KR20160144465A - Her3의 베타-헤어핀에 결합하는 항-her3 항체 - Google Patents

Her3의 베타-헤어핀에 결합하는 항-her3 항체 Download PDF

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미카엘 슈라엠
카르멘 페스
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Abstract

본 발명은 HER3의 베타-헤어핀에 결합하는 특이적인 항-HER3 항체, 그의 제조 및 약제로서의 용도에 관한 것이다.

Description

HER3의 베타-헤어핀에 결합하는 항-HER3 항체{ANTI-HER3 ANTIBODIES BINDING TO THE BETA-HAIRPIN OF HER3}
본 발명은 HER3의 베타-헤어핀에 결합하는 항-HER3 항체, 그의 제조 및 약제로서의 용도에 관한 것이다.
HER 단백질 그룹은 4개의 구성원, 즉 HER1(또한 상피 성장인자 수용체(EGFR) 또는 ErbB-1이라 명명한다), HER2(또한 ErbB-2라 명명한다), ErbB-3(또한 HER3이라 명명한다) 및 ErbB-4(또한 HER4라 명명한다)로 이루어진다. 상기 ErbB 그룹 단백질은 수용체 타이로신 키나제이며 세포 성장, 분화 및 생존의 중요한 매개체를 나타낸다. 상기 HER 그룹은 뉴레귤린(NRG) 그룹, 암피레귤린, EGF 및 (TGF-a)와 같은 상이한 리간드들의 수용체 단백질을 나타낸다. 헤레귤린(또한 HRG 또는 뉴레귤린 NRG-1이라 칭한다)은 예를 들어 HER3 및 HER4에 대한 리간드이다.
인간 HER3(ErbB-3, ERBB3, c-erbB-3, c-erbB3, 수용체 타이로신-단백질 키나제 erbB-3, 서열번호 3)은, HER1(또한 EGFR로서 공지됨), HER2, 및 HER4를 또한 포함하는 수용체 타이로신 키나제의 상피 성장인자 수용체(EGFR) 그룹의 일원을 암호화한다(문헌[Kraus, M.H. et al, PNAS 86 (1989) 9193-9197]; 문헌[Plowman, G.D. et al, PNAS 87 (1990) 4905-4909]; 문헌[Kraus, M.H. et al, PNAS 90 (1993) 2900-2904]). 상기 원형 상피 성장인자 수용체처럼, 막관통 수용체 HER3은 세포외 리간드-결합 도메인(ECD), 상기 ECD 내의 이량체화 도메인, 막관통 도메인, 세포내 단백질 타이로신 키나제 도메인(TKD) 및 C-말단 인산화 도메인으로 이루어진다. 상기 막-결합된 단백질은 상기 세포외 도메인내에 헤레귤린(HRG) 결합 도메인을 갖지만 활성 키나제 도메인은 갖지 않는다. 따라서, 상기 단백질은 상기 리간드와 결합할 수 있지만 단백질 인산화를 통해 상기 세포내로 신호를 전달할 수 없다. 그러나, 상기 단백질은 키나제 활성을 갖는 다른 HER 그룹 구성원들과 이종이량체를 형성한다. 이종이량체화는 상기 수용체-매개된 신호전달 경로의 활성화 및 그의 세포내 도메인의 트랜스인산화를 유도한다. HER 그룹 구성원들간의 이량체 형성은 HER3의 신호전달 가능성을 확대시키며 신호 다양화뿐만 아니라 신호 증폭을 위한 수단이다. 예를 들어 HER 그룹 구성원들 가운데에서 HER2/HER3 이종이량체는 PI3K 및 AKT 경로를 통해 가장 중요한 유사분열촉진 신호 중 하나를 유도한다(문헌[Sliwkowski M.X., et al, J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665]; 문헌[Alimandi M, et al, Oncogene. 10 (1995) 1813-1821]; 문헌[Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276 (2001) 42153-4261]; 문헌[Singer, E., J. Biol. Chem. 276 (2001) 44266-44274]; 문헌[Schaefer, K.L., Neoplasia 8 (2006) 613-622]). HER3 및 HER 수용체 그룹 및 NGR 리간드 그룹내에서의 그의 다양한 상호작용에 대한 개요에 대해서 예를 들어 문헌[G Sithanandam et al Cancer Gene Therapy (2008) 15, 413-448]을 참조하시오.
상기 유전자의 증폭 및/또는 그의 단백질의 과발현이 전립선, 방광 및 유방 종양을 포함한 다양한 암들에서 보고되었다. 상이한 동형들을 암호화하는 교번 전사 이어맞추기 변이체들이 특성화되었다. 하나의 동형은 막간 영역이 없으며 세포 밖에서 분비된다. 상기 형태는 막-결합된 형태의 활성을 조절하는 작용을 한다. 추가의 이어맞추기 변이체들이 또한 보고되었으나, 철저히 특성화되지는 않았다.
흥미롭게도, 상기 HER3 수용체는 평형 상태에서 그의 "폐쇄된 입체구조"로 존재하고, 이는 이종이량체화 HER3베타-헤어핀 동기가 비-공유 상호작용을 통해 HER3ECD 도메인 IV에 구속됨을 의미한다(도 1c 및 1d를 참조하시오). 상기 "폐쇄된" HER3 입체구조는 특정한 HER3 헤레귤린 결합 부위에서 리간드 헤레귤린의 결합을 통해 개방될 수 있는 것으로 생각된다. 이는 HER3 ECD 도메인 I 및 도메인 III에 의해 형성된 HER3 계면에서 발생한다. 상기 상호작용에 의해, 상기 HER3 수용체가 활성화되고 그의 "개방된 입체구조"로 이동하는 것으로 여겨진다(도 1e 및 1b 및 예를 들어 문헌[Baselga, J. et al, Nat Rev Cancer 9 (2009). 463-475] 및 문헌[Desbois-Mouthon, C., et al, Gastroenterol Clin Biol 34 (2010) 255-259]을 참조하시오). 상기 개방된 입체구조에서 HER2에 의한 이종이량체화 및 트랜스신호 유도가 가능하다(도 1b를 참조하시오).
WO 2003/013602는 HER 항체를 포함한, HER 활성의 억제제에 관한 것이다. WO 2007/077028 및 WO 2008/100624는 또한 HER3 항체에 관한 것이다.
WO 97/35885 및 WO 2010/127181은 HER3 항체에 관한 것이다.
인간 HER4(또한 ErbB-4, ERBB4로서 공지됨, v-erb-a 적혈모구성 백혈병 바이러스 발암유전자 상동체 4, p180erbB4 조류 적혈모구성 백혈병 바이러스(v-erb-b2) 발암유전자 상동체 4; 서열번호 5)는 다수의 퓨린-유사 시스테인 풍부 도메인, 타이로신 키나제 도메인, 포스포티딜이노시톨-3 키나제 결합 부위 및 PDZ 도메인 결합 동기를 갖는 I형 단일 막관통 단백질이다(문헌[Plowman G D, wt al, PNAS 90:1746-50(1993)]; 문헌[Zimonjic D B, et al, Oncogene 10:1235-7(1995)]; 문헌[Culouscou J M, et al, J. Biol. Chem. 268:18407-10(1993)]). 상기 단백질은 뉴레귤린-2 및 -3, 헤파린-결합 EGF-유사 성장인자 및 베타셀룰린에 결합하고 이들에 의해 활성화된다. 리간드 결합은 유사분열유도 및 분화를 포함한 다양한 세포 반응들을 유도한다. 다수의 단백질분해 사건들이 세포질 단편 및 세포외 단편의 방출을 허용한다.
상기 유전자의 돌연변이는 암과 관련되었다. 상이한 단백질 동형들을 암호화하는 선택적 이어맞추기 변이체들이 개시되었으나; 모든 변이체가 특성화된 것은 아니다.
항암 요법에 사용하기 위한 항-HER4 항체가 예를 들어 미국특허 제 5,811,098 호, 미국특허 제 7,332,579 호 또는 문헌[Hollmen M, et al, Oncogene. 28 (2009) 1309-19](항-ErbB-4 항체 mAb 1479)으로부터 공지되어 있다.
지금까지 HER3(또는 HER4)의 베타-헤어핀은 모두 이들 수용체의 평형 상태에서는 접근될 수 없는 은닉 에피토프를 나타내므로 상기 HER3(및/또는 HER4)의 베타-헤어핀에 특이적으로 결합하는 항체를 선택할 수 없었다(도 1 참조).
본 발명은 HER3의 베타-헤어핀에 결합하는 최적화된 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 인간화된 변이체로서 마우스 항체 M-05-74(상기 HER3의 베타-헤어핀에 결합한다)로부터 유래된다. VH 및 VL 도메인에 대한 막대한 수의 잠재적인 인간 프레임워크로부터, 단지 5VH 및 5 VL 프레임워크만이 마우스 항체 M-05-74의 추가적인 인간화에 적합한 것으로 생각되었다. 놀랍게도 상기 사전-선택된 VH 중 단지 하나만이 최종적으로 인간 HER3에 효능 있는 결합을 부여할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체를 제공하고,
여기에서 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A)
를 포함한다.
본 발명은 또한 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체를 제공하고,
여기에서 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-D), 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-B), 또는 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-E)
을 포함한다.
본 발명은 또한 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체를 제공하고,
여기에서 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-D)
을 포함한다.
본 발명은 또한 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체를 제공하고,
여기에서 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-B)
을 포함한다.
본 발명은 또한 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체를 제공하고,
여기에서 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-E)
을 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기는
서열번호 13 TtSlyD-FKBP-Her3,
서열번호 17 TtSlyDcas-Her3,
서열번호 18 TtSlyDcys-Her3,
서열번호 19 TgSlyDser-Her3, 및
서열번호 20 TgSlyDcys-Her3
으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드 중에 포함된 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(서열번호 1)의 아미노산 서열내에 결합한다.
또한 상기와 같은 항체 또는 그의 모 항체를 획득하기 위해 SlyD 스캐폴드내에 3차원 배향으로 기능적으로 존재하는 HER3(및 HER4)의 베타-헤어핀(예를 들어 도 2, 및 서열번호 13 및 17 내지 24의 폴리펩타이드를 참조하시오)을 사용하는 방법을 개시한다.
또한 항체, 특히 인간 HER3에 결합하는(및 인간 HER4에 결합하는) 항체를 선택하는 방법을 개시하고, 여기에서 상기 항체는 인간 HER3의 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(서열번호 1)의 아미노산 서열내에 결합하고; 여기에서
a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는,
서열번호 13 TtSlyD-FKBP-Her3,
서열번호 17 TtSlyDcas-Her3,
서열번호 18 TtSlyDcys-Her3,
서열번호 19 TgSlyDser-Her3, 및
서열번호 20 TgSlyDcys-Her3
으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드
(및 임의로,
b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는,
서열번호 21 TtSlyDcas-Her4,
서열번호 22 TtSlyDcys-Her4,
서열번호 23 TgSlyDser-Her4, 및
서열번호 24 TgSlyDcys-Her4
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드)
는, 상기 a)의 하나 이상의 폴리펩타이드(및 임의로 상기 b)의 하나 이상의 폴리펩타이드)에 대해 결합을 나타내고
이에 의해 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(서열번호 1)의 아미노산 서열내 및 임의로 PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(서열번호 2)의 아미노산 서열내에 결합하는 항체를 선택하는데 사용한다.
하나의 실시태양에서 상기와 같은 항-HER3 항체는 인간 HER3에 결합하는(및 인간 HER4에 결합하는) 항체 단편이다.
하나의 실시태양에서 상기와 같은 항-HER3 항체는 전장 IgG1 항체 또는 IgG4 항체이다.
하나의 실시태양에서 상기와 같은 항-HER3 항체는 Fab 단편이다.
본 발명은 또한 상기 항-HER3 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한 상기와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 상기와 같은 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 단계를 포함하는, 상기 항체의 제조 방법을 제공한다.
하나의 실시태양에서 상기와 같은 방법은 또한 항체를 상기 숙주 세포로부터 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 상기와 같은 항-HER3 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기와 같은 항-HER3 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형을 제공한다.
본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 개시된 항-HER3 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 암 치료에 사용하기 위한 본 발명에 개시된 항-HER3 항체, 또는 상기 항-HER3 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 HER3/HER2 이량체화의 억제에 사용하기 위한 본 발명에 개시된 항-HER3 항체를 제공한다.
약제의 제조에서 상기와 같은 항-HER3 항체, 또는 상기 항-HER3 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체의 용도. 상기와 같은 용도에서, 상기 약제는 암을 치료하기 위한 것이다. 상기와 같은 용도에서 상기 약제는 HER3/HER2 이량체화를 억제하기 위한 것이다.
본 발명은 또한 암이 있는 개인에게 유효량의 본 발명에 개시된 항-HER3 항체, 또는 상기 항-HER3 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체를 투여함을 포함하는, 상기 개인의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 암을 앓고 있는 개인에게 유효량의 본 발명에 개시된 항-HER3 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체를 투여하여, 상기 개인에게서 암 세포의 세포사멸을 유도함을 포함하는, 상기 개인에게서 암 세포의 세포사멸을 유도하는 방법을 제공한다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는,
서열번호 13 TtSlyD-FKBP-Her3,
서열번호 17 TtSlyDcas-Her3,
서열번호 18 TtSlyDcys-Her3,
서열번호 19 TgSlyDser-Her3, 및
서열번호 20 TgSlyDcys-Her3
으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 개시한다.
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는,
서열번호 21 TtSlyDcas-Her4,
서열번호 22 TtSlyDcys-Her4,
서열번호 23 TgSlyDser-Her4, 및
서열번호 24 TgSlyDcys-Her4
로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 개시한다.
SlyD 스캐폴드내에 3차원 배향으로 기능적으로 존재하는 HER3(및 HER4)의 베타-헤어핀(예를 들어 도 2, 및 서열번호 13 및 17 내지 24의 폴리펩타이드를 참조하시오)을 사용하여, 상기 베타-헤어핀에 결합하는 본 발명에 개시된 항-HER3 항체를 선택할 수 있었다.
본 발명에 따른 항체는 매우 귀중한 성질들, 예를 들어 HER3 발현 암세포의 강한 성장 억제, 암세포 증식과 관련된 HER3 매개된 신호전달(예를 들어 HER3 인산화)의 강한 억제, 또는 매우 특이적인 약동학적 성질들(예를 들어 헤레귤린의 부재("폐쇄된 입체구조")에 비해 헤레귤린의 존재("개방된 입체구조")시의 활성화된 HER3에 대한 보다 빠른 결합 속도 및 보다 높은 결합 몰비)을 가질 수 있는 것으로 밝혀졌다.
도 1은 "폐쇄된" 및 "개방된" HER3 입체구조의 도식적 개요 및 입체구조 변화에 대한 뉴레귤린 그룹 리간드(예를 들어 여기에서 HR로서 약기된 헤레귤린과 같은)의 영향이다.
도 2는 써무스 써모필레스(Thermus thermophiles)의 SlyD 스캐폴드내에 3-차원 배향으로 기능적으로 존재하는 HER3의 베타-헤어핀의 3D-구조이다.
도 3은 TtSlyD-FKBP-Her3의 Ni-NTA 정제의 SDS-PAGE 분석이다. E1 및 E2는 정제된 분획 12 및 13을 도시한다. SN: 정제 전의 에스케리키아 콜라이 용해물 상등액.
도 4는 써무스 써모필루스 SlyD-FKBP-Her-3의 Ni-NTA 정제된 분획의 SEC 용출 프로파일이다.
도 5는 선택된 클론의 IHC에서 특이성 및 반응성의 시험이다. 3개의 클론은 모두 Her3에 대한 결합 및 Her4에 대한 교차 반응성을 나타내었다. Her1 및 Her2에 대한 교차 반응성은 검출할 수 없었다.
도 6은 T47D 세포에서 M-05-74 항체 유도된 시간 의존적인 HER3 내면화의 FACS 분석이다.
도 7은 비아코어 센서그램 오버레이 플롯이다. 1: 100 nM M-05-74*헤레귤린/Her-3 ECD 상호작용. 2: 100 nM M-08-11*헤레귤린/Her-3 ECD 상호작용. 3 및 4: 100 nM M-05-74 및 100 nM M-08-11*Her-3 ECD 상호작용. 5: 완충제 기준.
도 8은 비아코어 에피토프-비닝(binning) 실험의 센서그램 오버레이이다. 1차 항체 M-05-74(도면에서 M-074)는 2차 항체 M-208, GT(=8B8), M-05-74 및 M-08-11(도 8에서 M-011)에 Her-3 ECD를 제공하였다(M-. 상기 측정의 소음은 5RU였다).
도 9는 비아코아 센서그램 오버레이 플롯. 1: M-05-74상의 90 nM 헤레귤린*Her-3 ECD 복합체. 2: M-08-11상의 90 nM 헤레귤린*Her-3 ECD 복합체. 3: 8B8 항체상의 90 nM 헤레귤린*Her-3 ECD 복합체.
도 10은 비아코어 기능 분석에 의해 확인된 작용들의 도식적 모드이다. 1: M-08-11은 헤레귤린 활성화된 Her-3 ECD에 결합하고 지연된 헤레귤린 해리를 유도하고, 이때 M-08-11은 Her-3 ECD 수용체 복합체 중에 체류한다. 2: M-05-74는 헤레귤린 활성화된 Her-3 ECD에 결합한다. 헤레귤린은 복합체 중에 포획되고 항체는 복합체 중에 체류한다. 3: 8B8은 헤레귤린 활성화된 Her-3 ECD에 결합한다. 전체 복합체가 항체로부터 해리된다.
도 11은 에피토프 맵핑 및 알라닌-스캔 접근법의 전략이다. 구조적 매몰(구조적)을 포함하여 EGFR, Her-2 ECD, Her-3 ECD 및 Her-4 ECD의 펩타이드 헤어핀 서열(펩타이드 헤어핀)을 조사하였다. 시스테인이 세린에 의해 치환되었다.
도 12는 HER3 및 HER4상의 항체 M-05-74의 에피토프의 셀루스팟스(CelluSpots)(상표) 합성 및 에피토프 맵핑이다. 항-HER3/HER4 항체 M-05-74는 HER3 ECD 결합 에피토프 VYNKLTFQLEP(서열번호 43) 및 HER4 ECD 결합 에피토프 VYNPTTFQLE(서열번호 44)에 결합한다.
도 13은 항 HER3/HER4 항체 M-05-74(도면에서 M-074라 명명됨) 및 HER4 교차반응성 없는 항-HER3 항체 M-08-11(M-011이라 명명됨)의 셀루스팟스(상표) Ala-스캔으로부터의 결과이다 - 항-HER3/HER4 항체 M-05-74의 그의 HER3 ECD 결합 에피토프 VYNKLTFQLEP(서열번호 43) 및 그의 HER4 ECD 결합 에피토프 VYNPTTFQLE(서열번호 44)에의 결합에 가장 기여하는 아미노산은 밑줄로/굵게 표시한다.
도 14에서 M-05-74(M-074)의 결합은 HRG의 HER3-ECD에의 결합을 유도/촉진한다.
도 15는 MCF7 세포에서 HER2/HER3 이종이량체/이종이량체화(면역침전 및 웨스턴 블럿)의 억제이다(HER3-IP = HER3 항체에 의한 면역침전/HER2-IP = HER3 항체에 의한 면역침전).
도 16에서 M-05-74에 의한 MDA-MB175 세포의 처리는 세포 증식의 억제를 생성시켰다.
도 17에서 M-05-74(M-074)에 의한 처리(10 ㎎/㎏ q7d, i.p.)는 FaDu HNSCC 이식된 이종이식편의 종양 정지를 생성시켰다.
도 18에서 M-05-74-Fab-슈도모나스 외독소 접합체(M-074-PE)(10 ㎎/㎏ q7d, i.p.)에 의한 처리는 HRG의 부재하에서(가는 선) 보다 HRG의 존재하에서(굵은 선) 더 강한 세포 증식 억제를 생성시켰다.
도 19는 M-05-74-Fab-슈도모나스 외독소 접합체(M-05-74-PE)에 의한 생체내 종양 세포 성장 억제이다. 범례: 닫힌 선(비히클); 점선(M-05-74-Fab-슈도모나스 외독소 접합체(M-05-74-PE)).
도 20은 비아코어 센서그램 오버레이 플롯이다: 항-HER3 항체 MOR09823(2)과 비교된 TtSlyDcys-Her3(서열번호 18)에 대한 본 발명의 항체 M-05-74(1)의 결합은 WO 2012/22814에 개시되어 있다. 본 발명의 M-05-74의 항체(1)는 TtSlyDcys-Her3(서열번호 18)에 대해 분명한 결합 신호를 나타내는 반면, 항체 항-HER3 항체 MOR09823(2)은 TtSlyDcys-Her3(서열번호 18)에 전혀 결합을 나타내지 않는다. 항체가 전혀 없는 대조군 측정(3)은 TtSlyDcys-Her3(서열번호 18)에 어떠한 결합도 나타내지 않았다.
도 21은 리보솜 디스플레이를 통한 최적화된 인간화된 M-05-74 항체의 선택이다: 디스플레이 선택 중 농축된 RNA의 역전사 후 획득된 PCR 산물의 분석학적 DNA 칩 전기영동. 상기 획득된 젤 상은 레인 1에서 선택된 구조물 DNA의 농축을 나타내고 레인 2에서 음성 대조군(항원 부재하의 패닝)에 대한 농축은 나타내지 않는다. 남아있는 대조군들은 또한 예상된 대로 음성이다. DNA 절단이 완료되었다(레인 3은 표적에 대한 것이고, 레인 4는 배경에 대한 것이다). 따라서, 레인 1에서 획득된 모든 DNA는 상기 패닝 단계에서 선택된 결합 변이체, 및 그의 상응하는 RNA로부터 유래된다. 상기 역전사의 음성 대조군도, 상기 PCR의 음성 대조군도 밴드를 나타내지 않는다. 레인 7은 정제 후 모은 PCR 반응의 생성물을 나타낸다.
I. 정의
본 발명의 목적을 위한 "수용체 인간 프레임워크"는 하기에 정의되는 바와 같은, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 수용체 인간 프레임워크는 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 일부 실시태양에서, 상기 VL 수용체 인간 프레임워크는 상기 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서일이 일치한다.
"친화성 성숙된" 항체는 하나 이상의 초가변 영역(HVR) 중에 하나 이상의 변경을 갖지 않는 모 항체에 비해, 상기 변경을 갖는 항체를 지칭하고, 상기와 같은 변경은 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시킨다.
"항-HER3 항체", "(인간) HER3에 결합하는 항체" 및 "인간 HER3에 특이적으로 결합하는 항체"란 용어는 상기 항체가 HER3을 표적화하는 진단제 및/또는 치료제로서 사용하기에 충분한 친화성으로 HER3에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 관련되지 않은 비-HER3 단백질(HER4 제외)에의 항-HER3 항체의 결합 정도는 예를 들어 표면 플라스몬 공명 분석(예를 드어 비아코어)에 의해 측정된 바와 같은 HER3에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 몇몇 실시태양에서, 인간 HER3에 결합하는 항체는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하(예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 인간 HER3에의 결합에 대한 결합 친화성의 KD 값을 갖는다. 몇몇 실시태양에서 본 발명에 따른 항체는 인간 HER4에 (또한) 결합하고, 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하(예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 인간 HER4에의 결합에 대한 결합 친화성의 KD 값을 갖는다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 결합 친화성의 각각의 KD 값을 각각 HER3 결합 친화성의 경우 인간 HER3의 야생형 세포외 도메인(ECD)(HER3-ECD), 및 HER4 결합 친화성의 경우 야생형 인간 HER4-ECD를 사용하여 표면 플라스몬 공명 분석에서 측정한다.
본 발명에서 "항체"란 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 다양한 항체 구조물들, 예를 들어 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 항체 단편(목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한)을 포함한다.
"항체 단편"은 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 상기 완전 항체의 일부를 포함하는 상기 완전 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이성 항체를 포함한다.
기준 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 분석에서 항원에 대한 상기 기준 항체의 결합을 50% 이상까지 차단하는 항체를 지칭하고, 환언하면, 상기 기준 항체는 경쟁 분석에서 항원에 대한 상기 항체의 결합을 50% 이상까지 차단한다. 예시적인 경쟁 분석을 본 명세서에 제공한다.
본 발명에 사용되는 "암"이란 용어는 예를 들어 폐암, 비소세포 폐(NSCL)암, 기관지폐포 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위암, 위선암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 외음부암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요관암, 신세포암종, 신우암종, 중피종, 간세포암, 담즙암, 중추신경계(CNS) 종양, 척추종양, 뇌간신경교종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 슈반종, 상의세포종, 수모세포종, 뇌수막종, 편평세포암종, 뇌하수체선종, 림프종, 림프구성 백혈병, 및 상기 암들 중 임의의 암의 난치성 버전, 또는 상기 암들 중 하나 이상의 조합일 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기와 같은 암은 유방암, 난소암, 자궁경부암, 폐암 또는 전립선암이다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기와 같은 암은 HER3 발현 또는 과발현을 추가로 특징으로 한다. 하나의 추가의 실시태양에서 본 발명은 원발 종양 및 새로운 전이의 동시 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항-HER3 항체이다.
"키메릭" 항체란 용어는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 출처 또는 종으로부터 유래하는 반면 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 출처 또는 종으로부터 유래하는 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 상기 항체의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5개의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 다수는 하위부류(아이소타입)들, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 세분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류들에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다.
본 발명에 사용되는 "세포독성제"란 용어는 세포 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포사 또는 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 비제한적으로 방사성 동위원소(예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물(예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예를 들어 소분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 및 이들의 단편 및/또는 변이체; 및 하기에 개시하는 다양한 항종양 또는 항암제를 포함한다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 "세포독성제"는 슈도모나스 외독소 A 또는 그의 변이체이다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 "세포독성제"는 아마톡신 또는 그의 변이체이다.
"효과기 기능"은 항체의 Fc-영역에 기인할 수 있는 생물 활성들을 지칭하고, 상기 활성들은 상기 항체 아이소타입에 따라 변한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
작용제, 예를 들어 약학 제형의 "유효량"은 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기에 필요한 투여량에서 및 상기에 필요한 기간 동안 상기 성취에 유효한 양을 지칭한다.
"에피토프"란 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩타이드 결정인자를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹을 포함하고, 일부 실시태양에서, 특유의 3차원 구조 특징 및/또는 특유의 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다.
본 발명에서 "Fc-영역"이란 용어는 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 한정하는데 사용된다. 상기 용어는 고유 서열 Fc-영역 및 변형 Fc-영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 상기 중쇄의 카복시-말단까지 연장된다. 그러나, 상기 Fc-영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재할 수도, 존재하지 않을 수도 있다. 본 발명에서 달리 명시되지 않는 한, 상기 Fc-영역 또는 불변 영역 중 아미노산 잔기들의 넘버링은 문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]에 개시된 바와 같은 EU 넘버링 시스템(또한 EU 표시라 칭함)에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 상응하게, 상기 HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기의 순서로 존재한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"전장 항체", "완전 항체" 및 "전체 항체"란 용어들은 본 발명에서 본 발명에 정의된 바와 같은 Fc-영역을 함유하는 중쇄를 갖거나 고유 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하는데 호환적으로 사용된다.
"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"이란 용어는 호환적으로 사용되며 상기와 같은 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하고, 이들은 계대의 수와 상관 없이 1차 형질전환된 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일할 필요는 없으며, 돌연변이를 함유할 수도 있다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손은 본 발명에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특별히 제외시킨다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시 가장 통상적으로 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터 선택된다. 일반적으로, 상기 서열의 하위그룹은 문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3]에서와 같은 하위그룹이다. 하나의 실시태양에서, VL의 경우, 상기 하위그룹은 상기 문헌[Kabat et al.,]에서와 같은 하위그룹 카파 I이다. 하나의 실시태양에서, VH의 경우, 상기 하위그룹은 상기 문헌[Kabat et al.,]에서와 같은 하위그룹 III이다.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메릭 항체를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기에서 상기 HVR(예를 들어 CDR)의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 항체의 것들에 상응하고, 상기 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화된 변이체"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 쥐 HVR을 인간 항체의 프레임워크 영역에 이식하여 "인간화된 항체"를 제조한다. 예를 들어 문헌[Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327]; 및 문헌[Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270]을 참조하시오. 상기 쥐 가변 영역 아미노산 서열을 인간 생식계열 항체 V-유전자의 컬렉션에 정렬시키고, 서열 일치성 및 상동성에 따라 분류한다. 상기 수용체 서열을 높은 전체 서열 상동성 및 임의로 또한 이미 상기 수용체 서열 중의 올바른 정규 잔기의 존재를 근거로 선택한다(문헌[Poul, M-A. and Lefranc, M-P., in "Ingenierie des anticorps banques combinatores" ed. by Lefranc, M-P. and Lefranc, G., Les Editions INSERM, 1997]을 참조하시오). 상기 생식계열 V-유전자는 중쇄의 경우 HVR3의 시작까지의 영역만, 및 경쇄의 HVR3의 중간까지만 암호화한다. 따라서, 상기 생식계열 V-유전자의 유전자들은 전체 V-도메인에 걸쳐 정렬되지 않는다. 상기 인간화된 구조물은 인간 프레임워크 1 내지 3, 쥐 HVR, 및 인간 JK4로부터 유래된 인간 프레임워크 4, 및 각각 경쇄 및 중쇄의 JH4 서열들을 포함한다. 하나의 특정한 수용체 서열을 선택하기 전에, 상기 공여 항체의 소위 정규 고리 구조를 결정할 수 있다(문헌[Morea, V., et al., Methods, Vol 20, Issue 3 (2000) 267-279]을 참조하시오). 이들 정규 고리 구조는 소위 정규 위치들에 존재하는 잔기들의 유형에 의해 결정된다. 이들 위치는 상기 HVR 영역의 (부분적으로) 외부에 놓이며, 모 (공여) 항체의 HVR 입체구조를 유지하기 위해서는 최종 구조물 중에 기능적으로 동등하게 유지되어야 한다.
본 발명에 사용되는 "초가변 영역" 또는 "HVR"이란 용어는 서열이 초가변성이고/이거나("상보성 결정 영역" 또는 "CDR") 구조적으로 한정된 고리("초가변 고리")를 형성하고/하거나, 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역들을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 중 3개(H1, H2, H3) 및 VL 중 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 본 발명에서 예시적인 HVR은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에 존재하는 초가변 고리들(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917(1987)]);
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에 존재하는 CDR(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]);
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에 존재하는 항원 접촉부(문헌[MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]); 및
(d) (a), (b) 및/또는 (c)의 조합, 예를 들어 HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3).
달리 가리키지 않는 한, 가변 도메인 중의 HVR 잔기 및 다른 잔기(예를 들어 FR 잔기)를 본 발명에서 상기 카밧(Kabat) 등에 따라 넘버링한다.
"면역접합체"는 비제한적으로 세포독성제를 포함하여, 하나 이상의 이종 분자(들), 예를 들어 혈액-뇌-장벽 셔틀 모듈에 접합된 항체이다.
"개인" 또는 "피실험자"는 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예를 들어 소, 양, 개, 고양이 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 개인 또는 피실험자는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시태양에서, 항체를 예를 들어 전기영동(예를 들어 SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되는 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제시킨다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848(2007) 79-87]을 참조하시오.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은, 통상적으로 핵산 분자를 함유하지만 상기 핵산 분자가 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재하는 세포 중에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
"항-HER3(/HER4 항체)을 암호화하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자(또는 그의 단편), 예를 들어 단일 벡터 또는 별도의 벡터 중의 상기와 같은 핵산 분자(들)를 지칭하고, 상기와 같은 핵산 분자(들)는 숙주 세포 중의 하나 이상의 위치에 존재한다.
본 발명에 사용되는 "단클론 항체"란 용어는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 획득되는 항체를 지칭한다. 즉, 상기 집단을 포함하는 개별적인 항체들은 동일하고/하거나, 상기 단클론 항체의 생성 중 발생할 수 있는 가능한 변이체(상기와 같은 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 상기 항원상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 따라서, "단클론"이라는 수식어구는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 획득된다는 항체의 특징을 가리키며, 임의의 특정한 방법에 의한 상기 항체의 생성을 요구하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체를 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 부분을 함유하는 유전자이식 동물을 사용하는 방법에 의해 제조할 수 있으며, 상기와 같은 방법 및 단클론 항체의 다른 예시적인 제조 방법들은 본 발명에 개시되어 있다.
"Mab"란 용어는 단클론 항체를 지칭한다.
"네이키드 항체"는 이종 부분(예를 들어 세포독성 부분) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 상기 네이키드 항체는 약학 제형 중에 존재할 수 있다(종래 기술이 면역접합체를 갖는 경우 포함된다).
"고유 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어 고유 IgG 항체는 다이설파이드-결합되는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-에서부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 영역(VH)(또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라 칭한다)에 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-에서부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 영역(VL)(또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라 칭한다)에 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄를 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 근거로, 카파(κ) 및 람다(λ)라 칭하는 2가지 유형 중 하나로 지정할 수 있다.
"패키지 삽입물"이란 용어는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 용량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 함유하는 상기 치료 제품의 상업적인 패키지 중에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하는데 사용된다.
기준 폴리펩타이드 서열에 관한 "아미노산 서열 일치성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우 최대의 서열 일치성 퍼센트를 성취하기 위해서, 및 상기 서열 일치성의 부분으로서 어떠한 보존적인 치환도 고려하지 않고, 서열과 도입 틈을 정렬시킨 후에, 기준 폴리펩타이드 서열 중의 아미노산 잔기들과 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기들의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 일치성 퍼센트를 측정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식들로, 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALGN 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 성취될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 서열들을 정렬시키기에 적합한 매개변수들, 예를 들어 비교하는 서열들의 전체 길이에 대해 최대의 정렬을 성취하기 위해 필요한 임의의 연산을 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서, 아미노산 서열 일치성%를 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성시킨다. 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 저술되었으며, 소스 암호는 미국 저작권 관청(미국 워싱톤 D.C. 20559 소재)에 사용자 문서와 함께 제출되었다(이때 상기 코드는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다). 상기 ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수할 수 있거나, 상기 소스 암호로부터 편집될 수 있다. 상기 ALIGN-2 프로그램을, 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여, UNIX 실행 시스템상에서 사용하기 위해 편집해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수들은 상기 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다.
ALIGN-2를 아미노산 서열 비교를 위해 사용하는 경우에, 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에의, 상기 B와의, 또는 상기 B에 대한 아미노산 서열 일치성%(이는 한편으로 주어진 아미노산 서열 B에, 상기 B와, 또는 상기 B에 대해 일정한 아미노산 서열 일치성%를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)를 하기와 같이 계산한다:
100 x X/Y 분수
상기에서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 정렬에서 상기 프로그램에 의해 일치성 합치로서 채점되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 아미노산 서열 일치성%는 B 대 A의 아미노산 서열 일치성%와 동일하지 않음을 알 것이다. 달리 구체적으로 서술되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 아미노산 서열 일치성% 값들은 상기 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에 개시된 바와 같이 획득된다.
"약학 제형"이란 용어는 제형 중에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태로 존재하고 상기 제형이 투여되는 환자에게 허용되지 않게 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 환자에게 무독성인, 활성 성분 이외의 약학 제형 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체는 비제한적으로 완충제, 부형제, 안정제, 또는 보존제를 포함한다.
본 발명에 사용되는 "HER3"이란 용어는 달리 나타내지 않는 한 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한, 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 고유 HER3을 지칭한다. 상기 용어는 세포에서의 가공으로부터 생성되는 HER3의 임의의 형태뿐만 아니라 "전장"의 가공되지 않은 HER3을 포함한다. 상기 용어는 또한 HER3의 천연 변이체, 예를 들어 이어맞추기 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 HER3의 아미노산 서열을 서열번호 3에 나타낸다. "인간 HER3"(ErbB-3, ERBB3, c-erbB-3, c-erbB3, 수용체 타이로신-단백질 키나제 erbB-3, 서열번호 3)은, HER1(또한 EGFR로서 공지됨), HER2 및 HER4를 또한 포함하는 수용체 타이로신 키나제의 상피 성장인자 수용체(EGFR)의 일원을 암호화한다(문헌[Kraus, M.H. et al, PNAS 86 (1989) 9193-9197]; 문헌[Plowman, G.D. et al, PNAS 87 (1990) 4905-4909]; 문헌[Kraus, M.H. et al, PNAS 90 (1993) 2900-2904]). 원형의 상피 성장인자 수용체처럼, 상기 막관통 수용체 HER3은 세포외 리간드-결합 도메인(ECD), 상기 ECD 내의 이량체화 도메인, 막관통 도메인, 세포내 단백질 타이로신 키나제 도메인(TKD) 및 C-말단 인산화 도메인으로 이루어진다. 상기 막-결합된 단백질은 상기 세포외 도메인내에 헤레귤린(HRG) 결합 도메인을 갖지만 활성 키나제 도메인은 갖지 않는다. 따라서, 상기 단백질은 상기 리간드와 결합할 수 있지만 단백질 인산화를 통해 상기 세포내로 신호를 전달할 수 없다. 그러나, 상기 단백질은 키나제 활성을 갖는 다른 HER 그룹 구성원들과는 이종이량체를 형성한다. 이종이량체화는 상기 수용체-매개된 신호전달 경로의 활성화 및 그의 세포내 도메인의 트랜스인산화를 유도한다. HER 그룹 구성원들간의 이량체 형성은 HER3의 신호전달 가능성을 확대시키며 신호 다양화뿐만 아니라 신호 증폭을 위한 수단이다. 예를 들어 HER 그룹 구성원들 가운데에서 HER2/HER3 이종이량체는 PI3K 및 AKT 경로를 통해 가장 중요한 유사분열촉진 신호 중 하나를 유도한다(문헌[Sliwkowski M.X., et al, J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665]; 문헌[Alimandi M, et al, Oncogene. 10 (1995) 1813-1821]; 문헌[Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276 (2001) 42153-4261]; 문헌[Singer, E., J. Biol. Chem. 276 (2001) 44266-44274]; 문헌[Schaefer, K.L., Neoplasia 8 (2006) 613-622]). HER3 및 HER 수용체 그룹 및 NGR 리간드 그룹내에서의 그의 다양한 상호작용에 대한 개요에 대해서 예를 들어 문헌[G Sithanandam et al Cancer Gene Therapy (2008) 15, 413-448]을 참조하시오.
흥미롭게도, 상기 HER3 수용체는 평형 상태에서 그의 "폐쇄된 입체구조"로 존재하고, 이는 이종이량체화 HER3 베타-헤어핀 동기가 비-공유 상호작용을 통해 HER3 ECD 도메인 IV에 구속됨을 의미한다(도 1c를 참조하시오). 상기 "폐쇄된" HER3 입체구조는 특정한 HER3 헤레귤린 결합 부위에서 리간드 헤레귤린의 결합을 통해 개방될 수 있는 것으로 생각된다. 이는 HER3 ECD 도메인 I 및 도메인 III에 의해 형성된 HER3 계면에서 발생한다. 상기 상호작용에 의해, 상기 HER3 수용체가 활성화되고 그의 "개방된 입체구조"로 이동하는 것으로 여겨진다(도 1e 및 1b 및 예를 들어 문헌[Baselga, J. et al, Nat Rev Cancer 9 (2009). 463-475] 및 문헌[Desbois-Mouthon, C., et al, Gastroenterol Clin Biol 34 (2010) 255-259]을 참조하시오). 상기 개방된 입체구조에서 HER2에 의한 이종이량체화 및 트랜스신호 유도가 가능하다(도 1b를 참조하시오).
본 발명에 사용되는 "HER4"란 용어는 달리 나타내지 않는 한 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한, 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 고유 HER4를 지칭한다. 상기 용어는 세포에서의 가공으로부터 생성되는 HER4의 임의의 형태뿐만 아니라 "전장"의 가공되지 않은 HER4를 포함한다. 상기 용어는 또한 HER4의 천연 변이체, 예를 들어 이어맞추기 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 HER4의 아미노산 서열을 서열번호 5에 나타낸다. "인간 HER4"(또한 ErbB-4, ERBB4, v-erb-a 적혈모구성 백혈병 바이러스 발암유전자 상동체 4, p180erbB4 조류 적혈모구성 백혈병 바이러스(v-erb-b2) 발암유전자 상동체 4로서 공지됨; 서열번호 5)는 다수의 퓨린-유사 시스테인 풍부 도메인, 타이로신 키나제 도메인, 포스포티딜이노시톨-3 키나제 결합 부위 및 PDZ 도메인 결합 동기를 갖는 I형 단일 막관통 단백질이다(문헌[Plowman G D, wt al, PNAS 90:1746-50(1993)]; 문헌[Zimonjic D B, et al, Oncogene 10:1235-7(1995)]; 문헌[Culouscou J M, et al, J. Biol. Chem. 268:18407-10(1993)]). 상기 단백질은 뉴레귤린-2 및 -3, 헤파린-결합 EGF-유사 성장인자 및 베타셀룰린에 결합하고 이들에 의해 활성화된다. 리간드 결합은 유사분열유도 및 분화를 포함한 다양한 세포 반응들을 유도한다. 다수의 단백질분해 사건은 세포질 단편 및 세포외 단편의 방출을 허용한다. 상기 유전자의 돌연변이는 암과 관련되었다. 상이한 단백질 동형들을 암호화하는 선택적 이어맞추기 변이체들이 개시되었으나; 모든 변이체가 특성화된 것은 아니다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "치료"(및 "치료하다" 및 "치료하는"과 같은 그의 문법상 어미변화)는 치료 중인 개인의 자연적인 과정을 변경시키고자 하는 임상적 중재를 지칭하고, 예방을 위해서 또는 임상적 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질병의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체를 사용하여 질병의 발생을 지연시키거나 질병의 진행을 늦춘다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이란 용어는 항원에 대한 항체의 결합과 관련된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 고유 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조들을 가지며, 이때 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들어 문헌[Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91]을 참조하시오). 단일의 VH 또는 VL 도메인이면 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱 또한, 특정 항원에 결합하는 항체를, 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별하기 위해 상기 항원에 결합하는 상기 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리시킬 수 있다(예를 들어 문헌[Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887]; 문헌[Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628]을 참조하시오).
본 발명에 사용된 바와 같은 "벡터"란 용어는 결합된 또 다른 핵산을 전파할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조물로서 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈내에 통합된 벡터를 포함한다. 몇몇 벡터는 상기 벡터가 작동적으로 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 상기와 같은 벡터를 본 발명에서 "발현 벡터"라 칭한다.
II. 조성물 및 방법
하나의 태양에서, 본 발명은 부분적으로 SlyD 스캐폴드내에 3차원 배향으로 기능적으로 존재하는 HER3 및 HER4의 베타-헤어핀(예를 들어 도 2, 및 서열번호 13 및 17 내지 24의 폴리펩타이드를 참조하시오)을 사용하여, 상기 HER3(및 HER4)의 베타-헤어핀에 특이적인 항체를 선택할 수 있었다는 발견을 기본으로 한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 인간 HER3에 결합하는(및 인간 HER4에 결합하는) 항체를 개시하고, 여기에서 상기 항체는 인간 HER3의 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(서열번호 1)의 아미노산 서열내에 결합한다(그리고, 임의로 PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(서열번호 2)의 아미노산 서열내에 결합한다).
본 발명의 항체는 예를 들어 암의 진단 또는 치료에 유용하다.
A. 예시적인 항- HER3 / HER4 항체
본 발명은 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체를 제공하고,
여기에서 상기 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-D), 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-B), 또는 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-E)
을 포함한다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체를 제공하고,
여기에서 상기 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-D)
을 포함한다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체를 제공하고,
여기에서 상기 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-B)
을 포함한다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체를 제공하고,
여기에서 상기 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-E)
을 포함한다.
본 발명은 인간 HER3에 결합하고 인간 HER4에 결합하는 단리된 항체를 제공하고,
여기에서 상기 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-D), 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-B), 또는 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-E)
을 포함한다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 인간 HER3에 결합하고 인간 HER4에 결합하는 단리된 항체를 제공하고,
여기에서 상기 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-D)
을 포함한다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 인간 HER3에 결합하고 인간 HER4에 결합하는 단리된 항체를 제공하고,
여기에서 상기 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-B)
을 포함한다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 인간 HER3에 결합하고 인간 HER4에 결합하는 단리된 항체를 제공하고,
여기에서 상기 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-E)
을 포함한다.
또 다른 태양에서, 항-HER3 항체를 제공하고, 여기에서 상기 항체는 하기를 포함하는 항체에 대해 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 적어도 95%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다:
여기에서, 상기 항체는 각각
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-D), 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-B), 또는 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-E)
을 포함하고,
상기 항체는 하기의 성질들 중 하나 이상을 갖는다: 상기 항체는
a) 서열번호 13 TtSlyD-FKBP-Her3,
서열번호 17 TtSlyDcas-Her3,
서열번호 18 TtSlyDcys-Her3,
서열번호 19 TgSlyDser-Her3, 및
서열번호 20 TgSlyDcys-Her3
으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드 중에 포함된 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(서열번호 1)의 아미노산 서열내에 결합하고;
b) 서열번호 13 TtSlyD-FKBP-Her3,
서열번호 17 TtSlyDcas-Her3,
서열번호 18 TtSlyDcys-Her3,
서열번호 19 TgSlyDser-Her3, 및
서열번호 20 TgSlyDcys-Her3
으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드에 결합하고;
c) HER3/HER2 공침전 분석에서 MCF-7 세포에서의 HER3/HER2 이종이량체의 이종이량체화를 억제하고;
d) 서열번호 21 TtSlyDcas-Her4,
서열번호 22 TtSlyDcys-Her4,
서열번호 23 TgSlyDser-Her4, 및
서열번호 24 TgSlyDcys-Her4
로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드 중에 포함된 PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(서열번호 2)의 아미노산 서열내에 결합하고;
e) 서열번호 21 TtSlyDcas-Her4,
서열번호 22 TtSlyDcys-Her4,
서열번호 23 TgSlyDser-Her4, 및
서열번호 24 TgSlyDcys-Her4
로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드에 결합하고;
f) 1가 Fab 단편으로서, 2가의 모 전장 항체에 비해(MCF-7 세포에서 HER3 인산화 억제 분석에서의 동몰량으로 비교시) 동일하거나 더 높은 생물학적 활성을 나타내고;
g) 생체내에서 종양성장 억제 활성을 나타내고;
h) HER3-ECD에, 1 x 10-8 M 이하의 KD 값(하나의 실시태양에서 1 x 10-8 M 내지 1 x 10-13 M의 KD 값; 하나의 실시태양에서 1 x 10-9 M 내지 1 x 10-13 M의 KD 값)의 친화성으로 결합하고;
i) HER4-ECD에, 1 x 10-8 M 이하의 KD 값(하나의 실시태양에서 1 x 10-8 M 내지 1 x 10-13 M의 KD 값; 하나의 실시태양에서 1 x 10-9 M 내지 1 x 10-13 M의 KD 값)의 친화성으로 결합하고;
j) 여기에서 상기 항체는 VYNKLTFQLEP(서열번호 43)로 이루어진 폴리펩타이드 또는 VYNPTTFQLE(서열번호 44)로 이루어진 폴리펩타이드에 결합하고;
k) 여기에서 상기 항체는 VYNKLTFQLEP(서열번호 43)로 이루어진 폴리펩타이드에 결합하고/하거나;
l) 여기에서 상기 항체는 VYNPTTFQLE(서열번호 44)로 이루어진 폴리펩타이드에 결합한다.
하나의 바람직한 실시태양에서 상기 항체 단편은 Fab 단편이다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 항체는 전장 IgG1 또는 IgG4 항체이다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 항체 단편(상기 단편 중에 불변 도메인이 함유되는 경우에)은 인간 기원의 불변 도메인(인간 불변 도메인)을 포함한다. 각각의 인간 불변 도메인을 포함하는 본 발명의 의미내의 전형적인 인간 불변 영역은 서열번호 53 내지 서열번호 58의 아미노산 서열들(부분적으로 돌연변이를 포함한다)을 갖는다.
1. 항체 친화성
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하(예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리상수 KD를 갖는다.
하나의 실시태양에서, KD를 약 10 응답 단위(RU)에서 고정화된 항원 CM5 칩으로 25 ℃에서 비아코어(등록상표)를 사용하는 표면 플라스몬 공명 분석을 사용하여 측정한다. 간단히, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어 인코포레이티드)을 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(ECD) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 4.8)로 5 ㎍/㎖(약 0.2 μM)로 희석한 후에 5 ㎕/분의 유량으로 주입하여 약 10 응답 단위(RU)의 결합된 단백질을 성취한다. 상기 항원의 주입에 이어서, 1 M 에탄올아민을 주입하여 반응되지 않은 그룹들을 차단한다. 동역학적 측정을 위해서, Fab의 2배 연속 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)을 25 ℃에서 약 25 ㎕/분의 유량으로 0.05% 폴리솔베이트 20(트윈-20(상표)) 계면활성제(PBST)와 함께 PBS 중에서 주입한다. 결합률(kon 또는 ka) 및 해리율(koff 또는 kd)을 결합 및 해리 센서그램을 동시에 정합시킴으로써 간단한 1 대 1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 KD를 kd/ka(koff/kon) 비로서 계산한다(예를 들어 문헌[Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293(1999) 865-881]을 참조하시오). 상기 온-율(on-rate)이 상기 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 상기 온-율을 분광계, 예를 들어 스탑-플로우(stop-flow) 구비된 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments) 또는 교반식 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO(상표) 분광광도계(써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정되는 바와 같이 증가하는 농도의 항원의 존재하에서 25 ℃에서 PBS(pH 7.2) 중의 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 형광 방출 강도(여기 = 295 ㎚; 방출 = 340 ㎚, 16 ㎚ 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기법을 사용하여 측정할 수 있다.
2. 항체 단편
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 비제한적으로 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기에 개시되는 다른 단편들을 포함한다. 몇몇 항체 단편의 리뷰를 위해서, 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]을 참조하시오. scFv 단편의 리뷰를 위해서 예를 들어 문헌[Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315]; 또한 WO 93/16185; 미국특허 제 5,571,894 호 및 미국특허 제 5,587,458 호를 참조하시오. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의에 대해서, 미국특허 제 5,869,046 호를 참조하시오.
다이아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어 EP 0 404 097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]; 및 문헌[Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448]을 참조하시오. 트라이아바디 및 테트라바디가 또한 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134)]에 개시되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부 또는 경쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이다. 몇몇 실시태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(문헌[Domantis, Inc., Waltham, MA]; 예를 들어 미국특허 제 6,248,516 B1 호를 참조하시오).
항체 단편을 본 발명에 개시된 바와 같은 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 완전 항체의 단백질분해 절단뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어 에스케리키아 콜라이 또는 파지)에 의한 생산에 의해 제조할 수 있다.
하나의 바람직한 실시태양에서 상기 항체 단편은 Fab 단편이다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 항체 단편(불변 도메인이 상기 단편 중에 함유되는 경우에)은 인간 기원의 불변 도메인(인간 불변 도메인)을 포함한다.
3. 키메릭 및 인간화된 항체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체는 키메릭 항체이다. 몇몇 키메릭 항체들이 예를 들어 미국특허 제 4,816,567 호; 및 문헌[Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855)]에 개시되어 있다. 일례로, 키메릭 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메릭 항체는 상기 부류 또는 하위부류가 모 항체의 부류 또는 하위부류로부터 변화된 "부류 변환된(switched)" 항체이다. 키메릭 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 키메릭 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성은 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들어 CDR(또는 그의 부분들)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 그의 부분들)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 바람직한 실시태양에서 인간화된 항체는 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 일부 실시태양에서, 인간화된 항체 중의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 개선시키기 위해서 비-인간 항체(예를 들어 HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화된 항체 및 그의 제조 방법들이 예를 들어 문헌[Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633]에 리뷰되어 있으며, 예를 들어 문헌[Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329]; 문헌[Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]; 미국특허 제 5,821,337 호, 미국특허 제 7,527,791 호, 미국특허 제 6,982,321 호 및 미국특허 제 7,087,409 호; 문헌[Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34](SDR(a-CDR) 이식을 개시함); 문헌[Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498]("재표면화"를 개시함); 문헌[Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60]("FR 셔플링"을 개시함); 및 문헌[Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68] 및 문헌[Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260](FR 셔플링으로의 "유도된 선택" 접근을 개시함), 문헌[Morea, V. et al., Methods, Vol 20, Issue 3(2000)267-279] 및 WO 2004/006955(정규 구조를 통한 접근)에 추가로 개시되어 있다.
4. 인간 항체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 기법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 인간 항체는 문헌[van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374] 및 문헌[Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459]에 일반적으로 개시되어 있다.
인간 항체를, 항원 공격에 응답하여 완전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 완전 항체를 생성하도록 변형시킨 유전자이식 동물에게 투여함으로써 제조할 수 있다. 상기와 같은 동물은 전형적으로는 인간 면역글로불린 유전자좌의 일부 또는 전부를 함유하고, 상기 자리는 내인성 면역글로불린 유전자좌로 대체되거나 염색체외에 존재하거나 상기 동물의 염색체내로 무작위로 삽입된다. 상기와 같은 유전자이식 마우스에서, 상기 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 유전자이식 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법의 리뷰에 대해서, 문헌[Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125]을 참조하시오. 또한 예를 들어 제노마우스(XENOMOUSE)(상표) 기술을 개시하는 미국특허 제 6,075,181 호 및 미국특허 제 6,150,584 호; 휴맵(HUMAB)(등록상표) 기술을 개시하는 미국특허 제 5,770,429 호; 케이엠 마우스(K-M MOUSE)(등록상표) 기술을 개시하는 미국특허 제 7,041,870 호; 및 벨로시마우스(VELOCIMOUSE)(등록상표) 기술을 개시하는 미국특허공개 제 2007/0061900 호를 참조하시오. 상기와 같은 동물들로부터 생성된 완전 항체로부터의 인간 가변 영역들을 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과의 조합에 의해 추가로 변형시킬 수도 있다.
인간 항체를 또한 하이브리도마-기재 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 단클론 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 개시되었다(예를 들어 문헌[Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005]; 문헌[Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63]; 및 문헌[Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95]을 참조하시오). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 또한 문헌[Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562]에 개시되어 있다. 추가의 방법은 예를 들어 미국특허 제 7,189,826 호(하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체의 생성을 개시한다) 및 문헌[Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268](인간-인간 하이브리도마를 개시한다)에 개시된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트라이오마(Trioma) 기술)이 또한 문헌[Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937] 및 문헌[Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191]에 개시되어 있다.
인간 항체를 또한, 인간-유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성시킬 수 있다. 이어서 상기와 같은 가변 도메인 서열을 목적하는 인간 불변 도메인과 병용할 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기법을 하기에 개시한다.
5. 라이브러리- 유래된 항체
본 발명의 항체를 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 선별함으로써 단리할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 상기와 같은 라이브러리를 목적하는 결합 특성을 갖는 항체들에 대해 선별하는 다양한 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기와 같은 방법들은 예를 들어 문헌[Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37]에 리뷰되어 있으며 예를 들어 문헌[McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554]; 문헌[Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628]; 문헌[Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597]; 문헌[Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175]; 문헌[Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310]; 문헌[Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093]; 문헌[Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472]; 및 문헌[Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132]에 추가로 개시되어 있다.
몇몇 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리를 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝하고 파지 라이브러리에 무작위로 재조합시키고, 이어서 상기 라이브러리를 문헌[Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455]에 개시된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 선별할 수 있다. 파지는 전형적으로 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 표시한다. 면역된 출처로부터의 라이브러리들은 하이브리도마 제작의 필요 없이 면역원에 대한 고-친화성 항체를 제공한다. 한편으로, 미경험 레퍼토리를 문헌[Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734]에 개시된 바와 같이 클로닝하여(예를 들어 인간으로부터) 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기-항원에 대한 단일 출처의 항체를 제공할 수 있다. 최종적으로, 미경험 라이브러리를 또한, 줄기세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내에서 재배열을 수행함으로써 합성적으로 제조할 수 있다(문헌[Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388]에 개시되어 있다). 인간 항체 파지 라이브러리를 개시하는 특허 공보들은 예를 들어 미국특허 제 5,750,373 호, 및 미국특허공개 제　2005/0079574 호, 제　2005/0119455 호, 제　2005/0266000 호, 제　2007/0117126 호, 제　2007/0160598 호, 제　2007/0237764 호, 제　2007/0292936 호 및 제　2009/0002360 호를 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본 발명에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다중특이성 항체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예를 들어 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 결합 특이성 중 하나는 HER3/HER4에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 이중특이성 항체를 또한 HER3 또는 HER4를 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화시키기 위해 사용할 수 있다. 이중특이성 항체를 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조할 수 있다.
다중특이성 항체의 제조 기법은 비제한적으로 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현(문헌[Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540], WO 93/08829, 및 문헌[Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659]을 참조하시오), 및 "구멍에 손잡이(knob-in-hole)" 공학(예를 들어 미국특허 제 5,731,168 호를 참조하시오)을 포함한다. 다중특이성 항체를 또한, 항체 Fc-이종이량체성 분자의 제조를 위해 정전기적 조향(steering) 효과를 조작하고(WO 2009/089004); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시키고(예를 들어 미국특허 제 4,676,980 호, 및 문헌[Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83]을 참조하시오); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이성 항체를 생성시키고(예를 들어 문헌[Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553]을 참조하시오); 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 "다이아바디" 기술을 사용하고(예를 들어 문헌[Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448]을 참조하시오); 단쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하고(예를 들어 문헌[Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374]을 참조하시오); 예를 들어 문헌[Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69]에 개시된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조함으로써 제조할 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본 발명에 포함된다(예를 들어 미국특허공개 제　2006/0025576 호를 참조하시오).
본 발명에서 항체 또는 단편은 또한 HER3뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들어 미국특허공개 제 2008/0069820 호를 참조하시오).
본 발명에서 항체 또는 단편은 또한 WO　2009/080251, WO　2009/080252, WO　2009/080253, WO　2009/080254, WO　2010/112193, WO　2010/115589, WO　2010/136172, WO　2010/145792, 및 WO 2010/145793에 개시된 다중특이성 항체들을 포함한다.
7. 항체 변이체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체를 고려한다. 예를 들어, 상기 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질들을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체를, 상기 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 적합한 변형을 도입시키거나, 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 변형은 예를 들어 상기 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기들의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 잔기들의 삽입 및/또는 상기 서열내에서 잔기들의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 최종 구조물에 도달하도록 수행할 수 있으나, 단 최종 구조물은 목적하는 특성, 예를 들어 항원-결합성을 가져야 한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체를 제공한다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환을 표 1에서 "바람직한 치환"의 제목하에 나타낸다. 보다 실질적인 변화를 표 1에 "예시적인 치환"의 제목하에, 및 하기에 추가로 개시하는 바와 같이 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 제공한다. 아미노산 치환을 관심 항체에 도입시키고 생성물을 목적하는 활성, 예를 들어 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별할 수 있다.
[표 1]
Figure pct00001
아미노산들을 공통 측쇄 성질에 따라 분류할 수도 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적인 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류에 대해 교환함을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 모 항체(예를 들어 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시킴을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택되는 상기 생성되는 변이체(들)는 모 항체에 비해 몇몇 생물학적 성질들(예를 들어 증가된 친화성, 감소된 면역원성)의 변형(예를 들어 개선)을 갖고/갖거나, 상기 모 항체의 몇몇 생물학적 성질들을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체이며, 상기 항체를 편의상, 예를 들어 파지 디스플레이-기재 친화성 성숙 기법, 예를 들어 본 발명에 개시된 것들을 사용하여 생성시킬 수 있다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고 변이체 항체를 파지상에 표시하고 특정한 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화성)에 대해 선별한다.
변경(예를 들어 치환)을, 예를 들어 항체 친화성을 개선시키기 위해 HVR에서 수행할 수 있다. 상기와 같은 변경을 HVR "핫스폿", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 암호화된 잔기(예를 들어 문헌[Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196]을 참조하시오), 및/또는 SDR(a-CDR)에서 수행할 수 있으며, 이때 생성되는 변형 VH 또는 VL을 결합 친화성에 대해 시험한다. 2차 라이브러리로부터의 제작 및 재선택에 의한 친화성 성숙이 예를 들어 문헌[Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37]에 개시되었다. 친화성 성숙의 일부 실시태양에서, 다양한 방법들 중 임의의 방법(예를 들어 오류유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오타이드-지시된 돌연변이유발)에 의해 성숙화용으로 선택된 가변 유전자내에 다양성을 도입시킨다. 이어서 2차 라이브러리를 생성시킨다. 이어서 상기 라이브러리를 목적하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 선별한다. 다양성을 도입시키는 또 다른 방법은 HVR-지시된 접근법을 포함하고, 상기 접근법에서 다수의 HVR 잔기들(예를 들어 한 번에 4 내지 6개의 잔기)이 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기를 예를 들어 알라닌 주사 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 확인할 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3을 종종 표적화한다.
몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이, 상기와 같은 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어 본 발명에 제공되는 바와 같은 보존적 치환)을 HVR에서 수행할 수 있다. 상기와 같은 변경은 HVR "핫스폿" 또는 SDR의 밖에서 있을 수 있다. 상기에 제공된 변형 VH 및 VL 서열의 몇몇 실시태양에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법을 문헌[Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244(1989) 1081-1085]에 개시된 바와 같이 "알라닌 주사 돌연변이유발"이라 칭한다. 상기 방법에서, 표적 잔기들(예를 들어 하전된 잔기, 예를 들어 arg, asp, his, lys 및 glu)의 잔기 또는 그룹이 확인되며 이들을, 상기 항원과 항체와의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 치환시킨다. 추가의 치환을 상기 아미노산 위치들에 도입시켜 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 항체와 항원간의 접촉 지점들을 확인하기 위한 상기 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기와 같은 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기들을 치환용 후보로서 표적화하거나 제거할 수 있다. 변이체를, 상기 변이체가 목적하는 성질을 함유하는지를 측정하기 위해서 선별할 수도 있다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드까지의 길이 범위에 이르는 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기들의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소(예를 들어 ADEPT를 위한) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드에의 항체의 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체를 상기 항체가 글리코실화되는 정도가 증가하거나 감소하도록 변경시킨다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실을 편의상 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 수행할 수 있다.
상기 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 상기에 부착된 탄수화물을 변경시킬 수도 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 고유 항체는 전형적으로 상기 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 이중촉각 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들어 문헌[Wright, A. and Morrison, S.L., et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조하시오). 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물들, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산뿐만 아니라 상기 이중촉각 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 중 GlcNAc에 부착된 퓨코스를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체에서 상기 올리고사카라이드의 변형을 몇몇 개선된 성질들을 갖는 항체 변이체를 생성시키기 위해 수행할 수도 있다.
하나의 실시태양에서, Fc 영역에 부착된(직접 또는 간접적으로) 퓨코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체를 제공한다. 예를 들어, 상기와 같은 항체 중 퓨코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 상기 퓨코스의 양을, 예를 들어 WO 2008/077546에 개시된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정된 바와 같이 Asn297에 부착된 모든 당구조물들(예를 들어 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조물)의 합에 대해, Asn297에서 상기 당 쇄 중 퓨코스의 평균량을 계산함으로써 측정한다. Asn297은 상기 Fc 영역 중 대략 297번(Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라진 잔기를 지칭하나; Asn297은 또한 297번 위치의 상류 또는 하류 약 ±3 아미노산에, 즉 항체 중 작은 서열 변동으로 인해 294 내지 300번 위치에 위치할 수도 있다. 상기와 같은 퓨코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어 US 2003/0157108; US 2004/0093621을 참조하시오. "탈퓨코실화된" 또는 "퓨코스-결핍된" 항체 변이체에 관한 발행물들의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; 문헌[Okazaki, A. et al. J. Mol . Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 문헌[Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87: 614-622 (2004)]. 탈퓨코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 퓨코실화 결함 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka, J. et al . Arch . Biochem . Biophys . 249:533-545 (1986)]; US 2003/0157108; 및 WO　2004/056312(특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-퓨코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들어 문헌[Yamane-Ohnuki, N. et al . Biotech . Bioeng . 87: 614-622 (2004)]; 문헌[Kanda, Y. et al., Biotechnol . Bioeng ., 94:680-688 (2006)]; 및 WO 2003/085107을 참조하시오)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중촉각 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 항체 변이체를 추가로 제공한다. 상기와 같은 항체 변이체는 감소된 퓨코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체의 예는 예를 들어 WO 2003/011878; 미국특허 제 6,602,684 호; 및 US 2005/0123546에 개시되어 있다. 상기 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 중에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체를 또한 제공한다. 상기와 같은 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 개시되어 있다.
c) Fc -영역 변이체
몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본 발명에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입시켜 Fc 영역 변이체를 생성시킬 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 일부(전부는 아닌) 효과기 기능(이는 항체 변이체를, 생체내에서 항체의 반감기가 중요하지만 몇몇 효과기 기능(예를 들어 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 유해한 용도에 바람직한 후보로 만든다)을 갖는 항체 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어 Fc 수용체(FcR) 결합 분석을, 항체가 FcγR 결합은 없지만(따라서, ADCC 활성이 없는 듯하다) FcRn 결합 능력은 유지함을 확실히 하기 위해 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포, NK 세포는 Fc(RIII 만을 발현하는 반면, 단세포는 Fc감마RI, Fc감마RII 및 Fc감마RIII을 발현한다. 조혈세포상의 FcR 발현이 문헌[Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu . Rev . Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464 페이지, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적인 예들이 미국특허 제 5,500,362 호(예를 들어 문헌[Hellstrom, I. et al . Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 83:7059-7063 (1986)]을 참조하시오) 및 문헌[Hellstrom, I et al ., Proc . Nat'l Acad. Sci . USA 82:1499-1502 (1985)]; 미국특허 제 5,821,337 호(문헌[Bruggemann, M. et al ., J. Exp . Med . 166:1351-1361 (1987)]을 참조하시오)에 개시되어 있다. 한편으로, 비-방사성 분석 방법을 사용할 수도 있다(예를 들어 유식 세포측정을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 참조하시오). 상기와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes R., et al. Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수도 있다. C1q 결합 분석을 또한, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서, CDC 활성이 없음을 확인하기 위해서 수행할 수 있다. 예를 들어 WO　2006/029879 및 WO　2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조하시오. 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 분석을 수행할 수도 있다(예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro, H. et al ., J. Immunol . Methods 202:163-171 (1996)]; 문헌[Cragg, M.S. et al ., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)]을 참조하시오). FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정을 또한 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다(예를 들어 문헌[Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18:1759-1769 (2006)]을 참조하시오).
감소된 효과기 기능을 갖는 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국특허 제 6,737,056 호). 상기와 같은 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체(알라닌으로의 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함(미국특허 제 7,332,581 호))를 포함한다.
FcR에 대한 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 몇몇 항체 변이체들이 개시되어 있다(예를 들어 미국특허 제 6,737,056 호; WO 2004/056312, 및 문헌[Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 (2001)]을 참조하시오).
몇몇 실시태양에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 상기 Fc 영역의 298, 333 및/또는 334번 위치(잔기의 EU 넘버링)의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시태양에서, 예를 들어 미국특허 제 6,194,551 호, WO　99/51642, 및 문헌[Idusogie, E.E. et al . J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000)]에 개시된 바와 같이, Fc 영역에서, 변경된(즉 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적인 세포독성(CDC)을 생성시키는 변경을 수행한다.
증가된 반감기 및 신생아 Fc 수용체(RcRn)(모 IgG의 태아로의 전달을 맡고 있다)(문헌[Guyer, R.L. et al ., J. Immunol . 117:587-593 (1976)] 및 문헌[Kim J.K. et al ., J. Immunol . 24:2429-2434 (1994)])에의 개선된 결합을 갖는 항체들이 US 2005/0014934에 개시되어 있다. 상기 항체들은 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 상기 Fc 영역을 포함한다. 상기와 같은 Fc 변이체들은 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 및 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434에서의 치환(미국특허 제 7,371,826 호)을 갖는 것들을 포함한다.
또한 Fc 영역 변이체의 다른 예들에 관한 문헌[Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322:738-740 (1988)]; 미국특허 제 5,648,260 호; 미국특허 제 5,624,821 호; 및 WO 94/29351을 참조하시오.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
몇몇 실시태양에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "티오MAb"를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 치환된 잔기는 상기 항체의 접근 가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 상기 항체의 접근 가능한 부위에 위치되며 이를 사용하여 본 발명에 추가로 개시된 바와 같이 상기 항체를 다른 부분, 예를 들어 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 접합시켜 면역접합체를 생성시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 하기의 잔기들 중 임의의 하나 이상을 시스테인으로 치환시킬 수도 있다: 경쇄의 V205(카밧 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체를 예를 들어 미국특허 제 7,521,541 호에 개시된 바와 같이 생성시킬 수 있다.
e) 항체 유도체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체를 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 추가적인 비단백질성 부분을 함유하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 부분은 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수 중 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며 분지되거나 분지되지 않을 수도 있다. 상기 항체에 부착된 중합체들의 수는 변할 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 부착되는 경우, 이들 중합체는 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 상기 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형을 비제한적으로, 개선시키고자 하는 상기 항체의 특정한 성질, 상기 항체 유도체를 한정된 조건하에서 치료법에 사용할 것인지의 여부 등을 포함한 고려사항을 기준으로 결정할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 부분의 접합체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 비단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 비제한적으로 통상적인 세포에는 해롭지 않지만 상기 비단백질성 부분을 상기 항체-비단백질성 부분에 근접한 세포를 죽이는 온도로 가열하는 파장을 포함한다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체를 예를 들어 미국특허 제 4,816,567 호에 개시된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 개시된 항-HER3(및 항-HER4) 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 상기와 같은 핵산은 항체(예를 들어 상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)의 VH를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기와 같은 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어 발현 벡터)를 제공한다. 추가의 실시태양에서, 상기와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 상기 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들어 이들 벡터로 형질전환되었다). 하나의 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 진핵생물, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프양 세포(예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 하나의 실시태양에서, 항-HER3/HER4 항체의 제조 방법을 제공하고, 여기에서 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건하에서, 상기에 제공된 바와 같은, 상기 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 임의로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수함을 포함한다.
항-HER3(및 항-HER4) 항체의 재조합 생성을 위해서, 예를 들어 상술한 바와 같은, 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 상기와 같은 핵산을 통상적인 과정을 사용하여(예를 들어 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용함으로써) 쉽게 단리하고 서열분석할 수 있다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 발명에 개시된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체를, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 세균에서 생성시킬 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 대해서, 예를 들어 미국특허 제 5,648,237 호, 미국특허 제 5,789,199 호 및 미국특허 제 5,840,523 호를 참조하시오. (또한 에스케리키아 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 개시하는 문헌[Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254]을 참조하시오). 발현 후에, 상기 항체를 용액 분획 중 세균 세포 페이스트로부터 단리하고 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 섬유상 진균 또는 효모, 예를 들어 글리코실화 경로가 "인간화되어" 부분적인 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산하는 진균 및 효모 균주가 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414]; 및 문헌[Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215]을 참조하시오.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포이다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,959,177 호, 미국특허 제　6,040,498 호, 미국특허 제 6,420,548 호, 미국특허 제 7,125,978 호 및 미국특허 제　6,417,429 호(유전자이식 식물에서 항체를 생성시키기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)(상표) 기술을 개시한다)를 참조하시오.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 현탁액에서 증식시키기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통(예를 들어 문헌[Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74]에 개시된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들어 문헌[Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252]에 개시된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간세포(BRL 3A); 인간 폐세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어 문헌[Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68]에 개시된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포(문헌[Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220]); 및 골수종 세포주, 예를 들어 Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 몇몇 포유동물 숙주 세포주에 대한 리뷰에 대해서, 예를 들어 문헌[Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268]을 참조하시오.
C. 분석
본 발명에 제공된 항-HER3(및 항-HER4) 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 분석에 의해 그의 물리/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인하거나, 선별하거나, 특성화할 수 있다.
인간 HER3에 결합하는(및 인간 HER4에 결합하는) 항체를 선택하는 방법을 개시하고, 여기에서 상기 항체는 인간 HER3의 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(서열번호 1)의 아미노산 서열내에 결합하고(그리고 인간 HER4의 PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(서열번호 2)의 아미노산 서열내에 결합하고); 여기에서
a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는,
서열번호 13 TtSlyD-FKBP-Her3,
서열번호 17 TtSlyDcas-Her3,
서열번호 18 TtSlyDcys-Her3,
서열번호 19 TgSlyDser-Her3, 및
서열번호 20 TgSlyDcys-Her3
으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드, 및
b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는,
서열번호 21 TtSlyDcas-Her4,
서열번호 22 TtSlyDcys-Her4,
서열번호 23 TgSlyDser-Her4, 및
서열번호 24 TgSlyDcys-Her4
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드
를, 상기 a)의 하나 이상의 폴리펩타이드 및 상기 b)의 하나 이상의 폴리펩타이드 모두에 대해 결합을 나타내고,
이에 의해 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(서열번호 1)의 아미노산 서열내(인간 HER3 내)(및 PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(서열번호 2)의 아미노산 서열내(인간 HER4 내))에 결합하는 항체를 선택하는, 항체의 선택(결합 분석)에 사용한다.
하나의 실시태양에서 상기 선택 방법은 상기 선택된 항체를
서열번호 14 TtSlyD-야생형,
서열번호 15 TtSlyDcas, 및
서열번호 16 TgSlyDΔIF
로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드(상기 폴리펩타이드에의 결합에 대해 시험된)로 대조염색하여 상기 선택된 항체가 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(서열번호 1)의 아미노산 서열 또는 PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하지 않는 폴리펩타이드 스캐폴드에 결합하지 않음을 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
1. 결합 분석 및 다른 분석
하나의 태양에서, 본 발명의 항체를 예를 들어 공지된 방법, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블럿, 및 표면 플라스몬 공명(예를 들어 비아코어) 등에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다.
또 다른 태양에서, 경쟁 분석을 사용하여 HER3 및/또는 HER4에의 결합에 대해 M-05-74와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기와 같은 경쟁 항체는 M-05-74에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들어 선형 또는 입체구조 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프의 지도화에 대한 상세한 예시적인 방법들이 문헌[Morris, G.E. (ed.), Epitope Mapping Protocols, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996)]에 제공되어 있다. 추가의 방법들을 셀스폿(CellSpot)(상표) 기술을 사용하는 실시예 4에 상세히 개시한다.
예시적인 경쟁 분석에서, 고정화된 HER3 또는 HER4를, HER3 또는 HER4 각각에 결합하는 제1 표지된 항체(예를 들어 M-05-74), 및 HER3 또는 HER4에의 결합에 대해 상기 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 시험하고자 하는 표지되지 않은 제2 항체를 포함하는 용액 중에서 배양한다. 상기 제2 항체는 하이브리도마 상등액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 HER3 또는 HER4를, 상기 표지된 제1 항체는 포함하지만 상기 표지되지 않은 제2 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 배양한다. 상기 제1 항체의 HER3 또는 HER4에의 결합을 허용하는 조건하에서 배양 후에 과잉의 결합되지 않은 항체를 제거하고, 고정화된 HER3 또는 HER4와 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 HER3 또는 HER4와 결합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소하는 경우, 이는 상기 제2 항체가 HER3 또는 HER4에의 결합에 대해서 상기 제1 항체와 경쟁함을 암시한다(예를 들어 문헌[Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)]을 참조하시오).
2. 활성 분석
하나의 태양에서, 생물학적 활성을 갖는 항-HER3 항체를 확인하기 위한 분석을 제공한다. 생물학적 활성은 예를 들어 HER3 인산화의 억제, 암세포를 발현하거나 과발현하는 HER3 및/또는 HER4의 암세포 증식 억제, HER3/HER2 이종이량체화의 억제, FACS 분석을 통한 (시간-의존적인) 내면화, 암세포를 발현하거나 과발현하는 이종이식된 HER3 및/또는 HER4를 갖는 이종이식 동물(예를 들어 마우스 또는 래트) 모델의 생체내 종양 성장 억제를 포함한다. 생체내 및/또는 시험관내에서 상기와 같은 생물학적 활성을 갖는 항체들을 또한 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항체를 상기와 같은 생물학적 활성에 대해 시험한다. 명시된 생물학적 활성에 대한 예시적인 시험관 또는 생체내 분석을 실시예 2e, 3, 5 내지 9 및 11에 개시한다.
D. 면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예를 들어 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본 발명에 개시된 항-HER3/HER4 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 면역접합체는, 항체가 하나 이상의 약물, 예를 들어 비제한적으로 메이탄시노이드(미국특허 제　5,208,020 호, 미국특허 제 5,416,064 호 및 EP 0 425 235 B1를 참조하시오); 아우리스타틴, 예를 들어 모노메틸 아우리스타틴 약물 부분 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국특허 제 5,635,483 호, 미국특허 제 5,780,588 호, 및 미국특허 제 7,498,298 호); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체(미국특허 제 5,712,374 호, 미국특허 제 5,714,586 호, 미국특허 제 5,739,116 호, 미국특허 제 5,767,285 호, 미국특허 제 5,770,701 호, 미국특허 제 5,770,710 호, 미국특허 제 5,773,001 호, 및 미국특허 제 5,877,296 호; 문헌[Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342]; 및 문헌[Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928]을 참조하시오); 안트라사이클린, 예를 들어 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌[Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523]; 문헌[Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362]; 문헌[Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721]; 문헌[Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834]; 문헌[Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532]; 문헌[King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343]; 및 미국특허 제 6,630,579 호를 참조하시오); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예를 들어 도세탁셀, 패클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065를 포함하는 약물에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다.
또 다른 실시태양에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편, 예를 들어 비제한적으로 디프테리아-A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류라이테스 포르디이 단백질, 다이안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센에 접합된 본 발명에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 면역접합체는 슈도모나스 외독소 A 또는 그의 변이체에 접합된 본 발명에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다. 슈도모나스 외독소 A 또는 그의 변이체는 예를 들어 WO 2011/32022, WO 2009/32954, WO 2007/031741, WO 2007/016150, WO 2005/052006 및 문헌[Liu W, et al, PNAS 109 (2012) 11782-11787]에 개시되어 있다.
또 다른 실시태양에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성 접합체를 형성하는 본 발명에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소들을 방사성 접합체의 생성에 이용할 수 있다. 예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 상기 방사성 접합체가 검출에 사용되는 경우 상기 접합체는 섬광조영술 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 TC99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명(NMR) 영상화(또한 자기공명 영상화, MRI로서 공지됨)용 스핀 표지, 예를 들어 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체를 a) 재조합 발현 기법(예를 들어 에스케리키아 콜라이에서 Fab 또는 Fv 항체 단편에 융합된 아미노산 서열 기재 독소의 발현을 위해서)을 사용하거나 b) 폴리펩타이드 커플링 기법(Fab 또는 Fv 항체 단편에의 아미노산 서열 기재 독소의 분류효소 기재 커플링과 같은)을 사용하거나 c) 다양한 이중기능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이중작용성 유도체(예를 들어 다이메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스터(예를 들어 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트(예를 들어 톨루엔 2,6-다이아이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌[Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104]에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-아이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(MX-DTPA)은 상기 항체에의 방사성 핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026을 참조하시오. 상기 링커는 세포 중의 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌[Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131]; 미국특허 제 5,208,020 호)를 사용할 수 있다.
상기 면역접합체 또는 ADC는 가교결합제 시약, 예를 들어 비제한적으로 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(숙신이미딜-4-(비닐설폰)벤조에이트)(이들은 예를 들어 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc.), 미국 일리노이주 록빌 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있다)로 제조된 상기와 같은 접합체가 본 발명에서 명백히 고려된다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
몇몇 실시태양에서, 본 발명에서 제공된 항-HER3(및 항-HER4) 항체 중 어느 하나는 생물학적 샘플 중의 HER3 및/또는 HER4 각각의 존재를 검출하기에 유용하다. 본 발명에 사용되는 "검출하는"이란 용어는 정량적인 또는 정성적인 검출을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들어 종양 조직을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-HER3(및 항-HER4) 항체를 제공한다. 추가의 태양에서, 생물학적 샘플 중의 HER3 또는 HER4 각각의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 상기 항-HER3/HER4 항체의 HER3 또는 HER4 각각에의 결합을 허용하는 조건하에서 본 발명에 개시된 바와 같은 항-HER3(및 항-HER4) 항체와 접촉시키고, 상기 항-HER3(및 항-HER4) 항체와 HER3 또는 HER4 각각 간에 복합체가 형성되는 지를 검출함을 포함한다. 상기와 같은 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 항-HER3(및 항-HER4) 항체를 사용하여, 예를 들어 HER3 및 HER4 각각이 모두 환자의 선택을 위한 생물마커인 경우, 항-HER3/HER4 항체에 의한 요법에 적격인 피실험자를 선택한다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 질환은 암을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 표지된 항-HER3(및 항-HER4) 항체를 제공한다. 표지는 비제한적으로 직접 검출되는 표지 또는 부분(예를 들어 형광성, 발색성, 전자-밀집성, 화학발광성 및 방사성 표지)뿐만 아니라, 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 부분들, 예를 들어 효소 또는 리간드를 포함한다. 예시적인 표지는 비제한적으로 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예를 들어 희토 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라제, 예를 들어 개똥벌레 루시페라제 및 세균 루시페라제(미국특허 제 4,737,456 호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제(과산화 수소를 사용하여 염료 전구체, 예를 들어 HRP를 산화시키는 효소와 결합된), 락토퍼옥시다제, 또는 미세퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 회전 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함한다.
F. 약학 제형
본 발명에 개시된 바와 같은 항-HER3(및 항-HER4) 항체의 약학 제형을, 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기와 같은 항체를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용되는 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다. 약학적으로 허용되는 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성이며, 상기 담체는 비제한적으로 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 본 발명에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 간질성 약물 분산제, 예를 들어 용해성 중성-활성 히아루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 용해성 PH-20 히아루로니다제 당단백질, 예를 들어 rHuPH20(하이레넥스(HYLENEX)(등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함한 몇몇 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국특허공개 제 2005/0260186 호 및 제 2006/0104968 호에 개시되어 있다. 하나의 태양에서, sHASEGP를 하나 이상의 추가적인 클리코스아미노글리카나제, 예를 들어 콘드로이티나제와 병용한다.
예시적인 동결건조된 제형들이 미국특허 제 6,267,958 호에 개시되어 있다. 수성 항체 제형은 미국특허 제 6,171,586 호 및 WO 2006/044908에 개시된 것들을 포함하고, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본 발명의 제형은 또한 치료하려는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분들을 함유할 수 있다.
활성 성분을 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해서 또는 계면 중합에 의해서 제조된 미세캡슐, 예를 들어 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어 리포솜, 알부민 미소구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 중의 또는 거대유화액 중의 각각의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 미세캡슐 중에 포집할 수 있다. 상기와 같은 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제를 제조할 수도 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 상기 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질(상기 기질은 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다)을 포함한다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본 발명에 제공된 항-HER3(및 항-HER4) 항체 중 어느 하나 또는 세포독성제에 접합된 상기 항-HER3/HER4 항체의 면역접합체를 치료 방법에 사용할 수 있다.
하나의 태양에서, 약제로서 사용하기 위한 항-HER3/HER4 항체 또는 세포독성제에 접합된 상기 항-HER3/HER4 항체의 면역접합체를 제공한다. 추가의 태양에서, 암의 치료에 사용하기 위한 항-HER3(및 항-HER4) 항체 또는 세포독성제에 접합된 상기 항-HER3(및 항-HER4) 항체의 면역접합체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-HER3(및 항-HER4) 항체 또는 세포독성제에 접합된 상기 항-HER3(및 항-HER4) 항체의 면역접합체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 암이 있는 개인에게 유효량의 항-HER3/HER4 항체 또는 세포독성제에 접합된 상기 항-HER3(및 항-HER4) 항체의 면역접합체를 투여함을 포함하는, 상기 개인의 치료 방법에 사용하기 위한 항-HER3/HER4 항체 또는 세포독성제에 접합된 상기 항-HER3(및 항-HER4) 항체의 면역접합체를 제공한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명은 암세포의 세포사멸을 유도하고/하거나 암세포 증식을 억제하는데 사용하기 위한 항-HER3/HER4 항체 또는 세포독성제에 접합된 상기 항-HER3(및 항-HER4) 항체의 면역접합체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 개인에게 암세포의 세포사멸을 유도하고/하거나 암세포 증식을 억제하기에 유효한 항-HER3(및 항-HER4) 항체 또는 세포독성제에 접합된 상기 항-HER3(및 항-HER4) 항체의 면역접합체를 투여함을 포함하는, 상기 개인에서 암세포의 세포사멸을 유도하고/하거나 암세포 증식을 억제하는 방법에 사용하기 위한 상기 항-HER3(및 항-HER4) 항체 또는 세포독성제에 접합된 상기 항-HER3(및 항-HER4) 항체의 면역접합체를 제공한다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개인"은 바람직하게는 인간이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에서 항-HER3(및 항-HER4) 항체 또는 세포독성제에 접합된 상기 항-HER3(및 항-HER4) 항체의 면역접합체의 용도를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 약제는 암 치료용이다. 추가의 실시태양에서, 상기 약제는 암이 있는 개인에게 유효량의 상기 약제를 투여함을 포함하는 상기 암의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시태양에서, 상기 약제는 암세포의 세포사멸을 유도하고/하거나 암세포 증식을 억제하기 위한 것이다. 추가의 실시태양에서, 상기 약제는 암을 앓고 있는 개인에게 암세포의 세포사멸을 유도하고/하거나 암세포 증식을 억제하기에 유효한 양의 상기 약제를 투여함을 포함하는 상기 개인에서 암세포의 세포사멸을 유도하고/하거나 암세포 증식을 억제하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개인"은 인간일 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 암의 치료 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 방법은 암이 있는 개인에게 유효량의 항-HER3(및 항-HER4) 항체를 투여함을 포함한다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개인"은 인간일 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 암을 앓고 있는 개인에서 암세포의 세포사멸을 유도하고/하거나 암세포 증식을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 방법은 암을 앓고 있는 개인에게 상기 개인에서 암세포의 세포사멸을 유도하고/하거나 암세포 증식을 억제하기에 유효한 양의 항-HER3/HER4 항체 또는 세포독성제에 접합된 상기 항-HER3/HER4 항체의 면역접합체를 투여함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, "개인"은 인간이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 예를 들어 상기 치료학적 방법들 중 어느 하나에 사용하기 위한, 본 발명에 제공된 항-HER3(및 항-HER4) 항체 중 어느 하나를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 약학 제형은 본 발명에 제공된 항-HER3(및 항-HER4) 항체 중 어느 하나 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명의 항체(및 임의의 추가적인 치료제)를 임의의 적합한 수단, 예를 들어 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료를 원하는 경우, 병변내 투여에 의해 투여할 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 부분적으로 투여가 짧은지 또는 만성적인지에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 본 발명에서는 비제한적으로 다양한 시점들에 걸친 단일 또는 수회 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투여 스케줄이 고려된다.
본 발명의 항체를 양호한 의학적 실행과 일관되는 방식으로 제형화하고, 복용시키고, 투여할 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개인 환자의 임상적 조건, 질환의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 상기 항체는 문제의 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와, 필요하지는 않지만, 임의로 제형화한다. 상기와 같은 다른 작용제의 유효량은 상기 제형 중에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료제의 유형, 및 상기에 논의된 다른 인자들에 따라 변한다. 이들은 본 발명에 개시된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로에 따라, 또는 본 발명에 개시된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 임의의 경로에 의해 일반적으로 사용된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명의 항체의 적합한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 함께 사용될 때)은 치료되는 질병의 유형, 항체의 유형, 상기 질병의 중증도 및 과정, 상기 항체가 예방 또는 치료 목적으로 사용되는지의 여부, 선행 치료법, 환자의 임상 병력 및 상기 항체에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 변할 것이다. 상기 항체를 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여한다. 상기 질병의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏(예를 들어 0.5 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏)의 항체가, 예를 들어 1회 이상의 분리 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든 간에, 상기 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 임의의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급한 인자들에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸쳐 반복된 투여를 위해서, 상기 조건에 따라, 상기 치료를 일반적으로는 질병 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 지속할 수 있다. 상기 항체의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량을 상기 환자에게 투여할 수 있다. 상기와 같은 용량을 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다(예를 들어 상기 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 상기 항체를 수령하도록) 투여할 수 있다. 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서 하나 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수도 있다. 예시적인 투여 섭생은 상기 항체의 약 4 ㎎/㎏의 초기 부하 용량을 투여한 다음, 약 2 ㎎/㎏의 매주 유지 용량을 투여함을 포함한다. 그러나, 다른 복용 섭생이 유용할 수도 있다. 상기 치료법의 진행을 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링한다.
상기 제형들 및 치료 방법들 중 어느 하나를 항-HER3(및 항-HER4) 항체 대신에 또는 상기 항체 외에 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행할 수 있는 것으로 생각된다.
III. 제조 물품
본 발명의 또 다른 태양에서, 상술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품을 제공한다. 상기 제조 물품은 용기 및 상기 용기 상의 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질들, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로, 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 함께 유지하고 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들어 상기 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 항체이다. 상기 표지 또는 패키지 삽입물은 상기 조성물이 선택 상태의 치료에 사용됨을 가리킨다. 더욱이, 상기 제조 물품은 (a) 조성물이 함유된 제1 용기(여기에서 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함한다); 및 (b) 조성물이 함유된 제2 용기(여기에서 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시태양에서 제조 물품은 상기 조성물을 사용하여 특정 상태를 치료할 수 있음을 가리키는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 제조 물품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들어 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 물품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수도 있다.
상기 제조 물품 중 임의의 물품이 항-HER3(및 항-HER4) 항체 대신에 또는 상기 항체 외에 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 생각된다.
아미노산 서열의 설명
서열번호 1 인간 HER3의 β-헤어핀
서열번호 2 인간 HER4의 β-헤어핀
서열번호 3 인간 HER3
서열번호 4 인간 HER3 세포외 도메인(ECD)
서열번호 5 인간 HER4
서열번호 6 인간 HER4 세포외 도메인(ECD)
서열번호 7 인간 HER1
서열번호 8 인간 HER1 세포외 도메인(ECD)
서열번호 9 인간 HER2
서열번호 10 인간 HER2 세포외 도메인(ECD)
서열번호 11 인간 헤레귤린 단편(HRG)
서열번호 12 인간 헤레귤린 β-1 단편(프레프로테크(Preprotech)로부터 제공된 바와 같다)
서열번호 13 TtSlyD-FKBP-Her3
서열번호 14 TtSlyD-야생형
서열번호 15 TtSlyDcas
서열번호 16 TgSlyDΔIF
서열번호 17 TtSlyDcas-Her3
서열번호 18 TtSlyDcys-Her3
서열번호 19 TgSlyDser-Her3
서열번호 20 TgSlyDcys-Her3
서열번호 21 TtSlyDcas-Her4
서열번호 22 TtSlyDcys-Her4
서열번호 23 TgSlyDser-Her4
서열번호 24 TgSlyDcys-Her4
서열번호 25 중쇄 HVR-H1, M-05-74
서열번호 26 중쇄 HVR-H2, M-05-74
서열번호 27 중쇄 HVR-H3, M-05-74
서열번호 28 경쇄 HVR-L1, M-05-74
서열번호 29 경쇄 HVR-L2, M-05-74
서열번호 30 경쇄 HVR-L3, M-05-74
서열번호 31 중쇄 가변 도메인 VH, M-05-74
서열번호 32 경쇄 가변 도메인 VL, M-05-74
서열번호 33 M-05-74의 중쇄 가변 도메인 VH의 인간화된 변이체 A(VH-A)
서열번호 34 M-05-74의 중쇄 가변 도메인 VH의 인간화된 변이체 B(VH-B)
서열번호 35 M-05-74의 중쇄 가변 도메인 VH의 인간화된 변이체 C(VH-C)
서열번호 36 M-05-74의 중쇄 가변 도메인 VH의 인간화된 변이체 D(VH-D)
서열번호 37 M-05-74의 중쇄 가변 도메인 VH의 인간화된 변이체 E(VH-E)
서열번호 38 M-05-74의 경쇄 가변 도메인 VL의 인간화된 변이체 A(VL-A)
서열번호 39 M-05-74의 경쇄 가변 도메인 VL의 인간화된 변이체 B(VL-B)
서열번호 40 M-05-74의 경쇄 가변 도메인 VL의 인간화된 변이체 C(VL-C)
서열번호 41 M-05-74의 경쇄 가변 도메인 VL의 인간화된 변이체 D(VL-D)
서열번호 42 M-05-74의 경쇄 가변 도메인 VL의 인간화된 변이체 E(VL-E)
서열번호 43 인간 HER3의 β-헤어핀 내의 결합 에피토프
서열번호 44 인간 HER4의 β-헤어핀 내의 결합 에피토프
서열번호 45 슈도모나스 외독소 변이체 PE24LR8M_3G(GGG 링커 포함)
서열번호 46 M-05-74의 경쇄(M-05-74_LC)
서열번호 47 분류효소 태그를 갖는 M-05-74 HC의 중쇄(M-05-74_HC)
서열번호 48 슈도모나스 외독소 변이체 PE24LR8M에 접합된 M-05-74 HC의 중쇄(Fab-074-PE 중쇄 1)
서열번호 49 직접적인 PE24LR8M 융합으로서 슈도모나스 외독소 변이체 PE24LR8M에 접합된 M-05-74 HC의 중쇄(Fab-074-PE 중쇄 2)
서열번호 50 용해성 스타필로코커스 아우레우스 분류효소 A
서열번호 51 중쇄 가변 도메인 VH, <Her3> M-08-11
서열번호 52 경쇄 가변 도메인 VL, <Her3> M-08-11
서열번호 53 인간 카파 경쇄 불변 영역
서열번호 54 인간 람다 경쇄 불변 영역
서열번호 55 IgG1로부터 유래된 인간 중쇄 불변 영역
서열번호 56 L234A 및 L235A상에서 돌연변이된 IgG1로부터 유래된 인간 중쇄 불변 영역
서열번호 57 L234A, L235A 및 P329G상에서 돌연변이된 IgG1로부터 유래된 인간 중쇄 불변 영역
서열번호 58 IgG4로부터 유래된 인간 중쇄 불변 영역
하기의 실시예들 및 도면들은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 제시된다. 변형을 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 제시된 과정에서 수행할 수 있음은 물론이다.
하기에서 본 발명의 다수의 실시태양들을 나열한다:
1. 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체로서,
여기에서 상기 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A)
를 포함한다.
2. 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체로서,
여기에서 상기 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-D), 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-B), 또는 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-E)
을 포함한다.
3. 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체로서,
여기에서 상기 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-D)
을 포함한다.
4. 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체로서,
여기에서 상기 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-B)
을 포함한다.
5. 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체로서,
여기에서 상기 항체는
a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH(VH-A); 및
b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL(VL-E)
을 포함한다.
6. 실시태양 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 항체에서, 상기 항체는
서열번호 18 TtSlyDcys-Her3
의 폴리펩타이드 중에 포함된 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(서열번호 1)의 아미노산 서열내에 결합한다.
7. 실시태양 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 항체에서, 상기 항체는
서열번호 18 TtSlyDcys-Her3
의 폴리펩타이드에 결합한다.
8. 실시태양 6 또는 7에 따른 항체에서, 상기 항체는 인간 HER4에 결합하고
서열번호 22 TtSlyDcys-Her4
를 갖는 PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(서열번호 2)의 아미노산 서열내에 결합한다.
9. 실시태양 6 또는 7에 따른 항체에서, 상기 항체는 인간 HER4에 결합하고,
서열번호 22 TtSlyDcys-Her4
의 폴리펩타이드에 결합한다.
10. 항-HER3 항체로서, 상기 항체는 실시태양 2 내지 5 중 어느 하나에 따른 항체에 적어도 95%의 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열 및 적어도 95% 또는 100%의 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고,
상기 항체는 하기의 성질들 중 하나 이상을 갖는다: 상기 항체는
a) 서열번호 13 TtSlyD-FKBP-Her3,
서열번호 17 TtSlyDcas-Her3,
서열번호 18 TtSlyDcys-Her3,
서열번호 19 TgSlyDser-Her3, 및
서열번호 20 TgSlyDcys-Her3
으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드 중에 포함된 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(서열번호 1)의 아미노산 서열내에 결합하고;
b) 서열번호 13 TtSlyD-FKBP-Her3,
서열번호 17 TtSlyDcas-Her3,
서열번호 18 TtSlyDcys-Her3,
서열번호 19 TgSlyDser-Her3, 및
서열번호 20 TgSlyDcys-Her3
으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드에 결합하고;
c) HER3/HER2 공침전 분석에서 MCF-7 세포에서의 HER3/HER2 이종이량체의 이종이량체화를 억제하고;
d) 서열번호 21 TtSlyDcas-Her4,
서열번호 22 TtSlyDcys-Her4,
서열번호 23 TgSlyDser-Her4, 및
서열번호 24 TgSlyDcys-Her4
로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드 중에 포함된 PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(서열번호 2)의 아미노산 서열내에 결합하고;
e) 서열번호 21 TtSlyDcas-Her4,
서열번호 22 TtSlyDcys-Her4,
서열번호 23 TgSlyDser-Her4, 및
서열번호 24 TgSlyDcys-Her4
로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드에 결합하고;
f) 1가 Fab 단편으로서, 2가의 모 전장 항체에 비해(MCF-7 세포에서 HER3 인산화 억제 분석에서의 동몰량으로 비교시) 동일하거나 더 높은 생물학적 활성을 나타내고;
g) 생체내에서 종양성장 억제 활성을 나타내고;
h) HER3-ECD에, 1 x 10-8 M 이하의 KD 값(하나의 실시태양에서 1 x 10-8 M 내지 1 x 10-13 M의 KD 값; 하나의 실시태양에서 1 x 10-9 M 내지 1 x 10-13 M의 KD 값)의 친화성으로 결합하고;
i) HER4-ECD에, 1 x 10-8 M 이하의 KD 값(하나의 실시태양에서 1 x 10-8 M 내지 1 x 10-13 M의 KD 값; 하나의 실시태양에서 1 x 10-9 M 내지 1 x 10-13 M의 KD 값)의 친화성으로 결합하고;
j) 여기에서 상기 항체는 VYNKLTFQLEP(서열번호 43)로 이루어진 폴리펩타이드 또는 VYNPTTFQLE(서열번호 44)로 이루어진 폴리펩타이드에 결합하고;
k) 여기에서 상기 항체는 VYNKLTFQLEP(서열번호 43)로 이루어진 폴리펩타이드에 결합하고/하거나;
l) 여기에서 상기 항체는 VYNPTTFQLE(서열번호 44)로 이루어진 폴리펩타이드에 결합한다.
11. 실시태양 1 내지 10 중 어느 하나의 항체로서, 상기 항체는 전장 IgG1 항체 또는 IgG4 항체이다.
12. 실시태양 1 내지 10 중 어느 하나의 항체로서, 상기 항체는 Fab 단편이다.
13. 실시태양 11 또는 12의 항체에서, 상기 항체는 인간 기원의 불변 도메인을 포함한다.
14. 실시태양 1 내지 10 중 어느 하나의 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체.
15. 암 치료에 사용하기 위한 실시태양 1 내지 10 중 어느 하나의 항체, 또는 실시태양 14의 면역접합체.
16. HER3/HER2 이량체화의 억제에 사용하기 위한 실시태양 1 내지 10 중 어느 하나의 항체.
17. 실시태양 1 내지 10 중 어느 하나의 항체, 또는 실시태양 14의 면역접합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형.
18. 약제로서 사용하기 위한 실시태양 1 내지 10 중 어느 하나의 항체, 또는 실시태양 14의 면역접합체.
19. 약제의 제조에서 실시태양 1 내지 10 중 어느 하나의 항체, 또는 실시태양 14의 면역접합체의 용도.
20. 실시태양 19의 용도에서, 상기 약제는 암 치료용이다.
21. 실시태양 1 내지 10 중 어느 하나의 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
22. 실시태양 21의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
23. 실시태양 22의 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 단계; 및 상기 항체를 세포 배양물 또는 세포 배양 상등액으로부터 회수하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법.
실시예 :
재료 및 일반적인 방법
재조합 DNA 기법
문헌[Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 개시된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물학 시약들은 제조사의 설명서에 따라 사용하였다.
유전자 합성
목적하는 유전자 분절들을 화학 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오타이드로부터 제조하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위들이 측면에 인접해 있는 400 내지 1600 bp 길이 유전자 분절들을 PCR 증폭을 포함하여 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 및 이어맞추기에 의해 조립하고 후속으로 지시된 제한 부위, 예를 들어 EcoRI/BlpI 또는 BsmI/XhoI를 통해 하기에 개시하는 발현 벡터내로 클로닝시켰다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 유전자 합성 단편들을 진아트(Geneart)(독일 레겐스부르크 소재)에서 제공된 명세서에 따라 정렬시켰다.
DNA 서열 측정
DNA 서열을 세퀴서브(Sequiserve) GmbH(독일 바테르스테텐 소재)에서 수행된 이중가닥 서열분석에 의해 측정하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 처리
인포맥스의 벡터 NT1 어드밴스 스위트 버전(Infomax's Vector NT1 Advance suite version) 11.5.0을 서열 생성, 맵핑, 분석, 주석 및 예시에 사용하였다.
실시예 1
항원 및 선별 단백질의 제조 - HER3의 β-헤어핀 및 HER4의 β-헤어핀에 결합하는 항체를 선택하기 위한 기능성 β-헤어핀 HER3 및 β-헤어핀 HER4 구조물의 생성
기능성 β-헤어핀 HER3 및 HER4 구조물을 생성시키기 위해서, HER3(서열번호 1) 및 HER4(서열번호 2)의 β-헤어핀의 아미노산 서열을 FKBP 도메인을 포함하는 SlyD 폴리펩타이드 프레임워크에 이식하였다. 상기와 같은 구조물에서 상기 이식된 β-헤어핀은 HER3 또는 HER4의 고유의 활성화되지 않은 입체구조 중의 은닉 구조(예를 들어 HRG로서 리간드의 부재하의)에 비해 자유롭게 접근 가능하다(HER3의 β-헤어핀이 은닉된 도 1c 및 1d를 참조하시오).
모든 융합된 SlyD 폴리펩타이드를 거의 동일한 프로토콜을 사용하여 정제하고 리폴딩할 수 있다. 특정한 발현 플라스미드로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 BL21(DE3) 세포를 선택성 생육을 위한 각각의 항생제(가나마이신 30 ㎍/㎖, 또는 암피실린(100 ㎍/㎖))를 함유하는 LB 배지에서 37 ℃에서 1.5의 OD600으로 증식시키고, 시토솔 과발현을 1 mM 아이소프로필-β-D-티오갈락토사이드(IPTG)의 첨가에 의해 유도하였다. 유도 3시간 후에, 세포를 원심분리(5,000 g에서 20분)에 의해 수확하고, 동결시키고 -20 ℃에서 보관하였다. 세포 용해를 위해서, 상기 동결된 펠릿을 7 M GdmCl 및 5 mM 이미다졸이 보충된 냉장된 50 mM 나트륨 포스페이트 완충제(pH 8.0) 중에 재현탁시켰다. 그 후에 상기 현탁액을 얼음 상에서 2 내지 10시간 동안 교반하여 세포 용해를 완료시켰다. 원심분리(25,000 g, 1시간) 및 여과(셀룰로스 나이트레이트 멤브레인, 8.0 ㎛, 1.2 ㎛, 0.2 ㎛) 후에, 용해물을 용해 완충제로 평형화시킨 Ni-NTA 컬럼상에 적용하였다. 후속의 세척 단계에서 상기 티올 부분을 환원된 형태로 유지시키고 조기 다이설파이드 가교를 방지하기 위해서 상기 이미다졸 농도를 10 mM(7 M GdmCl을 포함하는 50 mM 나트륨 포스페이트 완충제(pH 8.0) 중에서)로 상승시키고 5 mM TCEP를 가하였다. 적어도 15 내지 20 부피의 상기 환원 세척 완충제를 적용하였다. 그 후에, 상기 GdmCl 용액을 100 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 및 5 mM TCEP를 포함하는 50 mM 나트륨 포스페이트 완충제(pH 8.0)로 교체하여 상기 매트릭스-결합된 SlyD 융합 폴리펩타이드의 입체구조 리폴딩을 유도하였다. 동시-정제 프로테아제의 재활성화를 피하기 위해서, 프로테아제 억제제 칵테일(컴플릿(Complete)(등록상표) 무-EDTA, 로슈)을 상기 리폴딩 완충제에 가하였다. 총 15 내지 20 컬럼 부피의 리폴딩 완충제를 밤새 과정으로 적용하였다. 그 후에, TCEP 및 컴플릿(등록상표) 무-EDTA 억제제 칵테일 모두를, 100 mM NaCl 및 10 mM 이미다졸을 포함하는 50 mM 나트륨 포스페이트 완충제(pH 8.0) 10 컬럼 부피로 세척하여 제거하였다. 상기 최종 세척 단계에서, 떨어지지 않는 오염물질을 제거하기 위해서 상기 이미다졸 농도를 30 mM(10 컬럼 부피)로 상승시켰다. 이어서 상기 리폴딩된 폴리펩타이드를 동일한 완충제 중의 250 mM 이미다졸을 적용하여 용출시켰다. 단백질-함유 분획들을 트리신(Tricine)-SDS-PAGE에 의해 순도에 대해 평가하였다(문헌[Schaegger, H. and von Jagow, G., Anal. Biochem. 166 (1987) 368-379]). 후속으로, 상기 단백질에 완충제 시스템(50 mM 칼륨 포스페이트 완충제(pH 7.0), 100 mM KCl, 0.5 mM EDTA)으로서 칼륨 포스페이트를 사용하여 크기-배제-크로마토그래피(슈퍼덱스(Superdex)(상표) 힐로드(HiLoad), 에머샴 파마시아(Amersham Pharmacia))를 수행하였다. 최종적으로, 상기 단백질-함유 분획들을 모으고 아미콘 셀(YM10) 중에서 약 5 ㎎/㎖의 농도로 농축시켰다. TtSlyD-FKBP-Her3의 Ni-NTA 정제의 예시적인 SDS-PAGE 분석을 도 3에 도시하고 써무스 써모필루스 SlyD-FKBP-Her-3의 Ni-NTA 정제된 분획의 SEC 용출 프로파일을 도 4에 도시한다. 상기 써무스 써모필루스 SlyD(TtSlyD)-Her-3 융합 폴리펩타이드를 그의 단량체성 형태로 용해성 및 안정성 폴리펩타이드로서 성공적으로 정제할 수 있었다. 최종 수율은 분획 12 및 13으로부터 16.4 ㎎의 정제된 단백질로 정량분석되었다.
표 2는 발생된 SlyD-기재 에피토프 스캐폴드(삽입물로서 HER3 이량체화 도메인 단편(HER3(서열번호 1)의 β-헤어핀) 또는 삽입물로서 HER4 이량체화 도메인 단편(HER4(서열번호 2)의 헤어핀)을 운반한다)의 아미노산 서열의 요약을 나타낸다.
TtSlyD-FKBP-Her3, TtSlyDcas-Her3, TtSlyDcys-Her3, 써모코커스 감마톨레란스(Thermococcus gammatolerans) TgSlyDser-Her3 및 TgSlyDcys-Her3은 삽입물로서 Her3 이량체화 도메인 단편(HER3(서열번호 1)의 β-헤어핀)을 운반하고 ELISA 선별에서 면역원으로서 및 양성 대조군으로서 사용되었다.
TtSlyD-야생형, TtSlyDcas, TgSlyDΔIF는 ELISA 선별에서 음성 대조군으로서 사용되었다(삽입물로서 Her3 이량체화 도메인 단편(HER3(서열번호 1)의 β-헤어핀) 또는 Her4 이량체화 도메인 단편(HER4(서열번호 2)의 헤어핀)의 부재).
TtSlyDcas-Her4, TtSlyDcys-Her4, TgSlyDser-Her4 및 TgSlyDcys-Her4(삽입물로서 Her4 이량체화 도메인 단편(HER4(서열번호 2)의 β-헤어핀)을 운반한다)를 ELISA 선별에 사용하여 상기 발생된 클론들을 HER4 교차반응성에 대해서 검사하였다.
상기 에피토프 스캐폴드는 에스케리키아 콜라이에서 발현되기 때문에, N-말단 메티오닌 잔기가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다(Nt = N-말단; Ct = C-말단).
[표 2]
Figure pct00002
실시예 2
a) HER3 항체의 면역화 및 선택
HER3 및 HER4의 β-헤어핀에 대한 항체의 생성을 위해서, Balb/C, NMRI 또는 SJL 마우스를 상이한 항원들로 면역시켰다. 항원으로서 하기의 단백질들을 사용하였다: 전장 Her3 ECD, 또는 에피토프 스캐폴드 단백질 TtSlyD-FKBP12-Her3, TtSlyDcys-Her3, TtSlyDcas-Her3, TgSlyDcys-Her3 및 TgSlyDser-Her3. TtSlyD-FKBP12-Her3 변이체는 1세대 에피토프 스캐폴드를 나타내며, Her3 이량체화 도메인 특이성 항체의 생성에 사용되었다. 에피토프 스캐폴드로서 SlyD 변이체를 사용하는 일반적인 원리는 상기 1세대 SlyD-FKBP12 스캐폴드를 사용하여 이미 입증될 수 있었지만, 보다 높은 안정성을 갖는 상기 스캐폴드의 개선된 변이체가 발생하였다. 이러한 SlyD 변이체는 써모스 써모필루스 및 써모코커스 감마톨레란스로부터 유래된다.
모든 마우스에게 상기 면역화 캠페인 시작 후 0, 6 및 10주째의 시점에서 3회의 면역화를 가하였다. 각각의 시점에서 각각의 마우스를 100 ㎕ PBS 중에 용해된 100 ㎍의 내독소 부재 면역원으로 면역시켰다. 상기 첫 번째 면역화의 경우, 상기 면역원을 100 ㎕의 CFA와 혼합하였다. 두 번째 및 세 번째 면역화의 경우, 상기 면역원을 IFA와 혼합하였다. 상기 첫 번째 및 세 번째 면역화를 복강내 경로를 통해 적용하였으며, 상기 두 번째 면역화는 피하로 적용하였다. 하이브리도마 기술을 사용하는 항체 발생을 위한 비장세포의 제조 2 및 3일 전에, 상기 마우스에게 100 ㎕ PBS 중의 12.5 ㎍ 면역원으로 항원보강제 없이 정맥내 추가 면역화를 가하였다.
역가 분석
각각의 면역원 및 선별 단백질에 대한 혈청 역가의 측정을 위해서 소량의 각 마우스의 혈청을 상기 면역화 캠페인 시작 후 11주째에 수집하였다. ELISA를 위해서 상기 면역원 또는 상기 선별 스캐폴드 단백질을 플레이트 표면상에 고정화시켰다. Her3 ECD를 1 ㎍/㎖의 농도로 고정화시켰으며 스캐폴드 단백질 TtSlyD-FKBP12-Her3, TtSlyD-FKBP12, TtSlyDcys-Her3, TtSlyDcas-Her3, TtSlyDcas, TgSlyDcys-Her3, TgSlyDser-Her3 및 TgSlyDΔIF를 0.5 ㎍/㎕의 농도로 사용하였다. 스캐폴드 단백질 TtSlyDcas 및 TgSlyDΔIF를 음성 대조군으로서 사용하였다. 각 마우스로부터의 혈청을 PBS 중에서 1% BSA로 희석하고 상기 희석물을 상기 플레이트에 가하였다. 상기 혈청을 1:300, 1:900, 1:2700, 1:8100, 1:24300, 1:72900, 1:218700 및 1:656100의 희석비로 시험하였다. 결합된 항체를 HRP-표지된 F(ab')2 염소 항-마우스 Fcγ(다이아노바(Dianova)) 및 기질로서 ABTS(로슈)로 검출하였다.
혈청 적정의 수준에 대해서조차, 면역된 마우스는 Her3 β-헤어핀 도메인에 대해 항체를 발생시킴은 이미 명백하였다. Her3 ECD로 면역된 마우스에서 이는 상기 이량체화 β-헤어핀 고리를 함유하는 스캐폴드 단백질들 중 하나에 대한 적정에 의해 입증될 수 있다. 상기 강하게 감소된 신호는, Her3 ECD에 의한 면역화에 의해 발생된 항체의 대부분이 상기 ECD내의 다른 부분을 표적화하고 단지 작은 분획만이 상기 이량체화 β-헤어핀 도메인에 결합한다는 사실에 의해 설명될 수 있다. Her3 이량체화 고리 함유 스캐폴드로 면역된 마우스에서 상기 고리를 표적화하는 항체의 분획은 Her3 ECD에 대한 적정(양성 대조군) 및 Her3 삽입 없는 대조군 스캐폴드에 대한 적정(음성 대조군)에 의해 입증될 수 있다.
b) 항체 발생 및 ELISA 선별/선택
여기에 개시된 에피토프 스캐폴드 기술의 사용은 원칙적으로 상기 Her3 이량체화 도메인(HER3(서열번호 1)의 β-헤어핀)을 표적화하는 항체의 발생을 위한 2개의 전략을 제공한다. 하나의 전략은 전장 Her3 ECD에 의한 면역화 및 상기 스캐폴드를 이량체화 도메인 특이성 항체에 대한 선별에 사용하는 것이다. 다른 전략은 면역화를 위한 상기 스캐폴드의 직접적인 사용 및 상기 Her3 ECD, 또 다른 주쇄를 갖는 스캐폴드, 또는 대조 선별을 위한 무-삽입 스캐폴드를 사용하는 것이다. 항체를, 1차 B-세포를 P3X63Ag8.653 골수종 세포와 융합시킴으로써 하이브리도마 기술로 발생시켰다. 최종 추가 면역화 후 2일 째에, 면역된 마우스를 죽이고 비장세포 집단을 제조하였다. 상기 비장세포를 PEG 융합 기술을 사용하여 P3X63Ag8.653과 융합시켰다. 상기 융합으로부터의 세포 배치 배양물을 밤새 37 ℃에서 5% CO2 하에서 배양하였다. 다음 날, 상기 융합된 세포를 함유하는 세포 배치를 400 g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 그 후에, 상기 세포를 0.1x 아자세린-하이포잔틴(시그마)이 보충된 하이브리도마 선택 배지에 현탁하고 96웰 플레이트 중에서 웰당 2.5 x 104 세포의 농도로 시딩하였다. 상기 플레이트를 37 ℃에서 5% CO2 하에서 적어도 1주일 동안 배양하였다. ELISA 분석 3일 전에, 상기 선택 배지를 교환하였다.
1차 배양 상등액을 Her3 ECD 및 다양한 스캐폴드 단백질들에 대해서 ELISA에서 시험하였다. 상기 스캐폴드 단백질들에 대한 시험은 상기 선택된 클론들이 고유의 Her3 ECD의 이량체화 도메인 β-헤어핀에 결합함을 입증하기 위해서 수행되었다. 상기 대조군 스캐폴드 TtSlyDcas 및 TgSlyDΔIF에 대한 시험을 수행하여 상기 선택된 클론들이 상기 삽입된 Her3 유래된 서열에 결합하고 상기 스캐폴드 주쇄에는 결합하지 않음을 입증하였다. 교차 반응성에 대해서 검사하기 위해서, 상기 생성되는 클론들을 상기 Her 그룹의 다른 구성원들, 즉 Her1, Her2 및 Her4의 전장 ECD에 대해 시험하였다. 입증된 바와 같이 모든 선택된 클론들은 Her3에 대해 매우 특이적이며 HER4에 대한 매우 특이적인 교차 반응성을 검출할 수 있었던 반면, 상기 Her 그룹의 다른 구성원들에 대한 교차 반응성은 검출되지 않았다. ELISA를 위해서, 선별 항원 다운 포맷을 사용하였다. Her3 ECD를 1 ㎍/㎖의 농도로 고정화시켰으며 스캐폴드 단백질 TtSlyD-FKBP12-Her3, TtSlyD-FKBP12, TtSlyDcys-Her3, TtSlyDcas-Her3, TtSlyDcas, TgSlyDcys-Her3, TgSlyDser-Her3 및 TgSlyDΔIF를 0.5 ㎍/㎕의 농도로 고정화시켰다. 하이브리도마 상등액을 상기 플레이트에 가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 결합된 항체를 HRP-표지된 F(ab')2 염소 항-마우스 Fcγ(다이아노바)로 검출하였고 ABTS(로슈)를 HRP-기질로서 사용하였다.
표 3은 ELISA에 의한 선택된 클론들의 평가를 나타낸다. 상기 클론들을 스캐폴드 단백질 TtSlyDcys-Her3, TtSlyDcas-Her3, TgSlyDser-Her3 및 TgSlyDcys-Her3 및 전장 Her3 ECD에 대해 시험하여 이들의 Her3 이량체화 도메인 삽입물(HER3(서열번호 1)의 β-헤어핀) 특이성을 확인하였다. 음성 대조군으로서 스캐폴드 단백질 TsSlyDcas 및 TgSlyDΔIF를 사용하였다. 추가로, 클론들을 Her1, Her2, Her3 및 Her4의 전장 ECD에 대해 시험하여 잠재적인 교차 반응성을 확인하였다. 클론들은 전장 Her3 ECD에 대해 결합을 나타내며 전장 Her4 ECD에 대해 교차 반응성이다.
[표 3]
Figure pct00003
c) 면역조직화학
모든 선택된 클론들을 IHC에서 반응성 및 특이성에 대해 시험하였다. 따라서, HEK293 세포를, 전장 HER1, HER2, HER3 또는 HER4 각각을 암호화하는 플라스미드들로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 후 2일째에 이제 HER1, HER2, HER3 또는 HER4를 발현하는 상이한 세포주들을 수확하였으며, 후속으로 포르말린 중에서 고정시키고 IHC 대조군의 생성을 위해 아가로스에 매몰하였다. 포르말린 중에서 밤새 추가로 고정 후에 상기 아가로스 블록은 파라핀 중에 매몰되었다. 형질감염되지 않은 HEK293 세포를 음성 대조군으로서 사용하였으며 상기 형질감염된 세포에 상응하게 처리하였다. 파라핀 매몰 후에 3 ㎛의 얇은 절편을 마이크로톰을 사용하여 제조하였다. 상기 절편을 유리 현미경 슬라이드상에 올려놓고 2시간 동안 건조시켰다. 상기 면역조직화학 염색 과정의 모든 추가의 단계들을 벤타나 벤치마크(Ventana Benchmark) XT를 사용하여 수행하였다. 상기 슬라이드를 탈랍시키고 1시간 동안 열을 가하여 항원 회복을 수행하였다. 항원 회복을 위해서 벤타나 완충제 CCl을 사용하였다. 항체를 1 ㎍/㎖의 농도로 사용하였다. 결합된 항체의 검출을 위해서 벤타나 울트라뷰(Ventana UltraView) 검출 키트를 사용하였다. 결과를 도 5에 도시한다. 3개의 클론은 모두 HER3에 대한 결합 및 HER4에 대한 교차 반응성을 보였다. HER1 및 HER2에 대한 교차 반응성은 검출할 수 없었다.
d) 선택된 항- Her3 하이브리도마의 DNA 서열분석
상기 선택된 하이브리도마 클론의 DNA 서열을 획득하기 위해서 5'Race PCR을 수행하였다. 상기 RT-PCR을 위해서 전체 RNA를 전체 RNA 정제 키트(퀴아겐(Qiagen))를 사용하여 5 x 106 세포로부터 제조하였다. 역전사 및 PCR을 5'프라임 RACE PCR 키트(로슈)를 사용하여 수행하였다. 중쇄 및 경쇄로부터 생성되는 PCR 단편을 젤 전기영동 및 후속의 젤 정제에 의해 정제하였다. 상기 PCR 단편을 토포 제로-블런트(Topo Zero-Blunt) 클로닝 키트(인비트로젠)를 사용하여 클로닝하고 수용세포로 형질전환시켰다. 각각의 하이브리도마로부터의 다수의 클론을 상기 선택된 클론들에 대한 공통 서열을 획득하기 위한 서열분석을 위해 제출하였다. M-05-74 M-15-02 M-15-04를 서열분석을 위해 제출하였으며 3개의 클론 모두에 대해 동일한 VH 및 VL 서열이 생성되었다. M-15-03, M-15-05, M-15-08, M-15-09, M-15-11, M-16-01을 유사하게 서열분석하였으며 또한 모든 클론에 대해서 동일한 VH 및 VL 서열이 생성되었다.
e) FACS를 통한 M-05-74의 시간 의존적인 내면화 분석
HER3에 대해 상기 선택된 M-05-74에 의한 HER3의 결합 및 내면화를 상기 HER3 발현 종양 세포주 T47D를 사용하여 FACS에서 분석하였다. 5 x 105 세포를 50 ng 재조합 인간 헤레귤린 단편(HRG)(서열번호 11)으로 처리하였다. 서열번호 11의 아미노산을 포함하는 단편을 pCDNA.1 벡터(인비트로젠)에 클로닝하였다. 상기 HRG 단편을 인비트로젠에 의해 개시된 프로토콜에 따라 프리스타일(FreeStyle)(상표) 293-F 세포에서 발현시켰다(프리스타일(상표) 293 발현 시스템 카탈로그 번호 K9000-01). 정제된 HRG 단편을 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl; pH 6.0에 용해시키고 -80℃까지 보관하였다.
처리되지 않은(-) 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 헤레귤린 유도된 활성화 직후에, 1 ㎍의 M-05-74를 상기 세포에 가하였다. 상기 세포를 37 ℃에서 0, 5, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 180 또는 240분 동안 배양하였다. 배양 후에 상기 세포를 바로 얼음상에 놓았다. 상기 세포를 3 ㎖ FACS 완충제로 1회 세척하고 이어서 30분 동안 1 ㎍의 R-피코에리트린 염소 항-마우스 IgG(H+L) 2차 항체로 염색하였다. 유식 세포측정을 FACSCantoTM 유식 세포계(BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 수행하였다. 결과는 T47D 세포에서 M-05-74 유도된, 시간 의존적인 HER3 수용체 내면화의 FACS 분석이다. M-05-74는 보충된 재조합 인간 헤레귤린 단편(HRG)과 함께 또는 상기 단편 없이 상기 발현된 HER3 ECD에 대해 결합을 나타낸다. M-05-74는 4시간의 기간에 걸쳐 Her3 수용체 내면화를 유도한다. 결과를 도 6에 도시한다. 아이소타입 대조군은 일정한 수평의 검은색 막대로서 나타낸다. M-05-74는 인간 헤레귤린 단편(-) 및 (+HRG)의 존재 또는 부재하에서, 상기 발현된 Her3 ECD에 대해 결합을 나타낸다. M-05-74는 4시간에 걸쳐 Her3 수용체 내면화를 유도한다. 아이소타입 대조군은 일정한 수평의 검은색 막대로서 나타낸다. HRG의 존재하에서 HER3의 항체 유도된 내면화는 HRG 부재(-)하의 값과 비교할 때 더 빨랐다(예를 들어 1시간 후에, 적어도 25% 더 많은 HER3이 HRG의 존재(+HRG)하에서 내면화되었다).
실시예 3
a) HER3 항체의 동역학적 선별/결합 성질
동역학적 선별을 비아코어 CM5 센서가 탑재된 비아코어 4000 장비상에서 슈라엠(Schraeml) 등(문헌[Schraeml, M. and M. Biehl, Methods Mol Biol 901 (2012) 171-181])에 따라 수행하였다. 모든 분석에서 시험 항체를 포획하였다. 상기 시스템은 소프트웨어 버전 V1.1의 조절하에 있었다. 상기 장비 완충제는 HBS-EP(10 mM HEPES(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05%(w/v) P20)였다. 상기 시스템은 25 ℃에서 작동하였다. 10 mM 나트륨 아세테이트 완충제(pH 4.5) 중의 30 ㎍/㎖ 토끼 다클론 항체(RAM IgG(Fc 감마 특이성을 갖는 토끼 항 마우스 IgG), GE 헬쓰케어)를 유동 셀 1, 2, 3 및 4에서 스폿 1, 2, 4 및 5상에 제조사의 설명서에 따라 EDC/NHS 화학을 사용하여 고정화시켰다. 상기 센서를 1 M 에탄올아민을 사용하여 포화시켰다. 각각의 유동 셀에서, 기준 신호를 스폿 1-2 및 스폿 5-4를 사용하여 계산하였으며, 스폿 3은 블랭크 대조군으로서 제공되었다. 상기 항원(인간 재조합 Her-3 ECD(68 kDa), 및 HER3(서열번호 1)의 β-헤어핀을 포함하는 재조합 써무스 써모필루스 SlyD FKBP-Her3(15 kDa))을 1 ㎎/㎖ CMD(카복시메틸덱스트란, 시그마)가 보충된 장비 완충제 중에서 150 nM로 희석하여 비특이적 결합을 억제하였다. 상기 하이브리도마 배양 상등액을 적용 전에 장비 완충제 중에서 1:5로 희석하였다. 상기 희석된 혼합물을 2분 동안 30 ㎕/분의 유량으로 주사하였다. 상기 항체 포획 수준(CL)을 응답 단위로 모니터링하였다. 그 후에 바로 각각의 항원을 3분의 결합 시간 동안 30 ㎕/분의 유량으로 주사하였다. 그 후에, 상기 항체-항원 복합체 해리 신호를 5분 동안 기록하였다. 상기 센서를, 10 mM 글리신-HCl 용액(pH 1.7)을 2분 동안 30 ㎕/분의 유량으로 주입함으로써 재생시켰다. 상기 항원의 주입이 끝나기 직전에 기록된 신호를 결합 말기(BL)로서 응답 단위로 나타내었다. 상기 해리의 기록이 끝나기 직전에 기록된 신호를 안정성 말기(SL)로서 응답 단위로 나타낸다. 상기 해리 속도 상수를 측정하고 계산하였다. 상기 항체-항원 복합체 안정성(분)을 하기 식으로 계산하였다: In(2)/60*kd. 몰비를 하기 식으로 계산하였다: MW(항체)/MW(항원)*BL(항원)/CL(항체).
결합 말기(BL)는 상기 분석물 주입 끝의 응답 단위를 나타낸다. 상기 센서 표면상에서 리간드로서 포획된 항체의 양을 포획 수준(CL)으로서 응답 단위로 측정한다. 상기 시험된 분석물, 상기 항체 및 상기 용액 중의 분석물의 분자량의 정보와 함께, 상기 몰비를 계산할 수 있다. 상기 센서가 적합한 양의 항체 리간드 포획 수준으로 배열된 경우, 각각의 항체는 적어도 용액 중의 하나의 분석물에 기능적으로 결합할 수 있을 것이며, 이를 MR의 몰비 = 1.0으로 나타낸다. 이때, 상기 몰비는 또한 분석물 결합의 결합가 모드에 대한 지표이다. 최대 결합가는, 하나가 각각의 Fab 결합가를 갖는 2개의 분석물에 결합하는 항체의 경우, MR = 2일 수 있다. 입체 제한 또는 이상 분석물 결합의 경우에, 상기 몰비는, 상기 Her-3 ECD가 그의 "폐쇄된" 입체구조로 결합되는 경우에서처럼, 화학량론 이하의 결합을 가리킬 수 있다. 상기 몰비의 측정에서 최대 분석 편차는 MR = 0.2이다.
항- HER3 / HER4 항체 M-05-74의 선별/선택:
하나의 실험에서, 동역학적 선별을 인간 재조합 Her-3 ECD에 의한 마우스의 면역화로부터 획득된 상이한 융합물로부터의 하이브리도마 1차 배양물로 구동하였다. 목적은 상기 Her-3 이종이량체화 도메인 β-헤어핀 펩타이드(서열번호 1)에 대한 결합 특이성을 갖는 배양물을 선택하기 위한 것이었다. 용액 중 항원으로서 인간 재조합 Her-3 ECD(68 kDa), 및 HER3(서열번호 1)의 β-헤어핀 펩타이드를 포함하는 재조합 써무스 써모필루스 SlyD FKBP-Her3(15 kDa)을 사용하였다. 양의 적중물을 상기 두 항원 모두에 대해 결합 활성을 갖는 1차 배양 상등액으로서 분류하였다.
표 4는 예시적으로 1차 배양 상등액을 도시하고, 이로부터 M-05-74는 상기 요건을 충족시키고, 이는 HER3의 β-헤어핀에 대한 에피토프 특이성을 가리킨다. 따라서, 상기는 서열번호 1의 Her-3 헤어핀에 결합하는 항-HER3 항체의 적합한 선별 방법이다.
표 4에서 예시적인 결과가 융합물로부터의 일련의 하이브리도마 1차 배양물과 함께 동역학적 선별 실험으로부터 획득되었으며, 여기에서 항체 M-05-74는 써모 SlyD-Her3 구조물내의 HER3 ECD 및 HER3(서열번호 1)의 β-헤어핀 모두에 결합하는 것으로서 확인되었다.
[표 4]
Figure pct00004
M-05-74는 인간 Her-3 ECD 분석물에 대한 그의 결합에서 감소된 몰비(MR = 0.5)를 나타내는 반면, β-헤어핀 HER3(서열번호 1)을 포함하는 분석물 써무스 써모필루스 SlyD FKBP-Her3에 대한 그의 결합은 개선된 몰비(MR = 1.1)를 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 이는 개선된 에피토프 접근성(인간 Her-3 ECD에 비해)으로 기능적인 화학량론적 1:1 결합을 암시한다.
b) 헤레귤린(HRG)의 부재 및 존재하에서 M-05-74의 작용 방식을 조사하기 위한 HER3 항체 M-05-74, M-205 및 M-208 동역학의 동역학
상기 HER3 수용체는 평형 상태에서 그의 "폐쇄된 입체구조"로 존재하고, 이는 이종이량체화 HER3 베타-헤어핀 동기가 비-공유 상호작용을 통해 Her-3 ECD 도메인 IV에 구속됨을 의미한다(도 1c 및 1d를 참조하시오). 상기 "폐쇄된" Her-3 입체구조는 특정한 Her-3 헤레귤린 결합 부위에서 리간드 헤레귤린의 결합을 통해 개방될 수 있는 것으로 생각된다. 이는 Her-3 ECD 도메인 I 및 도메인 III에 의해 형성된 Her-3 계면에서 발생한다. 상기 상호작용에 의해, 상기 Her-3 수용체가 활성화되고 그의 "개방된 입체구조"로 이동하는 것으로 여겨진다(도 1b 및 e를 참조하시오). 상기가 발생하면, 상기 Her-3 베타-헤어핀은 상기 개시된 항체에 접근가능하다. 이러한 작용 방식을 비아코어 실험에 의해 시험관내에서 시뮬레이션할 수 있다.
비아코어 T100 장비(GE 헬쓰케어)를 사용하여 상기 단클론 항체들을 헤레귤린-활성화된 Her-3 세포외 도메인(Her3_ECD)에 대한 그의 반응에 대해 동역학적으로 평가하였다. CM5 시리즈 센서를 상기 시스템상에 적재하고 제조사의 설명서에 따라 HBS-ET 완충제(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% w/v 트윈20) 중에서 표준화하였다. 상기 샘플 완충제는 1 ㎎/㎖ CMD(카복시메틸덱스트란, 시그마 #86524)가 보충된 시스템 완충제였다. 상기 시스템은 25 ℃에서 작동하였다. 6500 RU RAM-Fcγ(Fcγ-단편 RamIgG의 상대 단위, GE 헬쓰케어)를 4개의 유동 셀 모두상에 EDC/NHS 화학을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 고정화시켰다. 상기 센서를 1 M 에탄올아민을 사용하여 탈활성화시켰다.
상기 분석물들에 대한 각 항체의 결합 활성을 동역학적으로 시험하였다. 항체들을 5 ㎕/분으로 1분 주입에 의해 35 nM 농도에서 포획하였다. 유량을 100 ㎕/분으로 설정하였다.
상기 시험된 용액 중 분석물들은 인간 헤레귤린 단편(HRG)(서열번호 11), 44 kDa 동종이량체성 단백질(실시예 2e에 따라 제조됨), 인간 재조합 HER2 ECD(서열번호 10)(69.6 kDa), 인간 재조합 HER3 ECD(서열번호 4)(68 kDa), 인간 재조합 HER4 ECD(서열번호 6), 및 100 nM의 Her-3 ECD 및 Her-4 ECD(각각 실온에서 60분 동안 5배 몰 과잉의 헤레귤린과 배양하여 HER3 ECD-HRG 복합체 및 HER4 ECD-HRG 복합체(복합체들의 경우 MW의 추가)를 생성시킨다)였다.
용액 중 분석물들을 3.5분 동안 0 nM, 1.1 nM, 3.7 nM, 11.1 nM, 33.1 nM 및 90 nM의 상이한 농도 단계로 주입하였다. 해리를 15분 동안 모니터링하였다. 가능한 경우, 동역학적 특징들을 랭뮤어 적합도에 따라 평가하였다.
[표 5a]
Figure pct00005
상기 항체 M-205는 상기 Her-3 ECD 헤레귤린 결합 부위 부근의 에피토프 대비 결합 활성을 갖는 쥐 단클론 항체이다(WO 2011/076683에서 Mab205.10.2로서 개시됨). M-205는 상기 Her-3 ECD상의 그의 결합 부위 부근에서 헤레귤린과 경쟁한다.
상기 항체 M-208은 상기 Her-3 ECD 도메인 IV 대비 결합 활성을 갖는 쥐 단클론 항체이다. M-208은 상기 Her-3 ECD에, 상기 Her-3 ECD 입체구조 상태와 독립적으로 결합한다.
M-05-74(=표 5에서 M-074)는 상기 Her-3 ECD에 그의 활성 "개방된" 입체구조(리간드(예를 들어 헤레귤린 HRG)의 존재하에서, "개방된" 입체구조의 상기 Her-3 헤어핀의 보다 양호한 접근성으로 인해 개선된 동역학으로)로 결합한다. 상기 MR은 적어도 2배 더 높다.
상기 음성 대조군 분석물 헤레귤린 베타(HRG) 및 세포외 HER-2 도메인(HER2_ECD)과 대조적으로 항체 결합이 관찰되지 않았다(n.d.). 상기 시험된 항체들은 모두 상기 Her3-ECD(HER3_ECD)에 결합을 나타내었지만, 대단히 상이한 BL 값들을 갖는다.
M-05-74는 상기 Her-3 ECD에 그의 "폐쇄된" 입체구조에서, 보다 빠른 ka = 4.9E+04 l/Ms 및 BL(235 RU)에서 높은 신호 진폭을 갖는 클론 M-205 및 보다 빠른 ka = 5.8E+04 l/Ms 및 또한 BL(367RU)에서 높은 신호 진폭을 갖는 M-208에 비해, 더 느린 결합 속도 상수 ka = 1.3E+04 l/MS 및 보다 작은 BL(70 RU)로 결합한다. 이는 상기 결합의 화학량론(MR)에 대해, M-205(MR = 1.0) 및 M-208(MR = 1.0)이 모두 상기 HER3-ECD에 대해 기능적 1:1 결합을 나타내는 반면, M-05-74는 비-기능적 결합(MR = 0.2)을 나타냄을 암시한다. 여기에서, 상기 M-05-74 대 상기 Her-3 ECD의 상호작용은 구조적으로 불리한 Her-3 ECD 분석물의 일부의 잔여 결합인 것으로 생각된다. 이는 또한 BL(27 RU) 및 (MR = 0.1)과 함께 비-기능적 결합을 나타내는, M-05-74 대 상기 Her-4 ECD의 상호작용에 대해서도 가정된다.
놀라운 결과는 상기 "폐쇄된" Her-3 ECD로부터 "개방된" Her-3 ECD/헤레귤린 복합체로의, ka = 1.3E+04 l/MS(Her3_ECD)로부터 ka = 6.3E+04 l/MS(Her3-ECD-HRG)로의, 상기 M-05-74 결합 속도 상수 ka의 4배 초과(거의 5배)의 증가이다. 따라서, M-05-74는 HER3-ECD에, 4.0 이상의 헤레귤린 존재하의 결합 상수(Ka(+헤레귤린)) 및 헤레귤린 부재하의 결합 상수(Ka(-헤레귤린))의 비(Ka(+헤레귤린))/(Ka(-헤레귤린) = ka (Her3-ECD-HRG)/ka(Her3-ECD) = 6.3E+04[l/Ms]/1.3E+04[l/Ms]) = 4.85))로 결합한다. 이에 의해 상기 몰비는 3배 개선되며, 이는 이제 M-05-74와 Her-3 ECD 헤레귤린 복합체의 1:1 상호작용을 암시한다. 따라서, M-05-74는 HER3-ECD에, 3.0(MR(+헤레귤린))/(MR(-헤레귤린) = 0.6/0.2 = 3)의 헤레귤린 존재하(MR(+헤레귤린)) 및 헤레귤린 부재하(MR(-헤레귤린))의 결합 몰비 MR의 비로 결합한다.
이는 또한 상기 Her-4 ECD/헤레귤린 복합체에 대해서도 유효하고, 이때 몰비는 6배 개선되고, 이는 M-05-74와 상기 Her-4 ECD 헤레귤린 복합체와의 1:1 상호작용을 암시한다. 따라서, M-05-74는 HER4-ECD에, 3.0(MR(+헤레귤린))/(MR(-헤레귤린) = 0.6/0.1 = 6)의 헤레귤린 존재하(MR(+헤레귤린)) 및 헤레귤린 부재하(MR(-헤레귤린))의 결합 몰비 MR의 비로 결합한다. 더욱 또한 놀랍게도 상기 M-05-74 결합 속도 상수 ka는 상기 "폐쇄된" Her-4 ECD로부터 "개방된" Her-4 ECD/헤레귤린 복합체로, ka = 6.7E+03 l/MS(Her3_ECD)에서 ka = 1.6E+05로 20배 초과하여 증가한다. 따라서, M-05-74는 HER4-ECD에, 20.0 이상(Ka(+헤레귤린))/(Ka(-헤레귤린) = ka(Her4-ECD-HRG)/ka(Her4-ECD) = 6.7E+0.4[l/Ms]/1.6E+05[l/Ms] = 23.88)의 헤레귤린 존재하(Ka(+헤레귤린)) 및 헤레귤린 부재하(Ka(-헤레귤린))의 결합 상수(Ka)의 비로 결합한다.
예상한 바와 같이, 헤레귤린 배제물 M-205는 그의 BL 값 및 몰비를 감소시킨다. 상기 몰비는 BL에서 235 RU와 함께 MR = 1.0(Her3-ECD)을 갖는 완전히 기능적인 1:1 상호작용으로부터, BL에서 164 RU와 함께 덜 기능적인 MR = 0.4(Her3-ECD-HRG)로 2.5배 감소된다. 이는 경쟁하는 과잉의 헤레귤린의 존재로 인한 기능성의 상실을 암시한다.
상기 Her-3 ECD 도메인 IV에 결합하는 항체 M-208은 헤레귤린의 존재에 의해 전적으로 영향받지는 않은 채로 남아있는다. 상기 몰비 MR의 현저한 변화를 검출할 수 없었다.
도 7은 헤레귤린-활성화된 Her-3 ECD 복합체에 대한 항-HER3/HER4 β-헤어핀 항체 M-05-74의 결합 방식을 도시한다. M-05-74(플롯 1 참조)는 상기 복합체로부터 헤레귤린을 포획하여 해리를 방지한다. M-05-74는 헤레귤린에 대한 트랩("헤레귤린-싱크")이다. M-05-74는 상기 Her-3 ECD상의 결합 부위에 대해 헤레귤린과 경쟁하지 않는다. 비교를 위해서 M-08-11(플롯 2)을 도시하고; M-08-11(VH 및 VL 서열번호 51 및 52 참조)은 HER4 ECD 및 HER4 β-헤어핀 교차반응성이 없는 또 다른 HER3 β-헤어핀 결합제이며, M-05-74와 상이한 에피토프에 결합한다.
추가의 실험에서 또한 HER1 ECD, T.T.SlyD-cysHer3 및 상기 HER3 β-헤어핀이 없는 T.T.SlyD-cas를 상기 측정에 포함시켰으며, 결과를 표 5b에 나타내고, 상기 표는 실질적으로 M-05-74의 동일한 결합 성질을 나타낸다.
비아코어 T200 장비(GE 헬쓰케어)를 CM5 시리즈 센서와 함께 적재하였다. 상기 센서를 제조사의 설명서에 따라 HBS-ET 완충제(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% w/v 트윈20) 중에서 표준화하였다. 상기 샘플 완충제는 1 ㎎/㎖ CMD(카복시메틸덱스트란, 시그마 #86524)가 보충된 시스템 완충제였다. 상기 시스템은 25 ℃에서 작동하였다. 6500 RU RAM-Fcγ(Fcγ-단편 RamIgG의 상대 단위, GE 헬쓰케어)를 4개의 유동 셀 모두상에 EDC/NHS 화학을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 고정화시켰다. 상기 센서를 1 M 에탄올아민을 사용하여 탈활성화시켰다. 단클론 항체를 10 ㎕/분으로 1분 주입에 의해 상기 센서 표면상에서 포획하였다(CL, 포획 수준). 농도 의존적인 동역학을 측정하였다. 일련의 농도의 분석물 HER-1-ECD, HER-2-ECD, HER-3-ECD, HER-4-ECD, T.T.SlyD-cysHer3 및 T.T.SlyD-cas를 각각 0 nM, 1.1 nM, 3.3 nM, 2 x 10 nM, 30 nM 및 90 nM로 주입하였다. 헤레귤린 베타(HRG)를 0 nM, 17 nM, 2 x 50 nM, 150 nM 및 450 nM로 주입하였으며, 90 nM HER-3 ECD 및 90 nM HER-4 ECD를 2시간 동안 5배 몰 과잉의 HRG 베타와 예비배양하고 0 nM, 1.1 nM, 3.3 nM, 2 x 10 nM, 30 nM 및 90 nM의 HER 농도 단계로 주입하였다. 모든 분석물을 5분 결합 시간 및 10분 해리 시간 동안 100 ㎕/분의 유량으로 주입하였다. 상기 센서 포획 시스템을 10 mM 글리신 pH 1.7 10 ㎕/분의 3분 주입에 의해 재생시켰다. 가능 한 경우 동역학적 데이터를 비아코어 T200 평가 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. HER-3-ECD, HER-4-ECD 및 T.T.SlyD-cysHer3 동역학을 랭뮤어 적합도 모델을 사용하여 평가하였다. M-5-74의 HER3 ECD-HRG 및 HER4 ECD-HRG 동역학을 랭뮤어 적합도 모델에 따라 평가하였다.
[표 5b]
Figure pct00006
실시예 4
항- HER3 항체 M-05-74의 에피토프 맵핑 및 M-05-74와 독특한 에피토프(HER3 및 HER4의 β-헤어핀)와의 작용 방식 분석
비아코어 2000(GE 헬쓰케어) 장비를 사용하여 입수 가능한 에피토프 클론 배양 상등액들을 그들의 결합 특이성에 대해 평가하였다. CM5 센서를 제조사의 설명서에 따라 HBS-ET 완충제(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% w/v 트윈20) 중에서 표준화하였다. 상기 샘플 완충제는 1 ㎎/㎖ CMD(카복시메틸덱스트란, 시그마)가 보충된 시스템 완충제였다. 상기 시스템은 37 ℃에서 작동하였다. 10000 RU RAM-Fcγ(Fcγ-단편 토끼 항-마우스 IgG의 상대 단위/잭슨 레보라토리즈(Jackson Laboratories))를 4개의 유동 셀 모두상에 EDC/NHS 화학을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 고정화시켰다. 상기 센서를 1 M 에탄올아민을 사용하여 탈활성화시켰다.
10 ㎕/분의 유량에서 상기 1차 항체 50 nM 항-HER3 M-05-74를 모든 유동 셀상에서 1분 동안 포획하였다. 상기 유량을 30 ㎕/분으로 설정하고 IgG 차단 용액(50 ㎍/㎖ IgG(20:2:1 IgG1-Fcγ, IgG2a-Fcγ, IgG2b), 로슈)을 5분 동안 주입하였다. 항원 Her-3 ECD를 3분 동안 1.5 μM로 주입하였다.
그 후에, 100 nM의 각각의 항-HER3 2차 항체(a) M-05-74, b) WO 97/35885로부터의 8B8(도면에서 GT라 명명함), c) HER3의 도메인 IV에 결합하는 M-208, 및 d) M-08-11; HER4 ECD 및 HER4 β-헤어핀 교차반응성이 없는 또 다른 HER3 β-헤어핀 결합제)를 30 ㎕/분으로 3분 동안 주입하였다. 상기 센서 표면의 산성 재생을 60초 동안 10 mM 글리신 pH 1.7 30 ㎕/분의 3회 연속 주입을 사용하여 성취하였다.
상기 측정의 소음은 이미 해리된 1차 M-05-74를 재-포화시키는 2차 M-05-74 주입의 재결합에 의해 한정된다. 상기 실험은, 상기 2차 M-208 신호가 M-05-74의 존재하에서 상기 Her-3 ECD를 완전히 포화시키므로, M-208 및 M-05-74가 상기 Her-3 ECD상의 별도의 에피토프들을 차지함을 보였다(도 8을 참조하시오). M-08-11 결합은 M-05-74의 존재에 의해 완전히 차단된다. M-08-11 2차 신호는 심지어 소음 아래이다. 그럼에도 불구하고 M-08-11은 인간 HER4 ECD 및 HER4 β-헤어핀에 결합하지 않기 때문에 M-05-74와는 상이한 에피토프에 결합한다(또한 하기 HER3 및 HER4의 β-헤어핀에 대한 정확한 에피토프 맵핑 데이터를 참조하시오). 상기 8B8(=GT) 2차 항체는 M-05-74의 존재하에서 현저한 신호를 생성시키며, 이는 소음 이상이다. 따라서, 상기 8B8(=GT) 항체는 M-05-74 및 M-08-11과는 또 다른 에피토프에 결합한다.
독특한 에피토프 및 작용 방식을 갖는 M-05-74
비아코아 B3000 장비(GE 헬쓰케어)를 사용하여 클론 배양물 M-05-74 및 항체 8B8(WO 97/35885로부터, 도면에서 GT라 명명됨)을, Her-3 ECD의 "폐쇄된" 입체구조 및 "개방된", 헤레귤린-활성화된 Her-3 ECD에 대해서 동역학적으로 평가하였다. CM5 시리즈 센서를 제조사의 설명서에 따라 HBS-ET 완충제(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% w/v 트윈20) 중에서 표준화하였다. 상기 샘플 완충제는 1 ㎎/㎖ CMD(카복시메틸덱스트란)가 보충된 시스템 완충제였다. 상기 시스템은 25 ℃에서 작동하였다. 10000 RU RAM-Fcγ(Fcγ-단편 토끼 항-마우스 IgG의 상대 단위/잭슨 레보라토리즈)를 모든 유동 셀상에 EDC/NHS 화학을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 고정화시켰다. 상기 센서를 1 M 에탄올아민을 사용하여 탈활성화시켰다. 용액 중 분석물을 2분 동안 0 nM, 1.1 nM, 3.7 nM, 11.1 nM, 33.1 nM 및 90 nM의 상이한 농도 단계에서 100 ㎕/분으로 주입하였다. 해리를 5분 동안 모니터링하였다. 상기 센서 표면의 산성 재생을 60초 동안 30 ㎕/분으로 10 mM 글리신 pH 1.7의 3회의 연속적인 주입을 사용하여 성취하였다. 동역학적 데이터를 랭뮤어 적합도에 따라 평가하였다.
[표 6]
Figure pct00007
상기 표에서, 항체 클론 M-05-74 및 항체 8B8의 동역학적 데이터를 나열한다. M-05-74는 상기 헤레귤린-활성화된 Her-3 ECD에 높은 기능성 MR = 0.8로 결합하고 헤레귤린 트랩으로서 작용한다(또한 도면 비아코어 센서그램 실시예 3b 및 도 7을 참조하시오).
t1/2 해리 = 0.8분을 갖는 상기 8B8 항체의 복합체 안정성은 약하다. 8B8은 MR = 0.4로 결합한다. 상기 8B8 항체의 분리된 해리 상 및 헤레귤린 해리를 식별할 수 없다. 헤레귤린은 8B8처럼 동일한 시간틀 및 동일한 속도로 완전히 해리된다. 8B8 항체는 상기 헤레귤린 해리를 지연시키지 않는다.
M-05-74는 KD = 27 nM로 서열번호 1의 HER3 β-헤어핀을 포함하는 써무스 써모필루스 SlyD FKBP-Her3에 기능적으로 결합한다(MR = 1.5). 상기 항체 8B8은 써무스 써모필루스 SlyD FKBP-Her-3 융합 폴리펩타이드를 포함하는 HER3 β-헤어핀에 결합하지 않으므로, 상기 항체는 M-05-74와는 또 다른 에피토프를 표적화한다.
도 9는 상이한 결합 작용 방식들을 도시하는 항-HER3/HER4 항체 M-05-74, 항-HER3 항체 M-08-11 및 항-HER3 항체 8B8(WO 97/35885로부터)의 비아코어 센서그램들의 오버레이 플롯이다. 항-HER3/HER4 항체 M-05-74는 상기 헤레귤린-활성화된 Her-3 ECD(1)를 t1/2 해리 = 18분으로 포획하고 헤레귤린-싱크로서 작용한다. 항-HER3 항체 M-08-11 HER3(HER4 ECD 및 HER4 β-헤어핀 교차반응성이 없는 β-헤어핀 결합제)은 헤레귤린 해리(2)를 지연시키고 복잡한 2-상태 동역학을 생성시킨다. 8B8 항체(3)는 헤레귤린을 포획하지 않으며 상기 Her-3 ECD/헤레귤린 복합체로부터 헤레귤린 해리를 지연시키지 않는다. 상기 헤레귤린/Her-3 ECD 복합체는 완벽한 랭뮤어 상호작용이기 때문에, 상기 8B8 항체로부터 완전한 복합체로서 신속하고 완전하게 해리된다.
도 10에서 상기 결합 작용 방식의 도해를 도시한다: 1: M-08-11은 헤레귤린 활성화된 Her-3 ECD에 결합하고 지연된 헤레귤린 해리를 유도하고, 이때 M-08-11은 상기 Her-3 ECD 수용체 복합체 중에서 유지된다. 2: M-05-74는 헤레귤린 활성화된 Her-3 ECD에 결합한다. 헤레귤린은 상기 복합체 중에 포획되며 상기 항체는 상기 복합체 중에서 유지된다. 3: 8B8은 헤레귤린 활성화된 Her-3 ECD에 결합한다. 전체 복합체가 상기 항체로부터 해리된다.
펩타이드 -기재 2D 에피토프 맵핑
또 다른 실시태양에서 펩타이드-기재 에피토프 맵핑 실험을 셀루스팟스(상표) 합성 및 에피토프 맵핑 기술을 사용함으로써 수행하여 상기 Her-3 ECD 에피토프를 특성화하였다. 에피토프 맵핑을 인간 Her-1 ECD, Her-2 ECD, Her-3 ECD 및 Her-4 ECD 펩타이드 헤어핀의 서열들에 상응하는 중복되는, 고정화된 펩타이드 단편들(길이: 15 아미노산)의 라이브러리에 의해 수행하였다. 도 11에서, 에피토프 맵핑 및 알라닌-스캔 접근법의 전략을 도시한다. 구조적 매몰(구조적)을 포함하여 HER1(EGFR) ECD, HER2 ECD, HER3 ECD 및 HER4 ECD의 펩타이드 헤어핀 서열(β-헤어핀)을 조사하였다. 시스테인을 세린에 의해 치환시켰다. 상기와 같은 β-헤어핀들에의 결합을 통한 항체들의 항체 선택을 위해서, 상기 HER3 및 HER4의 β-헤어핀을 서열번호 1 및 서열번호 2에 의해 한정한다.
합성된 각각의 펩타이드는 하나의 아미노산에 의해 이동되었다. 즉, 상기 펩타이드는 각각 앞 및 뒤의 펩타이드와 14개 아미노산 중복을 가졌다. 상기 펩타이드 배열의 제조를 위해서, 인타비스(Intavis) 셀루스팟스(상표) 기술을 사용하였다. 상기 접근법에서, 펩타이드를 합성 후 용해되는 변형된 셀룰로스 원반상에서 자동화된 합성기(인타비스 멀티펩(MultiPep) RS)로 합성하였다. 이어서 거대분자 셀룰로스에 공유 결합된 채로 있는 개별적인 펩타이드의 용액들을 코팅된 현미경 슬라이드상에 스폿팅하였다. 상기 셀루스팟스(상표) 합성을 384-웰 합성 플레이트에서 아미노-변형된 셀룰로스 원반상에서 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 화학을 사용하여 단계적으로 수행하였다. 각각의 커플링 주기에서, 상응하는 아미노산을 DMF 중의 DIC/HOBt 용액으로 활성화시켰다. 커플링 단계 사이에서, 반응되지 않은 아미노기를 아세트산 무수물, 다이아이소프로필에틸 아민 및 1-하이드록시벤조트라이아졸의 혼합물로 캡핑하였다. 상기 합성의 완료시, 상기 셀룰로스 원반을 96-웰 플레이트로 옮기고 측쇄 탈보호를 위해 트라이플루오로아세트산(TFA), 다이클로로메탄, 트라이아이소프로필실란(TIS) 및 물의 혼합물로 처리하였다. 상기 절단 용액의 제거 후에, 상기 셀룰로스 결합된 펩타이드를 TFA, TFMSA, TIS 및 물의 혼합물로 용해시키고, 다이아이소프로필 에테르로 침전시키고 DMSO에 재-현탁시킨다. 이들 펩타이드 용액을 후속으로 인타비스 슬라이드 스폿팅 로봇을 사용하여 인타비스 셀루스팟스(상표) 슬라이드상에 스폿팅하였다.
에피토프 분석을 위해서, 상술한 바와 같은 슬라이드를 에탄올로 세척하고 이어서 트리스-완충된 염수(TBS; 50 mM 트리스, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 8)로 세척한 후에 TBS, 0.1% 트윈-20 중의 5 ㎖의 10x 웨스턴 차단 시약(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science)), 2.5 g 슈크로스로 4 ℃에서 16시간 동안 차단하였다. 상기 슬라이드를 TBS 및 0.1% 트윈-20으로 세척하고 그 후에 주변 온도에서 2시간 동안 TBS 및 0.1% 트윈20 중의 상응하는 IGF1 항체 1 ㎍/㎖와 배양하고 후속으로 TBS + 0.1% 트윈20으로 세척하였다. 검출을 위해서, 상기 슬라이드를 항-토끼/항-마우스 2차 HRP-항체(TBS-T 중의 1:20000)와 함께 배양한 다음 화학발광성 기질 루미놀과 배양하고 루미이미저(LumiImager)(로슈 어플라이드 사이언스)로 시각화하였다. ELISA-양성 SPOT를 정량분석하고 상응하는 펩타이드 서열의 지정을 통해 항체 결합 에피토프를 확인하였다.
도 12에 도시된 바와 같이, M-05-74는 아미노산 서열 VYNKLTFQLEP(서열번호 43), 및 EGFR 및 HER2 ECD 중의 헤어핀 동기에 비해 검출할 수 있는 신호가 없는 아미노산 서열 VYNPTTFQLE(서열번호 44)를 갖는 HER4 ECD 에피토프에 대해 교차반응성을 갖는 HER3 ECD 에피토프를 도시한다. 8B8 항체에 대해서는 신호를 전혀 검출할 수 없었고, 따라서, 상기 8B8 항체는 상기 헤어핀 펩타이드 동기와 상이한 에피토프들을 표적화한다. M-08-11은 상기 Her-그룹의 다른 헤어핀 서열들에 대해 검출할 수 있는 교차반응성이 없는 아미노산 서열 PLVYNKLTFQLE를 갖는 HER3 ECD 특이성 에피토프를 나타낸다.
도 13에서, 항-HER3/HER4 항체 M-05-74의 그의 HER3 ECD 결합 에피토프 VYNKLTFQLEP(서열번호 43) 및 그의 HER4 ECD 결합 에피토프 VYNPTTFQLE(서열번호 44)에의 결합에 가장 기여하는, Ala-Scan에 의해 식별된 아미노산들을 밑줄 긋고/거나 굵게 나타낸다.
실시예 5
HER3 항체의 존재하에서 HRG의 HER3 - ECD에의 결합(ELISA)
스트렙트아비딘-코팅된 96-웰 플레이트를 4 ℃에서 SBP-태그된 HER3-ECD를 함유하는 세포 배양 상등액과 함께 배양하였다. 다음 날 상기 웰을 세척 완충제(PBS + 0.05% 트윈-20)로 3회 세척하고 1% BSA를 함유하는 PBS로 1시간 동안 차단하였다. 세척 완충제로 추가로 3회 세척 후에, 40 ㎕의 항체 용액(델피아(Delfia) 결합 완충제 중의)을 각 웰에 목적하는 최종 농도(10-3 내지 103 nM, 선택적으로 10-4 내지 102 nM)의 2x 모액으로서 가하였다. 즉시 40 ㎕의 20 nM 유로피움-표지된 헤레귤린-베타(페프로테크(PeproTech), Cat. #100-03)를 가하여 10 nM의 최종 농도를 성취하였다. 상기 플레이트를 실온에서 2시간 동안 진탕기상에서 배양하였다. 델피아 세척 완충제로 3회 세척에 이어서, 델피아 증강 용액을 가하고 진탕기상에서 15분 동안(광 차단) 배양하였다. 최종적으로, 상기 플레이트를 시간-분석된 형광 측정 프로토콜을 사용하여 테칸 인피니트(Tecan Infinite) F200 판독기에서 측정하였다. M-05-74(도 14에서 M-074로 명명됨)의 결합은 650의 신호에서 평탄역에 도달할 때까지 HRG의 HER3-ECD에의 결합을 촉진할 수 있다. 결과를 도 14에 도시한다.
실시예 6
a) ZR -75-1 세포에서 HER3 인산화의 억제
분석을 하기의 프로토콜에 따라 ZR-75-1 세포에서 수행하였다: 세포를 500,000 세포/웰로 10% FCS가 있는 RPMI1640 배지에서 폴리-D-리신 코팅된 6-웰 플레이트내에 시딩한다. 24시간 동안 배양하다. 배지를 흡출에 의해 제거하고, 0.5% FCS가 있는 500 ㎕/웰 RPMI 1640과 함께 밤새 배양한다. 항체를 0.5% FCS가 있는 500 ㎕의 RPMI 1640 중에 가한다. 1시간 동안 배양한다. 헤레귤린-베타(페프로테크, cat. #100-03)(최종 농도 500 ng/㎖)를 10분 동안 가한다. 상기 세포를 용해시키기 위해서 배지를 제거하고 80 ㎕ 빙냉 트리톤-X-100 세포 용해 완충제를 가하고 얼음상에서 5분 동안 배양한다. 상기 용해물을 1.5 ㎖ 반응 튜브로 옮기고 4 ℃에서 14000 rpm에서 15분 동안 원심분리시킨 후에, 상등액을 새로운 반응 튜브로 옮긴다. SDS 부하 완충제 중에 동량의 단백질을 함유하는 샘플들을 SDS PAGE상에서 분리시키고 반-건조 웨스턴 블럿을 사용하여 나이트로셀룰로스 멤브레인에 블럿팅하였다. 멤브레인을 1xNET-완충제 + 0.25% 젤라틴에 의해 1시간 동안 차단하고 pHER3을 항체 α포스포-HER3/ErbB3(Tyr1289)(21D3), 셀 시그널링(Cell Signaling), #4791에 의해서 검출하고, HER3을 항체 αErbB3(C-17), 산타 크루즈(Santa Cruz), #sc-285에 의해 검출한다. POD 커플링된 2차 항체에 의한 신호의 세척 및 검출 후에, 밴드를 덴소미터에 의해 스캐닝하였다. zr-75-1 세포에서 수용체 인산화에 대한 항-HER3 항체 M-05-74의 억제 퍼센트(%)를 하기 표 7에 나타낸다.
[표 7]
Figure pct00008
b) 2가 모 M-05-74 및 M-05-74의 Fab 단편( Fab - 74)의 HER3 인산화의 억제
MCF-7 세포를 24-웰 플레이트(1 ㎖ RPMI, 10% FCS, 3x105 세포/웰)에 시딩하고 37 ℃/5% CO2에서 밤새 배양하였다. 24시간 후에 상기 배지를 0.5% FCS를 함유하는 1 ㎖ 배지로 교체하였다. 48시간 후에 상기 항체를 10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 및 0.1 ㎍/㎖(M-05-74) 및 6.66 ㎍/㎖, 0.66 ㎍/㎖ 및 0.066 ㎍/㎖(Fab-074)의 최종 농도로 가하였다. 상기 플레이트를 37 ℃에서 50분 동안 배양하고 이어서 헤레귤린-베타(페프로테크, Cat. #100-03)를 500 ng/㎖의 최종 농도로 가하였다. 상기 플레이트를 추가로 10분 동안 37 ℃/CO2에서 배양하였다. 상기 세포를 PBS로 세척하고 아프로티닌(10 ㎍/㎖), 오쏘바나데이트(0.4 mM), 페닐메틸설포닐 플루오라이드(1 mM)를 함유하는 40 ㎕ 트리톤 용해 완충제(1% 트리톤) 중에 용해시켰다. 26 ㎕의 상기 수집된 용해물을 반응 튜브로 옮기고 14 ㎕ 샘플 완충제(NuPAGE LDS 샘플 완충제 4x, NuPAGE 샘플 환원제 10x)를 가하였다. 상기 샘플들을 70 ℃에서 10분 동안 배양하고 이어서 SDS-PAGE(NuPAGE, 4 내지 12% 비스-트리스-미니-젤)에 의해 분석하였다. 전기블럿팅을 iBlot 건식 블럿팅 시스템(인비트로젠)을 사용하여 수행하였다. 상기 나이트로셀룰로스 멤브레인을 포스포HER3 항체(α 포스포 Her3, 셀시그널링 #4791, 토끼 1:1000)와 배양한 다음 HRP-접합된 2차 항체(염소 항 토끼 1:5000, 바이오래드(BioRad) cat: 170-6515)와 배양하였다. X-선 필름(로슈 루미 필름(Lumi-Film) 화학발광 검출 필름 11666657001)상에서 ECL 검출 시약(에머샴 RPN2209)을 사용하여 신호를 발생시켰다. 상기 항-HER3 항체 M-05-74(하이브리도마로부터 정제된 전장) 및 상기 항체의 Fab 단편 Fab-74(전장 M-05-74로부터 파파인 절단에 의해 수득됨)를 동몰량으로 조사하였다. Fab 단편을 상기 항체의 파파인 절단에 의해 생성시켰다. 간단히, 1 ㎖의 약 2 ㎎/㎖ 항체 함유 용액에 25 mM 시스테인 및 70 ㎍ 파파인(로슈)을 보충하였다. 37 ℃에서 1.5시간 동안 배양 후, 요오도아세트아미드의 첨가에 의해 절단 반응을 중지시키고 반응 혼합물을 맵셀렉트 슈어(MabSelect Sure)(GE 헬쓰케어)에 의해 정제하였다. 상기 Fab 함유 통과 분획을 크기 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스(superdex) 200; GE 헬쓰케어)에 의해 추가로 정제시켰다.
MCF7 세포에서 수용체 인산화에 대한 항-HER3 항체의 억제 퍼센트(%)를 하기 및 표 8에 요약한다. 상기 항체 M-05-74(하이브리도마로부터 전장) 및 상기 항체의 Fab 단편 Fab-74는 동몰 농도로 HER3 인산화를 필적하는 정도로 억제할 수 있다.
[표 8]
Figure pct00009
실시예 7
MCF7 세포에서 HER2 / HER3 이종이량체의 억제(면역침전 및 웨스턴 블럿 )
MCF-7 세포를 6-웰-플레이트(2 ㎖ RPMI, 10% FCS, 8x105 세포/웰)에 시딩하고 밤새 증식시켰다. 다음날 상기 배지를 0.5% FCS를 함유하는 2 ㎖ 기아 배지로 교환하였다. 3일째에 상기 항체를 10 ㎍/㎖의 최종 농도로 가하고 상기 플레이트를 37 ℃에서 배양하였다. 50분 후에 헤레귤린-베타(페프로테크, Cat.#100-03)를 500 ng/㎖의 최종 농도로 가하고 상기 플레이트를 37 ℃에서 추가로 10분 동안 배양하였다. 상기 세포를 PBS로 세척하고 1% 디지토닌을 함유하는 250 ㎕ 트리톤 용해 완충제에 용해시켰다. 60 ㎕의 상기 수집된 용해물을 반응 튜브로 옮기고 40 ㎕의 항체-커플링된 세파로스(허셉틴 또는 HER3-항체 #208) 및 0.3% 디지토닌을 함유하는 500 ㎕의 완충제와 함께 배양하였다. 상기 반응 혼합물을 4 ℃에서 밤새 휠 회전기상에서 배양하였다. 다음날 상기 반응 혼합물을 0.3% 디지토닌을 함유하는 500 ㎕의 완충제로 3회 세척하였다. 최종 세척 후에 상등액을 버리고 10 ㎕의 4x 부하 완충제를 가하였다. 상기 튜브를 70 ℃에서 10분 동안 배양하고 후속적으로 상등액을 SDS-PAGE용 젤상에 부하하였다. 이어서 반-건식 웨스턴 블럿 후에 HER2 항체로 면역침전된 샘플을 함유하는 멤브레인들을 항-HER3/HER4 항체 M-05-74(도 15에서 M-074)와 배양하였으며 이와 역으로도 수행하였다. 이어서 상기 멤브레인들을 HRP-접합된 2차 항체와 함께 배양하고 ECL 신호를 X-선 필름상으로 옮겼다. 결과를 도 15에 도시하고, 상기 도면은 상기 M-05-74에 의한 HER2/HER 이종이량체 형성(HER2/HER 이종이량체화)의 강한 억제를 나타낸다.
실시예 8
MDA - MB -175 세포에서 M-05-74의 종양 세포 증식의 억제
세포 증식 분석에서 HER3 항체 M-05-74의 항-종양 효능을 MDA-MB-175 세포(VII 인간 유방 암종 세포, ATCC 카탈로그 번호 HTB-25)를 사용하여 평가하였다. 웰당 20,000 세포를, 10% FCS를 함유하는 DMEM/F12 세포 배양 배지를 갖는 멸균 96 웰 조직 배양 플레이트내에 시딩하고 37℃±1℃ 및 5%±1% CO2에서 하루 동안 배양하였다. 상기 세포는 약 3일의 배가 시간을 갖는 느리게 성장하는 세포이다. 항-HER3 항체를 연속 희석해서 가하고 6일 동안 추가로 배양하였다. 이어서 세포 생육력을 alamarBlue(등록상표) 판독정보를 사용하여 평가하였다. EC50 값을 계산하였다.
[표 9]
Figure pct00010
실시예 9
항- HER3 항체 M-05-74의 생체내 항종양 효능
항-HER3 항체 M-05-74(M-074)의 생체내 항종양 효능을 SCID 베이지상에 이식된 다양한 종양 기원(예를 들어 SCCHN 및 췌장암)의 세포 기재 모델에서 검출할 수 있었다. 예로서 SCCHN 이종이식 모델 FaDu(세포주 기재)에 대한 데이터를 나타낸다.
시험제
M-05-74를 하이브리도마 세포로부터 발현되고 정제된 독일 펜츠베르크 소재의 로슈로부터 모액으로서 제공하였다. 항체 완충제는 히스티딘을 포함하였다. 항체 용액을 주입 전 모액으로부터 완충제 중에서 적합하게 희석하였다.
세포주 및 배양 조건
HNSCC 세포로부터의 FaDu를 당초 ATCC로부터 수득하였다. 상기 종양 세포주는 10% 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루베이트 및 0.1 mM NEAA가 보충된 MEM 이글 배지에서 수-포화된 대기하에 37 ℃ 및 5% CO2에서 통상적으로 배양되었다. 계대 배양을 3일마다 트립신/EDTA 1x 분할로 수행하였다.
동물
암컷 SCID 베이지 또는 누드 마우스를 사육자(예를 들어 독일 슐츠펠트 소재의 찰스 리버(Charles River))로부터 구입하고 관련된 지침(GV-Solas; Felasa; TierschG)에 따라 12시간 명/12시간 암의 1일 주기로 특수-무균 조건하에서 유지시켰다. 실험 연구 프로토콜을 재검토하고 지방 정부의 승인을 받았다. 동물들을 도착 후 1주일 동안 격리된 동물 시설에서 유지시켜 새로운 환경에 순응하게 하고 관찰하였다. 지속적인 건강 모니터링을 규칙적으로 수행하였다. 식이요법 식사(Provimi Kliba 3337) 및 물(산성화된 pH 2.5 내지 3)을 자유롭게 제공하였다.
동물들을 임상 증상 및 부작용의 검출에 대해 매일 검사하였다. 상기 실험 전체를 통한 모니터링을 위해 동물들의 체중을 문서에 기록하였다.
동물 처리는 동물 랜덤화 후 세포 이식 후 중간 종양 크기가 약 100 내지 150 mm3일 때 개시하였다. 항체를 단일 작용제로서 모델에 따라 수 주일 동안 매주 1회 10 ㎎/㎏ i.p. q7d로 투여하였다. 상응하는 비히클을 같은 날에 투여하였다.
FaDu HNSCC 이종이식편을 갖는 마우스를 10 내지 24 연구일로부터 항체 M-05-74로 처리하였다. 그 결과, H-74 항체에 의한 처리는 s.c. FaDu 이종이식편의 거의 종양 정지와 함께 현저한 항-종양 효능을 나타내었다. 상기 종양 성장 억제(TGI)는 89%로 계산되었다.
M-05-74에 의한 처리(10 ㎎/㎏ q7dx3, i.p.)는 FaDu의 거의 종양 정지를 생성시켰다. 결과를 도 17에 도시하고, 여기에서 M-05-74는 M-074로 명명된다.
실시예 10
M-05-74- Fab -슈도모나스 외독소 접합체(M-05-74- PE )의 생성
M-05-74의 Fab 단편, PE24 변이체, 및 슈도모나스 외독소 변이체 PE24LR8M에 접합된 M-05-74의 Fab 단편의 발현, 정제 및 재생은 서열번호 45, 46, 47, 48(또는 49)의 서열을 기본으로 하였다.
Fab의 발현(예를 들어 분류효소 커플링을 위한) - 발현 벡터
상기 개시된 Fab 단편의 발현을 위해서, CMV-인트론 A 프로모터가 있거나 없는 cDNA 기구 또는 CMV 프로모터를 갖는 게놈 기구를 기본으로 하는 일시 발현(예를 들어 HEK293-F) 세포용 발현 플라스미드의 변이체들을 적용하였다.
항체 발현 카세트 외에 상기 벡터는
- 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 복제 기원, 및
- 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 β-락타마제
를 함유하였다.
상기 항체 유전자의 전사 단위는 하기의 요소들로 구성되었다:
- 5' 단부에 독특한 제한 부위(들)
- 인간 거대세포바이러스로부터의 급초기 인헨서 및 프로모터,
- cDNA 기구의 경우에, 이어서 인트론 A 서열,
- 인간 항체 유전자의 5'-비번역 영역,
- 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- cDNA로서 또는 면역글로불린 엑손-인트론 기구를 갖는 게놈 기구로서 인간 항체 쇄,
- 폴리아데닐화 신호 서열을 갖는 3'-비번역 영역, 및
- 3'-단부에 독특한 제한 부위(들).
하기에 개시하는 바와 같은 항체 쇄를 포함하는 융합 유전자를 PCR 및/또는 유전자 합성에 의해 생성시키고 공지된 재조합 방법 및 기법에 의해, 예를 들어 각각의 벡터 중의 독특한 제한 부위들을 사용하여 상응하는 핵산 분절들의 연결에 의해 조립하였다. 상기 서브클로닝된 핵산 서열들을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 일시적인 형질감염을 위해서 보다 많은 양의 플라스미드를 형질전환된 에스케리키아 콜라이 배양물로부터의 플라스미드 제제에 의해 제조하였다(뉴클레오본드(Nucleobond) AX, 마슈레이-나겔(Macherey-Nagel)).
세포 배양 기법
표준 세포 배양 기법을 문헌[Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.]에 개시된 바와 같이 사용하였다.
상기 Fab 단편을 하기에 개시하는 바와 같이 현탁액 중에서 생육하는 HEK29-F 세포 중의 중쇄 및 경쇄의 발현 플라스미드의 일시적인 동시-형질감염에 의해 발현하였다.
HEK293 -F 시스템에서 일시적인 형질감염
상기 Fab 단편을 제조사의 설명서에 따라 HEK293-F 시스템(인비트로젠)을 사용하여 각각의 플라스미드(예를 들어 중쇄 및 변형 중쇄뿐만 아니라 상응하는 경쇄 및 변형 경쇄를 암호화하는)에 의한 일시적인 형질감염에 의해 생성시켰다. 간단히, 무혈청 프리스타일(상표) 293 발현 배지(인비트로젠) 중의 진탕 플라스크 또는 교반식 발효기에서 현탁액 중에서 생육하는 HEK293-F 세포(인비트로젠)를 4개의 발현 플라스미드 및 293-프리(상표)(노바겐(Novagen)) 또는 펙틴(Fectin)(인비트로젠)의 혼합물로 형질감염시켰다. 2 L 진탕 플라스크(코닝)의 경우 HEK293-F 세포를 600 ㎖ 중 1.0E*6 세포/㎖의 밀도로 시딩하고 120 rpm, 8% CO2에서 배양하였다. 그 다음날 상기 세포를 A) 각각 상기 중쇄 또는 변형 중쇄 및 동몰비의 상응하는 경쇄를 암호화하는 전체 플라스미드 DNA(1 ㎍/㎖) 600 ㎍을 갖는 20 ㎖ Opti-MEM(인비트로젠 및 B) 20 ㎖ Opti-MEM + 1.2 ㎖ 293-프리(노바젠) 또는 펙틴(2 ㎕/㎖)의 약 42 ㎖ 혼합물로 약 1.5E*6 세포/㎖의 세포 밀도로 형질감염시켰다. 글루코스 소비에 따라 글루코스 용액을 상기 발효 기간 동안 가하였다. 분비된 항체를 함유하는 상등액을 5 내지 10일 후에 수확하고 항체를 상기 상등액으로부터 직접 정제하거나 상기 상등액을 동결시키고 보관하였다.
분류효소 커플링-발현 벡터를 위한 슈도모나스 외독소 변이체 PE24- LR8M의 발현
PE24-LR8M의 발현을 위해서 에스케리키아 콜라이 발현 플라스미드를 사용하였다.
상기 벡터는 상기 슈도모나스 외독소 A 도메인 III에 대한 발현 카세트 외에 하기를 함유하였다:
- 에스케리키아 콜라이에서 복제를 위한 벡터 pBR322로부터의 복제 기원(문헌[Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90]에 따라),
- 에스케리키아 콜라이로부터 lacI 리프레서 유전자(문헌[Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769]),
- 에스케리키아 콜라이 pyrF 결실 균주(유라실 영양요구성)의 상보성에 의한 플라스미드 선택을 허용하는 오로티딘 5'-포스페이트 데카복실라제(문헌[Rose, M. et al. Gene 29 (1984) 113-124])를 암호화하는 사카로마이세스 세레비지아에의 URA3 유전자.
상기 독소 유전자의 전사 단위는 하기의 요소들로 구성되었다:
- 5' 단부의 독특한 제한 부위(들),
- 스튜에베르 D(Stueber, D.) 등(하기 참조)에 따른 합성 리보솜 결합 부위를 포함하는 T5 하이브리드 프로모터(문헌[Bujard, H., et al. Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433] 및 문헌[Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152])에 따른 T5-PN25/03/04 하이브리드 프로모터),
- N-말단 커플링 태그에 이어서 퓨린 부위를 갖는 슈도모나스 외독소 A 도메인 III(분류효소 커플링을 위한 GGG 링커를 포함하는, 서열번호 45 슈도모나스 외독소 변이체 PE24LR8M_3G),
- 2개의 박테리오파지-유래된 전사 종결자, λ-T0 종결자(문헌[Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414]) 및 fd-종결자(문헌[Beck E. and Zink, B. Gene 1-3 (1981) 35-58]),
- 3'-단부의 독특한 제한 부위(들).
화학적 규명 배지상의 에스케리키아 콜라이 유가 과정에서 슈도모나스 외독소 A 구조물 변이체 PE24- LR8M _3G의 배양 및 발현
PE24-LR8M_3G_Ecoli(25 kDa)의 발현을 위해서, 에스케리키아 콜라이 영양요구성(PyrF)의 상보성에 의해 무항생제 플라스미드 선택을 가능하게 하는 에스케리키아 콜라이 숙주/벡터 시스템을 사용하였다(EP 0 972 838 및 미국특허 제 6,291,245 호).
에스케리키아 콜라이 K12 균주를 상기 발현 플라스미드에 의한 일렉트로포레이션에 의해 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 에스케리키아 콜라이 세포를 먼저 아가 플레이트상에서 37 ℃에서 증식시켰다. 상기 플레이트로부터 채집된 콜로니를 3 ㎖ 롤러 배양물로 옮기고 37 ℃에서 1 내지 2의 광학 밀도(578 ㎚에서 측정됨)로 증식시켰다. 이어서 1000 ㎕의 배양물을 1000 ㎕의 멸균 86%-글리세롤과 혼합하고 장시간 보관을 위해 -80 ℃에서 바로 동결시켰다. 10 L 발효기로 옮기기 전에 상기 클론의 올바른 생성물 발현을 먼저 소규모 진탕 플라스크 실험에서 확인하고 SDS-Page로 분석하였다.
예비 배양:
전-발효를 위해서 화학적 규명 배지를 사용하였다. 전-발효를 위해서 4개의 배플을 갖는 1000 ㎖ 삼각-플라스크 중의 220 ㎖의 배지에 1차 시드 뱅크 앰플로부터 1.0 ㎖를 접종하였다. 상기 배양을 2.9의 광학 밀도(578 ㎚)가 획득될 때까지 32 ℃ 및 170 rpm에서 8시간 동안 회전 진탕기상에서 수행하였다. 100 ㎖의 예비 배양물을 사용하여 상기 10 L 생물반응기의 배치 배지를 접종하였다.
발효:
10 L 바이오스탯(Biostat) C, DCU3 발효기(사르토리우스(Sartorius), 독일 멜숭겐 소재)에서의 발효를 위해서 화학적 규명 배치 배지를 사용하였다. 모든 성분들을 탈이온수에 용해시켰다. pH 조절용 알칼리성 용액은 11.25 g/1 L-메티오닌이 보충된 수성 12.5%(w/v) NH3 용액이었다.
상기 예비 배양으로부터의 100 ㎖ 접종물 + 4.2 L 멸균 배치 배지로 출발하여 상기 배치 발효를 31 ℃, pH 6.9±0.2, 800 mbar 배압 및 10 l/분의 초기 통기율로 수행하였다. 용존 산소(pO2)의 상대적인 값을, 교반기 속도를 1500 rpm까지 증가시킴으로써 상기 발효 전체를 통해 50%에서 유지시켰다. 용존 산소 값의 예리한 증가에 의해 나타난, 상기 초기에 보충된 글루코스의 고갈 후에, 온도를 25 ℃로 이동시키고 15분 후에 상기 발효는 2개 공급물 공급(각각 60 및 14 g/h)이 모두 개시되는 유가 방식에 돌입하였다. 공급물 2의 속도를 일정하게 유지시키면서, 공급물 1의 속도는 60에서부터 7시간 이내에 최종적으로 160 g/h의 소정의 공급 프로파일로 단계적으로 증가시킨다. 이산화 탄소 오프 가스 농도가 2% 이상으로 고르게되었을 때 상기 통기율을 5시간 이내에 10에서 20 l/분으로 일정하게 증가시켰다. 재조합 PE24-LR8M_3G_Ecoli 단백질의 발현을 약 120의 광학 밀도에서 2.4 g IPTG의 첨가에 의해 유도하였다. 표적 단백질은 상기 세포질내에서 용해성으로 발현된다.
24시간의 배양 후에 209의 광학 밀도가 성취되며 전체 브로쓰를 4 내지 8 ℃로 냉각시킨다. 세균을 통과식 원심분리기(13,000 rpm, 13 l/h)에 의한 원심분리를 통해 수확하고 상기 수확된 바이오매스를 추가의 가공(세포 파괴)시까지 -20 ℃에서 보관한다. 수율은 1 L당 67.5 g의 건조 세포이다.
생성물 형성의 분석:
상기 발효기로부터 채취한 샘플들(하나는 단백질 발현의 유도 전 및 다른 것들은 상기 유도 후 지정된 시점들에서)을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석한다. 모든 샘플로부터 동일한 양의 세포(OD표적 = 10)를 5 ㎖의 PBS 완충제에 현탁하고 얼음상에서 초음파 처리를 통해 붕괴시킨다. 이어서 100 ㎕의 각각의 현탁액을 원심분리시키고(15,000 rpm, 5분) 각각의 상등액을 회수하여 별도의 바이알로 옮긴다. 이는 용해성 및 불용성 발현된 표적 단백질을 구별하기 위한 것이다. 각각의 상등액(=용해성 단백질 분획)에 100 ㎕, 및 각각의 펠릿(=불용성 단백질 분획)에 200 ㎕의 SDS 샘플 완충제(문헌[Laemmli, U.K., Nature 227(1970) 680-685])를 가한다. 샘플들을 강한 혼합하에 95 ℃에서 15분 동안 가열하여 상기 샘플 중의 모든 단백질을 용해시키고 환원시킨다. 실온으로 냉각 후에 5 ㎕의 각 샘플을 4 내지 20% TGX 크리테리온 스테인 프리(Criterion Stain Free) 폴리아크릴아미드 젤(바이오 래드(Bio-Rad))로 옮긴다. 추가로 5 ㎕의 분자량 표준(프리시전 플러스 프로테인 스탠다드(Precision Plus Protein Standard), 바이오 래드)을 적용하였다.
상기 전기영동을 200V에서 60분 동안 실행하고 그 후에 상기 젤을 GelDOC EZ 이미저(바이오 래드)로 옮기고 5분 동안 UV 조사로 처리하였다. 젤 상들을 이미지 랩(Image Lab) 분석 소프트웨어(바이오 래드)를 사용하여 분석하였다. 단백질 발현의 상대적인 정량분석을, 상기 생성물 밴드의 부피와 상기 분자량 표준의 25 kDa 밴드의 부피를 비교함으로써 수행하였다.
화학적 규명 배지상의 에스케리키아 콜라이 유가 과정에서 항체 단편 경쇄 구조물(VL) 및 항체 단편 중쇄 슈도모나스 외독소 A 변이체 융합물(Fab-PE24)의 배양 및 발현
Fab-경쇄(23.4 kDa) 및 Fab-중쇄 PE24 융합물(48.7 kDa)의 발현을 위해서 에스케리키아 콜라이 영양요구성(PyrF)의 상보성에 의해 무항생제 플라스미드 선택을 가능하게 하는 에스케리키아 콜라이 숙주/벡터 시스템을 사용하였다(EP 0 972 838 및 미국특허 제 6,291,245 호).
에스케리키아 콜라이 K12 균주를 상기 각 발현 플라스미드에 의한 일렉트로포레이션에 의해 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 에스케리키아 콜라이 세포를 먼저 아가 플레이트상에서 37 ℃에서 증식시켰다. 각각의 형질전환을 위해서 상기 플레이트로부터 채집된 콜로니를 3 ㎖ 롤러 배양물로 옮기고 37 ℃에서 1 내지 2의 광학 밀도(578 ㎚에서 측정됨)로 증식시켰다. 이어서 1000 ㎕의 배양물을 1000 ㎕의 멸균 86%-글리세롤과 혼합하고 장시간 보관을 위해 -80 ℃에서 바로 동결시켰다. 10 L 발효기로 옮기기 전에 상기 클론의 올바른 생성물 발현을 먼저 소규모 진탕 플라스크 실험에서 확인하고 SDS-Page로 분석하였다.
예비 배양:
전-발효를 위해서 화학적 규명 배지를 사용하였다. 전-발효를 위해서 4개의 배플을 갖는 1000 ㎖ 삼각-플라스크 중의 220 ㎖의 배지에 1차 시드 뱅크 앰플로부터 1.0 ㎖를 접종하였다. 상기 배양을 7 내지 8의 광학 밀도(578 ㎚)가 획득될 때까지 37 ℃ 및 170 rpm에서 9시간 동안 회전 진탕기상에서 수행하였다. 100 ㎖의 예비 배양물을 사용하여 상기 10 L 생물반응기의 배치 배지를 접종하였다.
발효(RC52#003):
10 L 바이오스탯(Biostat) C, DCU3 발효기(사르토리우스, 독일 멜숭겐 소재)에서의 발효를 위해서 화학적 규명 배치 배지를 사용하였다. pH 조절용 알칼리성 용액은 11.25 g/1 L-메티오닌이 보충된 수성 12.5%(w/v) NH3 용액이었다.
상기 예비 배양으로부터의 100 ㎖ 접종물 + 4.2 l 멸균 배치 배지로 출발하여 상기 배치 발효를 31 ℃, pH 6.9±0.2, 800 mbar 배압 및 10 l/분의 초기 통기율로 수행하였다. 용존 산소(pO2)의 상대적인 값을, 교반기 속도를 1500 rpm까지 증가시킴으로써 상기 발효 전체를 통해 50%에서 유지시켰다. 용존 산소 값의 예리한 증가에 의해 나타난, 상기 초기에 보충된 글루코스의 고갈 후에, 온도를 37 ℃로 이동시키고 15분 후에 상기 발효는 2개 공급물 공급(각각 60 및 14 g/h)이 모두 개시되는 유가 방식에 돌입하였다. 공급물 2의 속도를 일정하게 유지시키면서, 공급물 1의 속도는 60에서부터 7시간 이내에 최종적으로 160 g/h의 소정의 공급 프로파일로 단계적으로 증가시킨다. 이산화 탄소 오프 가스 농도가 2% 이상으로 고르게 되었을 때 상기 통기율을 5시간 이내에 10에서 20 l/분으로 일정하게 증가시켰다. 세포질 중에 위치한 불용성 봉입체로서 재조합 표적 단백질의 발현을 약 40의 광학 밀도에서 2.4 g IPTG의 첨가에 의해 유도하였다.
24시간의 배양 후에 185의 광학 밀도가 성취되며 전체 브로쓰를 4 내지 8 ℃로 냉각시킨다. 세균을 통과식 원심분리기(13,000 rpm, 13 l/h)에 의한 원심분리를 통해 수확하고 상기 수확된 바이오매스를 추가의 가공(세포 파괴)시까지 -20 ℃에서 보관한다. 수율은 리터당 40 내지 60 g의 건조 세포이다.
생성물 형성의 분석:
상기 발효기로부터 채취한 샘플들(하나는 단백질 발현의 유도 전 및 다른 것들은 상기 유도 후 지정된 시점들에서)을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석한다. 모든 샘플로부터 동일한 양의 세포(OD표적 = 10)를 5 ㎖의 PBS 완충제에 현탁하고 얼음상에서 초음파 처리를 통해 붕괴시킨다. 이어서 100 ㎕의 각각의 현탁액을 원심분리시키고(15,000 rpm, 5분) 각각의 상등액을 회수하여 별도의 바이알로 옮긴다. 이는 용해성 및 불용성 발현된 표적 단백질을 구별하기 위한 것이다. 각각의 상등액(=용해성 단백질 분획)에 100 ㎕, 및 각각의 펠릿(=불용성 단백질 분획)에 200 ㎕의 SDS 샘플 완충제(문헌[Laemmli, U.K., Nature 227(1970) 680-685])를 가한다. 샘플들을 강한 혼합하에 95 ℃에서 15분 동안 가열하여 상기 샘플 중의 모든 단백질을 용해시키고 환원시킨다. 실온으로 냉각 후에 5 ㎕의 각 샘플을 4 내지 20% TGX 크리테리온 스테인 프리 폴리아크릴아미드 젤(바이오 래드)로 옮긴다. 추가로 5 ㎕의 분자량 표준(프리시전 플러스 프로테인 스탠다드, 바이오 래드) 및 공지된 표적 단백질 농도(0.1 ㎍/㎕)를 갖는 3개 양(0.3 ㎕, 0.6 ㎕ 및 0.9 ㎕)의 정량분석 표준을 적용하였다.
상기 전기영동을 200V에서 60분 동안 실행하고 그 후에 상기 젤을 GelDOC EZ 이미저(바이오 래드)로 옮기고 5분 동안 UV 조사로 처리하였다. 젤 상들을 이미지 랩 분석 소프트웨어(바이오 래드)를 사용하여 분석하였다. 상기 3개의 표준을 사용하여, 선형 회귀 곡선을 0.99 초과의 계수로 계산하고 원래 샘플 중 표적 단백질의 농도를 계산하였다.
정제, 분류효소 커플링 및 재생(M-05-74의 Fab 단편, PE24 변이체, 및 슈도모나스 외독소 변이체 PE24LR8M에 접합된 M-05-74의 Fab 단편의)
Fab 단편
상기 Fab 단편을 제조사의 설명에 따라 친화성 크로마토그래피(Ni 세파로스(Sepharose)(상표) 하이 퍼포먼스(High Perfomance) HisTrap(상표))에 의해 정제하였다. 간단히, 상등액을 50 mM 나트륨 포스페이트 pH 8.0, 300 mM NaCl 중에 평형화시킨 컬럼상에 부하하였다. 단백질 용출을 4 mM 이미다졸에 이은 100 mM까지의 이미다졸의 구배를 함유하는 세척 단계와 함께 pH 7.0에서 동일한 완충제로 수행하였다. 목적하는 Fab 단편을 함유하는 분획들을 모으고 20 mM His, 140 mM NaCl, pH 6.0에 대해 투석시켰다.
분류효소 커플링을 위한 PE24
PE24를 발현하는 에스케리키아 콜라이 세포를 20 mM 트리스, 2 mM EDTA, pH 8.0 + 완전 프로테아제 억제제 칵테일 정제(로슈) 중에서의 고압 균질화(세부사항이 필요한 경우: 크리스티안 슈안츠(Christian Schantz))에 의해 용해시켰다. 상기 용해물을 여과하고 20 mM 트리스, pH 7.4 중에서 평형화시킨 Q 세파로스 FF(GE 헬쓰케어)상에 부하하였다. 단백질을 동일한 완충제 중의 500 mM NaCl 이하의 구배로 용출시켰다. PE24 함유 분획들을 SDS PAGE에 의해 확인하였다. 합한 풀을 농축시키고 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 7.4 중에서 평형화시킨 힐로드(HiLoad)(상표) 슈퍼덱스(Superdex)(상표) 75(GE 헬쓰케어)에 적용하였다. PE24를 함유하는 분획들을 SDS PAGE에 따라 모으고 -80 ℃에서 동결시켰다.
Fab 단편의 PE24에의 분류효소 커플링
Fab 단편 및 PE24를 아미콘(Amicon)(등록상표) 울트라 4 원심분리 필터 장치(메르크 밀리포어(Merck Millipore))를 사용하여 50 mM 트리스, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2 pH 7.5내로 별도로 투석여과하고 5 내지 10 ㎎/㎖로 농축시켰다. 상기 단백질과 분류효소를 모두 1:1:0.8 몰비로 합하였다. 37 ℃에서 1시간 배양 후에 상기 혼합물을 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl 중에서 평형화시킨 Ni 세파로스(상표) 하이 퍼포먼스 HisTrap(상표)상에 부하하였다. 용출을 동일한 완충제 pH 7.0 중의 100 mM 이미다졸 이하의 구배로 수행하였다. 최종 생성물 Fab-PE24를 함유하는 통과 분획들을 농축시키고 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 7.4 중의 힐로드(상표) 슈퍼덱트(상표) 200(GE 헬쓰케어)상에 부하하였다. 목적하는 커플링된 단백질을 함유하는 분획들을 모으고 -80 ℃에서 보관하였다. 분류효소로서 용해성 스타필로코커스 아우레우스 분류효소 A를 사용하였다(서열번호 50). 용해성 스타필로코커스 아우레우스 분류효소 A를 발현시키고 하기의 발현 플라스미드를 사용하여 정제하였다: 상기 분류효소 유전자는 N-말단 절두된 스타필로코커스 아우레우스 분류효소 A(60-206) 분자를 암호화한다. HEK293 세포에서 용해성 분류효소의 일시적인 발현을 위한 발현 플라스미드는 상기 용해성 분류효소 발현 카세트 외에, 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기원, 및 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함하였다. 상기 용해성 분류효소의 전사 단위는 하기의 기능성 요소들을 포함한다:
- 인트론 A를 포함한 인간 거대세포바이러스(P-CMV)로부터의 급초기 인헨서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- N-말단 절두된 스타필로코커스 아우레우스 분류효소 A 암호화 핵산, 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).
에스케리키아 콜라이 봉입체로부터 유래된 Fab -PE24의 재생
VH-PE24 및 VL-C카파의 봉입체들을 8 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, 100 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 + 100 mM 다이티오쓰레이톨(DTT) 중에 별도로 용해시켰다. RT에서 12 내지 16시간 후에 상기 용해물의 pH를 3.0으로 조절하고, 상기 원심분리된 용액들을 8 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, 10 mM EDTA, pH 3.0에 대해 투석시켰다. 단백질 농도를 뷰렛 반응에 의해 측정하고, 봉입체 제제의 순도를 SDS PAGE에 의해 평가하였다. 동몰량의 상기 두 쇄를 0.5 M 아르기닌, 2 mM EDTA, pH 10 + 1 mM GSH/1 mM GSSG에 2 단계로 0.2 내지 0.3 ㎎/㎖의 최종 농도로 희석하였다. 4 내지 10 ℃에서 12 내지 16시간 후에 재생된 단백질을 H2O로 3 mS/㎝ 미만으로 희석하고 20 mM 트리스/HCl, pH 7.4 중에서 평형화시킨 Q 세파로스 FF(GE 헬쓰케어)상에 부하하였다. 용출을 동일한 완충제 중의 400 mM NaCl 이하의 구배로 수행하였다. 올바른 생성물을 함유하는 분획들을 SDS-PAGE 및 분석학적 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 확인하였다. 모은 분획들을 농축시키고 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 7.4 또는 선택적으로 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중의 힐로드(상표) 슈퍼덱스(상표) 200(GE 헬쓰케어)상에 부하하였다. 분획들을 분석학적 SEC에 따라 분석하고 모으고 -80 ℃에서 보관하였다.
서열번호 46 및 49를 기본으로 M-05-74의 Fab 단편과 슈도모나스 외독소 변이체 PE24LR8M(M-05-74-PE)과의 면역접합체를 재조합적으로 발현시키고, 정제하고 또한 직접적인 PE24LR8M 융합물로서 재생시킬 수 있다.
실시예 11
M-05-74- Fab -슈도모나스 외독소 접합체(M-05-74- PE )에 의한 상이한 종양 세포주의 세포살해
HER3 과발현 A549 세포를 백색 96-웰-플레이트(편평하고 투명한 기부, 1x104 세포/웰)에 시딩하고 RPMI(10% FCS)에서 밤새 증식시켰다. 다음 날, 상기 배지를 50 ㎕ 기아 배지(RPMI, 0.5% FCS)로 교환하였다. 적어도 4시간 후에, 5 ㎕ 헤레귤린-베타(페프로테크, Cat.#100-03)(HRG 베타)를 500 ng/㎖의 최종 농도로 가하였다. 50 ㎕의 Fab-74-PE 용액을 10, 3.3, 1.1, 0.37, 0.12, 0.04, 0.014, 0.005 및 0.002 ㎍/㎖의 최종 농도로 가하였다. 플레이트를 72시간 동안 배양하였다. 24시간 및 48시간 후에, 5 ㎕ 헤레귤린-베타를 다시 500 ng/㎖의 최종 농도로 가하였다. 72시간 후에 프로메가에 의한 셀티터-글로 발광 세포 생육력 분석(Cat.#G7571)을 사용하여 테칸 인피니트(Tecan Infinite) F200 판독기에서 발광을 측정하였다. M-05-74-Fab-슈도모나스 외독소 접합체(M-05-74-PE)에 대한 EC50 값은 HRG 베타 부재하에서 1.93 ㎍/㎖이고 존재하에서는 0.13 ㎍/㎖이었다.
[표 10]
Figure pct00011
실시예 12a
항- HER3 항체 M-05-74의 인간화된 변이체
쥐 항체 M-05-7 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 사용하여 유사한 인간 항체 가변 도메인들을 탐색하였다. 각각의 쇄에 대해 획득한 200개의 결과로부터 대략 절반이 비-인간 공급원으로부터의 것으로서 거부되었다. 남은 인간 항체를 전부 VH/VL 계면에 관련된 프레임워크내의 핵심 잔기, 및 CDR 고리 구조에 중요한 잔기들에 대해서 분석하였다. 가능한 한 상기 VH/VL 계면 및 정규 고리 구조에 중요한이들 핵심 잔기를 상기 인간화된 변이체 중에서 유지시켰으나, 이들 위치의 몇몇 변화가 때때로 포함된다. 상기 쥐 항체 쇄로부터의 CDR을 이들 인간 항체 프레임워크내에 이식하였다. 상위 5개의 이식된 도메인을 추가의 개발을 위해 선행 기준, 및 또한 T-세포 에피토프 인실리코 선별의 결과를 기준으로 선택하였다. 상응하게 상기 마우스 항-HER3 항체 M-05-74를 인간화시켜 하기 M-05-74의 인간화된 변이체 VH 및 VL 도메인을 제공하였다:
[표 11]
Figure pct00012
상기 5개의 VH 및 VL 도메인의 25개의 이론적으로 가능한 조합으로부터 가장 효능 있는 결합제를 하기와 같이 선택하였다:
유리한 동역학적 성질을 갖는 <Her3> M-05-74 항체의 가장 최적화된 인간화된 변이체를 찾기 위해서, 각 중쇄 및 경쇄의 5개 변이체를 상술한 바와 같이 설계하였다. 상기 획득된 서열들을 scFv-리보솜 디스플레이 구조물에서 모든 조합(총 25개)으로 생성시켰다.
상기 25개 scFv 구조물을 인접한 프라이머들에 의해 증폭시켜 리보솜 디스플레이에 필요한 선형 주형 DNA를 획득하였다. 각각의 PCR 생성물을 아가로스 젤-전기영동에 의해 정제한 다음 제조사의 설명서에 따라 퀴아겐 민일류트 키트(MinElute Kit)에 의해 추출하였다. 상기 생성물 DNA 농도를 측정하였으며 200 ng의 모든 선형 주형 DNA의 동몰 혼합물이 37 ℃에서 60분 동안 시험관내 전사/번역을 위한 토대였다. 상기 사용된 키트는 2개의 다이설파이드 결합 인헨서를 모두(DBE 1 및 2) 포함하는 PURExpress 시험관내 단백질 합성 키트(NEB)를 포함하였다. 2개의 반응 샘플을, 샘플당 배가된 반응량으로 처리하였다. 첫 번째 샘플은 후속의 패닝 단계에서 비오틴화되고 헤레귤린 활성화된 표적(Her3-ECD)을 포함하였다. 두 번째 샘플은 상기 패닝 단계에 표적 단백질이 없는 음성 대조군이었다. 상기 두 샘플 모두 동일하게 처리하였다. 전사 및 번역 후 획득된 3원 복합체(mRNA-리보솜-scFv 변이체)의 풀에, 4 ℃에서 30분 동안 사용된 자기 비드(스트렙트아비딘 M-270 다이나비즈(Dynabeads), 라이프 테크놀로지스(Life Technologies))와 함께 예비-패닝 단계를 수행하여 비특이적인 결합 변이체를 제거하였다. 상기 예비-패닝 비즈를 원심분리에 의해 제거하고 남은 3원 복합체를 갖는 상등액을 상기 제조된 표적/헤레귤린 혼합물에 가하여 상기 패닝 단계에서 4 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 상기 표적/헤레귤린 복합체를 상기 패닝 단계에 앞서 60분 동안 1:6 몰비로 배양하여 상기 수용체 도메인의 개방 입체구조를 획득하고 상기 74 모 항체의 에피토프를 노출시켰다. 상기 패닝 반응에서 비오틴화된 Her3-ECD의 최종 농도는 100 nM이었다. 이후 사용된 모든 완충제는 300 nM 헤레귤린을 함유하였다.
상기 표적 및 모든 결합 3원 복합체를 표적 비오틴 택(taq) 및 상기 언급된 스트렙트아비딘 비드를 통해 포획하였다. 포획을 위한 배양 시간은 4 ℃에서 20분이었다. 상기 비드의 자기 성질을 사용하여 상기 복합체들을 반복된 배양 및 세척 완충제의 제거에 의해 세척할 수 있다. 약한 결합 변이체를 제거하기 위해서 상기 세척압을 상기 세척 단계에 걸쳐 증가시켰다. 500 μL의 세척 완충제(헤레귤린 함유)를 사용하는 총 5회(2, 4, 5, 5 및 1분)의 세척 단계를, 단계 사이에 자기장에서의 2분 포획과 함께 사용하였다. 최종 단계를 사용하여 상기 남은 강한 결합 변이체를 상기 용출 단계(10 분, 4 ℃, EDTA를 함유하는 100 μL 용출 완충제)를 위한 깨끗한 새로운 반응 튜브에 이동시킨 다음 원심분리시켜 상기 비드를 제거하였다. 상등액 중의 상기 획득된 RNA를 제조사의 설명서에 따라 퀴아겐 RNEasy RNA 정제 키트로 정제하였다. 역 전사에 의해 나중에 생성된 DNA의 기원을 보장하기 위해서, 상기 RNA에 사전에 DNAse 절단을 가하였다. 상기 절단(앰비온(Ambion) DNA-부재 키트)을 12 μL의 정제된 RNA로 개시시키고 37 ℃에서 30분 동안 배양하였다. DNase의 제거에 이어서, 샘플당 3회의 역 전사 반응을 각각 12 μL로 개시시키고 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 12 μL의 각각의 절단된 RNA 샘플(절단된 생성물)을 상기 첫 번째 PCR을 위한 음성 대조군으로서 사용하여 DNA 잔사의 완전한 제거를 입증하였다.
상기 역 전사 반응의 생성물을 각각의 샘플에 대해 모으고 이를 사용하여 5회의 100 μL PCR 반응을 개시시켜 상기 DNA 선택 풀을 증폭시켰다. 상기 생성물들을 모으고 제조사의 프로토콜에 따라 젤 전기영동(1 μL 샘플 부피와 함께 1% 예비 아가로스 젤 및 분석학적 에이질런트(Agilent) DNA 7500 칩) 및 퀴아겐 민일류트 키트에 의해 정제시켰다. 도 1에서 획득된 젤 상은 레인 1에서 선택된 구조물 DNA의 농축, 및 레인 2에서 음성 대조군(표적 없는 패닝)에 대한 농축 없음을 명백히 나타낸다. 남은 대조군은 또한 예상된 바와 같이 음성이다. 상기 DNA 절단은 완전하였다(표적의 경우 레인 3, 배경의 경우 레인 4). 따라서, 레인 1 중의 획득된 DNA는 모두 상기 패닝 단계에서 선택된 결합 변이체, 및 그의 상응하는 RNA로부터 유래된다. 상기 역 전사의 음성 대조군도, 상기 PCR의 음성 대조군도 모두 밴드를 나타내지 않는다. 레인 7은 정제 후 모은 PCR 반응의 생성물을 나타낸다.
상기 PCR 생성물을 클로닝에 충분한 DNA가 생성되도록 증폭시켰다. 상기 선택 풀 및 발현 벡터 Her_scFv_huFc(각각 1 μg)를 37 ℃에서 1시간 동안 컷스마트(CutSmart) 완충제(모두 NEB) 중의 MfeI-HF 및 NotI-HF로 절단하였다. 상기 선택 삽입물 및 절단된 벡터를 먼저 정제하고 이어서 실온에서 30분 동안 NEB 퀵 리가제로 이어맞추었다. 절단된 삽입물 대 벡터의 몰비는 5:1(25 ng 절단된 삽입물 및 50 ng 절단된 벡터)이었다. 2 μL의 상기 이어맞추기 생성물을 직접 사용하여 50 μL의 DH5α(라이프 테크놀로지스) 수용 세포를 형질전환시켰다. 성장에 이어서, 50 μL를 암피실린 내성을 갖는 LB 플레이트(LBamp)상에 도말하고 37 ℃에서 16시간 동안 배양하였다. 34개 콜로니를 사용하여 37 ℃에서 16시간 동안 5 ㎖ LBamp 배지를 접종하였다. 상기 세포를 수확하고 DNA를 제조사의 설명서에 따라 퀴아겐 미니프렙 키트로 단리시키고 각 샘플의 300 ng 플라스미드 DNA를 서열분석을 위해 세퀴서브(Sequiserve) GmbH로 보냈다.
결과 - < Her3 > M-05-74 항체의 가장 최적화된 인간화된 변이체
상기 서열분석 결과는 하나의 특정한 변이체: VH -A/ VL -D의 농축을 나타낸다. 상응하는 서열을 34개 샘플로부터 6회 획득하였으며, 이는 상술한 분석에서 HER-ECD에 가장 효능 있는 결합 성질을 암시한다.
또한 조합 VH-A/VH-B 및 VH-A/VH-E는 2회 발생하였으며, 따라서, 이는 남아있는 덜 농축된 VH/VL조합에 비해 HER3 ECD에 대한 약간 더 우수한 결합 성질을 나타내었다.
놀랍게도 모든 농축된 변이체는 VH-A를 포함하였다. 결과적으로, VH-A가, 특히 바람직한 조합 VH-A/VL-D, VH-A/VH-B 및 VH-A/VH-E에서 <Her3> M-05-74의 모든 HER3 결합 인간화된 변이체의 핵심적인 특징이다.
상기 남은 24개 서열은 모두 상이하였으며 부수적인 결실 및/또는 점 돌연변이들의 조합을 특징으로 하였다. 3개의 서열은 완벽하게 편집될 수 없었으며 분석되지 않았다.
조합 VH-A/VL-D, VH-A/VH-B 및 VH-A/VH-E 각각은 인간 IgG1 아이소타입(카파 경쇄 불변 도메인을 갖는다)에서 발현되거나 한편으로 상술한 바와 같은 슈도모나스 외독소(면역독소)와의 융합 단백질로서 발현된다. 결합 특징 및 생물학적 성질들을 예를 들어 실시예 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11에 상술한 바와 같이 또는 하기 실시예 13에 개시하는 바와 같이 측정한다.
실시예 12b
항- HER3 항체 M-05-74의 인간화된 변이체 의 결합
리간드 헤레귤린의 존재 및 부재하에서 항-HER3 항체 M-05-74의 인간화된 변이체 VH -A/ VL -D(실시예 12a에 개시된)의 HER3-ECD 및 HER4-ECD에의 결합을 조사하기 위해서, SPR 분석을 비아코어 3000 장치(GE 헬쓰케어)를 사용하여 37 ℃에서 수행하였다(표 11).
[표 11a]
Figure pct00013
[표 11b]
Figure pct00014
항-HER3 항체 M-05-74의 인간화된 변이체 VH -A/ VL -D는 증가된 에피토프 접근성으로 인해 리간드 활성화된 ECD 복합체에 우선적으로 결합하였다. 상기는 HER3-ECD/HRG 복합체에 KD 10 nM의 친화성으로 결합하였다.
놀랍게도 항-HER3 항체 M-05-74의 인간화된 변이체 VH -A/ VL -D는 그의 HER3-ECD/HRG 반응성을 유지하면서(KD 7 nM에 비해 KD 10 nM), 모 항체 M-05-74((KD 4 nM))에 비해 강하게 감소된 HER4-ECD/HRG 반응성(KD 211 nM)을 나타내었다.
실시예 13
M-05-74- Fab -슈도모나스 외독소 접합체(M-05-74- PE )에 의한 생체내 종양 세포 성장 억제
인간 HER3을 암호화하는 발현 벡터로 안정하게 형질감염된 인간 A431-B34 비-소세포 폐암 세포주를 암컷 SCID 베이지 마우스의 우측 옆구리에 피하 접종하였다(1 x 107 세포/동물).
종양 접종 후 21일째에, 상기 동물들을 무작위화하고 처리군과 하나의 비히클 군으로 배분하여, 군당 약 110 ㎣의 중간 종양 부피를 생성시켰다. 같은 날에, 동물을 2 주기(각각의 주기는 3q7d(이틀마다)로 이루어진다) 동안 M-05-74-Fab-슈도모나스 외독소 접합체(M-05-74-PE)(1.0 ㎎/㎏)로 정맥내로 처리하였다. 대조군에게는 비히클(트리스 완충제)을 제공하였다. 상기 2개의 주기는 1주일 처리-중단에 의해 분리되었다.
1차 종양 부피(TV)를 NCI 프로토콜(TV = (길이 x 너비2)/2)에 따라 계산하였으며, 이때 "길이" 및 "너비"는 종양 덩어리의 길고 짧은 직경(㎜)이다(문헌[Corbett et al., 1997]). 계산을 종양 접종 후 42일까지 병기결정(staging)(종양 접종 후 21일째)으로부터 실행하였으며, 값들을 중앙값 및 제3 및 제1 사분위의 차이로서 정의된 사분범위(IQR)로서 기록하였다.
상기 처리 기간 동안 종양 성장 억제(TGI) 백분율의 계산을 위해서, 모든 처리된 군을 그들 각각의 비히클 대조군과 비교하였다. TVday z는 한정된 연구일(제z일)에서의 개별 동물의 종양 부피를 나타내고, TVday x는 병기결정일(제x일)에서의 개별 동물의 종양 부피를 나타낸다.
하기의 식을 적용하였다:
TGI[%] = 100 - {[중앙값(TV(처리된)day z - TV(처리된)day x)]/[중앙값(TV(각각의 대조군)day z - TV(각각의 대조군)day x)]} x 100
신뢰도 구간(CI)을 갖는 처리군 대 대조군 비(TCR)의 계산을 비-모수 방법을 사용하여 적용하였다. 사분범위를 갖는 중앙값 종양 부피의 결과를 도 19에 나타낸다. 종양 성장 억제는 0.509의 TCR(CI: 0.33 - 0.734)과 함께 M-05-74-Fab-슈도모나스 외독소 접합체(M-05-74-PE)의 66%였다.
실시예 14
WO 2012/22814에 개시된 항- HER3 항체 MOR09823(2)과 비교된 항체 M-05-74(1)의 TtSlyDcys - Her3(서열번호 18)에의 결합
비아코어 T200 장비(GE 헬쓰케어)를 CM5 시리즈 센서와 함께 적재하고 제조사의 설명서에 따라 HBS-ET + 완충제(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% w/v 트윈 20) 중에서 표준화하였다. 상기 샘플 완충제는 1 ㎎/㎖ CMD(카복시메틸덱스트란)가 보충된 시스템 완충제였다. 상기 시스템은 37 ℃에서 작동하였다. 이중 항체 포획 시스템을 상기 센서 표면상에 확립시켰다. 6500 RU mAb<M-IgG>R을 모든 유동 셀상에 EDC/NHS 화학을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 고정화시켰다. 상기 센서를 1 M 에탄올아민을 사용하여 탈활성화시켰다. 유동 셀 1은 기준으로서 제공되었으며 항-TSH IgG1 항체에 의해 10 ㎕/분으로 1분 동안 포획되었다. 유동 셀 2상에서 M-5-74를 10 ㎕/분으로 1분 동안 포획하였다. 유동 셀 3상에서 쥐 항-인간 Fc 광범위 항체를 10 ㎕/분으로 1분 포획한 다음 항-HER3 항체 M-05-74(1) 또는 항-HER3 항체 MOR09823 항체를 10 ㎕/분으로 1분간 주입하였다. 유량을 60 ㎕/분으로 설정하였다. 용액 중 분석물 TtSlyDcys-HER3(서열번호 18)을 5분 동안 0 nM 및 150 nM의 농도로 주입하고 해리를 600초 동안 모니터링하였다. 상기 센서를, 10 mM 글리신 pH 1.7 완충제를 10 ㎕/분으로 3분 동안 1회 주입하여 완전히 재생시켰다.
도 20은 150 nM에서 TtSlyDcys-Her3 및 완충제의 결합 신호를 도시하는 센서그램 오버레이 플롯을 묘사한다. 상기 오버레이 플롯은 150 nM TtSlyDcys-Her3(1)에서 항체 M-5-74 결합을 도시한다. MOR09823 항체는 TtSlyDcas-Her3(2)에 결합하지 않는다. (3)은 TtSlyDcas-HER3 대 mAb<M-IgG>R 포획 표면의 배경 결합 신호를 도시한다. WO 2012/22814에 개시된 항-HER3 항체 MOR09823(2)은 150 nM TtSlyDcys-Her3에서 어떠한 상호작용도 나타내지 않는다. 양성 대조군 항체 M-05-74(1)는 TtSlyDcas-Her3 대비 현저한 결합을 나타낸다. 150 nM TtSlyDcys(HER-3 삽입 없음) 주입시 상기 두 항체 모두와의 상호작용을 검출할 수 없었다(데이터 도시 안 됨).
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Anti-HER3 antibodies binding to the beta-hairpin of HER3 <130> P32122-WO <140> PCT/EP2015/060492 <141> 2015-05-12 <150> EP14168335.9 <151> 2014-05-14 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn 1 5 10 15 Pro His Thr <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Pro Gln Thr Phe Val Tyr Asn Pro Thr Thr Phe Gln Leu Glu His Asn 1 5 10 15 Phe Asn Ala <210> 3 <211> 1323 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 3 Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr Leu Asn Gly 1 5 10 15 Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu 35 40 45 Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val 50 55 60 Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu 65 70 75 80 Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe 85 90 95 Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu 100 105 110 Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val 115 120 125 Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr Ile Asp Trp 130 135 140 Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val Lys Asp Asn 145 150 155 160 Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly Arg Cys Trp 165 170 175 Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala 180 185 190 Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys 195 200 205 His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys 210 215 220 Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val Pro Arg Cys 225 230 235 240 Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn 245 250 255 Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala Ser Cys Pro 260 265 270 His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Pro 275 280 285 Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys Glu Pro Cys 290 295 300 Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser Gly Ser Arg 305 310 315 320 Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val Asn Cys Thr 325 330 335 Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu Asn Gly Asp 340 345 350 Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe 355 360 365 Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro 370 375 380 Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr Thr Ile Gly 385 390 395 400 Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile Met Lys Asn 405 410 415 Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala 420 425 430 Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser 435 440 445 Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu Arg Leu Asp 450 455 460 Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu Gly Lys Val 465 470 475 480 Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Gly 485 490 495 Gln Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr Ser Arg Gly Gly Val Cys Val Thr 500 505 510 His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu Pro Arg Glu Phe Ala His Glu Ala 515 520 525 Glu Cys Phe Ser Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Met Glu Gly Thr Ala 530 535 540 Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asp Thr Cys Ala Gln Cys Ala His Phe 545 550 555 560 Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser Ser Cys Pro His Gly Val Leu Gly 565 570 575 Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr Pro Asp Val Gln Asn Glu Cys Arg 580 585 590 Pro Cys His Glu Asn Cys Thr Gln Gly Cys Lys Gly Pro Glu Leu Gln 595 600 605 Asp Cys Leu Gly Gln Thr Leu Val Leu Ile Gly Lys Thr His Leu Thr 610 615 620 Met Ala Leu Thr Val Ile Ala Gly Leu Val Val Ile Phe Met Met Leu 625 630 635 640 Gly Gly Thr Phe Leu Tyr Trp Arg Gly Arg Arg Ile Gln Asn Lys Arg 645 650 655 Ala Met Arg Arg Tyr Leu Glu Arg Gly Glu Ser Ile Glu Pro Leu Asp 660 665 670 Pro Ser Glu Lys Ala Asn Lys Val Leu Ala Arg Ile Phe Lys Glu Thr 675 680 685 Glu Leu Arg Lys Leu Lys Val Leu Gly Ser Gly Val Phe Gly Thr Val 690 695 700 His Lys Gly Val Trp Ile Pro Glu Gly Glu Ser Ile Lys Ile Pro Val 705 710 715 720 Cys Ile Lys Val Ile Glu Asp Lys Ser Gly Arg Gln Ser Phe Gln Ala 725 730 735 Val Thr Asp His Met Leu Ala Ile Gly Ser Leu Asp His Ala His Ile 740 745 750 Val Arg Leu Leu Gly Leu Cys Pro Gly Ser Ser Leu Gln Leu Val Thr 755 760 765 Gln Tyr Leu Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Val Arg Gln His Arg 770 775 780 Gly Ala Leu Gly Pro Gln Leu Leu Leu Asn Trp Gly Val Gln Ile Ala 785 790 795 800 Lys Gly Met Tyr Tyr Leu Glu Glu His Gly Met Val His Arg Asn Leu 805 810 815 Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Lys Ser Pro Ser Gln Val Gln Val Ala 820 825 830 Asp Phe Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Pro Asp Asp Lys Gln Leu Leu 835 840 845 Tyr Ser Glu Ala Lys Thr Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile 850 855 860 His Phe Gly Lys Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val 865 870 875 880 Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Glu Pro Tyr Ala Gly Leu 885 890 895 Arg Leu Ala Glu Val Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Ala 900 905 910 Gln Pro Gln Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Val Met Val Lys Cys 915 920 925 Trp Met Ile Asp Glu Asn Ile Arg Pro Thr Phe Lys Glu Leu Ala Asn 930 935 940 Glu Phe Thr Arg Met Ala Arg Asp Pro Pro Arg Tyr Leu Val Ile Lys 945 950 955 960 Arg Glu Ser Gly Pro Gly Ile Ala Pro Gly Pro Glu Pro His Gly Leu 965 970 975 Thr Asn Lys Lys Leu Glu Glu Val Glu Leu Glu Pro Glu Leu Asp Leu 980 985 990 Asp Leu Asp Leu Glu Ala Glu Glu Asp Asn Leu Ala Thr Thr Thr Leu 995 1000 1005 Gly Ser Ala Leu Ser Leu Pro Val Gly Thr Leu Asn Arg Pro Arg 1010 1015 1020 Gly Ser Gln Ser Leu Leu Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Met Pro Met 1025 1030 1035 Asn Gln Gly Asn Leu Gly Glu Ser Cys Gln Glu Ser Ala Val Ser 1040 1045 1050 Gly Ser Ser Glu Arg Cys Pro Arg Pro Val Ser Leu His Pro Met 1055 1060 1065 Pro Arg Gly Cys Leu Ala Ser Glu Ser Ser Glu Gly His Val Thr 1070 1075 1080 Gly Ser Glu Ala Glu Leu Gln Glu Lys Val Ser Met Cys Arg Ser 1085 1090 1095 Arg Ser Arg Ser Arg Ser Pro Arg Pro Arg Gly Asp Ser Ala Tyr 1100 1105 1110 His Ser Gln Arg His Ser Leu Leu Thr Pro Val Thr Pro Leu Ser 1115 1120 1125 Pro Pro Gly Leu Glu Glu Glu Asp Val Asn Gly Tyr Val Met Pro 1130 1135 1140 Asp Thr His Leu Lys Gly Thr Pro Ser Ser Arg Glu Gly Thr Leu 1145 1150 1155 Ser Ser Val Gly Leu Ser Ser Val Leu Gly Thr Glu Glu Glu Asp 1160 1165 1170 Glu Asp Glu Glu Tyr Glu Tyr Met Asn Arg Arg Arg Arg His Ser 1175 1180 1185 Pro Pro His Pro Pro Arg Pro Ser Ser Leu Glu Glu Leu Gly Tyr 1190 1195 1200 Glu Tyr Met Asp Val Gly Ser Asp Leu Ser Ala Ser Leu Gly Ser 1205 1210 1215 Thr Gln Ser Cys Pro Leu His Pro Val Pro Ile Met Pro Thr Ala 1220 1225 1230 Gly Thr Thr Pro Asp Glu Asp Tyr Glu Tyr Met Asn Arg Gln Arg 1235 1240 1245 Asp Gly Gly Gly Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Ala Met Gly Ala Cys 1250 1255 1260 Pro Ala Ser Glu Gln Gly Tyr Glu Glu Met Arg Ala Phe Gln Gly 1265 1270 1275 Pro Gly His Gln Ala Pro His Val His Tyr Ala Arg Leu Lys Thr 1280 1285 1290 Leu Arg Ser Leu Glu Ala Thr Asp Ser Ala Phe Asp Asn Pro Asp 1295 1300 1305 Tyr Trp His Ser Arg Leu Phe Pro Lys Ala Asn Ala Gln Arg Thr 1310 1315 1320 <210> 4 <211> 624 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 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Lys 450 455 <210> 50 <211> 147 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 50 Gln Ala Lys Pro Gln Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Val Ala Gly Tyr 1 5 10 15 Ile Glu Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly Pro 20 25 30 Ala Thr Pro Glu Gln Leu Asn Arg Gly Val Ser Phe Ala Glu Glu Asn 35 40 45 Glu Ser Leu Asp Asp Gln Asn Ile Ser Ile Ala Gly His Thr Phe Ile 50 55 60 Asp Arg Pro Asn Tyr Gln Phe Thr Asn Leu Lys Ala Ala Lys Lys Gly 65 70 75 80 Ser Met Val Tyr Phe Lys Val Gly Asn Glu Thr Arg Lys Tyr Lys Met 85 90 95 Thr Ser Ile Arg Asp Val Lys Pro Thr Asp Val Gly Val Leu Asp Glu 100 105 110 Gln Lys Gly Lys Asp Lys Gln Leu Thr Leu Ile Thr Cys Asp Asp Tyr 115 120 125 Asn Glu Lys Thr Gly Val Trp Glu Lys Arg Lys Ile Phe Val Ala Thr 130 135 140 Glu Val Lys 145 <210> 51 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Met Ser Cys Gln Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Leu Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Arg Asn Gly Asp Phe Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Ile Asn Tyr Gly Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 52 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ala Ser Leu Phe Val Ser Glu Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Ile Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr His Gln Lys Lys Gly Lys Ser Pro Gln Val Leu Val 35 40 45 Tyr Ala Ala Ile Lys Leu Ala Asp Gly Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Pro Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 53 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 53 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 54 <211> 105 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 54 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 55 <211> 330 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 55 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 56 <211> 330 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 56 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 57 <211> 330 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 57 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 58 <211> 327 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 58 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325

Claims (15)

  1. 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체로서,
    a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH
    를 포함하는 항체.
  2. 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체로서,
    a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH; 및
    b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL, 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL, 또는 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL
    을 포함하는 항체.
  3. 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체로서,
    a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH; 및
    b) 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL
    을 포함하는 항체.
  4. 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체로서,
    a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH; 및
    b) 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL
    을 포함하는 항체.
  5. 인간 HER3에 결합하는 단리된 항체로서,
    a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 도메인 VH; 및
    b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인 VL
    을 포함하는 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열번호 13 TtSlyD-FKBP-Her3,
    서열번호 17 TtSlyDcas-Her3,
    서열번호 18 TtSlyDcys-Her3,
    서열번호 19 TgSlyDser-Her3, 및
    서열번호 20 TgSlyDcys-Her3
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드 중에 포함된 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(서열번호 1)의 아미노산 서열내에 결합하는 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    전장 IgG1 항체 또는 IgG4 항체인 항체.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fab 단편인 항체.
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체.
  10. 암 치료에 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제 9 항에 따른 면역접합체.
  11. HER3/HER2 이량체화의 억제에 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 항체.
  12. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제 9 항에 따른 면역접합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형.
  13. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
  14. 제 13 항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  15. 제 14 항에 따른 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 단계; 및
    상기 항체를 세포 배양물 또는 세포 배양 상등액으로부터 회수하는 단계
    를 포함하는, 항체의 제조 방법.
KR1020167031609A 2014-05-14 2015-05-12 Her3의 베타-헤어핀에 결합하는 항-her3 항체 KR20160144465A (ko)

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