ше 295 І 50 чав тей Таж Маї цей Бія бій Бер Тер о Бей Авий сту вив Ма стук Був 05 Зо Зла 320 сСув уз Маі чат дво Пув бів бец ро Діз Еко їіє 3м бує тп отїЄє
Зах. З3о 335
Зет цув Атасвьув Зіу сіп Бго Ак біз Рго біп уві тує Тбх їй ВБко
340 Зав зво
Рхо Бех АкЯ сій бій Меє тТвкт Пук яви біл аз Бек їеи УвВкоСув цей 355 зво Зх уаї Був п1у ре тТук Вро Всу двру о ї1є Аза уаї сій Тср сід бБег Авй
Зо 375 зво сту іп рес бій дви Два ТуУук Гук ТБЕ ТЕ кос рго чаї цей дер Бех зва зУй ЗУ. 05
АвроЗіу бек о вБпе Бе ей Тук Ббет Пцув Гей Так оуаї АБр опув бек АКа аО5. 210 тк
Ткр біп бій зу Авип уаї Ре бек Сув Зек Ма! Меє ців би діа хеч 425 425 3230
Нів Ап нів Туг тк б1іп обу ех ес обЗек цем Век обхо Ту пуз 135 аз за5 «210» 518
«112 5 «Ва» ОВТ «віз» пожо варієп «4005 РІВ вет тухк вів мМеї бек 1 З «Щ10з 715 «й11їз 17 «й1йз БЕТ «813» «Вото варісв «вдо» 218 чаї їїєе сіу Бек Сів З3іу Був вес тВх тую Туковіа АкроБек Маї пуб ї 5 То 15 чу ча30з 220 «кЕ31з» В «еїй» ВЕТ збо
-й33» Нопю варієй «4005 220 тТЕроБ1іу АБробіш Оу РБе АвБр ї16 х з «ві» 221 «2115 1 ха122 РЕТ «135 Ното варівд «400з хх
ВЕЯ Аїа Бек сід Біу тіє бек Авп Тур оїен дів 1 Б 16 «ій» ЙО «київ «таз РЕТ «213» Но вархет «абз лив п пьуУу Аїіа бек Бек Пи біп оВах
З а
«В10х 823 «й З «ші2з РНФ «ліз» Кошо Барівй «апа» 25 сіп зій туко век Бек рпе РЕО ХЕ ЛЕ 1 5 «вад» 274 піз 7 «2ії2» ВБЕтТ «вії» Ното Барісп «МО» Ід спіу вве зах Бре Бек бек тух 1 3 кллазх 975 «Вії» 6 «іа» ЕТ «тії» НОВО Бараівп
«аб» 85 сіу дех біп осіу був Зет 1 5 «2102 ва «138 8 «812» ВЕТ «2132 Вопє Барі «в00з хх тЕр ліу ввросів сік Бие Авротів
І ві «айв са «1187 «Зі25 БЕТ «13» Ного вархеп «аби 27 век бів ЗІу Ії2 Бєк Авдоткі їх 5
«вт ЗВ «Вік» З «З17» ЕТ
Тіз БНото варієц «оп» згВ сіу Аїв бек «5305 295 «2115 6 «?Т1йх РЕТ -213з Ношо варієв «а0бх 25
Тухк Бек Век Бе ро ТЕ ї р «йійт ВЗ «й1ї» 07 «Ми» ВИТ «213 Ношо варієн
«або» УЗ
Ар Ге біп МесС тег осів бек Ро беж Зек без бе Азіа Бех Уві су ї С хе 15
ВБВОАТУ таї Тк хіт ТЕ Сув вхч Аза бех сіпосі 16 бековвц о Уге а 25 зп тез діа Тер о тук Суп біл пу Бо віу ув діа Бко Був їед о Бемч ї1є з5 я 25
Тух сіу Аіа Чек оЗек їец бій бек біу бв)і Бко дек Ак Бне Бех ПТУ 5 55 су 1у вех «3у ТВЕ АвровББе Тк це) ЖНЕ Ме бек век їз ій сВуо ти тв во біз Авровве діз ТВу Тукстук Су о біп біц туго бек беє рре Бгто тнУ 85 зо З5
ТвЕ Впе сіу біп п1)у тік був уві Зто тів пу ї95 ї1а5
«210 3 «211» 117 «812» РР «213» Нота Барієй «400» 31
См о маї іп Пеб ем ан» вет сту ЗБУТУ зі аз бів ро у ЗІ1у 1 я їб 15 щдекопви Ату рез Бех сук АТїа Аза ББЖ (Ту Бе ТТ Бе бек ет Тук шо 25 30
А1а Меї бек тер чаї АтаЯа біз віа Ро піу ув бі рей б) тво 0 В.
Яек баї їїє біу век шій біу пу бек Тих Тук тут Аза дер ех ах
Зо в'я ве ув зіуУу АЖ воза сте гі Бех Ак ДвроАвБИ бек був яп отнЕ Бей ук в 70 75 ко їеи іп Ме дез бек бен йто Ата бій ввротТнт дів маї Тукотух су 85 Зо ВУ ліз Ага ЖХтроату варовія СТУ Бе Авр хів ТтТтрому вату тТвХ пем їп5 то5 115
Чаї тних Уаї Бех ек «210 а? «в1іхшм Зх теїг» ЧЕ «віх» Ношщше БАріша «йпдрж 255 заагссача козсссацад соссадесадеі сочазезссе осугЗзУсов сечачесасс о зссасстсчес созисядоса оадусассаяо аасгудсвоу стічаєасов дсадаазете з
Часаачдсос ссаачссаст дасстасчас зссадесссо косадвасяя содЕассваос хво аздабвтсвзуси чзсачсччсос сеуфасодзас сісвосссідча ссебсацсва себасачесо 240 тадавекісп ссасствоса сбуссвасваяа сасочсвасо тоссозесаєс скосядесає зп чосассавая содяававсва Я зві «9165 835
«київ ЗБ
«лі ДНК
«Ві3» Ношо варієй
«ад» сах зачусссваїє гчустдавага сузсазаччо сузабасачи сЕаЗсячсву себзачаска за гокрасясоЯ ссазсзаєсь саєостсацче аячссасдєса Спас уєУє содссаччсо 1-й чесуЗсався уастячанся дагасссясо втссчсавсо адсссвадач сасстаєссяс ви зссзасазчеу гозадздеся зессапсвзоо адссудоаса асвосяавава сзссебдтас Ай сторсасаєца асадосізсо дассдчазчас ассзссясчс астастороас сачасочазе 300 саслазачЕс ссчасаєсся чадссачоус зсссідчссв соугсаяетс св зії «8410 234
«вух 1
«їй» РЕТ
-813з Нопю варієюв
«Абй» 235
Авро хів сідсмеж тп ства Бех РКО Беб Бех рей бах діа Бет уві бі і З 195 І дар дтп чаї тах її тпроСув Аха Аз1з Бес іп осіу їтіїє Бех Кап Трр 20 з зо ем сдіа тк о ТУуєЄ бів бтя рУБ Бкс пі був Аза Ру Був зей оївр ї1е
Не 40 35 тук Біу під Ветї Бек цей бСтіп Бек Зіу Мазі Руб Бех Адку впе Бех сіу зо БЕ о
Бегозтїу БесоЗіу ТвЄ Авр оре Тв огец тТВх пі бек Бех ем Сіп ро
ЕВ 70 75 ве са Аза рде Віа стдІ тТук тТУухХ Су біп Зі тТух Бех бВет РП орто ТК зо ав. тих Ббе біу бів сіу тЬт пув баї б) тіє Пузодкя Тв Уві Кіз діа 100 Ха 11йп рхо бек уа1і рце т16 ре Бго ро бек АвробСій сій Бен пуво бек ст» 115 120 125 тато ваха вет уаї Уві сСув рем пеш зво Ва Ре тТух вто Вк са Вів 135 хз5 140
Був ЕІ сіЗз туросрув таї дарсдяп дій ей біп Яет о біу дей бах Ф1п 145 їБО 155 160 із Бакоїваі тТркосі спів дер ех пув Азр о Вег о Тк Тує Бек опей Бер ї655 іт 175 вето тв їжи Тпт без Бех о Буя АТ Вер отук 10 Бу нів Буд У Тут 185 тах 155
Віа Сув СМ Ма) так о Нів сь п1у рес Бех Бек ро Уаіїі тік Буз ет ї55 а ЗО тре дк Ака сіу під був ло
«21ї0з 35 «Ті» 447 «2325 РТ -513 Но варїіен «4905 335 сти жі бі Пеасбеб» біб беж СТу Бі 5іу ел мах біл бе біу діуУ ї 8 10 15 век іжиі Аа їм о бек су Аїва Аїа Бех сїу Ріє ТБ Бе Вес Бек Тук а 25 50
Аа Меє бЗеї Тхр Маї АхЯ ста діва Ехо бЗіУ їж бі стека ОБ Тгротчаї зв 20 45 вавкоуаї іє сь Бех біт б1у пув беготну Тує Тук дів дер дах Мах о в 55. тув о віу Ака пе тру гів Беж Ах АвВроАБА ЕХ Хув'АВИ Тлпж Бемотує 7 75 во ей бій Меб одвп о век цез Ага Аїа су АзротТвкК дів уаї тух тус сув 85 зо ЗБ
Атака тІр сіу Авр бій біу РПе Аво ті ТЕробіУ щі отіу Таж пе 1955 ї05 ма хв1і вх уві Чех бет Дід бес Ту опув Сіу Бро беу уві Вве Бко пе» 115 129 Е
АтТа Рхо Бех дек Пув бек Тк Бех Зі біу тпгоАїа Аза пе біу Суд 135 149 ївисуаї пув АвротТут Ре с руо Сів реко Уві тве Уаї ет тжро АБ ет
ТАБ во 155 ї50 біУ іа реа оту бекобіу Уаї НіБ РТВ Ріє Рго діла хаї сей біп Щек 155 7 їі7т75
Бек 1у рес Тут Бек оїє; БВЕ Бех Ма3 Чаї Та уаї Бо Чех обех бег 180 ІВ зо ведосіу ЖвЕ СТ ТВ отТух їЩїе Суво Ап Уаї Абв нів був БК Бех ля хз 2ах 805
Тит оцув Мві Авробув йдуЗУ Ууаї ЗІ кто Був ех Су дев був тих Бі 215 215 25759
ТтТНЕосСув вто Бо Су ргосА1а рго З1іш Без бе с1у біу вхо Бек Уаї ази 235 2485
Рпе тез Ре Бго рРго МПув орг пу Аво тах рез омеб х1е бег дк Тв 245 259 255 вко ім маї тне сСув уві уггі узі Аво Маї Бех нів зі дер рхо пім 250 265 то чаї вуз Ре Ап оттротук Маї Ар сі хаії бій Уущі Ні Аво діа був 275 зво 5 тТпж Був о рго Ага ат 13 бів Тук Або бек ТИжх Туг Акп Маїс Майї вет 255 зо
Ууйаї їв; о твк Уа Бе) Нів бі АБроткр Бех БО Ту був бі) тук Був зва ЗІ зіб зго
Су Був оуаї Беї Би цу5 АМїа Мем Бко дія жо ї1е ЗІ) Був тТвх ТІ 325 Зо з35, ват о Пув Аа су біУу біп Рго дк сій вхЄ бЗіпомачї тує Таксїєа Бко
Зо за5 355
Рго Бек Аха біб; сій Мею тТВЕ пу деп Осій Маї век ев ТЕ оСув цей зве зво ЗБ чяі пув біу бай Тук Бро Чех вер: ї1їе бів Уа) їз Ттр піч вет дв
Зв 375 зно спіу сів Бко біо с Авип дв оТуг пу ТП отв ро бро УВІі Пецодвробет ан зви ах да авроЗіу бек ре Бів цен о Тук бек був ву Твтг Ущі дерогуз Явк Ах 05 сже аїБ
Ттр'єїп сто О1у Авпоуаї рне дек був бет Маї мес Нія бій вій Цец ато див «30 нів аБо Вів Тух Трж бій був БЕТ ей Бек їм век рРІб Б1Уу ув ч35 48 4345 «2105 835 «и115 «ТЗ РКТ «йК3з Ново бапієц «Об» сл ех ТУук Аїа Мет вв 3 З «й» 37 «й11з 17 «ИТяз РКК «Жхі3з» Ношео Барівп «0028 537
Віз тів дБ АТа сі сіу Був бек їТвгоТут ТУК Аїа АБро ВЕК чаї Був
1 5 16 15
У
«лох зав «КЕ1ї» Я «ик ВКТ
У» пото варієцй «490з 38
ТЕр СіуУу АвросОТЬ сФіу Ре Авроте: 1 5 «йїібз За «ії» 11 «2122 РЕ «813» Ното бБарієй «до» 235
Акч о Аїв Яек о бтя с1у тіїє беж Авт тур беж дів
Ух 5 10
«ві» ха «112 7 «дій» СРЕТ «21і3» Ното шерієй «400 240
Зіу Аїа Бшх Явек Бей Бі обеж 1 В «30 241 «пії» 5 «ві» ЕТ кхаї13» Кощо верієй «АС Ват.
Зіп бій Тут обех вег Ре роса Твйх ТК ї 5 «Оз ча «ка 7 «212» ВЕтТ «213» Ноте вархєюв
«00 ВЗ
ЧБу Ріе їцт Ре бет Бе отує 1 5 «іс 243 «ШТ сб «ді2з ВЕТ «хі13» Ношо зарівй «айох таз
Авповіа сіп шіу ПувБ Бетг 1 5 «Б1б» йп44 «Из В «едіх» КЕ хвіЗ» номосварієт «аб» ша
Тер озіу двробід с1у вБПе АБр оті ї т
«ЕХО» даБ «кпиз РЕТ «313» Нопюо варієстї «40 245
Бах піз бСіу Г1е Вех Авпоткр 1 5 «ВО слав «хіх а крій» РЕТ «йх3» Ношо зарієй «аб иа біу віз век 1 «210» ЗАТ «віїз Є «віз ВЕЖ «213» Ното варієт ха» 87
Хук веж Бек рНесвто тиг
Х їх «й130х 748 «ті 107 «-2і1й» РЕТ «еіЗ» Нопе варіви «поз вав двротів сто Меб так о бтБп одег орг бек обет цею Зетх Аза ех Уві ЗІу 1ї КІ 19 ї5
Авройха уні тТВж тів тлх був джу Аза Бех сіла зіу т11е бек Ави Тр хо я по їеви Аза Теротує зрад іп обу рРтОо бу Буш Аза Рко Був реп дей тае 5
Тук озіу Ата Бет вех Бей зіп Бек бЗіу Ма1ї Бко бек дк ге жЖех п1у 5О 55 У
Бак сбіу Бак бЗІіу тТбк Авровпе ТНК ес Те лі бех ех пейобіп вто а 75 зо
Бім Ав ве діа тк о тТух тух Сув бі сій Туг бек о вех Рце вхо стнх ву зо 5 лит вне біу се сі тик опув уві ПМ Ї1е пух 100 5 «й10 дав «из 07 «212з БЕТ киїЗз Мото зарієп «а00йз З48 зій уаї Зіп обемобез бій Бех У У 01у їм Маї Зі Бко у зу 1 т 10 ї5 пеї ле аку Кей бек Сув'яїа діа Зехг сіу пе Таж Рие Бек БЕК оОтук 25, З
Віа Мег бек тур Ууаї Аку бій діа Вго сту цу о сіу рем Бій Тев Маї
25 Б
Бекодів тІїв Ап о Ата бів (1у ув Век тах Тук отут Віа АвроБек Уаї 5о Е во ув 'сСху вгоа Бе оїйх 116есбек Аку АвроАвИ бек Був Авп о Тну Сей тує за то 75 ви їез сіб Мес Авй овех еп вка Аза біз дво тах Віз Уаї Ту тТук пув
ВЗ во 5 діа дхч ТхроЗьу Авросі: ОХу ВББе Азротіє ткроІіу бій о оіу тТВУ цех 109 105 110
Ууаї їн ах Веї Бет хи «аз 255 «її» ЗХ «ра» ДИХ «віз» «Нощо варієп зЗ82
«аОй» 7250 чавакссзза сдасссазац сссесазсаде сосзацсяссво зосатачаоча садачьчасо 85 аксассітус судссадеса дудсассзоас авось сссаптакоз здездаауссо 120 чесавадссс ссаачевчсь засесвсоус десагосссе Бчсадчазеуч сстопсеваче тво азасссадсд с дсассяадптсс сассассоас сЕсвосстца ссяссаздсач собосадесе тай часчассвеу ссасстастіа ссчосачсвна гасачеоваст гСссевссяс тессзцесаа 290 ччсассвазу Есаваєтсав ч 23 ке» 251 к83їз 35 хтїйв дик
«733» Вотшо варієп
«об Бі цачвзізчсаа Босбссзаза сазсчаваЗс соядчеосазо ссспооасач сесбчачасох во тссресасоу повссцуоєї свсосссачи асстасасса сзваскачче седссзуугса 120 сссзчсесзазу Чассочузаєу зесчсссзоес згсадечссс адоЗсазчаз сассбассає 1їі89 чесчасачиЗ їчЧавадоазсов зусвссаєсс десстуаадеаса всассавсва сассоваває 250 стдсячавчЧа зсадбсвуєя зассчачуас аососечкає зоБасевсас сачяаєцваде 300 засчдавччост гсзасассто ячоссачядс зоросцасеа совзссазесс а зі «йилоз Ба «2112 814 «212 РКТ «813 Нопо вархей «фай» 55 двротіє Сіпомеє тТьЄє біпоВек ру вет бек дей бек вів Беж уаї 1у їх 5 10 1Х5.
Авгр о Аки маії ТПс тіе Тпх Сув Аку Дів Бех біпобіу ї18 его Авпотер 29 я за їез діа Тутротук піп б1іп Був Бсо біу пув діа Бго пу їжа еп її з5 ай 45
Тук пу Аа бехт бех це ошіп БеЄ щІ1у УВІ гпЕЄ йех ач Епе бек Ії
БО КЗ о вах шщіу пек пту Ж АБроРБе Тих цец СБК гТте Бек Бах Тем бій сво 65 70 75 85 із АБИ БОБ о лів тах тую туї Сув біпосіз Тук беж бек ре рко сту зо я пх впе сЗіу піп осіу То оБув узі СІ їТе був Акч Тйх Уві. Ата ЗІтВ мо 105 зма
Бга Бех Ма впе тіє Рпе орто рго Бех двр ості біп пе; Був Бех пу 1ї5 129 125
Тих Аза Чех уві Уа) сСув їси зб Ал ой Впе тТух рЕЄ с Ата біз дів 139 135 хо вув уаї біп ТрроПув уаї Авю дя діа Ббем Зід ех о Зіу Авповек стій таб т5й 155. т66 сід Бек Уві Тих біз сій дер дет Іув дЕр Вву ТОК Тут Щек їди Щек ї65 175 175 бек Сну Бецд тр теп дек пув Аза ввр о Тут бій пуб Нів пув уаї ТтТух хво 185 150 діа сСув ти маї Тк нів бій сіу їеч Бек Шех БКго Маї Тькрогпув бек 195 200 вок;
Бпе дви Ак 51у сім був ре «піт 3 «2112 447 «12 РИ «тїЗз» Ното Барівп «ява» 253 бЗта Маї бій оїви лез бій обЗеє сіу бшіу сту темі ба) біп Рго біу Ту і 5 і ї5 как ої АхЯ Ме Чеє був Аза Аіа бек біу Бпе тіх Впе Зекобвг Тух віз Ме Бех тТтр УМ Аха сій АТ Бхо С3У зд о Фіу ев ста тк оУвА
Бек А1а 112 Ввп оАЗа со біу був Бек о тТвВх Тух Тук Аза двробетк Уві 5О 55 со їхв о зіу АкЯ вне ївх 112 бер Дюка Ар вві бас МувБ Ав ТК обецй Туг те т во їж біп Место Ап бек їжа АкчЧ Ай 10 вер отв Аїа Маї Тук оту сСув 85 зо ах вів вх Тгр шіу дер біз с1уУ вце Азр о тіє тур осіу стро сіу ТВ (Би оо 1055 10 чаї твг Уві дек бек Аза бек Тв Бу З1іу роз век маї рив вхо с Бец 115 ї50 1725
Аіа Бхо Бек Бех Бу Бех Тпх бек БІУ бху тТвх вАїа діа ев сту Су 130 ї35 140
Гей маї Буг Авр оТух Ре Рхо бій Рбо Заї Тву Уа о бет Тер Ави Беїг їа5 150 і55 во
Зру Аїа беа тп бек озту уаї ніз' їТЬЕ рРпе ро дія маії гео Зіп бек 155 ї75 5
ВЗек сту пе Тук Бег пес беї Бех узі Уаі Ту Уаї Роз Зех шех бек їв ї85 3.жо це біу тих обі тпк о тТукої1е Сув Ав Чаї АвпонНів пу вхо Бек дв та по зп5 тт о зув Маїс дер був вка Маі спі Ре Був бек Сук авродув Тих Вів хо 515 а тво осуд о Бко Ро Сув ро Аза ра бі рей Сем обіу б1іу Рго Зву Ух 230 235 зай
РБлпе тей Впе вго Ро Був Вхо цу Авр о Тйжх ей Меб їТе Бех ДІЯ СтвЕ 245 50 Ба рсо бі; Уа ту Сув уаі Маї Узі Авороуді Бек нів 15 АвБровго іш зЗ88
280 255 270 чаї ув Рре дбБлотТтр о Тук уаі дер обіу баі бій Маї Нів вп діа буд ря 289 285 тик Був рко Ата Зір ЗМаовій тук дет Бех тик о Тух Ат маї узі Бех 29 вь зай
Уві їей ТвКоМаї ж» Нів біп Авроттр зей АБИ піу Був п3а о тук Був
У з19 315 зо
Сув бує ах веї век Був: Аїа цен схо дів Бко ї18 біз спувотбх ї18 325 335 аз5
Зек пув вІа сув зі ої БКо дк 013 РО 1 Уа Тук Жбк о Бей ро зав заз зо гРко Век дкЯ 51 ЄМ Ме остик о їуво Ав сій уаЗі бек зей тик оСув бе за БО ЗЕ чаї Мув зІїу Рре туї Рхо Зек АВр оті АтТа уві ій Бо» бі Беж АБИ з85
170 375 зно
ОІ1у бій Бо біц Авв одна тую Бу Таж ТВх обро Бко Чаї цей Авр Вех ав за зав 0 вЕроСіу вех ре Ре цей Тук Щек Бувоївє» ТБ Уві Ав Пув Бех Ах а5 а19 45
ТквоЗій сій Сіу Авд уві Рре век Сувоветг маї МеЄ КІВ ЗІ АТа ре» го 425 іза нів. Аши нів Ту Трг обіп о буд дек сви Бек пе» Бек орто сС1у Був аЗ5 чо «ах «кла А «811» 5 «12 РЕТ «33» Нопю варієт; «ао» в5а век Тк діа Ме опех 1 БУ
«ВБ0з ав «вів 17 «їй» РЕТ «213з Ношжо зарієл «дар» 255 іа тіє дат Тих сів біу цпув'яєк ТАЖ тух тух Аа Авровек маї пув 1 а 16 ав чу «ТІ 255 «іт Б «Вій СВТ «из» Мото варістї «00» жа тТкЕр 1у авр о ЗТи бім ве Авроїтіо ї в
«105 257 да «Мт» ОВКУ «Зїі3» Нопе зарієй «або» 2557 «Аа Ата Бет сів сту тле бжу двт; Тр оПпеи дів 3 я та «810 758 «іти 7 «Ва Брт «віз» нОоФфо заріва «аб» 58 біуУу АВ бего Бек цез біп век я я «еп» и59 «ТІ З «ки з ВЕК «йИхЗ3» Ното варі «Об» ХВ сів зій туко Бех вет Раз ро Тих ТНу 1 З «йІйз во «211з 77 «їй ВЕТ «213» "Ностео зарієлп «ай» 250 сіУусрлпе ТНК Епе бек бек Туї 1 5 «ЙО» ваВї «В 6 «Ай БЕУ «Різ» Бощпео варієй «425» 25
Авеп тп бій слу рув вех ї Ну «ьо 562
«ії» В «Мах ВЕК «213» Нофе варієй «вййз Би тер о з1у Ар опій сі вне дяроТіе: ї ей «їз ва «112 7 «еиї2з БЕ -вї32 Ново варієй «Ай» 263 кетобіп ж1іу піе бет Аво тр 1 5 «ай» Ба «лів З «вад» РКЕТ кіз» Нното варією «Ой» вва сту Ака Бер ї «10» аб ей б «иа РНТ «213» Нопею варівт «абз я
Тух Бет бек пе Бко Тву ї З «ли» 266 «ЕХх» 107 «312» ТЕТ «Зі» Нетпо Зарієй «ййбх тб
Авр оті біп Мебї стпх бій бах орко дек Бек о їєй цех вів белоуаві су ї 5 Б 15 двр'дха Чаї Тк оїз1е Тнх о сСув врч о Аїа цех біп птіу ї1е Бек АБО оТІр 5 30 пей Віа тур оту віл осб1іпй Був Ро сіу Шув аїа рхо був рей бпей їїе в 19 25
Тук шіу біа беї Євк рец бій Баехосіу Маї Бко Бек Ага Бра Бек С1У 50 че Що бет зіу Век біУу Те Аврорпе ТБт рец Так ІТїе Бех Зег цем си реє 70 75 ва сів взр вве Віа тт Тук тує Су о б1пб 512 Тук Зєх Чек о РБе вто ТВУ в5 зо 95
ТВвЕ о впе біу бів біб ТВ Пук Маї 15 її пув та 55 «10 267 «аї1їз 117 «3122 РЕЖ «пій» ЦоОпо вшаїей «або ВЕУ пли уаї біп Бен сїей 10 бек бі бім ЗІ дез мді ЗіБ ро сі оІ1у ї в та 35 бек ем Акоб цеюовек Сув вівса Чек О1у ре ТЕ Бпе БекоЗех Тук дів Меб бер тер уаї Аха біп діа Бгто піу пуг бСіу цей Зі тур УВІ
ЗЕ за 48: бБегойта Її Аси Тс Зіп о а1у ув Бек ТБЕ тТук тут Аїа дер бек Ууаї
БО У бо ув З1у Аа Бме тпк їТе беж Ак дЛЕр Ан Бех Був о Аеп Тк ей тук 65 7о 78 ао
Брец сі) Ме с Анц бел орєи джз Аїа З10 дер отнх Аіа уаї Ту Туї Сув ях зо 95 діа Ага Тер озіу вБр бій сіє вна дер Тіє Тур біусстїп піу ТИКОоЇей з3ао зо 118
Чаї так отуаї векоБек «а» БВ «Вії 81 «їй» ДНЕ «йха» МНоше БаМріст «абпе лвВ часвоссаца сезсссазат сессацесвчс сьзазечеса зоціочесса сазацсовос 50 акссасєсасс дузссадсса задедксачс аассочеваєт ссвдасвсох дсадавУвоо 188 часеазассс ссавчссаст Засссвсоаче зссаасвосс Сбосавазозу сасопедаче 188 зчастсачсе зсачеоччесо судсзсеуає Сровсостоа ссаєссацвевч ссгдвацесо Хай зазаассгсу ссвоскаста стдссаусяз басазсачев сСссоесассає суксячссау Зпо
ЧЧевссазоат спучавассза я ЗУ «210» УБА
ЕТ ву «п172: ДНК кл» Ноше варівй
«4002 х89 чачзчсасавЕ Єцстчаозава счасччазае ссочсосаде ссвосодсат соєдатасоо ва ссесцдсчсся сгачоозчсьЕ сасссссаде вчссвсзесе бузустЯаУх ссосевочеє 120 сссадсааус часідовзаса ядахоасосЯдсо ассадсовосс ваудсвачаз сасстассяс 186 чдсссасацеч сдаавдецеся Чпесрсассаос азосжоераса асачсладва сзооскатає 245 ткзчсацзасда зсацескЯся дссдвучас восасечечє асбвоссчвдс саочвсзцаде Ка чассазацес кстасабста Зззассачеочо асссгазуса седтсвпсіс са зБІ1 «кій ло «кіїх 215 «ній» ЕКТ ефІ1п» Нешо варіей «Фа» 57
Авр тїе о зіп о Меє ЖХбгозій Бек о рго бах Вехк їєц Бег Атїа бек чаї 01уУ 1 5 15 15
Ввр ака уаї Тих їзе ТіК бує вха Аза беї Зій біуУ їіє бвЕ АБй Ттгр о 2 зо їєш Аза ТкротТух бій Зіп Був Бгто сіу Був Аїа Ро пув ей Пец ті
ЗВ 40 а
Ттк 1у вів бЗет оБек їжи Зі Бех Ф1у Ха о вто бек оди Був Зек щу аб вії бек Зіу Беж сіу Таж Ак о рБе тТве БемотТвк тів Бек бек Бей біп вхо 65 7а КЕ во сіз двр бе віз тп отТук тук Сув Біло ої Ттух ех Бех ЕБпе росте 85 20 5
ТВ ре сіу бія сіу ТрЕ Пув хаї пін тів цу дтз так уві Ата лій ї0бо 105 110
Кго бек хаї Ре Ххзе Рре Рто Рко беї бБросбіц бІп їжа Був бет ПЗУ. 115 175 Лх5
Ттвк Аза цех уді таї Суб гей зво Аа вно те Туковко ву сі дуа 130 ї35 149
Був уаї бід тТке рує уаї авр деп Віа де) 012 Бех З1у дБп бетх ЗІ і45 т5О 155 169 іш Бек уаї так За бій зер о Зех Був авр Беї ТК Тук бек рем цеве та їі ї7
Беж тпЕ Гей тик пей бек огув вія Ар отТухк ЗІ пу вів Буг уаії тує ї82 185 тез дій сув сій уві ти нів іп с сіу їец бех Бех ВБто уаї твж Був о Зекг в па ах тпе дви га су ста сук 710 «кій 271 «11» 47 «вій» РЕТ «13» Ноше варівп «ай» 271
Сів маї бі» цей пей біз ех бі з1у чу та аз бЗіпобхо біу спіу ї а З 15
Бах їжи Дкщ їз бек Суб віза Аза бек й1іу рБе ТВх Ре Беїх бек тут о 5 3
Аївв мек беї Тор уві Ака Зіп Аза Ко біу Був 01у Без ЗБ откроМаї зо 45
Чек Вія 118 вни тих січ сіро пу о Вех ту ТУ ТукК Аїа двр бек уд ат 55 Ба вВвув сіу с Ака Ре їнЕ 112 бек Ат АБроАвп бЗеї Був Авп Тс бен тує ще та 75 Во ії» оЗіпоМей Авп бек опе» вхо Аза 31 АБо Твх іа уаї Тук Тук сСув ве о 5
Ата Ата Тк обпіу АвросТи Зіу Вре Авротїе Тер сту ЗІ ЗТ пк їв 105 їв 119 уаї Так уді Чех дек віз бек тах Був о сіу рРко 5гт уаї Ре РО Ти 115 тав та5 діа Ехо Бек Яеї цу Вех ТвгоВек біу сіу ТВЕ Аіїв Ата рез Зіу Сув 130 ї55 ї40 іїемш уаї Був Авр Тух ббе Вго Січ орсо ува) тТвк обаї Бех тТхр АвпоБеК так 150 ЕВ ї62
Зій АтТа іше тБУу бек осіу Ууаії Нав о Тйє Бе бто АтїаоУаї БО біпоВеє 155 170 175
Вех Біу с єм Тут Беж реп бек шок Уаї Уаї бпк ча1і Рго бег Бех Бе їв за5 ї95 тви пьу Тих сіб тк Тут Іще Суз дДепоМаї Ав Нівобув Бкго бу одва 155 200. 205 тпЕ Був о Маї Ар Був Ах Маї сту орхєо Пув бек Суд АБО Був о твт нів 515 йо.
тик оСув Бо РКО Сув Рго Аїва Рга бій Ів ем зіу 51іу вхо Бек узі 285 230 255 285 жйе пем орре Ба рос сув рхо пув Аве отТпк пПем Мет т3е Бах АкУ ТПУ заз 250 255 рко біз уві тр Сук уаї Уві Мі дер чаї Бех нів За дер орБко ОТ» 265 265 379 уаж пув Ре с аАва Ттротух уаї Вер обБіу уві бів Уду нів АвИ вла пую аз зво 285 тик цу Рто вк; бів са сіп отут ввпобех ТВЖ о тТук Аа уаї Маї Бех ж 2н5 -505. чаї ей ТЕк Ча1ї ес Ні бійп АвроТЕр Бей дев З1у був о біч Тух Був .йа5 зо 515 з2с сСув мук у) ех Авп Гуз Аід їжи БЕЗ Аза РЕ ї1е ЗМ) Був так оліє
За 339 315
Зек був Дів цу бту іп Бкє Ата Зіп ро сів Уві Тут ТНк Тем рЕо 34 45 ЗБ рго бек дра бій. сів мес тс був 'Ава бій Уаї Бех Бей оТвс був о пехй 355 зо зе чу«і був сту рБе Тук Бо Бех дво о Т1іє Аза уві За Ткробій без Ави 379 ал зво зЗіу са рсо сій дп одяй Тук Був ТВ ТЕ Бо Бро Уві без Авр Яеї за За з95 айс
АвроЯту бек рра РЦце рей тут деко був Беє Тк уаї Ави Був беж Ага агбе «то і: За
Ткр їпобЗіп а1у двпоуві ра Вет Сув Всу уаї Меб нів с біз Аів Бе а «5 азЗо ків ап НіЗ Тут Ту зій буяє Беї пеб Бех цей веж рто біу Буз за азо ач
«віоз 7Й «йіїв Б «В1йх КТ «2135 Но варкеп «ща СалИ бек Тук Аза Меє бе 1 З «лаз йла «тТііїх 17 «вій СВЕТ «хіїз опо варієп «400» 373
Уаї тигоЗіх А1їа баз біу бек Бек отак Тухкотук рко деро бек уаї Був ї 5 18 15 ату «-Війх ач квії» 8 «ко». ВЕ «Ех МОМОо вараєт
АН МЕ
Ткр ту авО обі су Ріє Авроїї5 ї з «Ва» Ю15 «Вуха 1 «310» РЕК «Віз» БНото варієп «абз свт вт діа бех іп ш1у ліє бех Бл ТУЮ МБ Ата ї 5 їй «10 75 явля «тих ОВЕТ. «ії» доспо шарієл «апсж 87Е су авта ет цех рек с Бех: ії 5 кпій» У зап» В «їй» КТ «йха» Бошо варієй «оз 277
ЗіпоЗХпо тут ек Бек ре Бго тах ТОх ї іх «вібх тн «Її «їм РК «212» Воо 5арієнп «ай» а7тя
Зіу пес ту пе Зек о бЗех Тут ї В «в1бь 279 «11 є
«тай» ЕКЕ «-913з Ното варівй «абз й аїу Ааїа ув) с(1у Бех Бех 1 щп «Вій ВН «аі1їз 8 «Й» РК «ВХ Кощо варієїй «400х 280
ТтЕВ оту Ввросій О1уУ Ве дер їїє 1 З
Ей» йВл ке» «вла РЕТ «біл» Вото варієй кабін ПВ
Бек йіп біу Г3Зе бех Ап Ттрф
1 ях «дій» ЕВ
Кл ше) «Зі2» СВТ «ФІЗ» Всто варієв «Об ШВИ 1у дія шЕВЕ 1 «Тло х В стії в «ід» ЕТ «213 «Ното варів «-4а0 Зп тТук дех Бех Рне грко о тНг 1 З «8102 584 «2113 а? «піз РЕТ
«3132 Ношто варіен «400» Ва дер іїе бій Меб тТвеоЗіп бес рго Явк Бекоївє) Ветг А1а бек уні Оу ря 5 195 ї5
Ав олйісь чаї тну ї16 Тех бує вку Аїа бек оЗіп сіу Ті Бек АвпотТкр хо 25 30 тей Вів тур Тук іп б1іп Був рРхбо 01у Бу Аза Рус Бувоїви пец тіЄ зе 4 45 туї сСіу Аїз пер оБет їви бій Вех о сіу маї Бо Бер Ат рБе Вех БІуУ а 55 СІЯ зеї сху ет з1у ЛЬ АвО оре тт ве отпх гіє Бех Бех т сій Бо бо то 75 во сім дер орпе дія ТИХ Тек Тут Суя Зіп біпотук дет Бековйе рко ТЦ ах зо 5 тТНЕ Ре сРу іп сту Тк Був с мві О1ю ЩХ1є цу та ча «їз» 85 «Зіїз 317 «Кт» РЕУ «2132 нот вкарієй «АФ» СЖВ
Яімн баї сіп ем рец ам; бек Ту біу с3у цем маїі п вхо СТУ О1у ї 5. то 18
Бак тей вка тей бесоСув А1За Аза йак о біу Бе Тр рРпе Явк Вет Тут то 25 30
Аїа Ме бек ТтТкр оуаї Аку біпоАіа ро Зіу Був Щіу цей бій Тюр о уах 43 25 чек хаї Тит біж А1їа уаї зіу бах Бек тик тТук тує вто вБо Бах Маї во В 55
Був щіу Атч о РНе ТНх Ті Бек Ага йвроАвр бех Дув Ави ТВг Бейпотук
70 пу ва їжи біп Мес Аби бес ви АакЗ Азія СТ Авротах Дів Уаї тую тую СУує ве ва за
Віа дха тТЕр п1У дврозіц шіу вМе Ав Тіє трробіу БРОМУ БЕ ТИ їчу тає Во чаї тк оуаї Бех Бех ї15 -105 285 «ії рі хжі ДЕК клії» Боба варіеп «а00з ве здактагссвзда счасссязад соссзодсачс скузадсдепа чодіпадпув сасадчковсс во десассьсгс чачдстадсса чздсаїсадлт вастзасіячя сссозкаєся зсазчавеєсоє 129 ччевацччссс ссзвуссяек бЗасссасдяє зосазевосо кчесвчачену субуссваче ї89 адестссасса псаясусебо саусаисоцає гЕсассостдча сеатсадевеа сседсвуєсо 240
А13 чаччзастссая ссаєстасва ссчосачсаз тасзасачсь сСесссапсас сегесууссви 305 чцсассвада Сддазассва 9 Зак «210з 987 «8 З8А свій ДНК «вів Нещео зврхєть «а00з тв чаччуєчснає Єускчсавава сасочаузс стадедсауо ссодсядсяач сстдачасся БО
Кессасся совасчоассе бассессаво засрасцеся боайаЗзсвеуас ссосвоаєео ї2й собадсвасо заскучзаса часЯяссозва асядосососч сучцсачсвч саоскассво їв ссссасазст коаацачеса ЧЕсзосаєс аосочоадласа асачодачав сассекоюзо 245 стідсачвоза зсадескусу пассчвадає ассасоціяї всбастабоєс садаєчео 90 засзадаась ссдасассец дасссацаас асссеуосся сезбсаусссе а 35 «т1бх ХВ «іїз 214 «віх ВРКт
«віз» нНомо варієїб «фаз ВЕ
Ав; ї1іе сів Мет ТІ біп беж Рко Веї Бек Гей бек Аїя Беж Уаії Ту ї Е 10 15 двракч чаї тах лів тих Суб АТЯ Аїа бегобіп зЗіМ 132 Бек двпоттр ай 25 зи ви АтастТхв о Тук біл сі пу Рго о Фшщіу пув лів БЕс Бувспвв бецй пів 4 У тук зіу Аза Беж беж пе» сіп бек біу Маі Рко бБет дк рРпе Бек 51 5о 5 50 бек Б1іуУ бек біу ТпесАБр ов ТВАЕоїеиа Тож ліє ет Бек їй біп хо щОІ У ТУ во зі ав оре Аза ТУ ТУЄ Жук Сув сій бл о тук бБегс обех ра РЕгОо ТОК в5 56 5
Те ре зу біп віу ТБрорув уаз Зі ї11ї8 Був Ажо Тас уаї Аїа Аїд їба 105 і10о
Ро Жах уаї Рне ї1є Ре Бго рго Яет вар бій 15 Шем Пув Зех (1У 115 т129 125
Ті діа бек уві Уаї Сув бец іє) Ап одДе) бр Тух Броо дга піз Аїа їЗО 135 145 їув уаї З1іп Тюкр цув Уаї Авробвиа Віа пе) Оіп бек бЗіу Ав Бех біл 145 152 155 ї5С бій вет Май тик сіб бій Ар обех Був двродек Так Туг Бек Пез Бек лЕ5 179 хе зает типу цез Тато зев Бас обув діз азр о Тук ст ув Нів був уві Тук во ВВ. 150
Віа Сук сій чаї Тс онНав біпоЗіу тез Бек шШег Рро уаі ТЕ Був бух
ІЗ ой 25
Епе Авп оАкЯ сіу бій Сук їй є«г1бз 2855 «тії» 447 «їз РЕК «213» Нощо зарієп «00 ВЗ
Сіп маї бів Бей ревсоспій ек бі Зіу біу Без Уаї біп ко біу Бі1у ї 5 в ї5
Нет гец джу їж беї був Адіх Аза бЗву сту рНе твх ре Зек цег Тух 20 25 Зо діа мес Вер тур хаїі Ах біб Аза Бго Зіу пу ЗУ тей тТЕромуаї 35 40 ах бек мах твх б1іу Аза Ма1 сту бек Бех Твтї Тук Тух Рро Аво бек уаї
ВЕ во
БУВ Зіу Аа рне ТБ ле Вот Ах с АвроАва беж ув бап тТйхосьей Тух ба 7о йЕе во ве Зіп мес деп Бех Бей вхо А18 біб АБрожик Аза ах Тук о тумл Сув 85 за 95
Аза дру Тр ос1у Авробій сп1у рРпе лАвр о ї1є Тер щу бів зіу ТВх ем 1па 105 уж чаї ТвхоУаї Чек Зек Аї2а Бек тис Пув с1у Рхб Зет Уді РНЄ рус уБо т їз то5 дія Бко Бет бек рув Веу ТК Вет біу біу тії вт1а Аіз Бву ЗІТу Сув о їз5 ї40
Цем Маі Ппуш дво Тут Бе руо ср) Рко Уві ТЕ Ма) Бек Тор Ав дет тах з 154 1650
СКУ Віз хе Тих бек чім Хві Нів ТБк вБпе Рко Ді ді Бен сів Беж 155 70 ниж
Зехк біу с їхна Тук бек їей бек бек уаї Маї Тк Уа1і рго бек Дех Бех
180 185 ї80 ей обіу такосійп тео тук 116 Сув Вапоуві во Ні Був рко Бех Авп та 255 зп тиж цуво уві Агро Був оАдтЯ Маї іа Бго Був Яеут Сув дер Був тлу Чів ій 215 229
Тнк Су Бо Рго Сув о Рго Атіа ро Зій Без Ге су П1у вто Бек уві 225 250 235 24б
Еве зей рресрка бо Був бто Був АвротТваг ес МебЄ тіе век врая ТНЕ 245 зо 255
Вко із уві тах був уаї Ууді Хаї АвроМав Чек Ні с3модяр бто 1» во от ш7а уаї дув рне АБ Тур тух Узі двробіу уві З1ц мМаї Бів'А5а діа Куз 275 сво зв тик дув вто сАха іа бі бів о тую Аби Чех ТнЕОотТує Бке аз Уаф Вву
289 295 300 чаї пецо тн Уаї ем нів біп АвроТхроеиа АБИ біу бу м Туко Пув
Зо 10 15 зо був Був ал Вет АБ мук Аза меч го Віа го ї31е бін пу Тк ї118 заб5 зо за
Яек муз Аза був сФ1у біп Бк АвгЯ Зіц Рто біпоуа! Тугс тик рез ро зай за 355
Бхо бек Аха Сім біз Меї ТНК о Був'йвп сіп уаї Зек ем ТЕБЕ Су пец 355 359 3655
М»і був біу Бпа тулорхо Бек Авр о Ї3іе Віз Маї бО1зч Туроспі; Бех Авт зп з75 зво
ОСЬ зіп ово біб; АБа Ада тує Був тйк ТВК о рго Бко уаї Бей Авробех зав зно 135 6
Авр бі бек рне ве цею Тух бек Був цемотТих Чаї Авробуз бековкє
305 16 15
ТтТкр ші осів с1у. Аа Зал орі дек сСує Бек уаї Мех нів Сім АТа пе
Ка ка нів дви пів тух тах сій пу Бех пед бек тн бек ро ЗКУ ЦуБ 435 44о з кал» 280 «ші З «їй РЕЖ «еві3з нНото зарівп «а30з 289 бек Тут Віа Меє Бег ї а «812 ПВ «В3їх 17 «712 ЕТ «213» БоОжто варієй «йоб» 251 уві тн З1у Аза уві сіу сі Бек ТВс Туг оТук БКо двр Бех Уві був
КІ В 19 ле в5ІУ «кй1Ооз 292 «811» В «20» РЕТ «813» Бопо варісї «аОб» зе туру Авр осіб сіу ра дер їт18 1 5 «Бій» УЗ «віх З «ді РЕК «213з Ношб БЗЮріспй «адо» зах
Ага Віа Беає бій зіу Тіе Бех Аво тер бем Віз
ВЕ 5 та «вій» па «дії 7 «й1й» РЕТ -ві13» Нсто варієпт «АЛ» шЗА
О1у Азавак Бек о рец бів Бек ї З «--51йз 235 в ШК «бт2х БТ «2135 На варів. «ЙО Фа іп осів Тух Бег зетх Ве вхо тТВх тя 1 5 «и» 296 «8312 7 «ати» ВТ
«213 пото барій «пс» хе сіє Ве Тк рчє бек бек ТУук ї БІ «10» а? «ЕТ1х ов «Віт РК «833з Ното вартісні «паз 297 віх Аіїа уві Зіу с1у Бек 1 5 «ій» ЗВ «зм В «ваз СрИТ «Бах Нотмо зварівп -300 738 тур 41у кр 1 пі рБе Аво Те ї В
«10» п хвіїв 7 «ії РЕ «3135 Ношоа зарієй «4цріз 359 вк оЗіпй бзу т11іе Бек Авапотутр ї 5 «2і10з З00 «шк й «йух» ВК Т «233» Бото варієй «ФойЗ з чу віз вех 1 «0» Зп чЧихім В «різ» РЕВЕ «213 Ното бваріги
«абох 30
Жук Бех бБеї ре Рто іє ї З «105 ЗО «ії» 1097 «712 БЕТ «813» Ното зарішй «0» 305
АБролівз бій Ме тик Сів Бех Бо бек о беу цез Беж Аза бЗаех уак Ту 1 хх та 15
Авровкч Уаї тих їі тТипк Сук Ага АМа бек Зіп Суу хі бек взи тер о 25. зо їєю Аїа ттротук зіп'озп був во СІіУ Був Аїа рус Буш оїви Бей ї1є
З ай а
Тук сіу Аїа Бех бБет їн біш Зек сту хзі Ро Вех дкЯ РЕ Мек СК 5О ва ка
Бех сіу Бек 51Му ТОК о Авр Ре ТК пев о тнК ті пек ВеЄх бем Зіп ро ї-е 73 75 аб
Сім Авровце ліва Те ОоТуює тТук був Зіп сі тТук Бек Бех ВЕ вес ОтТву в з 95
Тис вве боту баз сіїу ТВ рув'маї біс тів Був хо0 Ії95 «во» ЗОЗ «211із 41317 «гам БЕЖ «213 НОМ варів «ОО. ЗУ іп Маї біп Бем оїє5 зп Бех б1іу біу і цер уві бір онко зу Б1у ї 5 їо ії
Шек пен оджа БейоБех Сув вів Ата Бек о сіу РЕ ЛЕ вне бек Бех ту по 25 а
Ха мес Бех Ткр о уаї Аке Зіп Ахасрео зіу ув 81 реа Зі Тжромнї в «п 5 «ет маї Так біу діа с таї б1у сіу бек тах тугсотук ро Акр о бек туаї во 55 чо
Був а1у Аку РНЦе Тв тів ек АкЗ двр о АвповБет Був АБИ Так оТец Тут 7 7 8.
Гей опір Ме АапоБекобе! Ага Аза бій АвротТбкК Аза Ууаї ух Тук сСуз 88. за ов
Аїз Вк тТКкр шу Аврос1п бу Ре Аврої1в Тур о біу біпобіу тик це 100 105 1
Уаї ТнНу аз Бек Беї ї15 «ВІісз 304 к2ії» 321 «ії» ДЕК
«її: Нопт варівлп
«002 304 чакакссяцяа сзасссваац ссссачсадос сіозосасса чесусаадоде сачачсчасс о весасстоаос Чядзосачося зздеваісазс васктяачскачд сскоУсасса ссадавесссє зай чусавцачссо сосзаазекЯсс заєстасучо зсспадессосс Бчразачсов сусзчссаавце ІНу ачасбсвоой зсаЯсдасое сеососасечас зссазссьсв ссаєсачсая ссецсевсооє 240 дазувсюкод севсобаста скусрадову басвуладсв сосссасово спесучсову зо ласассаяавоя счЧававісав Я зді «Й10х 335
«йї1з Зз51 якшо СЕН
«ТРї» Нохо варієт кайб» З зазчзсчсзає гоастчоавааз саздеоззадас суузвасади стуцедпасау сессдачасгу БО ксксоасуссв ссачсоует сассстсвачє зессасусса газета содесаоцес 128 сегачсввча засинає вамарссчеч асазусцсся сосчсочдааз гасебасхає ї8а сасдасвосу Є«азууасов жссассакс здссоздаєсз асадсаасза сасстесесво то сЕдсачаєсуа васадсстося чЧассчаздає зссчсоцьоє всвбасвукує садесозооє хо чЧассаааась Козасаєсся задесаздузо асссореауєса седчбсазста а ЗБ. «ж1бз зоб хз сяде «лі?» РЕТ «ЕМУ» Ното варієпй «аййж 30 дво от1е іп мес тигошу Бест Бко Бек Бек Мей) Бет Аха Ббвх Уді СУ і 5 о 15
Азр дта а1 Твх її2е Ту Сув Ах Аза Бех Ями бО1у ї1е Бех Ал. тр о їЕ 30 ем вів Тхр о тУух сів сій Був Ро Бі пу оАла РКО був бец ем тії зе 4п а5
Тук Зіу Аза Бех дет тей сіл беж біу мазі рРко Бех Аха Бе бек БЗІУ во БУ Бо бек біу Бех біт Тк АвБроРре ТВЖ Пед тТагот1іе Бех беж деи шій РКО 7 те Во сп вно ре АТа Лрх Тут тую Сув опір бЗ1ій Тух обех аехк Ре тЕо ТВХ 85 зо 25 тре вве віУ віп о біУу тв Буш Уаї ста схів Був Ау Так Узі Вт Аа 105 195 116
Бжо Бегоуаї вп ЇЗе Бйе рго во бек о АБр біз оЗіп та ув бек б1у ї1а 170 хаб
Тис діа бБет уаї баї Сук ей Бе Ап оАяп РО ТУЮ ро Ака іч Ата 136 135 тай пув о у1 іп Тжробув зві АБе АвпоАБа пев біз зер Оу Авпобет Я 145 ї5БО 155 15 біз бех уаї ТИХ сід іп АБроБеї був дер обеК тну вух Бек отею Бек 3165 172 1735 пек о Тне Тсю Тк опей Бек був аїа двротук біб МПувонів Ппувоуай Тут ї8о хВ5 155 діа Сув 5Зій Маї тТБІ ніш біпобіу їео Беж оби рто ува тв пу дех 185 200 205 пе Авп о Асу у сто сСув 210 «йібз ЗИ -85115 247 «12» ВЕТ «в13» Ното 5арієтє «8002 307
Зіч у) біп гей цез ЗБ бек біу у бі їжи Маї Зіп Вже б1у у ї 5 10 15
Вех пе Акч емо бег о Сув А185 діа Чех БіУ пе Твж Ре ех бек отук 0 ха Мек Бек Ткр ах бхя піп ода вто слу ув су беи са тЕромах ай 45
Бек Маї тпт сСіу Атїа Зах іт сїіу бек Тих Тук тую Рсо АБр ох УВІ ви 55 50
Був зіу Асе рРБе тс оті бес Ага АБродвп Бех Був Авп отак рей Тух вв 70 тв 80 із біп Меб йкдобех Го Ага Аза сіц АвротТву Алла чаї тТук тую сук ва 5 5 діа вгастур сіу дБроспМ: біу Бае Вяроїіз ло З1у аз обіх ТЦ рем за їп5 110 чаі їй Маї век обех Аля вет ТЬх цук сзу Во ек уаї рпе РЕ сви 115 195 їх
Віз Бко баг Вєї Пув Бек Ту обех щ1у пі1У тлю Ата бів ей біу Суд 130 735 ТАЙ іББУ Ма1і Був Авротук Ре буо сі РЕ У«і ТВ уаїз век ТтроаАвІи: Бех 145 150 155 160
Ту ВІЗ ем Тк Бех сту сві Мі ТБх Рце р Аза уаї зву с01п о Вех 165 то яв
Яенх: слу їй Тук о бБег Тецп бек век о Маї Маї тТйх Чаї Ро Бек бек ех 18 185 385 реп аіу так сій тих тТук ті Су Ави Заї Ав оте Був Бхо Вех Ав 155 235 215 тіж о рув о Уві дар був Ак Маї За о рго пув бер осСує Авробув тво онів з1й 7і5 229
Трек осСує Рко бо Сув РЕо Аза ро Зіцдоїжи» дед Ям Су Рго Бех ді ве. З 235 2430 рРпе пе орбе то Рхо Був Вус Пув Авротьг о тєц Меї ї1е баж ке тну да5 ав я»
го ій мя1 тпк о Сув узі Маї Мі взв Маї бех ків Бій. Ав вто сі 260 зи5 ла чаї був Ріє дз Тур тТух уді Вврошіу угі Зім чаї нів Авп Аза був ав ва 285 тТиЕ гув ро Акча 10 січ піп Тук Ав бек ТВ тТух Вк лях чаї дет 290 255 за
УВК іже тТпк Уаї ре Нів біл дйвроТкр Гео АвпоЗіу бусів Тух був зо5 з1ї0 зЗ15 а25
Сує цув о уаї Бек Авп пув діа Пец Рго Аля Бо Ів СбЕцоїлдея тву І16 з25 з ЗУ бБет мув Аїа Був о зіу піп Ро дта орі РКО Сів уаї туї ТП бе) РКО за за ава ко Шетк Ата піс 14 Меботвре ув Аза оса Уаї бек ово Так Сув їец за5 КУ 355 чаї Був п1у Ріє тТух Боб вВех Авр їіє дів хаї зт ТЕр ім бек Ав 7 375 зво ту шіворко бій Авп Ав Тук о Сув Тахо ТБх вто РКО аз Пн АвроЗЕх зве 3955 395 «ва
Авр о сІу Бек Бре РПв грец тую Зек Буш Пец ти Уаї дер Бу век АЖ 405 Іо вя тра сіпобіп біу Аваоуаі Ре бег Сув бек оуді Меб нів о сій дія ей «88 «25 230
Нів Авпонів Тук ТУ Зіп Був Бех Мб бек Мпец Ветг бКо віх ув аз «аб 435 «вій» 308 «ші 5 «ВР2» БЕТ «213 Ноїво варіви -а0бз 308
Веї тук ді МЕЖ Бек ї 5 «3105 ЗП5 «й «ід» ВЕТ «13» Нохмо варієйп «апа» 305 таї тру сіу зів Уаї стру муз Веготипк Тукс тук ро Авробет Маї Цув хї 5 То 15 щу «ій ЗІ «ії» й «812» ВНТ «иР3» Нешо варієїй -40й0 З
Тер оЗіу Авр Зі з3у Рбе двр 116
І 5
«війх 311 «2115 1 «212з РТ «віз» нажо варієй «00» 11
Ага А1та Зех Зіп о біу Бі Бет АвпотЕр оцеч Та ї 2 10 хяхав» ЗЕ «їв 7 «212 ВВ «2із» НОото варієй «4005 СП аІіУ від БЕЖ бек Тв БІТ беЕ 1 5 «21». 315 жа кІ12 ВЕ «нії» напо 5аріеп
«002 ОМЕЗ піп сіл тую Чак бек ве Бро тТНу ТНК 1 5 «із 314 ке ШИЯ «й ВНІ «ВІЗ Ношо дадієй «8002 314 біж рре ТБ орНе бек бе Тук л і-Я «21б2» 315 «Ії «їй» ОВК «йіЗз сЦошое варієй «302» 315 ку АтТа с уаї бЗ1у Був век 1 5
«2162 316 коїїт 8 яилив СВК «Б1З» ВоОо барієй «об» СМ тів о сіу АвБросьм з1іу Бпе дя їТе ї. 5 «ша ЗТ 211 У «йіх РЕЖ «шЬ3із Номо варів «йОвх Зі вет бі шу т1іє щБек дви тер ї 5 «2102 318 «ххх З «1 ВЕТ «33» Ното варієй
«Апо» ЗВ
З1у Ат вет 1 «210» (313 шал св «212» С РЕТ «213» Ноше варіет «00 35. тухк век Чек вце рхо ТрХ і 5 «ее 320 «я 107 «2135 РЕт «віз» Ното варієй «40 320
Авр тів Сі Мебс Тит бій ех Різ Бек Бех ри Чек Віа бек Чаї ЗУ 1 5 10 НО дер Аха Маї Тих Ізїе Тбтг Сув Аку А1а бек обіп б1іу Ііє Бету АвпоТЕр хи 5 30
Тен вТа Тур Тук Сіп Бій Був Рко бСьу 1»в Аза Рго Був оця їем Ті1є «хв І 45 тук Ху вія Жеї Бех Бе бі» Бех сту баї бто Бек о Ату Би Бек Шу не ко бек ЗБу Вес с31у тн Авробре Тр обес ЖБК їз ек бежопев піп рхо
Б 7 пк во
Мі ввровне вів тих тТук тух Си біл сій тус ех чек Ве вро МЕ ве зо 5 лох вра Ззіу ід о З)у вх муз тУаї бій ї1іе вує 186 705 «шій» 321 «хіїхм лІї7 «125 РКТ -8ї5». Ношо зарієй жаб» З.
Зі маі зЗій єв із бтіи бет З1іу щ1іу біу ви Маї ЗіпортО сіу сіїу ї 5 10 5 жшек їша Ака пем бер Сук в1а АТа Бех шу ВНе Тих вце Бех ех Тух ла 25 зо
Аїа мер Явек ТЕр Уяі Ак Зій Аза ко ПТу Був біу без 412 Тсромаї 4 А
Вст уаї Тргосіу діа х7аї біу їв Бех Тну тую Тук Бко ВвроЗех уаї зо 55 ву мув а1у вкя о рпе Тахо Їїз бек ВкдоАвр о вво дет був Адп Тк тез Тух ве 7 75 зо йо бій Меб дви Бек Бе: Ахе Аза біз двротвс Азіа чаї Ту тТук Су 85 з З
Аїа вка то Сі Авр ЩО Зі Бе вер т1е тв о ЗтУу піп бЗіу тв Беу їпп хо 110 чаї Тк Ууаї бек Бек «2105 399 «вті» 384 хеї25 Дяк «УхіЗз» Ношто вВЗруеп «айбх За:
Заасссаса бчасссазацз спосачсачс сесадзечеса чсагчеусча сачачесвос ве аксасєсьчсс ддессавцссва зачсвссвас зассдЗесвач себцабакса дсадвачесе 2 дипсвачуссс ссавуєсуєє пасстасноас Зссвуєсесо ссазачечу сзваєсавоєю їв вчасссацея зсацеаассе свдсассовос свсасссеча севксвусай ссеагацеве 785
Чаччасессу ссвсссаста есчссазсаєф сасазсауев бссссассас ссбссррссву за
Часассвачяа содаваєсав ос зах «свій» (333 «гії» зБІ рій» ДЕК «2135. БКоОщо вархєй кабо» 373 зачесасзває кчссодавая сеасоцчазує стазеЗсечо сбадеоссва сов чзазссв 50 тетгасссса ссвасоаЗоїо свосутбсаде зассасуєса сохостчач ссупсвавой ї29 сосачсззаз чассзонаса Чдакокоссогя асаудсссоя бопддсозаває сасстаєсає тво сссцасачся гЗаасячеся чстсассате аозсочуачаса абазсвзачаа сассстває 240 сстасазаєча асацостяся зусозазсво ассояссобаї астассосоє сачаєзчезе з чесуацзадск сосзасаєЄєсту зздесадоче асесрочесв ссчеснУсес а зп1 «Т1йх Зоя «Ті» ій «172 РК «8135» Ной зварієт «або» ЗА
Аврої1е аіп Мес тТргодій бегоруо бежє бек о їей Бек Аза бек уві оїуУ 1 В хо З
АдвроАкч уві ТвВи тів тах Су АкчЗ діа бек б5іп біу Біє Бех АвпотЕо 25 35 пе діа ТЕр оТук Зіпобіп бує Бко біу ув Аіа Рхо Був Цей цею тів 0 55 тук БІФ А15 бес Зск ей Зій бек Зіу уаї Ркоосвєк Ах вБе дек бі о 55 ба ах біу бет Ш1іУу Тк АвВр рНе тп Гец бу гіє Бек Бек цем бі рко 79 та о зЗіз АвроРпесдіа Тв Тух отут сСув' зів біб тТук бек Вех вне ро тах 85 що 35 тпЕ рае бі ста піу твх му мМаї сп тів пув вжхя тТвхо Ма) Віа діа
Т95 105 115
Рго Бех Уві Рпе Тте вне Бо бко бек Аяросмі бів Бей бує дз Ху 115 ї2 25 тик АКЗа с дек Чаї Узі) Су ей фей; Ав АвпорРре Тук РКО Ага З1И АТа 130 та 140 пук баї іп отЕробув' узі АБО Авпойія пе; бій Бех біу АБп бек 3 ій5 1359 їв 162
Чізч бек уаї ТнНу са іп Авробех Був АвВробек ТИХ Тух Зет пез вет 165 за їв
Бех ЖХнЕ Бем ТП Пед бек ув вла Авротух бїз дув нів був уві Тук 180 тв ї122 діа Сувобіц Мах Ту Ні біп й3у печу бек о беж Ро Уаі ТВК бує бег 35 05 205 вре азподуЯа сіу Зіз Сув «ій 325 «їжа аа «ей РТ -813х Щщоло 5арісй каса ЗБ біз уаії бїпобем їенп бій Бекобіу бРу Біу бем чаї біповто Б1у Ту
Її 5 п 15 лес їй Ажу Бе Бех Сув Аїа Ата Бех сЩ1у рРБо Тв Ріесбет бек Тух 2 Ї5 ва аха Мес Вег Тхр Узі Вта бій вза бро бу був фу бен ій лхро Ма
Зх 40 аб
Зеж уаї три сі Ів Узі біу пувовех ТЕЖ тує ТтТух рко Авр век Уві с 0 цПув о спіу АхЗз с рпе Зп ті Бех Агу Ар АяБб Бек пу Ав тих Шец тук 65 7 75 но їез обід мес АвБлоБех цех Аж іа ЗБ; Авротнх Азіа ув тує Тух Сук ак зб 5 віта вх тур оту Аврозій БІУу Рпе Аврої1їе Тгр о Зі ЗіпобіУ тах ей
1065 105 що чаї Ту Ууаї Бех Бех бід Бех Твх Був су рРТо ет Маї де Ро їей 115 ї1та 125 діа Еко бехт бек цув Бех тик Бек біу іу їх Аза АТа їжи оіу Сув 130 ї35 тай їви уаї був дер тую пе нко си реко уаї ТВЕ о Заї Бех ТЕр АБ бах 14 159 155 150 сту дів Мед Так о бех п3у УВІ Лів тТвх Ре Бгто віж ча) Пе бій ех ї65 ї170 175 чек зіу цей Тух вк їБо Бек ер Уві Уві ТБк уаї Ркб Бек Бек Бех тва їв 50 теп спіу ККУ біп оту тТух хів Сув Ав уаї Ави нів пуш рго Беж Аве 1з5 2889 205 тЕк оБувомві Аврорув Ат чаї щі бро Був бек Суб Авр обу ТАЖ НІВ о зі5 ЗУ
ТВк Су Буб рко Сузв Рго Д1іа Бгто Зіш веворец с4іу бі Вко бек Хв1 75 235 235 реч вБйе ей Рпе Бко Бгто цув Бго Пув Авр о тТрж Цей Ме І1ї6 БексАка тат 945 25 а хо січ Мві ТЕ Сув чаї ді маі Авроуві бев Нів пів двровко о1 ко 285 79
Уаї Був рце ав ТЕр ту хаї Ав біу баї сім МІ Нів дБп АТа цув 275 во 85 тТВжх о сбуворго вка 10 біо сіп туго оАви Яву тТпу тую о вгоа уйі узі бах ау 795 Зоо
Ууаї ей тТни о Уві реве оНів біп Ав Тур пев Ана о б1у Був бій стук Був
З05 310 зЗ15 зта
Су Був Уаі бер о Авпопув Аз пе рро діа Бгто Бтіє бів Був Тк ліє
Зв 335 335
Бек ув Аїа гув су бСтп ро ВЕчЧ сій Різ сію Уві Тух тн о цеу рта засо 345 ТУ вто Бек Ажч су Зі Меб бнк пуво дво бій Уа) бех тємі ТЕ Сув ей з55 зво зЕ5
Узі іме біу вве тує Ро Вих Азр ї1е ліз уаї біх тур бло Бек ант 370 ать зва
Зфу зів рКо шій Аве Ав оТуг Був ТВ ТЬх то Бо мМаї ем Авр бех 230 Зх 300
Аве о ЗіУ Бех рце Де пео Ту бек оБув Бей ТНу Уа) АБр Був век дк «и ча «15 ткр іп б3іп о с1у Авп уаї ре бек буд Бек о Уаї Мех Нів біб Аїд Бех ах 75 Зо нів Ап онів Тук ТЕ біп Був Бех пев Бек Пец бек Бко Ту ув аз5 о 45 «їйз ЗВ «ЕЕ ої «їй» БТВХ «йї3з Нощпо варієй «Фр бе бек тТуг А1та КМеї Вех ї 5 «З10б» 357 «12 16 «й1Хз ВЕЖ «213» Кото зарієт «-400х: За уві твх щіу Аїа баз Ту вхо тиж Тук Тут Рго йврозех Мае1ї Ппувозіу 1 Б о 15 «Біб» ЗЕ «віх» В «3175 ВЕЖ
«213» Ното варієп «а0о5 388
Ттр сіу Авв о З1ц біу ріпа Авротів 1 5 «ДО ЗВ каезіз ТУ «тій» РЕКЕТ «2132 Ношто варієй «Вб» 329
АтУ вла Зек (ів о бЗРу ге беж Ави Тр очей АТа 1 З що «ТЛ х а «Ми 7 «їй ВЕТ кг)аз Ното варієд «00» 330 с1у діа Бех бак їви отв ех ї в
«жіСх 351 «ВБР» В «хійх ВН «Ух щото Барієй «апа» Зах сі бій туко Бех Бех рпе Ро тож тик ї 5 сей» 337. «8119 7 «ямах СВИТ «13 Вомо варівп «400 735 с3у Не ТМПх Бре Бег одек Тут 1 в «хо» 333 «й св «21825 БЕТ квїзз нОошо варієт
«35йх 333 су саїа Маї сту Ак оту 5. 15 «210» 334 хХЛтх В «вІ2з ВРХ «йх3з Мото вврісп «аа» 334 тер пі Авбр пи су вМе АвВБоІТе ня Я «Вії» 335 діт «31 рт «813» Ношо варіеть «400» 335
Бех зіп біу тліє бек дво те ії т
«шх10з 336 «кр з «и ВК «813» Нопто варієй «поз 336 с1У Аіа БЕЖ 1 па» 337 «8115 в «а» БЕТ «213» Ното зарієй «Я 5 тук ет Бех ве Рто хх
Я 5 «Во ЗІ «Вї ЗУ кхаїйх ЕКТ киїз» пошо Барієв
«або» ЗВ
Авр о тїе сій Мебствг біп бек рго Бех бек Те бек Лія бек узі під ї 5 ху 15
Бер о Ака Маї ТБт їіе Тпх Сув вка Аіа бек обід с1у їіє дет Бвлоткр 70 25 зо їев» дів тур тую шій біт Був рко 1у ув АТа то ру цем ем іє за 4 45 тух біУу АТа бек Бек зи сій бек біу Маї Ро Бех Ах3 Рпе Вех біс
БО в 5 век сіу бек 1У Тк двр о ве Типк Гец їмнЕ 116 бех бет цем зіповго ва зо та во віз Ар овре АТтТа Тіт ТУх Тут Сув СІЙ 030 Тук Вес бек овВде Ркб ТИ не Ну 5 тТвх ве су піл обу тве гув уаї ори ІТ ЬуБ щоб 105
«2105. 335 «в1їх 116 «віх ВЕУ «та» йото зарівй «400 359 зім чаї іп їжа Бец 15 дек діу сСіу Піу цви Уаї стіп овко сіу СОІУ ї 5 ща 15 бек рем ду тей Бех сСув 13 Лів бех стіу Ре ТвЕ ре бек бек тук 20 з ЗВ діа Мес бех Тер уві Вка Зіп Аіа го 01у ув (фу Бей ЯР Тгрома) 35 ай 45 ек уаї твж зіу Віз Ууаі БІіу Ахкео Тпе ту Тух ркКо АвроБек хХаї був 5 т
Зїу дкУ ре Тс сів Зет Зхо АвБр АБ Бек Гую Двпожик цез Тух й 65 7 7 во іп Мес вяп бек їжу вжб Аїа біз АвротигКодіа чаї Тух Тук Сув дів
ВЕ ЗО в ка тгропіу АвросСі: біу бе Аяр тіе ТЕроміу Сію біу тах Бей уаї таб ТЯ 115
Тр оуд)і бек дек 115 «абз аб «та З «125 ДНК «вій» пото зарівй «йо» 340 чабабссяда єчЧасссацад сссовосади ссуадеясса чодроаддасоая садлачтсасе 59 вкожосвасс додассачеєа заддсассвус аасточстяа соспозтасса чевазадесе 152 -чусваацассо ссааяастясх пасстасчос зсесачсессесс єдовзачецча сягоссавує 180 вчасссачст зсацеччесс сзасассзатє сбспосесов сСсаосвосау сскусацово ЗАЙ чвузасітса ссвостасєта содссаясво свсачесвусе босссассде стссудесад зо сзсасоваче содавзессва Ф звї «Ввібм зах
ВГУух зав таз ДНК «213 Неххо варштвт «4о0з 341 дачасчсаай сессццавач созсосачас ссопдбдсвоєс ссадсозсад ссічачасід 5
Бевіщсосса ссазсоачестт сасссссаує зассасяєсво всазсьччас ссассаочес т.2о спскодсаача чзастусеату чсасссока асзадедеся сододсазнас скаосасосс 188 засазессча азучассяяе сассассаус сечовсваса чесвазаасво соечеассва та сазакчавса пссксасачое сдасчасасе зссарасаєї вссуєзесач асо счас запа часазссвся вовестачУя стесаудасаєсс стддесасст ссадется зав твід» 345 «11 814 «ваз БЕЖ «2І3а Ново варієв
«Ой Зах дер її біпоМес Ти біл дек рко бек Бей цу бек вів Бех Маї а1у 1 ОВ 195 ї5
Азр вага уві типу Тіє Ліих Сув Ака Віа бек біпобіу т3іе Бек Авп Ткр га 25 35. іїсш Аза Тгротух бія біп цу бро Чіу Був о Аза го Бу БюЕмоїєд 1
ЗБ 0 5
ТУук віу Аза беут Бек пеа Зіп Бек зЗіу Уа РКО Бек ду Ве Бех у
ЗО ве бо бек С1у Бу ст1у Так АЕр ОМрє Так орви Ту Тіе бек ех жа сів ро 85 7о 7 во біб Авр о рпє Аза Тйх о Туг Тук Сув Зіп біб Тух бек Бек БРре рх ТВх я зо 85. тТнЕОВБе біу ста біу тк Був оМмаї ЗБи діє пПуводжхч твЕ Ма1ї І вів 185 85 зло
РБко Зеї Ууаії Рре ї1і5 ре с оржій рЕо Бек Аноосій сп Мей цу Бех щу 1: хо 125
Тв овід Бех чаї узі був гей їем АБа депо вве о тук РкЕб Ата Зі діа 159 35 145 вуз уаї бів ткробув уві дв оАБпПоАТа пе; біб Бек сту двдобех 1 155 Е5БО 155 150 бЗіз бек Чаї тає щи бід дво» Зех о пув Ар век тевЕ тую Бех їв БеЕ 165 ї70 іт бет отих пей о тТрЬЕ їв бек опув діа АБротук біз ув нія муз аз тує 180 І85 1950
Ата Сув ст; уаї Те нів бій БЗіу це» ек век о рко Уаї ТП Був бе 135 290 205
Ре АвпоАга сту сім су
«230з 343 «115 ває «вій БЕТ «Мах Вопто взрієй «ПП» 353 сій Уаї біп цей пез зі обех су біу сіу ей ува біп о рко піу зу і 5 зо їз
Бех бен ахя бес бек о Сув Аза Вів вет біу пе Тк Бе Яех Бех Тух 2 аз 30
Аїа Мет БзготкроУа1 Ата бід Аза ко З1у ув о біу їм бій Ткро ха 35 у З дет Уаї Ти ЗРу А14 Ууаї З1іу дтчз тат Ту тут рУЗ дво Бей уаї сувБ 50 за бо
Сі Ага гве тне ї116 Бек Ату АБр о дви Бек уводять тьи без отук бе
Ко а ве
Сіп Меє Аби дек пед вх Ата бі АвроТьк Аів уаї Тук тТук був Аза 85 50 55
Ака Тер-біу Авр 315 1у рпє Авр о ї16 ТтТкробіу Зід Ту ТВ Бец Ма! 100 їп5 118 тБх МЕі Век бек Аїа беж Трх Був сіу Рсо ЯттоУаї рре Рго лецш Аа 115 173 125 кс бет Век Буд бек Тир оБех бСіу біу ТАх АтТасаїа рен осту був о цех 150 Із та
Ууаз ув Авротух Фе руосб1ий Рто Уві тТБу таї Зех тер оАвлобат сту 145 156 І55 ї50
Аїв пес тйх БЕ б1у уаї нів тах рце вто вів'оуаї цей біпоБех БВеу 1655 уо їт5 бІіу Бей Тукобехг цей бег бек Узі Маії ТВЕ Маі Бко Бек ех Яек Гей ї8й 185 І50 сіу тру уз о тцЕ тує Іїє сСув дво Уаї АБю Нів Був РК Бет АвпоОтвЕ ча: оо аж
Ів Уа АБр о Буз Ахч Маї Сія Бко Бузв'бек Сув зер пув тв вів сте 215 215 о сСув вуо вто Сув Рг Аіз Еко бій стей рез З1іу біу Рго ех У) бле
З Зв З 280
Тед вре Руб ро Буз Бко цу Ар ЖБК рей Меї т3іє Зех Агч Тахо роз 745 250 255
Зій уаї тТвк був чаї Уві Зах дер Уві Бех нів біз Авр о рхо ій ах 266 255 270 пуа РВЄ Ав ТЕ оТух Уа) Вяр сзіу уаї Зіц чаї нів А Аїа пув оте те 280. 25 пув о ржс Ага сія бій сіп о тТук о Авап о Зет тих Тут бтя Маї чаї Зек Мме1ї во 255 300 їв:о ТиЄ Мал о їєвь нів осів АБИ ОтТкКо цей Ав обу Су Лв тую Був. Сув з05 319 335 го цув маїі бек о АвпоБув АтТа ге» рго Аза Ркб Ії6Є бій цув ТЬх Те Бех зав 3 335
Був віз пув БІ іп бго АгЯ сіб Рго біп уаї тТух Твжх бепсвов ро ай За5 350
Бах дЕЗ бі ста Ше тат Був аБи с1іпоУв1і Зек пед тах Сув ви чаї 355 зво зв5
Був ч1у Ріє Тут рес бек дер тів лів таї З1ій Тер обіж бем вБйЙ щ1іуУ за З75 зво сіп ро бій одЕа Ав туї Був ТЕ тс Бро вухо Ууді їм Ар ошех Дер зви зва ЗБ. що ху бек Ре Бре їбо тТухк бер о луБ БУ Тк Уаї Авропцув бек одка стр
З19 15
Чіп обіп 41у Авап мі вве бер оСубє бек охах Меб нів Біб Аіа дей Нід ашо 325 «за
Авп Мів тТук так бів був Бех Пес бек пед ек Рка Ту Був 335 440 445 «х10з За «МАЕ «хв» ОВКУ «13» Номо варієй «По» ЗА
Зек тук Віз Меб бик 1 я «ші» 34 «В» Оу «Ха» РЕТ кЖїЗ» Ното вврієй «або ЗА аз тів Авпосіу беа б1у Тук Тк Тв оРце ТуксАТа АБр Бек У дув
1 З 10 ТБ оту «032 386 «211 В «12 РЕТ «213» Нойео варівй «00бз За5
ТЕр о бім Авробій с1у Бе о лво їїе 1 х стій За «211х 11 «йХит ВАТ каї3х Ното даріст «400» 347
Ака олія Бех біп сіу ІЧе Веїт Азвоткр Без АТа ї в то
«їх За «8118 7 -212: -РЕТ «віЗх Коще зарієн «00з зав пу діа Зак Бех дез біл Бех 1 З «20» 345 «В1Х» З «т12з 0 вел. «вата» Ношо варієп «З00х 343 сіб Зій тує бек вех Ве рко ТЕ Те ії В «2І0О» 35 «Вл «віп БЕТ «213» Нощфео вБарієн
«Зб 350 бу пе ТьгоБпє Бех дек тук 1 8 «2103 Зк «ВІЇ» 6 стій РНТ «213 Вото веріво -400з 351 вец осБіу цей сту тує ТИ ї В «8152 357 «т1їз З «13 ОРЕТ «213» Нощо варів «або 355
ТЕ о і1уУ Авр сій біу рРпе Авр оЇ1е
Е 5
«Вій» З «М 7 «йіах РИТ «2135 Ново сзарієт «4005 353
Бех бСіпо ху Хі Чек ап тур ї Я -ед102 ЗзЗа «1» «й БЕЖ «213» Нощшео варіко «Щоох ЗБ сту віза БЕК ї «іо» 355 «-Б1їз 8 «ди ОРЕт «вта- Ното зарієй «айо» Зк
Тух Чех Бєк рі РКО Та і З «и З55. хлліх 407 «712з РЕТ «ВІіЗз Нео варти «абз 356
Авер о ІТ ст Мес от сій бЗех рко Вау Бек їж Вех Аза Бех Чаї З1У ї 3 10 15 ввр о Ата Маії ТЕ їзле тах Сув дхя Аза пек оба О1у іє Бест оАсполжр та ге зо їес діа Ттр Тук біп Зіп Був Бто біу ув Віа Бо ув їй тез Х1е 4 тук з1у Аза Бех Бек пшеза Зіп Бех оЗІіу чаї ро вВсу джка Ре лек З1У
ВО Ба 50
Бех ту дет зІіуУ ТАЖ дероргце ТБ о пео ТНК Ї1Є бек обек рез іп вхо 55 7о т У сій дер вне дія Узі Тут Тук Суз Зі» бЗіп Тук Зет Чек рРне Ро ТБХ 85 зо че тн вра біу піп ор1іу тТнкоБув уаї 1 ле сив ї5а Ка «Ів 357 «дії 117 хй1й» РЕТ «йІЗ» «Номо вкарівия «п» ОЗ піп уаї бій ей ав сій ет сту З1іу у бе Уві ЗІ ро білу МІУ і 5 10 15
ЖЯек їеш Аха тен Зеї Сув діа Аїа бек сіу Ріо Тит Ре Бехобек Тук 85 Кз вла мес Бек ТЕр о Уа? Ах Сі Аза вко с сіу пув'сїу Бемовіо тТррочаї
С й
Чет уві те деп Зім ей ЗРУу Тук тр тн Боестух Аза ввробек узі по ва 5а ув Біу вка ррє Твх ї1є Шейк Ахч АБроАни Зетг Був дв отВж цеб тук 65 7 те ва їшМи іп Меб два бек оцез Акч Ат січ дер отнкодіяа Уві тує Тук сув 85 76 ев
Аїа Ате Ткр о шШІуУ Авробіш бСту пе Адр їтіз Тк БіУ Зп осзУ Тв рем 120 ї55 щі
Уаїі тик маії бек Бек їв киїй» ЗВ «Щ11ї1з 302 «пібх лик -813» Ното зарієй 47А
«00 558 чакасссача счзсосачад ссесосокаЗс сочацозсуяа зсабзачеза сочеосчасе (9 астасстуса чазсувассв чдочеасєтест азеєсзастЯяя сесадкасся зсачеласса 159 ччгааачсас сузазобаєєс ваєксасадз чеквссееве бясаваустя суревеаюос то саїЕКІачся Зсспьччасо соадсастчає вЕсвсосїда ссасбазеач ссєдесассо з4а зчаазасвіея счузсхасса сеЧесачусад сзавкттсестє госсотассає секеЕдессач 300 ччсасавагу Есчавзаєтає а Зх «10 З «81їз 351 тій ДНК к213» Ното зарієї «Що» з58 саттесчсави соз'счЧазас сазоччсодос сьоссчсвас сочасопсвя себааксс во ацдекусссяд ссхесззавь басесскачс всссасасув сзазсточас додссявацесе ї20 сскччзаваз чстсзацья дисзазеяь агсгаасучис ссзаксаевс вБастссвсах 180
Чемивексся Ксвасодтст Кесрассась Беасцедата аскодавной сасствясає ака седсаазсца асачсествсо Бассузацає азссоссявЯв зосассоєяс аеро 300
ЧчавгчачаУкЕ сечзататесч судосазчачо асоссчасча сечкеасоке а зві «Пій» 350 «икхх 18 явїйв ВЕТ «2ї3з Нощте варієд «асо Я дв от1є сів Мебс Так біс шек о руо бек Бек Пец бек Дія бек Уаї Фіу ї З 10 15
АБО о дка уаї жк ті ТбокоСук бкч Аїв беж Віп Фіу І1е Векодви тТЕр за їз Аїш тТЕр отут ЧКп бхо пув Бко сіу Був діа рго пуб Пец о реп тіє зе «б до
Туг сіу вій Бек бек Пец біл бек Зі Уаї Рро Бех Ак рле Бех Му
Зо За бо
Бвкобзіу бах Зіу Бе Вврофде тТнКорец ТВ ОХіє беї Бех їв біп рко ач то т во шій а ра Аза Маї тує тух суб сі Зід тую бек Бех Бпесвко ТпЕ 85 90 за
Тк овзе аїу зій ЗУ Щрх пуг Уаї Зіш тля був Ажхе ТВх уві АТ Аа їбп 105 116 хо бек ма1 пе ті Рйе орго Бко пеї двросій бій ем овув дет ОДУ т11ї то Кс тиг Аза Як мМаї Маї Суб пе ви дБ о дАяп о рРпе ТУук рто Ако ЗТ Віа 150 135 148
Буг Уаї пів тко Буя Уві Авробвл Дія ге» біпобек Зіу Ав дек Вів зле ї5ю5 І5З5 159 сім Бек уші ХВх Бій зів вер обеїт Му АвБроек ТВі тую Бех цем Бех 165. 170 7 цех тт пе тіж їв) Вех пу Аіз Авротук бій Був нів Був хві тує 182 їв 186
Аїа був бід Уаї Тр: ніЗв обід с1у мем бек Бех ро УМ ТНт о пує Вех хЗ5 209 во
ЕПеє Авт Вже сту 035 Суб 215 кх2їйт» 361 8А4УВ рат «ЗІй» СЕТ «813» Ношо варіяп «ап» ех сів Уаї бів зви уаїЄ бій век слу сіу с1у Без чаї біп орто лу у ї В 10 15
Зег їв; Ак Пес Вет Суб дів АтТа бек йпфу рНе тах ре бековБек тук 29 5. Зо
Аза мех Бех тТкр уві вх сіл оАзас ро бїіУ цу сіу їец біз тхр о уаї.
У ча 5 ек хат тіе ЗБ бі1у без озіу Тук тих Та ре тут Аїа о двробек Уд1
ЗО Зх о
Буз ПТу дгУ Ре ТВ ліво бек Ата АБродвои ет Був дап тТвгОбей тук: 85 за та во їжа бій Ме АвБо Зек рез ву Вів Біб Ар оТнХ Аза Маі тух Тук Су. 85 зо 5 «Аїз діб Ткросїу Авр обі с1у рбпе Ав от18 Тер осіу Вій йіуУ Тк обео зо хо 119
Уаї твж Мах бах бе Аіао бек ХПг Був обіу ро Зек Чаї рРпе бжо тей 115 190 ї25 дів Вко деї Беж Бую бек тТпІ Берк Зіу шщіу бу Аза Аза пей їх Су 135 т35. 140 їеки о Маї цуводнр тут РпЄ Бто Са ро уаї тпс уві Бех Торо аАвп бек:
145 155 І55 ї155
ЗіУу Аза Мей ТБ дек бІу уві нія тВЕ РНе Руб АТастаї вп Зі Бех 155 170 ХВ
Бек оЗіу ей бух беж рез Вст о бвтг маї Уа» тик уаї о Бро бет Бек бек
Іво їя5 їзх тео ЗІу твг осів Тв тТук ті був дав ЗІ де» нів Ппув Рко Бекозве їз5 251 ок
Твг Був Уаї Авр цу Аг Маї СІ бро Був век Сув вар цуБ Тр снів. 210 215 жо
Чер Сув Без Во Сув вто Аха рро щі Без гей біу Зіу Ріє беж оуаї их че На чо
ЕВе гей рпе Ріо вк ув Бо цув Авробпє їжи Мевої1о Бег Ару рах. тав. 5 255 гко Фі. Маї Тпт Суз Ма1 Уа) Маї Авроуаї Бек нів бій дБЕр о рго зи
250 зЕ5 370 чаї цмув Бе Ав ТЕр оТук маї Авробіу Уа бій маї Нів Ави Ата Був 27 КІ та
Тік пу БгО Ага біз Зі сій ТУХ АяЕВ Бег Тр ТУуг Аку уаї уа1ї бек о чо 9
Ууаї Шеш тих чаї їз НіУв сій двротТКрої1ец Анпосту Бувозій Тух був зо 310 з1і5 зго
Сув о був узі Бек САва був свів зей вхо Ата Бко лів Сів Пуя ТНХ З16
Зх зва зз5 ек Був АтТа Був З1у бій рРто Аку 31 го бів о Уді Тк Тважх цем о бто 330 за ї55
Рхо дех дув біз Зіш Мей ЖБе Пцує вп іп Зах бек ей твж Сув це зЕ5 збо зач чаї Бу БЗ1Уу вре срух РгОо Бек Адюр хХіє Аїд чУай 010 ттровіо Банк дЕБ ати 75 Зв піу шій рю сій о дЕВ Авпотук пу ТИЖ ЛНЕ Бо Рко Ууді пев одвровЗеї
Зв хво за5 зЗ0о двр осі Бек ріпа риє їви отТук Бек був'їєи Тр очаї АвБробув: чех Акц 15 45 тр оОїп віч Ту Авл о уаї Ве Бех Суб бек уаї Меж Чів бів Аза лен 220 ат 4350 нів дви нів тух тп СРЬпоїпув Бек Ппез ошекК тей ЕК орКОо а1іу Був зв дай 445 «10 362 «йіїз В «2125 рНх -213з Ну зазівц
Фах ЛЯХ
Бет тук ВІ Мех Бех ї 5
«21бз 383 «піїх 16 «шій КВТ «ха Нощо варієв «005 ЗЕ
ЗіУу ру с1у Рго Тух о біу Шу ТЕ тую Тук РКО АБробет УЖ м іу х 5 15 ІБ «2102 354 «М В «евах ВИТ «2Ю3з нНощо варієвй «ап» З6А тТхвозЗіу Аврозів» 5Іу Вре Авротіє 1 5 «гій» (365 «й» Ж «Фїйз ОРИЕТ «її» ото варів
«А0ООз 365
Ага Аїа Вех піп сіу тів Бех АБЗ) ТКО ред о вів ї 5 10 «10 ЗБЕ «Вії 7 «-3і25 РЕТ «213» Ношто варієй капозм 66 сіу вда Беж о зехк Би суповех 1 зу «Еі0з З? хвіїВ я «Фіїз РЕЖ «8132» Бото варієй «вад» 367 сіб ри Тут Вет дех пе Рко ТВ ТУ 1 п
«210 ЗБЕ «її 7 «12 ВНТ «8115 Нойо варісл «айс» ЗВ
Зіу ве їн овце бек век Ту ї В «лійх 368 «й 5 «ВІ» КТ «2ї35 Боте с зарієй «апа» 369
ЗУ Бк тух су су ї З «Війх а «21» В «Вій ВНТ клїЗ» Ношжо варів
«400» 370 ттв остУ дБроОсічЧ З1у БпеоАБр о ш1в 1 ї «Ето 371 «вік 7 «Т1йз РЕТ «РІЗ» (Ното варіви «0йз 371
Зет пів З1у ї1е Бох Авио Тер х З іх 278 «211» З каз БЕТ «213» Нота варіво «вх 372 соску вла век
«і» ЗХ кя1ї5 « «ій» РЕТ «Ол» Вожто варієй «ай» З73 туг Бет Бек вкпе рей ТПЕ «хаі0ю 37 ххиїітх 0 ххх» БЕХ «513» Ното взарієб «або» 374
ВАвр ТЗ бСіп оМмеб Тйх Зі бе Вго бЗех Бек рейоБек Аіїв Беж ма) У 1 п 10 1ї15 звробхя Уаз Трек о І11е Так сСув Аху Аїз бак біпос1іу їїе Веж дае ткр то к5 Зо це» віх теротуУк ІП бій Був Вхо сіУу ув вів во Був мес тей ліє 38 30 р
Тут ПіУу діа бегт бег рей біл о беє біу уві Бто Вех йка ре бек З1уУ в 55 5а
Бех ШЩіу бер осіу тиж о Авр ре Три пео тик тів бек Жек ген осію Бо
Б т 78 80
Біб Авр о Рпе Аіх Узі Тук тук Суж сій іп тутсоБех Вет Ре Бко тах ва КІ 5 тТвЕ вне З1У ціп Бі тре Був уві 510 Кіє вуз 195 1п5 «їй» 375 «й1їж в «Ша» РВІ «213» Нота 5арієд «ай» 3765 дій хуаї 51) ем Уві 413 Бек с1у біу Зіу йбезомаї зів реко іу 15 1 5 10 і
Беж срецп дк Без ек Сув Аза Віа бат ху Ре тйх Рі дек бок тТух за й за
Ата Меї бек тТкрома1ї йхЯ біп ліз Бко Зіу пу о біу Бей бій Тер чаї
Кі ч0 45 пекочіу Трх зару ро Ту сіу сі1у Тато Тух тую БРЕОо Авробек Маї ув. 5О 55 бо сіу Ака Ре тТрЕЖ ті Бек духо дер Авп обекг гу Авп о Ттпк їемотук ТЯ 65 то 75 я бій мес дви Яекорем Ако АТа бій Авр ТВх АТа чаї Тут тух Сув Ата не -о 55
Ака Ттр азу Ар сій ш1у РО Авроїзе тТерофіу біп зіу тпкохав Маї а 1а5 о
Тс оуаї бак Бех
І15
«Від З78 «йїїх ЗЕш1 «вдих ДНК «віЗ3» Ношо варівй «40» 376 чаксгасссазча сочасссачац сесасскачсо ссчацчечоча оз зазеча Бест 50 абкассствоя задспавчеса зодкассєсь авссзоассят собудтаєся десадавасом 99 чЧіваадсас саааатіавре ваккетасччас зсоссссьв ЄусавначсоУ засос ї58 счЕссказоя яса ауаєс содеаосуає кекассссЗа ссаєскосея сссосавосу 2 чазчассЕка суцесваєьв Сбассвусяо васьсектстс срсствсбас стскзуссач 300
Чукассазач тсопазастаа я 325 «аа 377 «2115 За8 «ау» ДНК «йї3з Бото Барієй «або ОК? свячсзсави: тачесзуават судеччсоуєс сеочсусвас стчасопсая сссосувев 5 ачосопсасяд сесвосспса: гасостсвес аасстасосуа Єдадсвууз дсассавуєсс 125 сеспоачЧавчЗ ассісчазса азсоаЗзсяЯдь ассзусессь взевобачіасєс стактаєсст 185 часесіав:З азаЗкеч ее сассвессса сЗгчасвась сезванавсве сссстакока 20 плавесзваса Усссчсакас чзааачаєзся зссусчсає агтрасасрося Єкоозавчак, зда заччасссїЗ віасссзуЗа ссвадусаєс ссовсзаслоа Ебазевов заА5 «81» З7В кшІ1ї» 714 «238 РЕТ «2135 Ново зартеп «Вб ЗВ дар тїє Сім Мес Тк Зіп бе рРго бек о бвс їв Яву діл Яех уаї У ї я 19 5
Авр о асгу уві тре отіє Тих був дУЧу Ата вех біт обЗ1у тла бекоАва отри 2а а Зо вейовіє Тур Тук Зі іп пу Бто піу Му Аза рго пувошдец їм Хі 46 45 тук піу Аза Бех дет оїєю б1й ек 01у Уаі Ро Бек Аге ББе цех бту 5о сс 0
Зет Сіу Бех сіу ЧВжх о Авр Бе тп сїБжо» тТпх Іі Бех беї їсшп бій РЕо «5 7 їв но 915 вер Біне Аза маї Тук Тук Сувосів віп тує бек бек рРме ро Твт 85 5О 5
ТЕ овце біу іп Зіу Тк їПув оба бій хів Хув вта ТБх Уах Вів А1а їі то 1
БкосВехк уші Ре ті Ре рго бо Бех Авросій сій ем був ет Ду 115 та 135
Тит віза бек охазї Майї був цей без Авйп бе Рбз Тує Бко Ата с ЗІ Аза 130 135 147
Був уві біт ТО тв Узі дво аБл АтТа Без» віпоеш зЗіу АБ» обБек сів т45 150 155 тео
"ЧТ Чек уві ТВу 015032 вер дет о буз АвробекоТду тую Бех цей Вех їі65 170 ї7Е
Вех Тну їж тек ре» беу Був Аїа Авр о Тух Сів Пув Ні був Уа Тук 185 5 ї52
Аза ссСув бі) уві тБк Ніз Зіп біу Бей бек бек Рго Маї Тлї цув Бех 95 ХО ап
РпесАБп оАхч Ту біз су 216 «Вій» 379 «ії» 446 «Вій» РЕт «кіз» «Номе зарієй «ап 375 сів уайї дій рей узі сія бек Зіу зіу бі Бей уві сій рго піу у 1 5 10 1
Бех ї1ец Ака Пец Чех Сув Аза біз яву сЗІіу вРнєЄ ТВ Рпє бот Бек Тух 5 30 діа мек Бет Ткр ові АхЯ біл Аза рРЕо З1у НУВ сту пеюп о бхи СтТтр оХаї 80 ак деко сіу Тк опіу РКО Тук піу Зіу Ті бук Тукорго двр о бвтг о Маї Пув ва 55 Ба
Сіу духа рапе ста т116 Бек о дга АвроАвп бек Бувойвп ТК обем Тук їм бо 7 75 85 пі2 Мес Ана бек Сен буд Від б)о ввр тат вТа уві тТук тую оСув дів 85 зо -З5 вако Тер паху АБр су біу ре Авр оті тк обі бій Сіу Тих пвх оуаї той тав 110
Тнг ма) Беж бек Віа бек отву Буд сфу Рко Вет мМаї Бце РКО цех вла 115 ї5х9 125 го Век Вес цув бекоТйк бек дЗіу 01у Жнк Аза діа це бі Сув Гех їз0 і35 140
Уаї йує Вер отуг Ре Рго сій Бго Маї тТх уаї бек Тгр о Аваобех З1у 145 шо 155 во діа іїєй Твгобех Ту УВІ ів ТЕ Бе бро АХа ух) їз Зіповек ес
ВЕ 170 75 сіу цес тук век рем Бек бек Уаї Маї Тит Уаї ро шех бек Бек їжи тво зв ка іу Тис біл Тв тує т11е Сув Ака Уві Ав о вів Був БгОо бек АБ тех 1935 а5 205 пув'уві Аво пув о АгеЯ Мі сіз ко був дек Суводвр Був о ТвЕОоНів ЖИ. зо 215 тва сСувовхб рто ссСуя рго вій о рка 01моцєм Бей Б1іу сту вто Бех мах Ве 225 239 235 кет
Іїви о вВпе Рто ркб фу Біо Буб АВр ОТИХ Хей Меб ліве беж Бхе Тіх Ро 545 Іва ря сто маії ТВ Сув зтаї Уа) Уаї Авроуві Бех вів о 01їм Аворобхо бі Уві 250 ек 27о пу ре Ава Тхротух чаї АБ о біУ хаї зі) уаї вів ввп Аза пув лру 875 зо КЕ
Ту свко Ага Са бій сот отут авт беж ТНг тТух Акоа уаї Чаї Бек чаї 290 285 зп тей ТП Уві пев Нав бій ввр ото цей Авб зіу Був о б1ц Тукорув Сув зак 310 зі 35о їуз уа1 Зех Ава Був Аїа Ба бо Аза о рхо ї11їео піз був Тв ої1їе Бе
ЗБ 536 за пу Аза ту Су піп кто Бхе ПРО Бко біп Уві тую тТНУ рем орто вк 340 заб ав
ВЗех дпа сій ша Меб ту Бу дві сії; Маі Зак ес: тих був тей ува за зай зве
ВБув шіу впе Тук реко Бех двросхіе дій Ууаї 31 ТІЇ Зі вх дви Біу
З75 зво сів вго (зл одвл о Авп Тух бує Тпх ТЕ оБко ро уд рем оАвробех Авр зна 355 З95 задо сіу Бек Ви РПе Мен отух ек цув їв Тв Уві Двр Був Вех Ат Ткр 05 гій 15. пів бі» Сім оАо маї Ре бас Сув Бех Чаї Меб нів біс Аїа Пер нів
Уч пк за дек нів Ту Тк сій був вех цем овви деи бек рка пу ув за5 49 зац «віп» 380 «йі1» 155 «їй» БЕтТ
«іїх Ношо варієй «об» 380 41 уаї бій ем охаї 03: Вес Сіу бі зу цем маї Зіп Ро 1у ТУ ї я то 15
Бек цей Ак їй Бех був Аїа вія бек біу Рпе Тс ре бек бек Тук 29 25 зо
Аіа Меб Бех Ттро Уа) Агу ЗІ Аза рро йіу ув Зіу еп обій Тер отаї
З 46 35
Аіїа уаіїі Тк о сіу діа уаї сіу Ажа бек тах Тукотух Бхо Авр Яек Хві во 5 5 пу о біу Ато виє ТОЖ Ії Бех АкЯ двр о Ав Аза пув дви бек пе тує ве: 7 їв ві їз сіп Мебс АяпоБек іє АтФ о АтТа За Авр ої діа туаї ТУЮ Ту Сув 85 во я
Аіа дкЕч тЕр о З1у Ар и біу рпе АвротІв зло то5 «210 381 «йЇїз ЗБ «йїіх: СРКУ «бій» Ново варієц дай» Зх від уаї бір йеп хуаі ій бер сіу сіу сіу пе Уві сій ро сшіу дк 1 ія хо їз
Вет цей вБуч ой бех Сує А1а АХіа бек біу пе ТрЕ Бе бек бек Тук 26 їа з
Віа Меб бек тер уві вищ З1п Аза РКО сіу був ЗУ зей Зі о ткр о Уві жо ве
Бек Уаії Тих о біу дів уа1 бі Ауа бек ТнЕ Тук Тук Бхо АнроБек Ма)
БО 55 -О ув сСіу Аха ББЕ ТЯ тіє бег бта Авродвп діа уз дей бек рей тує вх а 75 во
Іси ів бесоАва Бек без вка Авіа бІЙ Авротчк Віа ей тую тую Сув 85 во а іа пу ттІрозіу Авробіо сту це дер хів ко 105 кіп» 382 «-211ї2» 1956 «аїйз БЕТ «23» сНсто заріяв «бйх ЗИ сів баї б3іп оце Ууаі біз Беж бі Зіу с1у Бе Уаї був Бу бсі1у у 1 5 їб ів бет цем АкЯ Пед ВЗєк Сув ліз діа пер обіу Бе тк ре бековВех ТУуК діа мес деї Тер т1є дкуд Ста Аза рес ЗБу фу Зі ва сія Ттроуаї
Зв 50 45 5О0 бех хі Тік обі вха чаї су Вхя ет Тйх ТукотТук ко Авю Бех Маї та 55 5 їжа 0О3у Атя Ре о Тру ї1еє БЗет дуя о аБр АвпоАха Був деп о беї евро Тукг
За ТЕ ве
Її; Я3)3п Ме Ав Бех о ївц Аха йіз За бер тах віз Узі Тук Тут Сув в во 5
Аїа Ака тТЕрозіу Авр бій сіу Ріко АБр Їїе їза 15 «2105 383 «шал 16 кадит ВЕК «ні3З» Кото варієд «оз зв3
От таї біпобей Уаї біо Бек біу віу с1іу пецо чаї біп Бо біє з1у ї Ку 10 ї5
Шев о їбеи Ак їв бек Сув діа АЇа бек с1іу вБе тру Рре беж ех тТуг й 25 за вів Меб бек тЕр уаї Акха4 Сіп ді тах біу пу Сіу Бей біз тЕв Уві «о 45
Бех таї ТвкК сту дів Маї (1у Аге Бех тТвЕ отук Тух Рга авр беж Уві ща Ва: 0 тн оЗіу Аку роя та Хі» оВет Аа біз дна Аза Муш ввопоЗеу ем ух ат КЕ те о ївк біз» Ме АБО Бер цей Ака Азїз 01у АвБо так оАів Уаії Тут тух Сув 85 зо з іш вка ТЕБООТЇУ АвБросІЗ ЗРу Ббеоаврогіє ї2по 125 «тіж 3ЗНа «пїхз 106 «21х2 ЖВТ 5О2
«УІ3х оНето варів «ПО» 384 стіц маї піп ії ув! Стів век шіу ЗіУ бІ1у Пез омаї Був о рго щу З1у 1 щу 18 15 ех пев» АуФфобви бек оСує Аза Аїа ех ту РНЄ ТЕТ Ра дех дех тТУК 20 ї5 зо дів Меб бек ткр чуах Ах іп Віа РКО сіу Був сім те) Зі ТкроУув1 35 ай 5 сіу чаї тТцжх сіж дід Уві ту йпе Бех тах Тук тук РХО азроБех Маі1
ЗО 55 Бо мує Зіу Ажха р ТнНЕ ї1іе Бех Ахо Ар оАвробБах пув вв ТЕ без о тук о т во
Пец осів Ме Ави дело пед цув ТВЖ З1ий дер отпт Ата Мі тує тую Сув 5ОЗ твх тпкотТІр о Біу Авробій пу РКе с АвБоОщіЄ со то «2305 385 йх1іх ЗзОЖ «тах ОБЕТ «2135 Нащо зарівн «або» зях
Зі ма) бів оцеа таї зідсчак б1у Шу О1У Мах чаї дку вхо оту щу 1 ї 15 15 пЕЕК їн Ака цей дек Сузв й1іа Віа Бек -1у РО ту РП Беж бек туї" 29 й Зо ді меї бек тер чаї Аха Сі йМіа хо вік пувобіу меш біз тир чаї зя аб в
Ббет Уу«і ТБ о сіу дів Мі сіу дтч Беу ТЕ тТухк ТукоБка йвр о бек Ух о 5 о
Був Зіу АкУ рРПе Тпх Ті Бех Вху АЛвроАвп А1іа о пцув АБ бек Мем тут 5О4
Кк я 75 7
Бей сій МекоАБоп бек огезасАкаЧ Аза 51 АБротвк Ата Пец о Тук Вів Оу 35 За ав
Віа Ато ТктробіЖ АБробдю п1у ВпЄ дер об3е іо п «Кі0» З8є «1» 06 «38» БЕТ «813» сНото варібп «Оойх зве
Сів маї сій ей уаї біш обет біУу Зіу пі ей уаї ву руо сіб сої 1 5 18 15
Зежх їі АкКЯ цею» Бек оСувовів іа бек о Зіу Бе ТнНЕ Бе бексвВек Тук
Вих
АтТа меї ву Ттр оуаї Ата сіб вла ва Ру був о біх цей біз тЕрочеї зЗ жа 45 бак Узі Тйх б1У А1їв уаї З1у дж Вех ТИХ ТУук о тук Рг Авробвк Ба еб цув осіу Яка ББе Ту оуїе бет Ака АвроАва АТ оцув йвп о бекобем Тук єв то т75 до їв суп Мев АП о бек пей Арч Ата бів ввротапх дів Хаї Тугкотух Сув я ча з5
Аді вка Тїтр обу Авробіз ЗЧРу вре Авр 11Те оо їп5 «вї0х СлВ7 «зії сїпє «йїа» ВЕК «йї3» ЖНошпю варіємп «ВИ» С3В7 біс чаї шій без йеш сої век бї1у Б1іу 1у пез Маї 01» Рго Чім З1уУ 1 5 10 15
Бек Мем АтЯ іє; дет Суб дта Аза Бех піу ре тпт Ре Зетобеж Ту 80 5 Зо
Кіа Меїбє дек Тткроуаї дкЗ сій Аза РЕ 051У пув бсіу цей біз тЕр уві 35 45 5 бетг Уаї ТЬК о сіу Віа уві сі Ак бек ТЬг отТух тує рРта дв» бег Уві «о 5 во ів РУ Ага ве тпг о хазвсвеї ака вер Ав век був вв Тато Бен тує та 5 во їец сій мес АБО Бек їв Вкч АТ сОЇЮ ВБротах віз увазі тух о тух Сув
Ве Зо 2
Віа тує їкр о З1у С АВр Обі сіу Бпе лев; ї1їе ї50 Та «-й1д» ЗВ «хійх 106 «від» ВКУ
«13» Кото зарівй «аб» 388
Фіб чаї ста ьо хаі сіб Веу с1у біу сіу уа1 Ууаї бій Рко 01У АхкУ 1 5. то 15
Бек ЦЕ Ага їв БегоСуз Аїа ВІВ бек біу ВпЄ ТНК РП бек Бех Ту о 25 зи діа мес Зес Тгр о маї Ага 0105 Аза Рго СТУ був біМм Бем їв ТЕроудї йо АБ дів саї тах біу дів уві біу вкя Зх Та Тух тТук рло АДвробек хві 5О 55 о
Був ' діту тя Бре тку іє Зех Аа ВвроАни беж шув Вей Тріо пев тую 5. пу 7 во їви піп Має Авп о бек о Пез Ака Да сій Авроїнк Ата Маі Тух Тухю сСув
І-ї зо 5 віта ув тїхр осі вер ошіц СІУ Бе АврОолує. 100 та5 «їй 85 ів ТОК «хз БТ «2135 Ното Берівп «300» 389 сЗій уаї бБи пес ха 2та Бех сьу пі б1іу Узі Хаві сій рхо а1У Арі
Е З 10 15 заго їеи Атгу їйей обех Сув АТа Аза бет С1у Рпе Тк бле бер Бе: тук 28 ех 30 аха мес бек оТСтр о Ууді АкУ біп Аза бро Сі Був о сіу ев під То Уаї
За 40 45 діа уаї те оБхіу Ада Уа1їі СУ Аку Бех Тв тує ТУЮ Ву авровек УВА 5-й пе ба ув ' ші вхУ Ре ТЬх ї1їе бек аку АвробБИ Вей ув о Ава тих би отТух 5ОЗ
«5 то 75 о їем біп Мес АБП Бех рез АхЯ АТо бій Вер Тпт о АХа чаї тує тує Сук ве за 95
Аіа Аке Ттроїу лев сТрвобіу пе АБротів
ІФ 105 «21бх ЗВ «231 Ох «ат КТ «Віа» НОМо вархлєв «00» 390
Схмпоуаф зви ве; уаї б век біУу ЗРу Ху тні у) ба РКО ОДУ Ах 1 5 10 її
Бех їз Акт їз Беж Сув АтТа біз бех Зіу Ре Тк Ре бек Вест Тує їй ді: Мет Бех тер охаі Атоа бій Віа вко б1у пуз Сжу свй біз тТЕромай
ЗУ 40 5
Ка кі тк 1у Віа хаі бі АКсообек ЇПЕ Тук Тук Ро Ар о Зех Уві
Ба 5Е СУ
Бу« СІіу Аку Рпе тих Хле бе АхЯ Авр одеп бек був Аа ТПЕ Бем тух 7 З 8 теу біл мех деп обет о їво Аку зіва біз Азр отак дія Уві туго отук Сув яз зо 5
Вів Був Тго с1іу Аве сі сі Ре дво одіє
І90 105 «їй 35 «4211: 106 «Ві2з РЕТ «213 Ноже вархев «або» ВХ
ІП оУуаі біп цен оуаі із Бек сту піу біу уві узї вій БКО З1у АКА 1 В я, 15
Бат їен дес ївії бЗех Сув Аза Аіа с Яег йІ1у БО Тит ве бер бек жує жо 25 а віа меє Бег тур узі За сСіт Ага вто біу їв біу дез бів Тер о уаї
ЗЕ 40 45
Аїа уві твгобіу дів чаї йЗіу Ака Бек отак Тук тТух Ркз лЛвр Зек Уаї ва Зв в ну Іу Ата о рпєе тТпж їз Беї Аху З8р дви Бек був Аа отБу їец тух е5 хо КЕ ВО ви за Ме АБИ Бех ївеи Ах Аза бій Авротпк діа Уві Тур отук Сує 85 28 з
Ата вата ТЕБобіу Авросіа бІту ВБе вбяр 1 тп 155 «їз 352 «їз 196 «2125 ВКЕ
«2132 ВНото варієй «асом ЗО піс хбаї сбї1па пе Маі сій бек сіру аїу уаї узі чаї біп бо су ту 1 я 19 15
Зах пе; да їз яву Суб Аїд вза Бех сіу Рпе тмгоБае бехт Бех тух 28 25 35 діа Мех Вау откр уа1і Аха бія діа Бо б1у був бух Бец б) Ткр уві
З5 жо ЧЕ
Зекоуаї Тпкобвіу А1а ві З1у Ах Вес Тк оТук тух Бжо Авробек узі ва 5 о
Був 'Зіу джу Биз о тек Хів'вет ду Ар дви Бек ую Ап Бек пе тух з 7о Тк Во їєз ій Мес Дейл бех йец Акту Три б1й Дар тик Ата рєц Тух ТтТук Сув ве чо ав ліз Пув Ткр аІіу двр бій сію РНе Авр лів то 155 «йо» 3853 «піз СКОЄ крів» РЕТ «хі3» Ното барій «40» 393 січ ах бій пес чаї Зїїш вес Зіу щіу б1іу Тем Маї 312: вгОо- с1їу оту і 5. їі 15
Зех їво Зкч о їец Бех Сув о Аза Віз бек біу Баде Спх Бе бЗековсхт Тух
Я 25
Аїа мес беж Ткр Маі дта Зіп А1а рРго сіу був'осв1іу ней с01ц Тер хмаї
Зк 40 45 їЖек чаї тНт сту діа Ууаї бсіу Ата дек ТЕ Тук отут рто Авробеїх чаї
БО 55 во пуз 01у Ак Бре о ХВк Ї1с Бек бка АБр лап Аза Був АБ бек їец тує то 5 ЕВ цем сій Меб вай Бех ем Ак Ввросі) вяв» о Твх Аїа уаї Тут тук сук 85 зб 5
Аіасвака туросіу Ар о с1а О1уУ вне вро отів їчо їп5 «31505 335 «Ті 106 «ит РЕ «2135 Нощо яашаьет капох зва
Сів схаї 14 Іжши уаї бін бек біу Зіу піу рез уві бій Рео-обіу Ахгу 1 х о ї5 дет їевзс'АтУ цей бек Сув Так о Алія бек біу рпе Тік бле ех бек Тух 29 а за діва Ммеб бер Тгр Бце вус Зп Аїв РтооЗіу ув 0Ї1у ес ОМ Тер маї з5 Ку 45 с41у маї тіх біу а1їз Уа1 біу дк бек ТвВкоТук Тут Еко Аво беє хуаї
БО 5 во їйув б1у кп Біре Ту І1їе бек Ата АвробЗіу Бех Пув Бех лів'яаїа Тук 79 75 о
Ім. піт; Месовво Зех дей опув Ту Віз дар твж АтТа ужі Тук о тук був -в5 за 35
ТЬг оАкЧ тхр сі; Авроб5Іц о Зу Ве дер б18 105 ов «2105 ЗБ «11» 105 «212з ВНТ «их13» Нето вашей «400» 355
Зі Чаї бій гей уаї ЗБ сте ЗіУу біу бі рем ге Зіп Без бі щу 1 5. 10 ї5
Бек лю Ака Тей Беж Сув АТа Віа ВЗек бі Рпе Тк рде бехс Бек тух го 25 35 віта Мес Бах тер уаї Аку сіп дія Бгто б1ім був Зі їв бій Ттр Увії о. о 45
Бет отаї тах біу ді Уві фу Ат беж Тк Тух тук РЕо Авро бек хУаь
БО ве 5 ув сіу Ака вп тн Т1е беХ Акс АвроАвпд Бех Бук ваше ТП опер тує то 75 во ей 2 Ме Ава Бех ей о вВгч Аїа 515 во тп вів чаї тук тує СУув ях зи 35
Аза Ач о тго біу Авр 3» 1іу Бе Авр о ї1е їсо 105 «105 396 «хів об «Визв ВТ
«хі3» Ношо зарієнй «ох ач бі уаї піп Бзи Уаї бій Бек сіу З1у плу бед Май біло бто бру Щ1У 3 5 160 15 бек їж Ага Гео век Сув ліз Аза бек зу ре тах рвав дет бек тую 25. зо дів Меї Бех ттр уаі Ака біп дів ро СОІУ Був буку цей СХ Тут Ууаї 49 48
Бек маї Тк біу АДіа таї біу зго бех ТБх ТугтоТук рРго Авробех Мв1 5о 5 66
Був шіу Аку Ре Тк Сів Бет дхУ АвроАві Бах пу дп отак ря тую 7о тя во пе сів Мекосту дек оси Ах дів 1 Авр оМеї Аза Уві тую тТук Сув пе Зо 85 вів дк Тхр о біу др біз з1у ре Авр о ї16 хоа 195 «102 337 «рід ВЕ «ій з РЕТ «13» ПоМо Баруєвй «збо дат хв хаї біпоьви узі біб век сту б1у С3У пез оуаї бів Бо сСіу ту х 5. Кз 15
Зег Ти Ахо Пец шех Сув Аза Атїа Бек Зі Рпє тТвх РБЄ Бек оцек тую йо 23 Зо діа мес Бех ткроУаї АХ Сів вла вхо сіу ув бі лем Зі Ткр Уві з Ай 45 цех Уді тнгос1іу А1а Чаї сту джу Шек тк тую Тухк ЕЖо Аво счеє хі о 55 Іе пуз ЗІу Ак рНе Так хХзю Ват дту АвББ АБИ Бах пу Ап тп опец те
То З що їв біп мес Вяв Бех лем Аха Аа біз дер Тйх Аїа Уа Тут Тур сСув 85 зо з діз ахчЧ тТкр о спіу дво сімобіу тре др тів тай 155 «3105 398 «11» 195 «ий» ВНТ «йЙ13 омшс варівй «00» ав сій чаї біл реч уві ій Бех біу біу біу іш баї біп орто Є1у 31 їі КЗ 10 15
Бег їв Ату пев бек бує А1а діа ек сіу РПЄ ТВКоРНє Бех бецпотук по 25 30
А1ївз Меї Бех Тур Маї деу біл Аїх реко сіу Був С1у Мез шій Тер маї
ЗЕ 40 45 сту чаї Тит соту вів Уа1 бі1у АхЯ бек Тих лук тую орРуо АвроБехк май о 55 БО
Був сту АкФ рпе тп ТЗ Бех Ак дер АвроБах Бук АБИ Бек оржа Тук то в як іже Зіп мех АБО обек Бей) ув ХК ОЗіц Авротнт Аза Ууаї тух ХуУХ сСув 5 50 ак
Віа ха жо біу Авропу» бі Ре дар 1 їпо 105 «-210»5 393 «вії Т05 «йїй» РЕЖ «йїЗ» Лото зарівп «4000 399 бі маї зп оре; уУвї бо ет біу зіу зфу бви уаї Зб орто піУу З1у х х 10 15
Бех Бей Гук Без бек Сув Біля діа с Яег зту Рпе Тк Бре бекх бек Тук то а З вів Меє бе г тТкр о уаї Аку с ів вліа бек о біу Був СІіУ Беб шій ТЕр Уаї
ЗЕ чо ав
Оу мМа1ї Хих біу аха чаї: пу Аху Бет вп тує о тухк рхо АвроЗєк ма
БО ва 5 ув сіУу Аа Ріе Ту ї1е Бех Ак АБр о Азробек Буз Ап отТнх Аза тТух
Я 70 їв о їей сп)іпоМес АвБп о бекоБей бує Тпт ЗУ АБвВ ОТаХх АтТа ба1і Тук тук о сСуз яе 5а 95
Тип вка Тгрощу вер осух Сіу Ве двр її хо. 105 «8102» 400 ке1їз 196 «Ма» РЕТ
«2к3з Ното варієї «Об» о біз Уаз біз ївц уаї вій дек Зіу «фу біу їяи чаї Від Бо Біу Фу ї є 15 15
Зех пед дгЯя рей бек Суд діа А1о бек о біу Ре тп оРНе Бек бек Тух 28 25. 30
Ала Меб вВеу Тер Маї Ата Зіп Аза ко 51у Буя 51 лем маі Ттвр Уві о 45
Беж ма) твж о сіу Віза мазі а1уУ джу бек ТВ туї ТУук Вже Вер обек маї ня є їув ЗРу вкч пе СтТвЄ тіє шШет джут АВр ЗБа Аїдобув Ап оЗНЕ ев тух
ЕІ 7е 75 я їеб о біп Меб МБ ошеї Бей Вкч Аїа сій АБО ТБродіз Уві Тут отук був 85 о зе вів Аха Ттросіу двробій Фіу РНа Авр г3е т І05 «2102: 491 «її ї06 «вішв РЕЖ «2і3» пото варієтй «005 «Пх спри таї бій бе: уаї бів бек дкч Зіу уаї ре; Уаї зіп Бко бі Ту 3 5 10 ї8
Бвк пес Акту рен обеу Суб дій АТа бек піу Рбе тат ріє бетобек Тук 20 25 за діа Ммек Веж Ткр оуді Ака Сіп АТа рсо ЗРуУ пувобіу йде біо Ткроуві 4 ав
Бех Уаї ТНК о сіу Віа уві щу Ах Вех Тахо Тух Тук Ргс Авробех уві 5 5 ЕС
Був 'ОЗ1у дка ср Тк Іїю Зех дя АБр Ав Бех був Ав тру пей ів
70 зе во ей ОТ; Ме дво Явт їж Ака Ата сій Ар оТВЕ Аза уазї ТУ тує Сук ве а 5 їув пув Ткросіу Аврошіа Сі ве Авр 11е 105 Ме «2105 .457 «7115 195 «її ВНТ «й» Ното взрієв «паз а ін Уа лів пе узі біз бек зі1у б1іу п1іу бр оуа3 бів Бус озіуУ пі 1 з о її
Зех їей дкч вв бек Сув Аза Віз Зех бу Рпе ТВж Же Бек бек тТукг 25 ай
Аів Меє ВекоТкр уаї Бку с спійп Віа вто Зі Був піу рес ЗІ) Ткроуві
ЗБ 45 5 вів АТа Те АБО Бек Зіп б1іу ув бек ТВ: тут Тук Аа йеровет чУаї
Бо ав ей
Мув о с1у Вт рпе тах Ті Бет Ак Авр АБ АТ пу АвпоБек їеч Тук
С У що їез бід Ме оАво Зак Пез Аха дів біо АвротТвх Аіа Уві Ттук Хук Сує ве за я вій АхУ тгросіу Аврошаізу слу рН дЕрод1е зап 1п5 «2105 403 «21їз ї05 я«еїйт ЕТ «КІЗ» Мото варізп «асо» 803 січ маі с)п еп оуді бій Бе о піу 0Т1у 2зіу вис Ух СІВ рго П1уУ Аге 1 5 15 її
ВЗех цей йтго еп Бек Сув Аза дів век 1і1у Бе Тк РБє бех Бек тук о 25 30 йта мес бек Ткр Уа! джу Зі дій РКО Біу цпув ЗРу Бей Зі тТжр уві ап 45 ек Атя 112 АБпоЗекх 230 біу бук беж Ту Тук тук Аза дер Бех Маї во з 50
Був З1у дДкчЧ гів те 112 БекоАга АдвроАвп діа був двп Бек Бей отур то Ще во їец дій Мес дви Бек їєц Ату Ві Ф1родвр оту дія бе Тує тТух Сув ве за З діа був о тЕр СТУ АврозІі» біу рве дяр о т3а
Х09 Що5 «-210з аз -81ї2 156 «81» ВЕ
«213 Нажто зарізи «50» апа сів ах біти Уаї біз Бех біУу щу сіу бйей УВК рув ко біу щІу ї 5 16 ї5 цех їй вжЕч би) бех Су АТа Аїа беж сту ББе ТНх Бре бет бек тук 25 25 за
Аїа мес Бек ТЕр ті ху сій Вів го ссіу мув Я1у пев сім Ткр УА
За 40 45
Ват Віа ті Автп оВеу сіп обЗіу цу бек зве тую Тух ла дер вет Маї
БО Бь 5О пу біУ АкЗ Рпе Ту Бі пек АТО АВо АБИ йїа Був деп оБбекоївиа ТухХ 79 75 зо бе спі Ме Аза о век рес Ак Біз зи сдев ТК Аза чаї тух Тухк Сув вх за гу
Віта дга Тр о біу дзр о бсібос3)у рве двротіє тао ї05 «З1їй» 4505 «3хю» Ов -В125 БЕТ «213» Бото варієй кабоз ЯЗ
Зі уаї бів пед уаї зі; бакобту шіу бі пем узі зіповрко в1у бі 41 Е 15 15 бек Бей ку рец беї був ді Аіа вву о ОХУ РВЄ ТП Рпє Бек бек тує ва 25 30 ха мес зем ТтІр Уа! Акая бБілпоАза тв осіу був ЗУ лев сім о хХтр ма! чо 5 пек аза 112 Анповек Зі піт був дек ТрЕ о тТук тукоАка Аврошек Мак зо я во пу зу Ач бле Тк те Бек одуя ій дей с АТа ву АБИ Бек. їі УК ах по 15 во
Кей сіті Мер оАво дек сей ач Аза сіу АвротТнх АтТа маї тутотук Сув ве за з віз Ата тв осіу дЕр обі ЗУ РНе дер хі ї5о 55 «ХО о «їз зва «рійз БЕТ кИїло оНото варієй «ц00з» а іа чаї Зіпойєю аз спі Вег бі 0Ху Зіу бер чаї Пузв рго піу у и 5 10 15
Бек оїео Ася реч беє був АТїа Аіа дек сіу Бпе ТВ рре ву Бек отух р) 25 Зо
Віз Меб ет тер оуаї вга ОМі АТа рго біу рувобіу лем Сбішоттв Уві їй яв сзіу аха 1122 Ав бек зі» сіу Був бе ТЕ тТух ТУЮ діз Авообеї Упі
НКУ Зв со
Тув Ту Аку Ре тих 112 бех Ага вво дер о зек був Ава ТНх рей хух то 75 на їжу Бі мив оавдобах дей цуя спи сі АвОо Тпж Аза Уаії тут тук су 85 п 5 тв Тиг Тгробіу Авро сін с1у вве Авротіє тод 105 «10» чо «211» ЛОБ «війз ЕТ «кіз» Номо варікй -400з дОп7 біз Маю спів рем суаї Зіз век сіу біу аїу уві ча) Бкч Руб піч віу ї 5 10 хТ5
Жає пемоАту Без БЕК ОСув діва А18 бек б1іу рБє щтіх РБе бву веж тує за дів мес Бах Ттр чаї дха бій дія вжш сін Був біУ тІви Зі» Тероуві бер Аїа Хі Авип Бек осзій бЗім був Бех тік о тТух Тух Віа Авр обу ді
Ти 5 во зув З1іу- Ата ре ТЕ Іїє Бех Аа аБр Авподів уз ваз вет мем тує
КБ я Ка во тем біп Меб дев ех Бей Вху Аїа бі АзротТБх Аа Тез Тук нів Суб яв за а5 ліз Аку Тхр З1Уу АБО 513 Ту Бе дво 116 105 їіо5 «їз ов «Едді МОВ «185 РЕЖ
«2і3з Нощо варівий «апуж 408
Чім уаї бБіпйобео маю Сіз Зет пі Зіу со1уУ бе Уві Був орто піУ у 1 є, 10 18 вексьей Ага іо Беї Суб Віа А1з Бех Біу РпЄ тпЕ Рпе Бек Бек чук 25 Зо діа Меї ето тур чві Ажхасбїв діа рРтО блу був біу цей 010 Тер Уві 35
Бек віз Ї1е Ав бек бів сіу пувовех ТВ Тут Тух Аїа двБроЗехт Маї
Бо 55 ей
Буз схлу Ако Бпе Ттвху ТтТе Бех Агу АвроАБлЛо о Аіа Бук Ави о беїт їй Тут 65 то 5 ко
ІВ Зібвз Меб ап оЗек Пен вкч АТа біс Авротйк Віа Увї Тур оТухк Суб за з5
Віа Ага Тур Біу двр Сів З1іу Бпе Авр 116 в Іп5 «510» 403 ак» ЗИ «ЗДО ОВБЕХ хвіз» Мово варієв «Оз 4 сію уаї біпсїец во обі» ет біу б1У сіу їешоуаї бів рго сСіу біт ї Я 10 15 ес печо дує їм Бек су Віа Аза бек щ1у Бе СТЕ Бае Бех беж ТУух
В 25 У діа ме Бех ТЕр уаї дхкч іп овія вто біу Був Су ес си Тер маї
ЗЕ чо в
ВЗех Аїх їтїе Авц Яек о біп біу Пув о бек Твх Тус о Тук Віа йно Бек Ууді
Зо 55 5
Був сту дга ВН ТНК зб деко Ага Авродви бек Був ана» ТК Опва тую
55 70. Тк во цей піп Мет о Авподех їй вк Віз сі; Авротне о а13 уві туго Тук Су 85 зо З вла був тр осіу АБрОоСТо сі» впе АвВр о гІтє шо 105 «230з «1 «83» 106 «2123 ВЕ -ев132 Ното варієп «00» 415 сіп' уаї біп ем чаї бій Бек с1іу Біу сіу Маз Уаї зЗіп Рко- с1у Вага 1 5 їй 15 цех ївиц йгЯ їжи век Сув Аза Аза бет йплу рое тах ропе бек Явлотут 7а 75 30 діа мес Бех Тгроухі вка сів Аза Бл аву був ЗКУ тез» бід Ткрома1ї а 25
Аза АТа ліс Аа» его оЗфпоспхХу Був бек ТНу тух Тук ліз дар бек УВІ рез БО пув'у Аку гне ТЬе ї1е Бек о дго дер АБ Вег Був Авпотакоїею Ту 7о пк во реч бід Меб Вви бат пз Ах Аха біб Авроїтбпх Аза Ууаї тут туко су ва ЕВ зе
Ата пу ТЕробіх Аврошіс С1у Бце дер о т31е 159 105 кеїй» 411 «г3їт 06 хЕшз» ВТ «хі35 Ношб варів тай» 411 біп маї біб оїшча Узі біз Бех СІ; щіу СТу Уаї а) біз Еко РУ Аке
Х 5 16 І бек пе» АгЯ тез дет Су діа віза Бех сіу Бе тк бе Бех бек Ту 20 25 Зо їв мет Бест тро чаї Аха бій віз риб о біу цувосту ем піз ТЕР очах
ЗВ 0 45 діа Азія хівоАВО бек ЗЕМ біу Був ойцех твнх тує Тух віх двровек Уугх 50 я по пМувс'саїу Акт вне Так ї1є чек дсу дер в5побех пув ВБи Таж Пец ТУЄ вх 70 75 "во ій бів Меб АвпоБесє пед АтЯ АТа Зі дер оТнгоА1а Уаї туї ТУК Суд що 5 віз Ат тТкросіу Вр оЗіс; піу ВйєЄ Авроїтїє ї00 105 «5105 1 «ярів 106 «прав ВЕНл
«Вій» Мото яарієп -а0о» ай
Зп о уаї біп їй Маї бій Бех о віу ші б1у увх Мат бів орто с1у вед 1 Б їб 15 беж цес дез сем о Беж о сув Аза дія Бек Су рКБе Тв рНе беж ех ТУуХ 25 зо дів мес бексткр чУаї дкч сп Вів рко бім Му о сіу рейпозма тав о уаї 25 Ст ФВ вів вів ї1е дело бек Сів біУу Бу бях Тіх Тук тух Віа Авробек Уві
ЗО а «й пцув о сіу ВкчЧ о ЕКе ТИХ Ії Бек Агу Бо дви Бех гу ВВ ОТОк Бей отух 85 70 т 8о їец СіпоМес Авт оБеє Тед дгт діа сій берогор вів Мі Тух тут Сув
Б за 35 діа Був Тур осіу Ар озІО СЕУ РПЄ Авро 112 і00 155 «?ійз 1415 «Віїх 106 «ВІ1Е» РЕЖ хйХЗ Мото зарієй «40» 413
З1й Ууаї зіп Бец уві бід бек оЗіу біу зіу уві уді іп Бго Зіу Ас 1 в ї0 ТУ
Веєк рей дДЕчЯ Гей бек сСув Аза Ат Бех сіу Бпе Таж орНе Беж Беж Тут та р 30
Віа мес очЧек Тер оуаї вка стіп вла ро ху Був п1у ем стій ТЕр Ома!
З а С та дів їїіе дяповек сіб сту пу Бех отв Тук тТук Аза Дер Бек ха1 5О 55 ва
Був оЗіу Ввкч Ве тих тІі2г бек Ага Авродви бе Був АБО Те ей Тух
70 75 во
Ієм Зіп Мек дви ек омео Ага А1я Зі АвВО ТтВУ АТа уві тує Тукосув
ЕЕ зо 95 дів АкеотЕр обіу Авр пім Біу ве вве оте ї1б0ба ї05 «Рай В14 «115 106 «2Лйз РТ «8335 Ното варі каша 48 51о шві їв цей уаї бі» Бек сіу зіу узі чаї Маї бі ро сіу Б51У 1 5 ке 15
Веб йей лкФ її Бек о Сув Аза дії Чет О)у Ре ТВкг о гпе бег Бех Тух зо вів Меє Бех тЕр уаї бо сіп о Аїз БІО ЗІіу Був шуу ред оспій їхроуві1
З «а у дек Аха І1є АБ» бак ій ЗІУ пув цех Трпт тує туї Аза ввровеї чаї о БЕ 5
ТУвосіу Вк рБе ТАЄ ліє бетї Акч лЛЕр Ав Зеаї ув о ввп бех пезстує
З 70 7 во
Без» біпоМеє АвпоБех цей вхя тп сіцп.двор Тигодів пейвотую Тух Суд в5 зу Зх віз пув'ттр З1у АдЕр обіц с1у РНе Азов от1є 100 155 219» 415 «8112 05 «дра» РЕЖ «віз» Комо зараієт «апа» 415 зт Уаї біх еп зах біб Бех біу сіу сіу тей май піп ко бїУ Ту 1 5 15 Не
БА
Бет їем АкЯ цей Бех Сув Аіа дуа бек опіу Ре ТНК вБпєЄ Бех Щек ТУух о 5 за дія мес дек Тхр ав вка сі дія Бто біу Був Ту реч шій ткЕр ах
З о 45 век Аїа Те Аяп Беж сіп біу пув бек Тру тує тТук о Ата вав Бек Уві
Ба 55 ща цувосху бле вне ТВ Бле Бех Аг дер АяпоАїа пу Ав бек сей ХУ то тА во ечосій Меї АБи бе Мей Ата Аярозій АвроТрІ Аза уаії Тут Хух сСув ж зо ЗБ діз вка Тур сіу Бр осі) Сіу Знесаво ля 150 105 кхеїт 6 «2135 108
ФЕВ Вт.
«743» Нощо варієй «40п» 416 вій чай Бій лено оМаї сій Бек у бі йіу с пво хі сів Вро 1 Ага ї В то Ії
Бех їва ВкЧ їви Бек був Таж Вів бет Піу не МО РНе бес бех Тук ве Кк 3
Аіа мех Бек ТЕр о рБе Ата бІіпоАїа ро зі муз 1у реч сім тжроМайї
КІ зи «5
О1у Аза тів Ав бек змі біу Був бек Тйх Тут Тук Аїас АБИ Бек о уаї 50 ав во пу пЛ3Уу Агу вНе ТК тІіє Бех Ага А5росіу ех мук бекотіє Атіастук за 75 БО ем іп оМеЄ Ава Бех вемо був Тс біз Авротпг о Ата Уві Тук Тугк сув 85 з ЗЕ твк де тур осі1у Авросзтн біу ББе о Авротіє ч06 105 «ам» 817 кЕ1ї» 406 каївх ВЕ «ЖїзЗ» Несто варізр «в00У 417 бі. уаї бід їем Ууаі сі тако біу ш3іу біу ївец хів біп Бко біу Щ3у т 5 10 їб цех їем АжаЯ цей Вет Сув дія Аза Зехк сту Ре Тр Впе дет дек туг 5 зо діа Меє Веж Ттр Мах: Ата бів А1іаоРко біу був лу ем сіб Тер уві 4 45
Век діа Ї16 АвпобЯех обіп 1у Був бек Тк Тут Тук Вів АгроБех Уві о 55 Бо цув З1у Аха вне Тих їте Бет зга двр ВЕУ Беж пув дво ТВ сей туг
БА ве тп В во твцоспій Меб йвп обег оїви Ага Аїа Зіз дяр Твпг Вів УуУаї Тук о тух дув 85 зо за
Віз Ажч Тер уїу Авробіз Чу ВВесАБрОТІЕ 105 тва «їй» ІВ «тік» 106 «тих БЕТ «813» Ното зарієп «поз ДВ. оіз Уа) біб бей оуаї бій бат бі біу сіб їва Уаї бід то біу «1у 3 5 10 ї5
Яекорви Ак Без обєх Сув Аіз Аза бек осту рпе тТБу вре Бех ба Туг хо В за «Аїа Ме Бех тлв Заї Ах бія ліа во Фу рув'єяіїу ей обій тук чі ав 35 ру
Зех Аіа тів Ав бекобій с1Уу Бу5 беж Хі тут Туг Аіїз Анр о Вест Уаї во пе ви
Язжа сім Аха Ре Тит Ті ех всу Авр Ав Зек дув Акта оТйх Пейі Тук
ЛЕ 5 во їй сіпомек осіу Вехо їй Воєб Аїа спіл дБроМеє Віа уві Тук Тук Сув
В зо та
Аїз Аква тТЕр о Зіу двБробІій зіу ре Ар ТІє ї9О 85 «Ві0з 515 «2115 106 хрпі» РКТ -еті13з Нео Бархвп «айб 519 ази Ууаї сів ви чзаї бій бех Біу ві біу Бей очаї іп обюо сЗіуУ ву ї 5 15 15 несг пец да цей ех був АТба а1а ЗБ Ту рРНЄє тТржх рре Бех Бек ту йо 5 Зо ліва меї бек ТЕр уві ду бія діа Бо Бу ув Бі Ппей» біз Тер хХаї
Ку ее а
Бк діа хів дей бек ОТП с 1у ув Бек Трх тух Тук віз ДнроБек Уаї 52 5 бо пу у вич шле ТК ї1є Бех вх АЕродВи бек бує ВяротТйх пев тут ія за 75 аа їви піп Меб Ап оБек Тео вк Аза С)ій о Авротах віза маї тує тТук Суд ви зо а вла деку Тхр о Зіу аво обі; сіу ве дер ї1е 1095 185 «ваз а «НІїз 196 «вій» БАК
«13» Ношо варієть хапо» айО0
Сіах Ме бій рем оМаї шій Бек 03У Оу піу спе» Маі 312» Ро Шу бзіу їх 5 о З
Зех ївц с джяЯ ей бек Сук Аза вії Зек о біу Брє УП рре бехс Вех Тух
Зо т Зо
АТїа вес дет Тр Мат Ато бЗіпові1а рго пір був З1у вЕч ЗТ Тор ЧІ 35 зб 5 зу 12 тї1є Авпобех іп Су цуз'бвк ТВ ОтТук Тук Атасднр бек ах во пув сту кар пе тт о т1е Бех АгЧп одвроАвроБек пув АБО обех їеий Тує «в 70 15 во їем ЗіпоМек вп о бЗеї її Був ТБРОБІб АвроївВу Аза уві Тух Тур Сх 85 зб Б іа ду тр с1у двр біз біу вбе дер тів 190 155 «шо» 41 «вух лов «81й» БЕТ «-21ї3» Ното зарієй «4800 431 зі маії іп Бем беі и Бек зіу сіу Бі пей уві зій Рко аіу ХУ ії 8 вк 15
Бак Геш Був Меп бек Сув Аза А1з Беу сіу РНе тп РНе Бест бек тук хо хз. Зо діа Ме цех Утр чу) Ак бій Аза его обі Був созУ еп обі ТІВ чаї їв ай ав пі Аза дів деп оБехк Мі сОіУ мув'явк ТЗЕ отут тус Аїв вБроБетк Уа
Бу 31у Ак ре Тих тій Бех Аго двр о АБро Бек пу Ав тах Аіа Ттух
65 то тв чо пеп с3іп Меб Аа обес тей Бук так обіо АБротих дія маї бує Тут сСув
Б ща з5 тик Ата Ткр обі Авробіц ЄТу Ріє Авроїї6 109 їа5 «пот уд «-1ї» 05 «їй ВВЕ «3» Бошо варіст «005 4 біз бах зів Бей уві бій дек СУ 1 сту бе уаї біп Ро бу щу 1 В іо ІВ бек пн Ах іє век Сув Аза йха с бех Зіу Бе тв рве пек Бех тує 7а 25 за віа Меї Бег Тхр уаії Ага СіпоАіа РБко п1у був бі Меч маї тер чаї хй 45 бек віз її двп обех бій 01У Гук Бе: їх Туг Тук Ата ав бех мМаї ви 55 50 пу сьу вка Ре тк от16є Бег.оАдко АврозБИ Аїа був АБ тТВЕ Пец тує 65 72 75 во реч озіп Меї Ав обет о мейп АЕЗ дів бЗіп А ТпЕ Аза Уві Тут тТук сСув
85 СТ я5 аїа вка Ткр бсіу дЕВосів шіу рве двр 112
105 105 «вій» 4 «арх Б «2139 РИ «-213» Ното зарієпй «4005 43 сів маю сп мен Ма) сс жет аха обу уві реп сук іп гро зу пТту 1 їх ТБ 15
Вехпт це) джу цей Бежг о Сув діа Аза дек бі Ре ту вне Бек дек Тук 36 25 Зб діа мес бек Трромаї дкУ біп Аіа то біуУу був ШІ1У Ма біс тТхроМа1 35 ап їв бек діа Ії Ап о Зеж о сїіп сіу вуз с зЗнк ТВКоТук тут вів. АБр о бех Уві
Б во
Му чху вхЯ ває Тахо їі Бех вхо Ар оВвловат Був АБЦОТИК Ге нів то 75 во
Па бій Ме оАБп бек їез Ака Аіа с ЗБц АБроїтну діа Маії Тую Тук був 85 зб че пув обу Тер о сїу дявосій біу ВББя Аврощ1е. тов 105 «105 454 «Тіз 97 «їй ОРЕТ 5б2
«215» НОожОо Барієй «Ом 44 ан оїіе біп Мес ТПх о біп бек Рто Бех беж цей дек АіїЗз бак уаї -ЩУу 1 5 10 х5
Авр оАта уаї ство їі ТВ оСув Ака Азї8 Бек Зів Зі тів Бех о Ава Тр ої ІВ 6 їжи Аїа Ттротук ХВ Осій пуя РКО ЗТУ пу Ада РЕйоБуз Бей бе птуе жи 5 тух сіу Аза Бек дет Ше» іп ББЖ піу уах ро бе" бля ВН ББЕ Б51Х 5О 55 5
Бек сіу Бех обіу ТЕ Аврорке Тлк опти ТвІ ї1їе щем Бвк Би бі вто 5 зи 75 зо бій дво рБя Ата так отТух Тук був Зіп бів тує Бек Бех влпе РЕОо ті: 85 зо 5 так «пап» 425 «ик В «тій ВКТ «ши» Всхро варізи «400» 25
Авр її б5Зів мес Ти бій Бек рко Чеї Бак Пеб Бех Азз Бех уаї Сі ї 5 хо ї5
Аврровху уві Тіт о їїз Хе Суз всеч лів бе ЗІп сіу ліз ех дп Тур хо 25 73 їти Втіа тер отТук біп ост Був вто піу був Ава РКО пу їжи ех Щіе з5 що В
Тухк бут дів виг Бах ей бій век п1у Ма) Бюбовек Аху ре Зак зу во ЗЕ БО двк віу Бех щІіу ЖМНт АврорБе тик оцей ТБЕ ті Бек ЗК Пт ста рЕо
65. 7 75 ви 1: Аврорне діа Тс Тук тую бух бів бій Тукобек Бек Бра ро ТЦЕ ве 5 5 тв «210» ра «211» 87 «ша ЕХ «13» Нощо варівю «00» ав
АвооЇ1е Чі) Ме тн сій Вер Бо бек Деу їенобех Аїа Бех Уаії З1У ї 5 то 15
АвБроАта Хві тВх хХіє тТпх Сув Ахж дув Бех Зіпосіу ліс шековвБо Тер 29 рія 38
Іви Аза Тур оТук 01 о Зіп о цув рго біу Був діа Бто був їви бе 11 ях 42 45 тук пі1у Атїа дех бек Бе: бів» бек о спіу За1і Бгто Бех Ах о Бре бек Ту 5О як й
Бех Зіу Бек ЗІу ТБ Ввровпє Ту пе Тв; 116 бек обех ей біло рко
Б То т во
Зіни бна ої1е діа тБкотукю ТУукх Суво бій с1ішю ТукоВек бет Бе ко ТБх ще зо 5
ТпхЕ квіїійз 457 «2112 37 «Раз РИХ «В13к Наото варіют «йо» 487
Аврої1е б5іп мес ТБ сбіп Ззежх рго бех бетг бе Бех Ата ЗвкК оУузю у і 5 хо 15
АвроАта Майї ствах ї1е Так був Аху АТа ех сіп ху Ті Беж Ап тер та 25 39 їв Аїі3з ткр тую Зіповів Ппув то біу Буз Аїча бус ув цем пев іє зе ай аб
Ттук сіу Віз Бек бек По ств бек с1у Маії Ртхо Бек Ак ВБе бек Щу б 5 во
Бек з1у Бек БІГУ Уйк Бр Ріє тн рРпе Тих їі Беж Бех їши піп о рко дв та 5 8о піз дврОТ1Є АтТа трготух Тук Сув бій 2іпотух Беї ех вце рко тн зо ве твЕ «рійх 428 «іх 37 «Ти». РЕЖ
«3» Нощо варів «аб» 428
Авр І1в бЗіп меї її Зіп Бек Рго Бех бетоїюю дет віза ет уві бІ1уУ ї в 16 15
АзроАхоа уаї ту 112 ТК оСув ВкУ Аїа бек бів с1у 118 Бех Авп о Ттр р 25 Зо
Тецш вів Ттр Тух біп сіб Був рхоссіїу Був Чаї Бу Був рей тем її ме 45
Тук п1у Аїз ет Бек тва Сія Дек с1у Чаї Бгз о Веї Ат: МНе с вех б1у 5 БО шек ху Бех Ху ТМж АББ БПпе тТвесїшиа Се сіє Беж век о їцез бі ко ве 7о те во іш Авросаї Міа Тв оТух Тук Сув Сів З12п о Тук Вес Шек Бпе Рко ТВ
ВЕ за 95
ТЕ
«1 та «тв 87 «Вл РТ «9335 Номо вархеті «00 ав
Ази їі б1іп мес тру біл дех Рго беж Яву ої» Вех Аіаодеу маф у 1 В 15 ява дер Аха маї Та хів Тк Сув Аху Аза дек 03 біу 116 бер Авто Тгр во яв 30
Вез віз тер отук 21 Сіп пує Рго зіу уз Від Бгто був Ат ем 112 о 45
Тук сіу Ата бек Ввг о їжи Зіп Бех пІ1у Ма1ї Екс его дДта ве ех біу 5о 5 Ба
Век щу бех СТіу ТвгосФіц Рпє Ту Пе» ТлЕ 16 Бех бек ово іп обо вх то їх г сСіз двроБпЄ та пу Тук тує Сув біл Сію Тук Чек Бек рве сорго ТВу 5 тих «2105 азо «Тім 57 «йїйз ВВХ «йХ3 Нсто вапівй «каб» 435
Авп о Хіе біл оМеї ТЕ з1й бек ркго ех Віва Мег Бех Аза бек о Уваї ЗТ
Е У то ке
ВМББ Ах ма) Тк І3е тВх о Сув вк Аа Бек обБіц п3)іу ті 5еє дялоттр 29 25 30 цеч Аїа ТЕроБме піп біл муж Рхо З1у Був Уві вто Був мів с пем тів
ЗЕ ж 45
Тук піу Аїа бех Бех Ген З1й Зес З1у уд) Бро Бек Ага Ре вк оЗІіу по ЗУ 5о век у Звх су те ій вве тах це» тТрк о І1е бек о Вех вм ла рко 65 то 15 о с ім вБр РВЕ бів тах ТтуК тТук Сув Зі бій ТУуХ Бех бек Ре Бра Ту 85 ва ЗБ тах «їй» 451 «иїїх 097 «пї35 ВЕК «2125 Вот варієй «ай» 431
Ввр Її бів о Меє ТЕ сію бег орто бек ббт реч оБет Аза Бек оуВі б1у ї х 10 45 дер АБЧ хаї ТК ї1е тТву Суб Аха Аїва ет сій пі ті Бек Ави тир ха хв за тем Ата тер о Рмє іп обіп Був Ро СІу ув діа Ро бу бек опем тів 35 4 ах тут сіу лів бек Бек їем піп Бек піу Мі Бо Бек дк ве век біу а БЕ во
Бех ЗБу шен бЗіу тих взровБде тик Пец тв Тіз ет бек бец бів сто «5 т 75 во 51 дврорпе АЧа тре отТук Бук Сув Сі біпоТук бег Бек вве о рКОо ТВг зо з ти «вІ0» АЗИ яЕзї У «плям СКУ 5б2
«213» Ножо варієп «Оз ази дво т1є Зіп має нь осів Зех Бкго Зек беє рей дет діа беж уві ЗІТуУ 1 5 15 ЗЕ
Авр й Май Тв їЗе тп Суб Аа Аїа Бех біп обу їіє Бер оАвлоттр їв вів ТІВ тую ій Зх Був оВуєсс біц Був Аїа сво пПув оЗет Бей ї1е з А 5 туї бі Аїа Бех Бех їв біз Бех сСіу маї Бо Бах дуЯд плов оБет 0Іу 50 55 5
Чех піу шек сту ТВЇ АвроБне Тк Ле тТву їзле век ба Бреда сів Бго то 75 89 біз Авр ре Аїа Тйх Тук о тук Сув З1й 15 Жук чех Бех ве Бюко Так вах 55 55 твЕ «Вій» 33 сао» 87 еїйз»з БЕ «21315 Бото варіва «400» 435 ліз т11ієе сій зеш Тх біп бек Его дек бек Би Бех Аїд Бех Уві зу 1 5 То ї5 вер вк Маї ЇБт тІїе Так оСув ду овія Зек о біп б1у хіє Бет АвпотТтр я ве 35
Вец Азїа Ттротук о біп бір Був Рго бБіу Му Аза вхо був'їез реп Ще з5 29. а
Тух 2іу Віа Бех бвгорец 010) Бех опіу чаї рРхо бек вх ре Бех ЩУ що
Бек бІу Бех пПіу ТК АБроЗле Так оїви ТБе Ії Бех Бег їжи 1 орхо то 75 ва зі: аБр ве Аза тру тук Хух Сузв с спіп Біп о тухт Бех Бек РПЄ Рує ТК
НЕ за за тн «ЙО» 4334 «211: 97 «2ї12х РВЕ «із Номо варіви «ай в віз 112 біз хе: З обЗів бек Рко Зек бек о бец Бек біа бек Уві ту ї 5 то 15 вер овкп Чаї ТЕ 11 тих Сув вка Аза ек бій ЗМУ ті Зву депотхр 29 25 зе йем Аза тт тує Зіпошіп с ьув охо сіу Був овіа ро пувомву тей дав 5. 40 ва тук ЗІіу Аза Веї їШехє ьо Бій БЕК піу Маї Рко Бех ВуФ рпе бек Щ1у 58 20
Век піу беж сіу Тр АБроОвББе тТвх ппшм Ту ЇТ1ЗЄ Беї бе збо сТїп о рхо т7а пе й біз Авровіж вів тс Тух тТух Сув ЗТп бів Ттуг чек Бех РВЄ РгОо с: як 0 ав ная «шій» «35 «її» 97 «ти ОРЕТ «Зі3з Ношто варієдй «аб» аа
Звродіє 015 Ме: Тих біз бек Бко беї Яех Хві дет Віа Вет Уаї 51У їх і-й БК І15
Вво ку уз) ТЕ їі Так оСув о Ата Аза декобів З41у Їїїе Вехї дяв Тур па 25 зо їєа Аза ТЕВв Тук біпобЗіп о цув орто с1іу Був Ата Еко Сувоїем Пец хіте
СН а
Тук біу: А1їз Бах Яву цей сіп Бекоб(Ііу уаї Рко-очЯеєс Аку Брав оБек У ви 55 5
Бех бі Веу СОКУ ТЕТ АВР ОРПЇ ТИХ цей Таж ЇЗе вет чек поем Оу вро 70 78 во
ЗІч Аве вне Аза ТЕ тТух Тук Сув п)й біз Ту бек дековвБе бро тах не я з
ТНЕ
«2105 436 «ЕМВ В «Мат СК.
«йїі1З» Ноше варів «Ой» 436
Авр Ії біп Меї тик оа1іп Бех бто Бек Вех таї ет Аза Бех уаї ЗУ 1 5 19 15
Вер Ага Уаї Тих Іїе Тр Су джб Аїа Зек о біп З1у 112 чего АБ ТК» м за їв Віа чтротбУуюк сбіп бій бувгобрз Зіу Був дів ви Був йем о цец ІїІї8 з5 0 45 тух біу ліа БЕХ Блху цей сій шШекх біУу узі Рхо Бег Ака вне Бек СІіуУ о в о ет сіу ват СІу Тпк АБО РБе тат опже тву Її11е Бви беї рез ша РКО 65 яу 15 аб
Сі вБроБВє Аза твЕотує тут Сувосїп Яіп оту веж бек вне рко Тнт 85. 20 ж тв «403 са «піжх 87 «12» РЕТ «21352 цопто варіви кабоз 437
Авор її ЗіБ Вей ТБ Бій бе Рко Чек о вБеЄ Сем беж Аза Бек Уві С1уУ 1 Бк І 15
Авробуч Чаї тт пів Твж Сув дку Аха беєобіп сіу т18а Бєжх депотЕкр 29 У Зо їй Аіз ТЕротукю іп суп дув о Бто бі Був Аза вхо пуБ опи пем тією ах п А тут Ху Аїв чех бек ем біт бет Зіу Маї Ро Бек Ага ре бет сту
Бех віу беж с1у ТЕкобБійш рпе тк отв ТЕЖ їле Бех бех ем біп вхо ве. 7 5 во
Сіп двробре ліа Тк Тук Тук Сув зів біб тТух беж бек Ре Рксо Тбх 85 зб ча тве «810 438 «щії 8 «иіїз ВН «ті3» Ношсе варієй «йо. ав діа тів Ажа Мес тпх бій Веї Рго Ре чех о рез Бет Віа бет Ууаї зу 1 З То 15
Азр вата хаі бтТвт жів ТВ Сув Ага Аза дет сб)п бСіу тліє Яех дви Тр 25 25 Кх їм Аза тер тухк бів Зій був Рко Аза був Аза ро рук оце» БНе ї12 5
Тук піу вла беї бек ей бій Бех сту уаї рхо бек Бк тве Закосі1у іх во дак обіу бек зіу три дер тук отих рем тк оТІіЄ бєк век ме) са)й рКо т7а те зп
Зі: АврорБе Але твеотух Туюк Сує Піп обіп тух Як деко ве Рго стае ве ча ЗБ
ТтТВе «2103 439 «11» 87 «Й БЕХ «йїЗх НощМо арії «йо» 4383 кїа ті Ву Меб Тпи бій бек рсо бек бек рце ех Аза ех Твх Ту ії кЯ Тс 15
Авр о ака М! Три діє Твбх Суб Ат АЇа бек с) ЗРТу 318 Бех два Ткр а и Зо
Беп діа Тер ТтТук Чі» 41р; цу Рго б1іуУу Був діа Ро Був о цвб Беца Г1Єе 4 ї5 тТук пгу Аза беж бек цей Зійобек Зіу маї Рго Вех Ада Бе Зек бу
В 55 50 чек Біу дет су ТЕБЕ АБО БПе твж бец ту їлїє Бет Сув рес сіп бек ва 78 5 во 315 АБО РНє Азв ТНК отук Тук був Зп біп тух Явг беж Не ко Так 5 о З5 тих «810 345 211 97 «ема БЕ
«813» Нотшо завів еаба» 44 уаі тІЄ тк мес тТпу біп Беж ж Вегк бевоьви Бек Кіа Бех ТМкК о оТу ї с 1 ії5 ввр Ак Ууаї ТЕ їі5 Беж Су АХЯ Аза Бек сій біу ї1є БвБтг Авц тКр га В їй їем віза тир тую сіпобів був рЕй 0І1у пув йіа ко біз Бей меш Т18
А ак тТух фу Аза Бех Бех Цез зій 5ет сіу Ущі рхо Зет ЗЕч бе пек оту
Бо ЗЕ во
Бех саіу Бвк піш тп о Авр вВйе Так їм Твг о Їле Бек Суя Пец сбіп Бер вх Чи я 865
Сь дев Ріє Аів Тк тує тут був бій сів Тук о Век Беж впесрко ТЕ ах зб ЗБ
Как «її 441 «ЕТ 7 «12» КТ «813» Боштосваріц «400» 441 ага ті сбіп Меє тру 5іп Бек Рто Чек Бек гео беїх діа бек узі У 1 х Іс 15
Авр ока Ма1 тТаголів Та Су о АкУ ваза Бех сій бІу тів бек Авй Ттр 23 25 хо їев АтТа Тер ТУК біпоозіб Пув Бгто сіу Був Ава РКО бух їтший Тез тів й їв
Тут сіу лі Бек Зет бер; біл обек йіу упі вБЕо Бех Аха Ре Бех ОТу зо ні 5 ех Ззіу Векосху ТЕЖ АвроБре їх ем їх 16 БбЕ бБзт йє» стій РКО
ВВ 7о У во
Пій дер орБе йїа тво отух Туг Сув сїп бід оТує Беж беї Ре Рго ТЬк в зо 25
Тпх «аї0Оз 448 «Ех 87 «2їп» ВЕЖ «811» Нотпюо варієнй «4й0Оз чах
Ввр о 112е біпв'Ммеб Тк Зій бек ро ваї Тв бєс Бех вза Беї Маї Фу ї Е То 5. двровгч М) Твх 118 ту був Аа Віа Зеу 031 п1у тів Бех дай Ткр а 5 Зо їеип Віа ТЕр тує Зіп піп пує Рго сіу Буводіа Рко вух мен ем те
БУ З
Тут біу дія Зех бек пед бтіп Бек Піу уаї Рко бек Ага Ріє бех бі
Зо Б во дер зіу бегобіу Так бій Ре ТБЕ Тез Твг оЇїє Бек бвг о їйвеу біп РКО
ЩЕ 7 45 во
Вер АвроРБє дів Ту Тук тує Смже біп сій Тук Зег бек Рів Бко ТНХ дах 5 5 тв. «10 ЗАЗ «па 97 «212» ЕТ «73» Ното варієб «й00Оз 443
Авротіє бій Меї Тис обів бек Бгто бег бек Пею бек дія Бег уві їж 7 5 10 15 ввр оБга уаї їх тів ТвКоСув Ат АТа Бек бій ЗіУ хів Зет Ава Ттр
Я 75 зо їви Віа Тк о тТук сій сій був вхо сіу Був Аза вхо пув оце Гей їіїв
З їа 45
Тух піу. Аїа БВет Бекорє; біп Бех б1у уві Рго ех Ву БДе бек У
БЕ 5 Зм
Зек бпіу Бех біу Ту двр оре тик їжу ТБх Її Яех бек Бец сій рга 65 70 5 то бій одер Ве діа тТвх ТУук Тук Сув'сіп бів Тут бек Ветхо рБе рто ТЬг в за ЗБ ти «210» 444 «1ХМв 57 «ій ВВЕ
«213» Нома варів ме не
Ав оті Бій мес тах Зіп Ве рко Бек Зех їжи Бет Ата век оуаї ЗТУ ї а То 35
Азродта чаї тю їі Тих був АБУ Віз бек обі сіу КГ) Ваг АВО Тхр 29 25 зо тпецпш діа тТЕр тує бі Бій ув ро піу Був АТа РКО Шув ши Меп КХЄ з5 о. З тук зЗіу Аїа бек шет Пеж дій бетг 5Ііу Уа! рко бех Вк рис его з1у
Ба ве о
Бек біу бат З1іу Те дар БЕ ЇвВг Мей ТВХ Ї16 бех дек ієм Сів ко то 7 зо
Чіп аББОББе с АТа хх тує ух Сув біп біл тут Зех Бест врре ста Тех
ТЕ
«810: 845 «їх 7 «810» ОРЕ «213» Нато варієй «00х в45
АБр тів піп Меж Трї бій веє рто бах Беготвй Бас о АїВобек уві сзу ї а т ІВ вро вгч аз тТвЕ їі ТБЕ о сСув о Ата вія Зекобін З1іу Ті Бек два отЕр ст 25 за
Шйеш діа ТЕО Тут біпошій ву реко сіу Був'Аїа ркЕс Пув Гей Бем Ї1Е 80 З тТук Ззіу діа Бех бек ес ШІ» бек біу Уаї Бко Бек Ага Ре бек щу 5 5 ОО
Бех Зіу Бех ЗРу ТАЖ АБО рДе тих рве тп 118 Бек ек рец о біп РКО ва та че як
ЗІ: АБроті16 Аїв Тпкотут Тук Сув пів обійп Тук Бак бВеї Біворхо ТЕ ве «210» 445 «екю 87 «жі СРЕТ «213» Нощша зарієг «400 де
Бар 11 01в МЕС тТнх бій беж ро Вет Бк Ме; беє АТ бБеї Уаї Ху х Е 7 15
Авроага умі Тв ліс твх Су Ак вів беж (іп обіу гів беж Ави Тор 26 ХВ ЗИ тей Аза тур стує сіпосіп Був то пуу му оАта сво бувойен Бей лів
З5 Б) 5 тут іу Вів Вех бек обец Чі беж йіу Маїс рго бек Ага Бів Дек ЩІ1У 58 во
Чек біу Зех бі Тахо Авробпе ТЬх вВБе тих Хіє Бек бег обемд бій рРго
В то Ше ва
Зі: АвроІ11є Аїа ТвготТух Тух Сув бів Зі отух бет Бек рів Ехо Тк зе З о тик «РХйм 447 «213 857 «ВІЙ ВНТ «213» Ното варієпв -400и 487.
АБр о І1е бід мес ТруКосзійп бек ро Зек бек Гей Бек діа бек чтві щіу 1 5 їп 15
Акр вка маі Бк оті Тпт Сув дка Аіа Зек Сіп с1у шїе Зек Авпоттр її 38
Тела іа тгротукобіп сів вув Бо біу був уаї Бо Був тем ем тїв
З5 4а 5 тТук ЗБу Уа Зеї Бех зей сій бех шу Уаї Ргро Бек Ара Ве век щу 2 а ко
Бекосїу веб бі тру двЮ РПе тТПЕ Бей тах ї11з Бех бек бец ст ро
В 7 5 ви
Зі аАБр уві АтТа ти тук Ту Сув бій зів Тук Бек Бек Бе вто Жжх 85 зо а твЕ «тійо 4 «Вії сл «хх КТ.
«віз» Зсто варієй «-4002: айв вер тів ст МеєЄ Тих стп Бек Вко ву Бех дей бек о дта чех ха сіу ї Е 1 і5
Авровкч Маї б вк тіє ТП був Аку Бій Бех біз ЗіуУ Ге Бек дЕВ Тр я 25 З
Без діа Ткротук бі З1іпобуворго 1у був А1а рр Буз А рем тіє 25 тук ліу діа Бек бек Гяи с1п бекобіу маф о рго веж Аху Ре бек у
ЗО 5 50 бат фіу Бех с1у Тйкю бій Бпе тт бем тТвк Гіє Бек Беж оїем Бідобхо 65 70 7Е во 11 АБрОобпе АТа тс тТук Тук Суб бів Зо Тук Баг Бек Ре рко ТБе в во з5
ТБХ
«адм па. «і Б «вій РЕЖ «лі3» нНотщо Баріей «Об 489
Авоа ліє Чіп мес тп бів дей РКО Бех АТа Мес бет вів Зеї Ууаі З1уУ 3 У 10 15 ар Ага маї Тс лів тру був Ак о Ата Бек осіп бЗ1іу хів бек АБп тр ї5 30 іїєм Діво тІроРйе СІіп бів Був рго Зіу був 'уаї вхб Був нівБ Шей Т1Є чо 45 тух ту вх Зеу Бех ва 013 Бех піу уаї Ркго ех АгЯ рРЦе Беж зіу
Зо За 50 чек сіу Бех біУ ТБЕСО1У БвНе тк бе Тне її дет бек рей щшІю хо
58 78 те о пім АвроРпе АТа тру тує тут Сув біп біпотух Жет Бех ле ро тп ве аб 5
Ти «-«йійз «БО «йіїх 97 о «Йї»з БЕТ «8уЗх Нопо варіат: «аб АВ
Авр отїє сій Меї Чу піп ЗБЕж то БекгоБех ши вет Аїа бег Уаї 0Іу і 5 10 15 ввр Ак Уаї Тр оїзїе Тну Сує БгчоАТа Чег Зійпосіу ЇТївзо бек вп тур го 25. З
Мцез Аїа ТкровБе сів осіз був Вко сіу Був дів Рхо Був важ рей ї1е а85 БІЯ -
тук сіу Віа шах Вес тей бів Бек сп1у уві бко бек Аку РБе Бек а3у 5 ЕІ бек біу ект піу ТикЕ Анрорпе Тр обез тс Їїє Бек бек цез біп Ро
ІЗ то В во сі двр ває Віа твтотух тут Су бів О1іпоТук бек Бех Рпе Рхо ТрЕ 85 зо зе
ТЕ
«ій ав «их 97 «12» РЕТ «713» Ното варієл «й кі
Ави оті бЗіпоМеї тТргозЗій Бек обхо бе Вех пеи дек діа бек о уаії 01У 1 5 ї0 15 ввр вка уаї ТП ІЇ1е6 ТВк Сув аку 5із Яєх біп З1іу Ще Бех Авпотур 4) я за їз Аза Тур Тук зіп піп Був о Бко 013 Був Аза Бко Пцув бек ем Ії 35 зб а5 тут С1у він Вау Бегоїец сія Бек бу уві вто пек одхо Бра дех сіу
БЕ ЕД
Бек Зіу бек Зіу Тк АЗЯр ре ТВЖ бец тк хіє бе сЕх їй біб РЕ 85 п ль во сій дер о РНе Авіа Тв Тух Тух Сув сіп зій Ттук Бск век вНє Ко ТНК
ВЕ зо «ча
ТЕ
«тій» 455 «Ві 87 «512: РЕТ
«пАЗ» Ношо варієт «00» «58
Віа тїе бій їз ТВ бій беж Бго бек Бек пей бек Аіа Бех уві ЛУ ї 5 18 15 авродху Уаї тах хі ТК оСув Акч Аїа Шеї бів б1ім Іч1тТє дет АвпотІтр зо 5 Зо без овіа ткротек з) бій Був ко ЗіУу гув Аїа Ро був їец Це» ТІЄ 35 ай ак
Тук щу вія бек бек хе біб Бек сту Маї Вхо Бех Ага РНе веж СТУ
Зо 5 жа бек піу вех щу ТБЕ Авр о ррє ТЕ цей Її ої1е бек Бек ойєюз Зіп ори та. та чо біз бар Бе Аїд тре Туг Тух був Зіп шій Тух бе бек орБе рт тТБу в за За тТае «Ж18з 45 «тії 7 «ві2з ВКТ «йк13х Може парієть к«апо» ще вія Іі Зійсолвои тв Зіп Беє Рхо вет Вего Пе) дек діа бжт Уах біу яЯ В 10 15
Авройта Маі Тв о ліє Тир оСув Ака АТ бек З31п бі ї1з Бех Авй хХхр 26 25 0 ви Ара о теВотТук аз ОЇ пуд о ВБко СБУ пуб вів Бо Був цей йеч ї18
Зк 4 а
ТУукК бтіу Ата бек ек ем біп Бех біу Ма) вкособБек Ат не пек 01у ча 55 55
Бек спіу Бек б3іу ТИХ АБр рНЕ Тих Пез їТнх ї16 бек Бех цец ЗМ Рг
7 т во двробне Ата вне Тут Тух Сув Біл б1іп Тує бек БЕ Бе рто тБЕ я за зе тНЕ «МВЕйз а
ДЕ ОО
«ій ВЕ «пї32 Ното 5арієт «абз Сава
Ав Ме біцп Мей Тих зійп бек вБто бек Бех узі Бех діа бек Уві сі 4 5 ї0 15 внро.АТа уві ТЕ тів ТЕ Су Аа Аза бах Зіп 1у хїє Вег Ав Ткр хо З зо
Бен Аа то тує чіп біб Був Рко біу БУ Віа вхо був цем й 16 48 АБ тук З1у Аз бек бет ей біп Бет ЗТу у рес ет дед тва Бек біт 585. в о
Бех піу Вет ЗЕу тах АвБЮ орла тих рег тТпу Хіє Всковек Пес о оїп ра 70 тя, НІХ бі вер огняа Азїа Твк туї тук Сув Та біп о тух бек дех Ре срко Тих 85 що 5 тьЕг «ей 455 «вір 097 «712» КТ «й13з Ното варієт кад аБЕ
Вер о ів бзіб Меє Твї оЗіз Вер обо век Бек оМаф Бех віа Зек Уа су ї 5 160 15 двровхча Узі Ти ї18 Тв оСув Аху біз ет Ів Фу тї1е Вест АвпотТЕр
Р) 25 зо їєю Віа тр Тук віп іп Був вБко сту цув Аза рЕо Пушоігжа ем їЇїЇе 48. 45 тТух п1іу АТа дех беж пец Зі Бек о Фіу Маї Рко Бек Ат Бе бех Ту зо в'я Бо
Нек о біу Беї бЗіу лк Ар овце вс рей Тв о Хіє Вет ет їв Сів рко «Б та Б во січ дБрорве Аза ТБ Тут тух був біп зів тух док век оБНа Руо ТЕ на о За хе «Ш10б» 456 «віл
Ей» СЕКТ
«діл» Бото варіеп «К0бз че
Бер о т1є біл оспец ТНЕЖ о ЗІй бек ркЕосяек риє Сер) Бек Ата Бек чаї Щ1У ї В о КІ
АвровтЧч о Маї ТНК о гі стврЕ Су Акч ві ес біп сіїу ті Бек Авпотур й 25 30
Бей Алла о ткротух зіпосіп Ппув Ро біу Був АІа вто буз грец опцев о тіє
ЕКЗ 48 45
Тув 1у. Аії5 Зег бохо ївчш бій Бех б1у Уді Рхо Бест йуд Ре бек Зіу ее Б ви
Веї бпіу Зех сі лит Зі рРБеа тах цей Тпкої1 С Зек Шех Цез бі БКа е5 70 то ща січ Авр РБе дів Тр отух Тук о Сув стій біз тує ет БеЕ вце Ро тв 85 Зв 5 та
Ох 57 «811 85 «Вій СРЕТ «аї3» оте Бзрієт «400 457
Віа тів Ак Мехс тк бів бек Бко Бе Бех Бец бек діа Бех чаї щу ї в 10 15
АвБробку Уді ТпПх її тп сСув АкчЯ вла Векосіц Зіу хі Бетс дез ТХр 29 ие За їни й1а Ттр оту сіп сІп Був Бго- діа Був ліа реко Шу по Ве лів
Ах 45
Тук 5Зіу Аїз Бех Бех Бей сій Бек об1у ув) рхо Бек ВкЯ вав бех сіу а о хек біу Беж сі тТвК дво тух ТК цез Твг ї1іє бБет Беж їжа біз вВко
85 7а 75 во «о АвровБае слів Твж тус Тух був ій біт тує Бех Бех вве веб тат
І5 0 5 тих ет105- ЧА «вії» 85 «212 БЕТ «ві3З» сНото зарієт «8005. 458
Аза 11е дк Меє тиж Ої5 Бек Бхо бек Бек вне век Ата Бек ТЬК бІТу ї 5 10 І5
Авр дка ча) тк діє Так оСув Ака Аза бек сій бСіу 11е Беб Авп оТтр 30 їви Аза Ткр отук біп Зіп руш Рро сту Буз Азія рте Був одер Бей 1182
За що у тТуг піу Ата Яву Бех їм сія Зеу Яру чаї Рго бех дра руе БЕшУ Ц1х
З БО
Бех бЗ1іу бек біу ТЕ ВБроРав тВи отец Тк тів бет Сув це бЗіп Зх
БУ 70 7» 80 ща Аво Рпе Аза Тв Тує Тук Сув бів ЗіпоТує Бех бек РБе жо ТЕ -5 Зо 85 тп «10» а кіз 97 «кві» РТ «813» ото зарієй «АП 55 чаї Іїє тер оМек тих сів Бек Бо дех Пец цем бек аза бек тах оду 1 Б Ів 18
Авробкч Уа) ТСН їі бек був о дку вія бек біп З3іу Хіе беу ДегоТер за Ж зо їх: Аїа Тер Тут піп З1ійп цЦув рРго (у був Аза РКО Зій це Бем їїе 20 4і5 тут аку Віа дег Вех жи Зі бек с1іу Маї рто бек Ах Бле бек з1у а 55 БО шви ЗІіу Векооіу тик Аяр Рке тк ре Так оті беї Сув їси: м бог «5 7 75 во
ЗІ АБрОвББе діа ТЯ Тук тую сСув сій біп тує бБетг Бек рпо орто ТЕ
ЗЕ во 5
СТвЕ «ВІЙ» аб «жх1хх 7 «п1йв СРЕТ дн1і3» Ношо БОЮ «айй2 чо
Віа 116 ЗІ Ме Тнг осів бегоБко бек Бех дей Бек Аза бек уа1 01уУ ї із 10 5
Ав оАгу Ммаї Тит Іїе ТЕ Суз Аку о АТа бек Зіп пу І18 Еек АБИ ТІВ па Зі 30 еп вів тер оту сіп біб муБ Бсаз Зіу цув вла Бро мув їец речо ї Те 35 Ай 45
Тух Ху біда бек бек їец біп Бек 1у Ха1і Кро Зв» Ак Рпе Бек О1У 5
Зек сі Бек піу ТИ АБО БВПс ТВ ка БЕ 116 Бек Бех зи ій Бр в п: т 85 піч Авроріе Аза Тіх Тут тух був Зіп сію тТух Явт бек оце ро Ту 85 Зо ак
ТЕ
«хо» аа «1їз 97 «йї2з ВЕТ «уз» Помо варієн «400: 451 дер тів бій мес трх бій бек РКО бек Тв ей Бех діа дех уаї БІіу 1 Б 10 і. вроду уві Тих її ТЕ Сув вк Аїа 5ес віпосіу ї1с бек вва отТІД га 25 за їви віза Ттр о тує біз бвійсбуяє РЕБ б3іу Був Ата рго Був бе) тец зе зв ЕН до
Тух в1у Аіїа щех бах цеч ОТ Бек зіу уві Бу ех оджяа Блез век б1у зо 85 5О
Зшкопіу Чек злу тах Зі вве тнг сеш ТНК ї1сє бек Бек обєм біп Бо
КК та 75 да вБЕ Ар о ВНе діа ТВ Тук тую Сув Піо біл Тукобех Бех ре орка ХК 85 зо з
ТЕ
«іп» а «к1132» 11 «Пій» ВИТ «21325 Номо варієїх «йо» Абе
Тер у бів віу ТК Мел очах» тв чаї Бех Бех 1 5 їй «їй» є кихї» 1 «вій вит «аХЗ» Мото варієїдй «ой 63 тер іу вка біу тцЕж цео ві тах оуві Бех ввю ї 5 10 «230» аб «її» 31 «ій» РЕТ «813» Ното варієй «400» 464
ТЕ піу біз Біу тк Меб Уваї Ту Ууді Єву Бех ї 5 16 «иї0з 465 «вії» 11 «8ХУ» РТ -2ї1З» Нойо варієд «30» яи5
Тгрос1у ЗіІп сфу Тв оїє) Маз Тік ма1ї Чек Бек 1 5 10 «ВІ ав
«їз 11 яиїйз СЕТ «213» Ното варієй кап» 4565 три щу. біп шіу тк Гай уа1ї те Уаї Зех Бек ї 5 10 «2І10з аб «йіїз 13у «2125 ЕЕТ «Т15» Ношо варієй «або» 46
ТтооЗіу сій біу Тих Тс ув) Твс ува Беж Бех 1 5 10 «210» 468 «йї 1) евіть Вт «213» Бото варієп «або ав бог
Те Зіу біл Су Ток Пув увх бім І31е Був 1 їх 10 «81. дае я2її5 16 «дій» РЕ «13» Ношо варієй «400» ап внє зіу сії ЗІ тах був печ бЗіц тІїе ву ї 5 То «ие Вл «ик 10 «ші» ВЕК «8Ії13» Нопо вавієй «з АТО вве сіу вхо З1у тах бБув'Маї Аз ої1е пу ї 5 15 «Еїійж алі «із 10
6ОоЗ
«212» ВНТ «візу Ношо взріенї «ой 471
Рре бі сту бу тих був о пяії с1й о ї1є уз 1 5 15 «І» 47? «2115 10 «ій БИТ «213» «Цото вдрауєю «аб0О0» 473
Ре 5Іу б1в ОБУ Те ВгЯ Тем біш тіе Бу ї 5 30 «жо» 473 «йіїз 117 «8125 РЕТ «Ві3З» Ноту варлєв «аб» ОЗ слі. Уа1і біпоїцей Ууаї бій Чек обіу ЩУу с1у ем Уаї Був, РЕс ЗіУ Ву
4 В 15 158
Зак реп Ак Пец веї Сув Аїа Віа Бех сіу РНе тр вне Беж век Тук 79 25 Зо вх Ме бех Тр уві вла Бій Вів рго с1у Був ошіу Без сі) Тер чаї 8 45 5 ту чаї тат сСіу Аїа щі піУу Ах дес тих Тує тук БгО Авробет узі
Бо в 5 ув сту дк рце Тв тІ1іесбекодго ар Авр бек Був Аа Тих Пед тТук с 7 те но
Без сів Меб дяп Чек оїєц Вуз ТНг 41) Авротвк Аза уаїі Тукотук Сув 85 зо з5 тс отит отТко біУу Авр бі» сіу ве вер ої1є Ткробку сі ЗіУ Зах оре ї6й їо5 110
Уві твВж Уа! Бех ех
«ві» 575 «Еїь 11 «из ТЕТ «віз» Ноше ввріво «00» 474 с і» уаї зЗій пез хаБ озів бек оспіу 2С1у Зіу їз Чаї пу рго Зїу біу. х 5 15 15
Зве орет) Абу беб; бет СувоАтжа Ата Бе Сьу Рпє ТЕ опе Бех век Тук 28 85 30 та мес бех тЕв уаї вВхч зуп діа ро спіу Був сім реч бій бо Уві
ЗЕ 0 45 31у хаї Так сі Аїа уві Зіу Агу Беж о ТБт Тук о Тух БхО Авробех Уаї
Во 55 50 пув'зіу Ажя во отв: 318 5 Агу Авродвр чек рук Ави ТЕО Бец тує 79 ЗЕ во їви 15 ОМеЄ Ал бек оцей Був Тдт ід дер оТйх Аза Мах ТУЮ рух сСув ве 8 25 тТиЕОТВах Тер осіу Авробзій б3іу ре АБр ОХІієЄ Туру Зіпосіу пу Мет во 105 що чаї тру Уаї Бек щеї іїх5 ей ЗК «811» ї17 «ВУ ОБЕТ «21325 Ножо зарієр «або 475 ств Маї піпорвиа уді біз дах пі б1у у їси узі був хо Ху З1у ї 5 їв нич бек хец Ак їм бех Сув Ата Вів Бек ху ре тпє рРпе Бекодех тук 2 р Зо діа Мек БетсоТтр ах Ат Сіп Аза руб біу був о бфу Без біЯ тер Уаї
Зк а 25 бЗіусА1а ліє АБ Бех піп ЗіМ був бат ТНК тТух тТух дія Ав» Бех Уві «а 5 ей
Бу с Зіу Аху Рпе Тих Ії5 Бек дж йвр Ав; одек ув да Тл Тез тує ат та ТІ» во
Тез Ст оМеб дви бек без дув Твх СТО АвроТНЕ Аїа Ууаї Тукотух сСув в5 зо за
ТВІ Твк тер с1іу Бврозуї ху ве дер їжте тТжтрос1у сій біу тНЕ Вей то їй їхо маї тн Уаї бексвех 115 «їй 376 «2Хї- 117 хд18з ОВТ
«8313» «Нотосварівй «ап Се сти Уві біп цей хаїі Збц обер піу чіу біу цецоуаії йув Бко Зіу 01у 1 5 ї0 ІВ
Яекг пей Вк ївй Бек Сув Аза Ал бек тіу РНе ТВк Ре бек Вех Тукг хо 25 Зо іа Меб БЕВх тхр уаї Ага зі ків ро ху був (Ту ж шіш ТтКроуваі з 4с 45 віу Аїй її вв оБек с1іпобіу пув беж тру Тук тух Аа Авробек Ча1
Був бі Ака вне чїйк їі Беї Аку АвроАвронек Був АеготНну бе» тує тя 75 ва рен сій сбес Аа пек цей Бу ТВХ Та о авр о Тре дів хі Тух ТУуК Су 85 о а
ТП тви ттробху Авросім біу РпЕ Аврої1ів Терору сів б1у лах МеЕ їм 105 175
Уві Уах хвісяет Бер;
Бе «під» 477 «тії» 1597 «тій» ОБКтТ «132 Ново варів к«апаз ау
Авр тХіє сіп Мет Таро обіп бек Бко Зек дек гео Зех вла Зекочмах іх 1 5 та 15
ДЕр Ах Маїс твт її ТЕ бує Ак діва Бех 430 біу тів бек Авп Тер за АІУ За їм Аза ТкроТук сій біп цув о рро ЗТу Був Аза Бко Був їеу Іжа 116
ЗЕ Си че тїук Ту Аіасбех Зех Бу Фі Чек бЗ1у чах Бго Вех Вюбя Вцпе Бек З1у.
по БЕ БО
Зег бпіу Беж пі тих Вер виє Тк тен ТБх Тіє бех Зеж пев біловто то ТЕ 0 сті: дБр опе сдіа ту Тук о Тук Суд бій бСіп тТук Бех бек о вре реє Тл 5 ЗО че таж Ве біу біб сіу твє Ццув уві біа тіє зу 199 105 «шій» 478 «ліз 107 «під» РЕТ «жі» Ноще варіств «00 яв
Аероїіїш З1п Ме Тв біз бек обро Зекодек Пез Вег вза бек баз С1У х 5 те 15
Азр о Аг сні ївВг о л1іє Трпжх був Дка Аїа Беї сів обу 1е бек АБО То 28 жо рей Аза тжр отут бсіп іп обу Ро пух Мув АтаоБга був пез цем ї4е 35 0 ЖЕ тух сіу віз ех Бек цей: бхупочек сім баї Бто Єшх вхо БЕ овву 01У ве я бек зіу беж с1у тТпх Авровпе їх се Тв тів бек бер Без бій вго 7о у во сі: АвровРпе Атаз отит Ту тую Сув біл ощЗій Тух Бех Бек вце рРто тТцх 85 а Зк
Тих Еце Зіу бію біу Ти оБув Ма1і Сто РІ був ї0о 15 «ЕТ0х 475 «тії» Ії07 «йЯ12з РКтТ «п1З» Мото зарієлй «пах 379
АвроІїЄ біп Меб тво 4312 Бех Сто Бех дек цем ех Аїа Бех аз б1у 1 В 10 15
Авр ота чмаїстних їіє тцкх Сув дгу Аза бек біпостіу т11е Яего дей ТЕР во Кк 35 їн о Аїв Ттротух Зіп бів Був вхо Зіу пуд уаї ВЖО Був Хей їеб тіє 3 що 45
Тух піу бід Бек дек цей бСіп Бек а1іу уві вхо его дуд рРБе Бех СІУ
БО ва БО ех сіу веж сіу Тв Ар овве ТУ Ппемз СПж 112 бек Вет Пез бій РІ
Е5 та ТЕ нс іс оАврозаї Аа ТВ ТукоТук Сув бій ЗіпоТує бек Бех Біе хо ТК «85 30 5 тнІ вве су біу сі тах вує узі сто тіє цу ї10па тО5
«310: дв «їз 1017 «21ійз РЕ «813» Зоо Варієй «00 450
АзвроІзе біп мес Бу біп обех Бо Бек Бе сеча о бех Аза Зет УВК Ту
Ії 5 зо 15
АБр о Аха Уві тп Іїв тні Су АКЧ о АТа сег бій сху І1Є Бех Авл о тІр го а 30 це» Аза ТЕр тує сіп бз1п о пув ро бі пув о хМаі Бро бує Сем оїев; ті
ЗУ 19 й5 тут а1у Віа Зет Бек Мен піп бек б1у Ммаї Ро Бех йкя Ре бек ФУ 5 5 ет сп1ж бек о с1у лах Авр о вне Ту їй ТЕ оїіє Бех овВек пебз біп рко 65 за ра во
М; дер уді Бін тат Тух тТух Сувій З15 Тух беу ес вве рго тк 85 З а таж о вце іу сь Зіу Твхсмув Маї м; тів ув
НІ 105 «210 з. вві «во ТІ «іди РЕТ «13» Наше варів «30» 41 віз маї із сївий чУах ЗІ век бі а1їу Зіу Хез Уах рув БЕЗ бБіу с3У 1 т 10 ї5
Ззек Пец АхЗ їез Бех су Вів Аза Бех біу Рпє ТЕ ре Беж век ТЕ га за дів Мек бек Тр омаї АтаЯ бів Ара вхо сІ1Уу ув СіуУу Меп сім ТЕр Чаї
ЗВ 43 5 піу уві пе бу Аів хаї Су Аго век УНЕ Чух Тук Ро Авробек Уаї
БІ 55 55. йуз П1у Акад оре ТК о тіє его Ага АБр оАвробех був АвпотВгорен тує 7 75 як
Тяц сій Мек Авп пек цец був Та сі дяр Тит дів Маі Тукотух Сув не чо 35 тн сотвк Теродіу Дер бід З1іу Ріє Авр ч1є Тур ошіу стіп біу ТНг Меб о 105 а чаї тре Ууах Бех век ув «510» 482 «вії» 107 «зі» ЕТ «2135 Ноше варівєв «40» сани
Варотіє піп Меє Так бів Зех Бко Вегойеє Бен Бех Аїа Вех чаї Зіу ї є 10 х5 авв о АКЯ Чаї тп їїе ТпЕ Су ака вза век зви ЗВУ сіесбек ВБО тур 29 85 360 те діа Хо тух вій З1іп пув о рко сі1у Був о А1а вже був 'АКЯ Мей тів
ЗЕ «и 55
Тук 5іу Аїа бег Чех Лем Чи бек біу Маї Рго бет вра Рпе Бех піу во а 0
Зет бі бет Сі тв ст рре так оре тТвх Тіе Век Бех о Беи с1к РКО ек 7о їв ва
ЗБо АвБроБпе дів ТвВж тух Тукю ПСув 1 бір Тух бБеє Бек Бе Бк ти як й 5 "ТЕ РН О1у БІУ ЗІіу тп Був уаї бій 315 Бук їбо х05 «гі 483 «2115 ЛлІ7
«212 ВИТ «213 Нежщо варієй «ап» ана сів Уві біз пе оуаї бі овек о бпіу біу сіу уві Маї Зіп Ркесу ве ї й хе ї5 чак оцей АхУу ГПоо Бек Сув діз Аїа Бек оЗіу ве тих р Бех чек тух ах ЕВ з авіа Мак Зшу Тжр Уя1 Ажха бі Аза Вко сіу був обТу ем Сіпсоттр уві
Ух Ся 5 -віз уаї тну с51у Віа ма? 3 Вхч бек о тВІ туї Ту орко АвроБек ах
НІ Б о їув ЗТу аку ре Тіт ї1е Бех Акад ввр о Авпобех був дя Тпуоїеп тук
БЕ КЕ В во їжу біп Меб о ЗвпоВежт їж ВЕЧ Аа сли дер отвЕ дів Уаї тукотук су з 20 З вкіа Був'тжр піу Агр осі Ф1у Рпе йво Ії Тур Біу біп шіу тв пей ав що 310 чаї тик Уа Бех бвт
Б
«Вій» ах «Вії» СВО? «пий ВИТ -513» Вото варієп «пз 45
Авр гіє Зіп о Мес тину стд век ро чек Бех цец о бех А13 Бех умі б1у 1 8 9 Ех дар вхо МІ) Тпж їїз тих Сук Ага Аза Зех бів Б51у 16 бекоАвої ТЕр
І6 25 зо
ГЕ. А1а ТЕробНе шМі сіті Буш юхо біу бує А1а бо цув о век ем ї11е аб ія стук сту Аїа бек Бех цей Зіп бак Оу Уаі Рго бех Агу Бе бах З1у во
Зек сіу Век сіу Тк дер рБе Ту Пец ТТН Ії1есбех бек пецосіп ро 55 7 75 ко бік дер оре діа ть тух тук Сувоб)іт бів о тТух бек Вест Ре орга ТЕБЕ не ча з5 тПЕОЕВе Ссіу зій щу тп опув о печ Зім тів Був 109 5 «4» аВ5 кгїїз 117 «12» РЕТ ха1їі5» Ното нарієвп. «-55305з Зах
Зіпоуаї бій єп суві Сід бек сіу Біу ту Уві Уаї б)1п вхо біу Вха 1 Б 10 К- вск обей вкЯ Пер Єв Сув Аїа Віз Бек бі Рпе Так рош бек Бек туї зо хв ЗО
Аїа мекв Бек отТЕр оМаї Ага Сів Аза Бхо Ту іл віх їм біз Тгор Уаї ах 40 45 дів мМаї ХВк бі Аза маї піу Аку бек ТЬх тус Тук БкО Ар Бек Уві 0 ав во уз З1фу Ах ре Тв Х1е бет дЗго Авр АБИ Яег Тув Внл Так оце Тух
Я Ще ща
Пен біп Меб дви бек без дк Азїа біз Авр о Твх Аза Уаї тукотух Суб 85 50 55
Аза пує ТЕрОП1У бер Чіа біУу пе АБО Ті Тхр біу Аку Сїу ТИЖ Те 109 155 о чаї тцк Маї бек бек хі5 кий» ан б21
«жів 107 «2125 БЕЖ «513». Немо варів «пп» ав зворотів бу Меє ТЬж обід зеє Вес озек бек Гейсдех Вів бексоуаь Ту х 5 10 ї5
АвроАХха чаї тво ї1е Тпх Сук Ах Ата Бех бій ім ті Бек два Тер 2 ав за їв Віа ткр Пе Піп бів дув бюс біу Був АТа Бо ув опех пев тіє 35 16 45 тТукх З1іу діа Бех Бех бем біп Бех біу Уаї рРго бек Аку Бе Зег Б1у ав Бо чек Зі еко біу Тис о АБЕ Ре тах ряй Так їТїє Бак оШек це) піп РО 5 то 75 80
Зі» вАвр Бе Віа Тит отук Тук Сує бій Зі бук Вед Бек рпє Его Тигр 85 зо За тик оБпеобіу З сту тв опув о сїез ім Діє пу 105 іп «ЖІ1О» ав «11 117 «2» ВН «8ї3х Ново варі кад» аву и хаї іп об-ч Ма) 3) Бек шу сі іу аю тах ака ро сту оіуУ ії З то 15 век їй дка ши Бер оСув діа ліз Бек бСіу рРпе ТЕ РБе Зех Бвг тТух 20 25 зо
Аіїа МЕС обеї ТІр чаї дз біп діасько зу Був Зту ей обій їхр таї 35 8 а бек йіа ле вАки Бет Ів Зі пуб бек Тпх Тух тТух діа АвроЗех ха ще во муз біт Ата Ре ТТ хів веж Ату АвродДету Ата о Гпув Аве Бек сцен Тух 5. то та о пед о) Ме одей дек оцей Ач Ада оїй Авротіх АТя ем тую нів Сув ях за зе діва Ах ТЕр 3у вврос1 0іу вне Аавротів: тгрозіу піп СІУ ТАБ Бе 100 тав 11
Ууаї Так Чаї: Бех бвЕ ще «віх зви «лі» 07 «бур» БЕТ «13» Ното варієт «00» «88
АВрР.Іїв Зід Мем отве чі Бех овео пек Бех рей Беж діа Бек о Ууву піу 1 5 19 і5 дер Ака уаї тт б3)е Тву Сув дга діа Бек обівп с3іу Хзя ех АБ ткр хо за за їжа Віа ТЕр тую Бій Ч10 був Во біс ув діа Бко Був беж цей Іїе зб 5 тук ім дід БЕЖ бек їй бій дет ху уаї вгосбеЖ дКЯ РЦе Бах су о Б о зак сшуу Бех ЗіУ Тйх авр оце тпжх ей таЕ ліє его бек па Зір вто ях п 75 зо
Зі Аво рпе дія Те отук тую Сув сій З1а ТУук Веїг бек Вце вЕс ВЕ ве а -5
ТБк ові Шіу вто О1іу ТБх Був Уаї Акрот1е Гуд зо 195 «т10» 483 «-8ії» 117 «Бій» БНТ «ХХ сНохв варієй
«300 ВО сій ма1і сів пев омеї бій бек о сіу Біу Сіу уаї баї 5ідо ро сіу Акад ї 5 19 ІВ
Бак реп Ахз рес бек оСув А1а Віа бек СХу РНе тії БРБе бех бех Тух а 25 35
Атіа ме бех Ттромаії вка Зіп о вза ко шіу бук о с1у еп бій Ттр УТ з5 Ай 45 діа ві піс двп оБеУ -1ь біу пув'бех тТпЕ тує туї Аза АВОо веж Уда о вн 5О пук ху вх пе тихо ї18 бек Агзсавр дяй Бет пув дви отв їейт Тух то 5 во
Тен сїп Меє Авп Шах Без АхУ Аїа Зі Авроїбх Аза Уві Тут Тук сСув 85 59 5
Аха АЕС Тр обіУу АБросда бЗіу Рпе АБр о ї13е Тхр Яку вхя сб1уУ Тих Сей ке 105 ї10
Маї тних Уаі Бех Бек «аа» 450 «71їїз 107 каз ВБЕТ «ВІЗ» Ното зарісв «дух 450 дер хі біп Ме ТБу іп Бек оБхо Вех бах зем де вза ЗвгоУві піт х 5 10 15 дер Ага маї тик оті: Уцт Суб йк3 Дід Бек біп зву ХІ6 веї деп отр: що 5 За
Бей вала тр отух сіп біпопув бЕс Ім груз уд) Ржс мув о пецобеи зе
Зк 45 ЯЗ
Тут шщІу Аза веж Бех Меп сс бек біу уаї Вухо беж вх Рпе Бек сту зо ща бо
Бек сіу Ввпгозжу тТМт дер ре Тих Без тп хзє Зеї Бек реа Зіз РЕс 65 7о 75 о
Ми Авроуві Аза Тут тує Тук Сухе сій Зіп о Тут Бех Бек вне Рро ТЕ 85 зо ще тихо вре сту Яї» спіу Так обув Мах Ме Стів ув 1559 їп5 «и10з 481 «115 (117 «ах вит -213» Ноло вараієль «00 сані
Зіз о Уаї бів і-ши уаї біб бек біу сіу щіу уаї Уді біт бго зіу Аку ї 5 за ї5
Беж рей ду осв бек оСув Аза АТ век З1у Бпе ТІ БЦЕ бву бек тТух 79 х5 за вів МеЄ Чек Тур уггі дкч цілі діа Рко сі був сіу Без ста Тер уві зе 40 45
Аза сАта І1з зви Вєк сів З1іу бувовек пк Тукотух Ата йвБр Бек Уві ща 55 5о пув бі йху вце о тйс от1Є бЗесе АкЯ Авр о АВи бет опув Ав тах опец тує ве 70 І ш 50 йеп аіп Ме Ази» бек о пец Ах вла сі вер отит Віа Уві Тул тую Сув я за з5 діа Ак Тхкр П1іУу Авр Сто 01у Бе АвроЩ1е тв обіу сів 03у тв Меє 105 1То чЧві ТЕ Маф дек свак 115 «віх 457 «В Еів й «иїш ОРЕТ
«віз» нНОощо варієт «ДП» 892
Аво о ї15 Зп о Мес Та бів Вех рРто бБеї есе) ех діа Збут Уві ОІу 1 не) то 15
Авровкея тах тах тів тТцх Сув Аа вла Бех сі Зіу 11іе вех Авй ткр ях зо
Хец йіа ТквротТух біб бій Буш Бго ху Брук уаї Рес Пув тез Бей Її за 45 су.
Тук 51» АТа Ясет бек пев» сій Бех о біу чаї рко йеє Аку вне пек о сіу
Зо За 0
Бек п1у Бех Сіу тах Адяр Біе Тк їй тп отіє якх вет пе біп ско з 73 75 Б зЗіч Ар уаі діа ТИХ Тух Тут Сув біп біп Тух бес Бех Ре орко тих 85 Ти а5
Тіт рБе о1у бід зіу ТЕЖ Був рем бл міе сук 190 ї55 «РО ЯЗ жах 4 «Пій» РЕТ «3135 НоОпиа варзєтй «ий х -З8Ж2 тівс геврикв «йййт 3), «РІЗ» Хах позначає каркасну ділянку, що скЕнадаєшвси в будьолких 30 амівакислот «о ««В2ї» щівс театьє сс І Я ШЕ ШО «хв» ав позначає каркасну ділянку, Ще складаєтеся а будь-яких Їж амінскислоех «а «83 щівс бейабике «вай ВІ... и5 «203» Хав позначає каркасну ділянку, во Складається з будь-яких Зо амінокислот «шу». «їз стівс їеахохе «пий» їа8),.134) чииам Кай позначає каркосну духянку, що пепадаєтнля З будк-яких ЗІ амікокиплот «А» 493
ЖХеа бек Туш Вів Меб Бек Хаз Віа Іі ви век Я1п о сСіу ув це тТнЕ 1 5 тб 15
Тут ТУк Аія Вер Бех У) був Я1У Хай тур о с1уУ Аврости Ту ввеодар хів Зва «МїО2 454 «вимі» Зі -18» БЕ «13 Ното верісл «и шах» тінс беакює «аввж 31... (1 «223» Хаа пузначтає каркасу ділянку. цт Складається в будь-яких 23 аиїнокислах «З20» «й2)х шівс Жеакчке «ВВ (13... (131 «83» Каз позначає каркасну ділянку, ще складаєтеси зв будиекхих Їх вмуінокислиат «ВЕ
«азї» тпівс севтиата «282» ї21)..(215 тот» Жав позвачає каркасну щі панку, що складається З будь-який зи амінокистлох «Ей «ав» жідс Бейбухе вв ізіф.: 21) «ИийЗ» жав. позначає каркасну давянжу, Ще складається з бБукрь:яких 15 вмінскмодот «йпб» 84
Хаа Акта Аза бек іп о бту тіе ВБт Авпоттроїжи діа Хаз Зі Вій дВЕ 1 5 10 15 ех ев ст Бех Хва спіп Зіп тує бак бек рце РКО тТПх ТНЕ Хай о 25 30

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
    1. Виділене антитіло для застосування при лікуванні раку, опосередкованого залежним від ліганду НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганду шляхом трансдукції сигналу, що містить послідовність, вибрану з групи, яка складається із: (а) гіперваріабельної області важкого ланцюга СОК/І, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 38; гіперваріабельної області важкого ланцюга СОК2, послідовність якої представлена в ЗЕБЕО ІО МО: 39; гіперваріабельної області важкого ланцюга СОКЗ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 40; гіперваріабельної області легкого ланцюга СОМ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 41; гіперваріабельної області легкого ланцюга СОК2, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 42; і гіперваріабельної області легкого ланцюга СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 43. (б) гіперваріабельної області важкого ланцюга СОКІ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 128; СОК2, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 129; СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 130; і гіперваріабельної області легкого ланцюга СОМ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮО МО: 131; СОК2, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 132; і СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 133; (в) гіперваріабельної області важкого ланцюга СОКІ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 146; СОК2, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮО МО: 147; СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 148; і гіперваріабельної області легкого ланцюга СОК'І, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮО МО: 149; СОК2, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 150; ії СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 151; (г) гіперваріабельної області важкого ланцюга СОКІ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 164; СОК2, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮО МО: 165; СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 166; і гіперваріабельної області легкого ланцюга СОМ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 167; СОК2, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 168; ії СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 169; Зо (г) гіперваріабельної області важкого ланцюга СОК'І, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 182; СОК2, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 183; СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 184; і гіперваріабельної області легкого ланцюга СОМ, послідовність якої представлена в 5ЕО І МО: 185; СОК2, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 186; і СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 187; (д) гіперваріабельної області важкого ланцюга СОМ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 200; СОК2, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮО МО: 201; СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІО МО: 202; і гіперваріабельної області легкого ланцюга СОК'І, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮО МО: 203; СОК2, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 204; і СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 205; (є) гіперваріабельної області важкого ланцюга СОКІ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 218; СОК2, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮО МО: 219; СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 220; і гіперваріабельної області легкого ланцюга СОМ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 221; СОК2, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 222; і СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮО МО: 223; (є) гіперваріабельної області важкого ланцюга СОКІ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 236; СОК2, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 237; СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 238; і гіперваріабельної області легкого ланцюга СОМ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮО МО: 239; СОК2, послідовність якої представлена в ЗЕО ІО МО: 240; і СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 241; (ж) гіперваріабельної області важкого ланцюга СОКТІ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 254; СОК2, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮО МО: 255; СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 256; і гіперваріабельної області легкого ланцюга СОМ, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮО МО: 257; СОК2, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮ МО: 258; і СОКЗ, послідовність якої представлена в ЗЕО ІЮО МО: 259.
    2. Виділене антитіло для застосування при лікуванні раку, опосередкованого залежним від ліганду НЕКЗ шляхом трансдукції сигналу або незалежним від ліганду шляхом трансдукції сигналу, що містить послідовність, вибрану з групи, яка складається із: (а) послідовності варіабельної області важкого ланцюга (МН), представленої в 5ЕО ІЮ МО: 51, та послідовності варіабельної області легкого ланцюга (М), представленої в 5ХЕО ІЮ МО: 50; (б) МН, представленої в ЗЕО ІЮ МО: 141, та МІ, представленої в ЗЕО ІЮО МО: 140; Ко) (в) МН, представленої в 5ЕО ІЮ МО: 159, та МІ, представленої в 5ЕО ІЮО МО: 158; (г) МН, представленої в ЗЕО ІЮ МО: 177, та МІ, представленої в 5ЕО ІЮО МО: 176; (г) МН, представленої в 5ЕО ІЮО МО: 195, та МІ, представленої в ЗЕО ІЮО МО: 194; (д) МН, представленої в 5ЕО ІО МО: 213, та МІ, представленої в ЗЕО ІЮО МО: 212; (є) МН, представленої в 5ЕО ІЮ МО: 231, та МІ, представленої в 5ЕО ІЮО МО: 230; (є) МН, представленої в ЗЕО ІО МО: 249, та МІ,, представленої в ЗЕО ІЮ МО: 248; та (ж) МН, представленої в 5ЕО ІЮ МО: 267, та МІ, представленої в 5ЕО ІЮ МО: 266.
    3. Виділене антитіло за будь-яким з пп. 1-2, де антитіло зв'язується з НЕКЗ-рецептором, який перебуває в неактивному стані.
    4. Виділене антитіло за будь-яким з пп. 1-2, де антитіло стабілізує НЕКЗ-рецептор у неактивному стані.
    5. Виділене антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, де антитіло вибране з групи, що включає моноклональне антитіло, химерне антитіло, гуманізоване антитіло і синтетичне антитіло.
    6. Виділене антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, де антитіло блокує як залежну від ліганду, так і незалежну від ліганду трансдукцію сигналу НЕКЗ.
    7. Виділене антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, де антитіло блокує залежну від ліганду трансдукцію сигналу НЕКЗ та де ліганд НЕКЗ вибраний з групи, що включає нейрегулін 1 (МКО), нейрегулін 2, бетацелюлін, гепаринзв'язувальний епідермальний фактор росту і епірегулін.
    8. Виділене антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, де антитіло стабілізує НЕКЗ-рецептор у неактивному стані, у результаті чого НЕКЗ-рецептор не димеризується з НЕК2-рецептором з утворенням білкового комплексу НЕК2-НЕВЗ.
    тав: і Людський Нокз | тео НекЗ мавли пинохмолкус 1
    Ук. лов х я Н мк як Інк Тон Те жо Гера ТМ В лакю яко Атетм ПЕ олаеюю 00 Ле ЗНМ нонко о, ідо ко У апо|: Т Котлям М дю «5 Кохавм - ї На Шо ї ІЩОяоб; х їй сі Н щ жд) іч Тож , вже -. пе че І тини ник ми | ни ни ек ооо Я ЗО БК стен --ННОСУЛОН У (ЯМУ сон ї яю. я, Митжачий Негу | мо ІПерячий Чех іш ; хе Том зна зво: х Ат ій ІОН Тв хажю ЗА ам Е Бе Еатіннх т 13 та - ІА е 15ИМ. шої ск І пого зх о КЕ лосоюі- ї ук Но мвен; ВАННИ Е Б кові. Кам ів віхю. - Кка- Мам ку Бл Н я й хо у. і мб я вх . й | В з гегралажнь шк що. ги У 1 те чоххю кінц. мінлячого Не ву ллняк юНо, еряного Бе (ПМ ФіБ1
    БАС: титрування ЯК-АВНУЗ що з о МОВОВВо ї ві з в а МОВОВВгА ; ; к МОоВнОбво Б яюе У ко з» р ; - Е Е здо , 7 о.0і вл Н й т ка кцензвація нм
    Фи.2
    Домен зв'язування НЕКЗ. (за ланими БІБ А) з 1 ія
    20. і ї В ї яю Е ї й це 2 щу ї Ж. ій оя і і й МИ
    7. В і й й ци -- в. ї й НИ Е ; ї й ВИ 1 З ! й ЦИ Ії і. І 5! ще і ї І: 254 | г Й й ще г: Ен В Я МИ х Н ІК Я М ПИКА НЯ дю она Іа пот жатизхЕвВнтдЕиатЖЕВт еЕШЕнА ке МЕ ВН ШРИ Єснетететесннй Мн одіннннннннн ааааоавінннний" нні 09823 дов25 807 165 ВР;
    Фнг. З зо ВЮМОЦЕМС ВОТІВСЬБУТ ООБНоєОЬ УКРУТАКИМУ МОНІХТОЮтВ ВМАрЕБНТОМ ІБР ЕУя АИМЕКЕТ ба живу. УХОСКЕАГЕУ міміка льБоЕавТОЬ ХБІБІСсУХІ шКкМоКБсКМО УЛОМИСІМРО ВоАхІсуКАМ і8б ЗРБСВРСНЕМ ККОрСОСгО5 ЕПОДСІТКТ: САРОСКОНсВ БоНеноОсль Беляссзбе ПТОЄРАЄВІ МОЕБАСУЄНЕ 2БО МУ МИКІ КОМКЛМУТК ОХОБИСоВЕ ПоМНУУУ Оу ВОУедсовск МеМОКАсИКМ Суросовски АСМВУВЗОхя заст прийвнір ЗУКЕОКиє КібБріготк сбениТМ. БЕЕКІНЧЕВІ УЗЕІТеНІВІ двіженкіки Метою «37 ЗУСІМНОЄКВ лиднянцу дісвкУникКу дасміхізаМ шення. Е яефснкох; шлірікникг КЕЛСУлЛЕоКУ БОБ срнвеюех фовостокі: СОДУНКчя УУпсеКАМиг ЗМЕТАПЕАЮЄ ЗУСИРУЄСОМ, ДеУСАРОМСВЬ Зотеврелих вус проносу вет УПАК: 1УКУРУУще СХРОН ОсАФРУЦове бою; ЗЕМОКВ Фіг ЗА Зміна ступеня дейтеризації «ЛЮ (НЕВЗ:Бабві у порівнянніз НЕКЗ релі сКТЕТ Ккт Кт КРікЕ КЕ де і сосні ін ун м повні нів ніневк ої сті тсоводетія ідею ЧК днк о наст Кано с тет Кен оч ТЕН піц іпідіея т ковтком іній сю чек кі о воітінк сПнке баку не Ніні кю піснею ние аю тече діння тре Я Е Н : 1 КЕ 1 З. і і : К | Е Н Я хі 4 Н ї о ПАНІ Май Їм. Й ПИЛИ Н Е . З рах ЩЕ Я Ж х Е я НЕ Н ою Іл шо і й що В Не чи Ер шен ква ку іх ня я кл ї їй і Її
    Н я. ще м 5 руш х : ІЗ ве . Й Й 35 Н АГ Аа я 5» ке о М щи "ще я В еВ і шик ва ж і з ой а в й І ШЕ нан В ен и М х і; До МК Айк м ом ей ен й Зк Не Я Я : НЯ : 1 ща «днк т нн рент ктнті уні тня не і Кук пані нкіненнн ний нею кінні ги пвоне еінікяосКі ниж ненька ккост р Др Всю пік ноіункінентичеткінебаноіюі іонів і інвес меінтемі жін і ї і ще з 05835 Н Н і г і і Н В Зх 1 Н : З Ві 80987 Н Ас Ве нн нн нн нн нн в: М в п в В В В ВВ ЗИ, і і : т я ВІ Н ; і і І і сн нн с і ї : і Я : Ї : : :
    Фіг. 45 р Фі Поверхня позілу ПОЛЯ я КО, б ян я ев в. па а в на о о кі й х не р ших рик» пом Що й ше та р2 ФУ п м В. т ї т В сл ак шкі ре вв я оз Нивки ча й р «БО со ї ще ді -Я Її. Кий но рес ї Ї СУЯ ев: ях її ь їх м
    Фіг. 48
    03 с: ЩЕ ше що о о пон ко в М дк я ом ; дея» и ДА а За ОВКУ а й кий нини я и Ко ОК де и ши а о ше НН ин ши нн Бо хи хо хх он иа що кх па 7 МУ В Кс, Бо
    ОО. ле ж уж СК ую ши З у Ям у НЕКЗ Ра МОКО9823 ие .АЮЗ Бе; Ва»; - ее й а шо в Фон Ба Жив в: ЩЕ і: 3 сеедех на ; Бе. ріже ю «ем вн ОВ НН а м «ие коня рі род кан и ши а сн б ьо є Баб МОКО9825 в о ФІЗА
    4. дБ оз і 0 ще й в ЩЕ ЕЕ ях . ПА ев ЕВ) д де Ти щі ах. шо й шо Б ВьК шо в. ее ой я іх ше кох м ою рі й шЖон ее в ен, По а 5 кош: В дв а 8 и я р ах са АЙ Коко йо
    Фіг. ЗБ б я У
    Ре. С ваь мМОКоОово3 . ток, у ак З З з, Б (о В ч аз Ж» Зк п еф ша «ат З с, х Ки й їс ра | Кок ди її дея а я Ме дат з ре я що Ки 571 Веб я й С Не лиса о я ро р3 ра Да» нів сви Ка со жк 5 в «й изд і и Я зей ко а о у Ко оо с дани КАК ще ев екв 59 ре р Б Я я. ж нн З В ї З яд и на дих йно мохи в АВМ шо Я ос йцв 267 Гуз ел «Жде ВСує 1 р ії и У ст В 2 До АБО ее ель еще віедакчеея ; ле) Як САНИ іш маш я дання, йог ех і яд їй вне дина сб) ОО нт ! вх «оби вна Фіг 5Г ук: шо ши й Дю ай и ЖНня щі я й
    Зв'язування МОКІТО7О3 з НЕКЗ пдв. Й ад й ж. дикий тп я . КА АОГТОБ5ВА 02 ЩО КОБТАДОВВА пай тез пох т ба -- тенден -12 1 -16 «Я -8 Я концентрація антитіла М) Фіг, ЗД
    Фіг. бА Інгібування фосформлювання ПЕК я стимульованик клітивах отв МК? 40068. х у помоКооа» мож ж я МОНОбН « ОТ ж ж мМОБпоВоВ З х я МОВІ? БОдо. х -- кр Ж в Бе в к хв в шк то М
    Фіг. 66 Інсібування фосфорилювання НЕКО в стимулюбвавих клітинах лінії ЗКАНІ й "п е моОоБобБоВ Зо а МОНОЗВ в й х мораавук вдо ве щ МОБОУЮ? Ки шк я Я а проод ; : Бу зима аиснннм зви вв 951 3 о ям
    «ФігоО7тА іннібування фосфорнлювання ЖІ В клупанах лін ЗВ во х е і З т й жи і ' ї: мОБОчягВ лк МОБОЗВ Гак х м моноввов доойке х а МОВЗ207 з ; ; вл о З че ям
    Фіг. 7 ВАК) в клітинах лінії ВТ-Я7і 2000 їх я т г хо 1500 я г у
    5. 10065 сок ща І (25 нн Я я ем ше Ме СУБОМ воно Троя МУ чо 2» Сн СЯ КО НН Ки У я є ВЕ М М З я фіг. ВА Прозіферашя клітин ліні ВТАЖКТЯ засо Е ЗОюю г В «жо - БА КЗ со Ж се БОМ Ша БЯ Е ж шо ши
    І и. Е сш ши 7 7')Г1 ви ем ре ем ре Ж п- АБИ ЕХ КМ. Б Я Я я Р а а и У «ее ее
    Фіг. 85 інпуційозвана МЕ проліферація клізинолінії МСЕ твою: "509. - й "ж Бор
    Б. ді збі ! З тож | | , Бика. т 4 Б ша
    «. - в ня : й ше Шк Її Її х
    Блокування зв'язування МИСТ? з лігандом зо й ї ст. сс без НВО б ш 200 бож шо Бе ж МОКО9823 Б 5 З 5 МмОКОов2х 55 7 Ф МАТАВІ ВЕ 00 у -- А 4 «10 в - ї канцентрація внтитілда (Му фіг. 9 Аваліз впливу на зв'язування МЕСУНЕКЗ 491 09823 105 Іва Ж -- За ти до-Н ков. й т й Е ГО ете ї а НВКЧНАЄ п Мая 0 НБН її" | КУН 5 1 ЗЕ Б ой МА неи- МКК ВЕБ ! -і0 (М) «Вір. 10
    Я А фіг. НЕ Оброблені МОМКОЧІЗ с)броблені МОВОЮ» З ксенотрансязантати НІ474 ксезотрансплантати ВХРОЗ вНЕКЗ ТЯ с РНК ВхРОЗ -у ОО Го ш е 26205 Е- Як х ря отв дома | Е "Щі : Ж 1000 Ж 7 я З й 8 4 5 в пастися вжеденив лоза Ух) частісля зведення лото. рак ВТЯ74 РАК ВХРЄЗ 150000. Що Зою 5 зов Во човрої « В в х боб. с я
    В. Ко лобо Я Ж нюве В . | за й 5 г. 1 й що 5 час після яхеленнх лизи сто часлестя введення дозн (пол) во Крива посту пухливи ліНІЕ втата мая С Ж н «во- і ш щ й з не :
    Фиг. 12А Е Е же то в-во ОВТ с 26 2 пре жрьаькиї ж о в В, 3 щей І) іі 20 а 50 дні після змилянтансії -ке ОТО мкг, у. Да
    «в. МОКІОТО1 0 мкг, ку. о Крива росту пухлини лінії ВТЯ 74 000 о 7во Фі: 126 Е ; 5 Бор 5 сни нн ше : я ке 250. їд щш ди ; За 37 44 дні після імплантьцї «фо ка як МОКІ0705420 мг/кг, ї-у:, 434)
    Криза посту пухлипи лінії НХРОЗ т ! ш т00 55 8 во --й - де за ЕЗ Жак і Сех ! Зо 40 лаві пня імплантації -е-івсі ге МОВІТО701, 20 мг/кг, Му., 42. -к- МОКТО7ОЗ, 20 мг/кг, 1., ЯЙ фіг. 13
    А Зк-ВеЗ г МОА-МВ-453 - пворишм и Хоок. ками що - вх ці Шок шк : ши : Ен - ча и й ха ? г КЕ З Я о г Їх т | пожоВлнтивнікть га ті пІанитивність 7 й ЕН і вч й Ек І 53 --- т т----т рр тут тири 0 влеа о ВКМ мкм 225 МОВОЮ (МКМ) ї КИ, Б шоп ВВ, МОА-МВ-453 ел! ї 7 Е 3 х , г щи Го сянтивність й о Я й НІ ще їх Я ох і Я БО : Б В Шия й - : ! сх жуалитивКість ВДЕ НН й ; 8 1 М Г - Бог вет ев ох плточакмі в МОВОоВІ3 (МЕМ д вУБлемЕМ) МОд-Ме-453: МОА-МВ-453 рано -о в --я іт
    881. | ! я і х ! ее: тоожеві сїк З і | 7 ж-аднтиввість ЕЕ 4: ху ткутнаниь 40000 же - І що - Ці яті Я шен ши. 5 5 44 я Б Ще нич а НЯ ср бен г р пет у нниннлвичч ВЕО3Х самі о КАТЮ ОМ «Фіг. 14
    Е - я сдллаівви і і ОЗ ебать З ря Еш ин В 7 е) ТИХ Ск, : пиття о пі Є МОК19703 (мкм 33 щ -ЕВА-- Ера гу В Е - у благ - / Год -апіитивність ІЙ 1 ш шк : З з я : Ж ве шен и й г. тт ерлозиміб (МКМ)
    фіг. 14 (продовження)
    Фіг БА Крнва росту пухли лінії 3474 во ща 1000 : от І-ї шаф й Ї ії й Ит щ : е ди БВ с я х о ш- і - ств: Ше ші и Нм інй ЗНЩЕЙ ї вав х Шк че «тло г; у аж Б ої в - Зо Я а то з у ва дні після імплантанії дні Й -е і ча б « МОВ10О7О1, 20 мікт, 92 за. трастузумає: її мг/кг, фах Зк трастузумаб 1 мейкг. їх. цех « МОВ107О3, 20 мис ода МОВО є трастхумай «. МОКІОВЗ » трастузумай трі. 15 Крина росту пухлини лінії 1.3.3 100 т наповнювач, ро; ді вч ЖЕ МОВО о межі З оо ЖЕ МОВІОТО3 ча Як й «й ерзатннів, З) муки, ро . Е де МОВІОТО3 в ерлотинів ; 8 800 Е 8 «0 - - о ; і шт 2 В р яке 5200 А джнн ЩЕ сти, . БАН ин 0 0 Б 10 1 вні після ввелення дози
UAA201214744A 2010-08-20 2011-08-22 Антитіло до рецептора епідермального фактора росту-3 (her3) UA114883C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37540810P 2010-08-20 2010-08-20
PCT/EP2011/064407 WO2012022814A1 (en) 2010-08-20 2011-08-22 Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA114883C2 true UA114883C2 (uk) 2017-08-28

Family

ID=44630597

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201214744A UA114883C2 (uk) 2010-08-20 2011-08-22 Антитіло до рецептора епідермального фактора росту-3 (her3)

Country Status (37)

Country Link
US (3) US8735551B2 (uk)
EP (1) EP2606070B1 (uk)
JP (4) JP6057896B2 (uk)
KR (1) KR102027011B1 (uk)
CN (2) CN105037552B (uk)
AU (1) AU2011290672B2 (uk)
BR (1) BR112013004012B1 (uk)
CA (1) CA2806637C (uk)
CL (2) CL2013000459A1 (uk)
CO (1) CO6680688A2 (uk)
CR (1) CR20130071A (uk)
CU (1) CU24094B1 (uk)
CY (1) CY1118761T1 (uk)
DK (1) DK2606070T3 (uk)
DO (1) DOP2013000044A (uk)
EA (1) EA036314B1 (uk)
ES (1) ES2620255T3 (uk)
GE (1) GEP201706605B (uk)
GT (1) GT201300046A (uk)
HR (1) HRP20170462T1 (uk)
HU (1) HUE031855T2 (uk)
IL (2) IL226712B (uk)
LT (1) LT2606070T (uk)
MA (1) MA34524B1 (uk)
ME (1) ME02637B (uk)
MX (1) MX2013002046A (uk)
MY (1) MY162825A (uk)
NI (1) NI201300023A (uk)
NZ (1) NZ607337A (uk)
PE (1) PE20140230A1 (uk)
PL (1) PL2606070T4 (uk)
PT (1) PT2606070T (uk)
RS (1) RS55930B1 (uk)
SG (1) SG187908A1 (uk)
SI (1) SI2606070T1 (uk)
UA (1) UA114883C2 (uk)
WO (1) WO2012022814A1 (uk)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ600262A (en) 2009-12-22 2013-06-28 Roche Glycart Ag Anti-her3 antibodies and uses thereof
MX2013002046A (es) * 2010-08-20 2013-04-03 Novartis Ag Anticuerpos para el receptor del factor de crecimiento epidermico 3 (her3).
DK2635604T3 (en) * 2010-11-01 2017-02-27 Symphogen As PAN-HER-ANTIBODY COMPOSITION
ITRM20100577A1 (it) * 2010-11-02 2012-05-03 Takis Srl Immunoterapia contro il recettore erbb-3
WO2012145507A2 (en) * 2011-04-19 2012-10-26 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Monospecific and bispecific anti-igf-1r and anti-erbb3 antibodies
AU2012274461A1 (en) * 2011-06-20 2014-01-16 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-erbB3 antibody
US9273143B2 (en) 2011-09-30 2016-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising a combination of an anti-ErbB3 antibody and an anti-EGFR antibody
CA2849508C (en) 2011-09-30 2020-12-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbb3 antibodies and uses thereof
GB2504139B (en) * 2012-07-20 2014-12-31 Argen X Bv Antibodies to highly conserved targets produced by the immunisation of Camelidae species
CA2855298A1 (en) * 2011-11-09 2013-05-16 The Uab Research Foundation Her3 antibodies and uses thereof
CN108424456B (zh) 2011-11-23 2022-04-26 医学免疫有限责任公司 特异于her3的结合分子及其用途
CA2857601A1 (en) * 2011-12-05 2013-06-13 Novartis Ag Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3) directed to domain ii of her3
ES2758433T3 (es) 2011-12-05 2020-05-05 Novartis Ag Anticuerpos contra el receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico (HER3)
EP2817335A1 (en) * 2012-02-22 2014-12-31 U3 Pharma GmbH Combination of hb-egf binding protein and egfr inhibitor
JP6339569B2 (ja) * 2012-08-21 2018-06-06 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． リスペリドンへの抗体及びその使用
WO2014066530A2 (en) * 2012-10-25 2014-05-01 Sorrento Therapeutics, Inc. ANTIGEN BINDING PROTEINS THAT BIND ErbB3
CA2884429A1 (en) * 2012-11-08 2014-05-15 Birgit Bossenmaier Anti-her3/her4 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3 and the beta-hairpin of her4
SG11201502538TA (en) 2012-11-08 2015-05-28 Hoffmann La Roche Her3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3
CN102993305B (zh) * 2012-11-16 2015-05-13 上海赛伦生物技术有限公司 人源抗人表皮生长因子受体抗体及其编码基因与应用
US9180185B2 (en) 2013-01-11 2015-11-10 Hoffman-La Roche Inc. Combination therapy of anti-HER3 antibodies
US20160228589A1 (en) * 2013-09-18 2016-08-11 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Methods and compositions for imaging disorders using polyspecific agents
US11305012B2 (en) 2013-09-24 2022-04-19 Medimmune, Llc Binding molecules specific for HER3 and uses thereof
EP3049442A4 (en) 2013-09-26 2017-06-28 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
WO2015066543A1 (en) * 2013-11-01 2015-05-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting her2 and her3 with bispecific antibodies in cancerous cells
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
SI3110849T1 (sl) 2014-02-28 2021-01-29 Merus N.V. Protitelo, ki veže ERBB-2 in ERBB-3
SG11201607109QA (en) 2014-02-28 2016-09-29 Merus Nv Antibodies that bind egfr and erbb3
SI3116909T1 (sl) 2014-03-14 2020-03-31 Novartis Ag Molekule protiteles na LAG-3 in njih uporaba
US10745490B2 (en) 2014-04-11 2020-08-18 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-ErbB antibodies and methods of use thereof
FR3020063A1 (fr) 2014-04-16 2015-10-23 Gamamabs Pharma Anticorps humain anti-her4
EP3143049B1 (en) 2014-05-14 2019-08-21 F. Hoffmann-La Roche AG Her3/her2 bispecific antibodies binding to the beta-hairpin of her3 and domain ii of her2
KR20160144465A (ko) * 2014-05-14 2016-12-16 에프. 호프만-라 로슈 아게 Her3의 베타-헤어핀에 결합하는 항-her3 항체
ES2729202T3 (es) * 2014-07-16 2019-10-30 Dana Farber Cancer Inst Inc Et Al Inhibición de HER3 en cánceres ováricos serosos de grado bajo
CN105367657B (zh) * 2014-08-14 2019-09-13 上海生物制品研究所有限责任公司 抗her3抗体、其制法及其应用
CA2960824A1 (en) 2014-09-13 2016-03-17 Novartis Ag Combination therapies of alk inhibitors
JP2017535528A (ja) 2014-10-03 2017-11-30 ノバルティス アーゲー 組み合わせ治療
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
PE20171067A1 (es) 2014-10-14 2017-07-24 Novartis Ag Moleculas de anticuerpo que se unen a pd-l1 y usos de las mismas
WO2016092508A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Massachusetts General Hospital Treatment of breast cancer brain metastases
WO2016145102A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene" -dependent signalling
EP3322735A4 (en) 2015-07-15 2019-03-13 Zymeworks Inc. BISPECIFIC ANTIGEN-BINDING CONSTRUCTS CONJUGATED TO A MEDICINAL PRODUCT
TW201716439A (zh) 2015-07-20 2017-05-16 美國禮來大藥廠 Ｈｅｒ３抗體
EP3317301B1 (en) 2015-07-29 2021-04-07 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to lag-3
EP3878465A1 (en) 2015-07-29 2021-09-15 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
JP6878405B2 (ja) 2015-07-29 2021-05-26 ノバルティス アーゲー Ｐｄ−１に対する抗体分子を含む組み合わせ治療
EP3334762A1 (en) * 2015-08-14 2018-06-20 Allergan, Inc. Heavy chain only antibodies to pdgf
PL3365373T3 (pl) 2015-10-23 2021-08-23 Merus N.V. Molekuły wiążące, które hamują wzrost nowotworu
CR20180234A (es) 2015-11-03 2018-09-11 Janssen Biotech Inc Anticuerpos que se unen especificamente a pd-1 y sus usos
JP6629581B2 (ja) * 2015-11-30 2020-01-15 サントリーホールディングス株式会社 ヒドロキシチロソール含有茶飲料
TWI778491B (zh) 2015-11-30 2022-09-21 美商輝瑞股份有限公司 位點專一性ｈｅｒ２抗體藥物共軛體
KR101746152B1 (ko) 2015-12-07 2017-06-13 주식회사 이수앱지스 ＥｒｂＢ3에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
CN108602890A (zh) 2015-12-11 2018-09-28 瑞泽恩制药公司 用于减少或预防对egfr和/或erbb3阻滞剂具有抗性的肿瘤生长的方法
JP2019503349A (ja) 2015-12-17 2019-02-07 ノバルティス アーゲー Ｐｄ−１に対する抗体分子およびその使用
MX2018011054A (es) 2016-03-15 2019-01-21 Merrimack Pharmaceuticals Inc Metodos para tratar cancer de mama er+, her2-, hrg+ usando terapias de combinacion que comprenden un anticuerpo anti-erbb3.
US11098077B2 (en) 2016-07-05 2021-08-24 Chinook Therapeutics, Inc. Locked nucleic acid cyclic dinucleotide compounds and uses thereof
CA3053749A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Kinki University Method for treating egfr-tki-resistant non-small cell lung cancer by administration of anti-her3 antibody-drug conjugate
CN110650752A (zh) 2017-03-31 2020-01-03 美勒斯公司 用于治疗具有NRG1融合基因的细胞的ErbB-2和ErbB3结合双特异性抗体
MX2019011658A (es) 2017-03-31 2019-11-18 Merus Nv Agente que se dirige al receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano (erbb-2) y anticuerpo biespecifico con sitios de union a antigeno que se unen a un epitopo sobre una parte extracelular de erbb-2 y el receptor 3 del factor de crecimiento epidermico humano (erbb-3), para el tratamiento de un individuo con un tumor positivo para erbb-2, erbb-2/erbb-3.
UY37695A (es) 2017-04-28 2018-11-30 Novartis Ag Compuesto dinucleótido cíclico bis 2’-5’-rr-(3’f-a)(3’f-a) y usos del mismo
WO2018237173A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag ANTIBODY MOLECULES DIRECTED AGAINST CD73 AND CORRESPONDING USES
BR112020002695A2 (pt) 2017-08-09 2020-08-25 Merus N.V. anticorpos que se ligam à egfr e cmet
CN111263767B (zh) 2017-08-30 2023-07-18 北京轩义医药科技有限公司 作为干扰素基因调节剂的刺激剂的环状二核苷酸
WO2019087087A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Aurigene Discovery Technologies Limited Dual inhibitors of tim-3 and pd-1 pathways
EP3706798A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Aurigene Discovery Technologies Limited Conjoint therapies for immunomodulation
WO2019185164A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Hummingbird Bioscience Holdings Pte. Ltd. Her3 antigen-binding molecules
AR126019A1 (es) 2018-05-30 2023-09-06 Novartis Ag Anticuerpos frente a entpd2, terapias de combinación y métodos de uso de los anticuerpos y las terapias de combinación
CN112912109A (zh) 2018-09-20 2021-06-04 第一三共株式会社 通过施用抗her3抗体-药物缀合物治疗her3-突变的癌症
CN110760003A (zh) * 2019-09-10 2020-02-07 广东药科大学 一种抗her3单链抗体的制备方法
JP2022548881A (ja) 2019-09-18 2022-11-22 ノバルティス アーゲー Ｅｎｔｐｄ２抗体、組合せ療法並びに抗体及び組合せ療法を使用する方法
CN113788895B (zh) * 2021-10-14 2023-09-15 陕西健吉跃生物科技有限公司 一种兔多克隆抗体及其制备方法和应用

Family Cites Families (185)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
DE3378250D1 (en) 1982-04-22 1988-11-24 Ici Plc Continuous release formulations
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
EP0138854B1 (en) 1983-03-08 1992-11-04 Chiron Mimotopes Pty. Ltd. Antigenically active amino acid sequences
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
AU612370B2 (en) 1987-05-21 1991-07-11 Micromet Ag Targeted multifunctional proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
EP0550436A1 (en) 1989-11-06 1993-07-14 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Protein microspheres and methods of using them
US5183884A (en) 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2096749T3 (es) 1990-12-14 1997-03-16 Cell Genesys Inc Cadenas quimericas para vias de transduccion de señal asociada a un receptor.
JPH06507404A (ja) 1991-05-01 1994-08-25 ヘンリー　エム．ジャクソン　ファウンデイション　フォー　ザ　アドバンスメント　オブ　ミリタリー　メディスン 感染性の呼吸性疾患の治療方法
ES2313867T3 (es) 1991-12-02 2009-03-16 Medical Research Council Produccion de anticuerpos anti-auto de repertorios de segmentos de anticuerpo expresados en la superficie de fagos.
JP3949712B2 (ja) 1991-12-02 2007-07-25 メディカル リサーチ カウンシル 抗体セグメントレパートリー由来でファージに表示される抗自己抗体の産生
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
EP2192131A1 (en) 1992-08-21 2010-06-02 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
US5958708A (en) 1992-09-25 1999-09-28 Novartis Corporation Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype
CA2103323A1 (en) 1992-11-24 1994-05-25 Gregory D. Plowman Her4 human receptor tyrosine kinase
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6838254B1 (en) 1993-04-29 2005-01-04 Conopco, Inc. Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of camelidae
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
CN1117155C (zh) 1994-07-29 2003-08-06 史密丝克莱恩比彻姆有限公司 新型化合物
US6132764A (en) 1994-08-05 2000-10-17 Targesome, Inc. Targeted polymerized liposome diagnostic and treatment agents
EP0805678B1 (en) 1995-01-05 2003-10-29 THE BOARD OF REGENTS acting for and on behalf of THE UNIVERSITY OF MICHIGAN Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
CA2230494A1 (en) 1995-08-31 1997-03-06 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Composition for sustained release of an agent
DK0885002T3 (da) 1996-03-04 2011-08-22 Penn State Res Found Materialer og fremgangsmåder til forøgelse af cellulær internalisering
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
WO1998031346A1 (en) 1997-01-16 1998-07-23 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US6136558A (en) 1997-02-10 2000-10-24 Genentech, Inc. Heregulin variants
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
WO1998056906A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 Thoegersen Hans Christian Trimerising module
EP0985039B1 (en) 1997-06-12 2008-02-20 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
AU9805398A (en) 1997-10-15 1999-05-03 Children's Medical Center Corporation Novel human egf receptors and use thereof
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
JP2002518432A (ja) 1998-06-24 2002-06-25 アドバンスト インハレーション リサーチ，インコーポレイテッド 吸入器から放出される大多孔性粒子
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
KR101155191B1 (ko) 1999-01-15 2012-06-13 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
PT1144607E (pt) 1999-07-20 2009-04-22 Morphosys Ag Novos métodos para apresentar (poli)peptídeos/ proteínas em partículas bacteriofágicas através de ligações dissulfureto
US6984720B1 (en) 1999-08-24 2006-01-10 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies
CA2405557C (en) 2000-04-12 2013-09-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2441903C (en) 2000-05-26 2012-07-31 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
EP1916303B1 (en) 2000-11-30 2013-02-27 Medarex, Inc. Nucleic acids encoding rearranged human immunoglobulin sequences from transgenic transchromosomal mice
LT3351246T (lt) 2001-02-19 2019-07-10 Novartis Pharma Ag Rapamicino darinys, skirtas kieto naviko, susijusio su nereguliuojama angiogeneze, gydymui
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
WO2002092780A2 (en) 2001-05-17 2002-11-21 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
ITMI20011483A1 (it) 2001-07-11 2003-01-11 Res & Innovation Soc Coop A R Uso di composti come antagonisti funzionali ai recettori centrali deicannabinoidi
WO2003011897A1 (en) 2001-07-27 2003-02-13 The Regents Of The University Of California Modulation of heregulin and her3 interaction
EP1283053A1 (en) 2001-08-09 2003-02-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibitors of HER3 activity
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
CA2467633C (en) 2001-12-03 2012-03-27 Abgenix, Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
KR100956195B1 (ko) 2002-02-01 2010-05-06 어리어드 파마슈티칼스, 인코포레이티드 인 함유 화합물 및 이의 용도
US20030157579A1 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Kalobios, Inc. Molecular sensors activated by disinhibition
US7335478B2 (en) 2002-04-18 2008-02-26 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Reactivation-based molecular interaction sensors
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
EP2135879A3 (en) 2002-06-28 2010-06-23 Domantis Limited Ligand
JP2006520584A (ja) 2002-11-08 2006-09-14 アブリンクス エン．ヴェー． 安定化単一ドメイン抗体
CA2511910A1 (en) 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
WO2004072266A2 (en) 2003-02-13 2004-08-26 Kalobios Inc. Antibody affinity engineering by serial epitope-guided complementarity replacement
EP2357237A1 (en) 2003-05-14 2011-08-17 Domantis Limited A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
DK1639011T3 (da) 2003-06-30 2009-02-16 Domantis Ltd Pegylerede enkelt-domæne antistoffer (dAb)
US7399865B2 (en) 2003-09-15 2008-07-15 Wyeth Protein tyrosine kinase enzyme inhibitors
WO2005069970A2 (en) 2004-01-20 2005-08-04 Kalobios, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
CA2595682A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
GB0503546D0 (en) * 2005-02-21 2005-03-30 Hellenic Pasteur Inst Antibody
GB0510390D0 (en) 2005-05-20 2005-06-29 Novartis Ag Organic compounds
KR20080080482A (ko) 2005-09-07 2008-09-04 메디뮨 엘엘씨 독소가 컨쥬게이트된 ｅｐｈ 수용체 항체
EP1931424A2 (en) 2005-09-07 2008-06-18 Laboratoires Serono S.A. P13k inhibitors for the treatment of endometriosis
CA2631184A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
AR056857A1 (es) * 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
AU2007257683A1 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Symphogen A/S Pan-cell surface receptor- specific therapeutics
PT2511301T (pt) * 2006-08-04 2018-03-08 Medimmune Ltd Anticorpos humanos para erbb2
US20080050385A1 (en) * 2006-08-21 2008-02-28 Thomas Friess Tumor therapy with an anti-vegf antibody
US7825127B2 (en) 2006-12-28 2010-11-02 Takeda Pharmaceutical Company, Limited Method for treating cancer
DK2129396T3 (da) 2007-02-16 2013-11-25 Merrimack Pharmaceuticals Inc Antistoffer mod ErbB3 og anvendelser deraf
CN103432580A (zh) 2007-03-02 2013-12-11 健泰科生物技术公司 基于低her3表达预测对her二聚化抑制剂的响应
US20080245375A1 (en) 2007-04-05 2008-10-09 Medtronic Vascular, Inc. Benign Prostatic Hyperplasia Treatments
MX338504B (es) 2007-09-12 2016-04-20 Genentech Inc Combinaciones de compuestos inhibidores de fosfoinosituro 3-cinasa y agentes quimioterapeuticos, y metodos de uso.
EP2205629A2 (en) 2007-10-16 2010-07-14 Symphogen A/S Compositions comprising optimized her1 and her3 multimers and methods of use thereof
ES2439705T3 (es) 2007-10-25 2014-01-24 Genentech, Inc. Proceso para la preparación de compuestos de tienopirimidina
UY31800A (es) 2008-05-05 2009-11-10 Smithkline Beckman Corp Metodo de tratamiento de cancer usando un inhibidor de cmet y axl y un inhibidor de erbb
US8362215B2 (en) 2009-04-29 2013-01-29 Trellis Bioscience, Llc Antibodies immunoreactive with heregulin-coupled HER3
WO2011022727A2 (en) 2009-08-21 2011-02-24 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Antibodies against the ectodomain of erbb3 and uses thereof
WO2011036911A1 (ja) 2009-09-25 2011-03-31 シャープ株式会社 液晶表示装置
CA2777242A1 (en) 2009-10-14 2011-04-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents targeting igf-1r and erbb3 signalling and uses thereof
BR112012012160B1 (pt) 2009-11-13 2022-04-26 Amgen, Inc. Material e métodos para tratar ou prevenir doenças associadas ao her-3
NZ600262A (en) 2009-12-22 2013-06-28 Roche Glycart Ag Anti-her3 antibodies and uses thereof
CN102892779B (zh) 2010-02-18 2016-12-21 基因泰克公司 神经调节蛋白拮抗剂及其在治疗癌症中的用途
EP2544680B1 (en) 2010-03-11 2015-01-14 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Use of erbb3 inhibitors in the treatment of triple negative breast cancer
CA2795799C (en) 2010-04-09 2018-09-25 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbb3 antibodies
EP2569334A4 (en) 2010-05-13 2014-01-22 Fox Chase Cancer Ct RECOMBINANT-PRODUCED ANTIBODIES FOR THE TARGETING OF ERBB SIGNALING MOLECULES AND METHOD FOR THEIR USE FOR DISEASE DIAGNOSIS AND TREATMENT
US9932403B2 (en) 2010-05-20 2018-04-03 Ablynx Nv Biological materials related to HER3
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2012019024A2 (en) 2010-08-04 2012-02-09 Immunogen, Inc. Her3-binding molecules and immunoconjugates thereof
CA2815154A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 U3 Pharma Gmbh Use of her3 binding agents in prostate treatment
MX2013002046A (es) 2010-08-20 2013-04-03 Novartis Ag Anticuerpos para el receptor del factor de crecimiento epidermico 3 (her3).
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
US9155802B2 (en) 2010-11-01 2015-10-13 Symphogen A/S Pan-HER antibody composition
ITRM20100577A1 (it) 2010-11-02 2012-05-03 Takis Srl Immunoterapia contro il recettore erbb-3
AR083705A1 (es) 2010-11-04 2013-03-13 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
NO2707391T3 (uk) 2011-05-13 2018-04-07
EP2736928B1 (en) 2011-07-28 2019-01-09 i2 Pharmaceuticals, Inc. Sur-binding proteins against erbb3
CA2857601A1 (en) 2011-12-05 2013-06-13 Novartis Ag Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3) directed to domain ii of her3
ES2758433T3 (es) * 2011-12-05 2020-05-05 Novartis Ag Anticuerpos contra el receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico (HER3)

Also Published As

Publication number Publication date
JP6770944B2 (ja) 2020-10-21
US20190194347A1 (en) 2019-06-27
CN105037552B (zh) 2019-03-29
MY162825A (en) 2017-07-31
US8735551B2 (en) 2014-05-27
KR20130108304A (ko) 2013-10-02
AU2011290672B2 (en) 2015-07-09
EP2606070A1 (en) 2013-06-26
PE20140230A1 (es) 2014-02-26
GEP201706605B (en) 2017-01-25
HUE031855T2 (en) 2017-08-28
CR20130071A (es) 2013-03-13
IL261916A (en) 2018-10-31
CU24094B1 (es) 2015-04-29
JP2017019815A (ja) 2017-01-26
CN103080134B (zh) 2015-11-25
US20170166653A1 (en) 2017-06-15
CN105037552A (zh) 2015-11-11
BR112013004012A2 (pt) 2016-06-28
CL2013000459A1 (es) 2014-01-31
BR112013004012B1 (pt) 2021-03-23
JP6416161B2 (ja) 2018-10-31
MA34524B1 (fr) 2013-09-02
CA2806637C (en) 2020-08-25
HRP20170462T1 (hr) 2017-05-19
EP2606070B1 (en) 2016-12-21
SI2606070T1 (sl) 2017-04-26
CO6680688A2 (es) 2013-05-31
SG187908A1 (en) 2013-03-28
JP2019001791A (ja) 2019-01-10
NZ607337A (en) 2015-06-26
EA201300256A1 (ru) 2013-08-30
LT2606070T (lt) 2017-04-10
JP6057896B2 (ja) 2017-01-11
CY1118761T1 (el) 2017-07-12
EA036314B1 (ru) 2020-10-26
IL226712B (en) 2018-10-31
KR102027011B1 (ko) 2019-09-30
WO2012022814A1 (en) 2012-02-23
DOP2013000044A (es) 2013-05-31
MX2013002046A (es) 2013-04-03
JP6771002B2 (ja) 2020-10-21
DK2606070T3 (en) 2017-03-27
PT2606070T (pt) 2017-03-31
NI201300023A (es) 2013-04-15
CL2014002750A1 (es) 2015-04-06
JP2018090590A (ja) 2018-06-14
US20120107306A1 (en) 2012-05-03
RS55930B1 (sr) 2017-09-29
ES2620255T3 (es) 2017-06-28
ME02637B (me) 2017-06-20
PL2606070T3 (pl) 2017-06-30
CU20130023A7 (es) 2013-05-31
GT201300046A (es) 2015-06-02
CN103080134A (zh) 2013-05-01
AU2011290672A1 (en) 2013-03-21
CA2806637A1 (en) 2012-02-23
JP2013537546A (ja) 2013-10-03
US10077317B2 (en) 2018-09-18
PL2606070T4 (pl) 2017-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA114883C2 (uk) Антитіло до рецептора епідермального фактора росту-3 (her3)
ES2884211T3 (es) Construcciones de anticuerpos biespecíficos que unen DLL3 y CD3
ES2900233T3 (es) Moléculas que se unen a CD70 y métodos de uso de las mismas
ES2929276T3 (es) Constructos de anticuerpo para CDH19 y CD3
ES2945313T3 (es) Construcciones de anticuerpos biespecificos para CDH3 y CD3
ES2431940T3 (es) Anticuerpos contra la ERBB3 y usos de los mismos
TWI290147B (en) Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
ES2717908T3 (es) Anticuerpos S100A4 y usos terapéuticos de los mismos
CN106519034A (zh) 抗pd‑1抗体及其用途
ES2748583T3 (es) Proteínas de unión al receptor Fc
UA125501C2 (uk) Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке здатне специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини, його застосування та спосіб лікування синуклеопатії
CN106103486A (zh) 抗ox40抗体和使用方法
UA125577C2 (uk) Антигензв'язуюча молекула, які містить тримерний ліганд сімейства tnf
CN110267678A (zh) 抗mic抗体和使用方法
UA119571C2 (uk) Антитіло проти lag3 і його антигензв'язувальний фрагмент
CN107531786A (zh) 抗axl拮抗抗体
CN106573980A (zh) 抗axl抗体
UA123695C2 (uk) Епітоп склеростину, антитіло, яке зв'язує склеростин, та застосування такого антитіла для лікування захворювання, опосередкованого склеростином
US11066471B2 (en) Antibodies to MICA and MICB proteins
CN106573979A (zh) 抗axl抗体
TR201807983T4 (tr) İnsanlaştırılmış anti-CXCR5 antikorları, deriveleri ve kullanımları.
JP2018504893A (ja) Ｂｍｐ６を標的とする抗体のための組成物および方法
BR112012028306A2 (pt) anticorpos para proteína 6 relacionada com lipoproteína de baixa densidade (lrp6) e seus fragmentos, seu uso, ácidos nucléicos, vetores, bem como composições farmacêuticas e combinações
UA103297C2 (uk) Спосіб лікування захворювання, пов'язаного з імунітетом, шляхом одночасного націлювання на il-17a і il-17f антитіл-антагоністів
CN107847570A (zh) 靶向hpv16‑e7肽/mhc复合体的构建体及其用途