JP6433511B2 - Her3のベータヘアピンに結合する抗her3抗体 - Google Patents
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Description
HERタンパク質ファミリーは、4つのメンバー:上皮成長因子受容体(EGFR)又はErbB−1とも称されるHER1、ErbB−2とも称されるHER2、HER3とも称されるErbB−3、及びHER4とも称されるErbB−4からなる。ErbBファミリータンパク質は、受容体チロシンキナーゼであり、細胞増殖、分化及び生存の重要なメディエーターを表している。HERファミリーは、ニューレグリン(NRG)ファミリー、アンフィレグリン、EGF及び(TGF−α)のような異なるリガンドの受容体タンパク質を表す。ヘレグリン(HRG又はニューレグリンNRG−1とも称される)は、例えばHER3及びHER4に対するリガンドである。
発明の要旨
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)を含む。
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及びb)配列番号41のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−D)、配列番号39のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−B)、又は配列番号42のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−E)を含む。
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及びb)配列番号41のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−D)を含む。
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及びb)配列番号39のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−B)を含む。
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及びb)配列番号42のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−E)を含む。
配列番号13 TtSlyD−FKBP−Her3、
配列番号17 TtSlyDcas−Her3、
配列番号18 TtSlyDcys−Her3、
配列番号19 TgSlyDser−Her3、及び
配列番号20 TgSlyDcys−Her3
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるPQPLVYNKLTFQLEPNPHT(配列番号1)のアミノ酸配列内に結合する。
ここで抗体は、ヒトHER3のPQPLVYNKLTFQLEPNPHT(配列番号1)のアミノ酸配列内に結合し;
ここで、
a)配列番号1のアミノ酸配列を含む
配列番号13 TtSlyD−FKBP−Her3、
配列番号17 TtSlyDcas−Her3、
配列番号18 TtSlyDcys−Her3、
配列番号19 TgSlyDser−Her3、及び
配列番号20 TgSlyDcys−Her3
からなる群から選択される少なくとも一のポリペプチド
(及び、任意で
b)配列番号2のアミノ酸配列を含む
配列番号21 TtSlyDcas−Her4、
配列番号22 TtSlyDcys−Her4、
配列番号23 TgSlyDser−Her4、及び
配列番号24 TgSlyDcys−Her4
からなる群から選択される少なくとも一のポリペプチド)が
a)に記載の少なくとも一のポリペプチド(及び任意でb)に記載の少なくとも一のポリペプチド)に対する結合を示す、抗体を選択するために使用され、
それによりPQPLVYNKLTFQLEPNPHT(配列番号1)のアミノ酸配列内に、及び任意でPQTFVYNPTTFQLEHNFNA(配列番号2)のアミノ酸配列内に結合する抗体を選択する
i)配列番号13 TtSlyD−FKBP−Her3、
ii)配列番号17 TtSlyDcas−Her3、
iii)配列番号18 TtSlyDcys−Her3、
iv)配列番号19 TgSlyDser−Her3、及び
v)配列番号20 TgSlyDcys−Her3
からなる群から選択されるポリペプチドであり、
そのポリペプチドは配列番号1のアミノ酸配列を含む。
i)配列番号21 TtSlyDcas−Her4、
ii)配列番号22 TtSlyDcys−Her4、
iii)配列番号23 TgSlyDser−Her4、及び
iv)配列番号24 TgSlyDcys−Her4
からなる群から選択されるポリペプチドであり、
そのポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列を含む。
I.定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワーク又は重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、又は2以下である。幾つかの実施態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、Vはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
(a)アミノ酸残基26−32(L1)、50−52(L2)、91−96(L3)、26−32(H1)、53−55(H2)、及び96−101(H3)で生じる超可変ループ(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b)アミノ酸残基24−34(L1)、50−56(L2)、89−97(L3)、31−35b(H1)、50−65(H2)、及び95−102(H3)で生じるCDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c)アミノ酸残基27c−36(L1)、46−55(L2)、89−96(L3)、30−35b(H1)、47−58(H2)、及び93−101(H3)で生じる抗原接触(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));及び
(d)HVRのアミノ酸残基46−56(L2)、47−56(L2)、48−56(L2)、49−56(L2)、26−35(H1)、26−35b(H1)、49−65(H2)、93−102(H3)、及び94−102(H3)を含む、(a)、(b)、及び/又は(c)の組合せ。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは、A及びBのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムALIGN−2によって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと一致しない場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは一致しないと評価されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての%アミノ酸配列同一性値は、直前のパラグラフに記載したように、ALIGN−2コンピュータプログラムを用いて得られる。
一態様において、本発明は一部が、SlyDスキャフォールド内で3次元的に配向して機能的に提示されるHER3及びHER4のベータヘアピンを使用して(例えば図2、配列番号13及び17から24のポリペプチドを参照)、HER3(及びHER4)のベータヘアピンに特異的である抗体を選択することが可能であるという知見にもとづいている。
本発明は、ヒトHER3に結合する単離された抗体を提供し、
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及びb)配列番号41のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−D)、配列番号39のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−B)、又は配列番号42のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−E)を含む。
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及び
b)配列番号41のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−D)を含む。
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及び
b)配列番号39のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−B)を含む。
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及び
b)配列番号42のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−E)を含む。
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及び
b)配列番号41のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−D)、配列番号39のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−B)、又は配列番号42のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−E)を含む。
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及び
b)配列番号41のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−D)を含む。
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及び
b)配列番号39のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−B)を含む。
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及び
b)配列番号42のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−E)を含む。
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及びb)配列番号41のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−D)、配列番号39のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−B)、又は配列番号42のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−E)をそれぞれ含む抗体に対して、少なくとも95%配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(VH)配列、及び少なくとも95%又は100%配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含み、
ここで抗体は以下の特性の一以上を有する:
抗体は、
a)配列番号13 TtSlyD−FKBP−Her3、
配列番号17 TtSlyDcas−Her3、
配列番号18 TtSlyDcys−Her3、
配列番号19 TgSlyDser−Her3、及び
配列番号20 TgSlyDcys−Her3
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるPQPLVYNKLTFQLEPNPHT(配列番号1)のアミノ酸配列内に結合する;
b)配列番号13 TtSlyD−FKBP−Her3、
配列番号17 TtSlyDcas−Her3、
配列番号18 TtSlyDcys−Her3、
配列番号19 TgSlyDser−Her3、及び
配列番号20 TgSlyDcys−Her3
からなる群から選択されるポリペプチドに結合する;
c)HER3/HER2の共沈殿アッセイでMCF−7細胞におけるHER3/HER2のヘテロ二量体のヘテロ二量体化を阻害する;
d)配列番号21 TtSlyDcas−Her4、
配列番号22 TtSlyDcys−Her4、
配列番号23 TgSlyDser−Her4、及び
配列番号24 TgSlyDcys−Her4
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるPQTFVYNPTTFQLEHNFNA(配列番号2)のアミノ酸配列内に結合する;
e)配列番号21 TtSlyDcas−Her4、
配列番号22 TtSlyDcys−Her4、
配列番号23 TgSlyDser−Her4、及び
配列番号24 TgSlyDcys−Her4
からなる群から選択されるポリペプチドに結合する;
f)二価の親完全長抗体と比較して、一価のFab断片として、(MCF−7細胞におけるHER3のリン酸化阻害において、等モル量で比較した場合)同じ又はそれ以上の生物学的活性を示す;
g)インビボで腫瘍増殖阻害活性を示す;
h)HER3−ECDに、KD値≦1x10−8Mの親和性で結合する(一実施態様において、1x10−8Mから1x10−13MのKD値で;(一実施態様において、1x10−9Mから1x10−13MのKD値で);
i)HER4−ECDに、KD値≦1x10−8Mの親和性で結合する(一実施態様において、1x10−8Mから1x10−13MのKD値で;(一実施態様において、1x10−9Mから1x10−13MのKD値で);
j)ここで、抗体は、VYNKLTFQLEP(配列番号43)からなるポリペプチドに、又はVYNPTTFQLE(配列番号44)からなるポリペプチドに結合する;
k)ここで、抗体は、VYNKLTFQLEP(配列番号43)からなるポリペプチドに結合し;及び/又は
l)ここで、抗体は、VYNPTTFQLE(配列番号44)からなるポリペプチドに結合する。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、又は≦0.001nM(例えば、10−8M以下、例えば10−8Mから10−13M、例えば10−9Mから10−13M)の解離定数KDを有する。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、Fv,及びscFv断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照。scFv断片の総説については、例えば、Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照;また、国際公開第93/16185号;及び米国特許第5571894号及び第5587458号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたFab及びF(ab’)2断片の議論については、米国特許第5869046号を参照のこと。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体はキメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4816567号、及びMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域)及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で周知の様々な技術を用いて生成することができる。ヒト抗体は一般的に、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459に記載されている。
本発明の抗体は、所望の活性又は活性(複数)を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。その方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37に概説され、更に、McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472;及びLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132に記載されている。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはHER3/HER4に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。二重特異性抗体はまたHER3又はHER4を発現する細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び/又は挿入及び/又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
ある実施態様において、一以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、HVRとFRを含む。保存的置換は、表1の「好ましい置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表1の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その生成物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の減少、又はADCC又はCDCの改善についてスクリーニングされる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
ある実施態様において、一又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のFc領域に導入することができ、それによってFc領域変異体を生成する。Fc領域の変異体は、一又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトFc領域の配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のFc領域)を含んでもよい。
ある実施態様において、抗体の一以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「thioMAbs」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中で更に記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、以下の残基の任意の一以上がシステインで置換され得る:軽鎖のV205(Kabatの番号づけ);重鎖のA118(EUの番号づけ);及び重鎖Fc領域のS400(EUの番号づけ)。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第7521541号に記載のように生成され得る。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な付加的な非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(単独重合体又はランダム共重合体の何れか)及びデキストラン又はポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び/又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む考慮に基づいて決定することができる。
抗体は、例えば米国特許第4816567号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗HER3(及び抗HER4)抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列、及び/又は抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む一以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む(例えば、以下で形質転換される):(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列、及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又はリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一実施態様において、抗HER3/HER4抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から抗体を回収することを含む。
本明細書で提供される抗HER3(及び抗HER4)抗体は、当技術分野で公知の様々なアッセイによって、同定され、その物理的/化学的性質及び/又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけることができる。
a)配列番号1のアミノ酸配列を含む
配列番号13 TtSlyD−FKBP−Her3、
配列番号17 TtSlyDcas−Her3、
配列番号18 TtSlyDcys−Her3、
配列番号19 TgSlyDser−Her3、及び
配列番号20 TgSlyDcys−Her3
からなる群から選択される少なくとも一のポリペプチド、
及び
b)配列番号2のアミノ酸配列を含む
配列番号21 TtSlyDcas−Her4、
配列番号22 TtSlyDcys−Her4、
配列番号23 TgSlyDser−Her4、及び
配列番号24 TgSlyDcys−Her4
からなる群から選択される少なくとも一のポリペプチドが、
a)に記載の少なくとも一のポリペプチド及びb)に記載の少なくとも一のポリペプチドの両方に対する結合を示す抗体を選択するために(結合アッセイにおいて)使用され、
それによりPQPLVYNKLTFQLEPNPHT(配列番号1)(ヒトHER3内)のアミノ酸配列内に(及びPQTFVYNPTTFQLEHNFNA(配列番号2)(ヒトHER4内)のアミノ酸配列内に結合する抗体を選択する。
選択された抗体が、PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(配列番号1)のアミノ酸配列又はPQTFVYNPTTFQLEHNFNA(配列番号2)のアミノ酸配列を含んでいないポリペプチドスキャフォールドに結合しないことを確認するために、
選択された抗体が、
配列番号14 TtSlyD−野生型
配列番号15 TtSlyDcas
配列番号16 TgSlyDΔIF
からなる群から選択されるポリペプチドによりカウンタースクリーニングされる(ポリペプチドに対する結合について試験される)工程を更に含む。
一態様において、本発明の抗体は、例えば、表面プラズモン共鳴(例えば、BIACORE)を含み、ELISA、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらの抗HER3抗体を同定するために与えられる。生物学的活性は、例えば、HER3リン酸化の阻害、HER3及び/又はHER4を発現又は過剰発現するがん細胞のがん細胞増殖の阻害、HER3/HER2のヘテロ二量体化の阻害、FACSアッセイを介した(時間依存性)内部移行、異種移植されたHER3及び/又はHER4を発現又は過剰発現するがん細胞を持つ異種移植動物(例えば、マウス又はラット)モデルにおけるインビボ腫瘍増殖阻害が含まれ得る。インビボ及び/又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片)、又は放射性同位元素など、一以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書に記載される抗HER3/HER4抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗HER3(及び抗HER4)抗体の何れかは、生物学的試料中のHER3及び/又はHER4のそれぞれの存在を検出するために有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。ある実施態様において、生物学的試料は、腫瘍組織などの細胞又は組織を含む。
本明細書に記載の抗HER3(及び抗HER4)抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容される一以上の担体(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980))とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容可能な担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリ(ビニルピロリドン);アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン;マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);及び/又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容可能な担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rhuPH20(HYLENEX(登録商標))、Baxter International、Inc.)などのヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なsHASEGP及び使用法は、rhuPH20を含み、米国特許出願公開第2005/0260186号及び第2006/0104968号に開示されている。一態様において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つ又は複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
本明細書において提供される抗HER3(及び抗HER4)抗体又は細胞傷害性薬物にコンジュゲートした抗HER3/HER4抗体のイムノコンジュゲートの何れかが、治療法で使用され得る。
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び/又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベル又は容器上にある又は容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び/又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、(a)組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器;及び(b)組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第2の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物を更に含んでいてもよい。別法として、又は加えて、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二(又は第三)の容器を更に含んでもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの立場から望まれる他の物質を更に含んでもよい。
配列番号1 ヒトHER3のβヘアピン
配列番号2 ヒトHER4のβヘアピン
配列番号3 ヒトHER3
配列番号4 ヒトHER3細胞外ドメイン(ECD)
配列番号5 ヒトHER4
配列番号6 ヒトHER4細胞外ドメイン(ECD)
配列番号7 ヒトHER1
配列番号8 ヒトHER1細胞外ドメイン(ECD)
配列番号9 ヒトHER2
配列番号10 ヒトHER2細胞外ドメイン(ECD)
配列番号11 ヒトヘレグリン断片(HRG)
配列番号12 ヒトヘレグリンβ−1断片(Preprotechから提供)
配列番号13 TtSlyD−FKBP−Her3
配列番号14 TtSlyD−野生型
配列番号15 TtSlyDcas
配列番号16 TgSlyDΔIF
配列番号17 TtSlyDcas−Her3
配列番号18 TtSlyDcys−Her3
配列番号19 TgSlyDser−Her3
配列番号20 TgSlyDcys−Her3
配列番号21 TtSlyDcas−Her4
配列番号22 TtSlyDcys−Her4
配列番号23 TgSlyDser−Her4
配列番号24 TgSlyDcys−Her4
配列番号25 重鎖HVR−H1、M−05−74
配列番号26 重鎖HVR−H2、M−05−74
配列番号27 重鎖HVR−H3、M−05−74
配列番号28 軽鎖HVR−L1、M−05−74
配列番号29 軽鎖HVR−L2、M−05−74
配列番号30 軽鎖HVR−L3、M−05−74
配列番号31 重鎖可変ドメインVH、M−05−74
配列番号32 軽鎖可変ドメインVL、M−05−74
配列番号33 M−05−74の重鎖可変ドメインVHのヒト化変異体A(VH−A)
配列番号34 M−05−74の重鎖可変ドメインVHのヒト化変異体B(VH−B)
配列番号35 M−05−74の重鎖可変ドメインVHのヒト化変異体C(VH−C)
配列番号36 M−05−74の重鎖可変ドメインVHのヒト化変異体D(VH−D)
配列番号37 M−05−74の重鎖可変ドメインVHのヒト化変異体E(VH−E)
配列番号38 M−05−74の軽鎖可変ドメインVLのヒト化変異体A(VL−A)
配列番号39 M−05−74の軽鎖可変ドメインVLのヒト化変異体B(VL−B)
配列番号40 M−05−74の軽鎖可変ドメインVLのヒト化変異体C(VL−C)
配列番号41 M−05−74の軽鎖可変ドメインVLのヒト化変異体D(VL−D)
配列番号42 M−05−74の軽鎖可変ドメインVLのヒト化変異体E(VL−E)
配列番号43 ヒトHER3のβヘアピン内の結合エピトープ
配列番号44 ヒトHER4のβヘアピン内の結合エピトープ
配列番号45 シュードモナス外毒素変異体PE24LR8M_3G(GGGリンカーを含む)
配列番号46 M−05−74の軽鎖(M−05−74_LC)
配列番号47 ソルターゼタグを有するM−05−74 HCの重鎖(M−05−74_HC)
配列番号48 シュードモナス外毒素変異体PE24LR8MにコンジュゲートしたM−05−74 HCの重鎖(Fab−074−PEの重鎖1)
配列番号49 シュードモナス外毒素変異体PE24LR8Mに、直接のPE24LR8M融合として、コンジュゲートしたM−05−74 HCの重鎖(Fab−074−PEの重鎖2)
配列番号50 可溶性黄色ブドウ球菌ソルターゼA
配列番号51 重鎖可変ドメインVH、<Her3>M−08−11
配列番号52 軽鎖可変ドメインVL、<Her3>M−08−11
配列番号53 ヒトカッパ軽鎖定常領域
配列番号54 ヒトラムダ軽鎖定常領域
配列番号55 IgG1由来のヒト重鎖定常領域
配列番号56 L234A及びL235Aに関して変異されたIgG1由来のヒト重鎖定常領域
配列番号57 L234A、L235A及びP329Gに関して変異されたIgG1由来のヒト重鎖定常領域
配列番号58 IgG4由来のヒト重鎖定常領域
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)を含む。
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及びb)配列番号41のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−D)、配列番号39のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−B)、又は配列番号42のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−E)を含む。
ここで抗体は
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及びb)配列番号41のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−D)を含む。
抗体が
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及びb)配列番号39のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−B)を含む。
抗体が
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH(VH−A)及びb)配列番号42のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL(VL−E)を含む。
配列番号18 TtSlyDcys−Her3
のポリペプチドに含まれるPQPLVYNKLTFQLEPNPHT(配列番号1)のアミノ酸配列内に結合する実施態様1から5の何れか一に記載の抗体。
配列番号18 TtSlyDcys−Her3
のポリペプチドに結合する、実施態様1から5の何れか一に記載の抗体。
ヒトHER4に結合し、かつ
配列番号22 TtSlyDcys−Her4
のPQTFVYNPTTFQLEHNFNA(配列番号2)のアミノ酸配列内に結合する実施態様6又は7に記載の抗体。
ヒトHER4に結合し、
配列番号22 TtSlyDcys−Her4
のポリペプチドに結合する実施態様6又は7に記載の抗体。
ここで抗体は以下の特性の一以上を有する:
抗体は、
a)配列番号13 TtSlyD−FKBP−Her3、
配列番号17 TtSlyDcas−Her3、
配列番号18 TtSlyDcys−Her3、
配列番号19 TgSlyDser−Her3、及び
配列番号20 TgSlyDcys−Her3
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるPQPLVYNKLTFQLEPNPHT(配列番号1)のアミノ酸配列内に結合する;
b)配列番号13 TtSlyD−FKBP−Her3、
配列番号17 TtSlyDcas−Her3、
配列番号18 TtSlyDcys−Her3、
配列番号19 TgSlyDser−Her3、及び
配列番号20 TgSlyDcys−Her3
からなる群から選択されるポリペプチドに結合する;
c)HER3/HER2の共沈殿アッセイでMCF−7細胞におけるHER3/HER2のヘテロ二量体のヘテロ二量体化を阻害する;
d)配列番号21 TtSlyDcas−Her4、
配列番号22 TtSlyDcys−Her4、
配列番号23 TgSlyDser−Her4、及び
配列番号24 TgSlyDcys−Her4
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるPQTFVYNPTTFQLEHNFNA(配列番号2)のアミノ酸配列内に結合する;
e)配列番号21 TtSlyDcas−Her4、
配列番号22 TtSlyDcys−Her4、
配列番号23 TgSlyDser−Her4、及び
配列番号24 TgSlyDcys−Her4
からなる群から選択されるポリペプチドに結合する;
f)二価の親完全長抗体と比較して、一価のFab断片として、(MCF−7細胞におけるHER3のリン酸化阻害において、等モル量で比較した場合)同じ又はそれ以上の生物学的活性を示す;
g)インビボで腫瘍増殖阻害活性を示す;
h)HER3−ECDに、KD値≦1x10−8Mの親和性で結合し(一実施態様において、1x10−8Mから1x10−13MのKD値で;(一実施態様において、1x10−9Mから1x10−13MのKD値で);
i)HER4−ECDに、KD値≦1x10−8Mの親和性で結合し(一実施態様において、1x10−8Mから1x10−13MのKD値で;(一実施態様において、1x10−9Mから1x10−13MのKD値で);
j)ここで、抗体は、VYNKLTFQLEP(配列番号43)からなるポリペプチドに、又はVYNPTTFQLE(配列番号44)からなるポリペプチドに結合する;
k)ここで、抗体は、VYNKLTFQLEP(配列番号43)からなるポリペプチドに結合し;及び/又は
l)ここで、抗体は、VYNPTTFQLE(配列番号44)からなるポリペプチドに結合する。
組換えDNA技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記述されるように、標準的な方法がDNAを操作するために使用された。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。
所望の遺伝子セグメントを、化学合成によって作られたオリゴヌクレオチドから調製した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接した400−1600bp長の遺伝子セグメントは、アニーリング及びPCR増幅を含むオリゴヌクレオチドの連結によって構築され、続いて示された制限部位、例えばEcoRI/BlpI又はBsmI/XhoIを介して以下に記載の発現ベクターへクローニングされた。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。遺伝子合成断片は、Geneart(Regensburg、Germany)で指定された仕様に基づいて発注された。
DNA配列は、Sequiserve GmbH(Vaterstetten、Germany)で行った二本鎖配列決定により決定した。
インフォマックスのベクターNT1アドバンススイートバージョン11.5.0が、配列の作成、マッピング、解析、注釈及び説明のために使用された。
抗原及びスクリーニングタンパク質の調製−HER3のβヘアピン及びHER4のβヘアピンに結合する抗体を選択するための機能的βヘアピンHER3及びβヘアピンHER4コンストラクトの生成
機能的βヘアピンHER3及びHER4コンストラクトを生成するために、HER3のβヘアピン(配列番号1)及びHER4のβヘアピン(配列番号4)のアミノ酸配列は、FKBPドメインを含むポリペプチドのSlyDフレームワークに移植された。このようなコンストラクトにおいて、移植されたβヘアピンは、(例えば、HRGなどのリガンドの非存在下で)HER3又はHER4の天然の非活性化型コンホメーションにおける隠れた構造とは対照的に、自由にアクセス可能である(HER3のβヘアピンが隠れている図1c及び1dを参照)。
a)免疫化とHER3抗体の選択
HER3及びHER4のβヘアピンに対する抗体の生成のために、Balb/C、NMRI又はSJLマウスを異なる抗原で免疫した。抗原として、以下のタンパク質を使用した:完全長Her3 ECD、又はエピトープスキャフォールドタンパク質TtSlyD−FKBP12−Her3、TtSlyDcys−Her3、TtSlyDcas−Her3、TgSlyDcys−Her3及びTgSlyDser−Her3。TtSlyD−FKBP12−HER3変異体は、HER3二量体化ドメイン特異的抗体の生成のために使用される第一世代のエピトープスキャフォールドを表す。エピトープスキャフォールドとしてSlyD変異体を使用することの一般原理は、既に第一世代のSlyD−FKBP12スキャフォールドを使用して実証することができたが、高い安定性を有するスキャフォールドの改善された変異体が開発された。これらのSlyD変異体は、サーマス・サーモフィラス及びThermococcus gammatoleransから由来する。
それぞれの免疫原に対する及びスクリーニングタンパク質に対する血清力価の測定のため、各マウスの血清の少量が、免疫化キャンペーンの開始後11週目に採取された。ELISAのため、免疫原又はスクリーニングのスキャフォールドタンパク質をプレート表面上に固定化した。HER3 ECDは1μg/mlの濃度で固定化し、スキャフォールドタンパク質TtSlyD−FKBP12−Her3、TtSlyD−FKBP12、TtSlyDcys−Her3、TtSlyDcas−Her3、TtSlyDcas、TgSlyDcys−Her3、TgSlyDser−Her3及びTgSlyDΔIFは、0.5/mlの濃度で使用した。スキャフォールドタンパク質TtSlyDcas及びTgSlyDΔIFは、陰性対照として使用された。各マウスからの血清を、1%BSAを含むPBS中に希釈し、希釈液をプレートに添加した。血清は、希釈1:300、1:900、1:2700、1:8100、1:24300、1:72900、1:218700及び1:656100で試験された。結合した抗体は、基質としてHRP標識F(ab`)2ヤギ抗マウスFcγ(Dianova)及びABTS(Roche)を用いて検出された。
ここで説明するエピトープスキャフォールド技術の使用は、Her3二量体化ドメイン(HER3のβヘアピン(配列番号1))を標的とする抗体の開発のための主要な2つの戦略を提供する。1つの戦略は、完全長Her3 ECDで免疫し、二量体化ドメインに特異的な抗体をスクリーニングするためのスキャフォールドを使用することである。他の戦略は、免疫化のためのスキャフォールドの直接の使用、及びHer3 ECD、他の骨格を持つスキャフォールド又はカウンタースクリーニングのための挿入体を含まないスキャフォールドを使用することである。抗体は、初代B細胞をP3X63Ag8.653骨髄腫細胞と融合することによるハイブリドーマ技術を用いて開発された。2日後、最終追加免疫の後、免疫したマウスを屠殺し、脾臓細胞集団を調製した。脾臓細胞は、PEG融合技術を用いて、P3X63Ag8.653と融合させた。融合からの細胞のバッチ培養は、5%CO2下、37℃で一晩インキュベートした。翌日、融合細胞を含む細胞のバッチを400gで10分間遠心分離した。その後、細胞を、0.1×アザセリン−ヒポキサンチン(Sigma)を補充したハイブリドーマ選択培地に懸濁し、96ウェルプレートにウェル当たり2.5x104細胞の濃度で播種した。プレートを、5%CO2下、37℃で少なくとも1週間培養した。ELISA分析の3日前に選択培地を交換した。
全ての選択されたクローンは、IHCにおいて反応性及び特異性について試験された。従って、HEK293細胞は、完全長HER1、HER2、HER3又はHER4をそれぞれコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトされた。トランスフェクションの2日後、HER1、HER2、HER3又はHER4を今や発現する異なる細胞株は回収され、続いて、ホルマリンで固定され、IHC対照を生成するためにアガロースに包埋された。ホルマリン中で一晩更に固定した後、アガロースブロックはパラフィンに包埋された。トランスフェクトされていないHEK293細胞を陰性対照として使用し、トランスフェクトされた細胞に応じて処置された。パラフィン包埋した後、3μmの薄い切片をミクロトームを用いて調製した。切片をガラス顕微鏡スライド上にマウントし、2時間乾燥させた。免疫組織化学の染色手順の全ての更なる工程は、ベンタナベンチマークXTを用いて行われた。スライドを脱脂し、抗原回復は1時間加熱することによって行われた。抗原回復のために、ベンタナ緩衝液CC1を使用した。抗体は、1μg/mlの濃度で使用した結合した抗体の検出のためにベンタナUltraView検出キットを使用した。結果を図5に示す。3つ全てのクローンは、HER3への結合とHER4に対する交差反応性を示した。HER1及びHER2に対する交差反応性は検出されなかった。
選択されたハイブリドーマクローンのDNA配列を得るために、5`Race PCRを行った。RT−PCRのために、全RNAは、全RNA精製キット(Qiagen)を用いて、5×106細胞から調製した。逆転写及びPCRは5`prime RACE PCRキットを使用して行った(Roche)。重鎖及び軽鎖から得られたPCR断片をゲル電気泳動及び続くゲル精製によって精製した。PCR断片をTopo Zero−Bluntクローニングキット(Invitrogen)を用いてクローンし、コンピテント細胞に形質転換した。各々のハイブリドーマからの幾つかのクローンが、選択されたクローンのコンセンサス配列を得るために配列決定に供された。M−05−74 M−15−02 M−15−04が、配列決定のために提出され、3つ全てのクローンについて同一のVH及びVL配列が得られた。M−15−03、M−15−05、M−15−08、M−15−09、M−15−11、M−16−01が同様に配列決定され、全てのクローンについて同一のVH及びVL配列をもたらした。
HER3に対して選択されたクローンM−05−74によるHER3の結合及び内部移行が、HER3を発現する腫瘍細胞株T47Dを用いてFACSで分析された。5×105細胞が、50ngの組換えヒトヘレグリン断片(HRG)(配列番号11)により処置された。配列番号11のアミノ酸を含む断片11が、pCDNA.1ベクター(Invitrogen)にクローニングされた。HRG断片は、Invitrogenにより記載されたプロトコルに従ってFreeStyleTM 293−F細胞中で発現された。(FreeStyleTM 293発現システムのカタログ番号K9000−01)。精製されたHRG断片は、20mMのヒスチジン、140mMのNaCl;pH6.0中に溶解され、−80℃で保存された。
a) HER3抗体の速度論的スクリーニング/結合特性
速度論的スクリーニングは、ビアコアCM5センサーを備えたBIAcore 4000装置で、Schraemlらに従って行われた(Schraml, M. and M. Biehl, Methods Mol Biol 901 (2012) 171-181)。全てのアッセイにおいて試験抗体が捕捉された。そのシステムは、ソフトウェアバージョンV1.1の制御下にあった。機器の緩衝液は、HBS−EP(10mMのHEPES(pH7.4)、150mMのNaCl、1mMのEDTA、0.05%(w/v)のP20)であった。システムは、25℃で操作された。10mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)中の30/mlのウサギポリクローナル抗体(RAM IgG、(Fcガンマ特異性を有するウサギ抗マウスIgG)GE Healthcare)が、フローセル1、2、3、及び4のスポット1、2、4及び5において、製造業者の指示に従ってEDC/NHS化学を用いて固定化された。センサーは、1Mのエタノールアミンを用いて飽和された。各フローセルにおいて、参照シグナルは、スポット1−2及びスポット5−4を用いて計算され、スポット3はブランク対照とした。抗原(ヒト組換えHer−3 ECD(68kDa)、及びHER3のβ−ヘアピンペプチド(配列番号1)を含む、組換えサーマス・サーモフィラスSlyD FKBP−HER3(15kDa)は、非特異的結合を抑制するために、1mg/mlのCMD(カルボキシメチルデキストラン、Sigma)を補充した機器の緩衝液で150nMに希釈された。それらの適用の前に、ハイブリドーマ培養上清は、機器の緩衝液で1:5に希釈された。希釈された混合物を2分間、30μl/分の流速で注入した。抗体捕捉レベル(CL)は応答単位でモニターされた。その直後に、各抗原を、3分間、30μl/分の流速で注入した。その後、抗体−抗原複合体の解離シグナルを5分間記録した。センサーは、30μl/分の流速で2分間、10mMのグリシン−HCl溶液(pH1.7)を注入することによって再生した。抗原の注入の終了の直前に記録されたシグナルは、応答単位で結合遅延(BL)として記された。解離の記録の終了の直前に記録されたシグナルは、応答単位で安定性遅延(SL)として記された。解離速度定数を算出して決定した。分単位での抗体−抗原複合体の安定性は、以下の式:ln(2)/60*kdを用いて計算した。モル比は、式:MW(抗体)/MW(抗原)*BL(抗原)/CL(抗体)を用いて計算した。
一実験において、速度論的スクリーニングは、ヒト組換えHer−3 ECDによるマウスの免疫化から得られた、異なる融合からのハイブリドーマ一次培養を用いて開始された。目的は、Her−3のヘテロ二量体化ドメインのβ−ヘアピンペプチド(配列番号1)に対する結合特異性を有する培養物を選択することであった。溶液中の抗原として、ヒト組換えHer−3 ECD(68kDa)、及びHER3のβヘアピンペプチド(配列番号1)を含有する組換えサーマス・サーモフィラスSlyD FKBP−HER3(15kD)が使用された。正の的中は、両方の抗原に対する結合活性を有する一次培養上清として分類された。
その平衡状態において、Her−3 ECDは、その「閉じたコンホメーション」で存在し、このことは、ヘテロ二量体化Her3ベータヘアピンモチーフはHer−3 ECDドメインIVへの非共有結合性相互作用を介して係留されていることを意味している(図1c及び1dを参照)。これは、「閉じた」Her3コンホメーションは、特異的なHer3ヘレグリン結合部位でのリガンドヘレグリンの結合を介して開くことができると想定される。これは、Her3のECDドメインIとドメインIIIによって形成されたHer3界面で起こる。この相互作用により、Her−3受容体が活性化され、その「開いたコンホメーション」へと移行されると考えられる(図1b及びeを参照)。これが生じると、Her−3のベータヘアピンは記載された抗体に対して接触可能となる。この作用機序は、ビアコア実験によりインビトロでシミュレートすることができる。
抗HER3抗体M−05−74のエピトープマッピングと作用機序の分析
ユニークなエピトープ(HER3及びHER4のβヘアピン)を有するM−05−74
ビアコア2000(GE Healthcare)装置は、アクセス可能なエピトープクローンの培養上清を、それらの結合特異性について評価するために使用された。CM5センサーをシステムに装着し、製造業者の指示に従ってHBS−ET緩衝液(10mMのHEPES pH7.4、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.005%w/vのTween20)で正規化した。試料緩衝液は、1mg/mlのCMD(カルボキシメチルデキストラン、Sigma)を補充したシステム緩衝液であった。システムは、37℃で操作された。10000RU−RAMのFcγ(Fcγ断片ウサギ抗マウスIgG/ジャクソン研究所の相対単位)は、4つ全てのフローセル上に、EDC/NHS化学を用いて、製造元の指示に従って固定化された。センサーは、1Mのエタノールアミンを用いて不活性化された。
ビアコアB3000装置(GE Healthcare)は、Her−3 ECDの「閉じた」コンホメーションと「開いた」ヘレグリン活性化Her−3 ECDに対して、クローン培養M−05−74及び抗体8B8(国際公開第97/35885号、図中でGTと命名)を速度論的に評価するために使用された。CM5シリーズセンサーをシステムに装着し、製造業者の指示に従ってHBS−ET緩衝液(10mMのHEPES pH7.4、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.005%w/vのTween20)で正規化した。試料緩衝液は、1mg/mlのCMD(カルボキシメチルデキストラン)を補充したシステム緩衝液であった。システムは、25℃で操作された。10000RU−RAMのFcγ(Fcγ断片ウサギ抗マウスIgG/ジャクソン研究所の相対単位)は、全てのフローセル上に、EDC/NHS化学を用いて、製造元の指示に従って固定化された。センサーは、1Mのエタノールアミンを用いて不活性化された。溶液中の分析物は、2分間、0nM、1.1nM、3.7nM、11.1nM、33.1nM及び90nMの異なる濃度のステップで注入した。解離は5分間モニターされた。センサー表面の酸性再生は、60秒間、30μlで、10mMのグリシンpH1.7の3回の連続注射を使用して達成された。速度論的データは、ラングミュアフィットに従って評価された。
別の実施態様において、CelluSpotsTM合成及びエピトープマッピング技術を使用してHer−3 ECDエピトープを特徴づけるために、ペプチドベースの2Dエピトープマッピング実験が行われた。エピトープマッピングは、ヒトHer−1 ECD、Her−2 ECD、Her−3 ECD及びHer−4 ECDペプチドヘアピンの配列に対応する、重複する、固定化されたペプチド断片(長さ:15アミノ酸)のライブラリーを用いて実施された。図11において、エピトープマッピング及びアラニンスキャンアプローチの戦略が示される。HER1(EGFR)ECD、HER2 ECD、HER3 ECD及びHER4 ECDのペプチドヘアピンの配列(βヘアピン)は、それらの構造的埋め込み(構造)を含めて、調べられた。システインは、セリンによって置換された。このようなβヘアピンへの結合を介した抗体の抗体選択のために、HER3及びHER4のβヘアピンは、配列番号1及び配列番号2により定義される。
HER3抗体の存在下でのHER3−ECDに対するHRGの結合(ELISA)
ストレプトアビジン被覆96ウェルプレートを、SBPタグ付きHER3−ECDを含有する細胞培養上清とともに4℃でインキュベートした。翌日、ウェルは洗浄緩衝液(PBS+0.05%のTween−20)で3回洗浄され、1%BSAを含有するPBSで1時間ブロックされた。洗浄緩衝液で更に3回洗浄した後、(デルフィア結合緩衝液中)40μlの抗体溶液を、所望の最終濃度の2倍ストック(10−3から103nM、あるいは10−4から102nM)として各ウェルに加えた。直ちに、40μlの20nMのユーロピウム標識ヘレグリンβ(PeproTech、カタログ#100−03)が、10nMの最終濃度を達成するために添加された。プレートを2時間室温でシェーカー上でインキュベートした。デルフィア洗浄緩衝液(Delfia Wash Buffer)で3回洗浄した後、デルフィア増強溶液(Delfia Enhancement Solution)が添加され、15分間シェーカー上でインキュベートされた(光防護されて)。最後に、プレートを、時間分解蛍光測定プロトコルを用いて、Tecan Infinite F200リーダーで測定した。M−05−74(図14でM−074と命名)の結合は、プラトーが650のシグナルに達するまで、HRGのHER3−ECDへの結合を促進することができる。結果を図14に示す。
a)ZR−75−1細胞におけるHER3リン酸化の阻害
アッセイは、以下のプロトコルに従ってZR−75−1細胞において行われた:細胞を、10%FCSを含むRPMI1640培地中で、ポリ−D−リジンを被覆した6ウェルプレートに、500,000細胞/ウェルで播種する。24時間インキュベートする。吸引により培地を除去し、0.5%FCSを含む500μl/ウェルのRPMI1640で一晩インキュベートする。0.5%FCSを含む500μlのRPMI1640中に抗体を添加する。1時間インキュベートする。ヘレグリンベータ(PeproTech、カタログ#100−03))を10分間添加する(最終濃度500ng/ml)。細胞を溶解するため、培地を除去し、80μlの氷冷Triton−X−100細胞溶解緩衝液を添加し、氷上で5分間インキュベートする。1.5mlの反応チューブに溶解物を移した後、4℃で15分間14000rpmで遠心分離し、新鮮な反応チューブに上清を移す。SDSローディング緩衝液中で等量のタンパク質を含有する試料はSDS PAGE上で分離され、ニトロセルロース膜にセミドライウエスタンブロットを使用してブロットされた。膜は1時間、1xNET緩衝液+0.25%ゼラチンによってブロックされ、pHER3は、抗体αホスホ−HER3/ErbB3(Tyr1289)(21D3)、Cell Signaling、#4791によって検出され、HER3は抗体αErbB3(C−17)はSanta Cruz、#sc−285によってそれぞれ検出される。洗浄及びPOD結合二次抗体によるシグナルの検出後、バンドは密度的にスキャンされた。zr−75−1細胞における受容体リン酸化に対する抗HER3抗体M−05−74の阻害の割合(%)は以下の表7に示される。
MCF−7細胞を24ウェルプレートに播種し(1mlのRPMI、10%のFCS、ウェル当たり3×105細胞)、一晩37℃/5%のCO2でインキュベートした。24時間後、培地を、0.5%FCSを含有する1mlの培地と交換した。48時間後、抗体は、10μg/ml、1μg/ml及び0.1μg/ml(M−05−74)及び6.66μg/ml、0.66μg/ml及び0.066μg/ml(Fab−074)の最終濃度まで添加された。プレートを50分間37℃でインキュベートし、次いで、ヘレグリンβ(PeproTech、カタログ#100−03)が、500ng/mlの最終濃度まで添加された。プレートを37℃/5%CO2で更に10分間インキュベートした。細胞はPBSで洗浄し、アプロチニン(10μg/ml)、オルトバナジウム酸(0.4mM)、フッ化フェニルメチル(1mM)を含む、40μlのトリトン溶解緩衝液(1%トリトン)で溶解した。収集された溶解物の26μlが反応チューブに移され、14μlの試料緩衝液(NuPAGE LDS試料緩衝液 4x、NuPAGE試料還元剤 10x)が添加された。試料は70℃で10分間インキュベートされ、次いでSDS−PAGE(NuPAGE、4−12%のビス−トリス−ミニゲル)によって分析された。エレクトロブロッティングはiBlotドライブロッティングシステム(Invitrogen)を使用して行われた。ニトロセルロース膜は、ホスホHER3抗体(α Phospho Her3、Cellsignaling #4791、Rabbit 1:1000)とインキュベートされ、その後、HRPコンジュゲート二次抗体(ヤギ抗ウサギ1:5000、BioRad カタログ:170−6515)とのインキュベーションが続いた。シグナルは、X線フィルム(ロシュルミフィルム化学発光検出フィルム11666657001)上でECL検出試薬(Amersham RPN2209)を使用して現像された。抗HER3抗体M−05−74(ハイブリドーマから精製された全長)と(全長のM−05−74からパパイン切断で得られた)抗体Fab−74のFab断片が等モル量で検討された。Fab断片は、抗体のパパイン消化によって生成された。簡潔には、約2mg/mlの抗体を含む溶液1mlに、25mMのシステインと70μgのパパイン(Roche)が補充された。1.5時間37℃でインキュベートした後、消化反応は、ヨードアセトアミドの添加により停止され、反応混合物はMabSelect Sure(GE Healthcare)により精製された。Fab含有フロースルー画分が、更にサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された(スーパーデックス200;GE Healthcare)。
MCF7細胞におけるHER2/HER3ヘテロ二量体の阻害(免疫沈降及びウエスタンブロット)
MCF−7細胞を6ウェルプレートに播種し(2mlのRPMI、10%FCS、ウェルあたり8x105細胞)、一晩増殖させた。翌日に、培地は0.5%のFCSを含有する2mlの飢餓培地により交換された。3日目に、抗体は10μg/mlの最終濃度まで添加され、プレートは37℃でインキュベートされた。50分後、ヘレグリンβ(PeproTech、カタログ#100−03)が500ng/mlの最終濃度まで添加され、プレートは37℃で更に10分間インキュベートされた。細胞はPBSで洗浄され、1%ジギトニンを含有する250μlのトリトン溶解緩衝液中で溶解された。収集された溶解物の60μlが反応チューブに移され、40μlの抗体結合セファロース(ハーセプチン又はHER3抗体#208の何れか)及び0.3%ジギトニンを含有する500μlの緩衝液と共にインキュベートされた。反応混合物は、4℃で一晩ホイール回転装置上でインキュベートされた。翌日、反応混合物は、0.3%ジギトニンを含有する500μlの緩衝液で3回洗浄された。最後の洗浄後、上清は捨てられ、10μlの4Xローディング緩衝液が添加された。チューブは70℃で10分間インキュベートされ、上清は、結果としてSDS−PAGE用のゲルにロードされた。次のセミドライウエスタンブロットの後、HER2抗体で免疫沈降した試料を含む膜は、抗HER3/HER4抗体M−05−74(図15のM−074)でインキュベートされ、逆も同様であった。次いで、膜はHRPコンジュゲート二次抗体と共にインキュベートされ、ECLシグナルはX線フィルム上に転写された。結果は、図15に示され、M−05−74によるHER2/HERヘテロ二量体形成(HER2/HERヘテロ二量体化)の強い阻害を示している。
MDA−MB−175細胞におけるM−05−74の腫瘍細胞増殖の阻害。
MDA−MB−175細胞(VIIヒト乳がん細胞、ATCCのカタログ番号HTB−25)を用いた、細胞増殖アッセイにおけるHER3抗体M−05−74の抗腫瘍効果が評価された。ウェルあたり20,000細胞が、10%FCSを含有するDMEM/F12細胞培地を含む滅菌96ウェル組織培養プレートに播種され、一日5%±1%のCO2によって、37℃±1℃でインキュベートされた。細胞は、約3日間の倍増時間を持つ、低速増殖細胞である。抗HER3抗体は、希釈系列で添加され、更に6日間インキュベートされた。細胞生存率は、その後、AlamarBlue(登録商標)の読み出しを使用して評価された。EC50値が算出された。
抗HER3抗体M−05−74のインビボでの抗腫瘍効果
抗HER3抗体M−05−74(M−074)のインビボでの抗腫瘍効果は、SCIDベージュに移植された様々な腫瘍起源(例えば、SCCHN及び膵臓がん)の細胞ベースのモデルで検出することができた。例として、データは、SCCHN異種移植モデルのFaDu(細胞株に基づく)について示される。
M−05−74は、発現され、ハイブリドーマ細胞から精製され、Roche、Penzberg、Germanyからストック溶液として提供された。抗体緩衝液はヒスチジンを含んでいた。抗体溶液は、注射前に、ストックから緩衝液中に適切に希釈された。
FaDuヒトHNSCC細胞は元々はATCCから入手した。腫瘍細胞株は、規定通りに、5%CO2で水飽和した大気中37℃で、10%ウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム及び0.1mMのNEAAを補充したMEMイーグル培地中で培養された。培養継代は、3日ごとにトリプシン/EDTA 1×分割により行った。
メスのSCIDベージュマウス又はヌードマウスは、ブリーダー(例えば、Charles River、Sulzfeld、Germany)から購入され、確約されたガイドライン(GV−Solas;Felasa;TierschG)に従って、特定の病原体フリーの条件下で、12時間明所/12時間暗所の日々のサイクルで維持された。実験研究プロトコルはレビューされ、地方政府によって承認された。到着後、動物は、新しい環境に慣れるため、及び観察のために、1週間動物施設の検疫部で維持された。連続的な健康モニタリングを定期的に行った。規制食(Provimi Kliba 3337)及び水(pH2.5−3に酸性化)が自由に与えられた。
M−05−74−Fas−シュードモナス外毒素コンジュゲートの生成(M−05−74−PE)
M−05−74のFab断片、PE24変異体、及び配列番号45、46、47、48(又は49)の配列に基づいたシュードモナス外毒素変異体PE24LR8MにコンジュゲートしたM−05−74のFab断片の発現、精製及び再生。
記載されたFab断片の発現のため、CMVイントロンAプロモーターを含む又は含まないcDNA構成、又はCMVプロモーターを含むゲノム構成の何れかに基づいた一過性発現(例えば、HEK293−F)細胞のための発現プラスミドの変異体が適用された。
− 大腸菌でこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、及び
− 大腸菌においてアンピシリン耐性を付与する、β−ラクタマーゼ遺伝子
− 5’末端におけるユニークな制限酵素部位(複数可)
− ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサー及びプロモーター、
− cDNA構成の場合には続いてイントロンAの配列、
− ヒト抗体遺伝子の5’-非翻訳領域、
− 免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− cDNA、又は免疫グロブリンエキソン−イントロン構成の何れかとしてのヒト抗体鎖、
− ポリアデニル化シグナル配列を有する3’非翻訳領域、及び
− 3’末端におけるユニークな制限酵素部位(複数可)。
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.に記載のように標準的な細胞培養技術を使用した。
Fab断片は、各プラスミド(例えば、重鎖及び修飾重鎖、並びに対応する軽鎖と修飾型軽鎖をコードする)により、製造業者の指示に従ってHEK293−Fシステム(Invitrogen)を使用して、一過性トランスフェクションにより作製された。簡潔には、無血清FreeStyleTM293発現培地(Invitrogen)の振盪フラスコ内又は攪拌発酵槽内の何れかの懸濁液中で増殖するHEK293−F細胞(Invitrogen)が、4つの発現プラスミドと293−FreeTM(Novagen)又はフェクチン(Invitrogen)との混合物によりトランスフェクトされた。2Lの振盪フラスコの場合(Corning)、HEK293−F細胞を、600ml中に1.0E*6細胞/mLの密度で播種し、8%CO2で120rpmでインキュベートした。翌日、細胞は、A)重鎖又は修飾型重鎖のそれぞれ及びその対応する軽鎖を等モル比でコードする計600μgのプラスミドDNA(1μg/mL)を含む20mLのOpti−MEM(Invitrogen)及びB)20mlのOpti−MEM+1.2mLの293−Free(Novagen)又はフェクチン(2μL/mL)の約42mLの混合物を用いて、約1.5E*6細胞/mLの細胞密度でトランスフェクトされた。グルコース消費に応じて、グルコース溶液が発酵の過程で添加された。分泌された抗体を含む上清を5−10日後に回収し、抗体が直接上清から精製されたか又は上清は凍結保存された。
PE24−LR8Mの発現のため、大腸菌発現プラスミドを使用した。
− 大腸菌での複製のためのベクターpBR322由来の複製起点(Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90による)、
− 大腸菌からのlacIリプレッサー遺伝子(Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769)、
− 大腸菌のpyrF欠失株(ウラシル要求性)の相補性により、プラスミドの選択を可能にする、オロチジン5’-リン酸脱炭酸酵素をコードするサッカロマイセス・セレビシエのURA3遺伝子(Rose, M. et al. Gene 29 (1984) 113-124)。
− 5’末端におけるユニークな制限酵素部位(複数可)、
− Stueber、Dらによる合成リボソーム結合部位を含む、T5ハイブリッドプロモーター(Bujard, H., et al. Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433 and Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152によるT5−PN25/03/04ハイブリッドプロモーター)(前を参照)、
− N末端結合タグ続いてフリン部位を伴うシュードモナス外毒素AドメインIII(ソルターゼカップリングのためのGGGリンカーを含む、配列番号45のシュードモナス外毒素変異体PE24LR8M_3G)、
− 2つのバクテリオファージ由来の転写ターミネーター、λ−T0ターミネーター(Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414) 及びfd-ターミネーター (Beck E. and Zink, B. Gene 1-3 (1981) 35-58)、
− 3’末端におけるユニークな制限酵素部位(複数可)。
PE24−LR8M_3G_Ecoli(25kDa)の発現のために、大腸菌の栄養要求性(PyrF)の相補性により、抗生物質無しのプラスミド選択を可能にする大腸菌の宿主/ベクター系が使用された(欧州特許第0972838号及び米国特許第6291245号)。
予備発酵用に、化学的に定義された培地が使用されている。予備発酵用に、4つのバッフル付きの1000mlの三角フラスコ内の220mlの培地に、初代種子バンク(primary seed bank)アンプルのうち1.0mlが播種された。培養は、2.9の光学密度(578nm)が得られるまで、32℃、170rpmで8時間、ロータリーシェーカー上で実施された。予備培養の100mlが、10Lバイオリアクターのバッチ培地に播種するために用いられた。
10lのBiostat C、DCU3発酵槽(Sartorius、Melsungen、Germany)内での発酵のために、化学的に定義バされたバッチ培地が使用された。全ての成分は脱イオン水に溶解された。pH調節のためのアルカリ溶液は、11.25g/lのL−メチオニンを補充した水性の12.5%(w/v)NH3溶液であった。
発酵槽から取り出された試料、一つは誘導の前、他方はタンパク質の発現の時点のものが、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析された。全ての試料から同量の細胞が(ODTarget=10)、5mLのPBS緩衝液中に懸濁させ、氷上で超音波処理を経て破壊された。次に、各懸濁液の100μLが(15,000rpmで5分間)遠心分離され、各上清は回収され別のバイアルに移された。これは、可溶性及び不溶性の発現された標的タンパク質とを区別することである。各上清(=可溶性タンパク質画分)100μlと各ペレット(=不溶性タンパク質画分)200μLに、SDS試料緩衝液(Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685)が添加された。試料は可溶化され、試料中の全てのタンパク質を可用化し還元するため、95℃での激しい混合下15分間加熱された。室温に冷却した後、各試料の5μLが、4−20%のTGX Criterion Stain Freeポリアクリルアミドゲルに移された(Bio−Rad)。更に、5μlの分子量標準物質(Precision Plus Protein Standard、Bio−Rad)が適用された。
Fab−軽鎖(23.4kDa)及びFab−重鎖PE24融合体(48.7kDa)の発現のために、大腸菌の栄養要求性(PyrF)の相補性により、抗生物質無しのプラスミド選択を可能にする大腸菌の宿主/ベクター系が使用された(欧州特許第0972838号及び米国特許第6291245号)。
予備発酵用に、化学的に定義された培地が使用されている。予備発酵用に、4つのバッフル付きの1000mlの三角フラスコ内の220mlの培地に、初代種子バンク(primary seed bank)アンプルのうち1.0mlが播種された。培養は、7から8の光学密度(578nm)が得られるまで、37℃、170rpmで9時間、ロータリーシェーカー上で実施された。予備培養の100mlが、10Lバイオリアクターのバッチ培地に播種するために用いられた。
10lのBiostat C、DCU3発酵槽(Sartorius、Melsungen、Germany)内での発酵のために、化学的に定義バされたバッチ培地が使用された。pH調節のためのアルカリ溶液は、11.25g/lのL−メチオニンを補充した水性の12.5%(w/v)NH3溶液であった。
発酵槽から取り出された試料、一つは誘導の前、他方はタンパク質の発現の時点のものが、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析された。全ての試料から同量の細胞が(ODTarget=10)、5mLのPBS緩衝液中に懸濁させ、氷上で超音波処理を経て破壊された。次に、各懸濁液の100μLが(15,000rpmで5分間)遠心分離され、各上清は回収され別のバイアルに移された。これは、可溶性及び不溶性の発現された標的タンパク質とを区別することである。各上清(=可溶性タンパク質画分)100μlと各ペレット(=不溶性タンパク質画分)200μLに、SDS試料緩衝液(Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685)が添加された。試料は可溶化され、試料中の全てのタンパク質を可用化し還元するため、95℃での激しい混合下15分間加熱された。室温に冷却した後、各試料の5μLが、4−20%のTGX Criterion Stain Freeポリアクリルアミドゲルに移された(Bio−Rad)。更に、5μlの分子量標準物質(Precision Plus Protein Standard、Bio−Rad)及び既知の標的タンパク質濃度(0.1μg/μl)を含む3つの量(0.3μl、0.6μl及び0.9μl)の定量標準物質が適用された。
Fab断片
Fab断片は、製造業者の説明に従って、アフィニティークロマトグラフィーによりニッケル(NiセファロースTM高性能HisTrapTM)により精製した。簡潔には、上清を、50mMリン酸ナトリウムpH8.0、300mMのNaClで平衡化したカラムにロードした。タンパク質の溶出は、4mMのイミダゾール及びその後に最大100mMのイミダゾールまでの勾配を含む洗浄工程により、pH7.0で、同じ緩衝液を用いて行なわれた。所望のFab断片を含む画分をプールし、20mMのHis、140mMのNaCl、pH6.0に対して透析された。
PE24を発現する大腸菌細胞は、20mMのトリス、2mMのEDTA、pHは8.0+コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル錠(Roche)中で高圧ホモジナイゼーションにより溶解された(詳細が必要な場合:Christian Schantz)。溶解物は濾過され、20mMトリス、pH7.4中で平衡化したQセファロースFF(GE Healthcare)にロードされた。タンパク質は、同じ緩衝液中で最大500mMのNaClまでの勾配により溶出された。PE24含有画分はSDS PAGEにより同定された。組み合わされたプールは濃縮され、20mMのトリス、150mMのNaCl、pH7.4中で平衡化されたHiLoadTMSuperdexTM75(GE Healthcare)に適用された。PE24を含む画分はSDS PAGEに従ってプールされ、−80℃で凍結された。
Fab断片及びPE24は、アミコン(登録商標)ウルトラ4遠心分離フィルター装置(Merck Millipore)を使用して50mMのトリス、150mMのNaCl、5mMのCaCl2、pH7.5へ別々に透析濾過され、5−10mg/mlまで濃縮された。タンパク質及びソルターゼの両方が1:1:0.8で混合された。37℃で1時間インキュベートした後、混合物は、50mMのリン酸ナトリウム、pH8.0、300mMのNaCl中で平衡化されたNi SepharoseTM High Perfomance HisTrapTMにロードされた。溶出液は、同じ緩衝液中で最大100mMのイミダゾールまでの勾配により溶出された。最終生成物のFab−PE24を含むフロースルー画分は濃縮され、20mMのトリス、150mMのNaCl、pH7.4中でHiLoadTMSuperdexTM200(GE Healthcare)にロードされた。所望の結合タンパク質を含有する画分がプールされ、−80℃で保存された。ソルターゼとして可溶性黄色ブドウ球菌のソルターゼA、が使用された(配列番号50)。可溶性黄色ブドウ球菌ソルターゼAは、以下の発現プラスミドを用いて発現され精製された。ソルターゼ遺伝子は、N末端切断型黄色ブドウ球菌ソルターゼA(20ー206)分子をコードする。HEK293細胞における可溶性ソルターゼの一過性発現のための発現プラスミドは、可溶性ソルターゼ発現カセットの他に、大腸菌においてこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18からの複製起点、及び大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。可溶性ソルターゼの転写ユニットは、以下の機能要素を含む:
− イントロンAを含む(P−CMV)ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサー及びプロモーター、
− ヒト重鎖免疫グロブリンの5’-非翻訳領域(5’UTR)、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− N末端切断型黄色ブドウ球菌ソルターゼAをコードする核酸、及び
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
VH−PE24及びVL−cカッパの封入体は、8Mのグアニジン塩酸塩、100mMのトリス−HCl、1mMのEDTA、pH8.0+100mMのジチオスレイトール(DTT)で別々に可溶化された。室温で12−16時間後、可溶化物のpHは3.0に調整され、遠心分離された溶液は8M塩酸グアニジン、10mMのEDTA、pH3.0に対して透析された。タンパク質の濃度は、ビウレット反応によって決定され、封入体調製物の純度はSDS PAGEにより評価された。両鎖の等モル量は、2段階で0.5Mのアルギニン、2mMのEDTA、pH10+1mMのGSH/1mMのGSSGへ、0.2−0.3mg/mlの最終濃度まで希釈された。4−10℃で16時間、再生されたタンパク質は、H2Oで<3mS/cmに希釈され、20mMトリス/HCl、pH7.4で平衡化されたQセファロースFF(GE healthcare)上にロードされた。溶出は、同じ緩衝液中で最大400mMのNaClへの勾配により行われた。正確な生成物を含有する画分が、SDS−PAGE及び分析用サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により同定された。プールした画分は濃縮され、20mMのトリス、150mMのNaCl、pH7.4中又は代わりに20mMヒスチジン、140mMの塩化ナトリウム、pH6.0中で、HiLoadTM SuperdexTM 200(GE Healthcare)にロードされた。画分は、分析用SECに応じて分析され、プールされ、−80℃で保存された。
M−05−74−Fab−シュードモナス外毒素コンジュゲート(M−05−74−PE)による異なる腫瘍細胞株の細胞死滅
HER3を過剰発現するA549細胞は、白色96ウェルプレートに播種され(平らな、透明底、ウェル当たり1×104細胞)、一晩RPMI(10%FCS)中で増殖された。翌日に、培地は50μlの飢餓培地(RPMI、0.5%FCS)で交換された。少なくとも4時間後、5μlのヘレグリンβ(PeproTech、カタログ#100−03)(HRGベータ)が500ng/mlの最終濃度まで添加された。50μlのFab−74−PE溶液が、10、3.3、1.1、0.37、0.12、0.04、0.014、0.005及び0.002μg/mlの最終濃度まで添加された。プレートは72時間インキュベートされた。24時間及び48時間後、5μlのヘレグリン−βが、500ng/mlの最終濃度になるように再び添加された。72時間後に、発光は、PromegaによるCellTiter−Glo発光細胞生存率アッセイ(カタログ#G7571)を使用して、Tecan Infinite F200リーダーで測定された。HRGベータの非存在下でのM−05−74−Fab−シュードモナス外毒素コンジュゲート(M−05−74−PE)のEC50値は、1,93μg/mlであって、その存在下では0,13μg/mlであった。
抗HER3抗体M−05−74のヒト化変異体
類似するヒト抗体可変ドメインを検索するために、マウス抗体M−05−7の重鎖及び軽鎖可変ドメインを使用した。各鎖について得られた200の結果から、約半分が非ヒト供給源からのものとして拒絶された。残りのヒト抗体の全てが、VH/Vl界面に関与するフレームワーク内の重要な残基について、及びCDRループ構造にとって重要である残基について分析された。可能な限り、VH/VL界面及びカノニカルループ構造にとって重要なこれらの重要な残基はヒト化変異体において維持されているが、ただし、これらの位置の一部の変化は時々含まれる。マウス抗体鎖のCDRが、これらのヒト抗体のフレームワークに移植された。上位5つの移植ドメインが、以前の基準に基づいて、また更なる開発のためのイン・シリコ・スクリーンにおけるT細胞エピトープの結果に基づいて選択された。従って、マウスの抗HER3抗体M−05−74は、M−05−74の以下のヒト化変異体VH及びVLドメインを与えるためにヒト化された。
配列決定の結果は、1つの特定の変異体:VH−A/VL−Dの濃縮を示す。対応する配列は34の試料から6回得られ、これは明らかに上記アッセイにおけるHER−ECDに対する最も強力な結合特性を示す。
抗HER3抗体M−05−74のヒト化変異体の結合
抗HER3抗体M−05−74(実施例12aに記載)のヒト化変異体VH−A/VL−DのHER3−ECD及びHER4−ECDへの結合を調べるために、リガンドのヘレグリンの存在下及び非存在下で、SPR分析をBiacore 3000装置(GE Healthcare)を用いて37℃で行った(表11)。
M−05−74−Fab−シュードモナス外毒素コンジュゲート(M−074−PE)によるインビボでの腫瘍細胞増殖阻害。
ヒトA431−B34の非小細胞肺がん細胞株は、ヒトHER3をコードする発現ベクターで安定的にトランスフェクトされた細胞株であり、雌のSCIDベージュマウスの右脇腹に皮下接種された(動物当たり1×107細胞)。
国際公開第2012/22814号に記載される抗HER3抗体MOR09823(2)と比較した、抗体M−05−74(1)のTtSlyDcys−Her3(配列番号18)に対する結合。
ビアコアT200装置(GE Healthcare)はCM5シリーズセンサーを備え、製造業者の指示に従って、HBS−ET+緩衝液(10mMのHEPES pH7.4、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.05%w/vのTween20)で正規化された。試料緩衝液は、1mg/mlのCMD(カルボキシメチルデキストラン)を補充したシステム緩衝液であった。システムは、37℃で操作された。二重抗体捕捉システムは、センサー表面上に構築された。6500RUのmAb<M−IgG>Rが、全てのフローセル上でEDC/NHS化学を用いて、製造業者の指示に従って固定化された。センサーは、1Mのエタノールアミンを用いて不活性化された。フローセル1は、基準としての役割を果たし、抗TSH IgG1抗体により10μl/分で1分間捕捉された。フローセル2に、M−5−74は、10μl/分で1分間捕捉された。フローセル3には、マウス抗ヒトFCパン抗体が10μl/分で1分間捕捉され、その後、抗HER3抗体M−05−74(1)又は抗HER3抗体MOR09823抗体が、1分間、10μl/分で注入された。流速は60μl/分に設定された。TtSlyDcys−HER3(配列番号18)の溶液中の分析物は、5分間、0nM及び150nMの濃度で注入され、その解離は600秒モニターされた。センサーは、10mMのグリシン、pHが1.7緩衝液による3分間、10μl/分での1回の注入により完全に再生された。
Claims (16)
- ヒトHER3に結合する単離された抗体であって、
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH、及び
b)配列番号41のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL、配列番号39のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVL、又は配列番号42のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVLを含む、抗体。 - ヒトHER3に結合する単離された抗体であって、
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH、及び
b)配列番号41のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVLを含む、抗体。 - ヒトHER3に結合する単離された抗体であって、
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH、及び
b)配列番号39のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVLを含む、抗体。 - ヒトHER3に結合する単離された抗体であって、
a)配列番号33のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインVH、及び
b)配列番号42のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインVLを含む、抗体。 - a)配列番号13 TtSlyD−FKBP−Her3、
配列番号17 TtSlyDcas−Her3、
配列番号18 TtSlyDcys−Her3、
配列番号19 TgSlyDser−Her3、及び
配列番号20 TgSlyDcys−Her3
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるPQPLVYNKLTFQLEPNPHT(配列番号1)のアミノ酸配列内に結合する、請求項1から4の何れか一項に記載の抗体。 - 完全長IgG1抗体又はIgG4抗体である、請求項1から5の何れか一項に記載の抗体。
- Fab断片である、請求項1から5の何れか一項に記載の抗体。
- 請求項1から5の何れか一項に記載の抗体及び細胞傷害性薬物を含む、イムノコンジュゲート。
- がんを治療することにおける使用のための、請求項1から5の何れか一項に記載の抗体、又は請求項8に記載のイムノコンジュゲート。
- HER3/HER2二量体化の阻害における使用のための、請求項1から5の何れか一項に記載の抗体。
- がんを治療するための薬学的製剤であって、請求項1から5の何れか一項に記載の抗体、又は請求項8に記載のイムノコンジュゲート、及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的製剤。
- 請求項1から5の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
- 請求項12に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 抗体が生成されるように請求項13に記載の宿主細胞を培養すること、及び前記細胞培養物又は細胞培養物上清から前記抗体を回収することを含む、抗体を生成する方法。
- がんを治療するための医薬であって、請求項1から5の何れか一項に記載の抗体、請求項8に記載のイムノコンジュゲート、又は請求項11に記載の薬学的製剤を含む、医薬。
- HER3/HER2二量体化を阻害するための薬剤であって、請求項1から5の何れか一項に記載の抗体を含む、薬剤。
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