TW201605902A - 結合ＨＥＲ３之β－髮夾結構的抗ＨＥＲ３抗體 - Google Patents

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卡門 皮司
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Abstract

本發明係關於結合HER3之β-髮夾結構的特定抗HER3抗體，其製備及作為藥劑的用途。

Description

結合HER3之β-髮夾結構的抗HER3抗體
本發明係關於結合HER3之β-髮夾結構的抗HER3抗體，其製備及作為藥劑的用途。
HER蛋白質家族由4個成員組成：HER1，亦稱為表皮生長因子受體(EGFR)或ErbB-1；HER2，亦稱為ErbB-2；ErbB-3，亦稱為HER3；且ErbB-4，亦稱為HER4。ErbB家族蛋白質為受體酪胺酸激酶，且是細胞生長、分化及存活的重要介體。HER家族代表不同配位體的受體蛋白質，如神經調節蛋白(NRG)家族、雙調蛋白、EGF及(TGF-a)。海瑞古林(Heregulin)(亦稱為HRG或神經調節蛋白NRG-1)為例如HER3及HER4的配位體。
人類HER3(ErbB-3、ERBB3、c-erbB-3、c-erbB3、受體酪胺酸-蛋白質激酶erbB-3，SEQ ID NO：3)編碼受體酪胺酸激酶的表皮生長因子受體(EGFR)家族的成員，其亦包括HER1(亦稱為EGFR)、HER2及HER4(Kraus,M.H.等人，PNAS 86(1989)9193-9197；Plowman,G.D.等人，PNAS 87(1990)4905-4909；Kraus,M.H.等人，PNAS 90(1993)2900-2904)。如同原型表皮生長因子受體，跨膜受體HER3由細胞外配位體結合域(ECD)、ECD內之二聚域、跨膜域、細胞內蛋白質酪胺酸激酶域(TKD)及C端磷酸化域組成。此膜結合蛋白質在細胞外域而 非在活性激酶域內具有海瑞古林(HRG)結合域。因此可結合此配位體但並不會經由蛋白質磷酸化將信號傳輸至細胞中。然而，其會與具有激酶活性之其他HER家庭成員形成雜二聚體。雜二聚致使受體介導之信號傳導路徑發生活化並且其細胞內域發生轉磷酸化。HER家庭成員之間的二聚體形成會擴展HER3的信號傳導潛能，且為一種不僅用於使信號多樣化而且使信號放大的方式。舉例而言，在HER家族成員中HER2/HER3雜二聚體經由PI3K及AKT路徑誘導一種最重要之促進細胞分裂信號(Sliwkowski M.X.等人，J.Biol.Chem.269(1994)14661-14665；Alimandi M等人，Oncogene.10(1995)1813-1821；Hellyer,N.J.,J.Biol.Chem.276(2001)42153-4261；Singer,E.,J.Biol.Chem.276(2001)44266-44274；Schaefer,K.L.,Neoplasia 8(2006)613-622)。對於HER3及其在HER受體家族及NGR配位體家族內之各種相互作用之概述，參見例如G Sithanandam等人Cancer Gene Therapy(2008)15,413-448。
包括前列腺、膀胱及乳房腫瘤之許多癌症中，已報導此基因之擴增及/或其蛋白質之過度表現。已表徵編碼不同同功異型物之替代轉錄剪接變異體。一種同功異型物缺乏膜間區域且分泌於細胞外。此形式用以調節膜結合形式之活性。亦已報導其他剪接變異體，但其尚未進行充分表徵。
有趣的是，在其平衡狀態下，HER3受體以其「閉合構形」形式存在，其意謂雜二聚HER3β-髮夾結構基元經由非共價相互作用繫栓至HER3ECD域IV(參見圖1c及1d)。推測「閉合」HER3構形可經由在特定HER3海瑞古林結合位點配位體海瑞古林之結合而打開。此舉發生於由HER3 ECD域I及域III形成之HER3界面。藉由此相互作用，咸信HER3受體發生活化且轉變為其「打開構形」(參見圖1e及1b且例如Baselga,J.等人，Nat Rev Cancer 9(2009).463-475及Desbois-Mouthon, C.等人，Gastroenterol Clin Biol 34(2010)255-259)。在此打開構形中，可能發生在HER2下雜二聚及轉信號誘導(參見圖1b)。
WO 2003/013602係關於HER活性之抑制劑，其包括HER抗體。WO 2007/077028及WO 2008/100624亦係關於HER3抗體。
WO 97/35885及WO2010/127181係關於HER3抗體。
人類HER4(亦稱為ErbB-4 ERBB4、v-erb-a有核紅血球白血病病毒致癌基因同源物4、p180erbB4禽有核紅血球白血病病毒(v-erb-b2)致癌基因同源物4；SEQ ID NO：5)為具有多個弗林樣(furin-like)半胱胺酸富域、酪胺酸激酶域、磷脂醯肌醇-3激酶結合位點及PDZ域結合基元的單次I型跨膜蛋白(Plowman G D等人，PNAS 90：1746-50(1993)；Zimonjic D B等人，Oncogene 10：1235-7(1995)；Culouscou J M等人，J.Biol.Chem.268：18407-10(1993))。蛋白質結合神經調節蛋白-2及神經調節蛋白-3、肝素結合EGF樣生長因子及β細胞調節素且藉由其活化。配位體結合誘導多種細胞反應，其包括致有絲分裂及分化。多個蛋白分解事件使得釋放細胞質片段及細胞外片段。此基因中之突變與癌症相關。或者已描述編碼不同蛋白質同功異型物之剪接變異體；然而，並非所有變異體均已完全表徵。
自例如US 5,811,098、US 7,332,579或Hollmén M等人，Oncogene.28(2009)1309-19(抗ErbB-4抗體mAb 1479)已知用於抗癌療法之抗HER4抗體。
迄今為止，選擇出特異性結合HER3(及/或HER4)之β-髮夾結構的抗體是不可能的，因為此等HER3(或HER4)之β-髮夾結構皆是隱藏性的抗原決定基，其等在這些受體之平衡狀態下無法接近(參見圖1)。
本發明係關於結合HER3之β-髮夾結構的最佳化抗體。此等抗體源自作為人類化變異體之小鼠抗體M-05-74(其結合HER3之β-髮夾結 構)。從VH及VL域之大量可能的人類構架中，似乎僅5個VH及5個VL構架適合於進一步人類化小鼠抗體M-05-74。令人驚奇地，僅一個預先選擇之VH最終能夠有效結合人類HER3。
因此本發明提供一種結合人類HER3之分離之抗體，其中抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)。本發明進一步提供一種結合人類HER3之分離之抗體，其中抗體包含
a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：41之可變輕鏈域VL(VL-D)、具有胺基酸序列SEQ ID NO：39之可變輕鏈域VL(VL-B)、或具有胺基酸序列SEQ ID NO：42之可變輕鏈域VL(VL-E)。
本發明進一步提供一種結合人類HER3之分離之抗體，其中抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：41之可變輕鏈域VL(VL-D)。
本發明進一步提供一種結合人類HER3之分離之抗體，其中抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：39之可變輕鏈域VL(VL-B)。
本發明進一步提供一種結合人類HER3之分離之抗體，其中抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：42之可變輕鏈域VL(VL-E)。
在一個實施例中，抗體在胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合，該胺基酸序列包含於選自由以下組成之群的 多肽中：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3、SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3、SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3、SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3；亦揭示一種使用在SlyD架構內功能上呈3維取向之HER3(及HER4)之β-髮夾結構(參見例如圖2，及SEQ ID NO：13及17至24之多肽)以獲得此類抗體或其母體抗體的方法。
亦揭示一種選擇抗體、尤其結合人類HER3(且結合人類HER4)之抗體的方法，其中抗體在人類HER3之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內結合；其中a)至少一種選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3、SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3、SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3、SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：1；(及視情況存在之b)至少一種選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4、SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4、SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4及 SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：2；)
用以選擇抗體，其展示結合至少一種a)下之多肽(及視情況存在之至少一種b)下之多肽)
且因此選擇抗體，其在胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內且視情況在胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內結合。
在一個實施例中，此類抗HER3抗體為結合人類HER3(及結合人類HER4)之抗體片段。
在一個實施例中，此類抗HER3抗體為全長IgG1抗體或IgG4抗體。
在一個實施例中，此類抗HER3抗體為Fab片段。
本發明進一步提供一種編碼此類抗HER3抗體之分離之核酸。
本發明進一步提供一種包含此類核酸之宿主細胞。
本發明進一步提供一種產生抗體之方法，其包含培養此類宿主細胞使得抗體產生。
在一個實施例中，此類方法進一步包含自宿主細胞回收抗體。
本發明進一步提供一種包含此類抗-HER3抗體及細胞毒性劑之免疫結合物。
本發明進一步提供一種包含此類抗HER3抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥調配物。
本發明進一步提供本文所述用作藥劑之抗HER3抗體。本發明進一步提本文所述之供抗HER3抗體或包含抗HER3抗體及細胞毒性劑之免疫結合物，其係用於治療癌症。本發明進一步提供本文所述之抗HER3抗體，其係用於抑制HER3/HER2二聚作用。
本發明係關於此類抗HER3抗體或包含抗HER3抗體及細胞毒性劑 之免疫結合物之用途，其係用於製造藥劑中。本發明係關於此類用途，其中藥劑係用於治療癌症。本發明係關於此類用途，其中該藥劑係用於抑制HER3/HER2二聚作用。
本發明進一步提供一種治療患有癌症之個體的方法，其包含向個體投與有效量之本文所述之抗HER3抗體或包含抗HER3抗體及細胞毒性劑之免疫結合物。
本發明進一步提供一種誘發患有癌症之個體之癌細胞細胞凋亡的方法，係包含向個體投與有效量之包含本文所述之抗HER3抗體及細胞毒性劑之免疫結合物，由此誘發個體之癌細胞細胞凋亡。
揭示一種選自由以下組成之群的多肽：i)SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3、ii)SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3、iii)SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3、iv)SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3及v)SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3，該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：1。
揭示一種選自由以下組成之群的多肽：i)SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4、ii)SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4、iii)SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4及iv)SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4，該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：2。
使用在SlyD架構內功能上呈3維取向之HER3(及HER4)之β-髮夾結構(參見例如圖2，及SEQ ID NO：13及17至24之多肽)，可選擇結合此等β-髮夾結構之本文所述之抗HER3抗體。
發現本發明之抗體可具有極有價值之特性，諸如表現HER3之癌 細胞之強生長抑制、涉及癌細胞增殖之HER3介導之信號轉導(諸如HER3磷酸化)之強抑制、或極特定之藥物動力學特性(諸如與不存在海瑞古林相比(「閉合構形」)時，存在海瑞古林下(「打開構形」)結合活化之HER3的締合速率較快且莫耳比較高)。
圖1(a)-(e) 「閉合」及「打開」HER3構形及神經調節蛋白家族配位體(例如海瑞古林，在本文中縮寫為HR)對構形變化之影響之示意性概述。
圖2 在嗜熱棲熱菌之SlyD架構內功能上呈3維取向之HER3之β-髮夾結構的3D結構。
圖3 TtSlyD-FKBP-Her3之Ni-NTA純化之SDS-PAGE分析。E1及E2展示純化部分12及13。SN：純化前之大腸桿菌(E.coli)溶胞物清液層。
圖4 嗜熱棲熱菌SlyD-FKBP-Her-3之Ni-NTA純化部分之SEC溶離特徵。
圖5 所選純系在IHC中之特異性及反應性之測試。所有三個純系均展示結合Her3且對Her4具有交叉反應性。並未偵測到針對Her1及Her2之交叉反應性。
圖6 T47D細胞中M-05-74抗體誘發之時間依賴性HER3內化之FACS分析。
圖7 Biacore感測器圖譜疊加曲線。1：100nM M-05-74*海瑞古林/Her-3 ECD相互作用。2：100nM M-08-11*海瑞古林/Her-3 ECD相互作用。3與4：100nM M-05-74及100nM M-08-11*Her-3 ECD相互作用。5：緩衝劑參比。
圖8 Biacore抗原決定基分級實驗之感測器圖譜疊加。初級抗體M-05-74(圖中之M-074)將Her-3 ECD呈遞給二級抗體M-208、 GT(=8B8)、M-05-74及M-08-11(圖8中之M-011)(M-。量測之雜訊為5RU。
圖9 Biacore感測器圖譜疊加曲線。1：M-05-74上之90nM海瑞古林*Her-3 ECD複合物。2：M-08-11上之90nM海瑞古林*Her-3 ECD複合物。3：8B8抗體上之90nM海瑞古林*Her-3 ECD複合物。
圖10 藉由Biacore功能分析鑑別之示意性作用模式。1：M-08-11結合海瑞古林活化之Her-3 ECD並且誘導延遲之海瑞古林解離，由此M-08-11保留於Her-3 ECD受體複合物中。2：M-05-74結合海瑞古林活化之Her-3 ECD。複合物中捕集獲海瑞古林且抗體保留於複合物中。3：8B8結合海瑞古林活化之Her-3 ECD。整個複合物自抗體解離。
圖11 抗原決定基定位之策略及丙胺酸掃描方法。研究EGFR、Her-2 ECD、Her-3 ECD及Her-4 ECD之肽髮夾結構序列(肽髮夾結構)(包括其結構性嵌入物(結構性))。半胱胺酸經絲胺酸置換。
圖12 HER3及HER4上抗體M-05-74之CelluSpotsTM合成及抗原決定基之抗原決定基定位。抗HER3/HER4抗體M-05-74結合HER3 ECD結合抗原決定基VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)及HER4 ECD結合抗原決定基VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)。
圖13 抗HER3/HER4抗體M-05-74(圖中稱為M-074)及無HER4交叉反應性之抗HER3抗體M-08-11(稱為M-011)之CelluSpotsTM Ala掃描之結果，促使抗HER3/HER4抗體M-05-74最大程度結合其HER3 ECD結合抗原決定基VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)及結合其HER4 ECD結合抗原決定基VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)的胺基酸帶下劃線/為粗體。
圖14 M-05-74(M-074)之結合誘導/有助於HRG結合HER3-ECD。
圖15 MCF7細胞中之HER2/HER3雜二聚體/雜二聚之抑制(免疫沈澱及西方墨點法)(HER3-IP為用HER3抗體免疫沈澱/HER2-IP為用 HER3抗體免疫沈澱)。
圖16 用M-05-74處理MDA-MB175細胞致使細胞增生受抑制。
圖17 用M-05-74(M-074)(10mg/kg，每7天，腹膜內)處理致使腫瘤停滯，一種FaDu HNSCC移植異種移植物。
圖18 用M-05-74-Fab-綠膿桿菌外毒素結合物(M-074-PE)(10mg/kg，每7天，腹膜內)處理致使與不存在HRG下(細線)相比在HRG存在下(粗線)細胞增生受更強的抑制。
圖19 藉由M-05-74-Fab-綠膿桿菌外毒素結合物(M-05-74-PE)產生活體內腫瘤細胞生長抑制。圖例：閉合線(媒劑)；點線(M-05-74-Fab-綠膿桿菌外毒素結合物(M-05-74-PE))。
圖20 Biacore感測器圖譜疊加曲線：與WO2012/22814中所述之抗HER3抗體MOR09823(2)相比，本發明之抗體M-05-74(1)結合TtSlyDcys-Her3(SEQ ID NO：18)。儘管本發明之抗體M-05-74(1)展示與TtSlyDcys-Her3(SEQ ID NO：18)之清晰結合信號，但抗體抗HER3抗體MOR09823(2)展示完全不結合TtSlyDcys-Her3(SEQ ID NO：18)。完全無抗體之對照量測(3)未展示與TtSlyDcys-Her3(SEQ ID NO：18)之任何結合。
圖21 經由核糖體展示選擇最佳人類化M-05-74抗體：在展示選擇期間富集型RNA反轉錄後獲得之PCR產物之分析型DNA晶片電泳。所獲得之凝膠影像展示泳道1中富含所選構築體DNA且在泳道2中陰性對照(無抗原淘選)不富含。如所預期，剩餘對照亦為陰性對照。DNA分解完成(對於靶標為泳道3，對於本底為泳道4)。因此，泳道1中之所有所獲得之DNA均源自淘選步驟中所選之結合變異體及其對應RNA。反轉錄(泳道5)之陰性對照與PCR之陰性對照(泳道6)接不展示色帶。泳道7展示純化後之彙集PCR反應之產物。
I. 定義
出於本文之目的，「接受體人類構架」為包含源自如以下所定義之人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「源自」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10個或10個以下、9個或9個以下、8個或8個以下、7個或7個以下、6個或6個以下、5個或5個以下、4個或4個以下、3個或3個以下、或2個或2個以下。在一些實施例中，VL接受體人類構架序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架在序列上一致。
「親和力成熟」抗體係指相較於在一或多個高變區(HVR)中不具有一或多個變化之親本抗體，在一或多個高變區中具有一或多個變化之抗體，此等變化使抗體對抗原之親和力得到改良。
術語「抗HER3抗體」、「結合(人類)HER3之抗體」及「特異性結合人類HER3之抗體」係指能夠以足夠親和力結合HER3以使得抗體在靶向人類HER3中適用作診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個實施例中，如藉由例如表面電漿子共振分析(例如BIACORE)所量測，抗HER3抗體與不相關非HER3蛋白質(除HER4之外)之結合程度小於抗體與HER3結合之約10%。在某些實施例中，結合人類HER3之抗體之結合人類HER3之結合親和力的KD值1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或小於10-8M，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，本發明之抗體(亦)結合人類HER4且其結合人類HER4之結合親和力之KD值1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或小於10-8M，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至 10-13M)。在一個較佳實施例中，在表面電漿子共振分析中分別對於HER3結合親和力使用人類HER3之野生型細胞外域(ECD)(HER3-ECD)且對於HER4結合親和力使用野生型人類HER4-ECD測定結合親和力之各別KD值。
術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展示所需抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指不同於完整抗體之分子，其包含完整抗體中結合該完整抗體所結合之抗原的部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
與參照抗體「結合至相同抗原決定基之抗體」係指在競爭分析中將參照抗體與其抗原之結合阻斷50%或50%以上之抗體，及反之，參照抗體在競爭分析中將抗體與其抗原之結合阻斷50%或50%以上。 本文提供一種例示性競爭分析。
如本文所使用，術語「癌症」可謂肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌(Stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎臟或尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽道癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、脊膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤、淋巴瘤、淋巴球性白血病，其 包括以上癌中之任一者之難治性形式或以上癌中之一或多者之組合。 在一個較佳實施例中，癌症為乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺癌或前列腺癌。在一個較佳實施例中，此類癌症之特徵進一步在於HER3表現或過度表現。本發明之另一實施例為本發明之抗HER3抗體，其係用於同步治療原發性腫瘤及新穎癌轉移。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種之抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。 存在5個主要抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中數個類別可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
如本文所用，術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、阿德力黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、小紅莓(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他插入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素，包括其片段及/或變異體；以及以下所揭示之各種抗腫瘤或抗癌劑。在一個較佳實施例中，「細胞毒性劑」為綠膿桿菌外毒素A或其變異體。在一個較佳實施例中，「細胞毒性劑」為鵝膏毒素或其變異體。
「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性，其隨抗體同型變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在必需劑量下且持續必需時間有效達成所需治療或防治結果之量。
術語「抗原決定基」意謂能夠特異性結合抗體之任何多肽決定子。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括分子之化學活性表面基團(諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，且在某些實施例中，其可具有特定三維結構特徵及或特定電荷特徵。抗原決定基為由抗體所結合之抗原之區域。
在本文中，術語「Fc區」用以定義含有至少一部分恆定區之免疫球蛋白重鏈之C端區。該術語包括天然序列Fc區及變異型Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，公共衛生服務部(Public Health Service)，美國國立衛生研究院(National Institutes of Health),Bethesda,MD(1991),NIH公開案91-3242中所述。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外的可變域殘基。 可變域之FR通常由4個FR域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，HVR及FR序列一般按以下次序出現在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互 換使用來指結構實質上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且指已引入外源性核酸之細胞，包括此等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及由其獲得之子代而不考慮繼代次數。子代在核酸含量上可能不完全與母細胞相同，而是可能含有突變。本文包括針對原始轉型細胞篩選或選擇具有相同功能或生物活性之突變型子代。
「人類抗體」為胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義特定排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共同構架」為代表所選人類免疫球蛋白VL或VH構架序列中最常出現之胺基酸殘基之構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之亞群。一般而言，序列亞群為如Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Bethesda MD(1991),NIH公開案91-3242，第1-3卷中之亞群。在一個實施例中，對於VL，亞群為如Kabat等人(同上)中之亞群κ I。在一個實施例中，對於VH，亞群為如Kabat等人(同上)中之亞群III。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中全部或實質上全部HVR(例如CDR)均對應於非人類抗體之HVR，且全部或實質上全部FR皆對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指己經歷人類化之抗體。在一個較佳實施例中，將鼠類HVR移 植至人類抗體之構架區中以製備「人類化抗體」。參見例如Riechmann,L.等人，Nature 332(1988)323-327；及Neuberger,M.S.等人，Nature 314(1985)268-270。比對鼠類可變區胺基酸序列與一批人類生殖系抗體V-基因，且根據序列一致性及同源性進行分選。基於高整體序列同源性且視情況亦基於接受體序列中已存在右側典型殘基來選擇接受體序列(參見Poul,M-A.及Lefranc,M-P.,「Ingénierie des anticorps banques combinatores」,Lefranc,M-P及Lefranc,G.編，INSERM出版社，1997)。生殖系V-基因僅編碼達至重鏈之HVR3之開始且直至輕鏈之HVR3之中間的區域。因此，不在完全V-域之上比對生殖系V-基因之基因。人類化構築體包含人類構架1至3、鼠類HVR及輕鏈及重鏈分別源自人類JK4及JH4序列之人類構架4序列。在選擇一個特定接受體序列之前，可確定供體抗體之所謂典型環結構(參見Morea,V.等人，Methods，第20卷，第3期(2000)267-279)。此等典型環結構藉由在所謂典型位置存在之殘基之類型來確定。此等位置位於(部分)HVR區之外部，且在最終構築體中應保持功能相等以保留親本(供體)抗體之HVR構形。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中序列高變(「互補決定區」或「CDR」)及/或形成結構上定義為環(「高變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原觸點」)之各個區域。一般而言，抗體包含六個HVR：三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。在本文中，例示性HVR包括：(a)出現在胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處之高變環(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；(b)出現在胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)處之CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，公共衛生服務部，美國國立衛生研究院，Bethesda,MD(1991))；(c)出現在胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)處之抗原觸點(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；及(d)(a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)及94-102(H3)。
除非另外指示，否則在本文中，根據Kabat等人，同上對可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)進行編號。
「免疫結合物」為與一或多個異源分子，包括(但不限於)細胞毒性劑結合之抗體。
「個體(individual)」或「個體(subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、家兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體為人類。
「分離」之抗體為與自然環境之組分分離之抗體。在一些實施例中，將抗體純化至純度大於95%或99%，如由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於抗體純度評估方法之綜述，參見例如Flatman,S.等人，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。
「分離之」核酸係指已與其天然環境之組分分離之核酸分子。分離之核酸包括如下核酸分子：該核酸分子含於通常含有該核酸分子之細胞中，但該核酸分子存在於染色體外或不同於其天然染色體位置之染色體位置上。
「編碼抗HER3(/HER4抗體)之分離之核酸」係指編碼抗體重鏈及 輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，包括單一載體或單獨載體中之此類核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置處之此類核酸分子。
如本文所使用，術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體之群體獲得之抗體，亦即除可能的變異型抗體(例如含有天然存在之突變或在產生單株抗體製劑期間產生之變異抗體，此等變異體一般以較小量存在)之外，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單個決定子。 因此，修飾語「單株」指示抗體之特性為獲自實質上均質的抗體群體，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製備，該等技術包括(但不限於)融合瘤法、重組DNA法、噬菌體呈現法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法，本文中描述製備單株抗體之此等方法及其他例示性方法。
術語「Mab」係指單株抗體。
「裸抗體」係指未與異源部分(例如細胞毒性部分)或放射性標記結合之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。(如果先前技術具有免疫結合物，則包括其)。
「天然抗體」係指具有不同結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體醣蛋白，由二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，隨後為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕域或輕鏈可變域，隨後為恆定輕(CL)域。抗體輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種， 稱為κ及λ。
術語「藥品說明書」用於指通常包括於治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或警告之信息。
相對於參比多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對參比多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將保守性取代視為序列一致性之一部分之情況下，候選序列中與參比多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。可以此項技術內之多種方式，例如使用公開可得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體，達成比對以測定胺基酸序列一致性百分比。熟習此項技術者可測定比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性百分比值。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech,Inc.創作且原始碼已與使用說明書一起在美國版權局(U.S.Copyright Office)(Washington D.C.,20559)存檔，其中其以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可自Genentech,Inc.(South San Francisco,California)公開獲得，或可由原始碼編譯。ALIGN-2程式應經編譯以供在UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情況下，如下計算既定胺基酸序列A對於、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可稱為既定胺基酸序列A具有或包含某一對於、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%)： 100乘分數X/Y
其中X為利用序列比對程式ALIGN-2對A與B進行程式比對時評為 一致匹配的胺基酸殘基之數目，且其中Y為B中胺基酸殘基的總數。 應瞭解，當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A與B之胺基酸序列一致性%將不等於B與A之胺基酸序列一致性%。除非另外特定說明，否則本文中使用之所有胺基酸序列一致性%值均使用ALIGN-2電腦程式如剛剛前一段落中所述獲得。
術語「醫藥調配物」係指呈某種形式以允許所含活性成分之生物活性有效且不含對該調配物所投與之個體有不可接受之毒性之其他組分的製劑。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外對個體無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
除非另有指示，否則如本文所用，術語「HER3」係指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)之任何天然HER3。該術語涵蓋「全長」未經處理之HER3以及由在該細胞中處理產生之任何形式之HER3。該術語亦涵蓋天然存在之HER3變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。 例示性人類HER3之胺基酸序列以SEQ ID NO：3展示。「人類HER3」(ErbB-3、ERBB3、c-erbB-3、c-erbB3、受體酪胺酸-蛋白質激酶erbB-3，SEQ ID NO：3)編碼受體酪胺酸激酶之表皮生長因子受體(EGFR)家族之成員，其亦包括HER1(亦稱為EGFR)、HER2及HER4(Kraus,M.H.等人，PNAS 86(1989)9193-9197；Plowman,G.D.等人，PNAS 87(1990)4905-4909；Kraus,M.H.等人，PNAS 90(1993)2900-2904)。如同原型表皮生長因子受體，跨膜受體HER3由細胞外配位體結合域(ECD)、ECD內之二聚域、跨膜域、細胞內蛋白質酪胺酸激酶域(TKD)及C端磷酸化域組成。此膜結合蛋白質在細胞外域而非在活性激酶域內具有海瑞古林(HRG)結合域。因此可結合此配位體但並不會 經由蛋白質磷酸化將信號傳輸至細胞中。然而，其會與具有激酶活性之其他HER家庭成員形成雜二聚體。雜二聚致使受體介導之信號傳導路徑發生活化並且其細胞內域發生轉磷酸化。HER家庭成員之間的二聚體形成會擴展HER3的信號傳導潛能，且為一種不僅用於使信號多樣化而且使信號放大的方式。舉例而言，在HER家族成員中HER2/HER3雜二聚體經由PI3K及AKT路徑誘導一種最重要之促進細胞分裂信號(Sliwkowski M.X.等人，J.Biol.Chem.269(1994)14661-14665；Alimandi M等人，Oncogene.10(1995)1813-1821；Hellyer,N.J.,J.Biol.Chem.276(2001)42153-4261；Singer,E.,J.Biol.Chem.276(2001)44266-44274；Schaefer,K.L.,Neoplasia 8(2006)613-622)。對於HER3及其在HER受體家族及NGR配位體家族內之各種相互作用之概述，參見例如G Sithanandam等人Cancer Gene Therapy(2008)15,413-448。
有趣的是，在其平衡狀態下，HER3受體以其「閉合構形」形式存在，其意謂雜二聚HER3 β-髮夾結構基元經由非共價相互作用繫栓至HER3 ECD域IV(參見圖1c)。推測「閉合」HER3構形可經由在特定HER3海瑞古林結合位點配位體海瑞古林之結合而打開。此舉發生於由HER3 ECD域I及域III形成之HER3界面。藉由此相互作用，咸信HER3受體發生活化且轉變為其「打開構形」(參見圖1b且例如Baselga,J.等人，Nat Rev Cancer 9(2009).463-475及Desbois-Mouthon,C.等人，Gastroenterol Clin Biol 34(2010)255-259)。在此打開構形中，可能發生在HER2下雜二聚及轉信號誘導(參見圖1b)。
除非另有指示，否則如本文所用，術語「HER4」係指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)之任何天然HER4。該術語涵蓋「全長」未經處理之HER4以及由在該細胞中處理產生之任何形式之HER4。該術語亦 涵蓋天然存在之HER4變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。 例示性人類HER4之胺基酸序列以SEQ ID NO：5展示。「人類HER4」(亦稱為ErbB-4 ERBB4、v-erb-a有核紅血球白血病病毒致癌基因同源物4、p180erbB4禽有核紅血球白血病病毒(v-erb-b2)致癌基因同源物4；SEQ ID NO：5)為具有多個弗林樣半胱胺酸富域、酪胺酸激酶域、磷脂醯肌醇-3激酶結合位點及PDZ域結合基元的單次I型跨膜蛋白(Plowman G D等人，PNAS 90：1746-50(1993)；Zimonjic D B等人，Oncogene 10：1235-7(1995)；Culouscou J M等人，J.Biol.Chem.268：18407-10(1993))。蛋白質結合神經調節蛋白-2及神經調節蛋白-3、肝素結合EGF樣生長因子及β細胞調節素且藉由其活化。配位體結合誘導多種細胞反應，其包括致有絲分裂及分化。多個蛋白分解事件使得釋放細胞質片段及細胞外片段。此基因中之突變與癌症相關。或者已描述編碼不同蛋白質同功異型物之剪接變異體；然而，並非所有變異體均已完全表徵。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指臨床介入以試圖改變所治療個體之自然病程，且可以為實現預防或在臨床病理學病程中進行。治療之所需作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發，緩解症狀，減輕疾病之任何直接或間接病理性結果，預防癌轉移，減緩疾病進展速率，改善或緩和疾病病況及緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明抗體用於延遲疾病產生或減緩疾病進展。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體結合抗原之域。天然抗體之重鏈及輕鏈的可變域(分別為VH及VL)一般具有類似結構，其中各域包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)。(參見例如Kindt,T.J.等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007)，第91頁)單一VH或VL域可足以賦予抗 原結合特異性。此外，可使用來自結合抗原之抗體的VH或VL域分離結合特定抗原之抗體以分別篩選互補VL或VH域之文庫。參見例如Portolano,S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人，Nature 352(1991)624-628)。
如本文所用，術語「載體」係指一種核酸分子，其能夠傳播其所連接之另一核酸。該術語包括呈自我複製型核酸結構(self-replicating nucleic acid structure)形式之載體以及併入其所引入之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠引導其可操作地連接之核酸之表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。
II. 組合物及方法
在一態樣中，本發明係部分基於使用在SlyD架構內功能上呈3維取向之HER3及HER4之β-髮夾結構(參見例如圖2，及SEQ ID NO：13及17至24之多肽)可以選擇對HER3(及HER4)之β髮夾結構具有特異性之抗體。
在某些實施例中，本發明揭示一種結合人類HER3(且結合人類HER4)之抗體，其中該等抗體結合於人類HER3之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)之內(且結合於人類HER4之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)之內)。
本發明抗體適用於例如診斷或治療癌症。
A. 例示性抗HER3/HER4抗體
本發明提供一種結合人類HER3之分離之抗體，其中抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：41之可變輕鏈域VL(VL-D)、具有胺基酸序列SEQ ID NO：39之可變輕鏈域VL(VL-B)、或具有胺基酸序列SEQ ID NO：42之可變輕鏈域VL(VL-E)。
在一個實施例中，本發明提供一種結合人類HER3之分離之抗體，其中抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：41之可變輕鏈域VL(VL-D)。
在一個實施例中，本發明提供一種結合人類HER3之分離之抗體，其中抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：39之可變輕鏈域VL(VL-B)。
在一個實施例中，本發明提供一種結合人類HER3之分離之抗體，其中抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：42之可變輕鏈域VL(VL-E)。
本發明提供一種結合人類HER3且結合人類HER4之分離之抗體，其中抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：41之可變輕鏈域VL(VL-D)、具有胺基酸序列SEQ ID NO：39之可變輕鏈域VL(VL-B)、或具有胺基酸序列SEQ ID NO：42之可變輕鏈域VL(VL-E)。
在一個實施例中，本發明提供一種結合人類HER3且結合人類HER4之分離之抗體，其中抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：41之可變輕鏈域VL(VL-D)。
在一個實施例中，本發明提供一種結合人類HER3且結合人類HER4之分離之抗體，其中抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：39之可變輕鏈域VL(VL-B)。
在一個實施例中，本發明提供一種結合人類HER3且結合人類HER4之分離之抗體，其中抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：42之可變輕鏈域VL(VL-E)。
在另一態樣中，提供抗HER3抗體，其中該抗體包含與包含以下之抗體具有至少95%序列一致性之重鏈可變結構域(VH)序列，及具有至少95%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL)：其中抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：41之可變輕鏈域VL(VL-D)、具有胺基酸序列SEQ ID NO：39之可變輕鏈域VL(VL-B)、或具有胺基酸序列SEQ ID NO：42之可變輕鏈域VL(VL-E)。
其中抗體具有以下特性中之一或多者：該抗體分別a)結合於包含於選自由以下組成之群的多肽中之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3、SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3、SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3、SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3； b)結合選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3、SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3、SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3、SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3；c)在HER3/HER2共沈澱分析中抑制MCF-7細胞中HER3/HER2雜二聚體之雜二聚作用；d)結合於包含於選自由以下組成之群的多肽中之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4、SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4、SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4；e)結合選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4、SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4、SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4；f)作為單價Fab片段展示與其二價親本全長抗體相比相同或較高之生物活性(當在MCF-7細胞中在HER3磷酸化抑制分析中以等莫耳量比較時)；g)展示活體內腫瘤生長抑制活性；h)以KD值1×10-8M之親和力結合HER3-ECD(在一個實施例中，KD值為1×10-8M至1×10-13M；在一個實施例中，KD值為1×10-9M至1×10-13M)； i)以KD值1×10-8M之親和力結合HER4-ECD(在一個實施例中，KD值為1×10-8M至1×10-13M；在一個實施例中，KD值為1×10-9M至1×10-13M)；j)其中抗體結合由VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)組成之多肽或由VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)組成之多肽；k)其中抗體結合由VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)組成之多肽；及/或l)其中抗體結合由VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)組成之多肽。
在一個較佳實施例中，抗體片段為Fab片段。在一個較佳實施例中，抗體為全長IgG1或IgG4抗體。在一個較佳實施例中，抗體片段(在片段中含有恆定域之情況下)包含人類來源之恆定域(人類恆定域)。在本發明之含義中包含各別人類恆定域之典型人類恆定區具有胺基酸序列SEQ ID NO：53至SEQ ID NO：58(部分包含突變)。
1. 抗體親和力
在某些實施例中，本文所提供之抗體之解離常數KD1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或小於10-8M，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一個較佳實施例中，使用表面電漿子共振分析、使用BIACORE®、在25℃下用固定抗原CM5晶片在約10個反應單位(RU)下量測KD。簡言之，根據供應商說明書，以N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感應器晶片(CM5,BIACORE,Inc.)。用10mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，隨後在5μl/min之流動速率下注射以獲得大約10個反應單位(RU)之偶合蛋白質。在抗原注射後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應之基團。關於動力學量測，在25℃下，以 約25μl/min之流動速率注射於含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)界面活性劑之PBS(PBST)中之Fab兩倍連續稀釋液(0.78nM至500nM)。使用簡單的一比一朗格繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model)(BIAcore®評估軟體3.2版)藉由同時擬合締合及解離感測圖譜來計算締合速率(kon或ka)及解離速率(koff或kd)。平衡解離常數KD計算為比率kd/ka(koff/kon)。參見例如Chen,Y.等人，J.Mol.Biol.293(1999)865-881。若藉由上文的表面電漿子共振分析測定之締合速率超過106M-1 s-1，則締合速率可使用螢光淬滅技術量測，該技術在如光譜儀(諸如具有攪拌式光析槽之止流裝備型分光光度計(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測之濃度增加之抗原存在下、在25℃下量測PBS中之20nM抗-抗原抗體(Fab形式)(pH 7.2)之螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)之增加或減少。
2. 抗體片段
在某些實施例中，本文提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv及scFv片段及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134。關於scFv片段之綜述，參見例如Plueckthun,A.,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore(編)，Springer-Verlag,New York(1994)，第269-315頁；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基及具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的討論，參見美國專利第5,869,046號。
雙功能抗體為具有2個抗原結合位點之可具有二價或雙特異性的抗體片段。參見例如EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134；及Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 90(1993)6444-6448。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(20039129-134)中。
單域抗體為包含抗體之全部或部分重鏈可變域或全部或部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。
抗體片段可藉由各種技術製備，包括(但不限於)完整抗體之蛋白水解消化，以及如本文所述由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產生。
在一個較佳實施例中，抗體片段為Fab片段。在一個較佳實施例中，抗體片段(在片段中含有恆定域之情況下)包含人類來源之恆定域(人類恆定域)。
3. 嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號；及Morrison,S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類已自親本抗體之類別或子類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體為人類化抗體。通常，對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)來源於非人類抗體，且FR(或其部分)來源於人類抗體序列。在一較佳實施例中，人類化抗體視情況亦包含人類恆定區之至少一部分。在一些具體實例中，人類化抗體中之一些 FR殘基經來自非人類抗體(例如HVR殘基所來源之抗體)之相應殘基取代以例如恢復或提高抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro,J.C.及Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，且進一步描述於例如Riechmann,I.等人，Nature 332(1988)323-329；Queen,C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri,S.V.等人，Methods 36(2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述「表面重塑」)；Dall'Acqua,W.F.等人，Methods 36(2005)43-60(描述「FR該組」)；及Osbourn,J.等人，Methods 36(2005)61-68及Klimka,A.等人，Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述FR改組之「引導選擇」方法)。Morea,V.，等人，Methods，第20卷，第3期(2000)267-279)及WO2004/006955(經由典型結構之方法)。
4. 人類抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為人類抗體。可使用此項技術中已知之各種技術產生人類抗體。人類抗體一般描述於van Dijk,M.A.及van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374及Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中。
人類抗體可藉由向轉殖基因動物投與免疫原來製備，該轉殖基因動物已經修飾以回應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體。此類動物通常含有置換內源性免疫球蛋白基因座或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中之全部或部分人類免疫球蛋白基因座。在此類轉殖基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常被不活化。關於自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,N.,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125。亦參見美國專利第 6,075,181號及第6,150,584號，其描述XENOMOUSETM技術；美國專利第5,770,429號，其描述HuMab®技術；美國專利第7,041,870號，其描述K-M MOUSE®技術，及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其描述VelociMouse®技術。來自由此類動物所產生之完整抗體之人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合來進一步修飾。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞株。(參見例如Kozbor,D.,J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur,B.R.等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987)，第51-63頁；及Boerner,P.等人，J.Immunol.147(1991)86-95)經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li,J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)3557-3562中。其他方法包括描述於例如美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni,J.,Xiandai Mianyixue 26(2006)265-268(描述人類-人類融合瘤)中之彼等方法。人類融合瘤技術(三源雜交瘤技術)亦描述於Vollmers,H.P.及Brandlein,S.,Histology and Histopathology 20(2005)927-937及Vollmers,H.P.及Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(2005)185-191中。
人類抗體亦可藉由分離自人類來源噬菌體呈現文庫選擇之Fv純系可變域序列產生。此類可變域序列可接著與所需人類恆定域組合。下文描述自抗體文庫選擇人類抗體之技術。
5. 源於文庫之抗體
本發明抗體可藉由篩檢組合文庫中具有所需活性之抗體來分離。舉例而言，此項技術中已知多種方法可用於產生噬菌體呈現文庫及篩選此等文庫中具有所需結合特徵之抗體。此類方法綜述於例如 Hoogenboom,H.R.等人，Methods in Molecular Biology 178(2001)1-37中，且進一步描述於例如McCafferty,J.等人，Nature 348(1990)552-554；Clackson,T.等人，Nature 352(1991)624-628；Marks,J.D.等人，J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.及Bradbury,A.,Methods in Molecular Biology 248(2003)161-175；Sidhu,S.S.等人，J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.等人，J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467-12472；及Lee,C.V.等人，J.Immunol.Methods 284(2004)119-132中。
在某些噬菌體呈現方法中，VH及VL基因之譜系分別藉由聚合酶鏈式反應(PCR)選殖及在噬菌體文庫中隨機重組，接著可篩檢抗原結合噬菌體，如Winter,G.等人，Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455中所述。噬菌體通常以單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。來自免疫接種來源之文庫提供抗免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可將原始譜系純系化(例如自人類)以提供抗各種非自體抗原以及自體抗原之抗體之單一來源而無需任何免疫接種，如Griffiths,A.D.等人，EMBO J.12(1993)725-734所述。最後，亦可藉由自幹細胞選殖未重排之V基因區段且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高可變CDR3區且完成活體外重排來合成製造原始文庫，如Hoogenboom,H.R.及Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388所述。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中視為人類抗體或人類抗體片段。
6. 多特異性抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者是針對HER3/HER4且另一者是針對任何其他抗原。雙特異性抗體亦可用於使細胞毒素劑定位於表現HER3或HER4之細胞上。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段。
用於製造多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共同表現具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein,C.及Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540,WO 93/08829，及Traunecker,A.等人，EMBO J.10(1991)3655-3659)及「杵臼結構(knob-in-hole)」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下來製造：製造抗體Fc-雜二聚分子之工程改造靜電轉向效應(WO 2009/089004)；交聯兩種或兩種以上抗體或片段(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan,M.等人，Science 229(1985)81-83)；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny,S.A.等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用製造雙特異性抗體片段之「雙功能抗體」技術(參見例如Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber,M等人，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；及如例如Tutt,A.等人J.Immunol.147(1991)60-69中所述製備三特異性抗體。
本文中亦包括具有三個或三個以上功能性抗原結合位點之工程改造抗體，包括「章魚抗體」(參見例如US 2006/0025576)。
本文之抗體或片段亦包括包含結合HER3以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙作用Fab」或「DAF」(參見例如US 2008/0069820)。
本文之抗體或片段亦包括WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792及WO 2010/145793中所描述之多特異性抗體。
7. 抗體變異體
在某些實施例中，涵蓋本文提供之抗體之胺基酸序列變異體。舉例而言，可需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物學特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成進行製備。此類修飾包括例如在抗體之胺基酸序列內進行殘基之缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合。
a)取代、插入及缺失變異體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於取代突變誘發之相關位點包括HVR及FR。保守性取代以標題「較佳取代」示於表1中。更實質性變化以標題「例示性取代」提供於表1中且如下文關於胺基酸側鏈類別所進一步描述。胺基酸取代可引入至相關抗體中且篩檢具有所需活性，例如保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC的產物。
胺基酸可根據共有側鏈特性進行分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將需要將此等類別中之一者中之一員換成另一類別的。
一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體(例如人化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體將在某些生物特定方面具有修改(例如改良)(例如增加之親和力、降低之免疫原性)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物性質。一種例示性取代變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所述之技術)方便地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且在噬菌體上呈現變異型抗體並篩檢具有特定生物活性(例如結合親和力)之變異型抗體。
可在HVR中進行改變(例如取代)例如以改良抗體親和力。此類改變可在HVR「熱點」，亦即藉由密碼子編碼之殘基中，該等殘基在體 細胞成熟過程中經歷高頻突變(參見例如Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)，及/或SDR(a-CDR)中進行，測試所得變異型VH或VL之結合親和力。藉由構築及自二級文庫再選擇之親和力成熟已描述於例如Hoogenboom,H.R.等人Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之突變誘發)中之任一者將多樣性引入至所選用於成熟之可變基因中。接著產生二級文庫。 接著篩檢文庫以鑑別具有所需親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導方法，其中使若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。參與抗原結合之HVR殘基可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來逐一鑑別。尤其常以CDR-H3及CDR-L3為目標。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守性改變(例如如本文所提供之保守性取代)。此等改變可在HVR「熱點」或SDR之外部。在以上提供之變異型VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
一種適用於鑑別可經靶向以用於突變誘發之抗體之殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如由Cunningham,B.C.及Wells,J.A.,science 244(1989)1081-1085所描述。在此方法中，鑑別出一個殘基或一組標靶殘基(例如帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且將其置換為中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)以判定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置引入其他取代。或者或另外，利用抗原-抗體複合物之晶體結構來鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之目標或排除在取代候選物之外。可篩檢變異體以確 定其是否含有所要特性。
胺基酸序列插入物包括長度為一個殘基至含有一百個或大於一百個多殘基之多肽之胺基及/或羧基未端融合體，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入物。末端插入物之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N末端或C末端與酶(例如對於ADEPT而言)或增加抗體之血清半衰期之多肽的融合體。
b)糖基化變異體
在某些實施例中，對本文提供之抗體進行改變以增加或減小抗體糖基化之程度。在抗體上添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來方便地達成。
在抗體包含Fc區之情況下，可改變附著於其上之醣。哺乳動物細胞所產生之原生抗體通常包含一般經N鍵聯與Fc區之CH2域之Asn297連接的分支雙觸寡醣。參見例如Wright,A.及Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的海藻糖。在一些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以便形成具有某些改良特性之抗體變異體。
在一個實施例中，提供具有缺乏與Fc區連接(直接或間接)之海藻糖之碳水化合物結構的抗體變異體。舉例而言，此類抗體中海藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。如例如WO 2008/077546中所述，藉由相對於與Asn 297連接之所有醣結構(例如複合、雜交及高甘露糖結構)之總和計算Asn297處糖鏈內海藻糖的平均量來測定海藻糖之量，如藉由MALDI-TOF質譜所量測。Asn297係指 大致位於Fc區中位置297(Fc區殘基之Eu編號)處之天冬醯胺殘基；然而，歸因於抗體中之微小序列變化，Asn297亦可位於位置297之上游或下游約±3個胺基酸處，亦即介於位置294與300之間。此類海藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如US 2003/0157108；US 2004/0093621。關於「去海藻糖基化」或「缺乏海藻糖」抗體變異體之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki,A.等人，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能夠產生去海藻糖基化抗體之細胞株之實例包括缺乏蛋白質海藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka,J.等人，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；及WO 2004/056312，尤其在實例11處)，及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki,N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；及WO 2003/085107)。
進一步提供具有平分型寡醣之抗體變異體，例如，其中連接至抗體Fc區之雙觸寡醣係由GlcNAc平分。此類抗體變異體具有經減低之海藻糖基化及/或經改良之ADCC功能。此類抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878；美國專利第6,602,684號；及US 2005/0123546中。亦提供寡醣中之至少一個半乳糖殘基與Fc區連接之抗體變異體。此類抗體變異體具有經改良之CDC功能。此類抗體變異體描述於例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；及WO 1999/22764 中。
c)Fc區變異體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入至本文提供之抗體之Fc區中，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非所有效應功能之抗體變異體，由此使得該抗體成為合乎應用需要之候選物，在該等應用中，活體內抗體半衰期較重要，而某些效應功能(諸如補體及ADCC)為不必要或有害的。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/減損。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析，以確保抗體缺乏FcγR結合能力(從而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII，然而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概述於Ravetch,J.V.及Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492之第464頁之表3中。評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例描述於以下中：美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom,I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；及Hellstrom,I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；美國專利第5,821,337號(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。或者，可使用非放射性分析方法(參見例如流動式細胞測量術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。用於此類分析之適用效應細胞包括周圍血液單核細胞(PBMC)及自然殺滅(NK)細胞。或者或另外，可例如在動物模型中活體內評估所關注之分子之ADCC活性，諸如 Clynes,R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中所揭示。亦可進行C1q結合分析以確認抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro,H.等人，J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人，Blood 101(2003)1045-1052；及Cragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743)。亦可使用此項技術中已知之方法測定FcRn結合及活體內清除率/半衰期(參加例如Petkova,S.B.等人，Int.Immunol.18(2006：1759-1769)。
效應功能降低之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代的抗體(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或兩者以上處具有取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代成丙胺酸之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
與FcR之結合得到改良或減弱之某些抗體變異體已有描述。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312及Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在某些實施例中，抗體變異體包含具有改良ADCC之一或多個胺基酸取代，例如Fc區之位置298、333及/或334(殘基之EU編號)處之取代的Fc區。
在一些實施例中，在Fc區中進行改變，其致使C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即改良或降低)，例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述。
半衰期增加且與負責母本IgGs傳遞至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn)之結合改良之抗體(Guyer,R.L.等人，J.Immunol.117(1976)587-593， 及Kim,J.K.等人，J.Immunol.24(1994)2429-2434)描述於US 2005/0014934。彼等抗體包含具有一或多個取代之Fc區，在其中Fc區與FcRn之結合得以改良。此類Fc變異體包括在以下Fc區殘基中之一或多者處具有取代之彼等變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如取代Fc區殘基434(美國專利第7,371,826號)。
關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan,A.R.及Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351。
d)半胱胺酸工程改造抗體變異體
在某些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程改造抗體，例如「硫基MAb(thioMAb)」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基在抗體之可達位點處出現。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基藉此定位於抗體之可達位點且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生如本文中進一步描述之免疫結合物。在某些實施例中，任一或多個以下殘基可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。半胱胺酸工程改造抗體可如例如美國專利第7,521,541號中所述來產生。
e)抗體衍生物
在某些實施例中，可將本文中所提供之抗體進一步修飾以含有此項技術中已知且可易於獲得之其他非蛋白質部分。適於抗體衍生化之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚 -1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可於製造時具有優點。聚合物可具有任何分子量，且可具支鏈或不具支鏈。與抗體連接之聚合物的數目可變化，且若連接一個以上聚合物，則聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生作用之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良抗體之特殊特性或功能，抗體衍生物是否將用於指定條件下之療法等考慮來確定。
在另一實施例中，提供抗體與可藉由暴露於輻射選擇性地加熱之非蛋白質部分之結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam,N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)不損害普通細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死抗體-非蛋白質部分近側之細胞之溫度的波長。
B. 重組方法及組合物
可使用例如如美國專利第4,816,567號中所描述之重組方法及組合物產生抗體。在一個實施例中，提供編碼本文所述之抗HER3(及抗HER4)抗體之分離之核酸。此類核酸可編碼包含VL之胺基酸序列及/或包含抗體之VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供一或多種包含此類核酸之載體(例如表現載體)。在另一實施例中，提供包含此類核酸之宿主細胞。在一個此類實施例中，宿主細胞包含(例如已經以下轉型)：(1)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的載體，或(2)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列之核酸的第一載體，及包含編碼包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞為真核 細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供製得抗HER3/HER4抗體之方法，其中該方法包含在適合於表現抗體之條件下培養如上文所提供之包含編碼抗體之核酸的宿主細胞且視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
對於重組產生抗HER3(及抗HER4)抗體，分離例如如上所述之編碼抗體之核酸並且將其插入至一或多種載體中以進一步進行選殖及/或表現於宿主細胞中。此類核酸可易於使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)分離及定序。
適於選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可於細菌中產生，特定言之在不需要糖基化及Fc效應功能時。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見例如US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523。(亦參見Charlton,K.A.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(編)，Humana Press,Totowa,NJ(2003)，第245-254頁，描述大腸桿菌中抗體片段之表現。)在表現之後，抗體可以可溶性溶離份自細菌細胞糊狀物分離且可進一步進行純化。
除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適用於編碼抗體之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而使得所產生之抗體具有部分或完全人類糖基化型態的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；及Li,H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
適用於表現糖基化抗體之宿主細胞亦可自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)獲得。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出眾多可與昆蟲細胞聯合使用，特定言之用於轉染草地黏 蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。
植物細胞培養物亦可用作宿主。參加例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。有用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為藉由SV40轉型之獼猴腎臟CV1細胞株(COS-7)；人胚腎細胞株(293或293細胞，如例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠睾丸支持細胞(TM4細胞，如例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所述)；獼猴腎臟細胞(CV1)；非洲綠獼猴腎臟細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌瘤細胞(HELA)；犬腎臟細胞(MDCK)；布法羅大鼠肝臟細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝臟細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如例如Mather,J.P.等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適用於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，參見例如Yazaki,P.及Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(編)，Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268頁。
C. 分析
可藉由此項技術中已知之各種分析對本文中所提供之抗HER3(及抗HER4)抗體進行針對其物理/化學特性及/或生物活性之鑑別、篩選或表徵。
揭示一種選擇結合人類HER3(且結合人類HER4)之抗體的方法， 其中該等抗體結合於人類HER3之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內(且結合於人類HER4之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內)；其中a)至少一種選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3、SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3、SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3、SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：1；及b)至少一種選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4、SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4、SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：2；用以(在結合分析中)選擇抗體，其展示結合兩者，至少一種a)下之多肽及至少一種b)下之多肽
且因此選擇結合於胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)(屬於人類HER3內)內(且結合於胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)(屬於人類HER4內))內之抗體。
在一個實施例中，選擇方法進一步包含在選自由以下組成之群的多肽(對與多肽之結合進行測試)下計數器篩檢所選抗體之步驟：SEQ ID NO：14 TtSlyD-野生型
SEQ ID NO：15 TtSlyDcas
SEQ ID NO：16 TgSlyD△IF
以確定所選抗體並未結合不包含胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)或胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)之多肽架構。
1. 結合分析及其他分析
在一態樣中，例如藉由已知方法(諸如ELISA、西方墨點法，包括表面電漿子共振(例如BIACORE)等)測試本發明抗體之抗原結合活性。
在另一態樣中，可使用競爭分析以鑑別與M-05-74競爭結合至HER3及/或HER4之抗體。在某些實施例中，此類競爭性抗體結合M-05-74所結合之相同抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。用於定位抗體所結合之抗原決定基之詳細例示性方法提供於Morris,G.E.(編)，Epitope Mapping Protocols,Methods in Molecular Biology，第66卷，Humana Press,Totowa,NJ(1996)中。其他方法詳細描述於使用CelluSpotTM技術之實例4中。
在例示性競爭分析中，在溶液中培育固定HER3或HER4，該溶液包含分別結合HER3或HER4之第一標記抗體(例如M-05-74)及測試與第一抗體競爭結合至HER3或HER4之能力的第二未標記抗體。第二抗體可存在於融合瘤清液層中。作為對照，在包含第一標記抗體但無第二未標記抗體之溶液中培育固定HER3或HER4。在允許第一抗體結合HER3或HER4之條件下培育之後，移除過量未結合抗體，且量測與固定HER3或HER4相關之標記之量。若測試樣品中與固定HER3或HER4相關之標記之量相對於對照樣品中實質上降低，則表明第二抗體與第一抗體競爭結合至HER3或HER4。參見Harlow,E.及Lane,D.,Antibodies：A Laboratory Manual，第14章，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1988)。
2. 活性分析法
在一態樣中，提供用於鑑別具有生物活性之抗HER3抗體的分析。生物活性可包括例如抑制HER3磷酸化、抑制表現或過度表現HER3及/或HER4之癌細胞之癌細胞增殖、抑制HER3/HER2雜二聚、經由FACS分析之(時間依賴性)內化、具有表現或過度表現異種移植HER3及/或HER4之癌細胞的異種移植動物(例如小鼠或大鼠)模型中之活體內腫瘤生長抑制。亦提供在活體內及/或活體外具有此類生物活性之抗體。
在某些實施例中，測試本發明抗體之此類生物活性。特定生物活性之例示性活體外或活體內分析描述於實例2e、3、5至9及11中。
D. 免疫結合物
本發明亦提供免疫結合物，其包含本文所述之結合一或多種細胞毒性劑之抗HER3/HER4抗體，該等細胞毒性劑諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之蛋白質毒素、酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一個實施例中，免疫結合物為抗體-藥物結合物(ADC)，其中抗體結合於一或多種藥物，包括(但不限於)類美登素(maytansinoid)(參見US 5,208,020、US 5,416,064及EP 0 425 235 B1)；奧瑞他汀(auristatin)，諸如單甲基奧瑞他汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參見US 5,635,483、US 5,780,588及US 7,498,298)；海兔毒素(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見US 5,712,374、US 5,714,586、US 5,739,116、US 5,767,285、US 5,770,701、US 5,770,710、US 5,773,001及US 5,877,296；Hinman,L.M.等人，Cancer Res.53(1993)3336-3342；及Lode,H.N.等人，Cancer Res.58(1998)2925-2928)；蒽環黴素(anthracycline)，諸如道諾黴素或 小紅莓(參見Kratz,F.等人，Curr.Med.Chem.13(2006)477-523；Jeffrey,S.C.等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)358-362；Torgov,M.Y.等人，Bioconjug.Chem.16(2005)717-721；Nagy,A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834；Dubowchik,G.M.等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12(2002)1529-1532；King,H.D.等人，J.Med.Chem.45(200294336-4343；及美國專利第6,630,579號)；甲胺喋呤；長春地辛；紫杉烷，諸如多烯紫杉醇、太平洋紫杉醇、拉洛他賽(larotaxel)、替司他賽(tesetaxel)及奧他賽(ortataxel)；單端孢黴烯族毒素；以及CC1065。
在另一實施例中，免疫結合物包含如本文所述之抗體與酶促活性毒素或其片段結合，該等毒素包括(但不限於)白喉(diphtheria)A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素(exotoxin)A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素(ricin)A鏈、相思子毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。
在另一實施例中，免疫結合物包含結合至綠膿桿菌外毒素A或其變異體之如本文所述之抗體。綠膿桿菌外毒素A或其變異體描述於例如WO2011/32022、WO2009/32954、WO2007/031741、WO2007/016150、WO2005/052006及Liu W等人，PNAS 109(2012)11782-11787中。
在另一實施例中，免疫結合物包含如本文所述之抗體與放射性 原子結合以形成放射性結合物。多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當放射性結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如TC99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱磁共振成像，MRI)之自旋標記物，又諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體及細胞毒性劑之結合物可如下製備：a)使用重組表現技術(例如例如在大腸桿菌中表現與Fab或Fv抗體片段稠合之毒素基胺基酸序列)或b)使用多肽偶合技術(如分選酶，基於毒素基胺基酸序列與Fab或Fv抗體片段之偶合)或c)使用多種雙功能蛋白質偶合劑，諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺基酯之雙功能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta,E.S.等人，Science 238(1987)1098-1104中所述製備。經碳14標記之1-異硫氰氧基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為使放射性核苷酸結合至抗體之例示性螯合劑。參見WO 94/11026。連接子可以為有助於細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接體」。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含有二硫鍵之連接子(Chari,R.V.等人，Cancer Res.52(1992)127-131；美國專利第No.5,208,020號)。
本文之免疫結合物或ADC明確涵蓋(但不限於)用以下可購得(例如自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A購得)之交聯試劑製備的此類結合物，該等交聯試劑包括(但不限於)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB、及SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)。
E. 用於診斷及偵測之方法及組合物
在某些實施例中，本文提供之抗HER3(及抗HER4)抗體中的任一者適用於分別偵測生物樣品中HER3及/或HER4之存在。如本文所用之術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織，諸如腫瘤組織。
在一個實施例中，提供一種用於診斷或偵測方法之抗HER3(及抗HER4)抗體。在另一態樣中，提供一種分別偵測生物樣品中HER3或HER4存在之方法。在某些實施例中，該方法包含在允許抗HER3/HER4抗體分別結合HER3或HER4之條件下使生物樣品與如本文所述之抗HER3(及抗HER4)抗體接觸，且偵測是否分別在抗HER3(及抗HER4)抗體與HER3或HER4之間形成複合物。此類方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，抗HER3(及抗HER4)抗體用於選擇符合抗HER3/HER4抗體療法之個體，例如其中HER3及HER4分別為選擇患者之生物標記。
可使用本發明抗體診斷之例示性病症包括癌症。
在某些實施例中，提供經標記之抗HER3(及抗HER4)抗體。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光及放射性標記)，以及例如經由酶促反應或分子相互作用間接偵測之部分(諸如酶或配位體)。例示性標記包括(但不限於)放射性 同位素32P、14C、125I、3H及131I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；若丹明及其衍生物；丹醯基；傘酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號)；螢光素；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與使用過氧化氫氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基及其類似物。
F. 醫藥調配物
如本文所述之抗HER3(及抗HER4)抗體之醫藥調配物係藉由將具有所需純度之此類抗體與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.(編)(1980))，以凍乾調配物或水溶液形式來製備。醫藥學上可接受之載劑在所採用之劑量及濃度下一般對接受者無毒性，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚(乙烯吡咯啶酮)；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇 (PEG)。本文中之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rhuPH20(HYLENEX®,Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP及使用方法(包括rhuPH20)描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一態樣中，sHASEGP與一或多個其他葡萄糖胺聚糖(諸如硫酸軟骨素酶)組合。
例示性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。抗體調配物水溶液包括美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中所述之彼等抗體調配物水溶液，WO2006/044908中所述之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
視所治療之特定適應症所之需要，在本文中，調配物亦可含有一種以上活性成分。
可例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成分可包覆於所製備之微囊中，例如分別在膠狀藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米囊劑)中或於巨乳液中之羥甲基纖維素或明膠微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含有抗體之固體疏水聚合物之半滲透性基質，該等基質呈成形物品(例如薄膜或微囊)之形式。
欲用於活體內投藥之調配物通常無菌。無菌性可易於例如藉由經由無菌過濾膜過濾來達成。
G. 治療方法及組合物
本文提供之抗HER3(及抗HER4)抗體或結合至細胞毒性劑之抗HER3/HER4抗體之免疫結合物中的任一者可用於治療方法中。
在一態樣中，提供抗HER3/HER4抗體或抗HER3/HER4抗體結合至細胞毒性劑之免疫結合物用作藥劑。在其他態樣中，提供用於治療癌症之抗HER3(及抗HER4)抗體或抗HER3(及抗HER4)抗體結合至細胞毒性劑之免疫結合物。在某些實施例中，提供用於治療方法之抗HER3(及抗HER4)抗體或抗HER3(及抗HER4)抗體結合至細胞毒性劑之免疫結合物。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有癌症之個體方法之抗HER3/HER4抗體或抗HER3(及抗HER4)抗體結合至細胞毒性劑之免疫結合物，該方法包含向個體投與有效量之抗HER3/HER4抗體或抗HER3(及抗HER4)抗體結合至細胞毒性劑之免疫結合物。在其他實施例中，本發明提供抗HER3/HER4抗體或抗HER3(及抗HER4)抗體結合至細胞毒性劑之免疫結合物，其係用於誘發癌細胞中之細胞凋亡/或抑制癌細胞增殖。在某些實施例中，本發明提供一種抗HER3(及抗HER4)抗體或抗HER3(及抗HER4)抗體結合至細胞毒性劑之免疫結合物，其係用於誘發個體中癌細胞中之細胞凋亡/或抑制癌細胞增殖之方法，該方法包含向個體投與有效之抗HER3(及抗HER4)抗體或抗HER3(及抗HER4)抗體結合至細胞毒性劑之免疫結合物以誘發癌細胞中之細胞凋亡/或抑制癌細胞增殖。根據以上實施例中之任一者之「個體」較佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供抗HER3(及抗HER4)抗體或抗HER3(及抗HER4)抗體結合至細胞毒性劑之免疫結合物之用途，其係用於製造或製備藥劑。在一個實施例中，藥劑用於治療癌症。在另一實施例中，藥劑用於治療癌症之方法中，該方法包含向患有癌症之個體投與有效量之藥劑。在另一實施例中，藥劑用於誘發癌細胞中之細胞凋亡/或抑制癌細胞增殖。在另一實施例中，藥劑用於誘發患有癌症之個體中癌細胞中之細胞凋亡/或抑制癌細胞增殖之方法中，該方法包含向個體投與有效量之藥劑以誘發癌細胞中之細胞凋亡/或抑制 癌細胞增殖。根據以上實施例中之任一者之「個體」可為人類。
在另一態樣中，本發明提供用於治療癌症之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有癌症之個體投與有效量之抗HER3(及抗HER4)抗體。根據以上實施例中之任一者之「個體」可為人類。
在另一態樣中，本發明提供一種誘發癌細胞中之細胞凋亡/或抑制患有癌症之個體中之癌細胞增殖之方法。在一個實施例中，該方法包含向個體投與有效量之抗HER3/HER4抗體或抗HER3/HER4抗體結合至細胞毒性化合物之免疫結合物以誘發癌細胞中之細胞凋亡/或抑制患有癌症之個體中之癌細胞增殖。在一個實施例中，「個體」為人類。
在另一態樣中，本發明提供包含本文提供之抗HER3(及抗HER4)抗體中之任一者之醫藥調配物，其係例如用於任何以上治療方法。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文中提供之抗HER3(及抗HER4)抗體中之任一者及醫藥學上可接受之載劑。
本發明抗體(及任何其他治療劑)可藉由任何適合方式投與，該等方式包括非經腸、肺內及鼻內投藥，且必要時對於局部治療，包括病灶內投藥。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。部分視投藥之短期或長期性而定，可藉由任何適合途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或經各個時間點多次投藥、快速投藥及脈衝式輸注。
本發明抗體將以與良好醫療實務一致之方式調配、給藥及投與。在此情形中考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑傳遞部位、投藥方法、投藥時程及醫學從業者已知的其他因素。抗體無需但視情況可與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。此類其他藥 劑之有效量視存在於調配物中之抗體之量、病症或治療之類型及如上文所述之其他因素而定。此等藥劑一般以相同劑量且用如本文所述之投藥途徑使用，或以本文所述之劑量之約1%至99%使用，或以任何劑量且憑經驗/臨床上確定為適當之任何途徑使用。
為預防或治療疾病，本發明抗體之適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視待治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重度及病程、是否出於預防或治療目的投與抗體、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應及主治醫師之判斷而定。抗體適於一次性或經一系列治療投與至患者。無論例如藉由一或多次分開投藥，或藉由連續輸注，視疾病類型及嚴重程度而定，抗體投與患者的初始候選劑量為約1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)。一種典型日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或大於100mg/kg之範圍內，此視上文所提及之因素而定。對於歷經數天或更長時間的重複投藥，治療視病狀而定通常可持續至疾病症狀之所要抑制發生為止。抗體之一種例示性劑量在約0.05mg/kg至約10mg/kg之範圍內。因此，可將約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg之一或多個劑量(或其任何組合)投與患者。此類劑量可間歇地投與，例如隔週或隔三週(例如以使得患者接受約二至約二十或例如約六個劑量的抗體)。可投與最初較高負荷劑量，隨後可投與一或多個較低劑量。例示性給藥方案包含投與約4mg/kg之初始負荷劑量之抗體，隨後投與約2mg/kg之每週維持劑量之抗體。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術及分析監控。
應瞭解，代替或除抗HER3(及抗HER4)抗體以外，可使用本發明免疫結合物進行以上調配或治療方法中之任一者。
III. 製品
在本發明之另一態樣中，提供一種含有適用於治療、預防及/或 診斷上文所述病症之物質的製品。製品包含容器及容器上或容器隨附之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、靜脈內溶液袋等。該等容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納單獨組合物或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體。標記或內頁說明書係指示該組合物用於治療所選病狀。此外，該製品可包含(a)內含組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體；及(b)內含組合物之第二容器，其中該組合物包含另一種細胞毒性劑或治療劑。本發明之此實施例中之製品可另外包含內頁說明書，該內頁說明書指示組合物可用於治療特定病狀。或者或另外，該製品可進一步包含包含醫藥學上可接受之緩衝劑(諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及葡萄糖溶液)之第二(或第三)容器。其可另外包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
應瞭解，代替或除抗HER3(及抗HER4)抗體以外，以上製品中之任一者均可包括本發明之免疫結合物。
胺基酸序列之描述
SEQ ID NO：1 人類HER3之β-髮夾結構
SEQ ID NO：2 人類HER4之β-髮夾結構
SEQ ID NO：3 人類HER3
SEQ ID NO：4 人類HER3細胞外域(ECD)
SEQ ID NO：5 人類HER4
SEQ ID NO：6 人類HER4細胞外域(ECD)
SEQ ID NO：7 人類HER1
SEQ ID NO：8 人類HER1細胞外域(ECD)
SEQ ID NO：9 人類HER2
SEQ ID NO：10 人類HER2細胞外域(ECD)
SEQ ID NO：11 人類海瑞古林片段(HRG)
SEQ ID NO：12 人類海瑞古林β-1片段(如Preprotech所提供)
SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3
SEQ ID NO：14 TtSlyD-野生型
SEQ ID NO：15 TtSlyDcas
SEQ ID NO：16 TgSlyD△IF
SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3
SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3
SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3
SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3
SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4
SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4
SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4
SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4
SEQ ID NO：25 重鏈HVR-H1，M-05-74
SEQ ID NO：26 重鏈HVR-H2，M-05-74
SEQ ID NO：27 重鏈HVR-H3，M-05-74
SEQ ID NO：28 輕鏈HVR-L1，M-05-74
SEQ ID NO：29 輕鏈HVR-L2，M-05-74
SEQ ID NO：30 輕鏈HVR-L3，M-05-74
SEQ ID NO：31 重鏈可變域VH，M-05-74
SEQ ID NO：32 輕鏈可變域VL，M-05-74
SEQ ID NO：33 M-05-74之重鏈可變結構域VH之人類化變異 體A(VH-A)
SEQ ID NO：34 M-05-74之重鏈可變結構域VH之人類化變異體B(VH-B)
SEQ ID NO：35 M-05-74之重鏈可變結構域VH之人類化變異體C(VH-C)
SEQ ID NO：36 M-05-74之重鏈可變結構域VH之人類化變異體D(VH-D)
SEQ ID NO：37 M-05-74之重鏈可變結構域VH之人類化變異體E(VH-E)
SEQ ID NO：38 M-05-74之輕鏈可變結構域VL之人類化變異體A(VL-A)
SEQ ID NO：39 M-05-74之輕鏈可變結構域VL之人類化變異體B(VL-B)
SEQ ID NO：40 M-05-74之輕鏈可變結構域VL之人類化變異體C(VL-C)
SEQ ID NO：41 M-05-74之輕鏈可變結構域VL之人類化變異體D(VL-D)
SEQ ID NO：42 M-05-74之輕鏈可變結構域VL之人類化變異體E(VL-E)
SEQ ID NO：43 結合人類HER3之β-髮夾結構內之抗原決定基
SEQ ID NO：44 結合人類HER4之β-髮夾結構內之抗原決定基
SEQ ID NO：45 綠膿桿菌外毒素變異體PE24LR8M_3G(包括GGG連接子)
SEQ ID NO：46 M-05-74之輕鏈(M-05-74_LC)
SEQ ID NO：47 具有分選酶tag之M-05-74之重鏈HC(M-05-74_HC)
SEQ ID NO：48 結合至綠膿桿菌外毒素變異體PE24LR8M之M-05-74之重鏈HC(Fab-074-PE重鏈1)
SEQ ID NO：49 結合至綠膿桿菌外毒素變異體PE24LR8M之M-05-74之重鏈HC(Fab-074-PE重鏈2)作為直接PE24LR8M融合體
SEQ ID NO：50 可溶性金黃色葡萄球菌分選酶A
SEQ ID NO：51 重鏈可變結構域VH，<Her3>M-08-11
SEQ ID NO：52 輕鏈可變結構域VL，<Her3>M-08-11
SEQ ID NO：53 人類κ輕鏈恆定區
SEQ ID NO：54 人類λ輕鏈恆定區
SEQ ID NO：55 源自IgG1之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO：56 L234A及L235A上突變之源自IgG1之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO：57 L234A、L235A及P329G上突變之源自IgG1之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO：58 源自IgG4之人類重鏈恆定區
提供如下實例及圖示以助於理解本發明，其真實範疇陳述於附加申請專利範圍中。應瞭解，可在不偏離本發明精神之狀況下對所闡述程序進行修正。
在下文中，列舉若干本發明之實施例：1.一種分離之抗體，其結合人類HER3，其中該抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)。2.一種分離之抗體，其結合人類HER3，其中該抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：41之可變輕鏈域VL(VL-D)、具有 胺基酸序列SEQ ID NO：39之可變輕鏈域VL(VL-B)、或具有胺基酸序列SEQ ID NO：42之可變輕鏈域VL(VL-E)。
3.一種分離之抗體，其結合人類HER3，其中該抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：41之可變輕鏈域VL(VL-D)。
4.一種分離之抗體，其結合人類HER3，其中該抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：39之可變輕鏈域VL(VL-B)。
5.一種分離之抗體，其結合人類HER3，其中該抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH(VH-A)及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：42之可變輕鏈域VL(VL-E)。
6.如實施例1至5中任一項之抗體，其中該抗體結合於胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內，該胺基酸序列包含於以下多肽中：SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3。
7.如實施例1至5中任一項之抗體，其中該抗體結合以下多肽：SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3。
8.如實施例6或7之抗體，其中該抗體結合人類HER4且結合於胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內，該胺基酸序列屬於：SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4。
9.如實施例6或7之抗體，其中該抗體結合人類HER4，結合多肽 SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4。
10.一種抗HER3抗體，其中該抗體包含與如實施例2至5中任一項之抗體具有至少95%序列一致性之重鏈可變結構域(VH)序列，且具有至少95%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL)：其中該抗體具有以下特性中之一或多者：該抗體
a)結合於包含於選自由以下組成之群的多肽中之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3、SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3、SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3、SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3；b)結合選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3、SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3、SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3、SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3；c)在HER3/HER2共沈澱分析中抑制MCF-7細胞中HER3/HER2雜二聚體之雜二聚作用；d)結合於包含於選自由以下組成之群的多肽中之胺基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID NO：2)內：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4、SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4、SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4； e)結合選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO：21 TtSlyDcas-Her4、SEQ ID NO：22 TtSlyDcys-Her4、SEQ ID NO：23 TgSlyDser-Her4及SEQ ID NO：24 TgSlyDcys-Her4；f)作為單價Fab片段展示與其二價親本全長抗體相比相同或較高之生物活性(當在MCF-7細胞中在HER3磷酸化抑制分析中以等莫耳量比較時)；g)展示活體內腫瘤生長抑制活性；h)以KD值1×10-8M之親和力結合HER3-ECD(在一個實施例中，KD值為1×10-8M至1×10-13M；在一個實施例中，KD值為1×10-9M至1×10-13M)；i)以KD值1×10-8M之親和力結合HER4-ECD(在一個實施例中，KD值為1×10-8M至1×10-13M；在一個實施例中，KD值為1×10-9M至1×10-13M)；j)其中該抗體結合由VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)組成之多肽或由VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)組成之多肽；k)其中該抗體結合由VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)組成之多肽；及/或l)其中該抗體結合由VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)組成之多肽。
11.如實施例實施例1至10中任一項之抗體，其為全長IgG1抗體或IgG4抗體。
12.如實施例1至10中任一項之抗體，其為Fab片段。
13.如實施例11至12中任一項之抗體，其中該抗體包含人源恆定域。
14.一種免疫結合物，其包含如實施例1至10中任一項之抗體及細胞毒性劑。
15.如實施例1至10中任一項之抗體或如實施例14之免疫結合物，其係用於治療癌症。
16.如實施例1至10中任一項之抗體，其係用於抑制HER3/HER2二聚作用。
17.一種醫藥調配物，其包含如實施例1至10中任一項之抗體或如實施例13之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。
18.如實施例1至10中任一項之抗體或如實施例14之免疫結合物，其係用作藥劑。
19.一種如實施例1至10中任一項之抗體或如實施例14之免疫結合物之用途，其係用於製造藥劑。
20.如實施例19之用途，其中該藥劑係用於治療癌症。
21.一種分離之核酸，其編碼如實施例1至10中任一項之抗體。
22.一種宿主細胞，其包含如實施例21之核酸。
23.一種產生抗體之方法，其包含培養如實施例22之宿主細胞以使得該抗體產生，及自該細胞培養物或該細胞培養物清液層回收該抗體。
實例： 材料及一般方法 重組DNA技術
如下所述使用標準方法操控DNA：Sambrook,J.等人，Molecular Cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989。根據製造商之說明使用分子生物試劑。
基因合成
自化學合成製成之寡核苷酸製備所需基因區段。側接單一限制性核酸內切酶裂解部位之400-1600bp長基因區段藉由黏接並接合(包括PCR擴增)寡核苷酸進行組合，且隨後經由例如EcoRI/BlpI或BsmI/XhoI之指定限制部位選殖至下文所述表現載體中。藉由DNA定序來確定次選殖基因片段之DNA序列。根據Geneart(Regensburg,Germany)之既定說明來對基因合成片段排序。
DNA序列確定
DNA序列藉由根據Sequiserve GmbH(Vaterstetten,Germany)執行之雙股定序來確定。
DNA及蛋白質序列分析及序列數據管理
將Infomax's Vector NT1 Advance套件11.5.0版用於序列產生、定位、分析、註釋及說明。
實例1 製備抗原及篩檢蛋白質-產生功能性β-髮夾結構HER3及β-髮夾結構HER4構築體，選擇結合HER3之β-髮夾結構及HER4之β-髮夾結構之抗體
為產生功能性β-髮夾結構HER3及HER4構築體，將HER3之β-髮夾結構之胺基酸序列(SEQ ID NO：1)及HER4之β-髮夾結構之胺基酸序列(SEQ ID NO：2)移植至包含FKBP域之SlyD多肽構架中。在此類構築體中，與HER3或HER4之天然未活化構形中之隱藏結構(在不存在配位體作為例如HRG下)相比，可自由獲得經移植β-髮夾結構(參見圖1c及1d，其中HER3之β-髮夾結構為隱藏的)。
可純化所有稠合SlyD多肽且使用幾乎相同之方案再摺疊。使由特定表現質體轉型之大腸桿菌BL21(DE3)細胞在37℃下於含有各別抗生素之LB培養基中生長以選擇性生長(卡那黴素(Kanamycin)30μg/ml，或安比西林(Ampicillin)(100μg/ml))至OD600為1.5，且藉由添 加1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導胞漿過度表現。誘導之後三小時，藉由離心收集細胞(在5,000g下20分鐘)，冷凍並且儲存於-20℃下。為進行細胞溶解，使冷凍集結粒再懸浮於補充有7M GdmCl及5mM咪唑之冷凍50mM磷酸鈉緩衝劑(pH 8.0)中。此後在冰上攪拌懸浮液2-10小時以完成細胞溶解。在離心(25,000g，1小時)並過濾(硝酸纖維素膜，8.0μm、1.2μm、0.2μm)之後，將溶胞物塗覆於用溶解緩衝劑平衡之Ni-NTA管柱上。在後續洗滌步驟中，咪唑濃度升高至10mM(於包含7M GdmCl之50mM磷酸鈉緩衝劑(pH 8.0)中)且添加5mM TCEP以使硫氫基部分保持為還原形式且防止過早發生二硫鍵橋接。塗覆至少15至20體積之還原洗滌緩衝劑。此後，GdmCl溶液經包含100mM NaCl、10mM咪唑及5mM TCEP之50mM磷酸鈉緩衝劑(pH 8.0)置換以誘導基質結合SlyD融合多肽之構形再摺疊。為避免共純化蛋白酶再活化，將蛋白酶抑制劑混合物(Complete® EDTA-free，Roche)添加至再摺疊緩衝劑中。在隔夜程序中塗覆總計15至20管柱體積之再摺疊緩衝劑。此後，藉由用10管柱體積包含100mM NaCl及10mM咪唑之50mM磷酸鈉緩衝劑(pH 8.0)洗滌移除TCEP與Complete® EDTA-free抑制劑混合物。在最後洗滌步驟中，咪唑濃度升高至30mM(10管柱體積)以移除頑固污染物。接著藉由塗覆於相同緩衝劑中之250mM咪唑溶離再摺疊多肽。藉由Tricine-SDS-PAGE評估含蛋白質溶離份之純度(Schaegger,H及von Jagow,G.,Anal.Biochem.166(1987)368-379)。隨後，使蛋白質經歷使用磷酸鉀作為緩衝劑系統(50mM磷酸鉀緩衝劑(pH 7.0)、100mM KCl、0.5mM EDTA)之尺寸排阻層析(SuperdexTM HiLoad,Amersham Pharmacia)。最終，使含蛋白質溶離份彙集且於Amicon細胞(YM10)中濃縮至濃度為約5mg/ml。TtSlyD-FKBP-Her3之Ni-NTA純化之例示性SDS-PAGE分析示於圖3中且嗜熱棲熱菌SlyD-FKBP-Her-3之Ni-NTA純化溶離份之SEC溶 離特徵示於圖4中。嗜熱棲熱菌SlyD(TtSlyD)-Her-3融合多肽可成功純化為呈其單體形式之可溶且穩定之多肽。在16.4mg來自溶離份12及13之純化蛋白質下定量最終產率。
表2：產生之SlyD基抗原決定基架構之胺基酸序列之概述(其帶有HER3二聚域片段(HER3之β-髮夾結構(SEQ ID NO：1))作為插入物或HER4二聚域片段(HER4之β-髮夾結構(SEQ ID NO：2))作為插入物)。
TtSlyD-FKBP-Her3、TtSlyDcas-Her3、TtSlyDcys-Her3、熱球菌(Thermococcus gammatolerans)TgSlyDser-Her3及TgSlyDcys-Her3帶有Her3二聚域片段(HER3之β-髮夾結構(SEQ ID NO：1))作為插入物且用作免疫原且作為ELISA篩檢中之陽性對照。
TtSlyD-野生型、TtSlyDcas、TgSlyD△IF在ELISA篩檢中用作陰性對照(在無Her3二聚域片段(HER3之β-髮夾結構(SEQ ID NO：1))或Her4二聚域片段(HER4之β-髮夾結構(SEQ ID NO：2))作為插入物下)。
TtSlyDcas-Her4、TtSlyDcys-Her4、TgSlyDser-Her4及TgSlyDcys-Her4(其帶有Her4二聚域片段(HER4之β-髮夾結構(SEQ ID NO：2))作為插入物)用於ELISA篩檢以檢查所產生之純系的HER4交叉反應性。
當抗原決定基架構表現於大腸桿菌中時，可存在或不存在N端甲硫胺酸殘基。(Nt=N端；Ct=C端)
實例2 a)HER3抗體之免疫及選擇
對於抗HER3及HER4之β-髮夾結構之抗體之產生，用不同抗原免疫接種Balb/C、NMRI或SJL小鼠。作為抗原，使用以下蛋白質：全長Her3 ECD或抗原決定基架構蛋白質TtSlyD-FKBP12到Her3、TtSlyDcys-Her3、TtSlyDcas-Her3、TgSlyDcys-Her3及TgSlyDser到Her3。TtSlyD-FKBP12-Her3變異體表示第一代抗原決定基架構，用於產生Her3二聚域特異性抗體。儘管使用SlyD變異體作為抗原決定基架構之通用原理已使用第一代SlyD-FKBP12架構表明，但會產生具有較高穩定性之架構之改良變異體。此等SlyD變異體源自嗜熱棲熱菌及熱球菌。
使所有小鼠在免疫接種操作開始之後第0、6及10週之時間點經歷3次免疫。在各時間點，用溶解於100μl PBS中之100μg無內毒素免疫原免疫接種各小鼠。對於第一次免疫接種，使免疫原與100μl CFA混合。對於第二及第三次免疫接種，使免疫原與IFA混合。第一及第三次免疫接種經由腹膜內途徑實施，第二次免疫接種皮下實施。在使用融合瘤技術製備用於抗體產生之脾細胞之前2及3天，用於100μl PBS中之12.5μg免疫原且不用助劑使小鼠經歷靜脈內輔助劑免疫接種。
效價分析
對於針對各別免疫原且針對篩檢蛋白質之血清效價之確定，在免疫接種操作開始之後第11週收集少量各小鼠之血清。對於ELISA，將免疫原或篩檢架構蛋白質固定於培養盤表面上。將Her3 ECD以濃度為1μg/ml固定且使用濃度為0.5μg/ml的架構蛋白質TtSlyD-FKBP12-Her3、TtSlyD-FKBP12、TtSlyDcys-Her3、TtSlyDcas-Her3、TtSlyDcas、TgSlyDcys-Her3、TgSlyDser-Her3及TgSlyD△IF。架構蛋白質TtSlyDcas及TgSlyD△IF用作陰性對照。將來自各小鼠之血清稀釋 於具有1%BSA之PBS中且將稀釋液添加至培養盤中。測試血清之1：300、1：900、1：2700、1：8100、1：24300、1：72900、1：218700及1：656100稀釋液。用HRP標記F(ab')2山羊抗小鼠Fcγ(Dianova)及ABTS(Roche)作為基質偵測細胞結合性抗體。
甚至在血清滴定水準上，已顯而易見的是經免疫接種小鼠產生抗Her3β-髮夾結構域之抗體。在經Her3 ECD免疫接種之小鼠中，此情況可藉由針對含有二聚β-髮夾環之架構蛋白質中之一者的滴定展示。 強還原信號可由以下事實解釋：大多數藉由用Her3 ECD免疫接種而出現之抗體靶向ECD內之其他部分，且僅一小部分結合二聚β-髮夾結構域。在經含Her3二聚環之架構免疫接種之小鼠中，靶向環之抗體之溶離份可藉由針對Her3 ECD(陽性對照)滴定及針對無Her3插入之對照架構(陰性對照)滴定來展示。
b)抗體產生及ELISA篩檢/選擇
使用本文所述抗原決定基架構技術原則上提供兩種策略以產生靶向Her3二聚域(HER3之β-髮夾結構(SEQ ID NO：1))之抗體。一種策略為用全長Her3 ECD免疫接種且使用該架構以篩檢二聚域特異性抗體。另一策略為直接使用架構進行免疫接種及使用Her3 ECD、具有另一主鏈之架構或無插入之架構進行計數器篩檢。用融合瘤技術藉由使原發性B細胞與P3X63Ag8.653骨髓瘤細胞稠合產生抗體。在最終輔助劑免疫接種之後2天，將經免疫接種小鼠處死且製備脾細胞群體。使用PEG融合技術使脾細胞與P3X63Ag8.653稠合。在37℃下在5%CO2下培育來自融合之細胞分批培養物隔夜。第二天在400g下離心含有細胞批料之稠合細胞10分鐘。此後，使細胞懸浮於補充有0.1倍偶氮絲胺酸-次黃嘌呤(δ)之融合瘤選擇培養基中且以每孔2.5×104個細胞之濃度接種於96孔盤中。在37℃下在5%CO2下培養培養盤至少1週。在ELISA分析之前3天，改變選擇培養基。
在ELISA中針對Her3 ECD及各種架構蛋白質初始培養物清液層。針對架構蛋白質進行測試表明所選純繫結合天然Her3 ECD之二聚域β-髮夾結構。針對對照架構TtSlyDcas及TgSlyD△IF進行測試展示所選純繫結合插入之Her3源序列而非架構主鏈。為檢查交叉反應性，針對Her家族之另一成員(亦即Her1、Her2及Her4)之全長ECD測試所得純系。如所示，所有所選純系均對Her3具有極高特異性且可偵測到對HER4具有極特定之交叉反應性，而並未偵測到對Her家族之其他成員具有交叉反應性。對於ELISA，使用篩檢抗原拉下格式。將Her3 ECD以濃度為1μg/ml固定且將架構蛋白質TtSlyD-FKBP12-Her3、TtSlyD-FKBP12、TtSlyDcys-Her3、TtSlyDcas-Her3、TtSlyDcas、TgSlyDcys-Her3、TgSlyDser-Her3及TgSlyD△IF以濃度為0.5μg/ml固定。將融合瘤清液層添加至培養盤中且在室溫下培育1小時。用HRP標記F(ab')2山羊抗小鼠Fcγ(Dianova)及ABTS(Roche)作為HRP基質偵測細胞結合性抗體。
c)免疫組織化學
在IHC中測試所有所選純系之反應性及特異性。因此HEK293細胞經分別編碼全長HER1、HER2、HER3或HER4之質體短暫轉染。在轉染之後2天，收集目前表現HER1、HER2、HER3或HER4之不同細胞株，隨後於福馬林中固定且包埋於瓊脂糖中以產生IHC對照。在於福馬林中再固定隔夜之後，將瓊脂糖嵌段包埋於石蠟中。將未轉染HEK293細胞用作陰性對照且因此處理為經轉染細胞。在石蠟包埋之後，使用薄片切片機製備3μm薄切片。將切片安放於玻璃顯微術載片上且乾燥2小時。使用Ventana Benchmark XT進行免疫組織化學染色程序之所有其他步驟。使載片脫蠟且藉由加熱1小時執行抗原修復。對於抗原修復，使用Ventana緩衝劑CC1。使用濃度為1μg/ml之抗體。對於細胞結合性抗體之偵測，使用Ventana UltraView偵測套組。結果示於圖5中。所有三種純系展示結合HER3且對HER4具有交叉反應性。未偵測到對HER1及HER2之交叉反應性。
d)所選抗Her3融合瘤之DNA定序
為獲得所選融合瘤純系之DNA序列進行5`Race PCR。對於RT-PCR，使用總RNA純化套組(Qiagen)自5×106個細胞製備總RNA。使用5`prime RACE PCR套組(Roche)進行反轉錄及PCR。藉由凝膠電泳及後續凝膠純化來純化來自重鏈及輕鏈之所得PCR片段。使用Topo Zero-Blunt選殖套組(Invitrogen)選殖PCR片段且轉型為勝任細胞。使來自各融合瘤之若干純系定序以所選純系獲得共同序列。使M-05-74、M-15-02、M-15-04定序，由此所有3種純系產生一致VH及VL序列。類似地將M-15-03、M-15-05、M-15-08、M-15-09、M-15-11、M-16-01定序並且所有純系產生一致VH及VL序列。
e)經由FACS進行M-05-74之時間依賴性內化分析
在FACS中使用HER3表現腫瘤細胞株T47D分析藉由HER3之所選純系M-05-74進行之HER3的結合及內化。用50ng重組人類海瑞古林片段(HRG)(SEQ ID NO：11)處理5×105個細胞。在pCDNA.1載體(Invitrogen)中選殖包括胺基酸SEQ ID NO：11之片段。根據Invitrogen所述方案，HRG片段表現於FreeStyleTM 293-F細胞中(FreeStyleTM 293表現系統，目錄號K9000-01)。將純化HRG片段溶解於20mM Histidin、140mM NaCl(pH 6.0)中且儲存於-80℃。
未處理(-)細胞用作陰性對照。在海瑞古林誘導活化之後不久，將1μg M-05-74添加至細胞中。在37℃下培育細胞0、5、15、30、45、60、75、90、105、120、180或240分鐘。在培育之後，立即將細胞置於冰上。用3ml FACS緩衝劑洗滌細胞一次，接著用1μg R-藻紅素山羊抗小鼠IgG(H+L)二次抗體染色30分鐘。使用FACSCantoTM流式細胞儀(BD Biosciences)進行流動式細胞測量術。結果為T47D細胞中M-05-74誘導之時間依賴性HER3受體內化之FACS分析。M-05-74展示在補充有或不補充重組人類海瑞古林片段(HRG)之情況下與表現之HER3 ECD結合。M-05-74致使Her3受體經4小時時段發生內化。結果示於圖6中。同型對照指示為恆定之水平黑條。M-05-74展示在(+HRG)有或無(-)人類海瑞古林片段及之情況下與表現之HER3 ECD結合。M-05-74致使Her3受體經4小時時段發生內化。同型對照指示為恆定之水平黑條。在HRG存在下，抗體誘導之HER3之內化更快，例如在1小時之後，當與在不存在HRG(-)下之值相比時，在HRG存在(+HRG)下至少25%以上HER3發生內化。
實例3 a)HER3抗體之動力學篩檢/結合特性
根據Schraeml等人(Schraeml,M.及M.Biehl,Methods Mol.Biol. 901(2012)171-181)在裝有Biacore CM5感測器之BIAcore 4000儀器上執行動力學篩選。在所有分析中，捕捉測試抗體。系統受V1.1版軟體控制。儀器緩衝劑為HBS-EP(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.05%(w/v)P20)。系統在25℃下操作。根據製造商之說明書使用EDC/NHS化學物質在流槽1、2、3及4中之點1、2、4及5上固定於10mM乙酸鈉緩衝劑(pH 4.5)中之30μg/ml兔多株抗體(RAM IgG，(具有Fcγ特異性之兔抗小鼠IgG)GE Healthcare)。使用1M乙醇胺將感測器飽和。在各流槽中，使用點1-2及點5-4計算所提及之信號，點3充當平衡對照。抗原(包含HER3之β-髮夾結構肽(SEQ ID NO：1)之人類重組Her-3 ECD(68kDa)及重組嗜熱棲熱菌SlyD FKBP-Her3(15kDa))以150nM稀釋於補充有1mg/ml CMD(Carboxymethyldextran，Sigma)之儀器緩衝劑中以抑止非特異性結合。在其施用之前，將融合瘤培養物清液層以1：5稀釋於儀器緩衝劑中。以30μl/min之流動速率注射稀釋之混合物2分鐘。監測以反應單位計之抗體捕獲水準(CL)。此後立即以30μl/min之流動速率注射各別抗原3分鐘締合時間。此後，記錄抗體-抗原複合物解離信號5分鐘。藉由以30μl/min之流動速率注射10mM甘胺酸鹽酸鹽溶液(pH 1.7)2分鐘再生感測器。在抗原注射結束之前不久記錄之信號表示為以反應單位計之結合遲延(BL)。在記錄解離結束之前不久記錄之信號表示為以反應單位計之穩定性遲延(SL)。測定、計算解離速率常數。 以分鐘計之抗體-抗原複合物穩定性由下式計算：ln(2)/60*kd。莫耳比由下式計算：MW(抗體)/MW(抗原)* BL(抗原)/CL(抗體)。
結合遲延(BL)表示分析物注射結束時之反應單位。作為感測器表面上之配位體捕捉之抗體量量測為以反應單位計之捕獲水準(CL)。連同所測試分析物、抗體及呈溶解狀態之分析物之分子量的信息一起，可計算莫耳比。倘若感測器經組態具有適合量之抗體配位體捕捉水 準，各抗體應在功能上能夠至少結合一種呈溶解狀態之分析物，其由莫耳比MR=1.0表示。接著，莫耳比亦為分析物結合之價數模式的指示。對於結合兩種分析物之抗體而言最大價數可為MR=2，每一者各具有Fab價數。在空間限制或異常分析物結合之情況下，莫耳比可指示低於化學計量之結合，如其為當Her-3 ECD以其「閉合」構形結合時之情況。莫耳比測定中之最大分析偏差為MR=0.2。
篩檢/選擇抗HER3/HER4抗體M-05-74：
在一個實驗中，用來自不同融合體之融合瘤初始培養物驅動動力學篩檢，該融合體由用人類重組Her-3 ECD免疫接種小鼠獲得。目標為選擇對Her-3雜二聚域β-髮夾結構肽(SEQ ID NO：1)具有結合特異性之培養物。作為呈溶解狀態之抗原，使用包含HER3之β-髮夾結構肽(SEQ ID NO：1)之人類重組Her-3 ECD(68kDa)及重組嗜熱棲熱菌SlyD FKBP-Her3(15kDa)。將陽性hit歸類為對兩種抗原具有結合活性之初始培養物清液層。
表4例示性展示初始培養物清液層，由此M-05-74滿足此等要求，表明對HER3之β-髮夾結構之抗原決定基特異性。因此，此為一種抗HER3抗體之適合篩檢方法，其結合SEQ ID NO：1之Her-3髮夾結構。
已發現M-05-74在其結合人類Her-3 ECD分析物中展示低莫耳比(MR=0.5)，然而在其結合包含β-髮夾結構HER3(SEQ ID NO：1)M-05-74之分析物嗜熱棲熱菌SlyD FKBP-Her3中展示改良之莫耳比(MR=1.1)，表明功能性化學計算量1：1結合及改良之抗原決定基可行性(與人類Her-3 ECD相比)。
b)研究不存在及存在海瑞古林(HRG)下之M-05-74之作用模式之HER3抗體M-05-74之動力學、M-205及M-208動力學
在其平衡狀態下，Her-3 ECD以其「閉合構形」形式存在，其意謂雜二聚Her-3 β-髮夾結構基元經由非共價相互作用繫栓至Her-3 ECD域IV(參見圖1c及d)。推測「閉合」Her-3構形可經由在特定Her-3海瑞古林結合位點配位體海瑞古林之結合打開。此舉發生於由Her-3 ECD域I及域III形成之Her-3界面。藉由此相互作用，咸信Her-3受體發生活化且轉變為其「打開構形」(參見圖1b及e)。當此情況發生時，可獲得所述抗體之Her-3 β-髮夾結構。此作用模式可藉由Biacore實驗活體外模擬。
Biacore T100儀器(GE Healthcare)用以以動力學方式評估單株抗 體對海瑞古林活化之Her-3細胞外域(Her3_ECD)之行為。將CM5系列感測器安置於系統中且根據製造商之說明書用HBS-ET緩衝劑(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% w/v Tween 20)校正。樣品緩衝劑為補充有1mg/ml CMD(羧甲基葡聚糖，Sigma號86524)之系統緩衝劑。系統在25℃下操作。根據製造商之說明書使用EDC/NHS化學物質將6500RU RAM-Fcγ(Fcγ-片段RamIgG之相對單位，GE Healthcare)固定於所有四個流槽上。使用1M乙醇胺將感測器去活化。
以動力學方式測試各別抗體對分析物之結合活性。在35nM濃度下藉由以5μl/min注射1分鐘來捕捉抗體。流動速率設定為100μl/min。
所測試之呈溶解狀態之分析物為人類海瑞古林片段(HRG)(SEQ ID NO：11)、44kDa均二聚蛋白質(根據實例2e製備)、人類重組HER2 ECD(SEQ ID NO：10)(69.6kDa)、人類重組HER3 ECD(SEQ ID NO：4)(68kDa)、人類重組HER4 ECD(SEQ ID NO：6)及100nM Her-3 ECD及Her-4 ECD，各在室溫下用5倍莫耳過量之海瑞古林培育60分鐘，產生HER3 ECD-HRG複合物及HER4 ECD-HRG複合物(對於複合物添加MW)。
注射0nM、1.1nM、3.7nM、11.1nM、33.1nM及90nM之不同濃度級之呈溶解狀態之分析物3.5分鐘。監測解離15分鐘。若可能，根據朗格繆爾擬合評估動力學特徵。
MR=莫耳比、BL=結合遲延、CL=捕捉水準；n.d.=不可偵測=不結合。莫耳比由下式計算：MW(抗體)/MW(抗原)*BL(抗原)/CL(抗體)。
抗體M-205為對鄰近Her-3 ECD海瑞古林結合位點之抗原決定基具有結合活性之鼠類單株抗體(在WO2011/076683中描述為Mab205.10.2)。M-205與其在Her-3 ECD上之結合位點周圍之海瑞古林競爭。
抗體M-208為對Her-3 ECD域IV具有結合活性之鼠類單株抗體。M-208結合Her-3 ECD，與Her-3 ECD構形狀態無關。
M-05-74(在表5中為M-074)結合動力學改良之呈活性「打開」構形之Her-3 ECD(在存在配位體(例如海瑞古林HRG)下)，此係歸因於呈「打開」構形之Her-3髮夾結構之可接近性較佳。MR高至少兩倍。
相對於陰性對照分析物海瑞古林β(HRG)，及細胞外HER-2域(HER2_ECD)，未觀測到抗體結合(n.d.)。所測試抗體展示所有均結合Her3-ECD(HER3_ECD)，但具有強烈不同之BL值。
與具有較快ka=4.9 E+04 1/Ms及BL(235RU)下之高信號振幅之純系M-205及具有較快ka=5.8E+04 1/Ms以及BL(367RU)下之高信號振幅之M-208相比時，M-05-74以較慢締合速率常數ka=1.3E+04 1/Ms及較小BL(70RU)結合呈「閉合」構形之Her-3 ECD。此情況涉及結合之化學計量(MR)，其中M-205(MR=1.0)與M-208(MR=1.0)展示對HER3-ECD之功能性1：1結合，然而M-05-74展示非功能性結合 (MR=0.2)。在本文中，推測M-05-74對Her-3 ECD之此相互作用為剩餘結合一部分結構上有缺陷之Her-3 ECD分析物。由此亦推測M-05-74對Her-4 ECD之相互作用，其亦展示BL(27RU)及(MR=0.1)下之非功能性結合。
出人意料之結果為M-05-74締合速率常數ka由「閉合」Her-3 ECD至「打開」Her-3 ECD/海瑞古林複合物；由ka=1.3E+04 1/Ms(Her3_ECD)至ka=6.3E+04 1/Ms(Her3-ECD-HRG)之4倍以上之增加(接近5倍)。因此M-05-74以4.0或高於4.0之存在海瑞古林(Ka(+海瑞古林))下及不存在海瑞古林(Ka(-海瑞古林))下之締合常數(Ka)之比率結合HER3-ECD((Ka(+海瑞古林))/(Ka(-海瑞古林)=ka(Her3-ECD-HRG)/ka(Her3-ECD)=6.3E+04[1/Ms]/1.3E+04[1/Ms])=4.85))。由此莫耳比提高3倍，表明目前M-05-74與Her-3 ECD海瑞古林複合物之1：1相互作用。由此使M-05-74以3.0之在存在海瑞古林(MR(+海瑞古林))及不存在海瑞古林(MR(-海瑞古林))下結合之莫耳比MR之比率結合HER3-ECD((MR(+海瑞古林))/(MR(-海瑞古林)=0.6/0.2=3)。
此情況對於Her-4 ECD/海瑞古林複合物亦為有效的，其中莫耳比提高6倍，表明M-05-74與Her-4 ECD海瑞古林複合物1：1相互作用。由此使M-05-74以3.0之在存在海瑞古林(MR(+海瑞古林))及不存在海瑞古林(MR(-海瑞古林))下結合之莫耳比MR之比率結合HER4-ECD((MR(+海瑞古林))/(MR(-海瑞古林)=0.6/0.1=6)。且此外令人驚奇地，M-05-74締合速率常數ka由「閉合」Her-4 ECD至「打開」Her-4 ECD/海瑞古林複合物，由ka=6.7E+03 1/Ms(Her3_ECD)至ka=1.6E+05增加20倍以上。因此M-05-74以20.0或高於20.0之存在海瑞古林(Ka(+海瑞古林))下及不存在海瑞古林(Ka(-海瑞古林))下之締合常數(Ka)之比率結合HER4-ECD((Ka(+海瑞古林))/(Ka(-海瑞古林)=ka(Her4-ECD-HRG)/ka(Her4-ECD)=6.7E+04[1/Ms]/1.6E+05[1/Ms])=23.88))。
正如所預期，海瑞古林置換劑M-205會降低其BL值及莫耳比。莫耳比降低1/2.5，由BL(235RU)下之MR=1.0(Her3-ECD)之完全功能性1：1相互作用降至BL(164RU)下之較小功能性MR=0.4(Her3-ECD-HRG)。由此指示由於過量海瑞古林存在競爭之功能性損失。
結合Her-3 ECD域IV之抗體M-208仍完全不受海瑞古林之存在影響。不可偵測到莫耳比MR之顯著變化。
圖7展示抗HER3/HER4 β-髮夾結構抗體M-05-74與海瑞古林活化Her-3 ECD複合物之結合模式。M-05-74(參見曲線1)捕獲且組織海瑞古林自複合物解離。M-05-74為海瑞古林之捕集阱(「海瑞古林儲槽」)。M-05-74不與其在Her-3 ECD上之結合位點之海瑞古林競爭。 為進行比較，展示M-08-11(曲線2)；M-08-11(VH及VL參見SEQ ID NO：51及52)為無HER4 ECD及HER4 β-髮夾結構交叉反應性之另一HER3 β-髮夾結構黏合劑，其結合除M-05-74外之抗原決定基。
在其他實驗中，此外量測中包括HER1 ECD、T.T.SlyD-cysHer3及無HER3 β-髮夾結構之T.T.SlyD-cas：結果示於表5b中，其實質上揭露M-05-74之相同結合特性。
Biacore T200儀器(GE Healthcare)安置有CM5系列感測器。根據製造商之說明書用HBS-ET緩衝劑(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% w/v Tween 20)校正感測器。樣品緩衝劑為補充有1mg/ml CMD(羧甲基葡聚糖，Sigma號86524)之系統緩衝劑。系統在25℃下操作。根據製造商之說明書使用胺偶合EDC/NHS化學物質將6500RU RAM-Fcγ(Fcγ-片段RamIgG之相對單位，GE Healthcare)固定於所有四個流槽上。使用1M乙醇胺將感測器去活化。 藉由以10μl/min注射1分鐘將單株抗體捕捉(CL，捕捉水準)於感測器表面上。量測濃度依賴性動力學。注射一系列濃度之分析物HER-1-ECD、HER-2-ECD、HER-3-ECD、HER-4-ECD、T.T.SlyD-cysHer3及 T.T.SlyD-cas，各濃度為0nM、1.1nM、3.3nM、2×10nM、30nM及90nM。注射0nM、17nM、2×50nM、150nM及450nM海瑞古林β(HRG)，90nM HER-3 ECD及90nM HER-4 ECD用五倍莫耳過量之HRG β預培育2小時且以0nM、1.1nM、3.3nM、2×10nM、30nM及90nM之HER濃度級注射。以100μl/min流動速率注射所有分析物5分鐘締合時間及10分鐘解離時間。藉由以10μl/min注射10mM甘胺酸(pH 1.7)3分鐘來再生感測器捕捉系統。若可能，使用Biacore T200評估軟體評估動力學數據。使用朗格繆爾擬合模型評估HER-3-ECD、HER-4-ECD及T.T.SlyD-cysHer3動力學。根據朗格繆爾擬合模型評估M-5-74之HER-3-ECD-HRG及HER-4-ECD-HRG動力學。
MR=莫耳比，BL=結合遲延，CL=捕捉水準；n.d.=不可偵測=不結合。M-05-74以1：1化學計量結合HER-3-ECD-HRG及HER-4-ECD-HRG且以10：1化學計量結合不活化HER-3-ECD及HER-4-ECD。M-05-74以高於HER-4-ECD及HER-4-ECD-HRG之親和力結合HER-3-ECD及HER-3-ECD-HRG。M-05-74並不與HER-1、HER-2及HRG相互作用。M-05-74以1：2化學計量結合T.T.SlyD-cysHer3且並不與T.T.SlyD-cas相互作用。
實例4 抗HER3抗體M-05-74之抗原決定基定位及作用分析模式 具有獨特抗原決定基之M-05-74(HER3及HER4之β-髮夾結構)
Biacore 2000(GE Healthcare)儀器用以評估可獲得之抗原決定基純系培養物清液層之結合特異性。將CM5感測器安置於系統中且根據製造商之說明書用HBS-ET緩衝劑(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% w/v Tween 20)校正。樣品緩衝劑為補充有1mg/ml CMD(羧甲基葡聚糖，Sigma)之系統緩衝劑。系統在37℃下操作。根據製造商之說明書使用EDC/NHS化學物質將10000RU RAM-Fcγ(Fcγ-片段兔抗小鼠IgG之相對單位/Jackson Laboratories)固定於所有四個流槽上。使用1M乙醇胺將感測器去活化。
在10μl/min之流動速率下，在所有流槽上捕捉初級抗體50nM抗HER3 M-05-74 1分鐘。流動速率設定為30μl/min且注射IgG阻斷溶液(50μg/ml IgG(20：2：1之IgG1-Fcγ、IgG2a-Fcγ、IgG2b)，羅氏)5分鐘。在1.5μM下注射抗原Her-3 ECD 3分鐘。
之後，以30μl/min注射100nM各抗HER3二級抗體(a)M-05-74；b)8B8，其來自WO97/35885(在圖中稱為GT)；c)M-208，其結合HER3之域IV；及d)M-08-11；無HER4 ECD及HER4 β-髮夾結構交叉反應性之另一HER3 β-髮夾結構黏合劑)3分鐘。感測器表面之酸性再生使用以30μl/min三次連續注射10mM甘胺酸(pH 1.7)60秒來實現。
量測之雜訊藉由二次M-05-74注射劑再結合來界定，其使已解離之初級M-05-74再飽和。實驗展示(參見圖8)M-208及M-05-74佔據Her-3 ECD上之獨特抗原決定基，因為在M-05-74存在下二級M-208信號使Her-3 ECD完全飽和。M-08-11結合完全藉由M-05-74之存在阻斷。M-08-11二次信號甚至低於雜訊。然而，與M-05-74相比M-08-11結合不同抗原決定基，因為M-08-11不會結合人類HER4 ECD及HER4 β-髮夾結構。(亦參見以下有HER3及HER4之β-髮夾結構下的精確抗原決定基 定位數據)。在M-05-74存在下8B8(=GT)二次抗體產生顯著信號，其高於雜訊。因此，與M-05-74及M-08-11相比8B8(=GT)抗體結合另一抗原決定基。
具有獨特抗原決定基之M-05-74及作用模式
Biacore B3000儀器(GE Healthcare)用以以動力學方式評估純系培養物M-05-74及抗體8B8(來自WO 97/35885，在圖式中稱為GT)對「閉合」構形之Her-3 ECD及「打開」之海瑞古林活化之Her-3 ECD。將CM5系列感測器安置於系統中且根據製造商之說明書用HBS-ET緩衝劑(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% w/v Tween 20)校正。樣品緩衝劑為補充有1mg/ml CMD(羧甲基葡聚糖)之系統緩衝劑。系統在25℃下操作。根據製造商之說明書使用EDC/NHS化學物質將10000RU RAM-Fcγ(Fcγ-片段兔抗小鼠IgG之相對單位/Jackson Laboratories)固定於所有流槽上。使用1M乙醇胺將感測器去活化。以100μl/min注射0nM、1.1nM、3.7nM、11.1nM、33.1nM及90nM之不同濃度級之呈溶解狀態之分析物2分鐘。監測解離5分鐘。感測器表面之酸性再生使用以30μl/min三次連續注射10mM甘胺酸(pH 1.7)60秒來實現。根據朗格繆爾擬合評估動力學數據。
MR=莫耳比，BL=結合遲延，CL=捕捉水準
在上表中，列舉抗體純系M-05-74及抗體8B8之動力學數據。M-05-74以高功能性MR=0.8結合海瑞古林活化之Her-3 ECD。M-05-74充當海瑞古林捕集阱(亦參見圖式Biacore感測器圖譜實例3b及圖7)。
t1/2解離為0.8分鐘之8B8抗體之複合物穩定性弱。8B8以MR=0.4結合。未鑑別出分離之8B8抗體之解離相及海瑞古林解離。海瑞古林在與8B8相同之時間框內且以相同之速度完全解離出。8B8抗體並不會使海瑞古林解離延遲。
M-05-74以KD=27nM功能上結合(MR=1.5)包含SEQ ID NO：1之HER3 β-髮夾結構的嗜熱棲熱菌SlyD FKBP-Her3。因為抗體8B8並不結合包含HER3 β-髮夾結構之嗜熱棲熱菌SlyD FKBP-Her-3融合多肽，故此抗體靶向除M-05-74外之另一抗原決定基。
圖9為抗HER3/HER4抗體M-05-74、抗HER3抗體M-08-11及抗HER3抗體8B8之biacore感測器圖譜之疊加曲線(來自WO97/35885)，其展示不同結合作用模式。抗HER3/HER4抗體M-05-74捕集t1/2解離為18分鐘之海瑞古林活化之Her-3 ECD(1)，且充當海瑞古林儲槽。抗HER3抗體M-08-11 HER3(無HER4 ECD及HER4 β-髮夾結構交叉反應性之β-髮夾結構黏合劑)會延遲海瑞古林解(2)且產生複合物兩態動力學。8B8抗體(3)並不捕集海瑞古林且不會延遲海瑞古林自Her-3 ECD/海瑞古林複合物解離。因為其為完全朗格繆爾相互作用，故海瑞古林/Her-3 ECD複合物自8B8抗體快速且完全解離為完整複合物。
在圖10中展示此等結合作用模式之流程：1：M-08-11結合海瑞古林活化之Her-3 ECD並且誘導海瑞古林解離延遲，由此M-08-11保留於Her-3 ECD受體複合物中。2：M-05-74結合海瑞古林活化之Her-3 ECD。複合物中捕集獲海瑞古林且抗體保留於複合物中。3：8B8結合海瑞古林活化之Her-3 ECD。整個複合物自抗體解離。
基於肽之2D抗原決定基定位
在另一實施例中，使用CelluSpotsTM合成及抗原決定基定位技術進行基於肽之抗原決定基定位實驗以表徵Her-3 ECD抗原決定基。藉助於與人類Her-1 ECD、Her-2 ECD、Her-3 ECD及Her-4 ECD肽髮夾結構之序列對應之重疊固定之肽片段(長度：15個胺基酸)之文庫進行抗原決定基定位。在圖11中，展示抗原決定基定位之策略及丙胺酸掃描方法。研究HER1(EGFR)ECD、HER2 ECD、HER3 ECD及HER4 ECD之肽髮夾結構序列(β-髮夾結構)(包括其結構性嵌入物)。半胱胺酸經絲胺酸置換。對於經由結合至此類β-髮夾結構對抗體進行抗體選擇，HER3及HER4之β-髮夾結構藉由SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2界定。
各合成之肽偏移了一個胺基酸，亦即其具有14個分別與先前及以下肽重疊之胺基酸。為製備肽陣列，採用Intavis CelluSpotsTM技術。在此方法中，用自動合成器(Intavis MultiPep RS)在合成之後溶解之改質纖維素圓盤上合成肽。接著將共價鍵聯至大分子纖維素之個別肽之溶液點樣於經塗佈顯微鏡載片上。利用9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)化學物質在胺基改質纖維素圓片上在384-孔合成培養盤中逐步進行CelluSpotsTM合成。在各偶合循環中，用DIC/HOBt於DMF中之溶液活化對應胺基酸。在偶合步驟之間，用乙酸酐、二異丙基乙基胺及1-羥基苯并三唑之混合物將未反應胺基封端。在合成完成時，將纖維素圓盤轉移至96孔盤且用三氟乙酸(TFA)、二氯甲烷、三異丙基矽烷(TIS)及水之混合物處理以用於側鏈脫除保護基。在移除裂解溶液之後，用TFA、TFMSA、TIS及水之混合物溶解纖維素結合之肽，用二異丙基醚沈澱且再懸浮於DMSO中。隨後使用Intavis載片點樣機器人將肽溶液點樣至Intavis CelluSpotsTM載片上。
對於抗原決定基分析，依序用乙醇、Tris緩衝鹽水(TBS；50mM Tris、137mM NaCl、2.7mM KCl，pH 8)洗滌如上所述製備之載片， 之後在4℃下用5mL 10×西方阻斷劑(Roche Applied Science)、含2.5g蔗糖之TBS、0.1% Tween 20阻斷16小時。用TBS及0.1% Tween 20洗滌載片且之後在環境溫度下用含1μg/mL對應IGF1抗體之TBS及0.1%Tween 20培育2小時，且隨後用TBS+0.1% Tween 20洗滌。為進行偵測，用抗兔/抗小鼠二級HRP抗體(1：20000，於TBS-T中)培育載片，隨後用化學發光基質流明諾培育且用LumiImager(Roche Applied Science)觀測。定量ELISA陽性SPOT且經由分配對應肽序列鑑別抗體結合抗原決定基。
如圖12中所描繪，M-05-74展示具有胺基酸序列VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)之HER3 ECD抗原決定基，及與具有胺基酸序列VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)之HER4 ECD抗原決定基具有交叉反應性，且對於EGFR及HER2 ECD中之髮夾結構基元無可偵測信號。在8B8抗體下完全無信號可偵測到，因此8B8抗體靶向與髮夾結構肽基元不同之抗原決定基。M-08-11展示具有胺基酸序列PLVYNKLTFQLE之HER3 ECD特定抗原決定基，且不可偵測到與Her家族之另一髮夾結構序列之交叉反應性。
在圖13中，最大程度地有助於抗HER3/HER4抗體M-05-74結合其HER3 ECD結合抗原決定基VYNKLTFQLEP(SEQ ID NO：43)及其HER4 ECD結合抗原決定基VYNPTTFQLE(SEQ ID NO：44)的Ala掃描鑑別之胺基酸帶下劃線/加粗。
實例5 在HER3抗體存在下HRG與HER3-ECD之結合(ELISA)
在4℃下，用含有經SBP標記之HER3-ECD之細胞培養物清液層培育經抗生蛋白鏈菌素塗佈之96孔盤。第二天，用洗滌緩衝劑(PBS+0.05% Tween-20)洗滌各孔三次，且用含有1% BSA之PBS阻斷一小時。再用洗滌緩衝劑洗滌三次之後，將40μl抗體溶液(於Delfia結合 緩衝劑中)添加至各孔中作為所需最終濃度(10-3至103nM，或者10-4至102nM)之2×儲備液。立即添加40μl 20nM銪標記之海瑞古林-β(PeproTech，目錄號100-03)以獲得10nM之最終濃度。在室溫下，於振盪器上培育培養盤兩小時。在用Delfia洗滌緩衝劑洗滌三次之後，添加Delfia增強溶液且於振盪器上培育15分鐘(光保護)。最終，使用時差式螢光量測方案用Tecan Infinite F200讀取器量測培養盤。M-05-74(圖14中稱為M-074)之結合可促進HRG結合至HER3-ECD，直至在650之信號處達到穩定水平。結果展示於圖14中。
實例6 a)抑制ZR-75-1細胞中之HER3磷酸化
根據以下方案在ZR-75-1細胞中進行分析：將細胞於具有10% FCS之RPMI 1640培養基中，以500,000個細胞/孔接種至聚-D-離胺酸塗佈之6孔盤中。培育24小時。藉由抽吸移除培養基，用每孔500μl具有0.5% FCS之RPMI 1640培育隔夜。添加含抗體之500μl具有0.5% FCS之RPMI 1640。培育1小時。添加海瑞古林-β(PeproTech，目錄號100-03))(最終濃度為500ng/ml)10分鐘。為溶解細胞，移除培養基且添加80μl冰冷Triton-X-100細胞溶解緩衝劑且在冰上培育5分鐘。在溶胞物轉移至1.5ml反應管中且在4℃下在14000rpm下離心15分鐘之後，將清液層傳遞至新的反應管中。於SDS裝載緩衝液中含有等量蛋白質之樣品經SDS PAGE分離並且使用半乾西方墨點法印跡於硝化纖維膜。藉由1×NET-緩衝劑+0.25%明膠阻斷膜1小時且分別藉由抗體αPhospho-HER3/ErbB3(Tyr1289)(21D3),Cell Signaling，第4791號偵測pHER3且藉由抗體αErbB3(C-17),Santa Cruz，第sc-285號偵測HER3。在洗滌且藉由POD偶合二次抗體偵測信號之後，對色帶進行光密度掃描。zr-75-1細胞中抗HER3抗體M-05-74對受體磷酸化之抑制百分比(%)示於以下表7中。
b)抑制二價親本M-05-74及M-05-74之Fab片段(Fab-74)之HER3磷酸化
將MCF-7細胞接種於24孔盤(1ml RPMI，10% FCS，3×105個細胞/孔)中且在37℃/5% CO2下培育隔夜。在24小時之後，該培養基用1ml含有0.5% FCS之培養基替換。在48小時之後，添加抗體至最終濃度為10μg/ml、1μg/ml及0.1μg/ml(M-05-74)及6.66μg/ml、0.66μg/ml及0.066μg/ml(Fab-074)。在37℃下培育培養盤50分鐘，接著添加海瑞古林-β(PeproTech，目錄號100-03)至最終濃度為500ng/ml。在37℃/5% CO2下再培育培養盤10分鐘。用PBS洗滌細胞且溶解於40μl含有抑肽酶(10μg/ml)、原釩酸鹽(0.4mM)、苯基甲磺醯氯(1mM)之Triton溶解緩衝劑(1% Triton)中。將26μl收集之溶胞物轉移至反應管中且添加14μl樣品緩衝劑(NuPAGE LDS樣品緩衝劑4×，NuPAGE樣品還原劑10×)。在70℃下培育樣品10分鐘，接著藉由SDS-PAGE(NuPAGE，4-12% Bis-Tris-Mini-凝膠)分析。使用iBlot乾墨點法系統(Invitrogen)執行電吸墨。用磷酸化HER3抗體(α磷酸化Her3，Cellsignaling號4791，兔1：1000)培育硝化纖維膜，隨後用結合HRP之二次抗體(山羊抗兔1：5000，BioRad目錄號：170-6515)培育。使用ECL偵測劑(Amersham RPN2209)在X射線膠片(Roche Lumi-Film化學發光偵測膠片11666657001)上產生信號。研究等莫耳量之抗HER3抗體M-05-74(自融合瘤純化之全長)及抗體Fab-74之Fab片段(藉由番木瓜蛋白酶裂解自全長M-05-74獲得)，Fab片段藉由抗體之番木瓜蛋白酶消化產生。簡言之，1ml含有約2mg/ml抗體之溶液補充有25mM半胱胺酸及70μg番木瓜蛋白酶(Roche)。在37℃下培育1.5小時之後，藉由添加碘乙 醯胺終止消化反應且藉由MabSelect Sure(GE Healthcare)純化反應混合物。藉由尺寸排阻層析(Superdex 200；GE Healthcare)來進一步純化含有Fab之流動溶離份。
MCF7細胞中抗HER3抗體對受體磷酸化之抑制百分比(%)概述於以下表8中。等莫耳濃度之抗體M-05-74(來自融合瘤之全長)及此抗體之Fab片段Fab-74可類似程度地抑制HER3磷酸化。
實例7 抑制MCF7細胞中之HER2/HER3雜二聚體(免疫沈澱及西方墨點法)
將MCF-7細胞接種於6孔盤(2ml RPMI，10% FCS，8×105個細胞/孔)中且生長隔夜。次日，培養基換為2ml含有0.5% FCS之供應不足培養基。第三天，添加抗體至最終濃度為10μg/ml且在37℃下培育培養盤。在50分鐘之後，添加海瑞古林-β(PeproTech，目錄號100-03)至最終濃度為500ng/ml且在37℃下再培育培養盤10分鐘。用PBS洗滌細胞且溶解於250μl含有1%毛地黃皂苷之Triton溶解緩衝劑中。將60μl收集之溶胞物轉移至反應管中且用40μl抗體偶合瓊脂糖(赫賽汀或HER3-抗體208號)及500μl含有0.3%毛地黃皂苷之緩衝劑培育。在4℃下經輪式旋轉器培育反應混合物隔夜。次日，用500μl含有0.3%毛地黃皂苷之緩衝劑洗滌反應混合物三次。在最後洗滌之後，丟棄清液層且添加10μl 4×裝載緩衝劑。在70℃下培育管10分鐘且因此將清液層裝載於凝膠上進行SDS-PAGE。在以下半乾西方墨點法之後，用抗HER3/HER4抗體M-05-74(圖15中之M-074)培育含有用HER2抗體免疫 沈澱之樣品的膜，且反之亦然。接著用HRP結合二次抗體培育膜且使ECL信號轉移於X射線膠片上。結果顯示於圖15中，展示藉由M-05-74強烈抑制HER2/HER雜二聚體形成(HER2/HER雜二聚)。
實例8 在MDA-MB-175細胞中M-05-74抑制腫瘤細胞增殖.
評估細胞增生分析中使用MDA-MB-175細胞(VII人類乳癌細胞，ATCC目錄號HTB-25)之HER3抗體M-05-74之抗腫瘤功效。將每孔20,000個細胞接種於有含有10% FCS之DMEM/F12細胞培養基之無菌96孔組織培養盤中，且在37℃±1℃、5%±1% CO2下培育一天。細胞為約3天之雙倍時間的緩慢成長細胞。添加系列稀釋之抗HER3抗體且再培育6天。接著使用alamarBlue®讀取器評估細胞存活率。計算EC50值。
實例9 抗HER3抗體M-05-74之活體內抗腫瘤功效
可在移植於SCID beige上之各種腫瘤來源(例如SCCHN及胰臟癌)之基於細胞之模型中偵測抗HER3抗體M-05-74(M-074)之活體內抗腫瘤功效。作為實例，展示SCCHN異種移植模型FaDu(基於細胞株)之數據。
測試劑
提供自融合瘤細胞表現並純化之M-05-74作為儲備溶液，來自Roche,Penzberg,Germany。抗體緩衝劑包括組胺酸。用來自儲備先前注射劑之緩衝劑適當稀釋抗體溶液。
細胞株及培養條件
FaDu人類HNSCC細胞最初獲自ATCC。通常在37℃下、在水飽和氣氛中、在5% CO2下、於補充有10%胎牛血清、2mM L-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉及0.1mM NEAA之MEM伊格爾培養基中培養腫瘤細胞株。每三天用胰蛋白酶/EDTA 1×分裂執行培養物繼代。
動物
雌性SCID beige或裸小鼠購自飼養員(例如Charles River,Sulzfeld,Germany)且根據已提交之準則(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小時光/12小時暗之日循環維持在無特定病原體條件下。實驗研究方案係由地方政府評審及批准。到達後，使動物維持於動物設施之隔離部分中一週，以習慣新環境且以供觀測。在常規基礎上進行連續健康監測。任意地提供膳食(Provimi Kliba 3337)及水(酸化pH 2.5-3)。
每日控制動物之臨床症狀且偵測副作用。監測整個實驗，記錄動物之體重。
在細胞移植之後，在將動物隨機分組之後，當中值腫瘤尺寸為約100-150mm3時開始進行動物處理。抗體每7天，即每週一次以10mg/kg之單一藥劑形式腹膜內投與視模型而定維持若干週。以相同之天數投與對應媒劑。
在研究之第10天至第24天用抗體M-05-74處理帶有FaDu HNSCC異種移植物之小鼠。因此，用H-74抗體處理展示顯著抗腫瘤功效，其中皮下FaDu異種移植物幾乎腫瘤生長停滯。計算腫瘤生長抑制(TGI)為89%。
用M-05-74(10mg/kg，每7天×3，腹膜內)處理幾乎使FaDu腫瘤生長停滯。結果示於圖17中，其中M-05-74稱為M-074。
實例10 產生M-05-74-Fab綠膿桿菌外毒素結合物(M-05-74-PE)
基於序列SEQ ID NO：45、46、47、48(或49)之M-05-74之Fab片 段、PE24變異體及結合至綠膿桿菌外毒素變異體PE24LR8M之M-05-74之Fab片段之表現、純化及複性。
Fab(例如用於分選酶偶合)之表現-表現載體
對於所述Fab片段之表現，應用基於有或無CMV-內含子A促進劑下之cDNA組織或基於有CMV促進劑下之基因組組織之短暫表現(例如HEK293-F)細胞之表現質體之變異體。
除了抗體表現卡匣之外，載體亦含有：- 允許在大腸桿菌中複製此質體之複製起點，及- β-內醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌以安比西林(ampicillin)抗性。
抗體基因之轉錄單元由以下要素構成：- 5'端之獨特限制性位點，- 人類巨細胞病毒之即刻早期強化子及啟動子，- 隨後為在cDNA組織情況下之內含子A序列，- 人類抗體基因之5'-未轉譯區；- 免疫球蛋白重鏈信號序列，- 呈cDNA或基因組組織及免疫球蛋白外顯子-內含子組織之人類抗體鏈，- 具有聚腺苷酸化信號序列之3'未轉譯區，及- 3'端之獨特限制性位點。
如下所述包含抗體鏈之融合基因藉由PCR及/或基因合成產生且藉由已知重組方法及技術藉由例如使用各別載體中之獨特限制性位點連接核酸區段組合。藉由DNA定序檢驗經次選殖之核酸序列。對於短暫轉染，較大量質體藉由質體製備方式自轉型之大腸桿菌培養物(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)來製備。
細胞培養技術
使用如下所述之標準細胞培養技術：Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.及Yamada,K.M.(編)，John Wiley & Sons,Inc。
Fab片段藉由在懸浮液中生長之HEK29-F細胞中短暫共轉染重鏈及輕鏈之表現質體之來表現，如下所述。
HEK293-F系統中之短暫轉染
Fab片段根據製造商之說明書使用HEK293-F系統(英傑公司)藉由用各別質體(例如編碼重鏈及經修飾之重鏈，以及對應輕鏈及經修飾之輕鏈)短暫轉染來產生。簡言之，搖振盪燒瓶或攪拌之醱酵槽中在無血清FreeStyleTM293表現培養基(Invitrogen)於懸浮液中生長之HEK293-F細胞(Invitrogen)用四種表現質體及293-FreeTM(Novagen)或Fectin(Invitrogen)之混合物轉染。對於2L振盪燒瓶(Corning)，將HEK293-F細胞以1.0E*6個細胞/毫升之密度接種於600mL中且在120rpm、8% CO2下進行培育。第二天，細胞以約1.5E*6個細胞/毫升之細胞密度用A)具有600μg分別編碼重鏈或經修飾之重鏈及等莫耳比對應輕鏈之總質體DNA(1μg/mL)的20mL Opti-MEM(Invitrogen)，及B)20ml Opti-MEM+1.2mL 293-Free(Novagen)或Fectin(2μl/mL)之42mL混合物轉染。在醱酵過程中根據葡萄糖消耗添加葡萄糖溶液。在5-10天之後收集含有所分泌抗體之清液層，且直接自該清液層中純化出抗體或將該清液層冷凍並儲存。
用於分選酶偶合之綠膿桿菌外毒素變異體PE24-LR8M之表現-表現載體
對於PE24-LR8M之表現，使用大腸桿菌表現質體。
除用於綠膿桿菌外毒素A域III之表現卡匣之外，載體亦含有：- 載體pBR322在大腸桿菌中複製之複製起點(根據Sutcliffe,G.，等人，Quant.Biol.43(1979)77-90)，
- 來自大腸桿菌之lacI抑制劑基因(Farabaugh,P.J.,Nature 274(1978)765-769)，- 編碼乳清酸核苷5'-磷酸去羧酶之釀酒酵母之URA3基因(Rose,M.等人Gene 29(1984)113-124)，其允許藉由補充大腸桿菌pyrF缺失菌株(尿嘧啶營養缺陷體)進行質體選擇。
毒素基因之轉錄單元由以下要素構成：- 5'端之獨特限制性位點，- T5混合促進劑(T5-PN25/03/04混合促進劑，根據Bujard,H.等人，Methods.Enzymol.155(1987)416-433及Stueber,D.，等人，Immunol.Methods IV(1990)121-152)，其包括合成核糖體結合位點，根據Stueber,D.等人(參見前文)，- 具有N端偶合tag，隨後為弗林蛋白酶位點之綠膿桿菌外毒素A域III(SEQ ID NO：45綠膿桿菌外毒素變異體PE24LR8M_3G，包括用於分選酶偶合之GGG連接子)，- 兩個噬菌體源轉錄終止子：λ-T0終止子(Schwarz,E.，等人，Nature 272(1978)410-414)及fd-終止子(Beck E.及Zink,B.Gene 1-3(1981)35-58)，- 3'端之獨特限制性位點。
在大腸桿菌分批進料方法中綠膿桿菌外毒素A構築體變異體PE24-LR8M_3G於化學成分確定之培養基上之培養及表現
對於PE24-LR8M_3G_Ecoli(25kDa)之表現，採用能夠藉由補充大腸桿菌營養缺陷體(PyrF)進行無抗生素質體選擇之大腸桿菌宿主/載體系統(EP 0 972 838及US 6,291,245)。
大腸桿菌K12菌株藉由電穿孔由表現質體來轉型。首先使經轉型大腸桿菌細胞在37℃下於瓊脂培養盤上生長。將選取自此培養盤之群落轉移至3mL滾動培養物中且在37℃下生長至光學密度為1-2(在578 nm下量測)。接著，1000μl培養物與1000μl無菌86%丙三醇混合且立即在-80℃下冷凍以長期存儲。此純系之恰當產物表現首先在小規模振盪燒瓶實驗中得以證實且在傳遞至10L醱酵槽中之前用SDS-Page進行分析。
預培養：
對於預醱酵，使用化學成分確定之培養基。對於預醱酵，在具有四個檔板之1000ml愛倫美氏燒瓶中用出自初始晶種庫安瓿之1.0ml接種220ml培養基。經旋轉振盪器在32℃及170rpm下執行培養8小時直至獲得2.9之光學密度(578nm)。使用100ml預培養物接種10L生物反應器之分批培養基。
醱酵：
對於在10l Biostat C,DCU3醱酵槽(Sartorius,Melsungen,Germany)中醱酵，使用化學成分確定之分批培養基。將所有組分溶解於去離子水中。用於調節pH值之鹼性溶液為補充有11.25g/l L-甲硫胺酸之12.5%(w/v)NH3水溶液。
以4.2l無菌分批培養基加100ml來自預培養之接種體為起始物質，在31℃、pH 6.9±0.2、800毫巴背壓及10l/min之初始通氣速率下執行分批醱酵。在整個醱酵中藉由使攪拌棒速度增至1500rpm使相對溶氧值(pO2)保持於50%。在藉由溶氧值急劇增加指示，最初補充之葡萄糖耗盡之後，溫度偏移為25℃，且15分鐘後，以兩種饋料(分別60及14g/h)作為起始物質醱酵進入分批進料模式。饋料2之速率保持恆定，而饋料1之速率隨預定進料特徵逐步增加，在7小時內由60增至最終160g/h。當二氧化碳廢氣濃度水準高於2%時，通氣速率在5小時內由10連續增加至20l/min。重組PE24-LR8M_3G_Ecoli蛋白質之表現藉由添加2.4g IPTG在光學密度約120下誘導。在細胞質內靶蛋白可溶性表現。
在培養24小時之後，實現209之光學密度且使整個培養液冷卻至4-8℃。經由用流過離心機(13,000rpm，13l/h)離心來收集細菌，且將所獲得之生物質儲存於-20℃下直至進一步加工(細胞破壞)。產量為每公升67.5公克幹細胞。
分析產物形成：
自醱酵槽抽取樣品，用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析一種誘導前之樣品及另一種誘導蛋白質表現後之指定時間點的樣品。根據每一樣品，將相同量之細胞(OD標靶=10)懸浮於5mL PBS緩衝劑中且在冰上經由音波處理破壞。接著離心(15,000rpm，5分鐘)100μL各懸浮液且取出各清液層並轉移至單獨小瓶中。由此辨別可溶與不可溶之表現靶蛋白。向各清液層(為可溶性蛋白質溶離份)中添加100μL且向各集結粒(為不可溶蛋白質溶離份)中添加200μL SDS樣品緩衝劑(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)。在95℃下在劇烈混合下加熱樣品15分鐘以溶解並減少樣品中之所有蛋白質。冷卻至室溫後，將5μL各樣品轉移至4-20% TGX Criterion Stain Free聚丙烯醯胺凝膠(Bio-Rad)中。另外應用5μl分子量標準物(超精度蛋白質標準物，Bio-Rad)。
在200V下運作電泳60分鐘，且此後將凝膠轉移至GelDOC EZ成像器(Bio-Rad)中且用UV輻射處理5分鐘。使用影像實驗室分析軟體(Bio-Rad)分析凝膠影像。蛋白質表現之相對定量藉由比較產物色帶之體積與分子量標準物之25kDa色帶之體積進行。
在大腸桿菌進料分批法中抗體片段輕鏈構築體(VL)及抗體片段重鏈綠膿桿菌外毒素A變異體融合體(Fab-PE24)於化學成分確定之培養基上之培養及表現
對於Fab-輕鏈(23.4kDa)及Fab-重鏈PE24融合體(48.7kDa)之表現，採用能夠藉由補充大腸桿菌營養缺陷體(PyrF)進行無抗生素質體選擇之大腸桿菌宿主/載體系統(EP 0 972 838及US 6,291,245)。
大腸桿菌K12菌株藉由電穿孔由各別表現質體轉型。首先使經轉型大腸桿菌細胞在37℃下於瓊脂培養盤上生長。對於各轉型，將選取自此培養盤之群落轉移至3mL滾動培養物中且在37℃下生長至光學密度為1-2(在578nm下量測)。接著，1000μl培養物與1000μl無菌86%丙三醇混合且立即在-80℃下冷凍以長期存儲。此等純系之適當產物表現首先在小規模振盪燒瓶實驗中得以證實且在傳遞至10L醱酵槽中之前用SDS-Page進行分析。
預培養：
對於預醱酵，使用化學成分確定之培養基。對於預醱酵，在具有四個檔板之1000ml愛倫美氏燒瓶中用出自初始晶種庫安瓿之1.0ml接種220ml培養基。經旋轉振盪器在37℃及170rpm下執行培養9小時直至獲得7至8之光學密度(578nm)。使用100ml預培養物接種10L生物反應器之分批培養基。
醱酵(RC52#003)：
對於在10l Biostat C,DCU3醱酵槽(Sartorius,Melsungen,Germany)中醱酵，使用化學成分確定之分批培養基。用於調節pH值之鹼性溶液為補充有11.25g/l L-甲硫胺酸之12.5%(w/v)NH3水溶液。
以4.2l無菌分批培養基加100ml來自預培養之接種體為起始物質，在31℃、pH 6.9±0.2、800毫巴背壓及10l/min之初始通氣速率下執行分批醱酵。在整個醱酵中藉由使攪拌棒速度增至1500rpm使相對溶氧值(pO2)保持於50%。在藉由溶氧值急劇增加指示，最初補充之葡萄糖耗盡之後，溫度偏移為37℃，且15分鐘後，以兩種饋料(分別60及14g/h)作為起始物質醱酵進入分批進料模式。饋料2之速率保持恆定，而饋料1之速率隨預定進料特徵逐步增加，在7小時內由60增至最終160g/h。當二氧化碳廢氣濃度水準高於2%時，通氣速率在5小時內由10連續增加至20l/min。作為位於細胞質中之不可溶內含體之重 組靶標蛋白質之表現藉由添加2.4g IPTG在光學密度約40下誘導。
在培養24小時之後，實現185之光學密度且使整個培養液冷卻至4-8℃。經由用流過離心機(13,000rpm，13l/h)離心來收集細菌，且將所獲得之生物質儲存於-20℃下直至進一步加工(細胞破壞)。產量介於每公升40與60公克幹細胞之間。
分析產物形成：
自醱酵槽抽取樣品，用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析一種誘導前之樣品及另一種誘導蛋白質表現後之指定時間點的樣品。根據每一樣品，將相同量之細胞(OD標靶=10)懸浮於5mL PBS緩衝劑中且在冰上經由音波處理破壞。接著離心(15,000rpm，5分鐘)100μL各懸浮液且取出各清液層並轉移至單獨小瓶中。由此辨別可溶與不可溶之表現靶蛋白。向各清液層(為可溶性蛋白質溶離份)中添加100μL且向各集結粒(為不可溶蛋白質溶離份)中添加200μL SDS樣品緩衝劑(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)。在95℃下在劇烈混合下加熱樣品15分鐘以溶解並減少樣品中之所有蛋白質。冷卻至室溫後，將5μL各樣品轉移至4-20% TGX Criterion Stain Free聚丙烯醯胺凝膠(Bio-Rad)中。另外應用5μl分子量標準物(超精度蛋白質標準物，Bio-Rad)及3種量(0.3μl、0.6μl及0.9μl)之具有已知靶蛋白濃度(0.1μg/μl)之定量標準物。
在200V下運作電泳60分鐘，且此後將凝膠轉移至GelDOC EZ成像器(Bio-Rad)中且用UV輻射處理5分鐘。使用影像實驗室分析軟體(Bio-Rad)分析凝膠影像。在三種標準物之情況下，在係數>0.99下計算線性回歸曲線，且由此計算原始樣品中靶蛋白之濃度。
純化、分選酶偶合及複性(M-05-74之Fab片段、PE24變異體及結合至綠膿桿菌外毒素變異體PE24LR8M之M-05-74之Fab片段) Fab片段
Fab片段根據製造商之說明書藉由親和性層析(Ni SepharoseTM高效HisTrapTM)來純化。簡言之，將清液層裝載於用50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl平衡之管柱上。用pH 7.0之相同緩衝劑用含有4mM咪唑，隨後梯度高達100mM咪唑之洗滌步驟執行蛋白質溶離。彙集含有所需Fab片段之溶離份且針對20mM其、140mM NaCl(pH 6.0)透析。
用於分選酶偶合之PE24
表現PE24之大腸桿菌細胞藉由高壓均質化溶解(若需要細節：Christian Schantz)於20mM Tris、2mM EDTA(pH 8.0)及完全蛋白酶抑制劑混合物錠劑(Roche)中。過濾溶胞物且裝載於用20mM Tris(pH 7.4)平衡之Q瓊脂糖FF(GE Healthcare)上。用相同緩衝劑在梯度高達500mM NaCl下溶離蛋白質。藉由SDS PAGE鑑別含有PE24之溶離份。濃縮合併之彙集物且應用於用20mM Tris、150mM NaCl(pH 7.4)平衡之HiLoadTM SuperdexTM75(GE Healthcare)。根據SDS PAGE彙集含有PE24之溶離份且冷凍於-80℃下。
Fab片段與PE24之分選酶偶合
使用Amicon®Ultra 4離心過濾器裝置(Merck Millipore)分別將Fab片段及PE24透濾至50mM Tris、150mM NaCl、5mM CaCl2(pH 7.5)中且濃縮至5-10mg/ml。。1：1：0.8之莫耳比組合兩種蛋白質及分選酶。在37℃下培育一小時之後，將混合物裝載於用50mM磷酸鈉(pH 8.0)、300mM NaCl平衡之Ni SepharoseTM高效HisTrapTM上。用相同緩衝劑(pH 7.0)在梯度高達100mM咪唑下執行溶離。濃縮含有最終產物Fab-PE24之流過溶離份且裝載於20mM Tris、150mM NaCl(pH值7.4)中之HiLoadTM SuperdexTM200(GE Healthcare)上。彙集含有所需偶合蛋白質之溶離份且儲存於-80℃。使用可溶性金黃色葡萄球菌分選酶A(SEQ ID NO：50)作為分選酶。使用以下表現質體表現並純化可溶性 金黃色葡萄球菌分選酶A：分選酶基因編碼N端截短之金黃色葡萄球菌分選酶A(60-206)分子。用於在HEK293細胞中短暫表現可溶性分選酶之表現質體除可溶性分選酶表現卡匣以外包含來自載體pUC18之複製起點，其允許在大腸桿菌中複製此質體，及β-內醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌以安比西林抗性。可溶性分選酶之轉錄單元包含以下功能性要素：-包括內含子A之人類巨細胞病毒(P-CMV)之即刻早期強化子及啟動子，-人類重鏈免疫球蛋白5'未轉譯區(5'UTR)，-鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列，-編碼N端截短之金黃色葡萄球菌分選酶A之核酸，及-牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
源自大腸桿菌內含體之Fab-PE24之複性
VH-PE24及VL-Cκ之內含體分別溶解於8M鹽酸胍、100mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH 8.0)及100mM二硫蘇糖醇(DTT)中。在室溫下12-16小時之後，將溶解化物之pH值調節至3.0，離心之溶液針對8M鹽酸胍、10mM EDTA(pH 3.0)進行透析。藉由縮二脲反應測定蛋白質濃度，藉由SDS PAGE評估包涵體製劑之純度。在兩個步驟中將等莫耳量之兩種鏈稀釋至0.5M精胺酸、2mM EDTA(pH 10)及1mM GSH/1mM GSSG中達至最終濃度為0.2-0.3mg/ml。在4-10℃下之12-16小時後，用H2O將複性蛋白質稀釋至<3mS/cm且裝載於用20mM Tris/HCl(pH 7.4)平衡之Q瓊脂糖FF(GE healthcare)上。用相同緩衝劑在梯度高達400mM NaCl下執行溶離。藉由SDS-PAGE及分析型尺寸排阻層析(SEC)鑑別含有恰當產物之溶離份。濃縮彙集之溶離份且裝載於20mM Tris、150mM NaCl(pH 7.4)或者20mM組胺酸、140mM NaCl(pH 6.0)中之HiLoadTM SuperdexTM200(GE Healthcare)上。根據 分析型SEC分析溶離份且彙集且儲存於-80℃。
根據SEQ ID NO：46及49，M-05-74之Fab片段與綠膿桿菌外毒素變異體PE24LR8M之免疫結合物(M-05-74-PE)可重組表現、純化且亦複性為直接PE24LR8M融合體。
實例11 藉由M-05-74-Fab-綠膿桿菌外毒素結合物(M-05-74-PE)對不同腫瘤細胞株實施細胞殺死
將HER3過度表現A549細胞接種於白色96孔盤(扁平、透明底部，1×104個細胞/孔)中且在RPMI(10%FCS)中生長隔夜。次日，培養基換為50μl供應不足培養基(RPMI，0.5% FCS)。至少4小時之後，添加5μl海瑞古林-β(PeproTech，目錄號100-03)(HRG β)至最終濃度為500ng/ml。添加50μl Fab-74-PE溶液至最終濃度為10、3.3、1.1、0.37、0.12、0.04、0.014、0.005及0.002μg/ml。培育培養盤72小時。在24小時及48小時之後，再次添加5μl海瑞古林-β至最終濃度為500ng/ml。在72小時之後，用Tecan Infinite F200讀取器使用CellTiter-Glo發光細胞存活率分析藉由普洛麥格(Promega)(目錄號G7571)量測發光。在不存在HRG β下之M-05-74-Fab-綠膿桿菌外毒素結合物(M-05-74-PE)之EC50值為：1.93μg/ml且在存在HRG β下為0.13μg/ml。
實例12a 抗HER3抗體M-05-74之人類化變異體
使用鼠類抗體M-05-7重鏈及輕鏈可變結構域檢索類似人類抗體可變結構域。根據200個各鏈所獲得之結果，約一半因來自非人類來 源而被排斥。分析所有剩餘人類抗體之涉及VH/VL界面之構架內之關鍵殘基及對於CDR環結構重要之殘基。使此等對於VH/VL界面及典型環結構重要之關鍵殘基儘可能維持於人類化變異體中，然而有時亦包括此等位置之某些改變。將來自鼠類抗體鏈之CDR移植至此等人類抗體構架中。基於先前標準以及T細胞抗原決定基計算機篩檢之結果選擇前五個移植域以進行進一步研究。因此，將小鼠抗HER3抗體M-05-74人類化，得到以下M-05-74之人類化變異體VH及VL域：
根據此等五個VH及VL域之25種理論上可能存在之組合，如下所選最有效黏合劑：為尋找具有有利動力學特性之<Her3>M-05-74抗體之最佳化人類化變異體，如上所述設計各重鏈及輕鏈之五個變異體。在scFv-核糖體顯示構築體中產生所有組合(總計25種)之所獲得之序列。
25種scFv構築體藉由側接引子擴增以獲得對於核糖體顯示所需之線性模板DNA。用瓊脂糖凝膠電泳純化各PCR產物，隨後根據製造商之說明書用Qiagen MinElute套組萃取。測定產物DNA濃度且200ng所有線性模板DNA之等莫耳混合物為在37℃下活體外轉錄/轉譯60分鐘之基礎。所用套組包含PURExpress活體外蛋白質合成套組(NEB)，包括兩種二硫鍵增強劑(DBE 1及2)。在每樣品雙倍反應量之情況下處理 兩種反應樣品。在後續淘選步驟中第一樣品包括經生物素標記且經海瑞古林活化之靶標(Her3-ECD)。在淘選步驟中，第二樣品為無靶蛋白之陰性對照。兩種樣品進行相同處理。在4℃下在有所用磁性珠粒(抗生蛋白鏈菌素M-270戴諾磁珠，Life Technologies)下使轉錄及轉譯後獲得之三元複合物彙集物(mRNA-核糖體-scFv變異體)經歷預淘選步驟30分鐘，以移除非特異性結合變異體。藉由離心移除預淘選珠粒且將具有剩餘三元複合物之清液層添加至製備之靶標/海瑞古林混合物中以在淘選步驟中在4℃下培育30分鐘。在淘選步驟之前培育1：6莫耳比之靶標/海瑞古林複合物60分鐘以獲得受體域之打開構形且使74親本抗體之抗原決定基暴露。淘選反應中經生物素標記之Her3-ECD之最終濃度為100nM。下文中所有所用之緩衝劑含有300nM海瑞古林。
經由靶標生物素taq及上文所提及之抗生蛋白鏈菌素珠粒捕捉靶標及所有結合三元複合物。在4℃下用於捕獲之培育時間為20分鐘。利用珠粒之磁特性，可藉由重複培育及移除洗滌緩衝劑來洗滌複合物。為移除弱結合變異體，在洗滌步驟內增加洗滌壓力。在其間之磁場中捕獲2分鐘之情況下採用總計五個用500μL洗滌緩衝劑(含有海瑞古林)之洗滌步驟(2、4、5、5及1分鐘)。最後一步用以將剩餘強結合變異體傳遞於乾淨新反應管中以進行溶離步驟(10分鐘，4℃，100μL含有EDTA之溶離緩衝液)，隨後離心，以移除珠粒。清液層中之所獲得之RNA根據製造商之說明書用Qiagen RNEasy RNA純化套組進行純化。為確保隨後藉由反轉錄產生之DNA之來源，預先使RNA經歷DNA酶消化。用12μL純化之RNA起始分解(Ambion DNA-free套組)且在37℃下培育30分鐘。在移除DNA酶之後，各用12μL起始每樣品之三個反轉錄反應且在37℃下培育一小時。將12μL各消化RNA樣品(消化產物)用作第一PCR之陰性對照以證明痕量DNA完全移除。
彙集各樣品之反轉錄反應之產物且用以起始五個100μL PCR反 應以使DNA選擇彙集物擴增。使產物彙集且藉由凝膠電泳(1%製備型瓊脂糖凝膠及具有1μL樣品體積之分析型Agilent DNA 7500晶片)且根據製造商之方案藉由Qiagen MinElute套組純化。圖1中之所獲得之凝膠影像明顯展示在泳道1中富含所選構築體DNA，且在泳道2不富含陰性對照(無靶標之淘選)。如所預期，剩餘對照亦為陰性對照。DNA分解完成(對於靶標為泳道3，對於本底為泳道4)。因此，泳道1中之所有所獲得之DNA均源自淘選步驟中所選之結合變異體及其對應RNA。 反轉錄之陰性對照與PCR之陰性對照皆不展示色帶。泳道7展示純化後之彙集PCR反應之產物。
使PCR產物擴增以產生足夠DNA進行選殖。在37℃下用於CutSmart緩衝劑中之MfeI-HF及NotI-HF(所有均來自NEB)消化選擇彙集物及表現載體Her_scFv_huFc(各1μg)一小時。首先純化選擇插入物及切割載體，接著在室溫下用NEB Quick接合酶接合30分鐘。切割插入物與載體之莫耳比為5：1(25ng切割插入物及50ng切割載體)。兩微升接合產物直接用以轉型50μL DH5α(Life Technologies)勝任細胞。 生長之後，將50μL接種於具有安比西林抗性(LBamp)之LB培養盤上且在37℃下培育16小時。在37℃下使用34個群落接種5mL LBamp培養基16小時。收集細胞且根據製造商之說明書用Qiagen Miniprep套組分離DNA且將300ng各樣品之質體DNA傳送至Sequiserve GmbH以進行定序。
結果-<Her3>M-05-74抗體之最佳化人類化變異體
定序結果展示富含一種特定變異體：VH-A/VL-D。自34個樣品獲得對應序列六次，其明顯指示在上述分析中與HER-ECD之最有效結合特性。
此外，組合VH-A/VH-B及VH-A/VH-E出現兩次且因此與剩餘較小富集型VH/VL組合相比展示一些優良之與HER3 ECD之結合特性。
令人驚奇地，所有富集型變異體包括VH-A。因此，VH-A，尤其較佳組合VH-A/VL-D、VH-A/VH-B及VH-A/VH-E為<Her3>M-05-74之所有HER3結合人類化變異體之關鍵特徵。
剩餘24個序列均不同且特徵為具有微小缺失及/或點突變之組合。三個序列不可進行完全編輯且不進行分析。
組合VH-A/VL-D、VH-A/VH-B及VH-A/VH-E中之每一者表現於人類IgG1同型(具有Cκ輕鏈恆定域)中或者例如表現為具如上所述有綠膿桿菌外毒素(免疫毒素)之融合蛋白。如上例如實例2、3、5、6、7、8、9、11中所述或以下實例13中所述測定結合特徵及生物特性。
實例12b 抗HER3抗體M-05-74之人類化變異體之結合
為在存在或不存在配位體海瑞古林下研究抗HER3抗體M-05-74之人類化變異體VH-A/VL-D(實例12a中所述)與HER3-ECD及HER4-ECD之結合，在37℃下使用Biacore 3000裝置(GE Healthcare)進行SPR分析(表11)。
由於抗原決定基可行性增加，故抗HER3抗體M-05-74之人類化變 異體VH-A/VL-D較佳鍵結至配位體活化之ECD複合物。其以K D 10nM之親和力結合HER3-ECD/HRG複合物。
令人驚奇地，抗-HER3抗體M-05-74之人類化變異體VH-A/VL-D展示與親本抗體M-05-74((K D 4nM))相比強烈降低之HER4-ECD/HRG反應性(K D 211nM)，同時保持其HER3-ECD/HRG反應性(與7nM相比為K D 10nM)。
實例13 藉由M-05-74-Fab-綠膿桿菌外毒素結合物(M-05-74-PE)實現活體內腫瘤細胞生長抑制
將用編碼人類HER3之表現載體穩定轉染之人類A431-B34非小細胞肺癌細胞株皮下接種至雌性SCID beige小鼠之右側腹中(每個動物1×107個細胞)。
在腫瘤接種後21天，將動物隨機分組且分配處理組及媒劑組中，從而得到每組約110mm3之中值腫瘤體積。在同一天，用M-05-74-Fab-綠膿桿菌外毒素結合物(M-05-74-PE)(1.0mg/kg)靜脈內處理動物2個週期，各週期由3q7d(每隔一天)組成。對照組接受媒劑(Tris緩衝劑)。兩個週期藉由一週停止處理隔開。
根據NCI方案計算原發腫瘤體積(TV)(TV=(長度×寬度2)/2)，其中「長度」及「寬度」為以mm計之腫瘤塊之長及短直徑(Corbett等人，1997)。由分級(腫瘤接種之後21天)直至腫瘤接種之後42天進行計算，且將值記錄為中值及定義為第三及第一四分位數之差異的四分位數間距(IQR)。
為在治療時段期間計算腫瘤生長抑制(TGI)百分比，使每一處理組與其各別媒劑對照組相比。TV 第z天 表示指定研究日(第z天)個別動物之腫瘤體積，且TV 第x天 表示分級日(第x天)個別動物之腫瘤體積。
應用下式：
使用非參數法施用具有信賴區間(CI)之處理組與對照組比率(TCR)之計算。具有四分位數間距之中值腫瘤體積之結果示於圖19中。M-05-74-Fab-綠膿桿菌外毒素結合物(M-05-74-PE)之腫瘤生長抑制為66%，TCR為0.509(CI：0.33-0.734)。
實例14 WO2012/22814中所述之與抗HER3抗體MOR09823(2)相比抗體M-05-74(1)與TtSlyDcys-Her3(SEQ ID NO：18)之結合.
Biacore T200儀器(GE Healthcare)中安置有CM5系列感測器且根據製造商之說明書用HBS-ET+緩衝劑(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% w/v Tween 20)校正。樣品緩衝劑為補充有1mg/ml CMD(羧甲基葡聚糖)之系統緩衝劑。系統在37℃下操作。雙抗體捕捉系統建立於感測器表面上。根據製造商之說明書使用EDC/NHS化學方法將6500RU mAb<M-IgG>R固定於流槽上。使用1M乙醇胺將感測器去活化。流槽1充當參比且用抗TSH IgG1抗體以10μl/min捕捉1分鐘。在流槽2上，以10μl/min捕捉M-5-74 1分鐘。在流槽3上，以10μl/min捕捉鼠類抗人類FC全抗體1分鐘，隨後以10μl/min注射抗HER3抗體M-05-74(1)或抗HER3抗體MOR09823抗體1分鐘。流動速率設定為60μl/min。注射濃度為0nM及150nM之呈溶解狀態之分析物TtSlyDcys-HER3(SEQ ID NO：18)5分鐘且監測解離600秒。藉由用10mM甘胺酸(pH 1.7)緩衝劑以10μl/min注射一次3分鐘完全更新感測器。
圖20描述感測器圖譜疊加曲線，其展示150nM TtSlyDcys-Her3及緩衝劑之結合信號。以上疊加曲線展示在150nM TtSlyDcys-Her3(1)下抗體M-5-74發生結合。MOR09823抗體並未結合TtSlyDcas-Her3 (2)。(3)展示TtSlyDcas-HER3相對於mAb<M-IgG>R捕捉表面之本底結合信號。描述於WO2012/22814中之抗HER3抗體MOR09823(2)在150nM TtSlyDcys-Her3下並未展示任何相互作用。陽性對照抗體M-05-74(1)展示相對於TtSlyDcas-Her3顯著結合。當注射150nM TtSlyDcys(無HER-3插入)時未測出與兩種抗體之相互作用(數據未列)。
<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
<120> 結合HER3之β-髮夾結構的抗HER3抗體
<130> P32122-FT
<150> EP14168335.9
<151> 2014-05-14
<160> 58
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
<210> 3
<211> 1323
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
<210> 4
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
<210> 5
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
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<213> 智人
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 嗜熱棲熱菌
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<213> 人工
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<213> 人工
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<213> 人工
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<223> TgSlyDser-Her4
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<213> 人工
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<223> TgSlyDcys-Her4
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> M-05-74之重鏈可變結構域VH之人類化變異體A(VH-A)
<400> 33
<210> 34
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
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<223> M-05-74之重鏈可變結構域VH之人類化變異體B(VH-B)
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> M-05-74之重鏈可變結構域VH之人類化變異體C(VH-C)
<400> 35
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> M-05-74之重鏈可變結構域VH之人類化變異體D(VH-D)
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> M-05-74之重鏈可變結構域VH之人類化變異體E(VH-E)
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<213> 人工
<220>
<223> M-05-74之輕鏈可變結構域VL之人類化變異體A(VL-A)
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<213> 人工
<220>
<223> M-05-74之輕鏈可變結構域VL之人類化變異體B(VL-B)
<400> 39
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<212> PRT
<213> 人工
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<223> M-05-74之輕鏈可變結構域VL之人類化變異體C(VL-C)
<400> 40
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> M-05-74之輕鏈可變結構域VL之人類化變異體D(VL-D)
<400> 41
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> M-05-74之輕鏈可變結構域VL之人類化變異體E(VL-E)
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
<210> 45
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 綠膿桿菌外毒素變異體PE24LR8M_3G(包括GGG連接子)
<400> 45
<210> 46
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> M-05-74之輕鏈(M-05-74_LC)
<400> 46
<210> 47
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 具有分選酶tag之M-05-74之重鏈HC(M-05-74_HC)
<400> 47
<210> 48
<211> 460
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 結合至綠膿桿菌外毒素變異體PE24LR8M之M-05-74之重鏈HC(Fab-074-PE重鏈1)
<400> 48
<210> 49
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 結合至綠膿桿菌外毒素變異體PE24LR8M之M-05-74之重鏈HC(Fab-074-PE重鏈2)作為直接PE24LR8M融合體
<400> 49
<210> 50
<211> 147
<212> PRT
<213> 金黃色葡萄球菌
<400> 50
<210> 51
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 51
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 52
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
<210> 55
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
<210> 58
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58

Claims (18)

  1. 一種分離之抗體，其結合人類HER3，其中該抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH。
  2. 一種分離之抗體，其結合人類HER3，其中該抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH；及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：41之可變輕鏈域VL、具有胺基酸序列SEQ ID NO：39之可變輕鏈域VL、或具有胺基酸序列SEQ ID NO：42之可變輕鏈域VL。
  3. 一種分離之抗體，其結合人類HER3，其中該抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH；及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：41之可變輕鏈域VL。
  4. 一種分離之抗體，其結合人類HER3，其中該抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH；及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：39之可變輕鏈域VL。
  5. 一種分離之抗體，其結合人類HER3，其中該抗體包含a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：33之可變重鏈域VH；及b)具有胺基酸序列SEQ ID NO：42之可變輕鏈域VL。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體，其中該抗體a)結合於包含於選自由以下組成之群的多肽中之胺基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID NO：1)內： SEQ ID NO：13 TtSlyD-FKBP-Her3、SEQ ID NO：17 TtSlyDcas-Her3、SEQ ID NO：18 TtSlyDcys-Her3、SEQ ID NO：19 TgSlyDser-Her3及SEQ ID NO：20 TgSlyDcys-Her3。
  7. 如請求項1至5中任一項之抗體，其為全長IgG1抗體或IgG4抗體。
  8. 如請求項1至5中任一項之抗體，其為Fab片段。
  9. 如請求項1至5中任一項之抗體，其係用於治療癌症。
  10. 如請求項1至5中任一項之抗體，其係用於抑制HER3/HER2二聚作用。
  11. 一種免疫結合物，其包含如請求項1至6中任一項之抗體及細胞毒性劑。
  12. 如請求項11之免疫結合物，其係用於治療癌症。
  13. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至6中任一項之抗體或如請求項11之免疫結合物，及醫藥學上可接受之載劑。
  14. 一種分離之核酸，其編碼如請求項1至6中任一項之抗體。
  15. 一種宿主細胞，其包含如請求項14之核酸。
  16. 一種產生抗體之方法，其包含培養如請求項15之宿主細胞以使得該抗體產生，及自該細胞培養物或該細胞培養物清液層回收該抗體。
  17. 一種如請求項1至6中任一項之分離之抗體或如請求項11之免疫結合物的用途，其係用於製造用以治療癌症之藥劑。
  18. 一種如請求項1至6中任一項之分離之抗體的用途，其係用於製造用以抑制HER3/HER2二聚作用之藥劑。
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