BR112013004012B1

BR112013004012B1 - Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao receptor her3, seu uso e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112013004012B1
Application number: BR112013004012-2A
Authority: BR
Inventors: Winfried ELIS; Seth Ettenberg; Andrew Paul Garner; Nicole HAUBST; Christian Carsten Silvester Kunz; Elizabeth Anne Reisinger Sprague
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2010-08-20
Filing date: 2011-08-22
Publication date: 2021-03-23
Also published as: ME02637B; US20190194347A1; US20120107306A1; WO2012022814A1; RS55930B1; MY162825A; NZ607337A; CN105037552A; NI201300023A; CY1118761T1; JP2019001791A; CR20130071A; GEP201706605B; KR20130108304A; JP2018090590A; IL226712B; BR112013004012A2; PT2606070T; CL2013000459A1; US8735551B2

Abstract

anticorpos para o receptor de fator de crescimento epidérmico 3 (her3), seu uso e seus fragmentos, bem como composições farma-cêuticas que os compreendem. a presente invenção refere-se a anticorpos ou o fragmentos dos mesmos que têm como alvo um epítopo conformacional de um receptor her. em particular, a presente invenção refere-se a anticorpos ou os fragmentos dos mesmos que alvejam um epítopo conforma-cional do receptor her3 e as composições e métodos de uso dos mesmos.

Description

ANTICORPO MONOCLONAL ISOLADO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO AO RECEPTOR HER3, SEU USO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

Referência cruzada aos pedidos de Patente relacionados

[001] Este pedido de patente reivindica a prioridade ao Pedido de Patente provisório 61/375, 408, depositado em 20 de agosto de 2010, cujo conteúdo está incluído na sua totalidade.

Campo da presente invenção

[002] A presente invenção refere-se, de uma maneira geral, aos anticorpos ou aos fragmentos dos mesmos que interagem com a família dos receptores do, por exemplo, receptor HER3. Em particular, refere-se a anticorpos ou os fragmentos dos mesmos que reconhecem um epítopo conformacional do receptor HER (por exemplo, HER3) compreendendo os resíduos de ambos os domínios 2 e 4, resultando em inibição da transdução de sinal tanto dependente do ligante quanto independente do ligante. A presente invenção também se refere a anticorpos e os fragmentos dos mesmos que se ligam a receptores HER (por exemplo, receptor HER3) simultaneamente com um ligante (por exemplo, neuregulina), enquanto prevenindo a ativação induzida por meio do ligante da transdução de sinal.

Antecedentes da presente invenção

[003] O receptor do fator de crescimento epidérmico humano 3 (ErbB3, também conhecido como HER3) é um receptor da tirosina-quinase de proteína e pertence ao fator de crescimento epidermal do receptor da subfamília (EGFR) de receptores de tirosina quinases de proteínas, que também inclui o EGFR (HER1, ErbB1), HER2 (ErbB2, Neu) e HER4 (ErbB4) (Plowman et al, (1990) Proc Natl Acad Sci U.S. 87 : 4905 a 4909, Kraus et al, Proc (1989) Natl Acad Sci. U.S. 86 : 9193 a 9197, e Kraus et al, Proc (1993) Natl Acad Sci U.S. 90 : 2900 a 2904). Tal como o receptor do fator de crescimento epidérmico prototípico, o receptor transmembranar HER3 consiste em um domínio de ligação do ligante extracelular (ECD), um domínio de dimerização de dentro do ECD, um domínio transmembranar, um domínio do tipo proteína tirosina-quinase intracelular (TKD) e um domínio de fosforilação do terminal C. Ao contrário dos outros membros de sua família, o domínio quinase HER3 exibe a atividade quinase intrínseca muito baixa.

[004] Os ligantes neuregulina 1 (NRG) ou neuregulina2 ligam-se ao domínio extracelular de HER3 e ativam a via de sinalização mediada por meio do receptor através da promoção de dimerização com parceiros de dimerização, tais como HER2. A heterodimerização resulta na ativação e na transfosforilação de domínio intracelular HER3 e é um meio não só para a diversificação de sinal, mas também no que diz respeito à amplificação do sinal. Além disso, a heterodimerização HER3 pode também ocorrer na ausência de ligantes de ativação e esta é normalmente denominada independente do ligante de ativação HER3. Por exemplo, quando HER2 é expresso em níveis elevados como resultado da amplificação de genes (por exemplo, mama, ovário, pulmão ou câncer gástrico) dímeros HER2 / HER3 espontâneos podem ser formados. Nesta situação, o HER2 / HER3 é considerado o dímero mais ativo de ErbB de sinalização e é, portanto, altamente transformador.

[005] HER3 aumentada foi encontrada em vários tipos de câncer, tais como da mama, do pulmão, gastrointestinal e pâncreas. É interessante notar que uma correlação entre a expressão de HER2 / HER3 e a progressão de uma forma não invasiva a uma fase invasiva tem sido mostrada (Alimandi et al, (1995) Oncogene 10 : 1813 a 1821; . DeFazio et al, (2000). Cancer 87 : 487 a 498 ; Naidu et al, (1988) Br. J. Cancer 78 : 1385 a 1390). Por conseguinte, os agentes que interferem com a sinalização mediada por HER3 são necessários.

Sumário da presente invenção

[006] A presente invenção é baseada na descoberta de proteínas de ligação ao antigênio (por exemplo, anticorpos ou os fragmentos dos mesmos) que se ligam a um epítopo conformacional do receptor HER3 compreendendo os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 de HER3. Esta ligação dos anticorpos ou os fragmentos dos mesmos com o domínio 2 e do domínio 4 estabiliza o receptor HER3 em uma conformação inativa ou fechada de tal modo que a ativação HER3 é inibida. Surpreendentemente, a ligação dos anticorpos ou o fragmentos dos mesmos com este epítopo conformacional bloqueia ambos dependentes do ligante (por exemplo, neuregulina) e as vias de sinalização independente do ligante HER3. Além disso, a inibição mediada pelo anticorpo de sinalização induzida pelo ligante ocorre sem bloquear a ligação do ligante (isto é, tanto o ligante e anticorpo pode ligar HER3), presumivelmente porque HER3 não pode sofrer rearranjos conformacionais necessários para a ativação.

[007] Deste modo, em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga a um estado inativo de um receptor HER, em que o anticorpo ou um fragmento do mesmo bloqueia tanto a transdução de sinal dependente do ligante e independente do ligante. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo, estabiliza o receptor HER em um estado inativo.

[008] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que reconhece um epítopo conformacional de um receptor HER, em que o epítopo conformacional compreende os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 do receptor HER, e em que o anticorpo ou um fragmento do mesmo bloqueia ambas as transduções de sinal dependente do ligante e independente do ligante. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo liga-se ao estado inativo do receptor HER. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo liga-se para o estado ativo do receptor HER e aciona-o no estado inativo. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo estabiliza o receptor HER no estado inativo. O receptor HER é selecionado a partir do grupo que consiste em HER1, HER2, HER3 e HER4. O anticorpo é selecionado de entre o grupo que consiste em um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo sintético.

[009] Um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que reconhece um epítopo conformacional de um receptor HER, em que o epítopo conformacional compreende os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 do receptor HER, em que a ligação ao anticorpo estabiliza o receptor HER em um estado inativo, e em que um ligante HER pode simultaneamente ligar-se a um local de ligação ao ligante no receptor HER. Em uma modalidade, a ligação ao ligante HER para o local de ligação do ligante não induz a uma alteração conformacional no receptor HER para um estado ativo. Em uma outra modalidade, a ligação ao ligante HER para o local de ligação do ligante não ativa a transdução de sinal.

[0010] Em uma modalidade, o ligante é HER selecionado a partir do grupo que consiste em neuregulina 1 (NRG), neuregulina 2, neuregulina 3, neuregulina 4, betacelulina, fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina, epiregulin, fator de crescimento epidérmico, anfiregulina, e fator de crescimento transformante alfa.

[0011] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que reconhece um epítopo conformacional de um receptor HER, em que o epítopo conformacional compreende os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 do receptor HER, em que a ligação ao anticorpo estabiliza o receptor HER em um estado inativo de tal forma que o receptor HER falha ao dimerizar com um co-receptor com a finalidade de formar um complexo receptor-receptor. A incapacidade com a finalidade de formar um complexo receptor-receptor impede a ativação da transdução do sinal, tanto dependente do ligante quanto independente do ligante.

[0012] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que reconhece um epítopo conformacional de um receptor HER, em que o epítopo conformacional compreende os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 do receptor HER, em que a ligação do anticorpo ao HER receptor permite a dimerização com um co-receptor com a finalidade de formar um complexo receptor-receptor inativo. A formação do complexo receptor-receptor impede a ativação da transdução de sinal independente do ligante.

[0013] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que se liga a uma conformação inativa de um receptor HER3, em que o anticorpo bloqueia ambas as transduções de sinal dependente do ligante e independente do ligante. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo, estabiliza o receptor HER3 em um estado inativo.

[0014] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que reconhece um epítopo conformacional de um receptor de HER3, em que o epítopo conformacional compreende os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 do receptor HER3, e em que o anticorpo ou um fragmento do mesmo bloqueia ambas as transduções de sinal dependente do ligante e independente do ligante. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo liga-se ao estado inativo do receptor HER3. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo estabiliza o receptor HER3, no estado inativo. O anticorpo é selecionado de entre o grupo que consiste em um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo sintético.

[0015] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que reconhece um epítopo conformacional de um receptor de HER3, em que o epítopo conformacional compreende os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 de receptor HER3, em que a ligação do anticorpo estabiliza o receptor HER3 em um estado inativo, e em que um ligante de HER3 pode simultaneamente ligar-se a um local de ligação do ligante no receptor de HER3. Em uma modalidade, a ligação do ligante HER3 para o local de ligação do ligante não induz a uma alteração conformacional no receptor HER3 para um estado ativo. Em uma outra modalidade, a ligação do ligante HER3 ao local de ligação do ligante não ativa a transdução de sinal. Em uma modalidade, o ligante HER3 é selecionado entre o grupo que consiste em neuregulina 1 (NRG), neuregulina 2, betacelulina, fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina e epiregulina.

[0016] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que reconhece um epítopo conformacional de um receptor de HER3, em que o epítopo conformacional compreende os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 do receptor HER3, e em que o anticorpo ou um fragmento do mesmo bloqueia ambas as transduções de sinal dependente do ligante e independente do ligante. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo liga-se ao estado inativo do receptor HER3. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo estabiliza o receptor HER3 em um estado inativo.

[0017] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou o fragmento do mesmo que se liga a um epítopo conformacional do receptor HER3, em que o epítopo conformacional compreende os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 do receptor HER3, em que o domínio 2, compreende um circuito de dimerização, e em que o anticorpo ou o fragmento bloqueia ambas as transduções de sinal dependente do ligante e independente do ligante. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo, estabiliza o receptor HER3 em um estado inativo. Em uma modalidade, o epítopo conformacional compreende os resíduos de aminoácidos 265 a 277, 315 (de domínio 2), 571,582-584, 596-597, 600 a 602, 609-615 (domínio de 4) ou um subconjunto destes. Em uma modalidade, o VH do anticorpo ou um fragmento do mesmo liga-se a pelo menos um dos seguintes resíduos : HER3 Asn266, Lys267, Thr269, Leu268, Gln271, Glu273, Pro274, Pro276, Asn275, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. Em uma modalidade, o VL do anticorpo ou um fragmento do mesmo liga-se a pelo menos um dos seguintes resíduos : HER3 Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Lys602, Ile600, Arg611, Glu609, Pro612, Cys613, His614, Glu615.

[0018] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que reconhece um epítopo conformacional do primeiro receptor HER, em que o epítopo conformacional compreende os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 do primeiro receptor HER, em que a ligação do anticorpo ou um fragmento do mesmo para o primeiro receptor HER na ausência de um ligante do receptor HER reduz a formação independente do ligante de um complexo de proteína do primeiro receptor HER - segundo receptor HER de uma célula que expressa o primeiro receptor HER e o segundo receptor HER. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo, estabiliza o primeiro receptor HER em um estado inativo de tal forma que o primeiro receptor HER falha com a finalidade de formar dímeros com o segundo receptor HER com a finalidade de formar um complexo de protpeina do primeiro receptor HER - segundo receptor HER. Em uma modalidade, a não formação de complexo de proteína do primeiro receptor HER - segundo receptor HER impede a ativação da transdução do sinal. Em uma modalidade, o primeiro HER é selecionado a partir do grupo que consiste em HER1, HER2, HER3, e HER4. Em uma modalidade, o segundo HER é selecionado a partir do grupo que consiste em HER1, HER2, HER3, e HER4.

[0019] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que reconhece um epítopo conformacional do receptor HER3, em que o epítopo conformacional compreende os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 de HER3, em que a ligação do anticorpo ou o fragmento do mesmo para o receptor HER3 na ausência de um ligante de HER3 reduz independente a formação do ligante de um complexo de proteína HER2 - HER3 em uma célula que expressa HER2 e HER3. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo, estabiliza o receptor HER3 em um estado inativo de tal forma que o receptor HER3 falha ao dimerizar com o receptor HER2, com a finalidade de formar um complexo de proteína HER2 - HER3. Em uma modalidade, a não formação de um complexo de proteína HER2 - HER3 impede a ativação da transdução do sinal. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo, estabiliza o receptor HER3 no estado inativo de tal forma que o receptor HER3 ainda pode dimerizar com HER2, mas forma um complexo de proteína inativo HER2 - HER3. Em uma modalidade, a formação de um complexo de proteína inativa HER2 -HER3 impede a ativação da transdução do sinal.

[0020] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que reconhece um epítopo conformacional do primeiro receptor HER, em que o epítopo conformacional compreende os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 do primeiro receptor, em que a ligação do anticorpo ou um fragmento do mesmo para o primeiro receptor HER na presença de um ligante HER reduz a formação dependente do ligante de um complexo de proteína do primeiro receptor HER - segundo receptor HER de uma célula que expressa o primeiro receptor HER e o segundo receptor HER. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo, estabiliza o o primeiro receptor HER em um estado inativo de tal forma que o receptor HER falha com a finalidade de formar dímeros com o o segundo receptor HER na presença de um ligante com a finalidade de formar um complexo de proteína do primeiro receptor HER - segundo receptor HER. Em uma modalidade, a não formação de um complexo de proteína do primeiro receptor HER -segundo receptor HER impede a ativação da transdução do sinal. Em uma modalidade, o ligante HER é selecionado a partir do grupo que consiste em neuregulina 1 (NRG), neuregulina 2, neuregulina 3, neuregulina 4, betacelulina, do fator de crescimento epidérmico ligado à heparina, epiregulin, fator de crescimento epidérmico, anfiregulina, e fator de crescimento transformante alfa. Em uma modalidade, o primeiro HER é selecionado a partir do grupo que consiste em HER1, HER2, HER3, e HER4. Em uma modalidade, o segundo HER é selecionado a partir do grupo que consiste em HER1, HER2, HER3, e HER4.

[0021] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que reconhece um epítopo conformacional do receptor HER3, em que o epítopo conformacional compreende os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 de HER3, em que a ligação do anticorpo ou o fragmento do mesmo para o receptor HER3 na presença de um ligante HER3 reduz a formação dependente do ligante de um complexo proteína HER2 - HER3 em uma célula que expressa de HER2 e HER3. O ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em neuregulina 1 (NRG), e neuregulina 2. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo, estabiliza o receptor HER3 em um estado inativo de tal forma que o receptor HER3 falha ao dimerizar com o receptor HER2 na presença de um ligante de HER3, com a finalidade de formar um complexo de proteína HER2 - HER3. Em uma modalidade, a não formação de um complexo de proteína HER2 - HER3 impede a ativação da transdução do sinal.

[0022] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que reconhece um epítopo conformacional do Receptor HER3, em que o epítopo conformacional compreende os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 de HER3, e em que o anticorpo ou o fragmento do mesmo inibe a fosforilação da HER3, tal como avaliado por meio do ensaio de fosforilação HER3 independente do ligante. Em uma modalidade, o ensaio de fosforilação HER3 independente do ligante HER2 utiliza as células amplificadas, em que as células amplificadas HER2 são as células SK-BR-3.

[0023] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo que reconhece um epítopo conformacional do Receptor HER3, em que o epítopo conformacional compreende os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 de HER3, e em que o anticorpo ou o fragmento do mesmo inibe a fosforilação da HER3, tal como avaliado por meio do ensaio de fosforilação dependente do ligante HER3. Em uma modalidade, o ensaio de fosforilação dependente do ligante HER3 utiliza as células MCF7 estimuladas com neuregulina (NRG).

[0024] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se o anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo a um receptor de HER3, que tem uma dissociação (KD) de pelo menos 1 x 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M -1, 1012 M-1, 1013 M-1. Em uma modalidade, o anticorpo ou o fragmento do mesmo inibe a fosforilação de HER3 como medido por meio dos testes in vitro de ligação a HER3 humanos em um ensaio de fosforilação selecionados a partir do grupo que consiste em fosfo-HER3 e fosfo-Akt.

[0025] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3, em que o cruzamento compete com um anticorpo descrito na tabela 1 ; um anticorpo ou o fragmento do mesmo que interage com (por exemplo, por meio do impedimento, a ligação estérica, estabilização / desestabilização, distribuição espacial) o mesmo epítopo, como um anticorpo descrito na Tabela 1. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo é um anticorpo monoclonal. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo é um anticorpo humano ou humanizado. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo é um anticorpo quimérico. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo compreende uma região constante de cadeia pesada humana e uma região de cadeia leve humana constante. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo é um anticorpo de cadeia simples. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo é um fragmento Fab. Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo é um scFv. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo liga-se tanto ao HER3 humano quanto ao HER3 cinomólogo. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo é um isotipo IgG. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo compreende uma estrutura em que os aminoácidos foram substituídos na estrutura do anticorpo a partir do respectivo VH humano ou sequências VL da linhagem germinativa .

[0026] Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo compreendendo HER3 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 CDRs calculados por meio deKabat Chothia ou por meio de qualquer um dos anticorpos na Tabela 1.

[0027] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou o fragmento do mesmo ao Receptor HER3 compreendendo uma CDR3 de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 58, SEQ ID NO : 64, SEQ ID NO : 76, SEQ ID NO : 82, SEQ ID NO : 94, SEQ ID NO : 100, SEQ ID NO : 112, SEQ ID NO : 118, SEQ ID NO : 130, SEQ ID NO : 136, SEQ ID NO : 148, SEQ ID NO : 166, SEQ ID NO : 184, SEQ ID NO : 202, SEQ ID NO : 220, SEQ ID NO : 238, SEQ ID NO : 256, SEQ ID NO : 274, SEQ ID NO : 292, SEQ ID NO : 310, SEQ ID NO : 328, SEQ ID NO : 346, e de SEQ ID NO : 364.

[0028] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 15 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 14, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0029] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 33 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 32, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0030] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 51 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 50, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0031] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 69 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 68, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0032] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 87 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 86, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0033] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 105 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 104, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0034] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 123 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 122, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0035] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 141 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 140, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0036] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 159 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 158, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0037] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 177 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 176, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0038] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 195 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 194, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0039] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 213 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 212, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0040] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 231 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 230, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0041] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 249, e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 248, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0042] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 267, e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 266, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0043] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 285 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 284, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0044] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 303 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 302, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0045] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 321 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 320, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0046] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 339 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 338, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0047] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 357 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 356, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0048] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo de receptor HER3 que o anticorpo compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO : 375 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO : 374, ou uma sequência de aminoácidos com a identidade de 97 a 99 % do mesmo .

[0049] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou o fragmento do mesmo que compreende uma sequência variável de cadeia pesada que possui a SEQ ID NO : 493.

[0050] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou o fragmento do mesmo que compreende uma sequência variável de cadeia leve que possui a SEQ ID NO : 494.

[0051] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou o fragmento do mesmo que compreende uma sequência variável de cadeia pesada que possui a SEQ ID NO : 493 e uma sequência variável de cadeia leve que possui a SEQ ID NO : 494.

[0052] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo para Receptor HER3 com uma variante da região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3, em que a variante possui pelo menos 1 a 4 alterações de aminoácidos em uma CDR1, CDR2, ou CDR3.

[0053] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 2 ; CDR2 da SEQ ID NO : 3 ; CDR3 de SEQ ID NO : 4, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 5 ; CDR2 da SEQ ID NO : 6, e CDR3 de SEQ ID NO : 7.

[0054] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 20 ; CDR2 da SEQ ID NO : 21 ; CDR3 de SEQ ID NO : 22, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 23, CDR2 da SEQ ID NO : 24, e CDR3 de SEQ ID NO : 25.

[0055] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 38 ; CDR2 da SEQ ID NO : 39 ; CDR3 de SEQ ID NO : 40, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 41 ; CDR2 da SEQ ID NO : 42, e CDR3 de SEQ ID NO : 43.

[0056] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 56 ; CDR2 da SEQ ID NO : 57 ; CDR3 de SEQ ID NO : 58, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 59, CDR2 da SEQ ID NO : 60, e CDR3 de SEQ ID NO : 61.

[0057] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 74, CDR2 da SEQ ID NO : 75 ; CDR3 de SEQ ID NO : 76, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 77 ; CDR2 da SEQ ID NO : 78, e CDR3 de SEQ ID NO : 79.

[0058] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 92 ; CDR2 da SEQ ID NO : 93 ; CDR3 de SEQ ID NO : 94, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 95 ; CDR2 da SEQ ID NO : 96, e CDR3 de SEQ ID NO : 97.

[0059] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 110, CDR2 da SEQ ID NO : 111 ; CDR3 de SEQ ID NO : 112, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 113, CDR2 da SEQ ID NO : 114, e CDR3 de SEQ ID NO : 115.

[0060] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 128, CDR2 da SEQ ID NO : 129 ; CDR3 de SEQ ID NO : 130, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 131, CDR2 da SEQ ID NO : 132, e CDR3 de SEQ ID NO : 133.

[0061] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 146, CDR2 da SEQ ID NO : 147 ; CDR3 de SEQ ID NO : 148, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 149, CDR2 da SEQ ID NO : 150, e CDR3 de SEQ ID NO : 151.

[0062] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 164, CDR2 da SEQ ID NO : 165 ; CDR3 de SEQ ID NO : 166, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 167, CDR2 da SEQ ID NO : 168, e CDR3 de SEQ ID NO : 169.

[0063] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 182, CDR2 da SEQ ID NO : 183 ; CDR3 de SEQ ID NO : 184, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 185, CDR2 da SEQ ID NO : 186, e CDR3 de SEQ ID NO : 187.

[0064] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 200, CDR2 da SEQ ID NO : 201 ; CDR3 de SEQ ID NO : 202, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 203, CDR2 da SEQ ID NO : 204, e CDR3 de SEQ ID NO : 205.

[0065] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 218, CDR2 da SEQ ID NO : 219 ; CDR3 de SEQ ID NO : 220, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 221, CDR2 da SEQ ID NO : 222, e CDR3 de SEQ ID NO : 223.

[0066] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 236, CDR2 da SEQ ID NO : 237 ; CDR3 de SEQ ID NO : 238, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 239, CDR2 da SEQ ID NO : 240, e CDR3 de SEQ ID NO : 241.

[0067] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 254, CDR2 da SEQ ID NO : 255 ; CDR3 de SEQ ID NO : 256, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 257, CDR2 da SEQ ID NO : 258, e CDR3 de SEQ ID NO : 259.

[0068] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 272, CDR2 da SEQ ID NO : 273 ; CDR3 de SEQ ID NO : 274, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 275, CDR2 da SEQ ID NO : 276, e CDR3 de SEQ ID NO : 277.

[0069] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 290, CDR2 da SEQ ID NO : 291 ; CDR3 de SEQ ID NO : 292, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 293, CDR2 da SEQ ID NO : 294, e CDR3 de SEQ ID NO : 295.

[0070] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 308, CDR2 da SEQ ID NO : 309 ; CDR3 de SEQ ID NO : 310, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 311, CDR2 da SEQ ID NO : 312, e CDR3 de SEQ ID NO : 313.

[0071] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 326, CDR2 da SEQ ID NO : 327 ; CDR3 de SEQ ID NO : 328, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 329, CDR2 da SEQ ID NO : 330, e CDR3 de SEQ ID NO : 331.

[0072] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 344, CDR2 da SEQ ID NO : 345 ; CDR3 de SEQ ID NO : 346, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 347, CDR2 da SEQ ID NO : 348, e CDR3 de SEQ ID NO : 349.

[0073] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou um fragmento do mesmo, que compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 362, CDR2 da SEQ ID NO : 363 ; CDR3 de SEQ ID NO : 364, uma região variável da cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO : 365, CDR2 da SEQ ID NO : 366, e CDR3 de SEQ ID NO : 367.

[0074] Em uma modalidade, o fragmento de um anticorpo se liga a HER3 é selecionado de entre o grupo que consiste em Fab, F (ab2) ', F (ab) 2', scFv, VHH, VH, VL, DABS.

[0075] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou o fragmento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende ainda um agente terapêutico adicional, tal como um anticorpo, uma molécula pequena, um inibidor ou um inibidor de mTOR PI3Kinase. Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende o anticorpo ou o fragmento do mesmo da presente invenção e um inibidor de HER1, incluindo, mas não se limita a, Matuzumab (EMD72000), Erbitux ® / Cetuximab, Vectibix ® / Panitumumab, mAb 806, Nimotuzumab, Iressa ® / Gefitinib, CI-1033 (PD183805), lapatinib (GW-572016), o Tykerb ® / lapatinib ditosilato, Tarceva ® / erlotinib HCL (OSI-774), PKI-166, e Tovok ®.

[0076] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende o anticorpo ou um fragmento da presente invenção e um inibidor de HER2, incluindo, mas não se limita a, pertuzumab, Trastuzumab, MM-111, neratinib, lapatinib ou ditosilato / lapatinib Tykerb ®.

[0077] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende o anticorpo ou o fragmento do mesmo da presente invenção e um inibidor de HER3, incluindo, mas não se limita a, MM-121, MM-111, IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203 (Aveo), MEHD7945A (Genentech) ; pequenas moléculas que inibem a HER3.

[0078] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende o anticorpo ou o fragmento da presente invenção e um inibidor de HER4.

[0079] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende o anticorpo ou o fragmento do mesmo da presente invenção e um inibidor de quinase PI3, incluindo, mas não se limita a, GDC 0941 BEZ235, BMK120 e BYL719.

[0080] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende o anticorpo ou o fragmento da presente invenção e de um inibidor de mTOR, incluindo, mas não se limita a, Temsirolimus / Torisel ®, ridaforolimus / Deforolimus, AP23573, MK8669, everolimus /Affinitor ®. Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método de tratamento de um câncer que compreende selecionar um sujeito que tem um câncer que expressa HER3, a administração à pessoa de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo ou um fragmento do mesmo, selecionado a partir de qualquer uma das reivindicações anteriores. Em uma modalidade, o sujeito é um ser humano.

[0081] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método de tratamento de um câncer que compreende selecionar um sujeito que tem um câncer que expressa HER3, a administração à pessoa de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo ou um fragmento do mesmo, selecionado a partir de qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo câncer ser selecionado a partir do grupo que consiste em câncer da mama, câncer colorretal, câncer do pulmão, mieloma múltiplo, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer da próstata, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, osteossarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores de nervos periféricos, schwannoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de esôfago, glioblastoma, sarcoma de células claras de tecidos moles, mesotelioma maligno, neurofibromatose, câncer renal, melanoma. Em uma modalidade, o câncer é o câncer da mama.

[0082] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método de tratamento de um câncer que compreende selecionar um sujeito que tem um câncer que expressa HER3, a administração ao referido indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma combinação de anticorpos ou o fragmentos dos mesmos descritos na Tabela 1 que se liga a HER3.

[0083] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método de tratamento de um câncer que compreende selecionar um sujeito que tem um câncer que expressa HER3, a administração ao referido indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a HER3 e inibe a transdução de sinal dedependente do ligante HER3 e transdução de sinal indedependente do ligante.

[0084] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito ao uso de um anticorpo ou um fragmento do mesmo de qualquer uma das reivindicações anteriores na fabricação de um medicamento para o tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou via de transdução de sinal independente do ligante selecionado a partir do grupo que consiste em câncer da mama, câncer colorretal, câncer do pulmão, mieloma múltiplo, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer da próstata, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, osteossarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores do nervo periférico, schwannoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de esôfago, glioblastoma, sarcoma de células claras de tecidos moles, mesotelioma maligno, neurofibromatose, câncer renal e melanoma.

[0085] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 15 e VL de SEQ ID NO : 14 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[0086] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 33 e VL de SEQ ID NO : 32 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[0087] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 51 e VL de SEQ ID NO : 50, para utilização no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[0088] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 69 e VL de SEQ ID NO : 68, para utilização no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[0089] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 87 e VL de SEQ ID NO : 86 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[0090] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 105 e VL de SEQ ID NO : 104, para utilização no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[0091] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 123 e VL de SEQ ID NO : 122 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[0092] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 141 e VL de SEQ ID NO : 140, para utilização no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[0093] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 151 e VL de SEQ ID NO : 158 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[0094] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 177 e VL de SEQ ID NO : 176 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[0095] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 195 e VL de SEQ ID NO : 194 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[0096] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 213 e VL de SEQ ID NO : 212 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[0097] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 231 e VL de SEQ ID NO : 230 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[0098] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 249 e VL de SEQ ID NO : 248 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[0099] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 267 e VL de SEQ ID NO : 266 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[00100] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 285 e VL de SEQ ID NO : 284 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[00101] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 303 e VL de SEQ ID NO : 302 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[00102] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 321 e VL de SEQ ID NO : 320, para utilização no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[00103] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 339 e VL de SEQ ID NO : 338 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[00104] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 357 e VL de SEQ ID NO : 356 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante.

[00105] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 375 e VL de SEQ ID NO : 374 para uso no tratamento de um câncer mediado por meio de uma transdução de sinal dependente do ligante HER3 ou por meio de uma transdução de sinal independente do ligante. Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 15 e VL de SEQ ID NO : 14 para o uso como um medicamento.

[00106] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 33 e VL de SEQ ID NO : 32, para utilização como um medicamento.

[00107] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 51 e VL de SEQ ID NO : 50, para utilização como um medicamento.

[00108] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 69 e VL de SEQ ID NO : 68, para utilização como um medicamento.

[00109] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 87 e VL de SEQ ID NO : 86, para utilização como um medicamento.

[00110] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 105 e VL de SEQ ID NO : 104, para utilização como um medicamento.

[00111] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 123 e VL de SEQ ID NO : 122 para utilização como um medicamento.

[00112] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 141 e VL de SEQ ID NO : 140, para utilização como um medicamento.

[00113] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 159 e VL de SEQ ID NO : 158 para utilização como um medicamento.

[00114] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 177 e VL de SEQ ID NO : 176 para utilização como um medicamento.

[00115] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 195 e VL de SEQ ID NO : 194 para utilização como um medicamento.

[00116] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 213 e VL de SEQ ID NO : 212 para utilização como um medicamento.

[00117] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 231 e VL de SEQ ID NO : 230 para utilização como um medicamento.

[00118] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 249 e VL de SEQ ID NO : 248 para utilização como um medicamento.

[00119] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 267 e VL de SEQ ID NO : 266 para utilização como um medicamento.

[00120] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 285 e VL de SEQ ID NO : 284 para utilização como um medicamento.

[00121] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 302 para utilização como um medicamento : 303 e VL de SEQ ID NO.

[00122] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 321 e VL de SEQ ID NO : 320, para utilização como um medicamento.

[00123] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 339 e VL de SEQ ID NO : 338 para utilização como um medicamento.

[00124] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 357 e VL de SEQ ID NO : 356 para utilização como um medicamento.

[00125] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo tendo VH de SEQ ID NO : 375 e VL de SEQ ID NO : 374 para utilização como um medicamento.

Breve Descrição das Figuras

[00126] Figura 1 : Curvas do conjunto MOR10701 representante obtido com HER3 humano, de rato, de camundongo e cino

[00127] Figura 2 : Determinação da ligação celular SK-BR-3 por meio da titulação FACS

[00128] Figura 3 : domínio de ligação HER3 ELISA

[00129] Figura 4 : O mapeamento de epítopos de troca de hidrogênio deutério. A) Ospeptídeos HER3 recuperados na sequência de análise ECD HDX-MS são indicados por meio das linhas tracejadas. Os locais de glicosilação potenciais ligados a N estão destacados. B) O grau relativo de deuteração observado nos peptídeos identificados através de EM. C) Os resíduos protegidos mapeados sobre a estrutura de cristal HER3publicada.

[00130] Figura 5 : A) representação da superfície dos HER3 / MOR09823 e estruturas de cristal de raios-x HER3 / MOR09825. HER3 (em cinza claro) está na conformação fechada, e MOR09823 ou MOR09825 (em cinzento mais escuro) ligam-se a ambos os domínios 2 e 4. B). Vista de superfície de HER3 da estrutura HER3/MOR09823 mostrada com uma orientação semelhante como (A). MOR09823 foi omitida para maior clareza. C) estrutura HER3/MOR09823 ilustrada como uma estrutura de fita, visto em uma rotação de 90 ° a partir de painéis (A), (B) e (D). D) Uma representação da fita da conformação HER3 inativa reconhecida por MOR09823 Fab com um close-up da interface do domínio 2/domínio 4, destacando os resíduos HER3 que estão dentro de 5A de FAB. E) determinação da ligação de HER3 / MOR10703 mutante por meio da titulação ELISA.

[00131] Figura 6 : Inibição do ligando induzido (A) ou fosforilação HER3 (B) independente do ligando.

[00132] Figura 7 : A inibição da HER3 dependente a jusante das vias sinalizadoras em linhagens de célula HER2 amplificadas.

[00133] Figura 8 : O impacto de HER3 sobre a inibição do crescimento celular em A) BT-474 e B) neuregulina estimuladas de células MCF-7.

[00134] Figura 9 : O efeito de neuregulina de MOR09823 e MOR09825 sobre a ligação a células MCF7.

[00135] Figura 10 : Impacto da ligação de MOR09823 a formação do complexo HER3 / neuregulina avaliado pela BiacoreTM. Nenhum anticorpo (barras pretas), MOR09823 (barras brancas), 105,5 (cinzento) e IgG de controle (barras a tracejado).

[00136] Figura 11 : Inibição mediada de MOR09823 de sinalização (A) independente do ligando (BT-474) e (B) dependente do ligando (BxPC3) de HER3 in vivo.

[00137] Figura 12 : O impacto da MOR10701 e MOR10703 sobre o crescimento do tumor BT-474.

[00138] Figura 13 : O impacto da MOR10701 e MOR10703 sobre o crescimento do tumor BxPC3.

[00139] Figura 14 : MOR10703 combinação do fármaco de em isobologramas in vitro (A) MOR09823 / trastuzumab, (B) MOR09823 / lapatinib, (C) MOR10703 / BEZ235, (D) MOR10703 / BKM120, (E) MOR10703 / BYL719, (F) MOR10703 / RAD001, (G) MOR10703 cetuximab / e (H) MOR10703 / erlotinib.

[00140] Figura 15 : MOR10701 MOR10703 ou em combinações in vivo com (A) e trastuzumab (B) erlotinib em BT-474 e L3.3.

Descrição Detalhada da Invenção Definições

[00141] A fim de que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendida, certos termos são definidos primeiro. As definições adicionais estão definidas ao longo da descrição detalhada.

[00142] A frase "a transdução de sinal" ou "atividade de sinalização", tal como usado na presente invenção refere-se a uma relação causal bioquímica geralmente iniciada por meio de uma interação proteína-proteína, tais como a ligação de um fator de crescimento para um receptor, o que resulta na transmissão de um sinal a partir de uma porção de um célula para outra parte de uma célula. Para HER3, a transmissão envolve a fosforilação específica de uma ou mais tirosina, serina ou treonina em uma ou mais proteínas da série de reações que causam a transdução de sinal. Os penúltimos processos tipicamente incluem os eventos nucleares, que resultam em uma alteração da expressão do gene.

[00143] Um "receptor HER" é um receptor tirosina-quinase de proteína que pertence à família de receptores HER e inclui os receptores EGFR, HER2, HER3 e HER4 e outros membros desta família a serem identificados no futuro. O receptor HER compreenderão, geralmente, um domínio extracelular, que pode ligar um ligando de HER, um domínio transmembranar lipofílico, um domínio quinase intracelular da tirosina conservada, e um domínio de sinalização do terminal carboxila abrigando os vários resíduos de tirosina que podem ser fosforilados. De preferência, o receptor HER é receptor HER humano de sequência nativa.

[00144] Os termos "HER1," "ErbB1", "receptor do fator de crescimento epidérmico" e "EGFR" são usados na presente invençãos de maneira indiferente e referem-se a EGFR tal como descrito, por exemplo, em Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56 : 881 a 914 (1987), incluindo as formas mutantes que ocorrem de uma maneira natural dos mesmos (por exemplo, um EGFR mutante de deleção como em Humphrey et al., (1990) PNAS (U.S.) 87 : 4207 a 4211). ErbB1 refere-se ao gene que codifica o produto proteico EGFR.

[00145] Os termos "HER2" e "ErbB2" e são usados na presente invenção de maneira indiferente e referem-se à proteína HER2 humana descrita, por exemplo, em Semba et al., (1985) PNAS (U.S.) 82 : 6497 a 6501 e Yamamoto et al. (1986 ) Nature 319 : 230 a 234 (Genebank número de acesso X03363). O termo "erbB2" refere-se ao gene que codifica ErbB2 humano e "neu" refere-se ao gene de codificação de rato p185 .

[00146] Os termos "HER4" e "ErbB4" na presente invenção referem-se ao receptor do polipeptídeo tal como descrito, por exemplo, na Patente EP n Appln 599,274; Plowman et al, (1993) Proc.. Natl. Acad. Sci. U.S., 90 : 1746 a 1750, e Plowman et al, (1993) Nature, 366 : 473 a 475, incluindo as isoformas dos mesmos, por exemplo, descritos em WO99/19488, publicado em 22 de abril de 1999 .

[00147] O termo "HER3" ou "receptor HER3" também conhecido como "ErbB3" conforme usado na presente invenção refere-se a proteínas de mamífero HER3 e "HER3" ou "erbB3" refere-se ao gene de mamíferos HER3. A proteína HER3 preferida é a presente proteína humana HER3 na membrana da célula de uma célula. O gene HER3 humano é descrito na Patente U.S. No. 5.480.968 e Plowman et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 87 : 4905 a 4909.

[00148] HER3 humano, tal como definido no No. de acesso NP_001973 (humano), a seguir representado como SEQ ID NO : 1. Todas as nomenclaturas são para o comprimento total, HER3 imaturo (aminoácidos 1 a 1342). O HER3 imaturo é clivado entre as posições 19 e 20, o que resulta na proteína madura HER3 (aminoácidos 20 a 1342). mrandalqvl gllfslargs evgnsqavcp gtlnglsvtg daenqyqtly klyercevvm gnleivltgh nadlsflqwi revtgyvlva mnefstlplp nlrvvrgtqv ydgkfaifvm Inyntnssha Irqlrltqlt eilsggvyie kndklchmdt idwrdivrdr daeivvkdng rscppchevc kgrcwgpgse dcqtltktic apqcnghcfg pnpnqcchde caggcsgpqd tdcfacrhfn dsgacvprcp qplvynkltf qlepnphtky qyggvcvasc phnfvvdqts cvracppdkm evdknglkmc epcgglcpka cegtgsgsrf qtvdssnidg fvnctkilgn ldflitglng dpwhkipald peklnvfrtv reitgylniq swpphmhnfs vfsnlttigg rslynrgfsl limknlnvts lgfrslkeis agriyisanr qlcyhhslnw tkvlrgptee rldikhnrpr rdcvaegkvc dplcssggcw gpgpgqclsc rnysrggvcv thcnflngep refaheaecf schpecqpme gtatcngsgs dtcaqcahfr dgphcvsscp hgvlgakgpi ykypdvqnec rpchenctqg ckgpelqdcl gqtlvligkt hltmaltvia glvvifmmlg gtflywrgrr iqnkramrry lergesiepl dpsekankvl arifketelr klkvlgsgvf gtvhkgvwip egesikipvc ikviedksgr qsfqavtdhm laigsldhah ivrllglcpg sslqlvtqyl plgslldhvr qhrgalgpql llnwgvqiak gmyyleehgm vhrnlaarnv llkspsqvqv adfgvadllp pddkqllyse aktpikwmal esihfgkyth qsdvwsygvt vwelmtfgae pyaglrlaev pdllekgerl aqpqictidv ymvmvkcwmi denirptfke laneftrmar dpprylvikr esgpgiapgp ephgltnkkl eevelepeld ldldleaeed nlatttlgsa lslpvgtlnr prgsqsllsp ssgympmnqg nlgescqesa vsgssercpr pvslhpmprg clasessegh vtgseaelqe kvsmcrsrsr srsprprgds ayhsqrhsll tpvtplsppg leeedvngyv mpdthlkgtp ssregtlssv glssvlgtee ededeeyeym nrrrrhspph pprpssleel gyeymdvgsd lsaslgstqs cplhpvpimp etiquetattpdedy eymnrqrdgg gpggdyaamg acpaseqgye emrafqgpgh qaphvhyarl ktlrsleatd safdnpdywh srlfpkanaq rt (SEQ ID NO : 1)

[00149] O termo " ligante HER" tal como usado na presente invenção refere-se aos polipeptídeos que se ligam e ativam os receptores HER tais como HER1, HER2, HER3 e HER4. Os exemplos de ligantes HERS incluem, mas não estão limitados a neuregulina 1 (NRG), neuregulina 2, neuregulina 3, neuregulina 4, betacelulina, fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina, epiregulin, fator de crescimento epidérmico, anfiregulina e do fator alfa de crescimento de transformação. O termo inclui os fragmentos biologicamente ativos e/ou variantes de um polipeptídeo que ocorre de uma maneira natural.

[00150] O termo "ligante HER3", tal como usado na presente invenção, refere-se aos polipeptídeos que se ligam e ativam HER3. Exemplos de Ligantes HER3 incluem, mas não estão limitados a neuregulina 1 (NRG) e neuregulina 2, betacelulina, fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina, e epiregulin. O termo inclui os fragmentos biologicamente ativos e/ou variantes de um polipeptídeo que ocorre de uma maneira natural.

[00151] O " complexo de proteína HER-HER " é um oligómero associado não covalentemente contendo os co-receptores HER em qualquer combinação (por exemplo, HER1 - HER2, HER1 - HER3, HER1 - HER4, HER2 - HER3, HER3 - HER4, e semelhantes). Este complexo pode formar quando uma célula que expressa ambos os receptores expostos a um ligante, por exemplo HER, NRG, ou quando um receptor HER está ativo ou sobreexpresso.

[00152] O "complexo proteína HER2 - HER3" é um oligómero associado não covalentemente contendo receptor HER2 e o receptor HER3. Este complexo pode formar quando uma célula que expressa ambos os receptores expostos a um ligante, por exemplo HER3, HER2 NRG ou quando está ativo / sobreexpresso

[00153] A frase "atividade HER3" ou "ativação HER3", tal como usado na presente invenção refere-se a um aumento na oligomerização (por exemplo, um aumento de complexos contendo HER3), fosforilação HER3, rearranjos conformacionais (por exemplo os induzidos por meio dos ligantes), e a sinalização HER3 mediada a jusante.

[00154] O termo " estabilização" ou "estabilizado", utilizado no contexto de HER3 refere-se a um anticorpo ou o fragmento que mantém diretamente (fechaduras, amarras, mantenedores, de preferência, ligantes, favores) no estado inativo ou conformação de HER3, sem bloquear a ligação do ligante a HER3, ligação que tal ligante já não é capaz de ativar HER3. Os ensaios descritos nos exemplos podem ser utilizados para medir a ligação do ligante a um receptor HER3 estabilizado, por exemplo, ensaio de Biacore.

[00155] O termo "sinalização dependente do ligante", tal como usado na presente invenção refere-se à ativação de HER (por exemplo, HER3), através do ligante. A ativação HER3 é evidenciada por meio do aumento de oligomerização (por exemplo, heterodimerização) e/ou fosforilação HER3 de tal modo que as vias de sinalização a jusante (por exemplo, PI3K) são ativados. O anticorpo ou um fragmento do mesmo pode estatisticamente significativamente reduzir a quantidade de HER3 fosforilado na célula estimulada exposta à proteína de ligação ao antigênio (por exemplo, um anticorpo) em relação a uma célula (testemunha) não tratada, tal como medido utilizando os ensaios descritos nos Exemplos. A célula que expressa HER3 pode ser uma linhagem de células que ocorrem de uma maneira natural (por exemplo, MCF7), ou pode ser produzida de forma recombinante através da introdução de ácidos nucleicos que codificam para a proteína HER3 para uma célula hospedeira. A estimulação das células pode ocorrer quer através da adição exógena de um ligante de ativação HER3 ou por meio daexpressão endógena de um ligante ativador.

[00156] O anticorpo ou um fragmento do mesmo que "reduz a ativação de HER3 induzida por neregulina em uma célula" é um que reduz significativamente estatisticamente a fosforilação HER3 da tirosina em relação a uma célula (testemunha) não tratada, tal como medido utilizando os ensaios descritos nos Exemplos. Isto pode ser determinado com base em níveis de fosfotirosina HER3, após a exposição de HER3 para NRG e o anticorpo de interesse. A célula que expressa a proteína HER3 pode ser uma célula que ocorre de uma maneira natural ou linhagem celular (por exemplo, MCF7), ou pode ser produzida de forma recombinante.

[00157] O termo "sinalização independente do ligante", tal como usado na presente invenção refere-se a atividade de HER3 celular (por exemplo, fosforilação), na ausência de um requisito para a ligação do ligante. Por exemplo, a ativação independente do ligante HER3 pode ser resultado de uma sobre-expressão de HER2 ou mutações ativadoras de heterodímeros HER3 parceiros, tais como EGFR e HER2. O anticorpo ou um fragmento do mesmo pode estatisticamente significativamente reduzir a quantidade de HER3 fosforilada em uma célula exposta à proteína de ligação ao antigênio (por exemplo, um anticorpo) em relação a uma célula (de controle) não tratadas. A célula que expressa HER3 pode ser uma linhagem celular que ocorre de uma maneira natural (por exemplo, SK-BR-3), ou pode ser produzida de forma recombinante através da introdução de ácidos nucleicos que codificam para a proteína HER3 para uma célula hospedeira.

[00158] O termo "bloqueio", tal como usado na presente invenção refere-se a conter ou prevenir uma interação ou um processo, por exemplo, parando a sinalização dependente do ligante ou independente do ligante.

[00159] O termo "reconhece", tal como usado na presente invenção refere-se a um anticorpo ou o fragmento do mesmo que localiza e interage (por exemplo, liga-se) com o seu epítopo conformacional.

[00160] A frase "liga-se ao mesmo tempo" usado na presente invenção refere-se a um ligante HER que pode se ligar a um local de ligação ao ligante no receptor HER juntamente com o anticorpo HER. Isto significa que tanto o anticorpo e anticorpo podem ligar-se ao receptor HER juntos. Por uma questão de ilustração apenas, o ligante HER3 NRG, pode ligar-se ao receptor HER3, juntamente com o anticorpo HER3. Ensaio para medir a ligação do ligante em simultâneo e de anticorpos que encontram-se descritos na seção dos exemplos (por exemplo, Biacore).

[00161] O termo "falha" como usado na presente invenção refere-se a um anticorpo ou o fragmento do mesmo que não faça um determinado evento. Por exemplo, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que "não ativa a transdução de sinal" é um que não faz a transdução de sinal de disparo, um anticorpo ou o fragmento do mesmo que "falha para induzir uma alteração conformacional" é aquele que não provoca uma alteração estrutural no receptor HER, um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que estabiliza o receptor HER em um estado inativo de tal forma que o receptor HER "falha ao dimerizar" é aquele que não forma complexos de proteína-proteína.

[00162] O termo "anticorpo", tal como usado na presente invenção refere-se a anticorpos completos que interagem com (por exemplo, por meio do impedimento estérico, da ligação, da estabilizacao / distribuição espacial desestabilizadora) um epítopo HER3 e inibem a transdução de sinal. O "anticorpo" que ocorre de forma natural é uma glicoproteína que compreende pelo menos inter-cadeias de duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) ligadas por meio das pontes dissulfureto. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (na presente invenção abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é constituída por uma região variável da cadeia leve (na presente invenção abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é constituída por um domínio CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, designadas por meio das regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta por meio de três CDRs e quatro FRs organizadas a partir do terminal amino para o terminal carboxila, na seguinte ordem : FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias leves e pesadas contêm um domínio de ligação que interaja com um antigênio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos do hospedeiro ou fatores, incluindo várias células do sistema imunitário (por exemplo, as células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. O termo "anticorpo" inclui, por exemplo, anticorpos monoclonais, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos camelizados, anticorpos quiméricos, de cadeia simples Fvs (scFv), dissulfureto ligados a Fvs (sdFv), fragmentos Fab, F (ab ') fragmentos, e anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo os anticorpos, por exemplo, anticorpos anti-Id para anticorpos da presente invenção), e fragmentos de ligação ao epítopo de qualquer um dos acima. Os anticorpos podem ser de qualquer isotipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse.

[00163] Ambas as cadeias leves e pesadas sao divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos "constante" e "variável" são usados funcionalmente. A este respeito, deve notar-se que os domínios variáveis das porções tanto da cadeia leve (VL) quanto da cadeia pesada (VH) determinam o reconhecimento do antigênio e de especificidade. Por outro lado, os domínios constantes de cadeia leve (CL) e de cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem as propriedades biológicas importantes tais como secreção, mobilidade transplacentária, a ligação ao receptor Fc, ligação do complemento e similares. Por convenção, a numeração dos domínios da região constante aumenta à medida que se tornam mais distal do local de ligação ao antigênio ou terminal amino do anticorpo. O terminal N é uma região variável e no extremo do terminal C está uma região constante, e os domínios CH3 e CL realmente compreendem o terminal carboxila da cadeia leve e pesada, respectivamente.

[00164] A expressão "fragmento de anticorpo", como usado na presente invenção, refere-se a uma ou mais porções de um anticorpo que retêm a capacidade de interagir especificamente com (por exemplo, por meo do impedimento estérico, da ligação, estabilização / desestabilização, da distribuição espacial) um epítopo HER3 e sinal de inibição da transdução. Exemplos de fragmentos de ligação incluem, mas não estão limitados a, um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos dominios VL, VH, CL e CH1, frgamento F (ab ') 2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por meio de uma ligação dissulfito em ponte na região de dobradiça, um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1 ; um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, um fragmento dAb (Ward et al, (1989) Nature 341. : 544 a 546), que consiste em um domínio VH e de uma região de complementaridade isolada determinante (CDR).

[00165] Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por meio do genes separados, eles podem ser unidos, utilizando os métodos recombinantes, por meio de um ligante sintético que permite que sejam feitos como uma cadeia de proteína única, em que as regiões de pares VL e VH tem a finalidade de formar moléculas mono valentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv), vide por exemplo, Bird et al, (1988) Science 242 : 423 a 426, e Huston et al, (1988) Proc Natl Acad . Sei. 85 : 5879 a 5883). Tais anticorpos de cadeia simples também se destinam a ser englobados dentro do termo "fragmento de anticorpo". Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando as técnicas convencionais conhecidas por meio daqueles que sao versados na técnica, e os fragmentos são rastreados quanto à utilidade do mesmo modo como os anticorpos intactos.

[00166] Os fragmentos de anticorpo podem também ser incorporados em anticorpos de domínio único, maxicorpos, minicorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bis-scFv (vide, por exemplo, Hudson e Hollinger, (2005) Nature Biotechnology 23 : 1126 a 1136) . Os fragmentos de anticorpo podem ser enxertados em suportes com base em polipeptídeos tais como Fibronectina tipo III (FN3) (vide Patente U.S. No. 6.703.199, que descreve os monocorpos polipeptídicos de fibronectina).

[00167] Os fragmentos de anticorpos podem ser incorporados em moléculas de cadeia simples que compreendem um par de segmentos Fv em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que, juntamente com os polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação ao antigênio (Zapata et al., (1995) Protein Eng 8 : 1057 a 1062; . e Patente U.S. No. 5.641.870)..

[00168] O termo "epítopo" inclui qualquer determinante de proteína capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou de outra forma interagir com uma molécula. Os determinantes epitópicos consistem geralmente em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos ou de hidratos de carbono ou cadeias laterais de açúcar e podem ter características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Um epítopo pode ser "linear" ou "conformacional".

[00169] O "epítopo linear" refere-se a um epítopo com todos os pontos de interação entre a proteína e a molécula interagindo (tal como um anticorpo) que ocorre de maneira linear ao longo da sequência primária de aminoácidos da proteína (contínuo). Uma vez que o epítopo em um antigênio desejado é determinado, é possível gerar anticorpos contra o epítopo que, por exemplo, utiliza as técnicas descritas na presente invenção. Alternativamente, durante o processo de descoberta, a geração e a caracterização de anticorpos podem elucidar as informações sobre os epítopos desejáveis. A partir desta informação, é possível então competitivamente rastrear os anticorpos para a ligação ao mesmo epítopo. Uma abordagem para alcançar este objetivo é a realização de estudos de competição cruzada de encontrar anticorpos que se ligam competitivamente com o outro, por exemplo, os anticorpos competem para a ligação ao antigênio. Um processo de alto rendimento para os anticorpos "binning" com base na sua competição cruzada é descrito no Pedido de Patente Internacional No. WO 2003 / 48731. Como será apreciado por aquele que e versado na técnica, praticamente nada ao qual um anticorpo se pode ligar especificamente a um epítopo pode ser. Um epítopo pode compreende os resíduos para o qual o anticorpo se liga.

[00170] O "epítopo conformacional" refere-se a um epítopo descontínuo no qual os aminoácidos se juntam em três conformaçoes tridimensionais. Em um epítopo conformacional, os pontos de interação ocorrem entre os resíduos de aminoácidos na proteína que são separados um do outro. Em uma modalidade, o epítopo está descrito nos Exemplos da presente invenção. Em uma modalidade, o epítopo conformacional é definido por (i) os resíduos de aminoácidos HER3 265277 e 315 (de domínio 2) e (ii) resíduos de aminoácidos HER3 571,582584, 596-597, 600 a 602, 609 -615 (domínio de 4) de SEQ ID NO : 1, ou um subconjunto do mesmo. Como será apreciado por um versado na técnica, o espaço que é ocupado por um resíduo de cadeia lateral ou que cria a forma de uma molécula ajuda a determinar se um epítopo.

[00171] Geralmente, os anticorpos específicos para um antigênio alvo particular preferencialmente reconhecem um epítopo no antigênio alvo de uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas.

[00172] As regiões de um dado polipeptídeo que incluem um epítopo podem ser identificadas usando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítopos, bem conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por exemplo, os epítopos lineares podem ser determinados por, por exemplo, sintetizando concorrentemente um grande número de peptídeos em suportes sólidos, os peptídeos correspondentes a porções da molécula de proteína, e de reagir com os anticorpos, os peptídeos, enquanto os peptídeos são ainda ligados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas na técnica e estão descritas em, por exemplo, Patente U.S. No. 4.708.871 ; Geysen et al, (1984) Proc.. Natl. Acad. Sci. U.S. 8 : 3998 a 4002; . Geysen et al, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 82 : 78 a182 ; Geysen et al, (1986) Mol. Immunol. 23 : 709 a 715. Do mesmo modo, os epítopos conformacionais são prontamente identificados por meio da determinação da conformação espacial de aminoácidos tais como por, por exemplo, o hidrogênio / troca de deutério, cristalografia de raios X e de duas dimensões de ressonância magnética nuclear. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. As regiões antigênicas das proteínas podem também ser identificadas através de antigenicidade padrão e parcelas de hidropatia, tais como as calculadas utilizando, por exemplo, o programa de software Omiga versão 1.0 disponível a partir do Grupo de Oxford Molecular. Este programa de computador emprega o método de Hopp / Woods, Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci U.S. 78 : 3824 a 3828, para determinar os perfis de antigenicidade, e a técnica de Kyte-Doolittle, Kyte et al, (1982) J.MoI.. Biol. 157 : 105 a 132, para parcelas de hidropatia.

[00173] O termo "paratopo" conforme usado na presente invenção refere-se a estrutura geral de uma região de ligação que determina a ligação a um epítopo. Esta estrutura influencia ou não e em que forma a região de ligação pode ligar-se a um epítopo. Paratopo pode referir-se a um local antigênico de um anticorpo que é responsável por um fragmento do mesmo de anticorpo, ou, se ligar a um determinante antigênico. Paratopo também se refere ao idiotopo do anticorpo, e a região determinante de complementaridade (CDR), que se liga ao epítopo. Em uma modalidade, o paratopo é a região do anticorpo que se liga ao epítopo conformacional que compreende (i) os resíduos de aminoácidos HER3 265-277 e 315 (de domínio 2), e (ii) resíduos de aminoácidos HER3 571, 582-584, 596-597, 600 a 602, 609-615 (domínio de 4) de SEQ ID NO : 1, ou um subconjunto do mesmo. Em uma modalidade, o paratopo é a região do anticorpo que compreende as sequências de CDR. Em uma modalidade, o paratopo compreende as sequências que constam do quadro 1. Em uma modalidade, o paratopo compreende pelo menos um resíduo de aminoácido que se liga com os resíduos HER3 : Asn266, Lys267, Thr269, Leu268, Gln271, Glu273, Pro274, Pro276, Asn275, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597 . Em uma modalidade, o paratopo compreende pelo menos um resíduo de aminoácido que se liga com Resíduos HER3 : Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Lys602, Ile600, Arg611, Glu609, Pro612, Cys613, His614, Glu615. Como será apreciado por um versado na técnica, o paratopo de um anticorpo, ou uma sua variante, pode ser determinado da forma estabelecida pelo presente pedido.

[00174] As frases "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", como usado na presente invenção, refere-se a polipeptídeos, incluindo anticorpos, fragmentos de anticorpos, anticorpos biespecíficos, etc, que têm substancialmente idêntica à sequência de aminoácidos ou são derivados a partir da mesma fonte genética. Este termo inclui também a preparação de moléculas de anticorpos da composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma especificidade única de ligação e afinidade para um epítopo particular.

[00175] A frase "anticorpo humano", tal como usado na presente invenção, inclui os anticorpos que possuem as regiões variáveis de ambas as regiões que a estrutura e CDR são derivadas a partir de sequências de origem humana. Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante, também é derivado de sequências humanas tais como, por exemplo, sequências de linhas germinais humanas, ou versões mutantes de sequências de linhas germinais humanas ou de anticorpos que contêm sequências de consenso derivadas de estrutura humana da análise da estrutura nas SEQuências, por exemplo, tal como descrito no Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296 : 57 a 86). As estruturas e os locais dos domínios variáveis de imunoglobulina, por exemplo, CDRs, podem ser definidos usando os sistemas de numeração bem conhecidos, por exemplo, o esquema de numeração de Kabat, o esquema de numeração de Chothia, ou uma combinação de Kabat e Chothia (vide, por exemplo, Sequences of Proteins of Interesse Immunology, U.S. Departamento de Saúde e Serviços Humanos (1991), eds Kabat et al, Lazikani et al, (1997) J. Mol. Bio 273 : 927 a 948), Kabat et al, (1991). Sequências de proteínas de interesse imunológicas, edição 5., NIH nenhuma publicação. 91 a 3242 U.S. Departamento de Saúde e Serviços Humanos,. Chothia et al, (1987) J. Mol. Biol. 196 : 901 a 917 ; Chothia et al, (1989) Nature 342 : 877-883; . E Al-Lazikani et al, (1997) J. Mol. Biol.. Biol. 273 : 927 a 948.

[00176] Os anticorpos humanos da presente invenção podem incluir os resíduos de aminoácidos não codificados por meio nas SEQuências humanas (por exemplo, as mutações introduzidas por muetiquetaênese ao acaso, ou específicas do local in vitro ou por meio da mutação somática in vivo, ou uma substituição conservativa com a finalidade de promover a estabilidade ou a fabricacao).

[00177] A expressão "anticorpo monoclonal humano", tal como usado na presente invenção, refere-se aos anticorpos apresentando uma especificidade de ligação única que têm as regiões variáveis nas quais ambas as regiões de enquadramento e CDR são derivadas de sequências humanas. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por meio de um hibridoma que inclui uma célula B obtido a partir de um animal transgênico não humano, por exemplo, um camundongo transgênico, possuindo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene da cadeia leve fundida com uma célula imortalizada .

[00178] A frase "anticorpo humano recombinante", tal como usado na presente invenção, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromosomal para imunoglobulina de genes humanos ou um hibridoma preparados a partir do mesmos, anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo de humano, por exemplo, a partir de um transfectoma, anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos recombinantes, combinatórios humanos, e os anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por meio de quaisquer outros meios que envolvem o fatiamento da totalidade ou de uma porção de um gene de imunoglobulina humana, as sequências para outras sequências de DNA. Tais anticorpos recombinantes humanos têm as regiões variáveis em que as regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos a muetiquetaênese in vitro (ou, quando um animal, transgênico para sequências Ig humana quando forem usadas, a muetiquetaênese somática in vivo) e, portanto, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL do anticorpos recombinantes são sequências que, apesar de derivadas de e relacionadas com linha germinal humana nas SEQuências VH e VL, podem não existir naturalmente no repertório da linhagem germinativa humana do anticorpo in vivo.

[00179] A ligação específica entre duas entidades significa uma ligação com uma constante de equilíbrio (KA) (kon / koff) de pelo menos 102M-1, pelo menos 5x102M-1, pelo menos 103M-1, pelo menos 5x103M-1, pelo menos 104M-1at Pelo 5x104M-1, pelo menos 105M-1, pelo menos 5x105M-1, pelo menos 106M-1, pelo menos 5x106M-1, pelo menos 107M-1, pelo menos 5x107M-1, pelo menos 108M-1, pelo menos 5x108M -1, pelo menos 109M-1, pelo menos 5x109M-1, pelo menos, 1010m-1, pelo menos 5x1010M-1, pelo menos 1011M-1, pelo menos 5x1011M-1, pelo menos 1012M-1, pelo menos 5x1012M-1, pelo menos 1013M-1, pelo menos, 5x1013 M-1, pelo menos 1014M-1, pelo menos 5x1014M-1, pelo menos 1015M-1, ou, pelo menos, 5x1015M-1.

[00180] A frase "especificamente (ou seletivamente) se liga" a um anticorpo (por exemplo, um anticorpo de ligação HER3) refere-se a uma reação de ligação que é determinativa da presença de um antigênio relacionado (por exemplo, um HER3humano) em uma população heterogênea de proteínas e outros produtos biológicos. Além da constante de equilíbrio (KA) mencionada acima, um anticorpo de ligação de HER3 da presente invenção tipicamente também tem uma taxa constante de dissociação (KD) (koff / kon) inferior a 5x10-2 M, inferior a 10-2M, inferior a 5x10 -3M, inferior a 10-3M, inferior a 5x10-4 M, inferior a 10-4M, inferior a 5x10-5M, inferior a 10-5M, inferior a 5x10 a 6 M, inferior a 10 a 6M, inferior a 5x10-7 M, inferior a 10-7M, inferior a 5x10-8 M, inferior a 10-8M, inferior a 5x10-9 M, inferior a 10-9M, inferior a 5x10-10 M, menos de 10-10M, inferior a 5x10-11M, menos de 10-11M, inferior a 5x10-12 M, menos de 10-12M, inferior a 5x10-13M, inferior a 10-13M, inferior a 5x10-14M, inferior a 10-14M, inferior a 5x10-15M, ou menos do que 10-15M ou inferior, e se liga a HER3 com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior do que a sua afinidade para a ligação a um antigênio não específico (por exemplo, HSA).

[00181] Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo tem a constante de dissociação (Kd) de menos de 3000 pM, inferior a 2500 pM, inferior a 2000 pM, inferior a 1500 pM, inferior a 1000 pM, inferior a 750 pM, a menos de 500 pM, inferior a 250 pM, a menos de 200 pM, inferior a 150 pM, a menos de 100 pM, inferior a 75 pM, a menos de dez horas, a menos de 13 : 00, tal como avaliado através de um método na presente invenção descrito ou conhecido por aquele que seja versado na técnica (por exemplo, um ensaio de BIAcore, ELISA, FACS, SET) (Biacore International AB, Uppsala, Suécia). O termo "Kassoc" ou "Ka", tal como usado na presente invenção, refere-se à taxa de associação de uma interação anticorpo-antigênio em particular, ao passo que o termo "Kdis" ou "Kd", tal como usado na presente invenção, refere-se a taxa de dissociação de um determinado da interação anticorpo-antigênio. O termo "KD", tal como usado na presente invenção, refere-se a constante de dissociação, o qual é obtido a partir da razão de Kd para Ka (isto é, Kd / Ka), e é expresso como a concentração molar (M). Os valores de Kd para anticorpos podem ser determinados usando os métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para determinar a KD de um anticorpo é por meio de ressonância de plasma de superfície, ou utilizando um sistema biosensor, como um sistema Biacore ®.

[00182] O termo "afinidade", como usado na presente invenção, refere-se à força de interação entre o anticorpo eo antigênio em locais antigênicos individuais. Dentro de cada local antigênico, a região variável do anticorpo "braço" interage através de fracas forças não covalentes com o antigênio em numerosos locais, quanto maiores as interações, mais forte a afinidade.

[00183] O termo "avidez" como usado na presente invenção refere-se a uma medida informativa da estabilidade global ou a força do complexo anticorpo-antigênio. Ela é controlado por três fatores principais : anticorpo epítopo de afinidade, a valência de ambos antigênio e o anticorpo, e o arranjo estrutural das peças interactuantes. Em última análise, estes fatores definim a especificidade do anticorpo, isto é, a probabilidade de que o anticorpo é específico para um epítopo de ligação de antigênio preciso.

[00184] O termo "valência", tal como usado na presente invenção refere-se ao número de locais alvo potenciais de ligação de um polipeptídeo. Cada local de ligação alvo se liga especificamente a uma molécula alvo ou local específico (isto é, epítopos) em uma molécula alvo. Quando um polipeptídeo é composto por mais do que um local de ligação alvo, cada local de ligação alvo pode ligar-se especificamente a moléculas iguais ou diferentes (por exemplo, pode ligar-se a moléculas diferentes, por exemplo, antigênios ou epítopos diferentes, diferentes na mesma molécula).

[00185] A frase "anticorpo anetiquetaonista", tal como usado na presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga com HER3 e neutraliza a atividade biológica de sinalização de HER3, por exemplo, reduz, diminui e/ou inibe a atividade induzida da sinalização de HER3, por exemplo, de um fosfo-HER3 ou fosfo- ensaio Akt. Exemplos de ensaios estão descritos em mais detalhes nos exemplos abaixo. Consequentemente, um anticorpo que "inibe" uma ou mais destas propriedades funcionais HER3 (por exemplo, bioquímicos, imunoquí-micos, celular, fisiológica ou outra atividade biológica, ou similares), tal como determinado de acordo com metodologias conhecidas na técnica e descritas no presente documento, será entendido se relacionar a uma diminuição estatisticamente significativa na atividade específica relativa ao observado na ausência do anticorpo (por exemplo, ou quando um anticorpo de controle irrelevante de especificidade está presente). Um anticorpo que inibe os efeitos da atividade HER3 tal como o decréscimo estatisticamente significativo em pelo menos 10 % do parâmetro medido, pelo menos, 50 %, 80 % ou 90 %, e em certas modalidades de um anticorpo da presente invenção podem inibir mais do que 95 %, 98 % ou 99 % de atividade funcional de HER3, tal como evidenciado por uma redução do nível de fosforilação de HER3 celular.

[00186] A frase "anticorpo isolado" refere-se a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos que possuem especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a HER3 é substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente a outros antigênios de HER3). Um anticorpo isolado que se liga especificamente aHER3 pode, no entanto, ter uma reatividade cruzada a outros antigênios. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos.

[00187] A expressão "variante conservadora modificada" aplica-se a ambas as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. No que diz respeito a determinanas SEQuências de ácidos nucleicos, as variantes modificadas de forma conservadora refere-se aos ácidos nucleicos que codificam as sequências de aminoácidos, idênticas ou essencialmente idênticas ou onde o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, a sequências essencialmente idênticas. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codificam qualquer dada proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o aminoácido alanina. Dessa maneira, em cada posição em que uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácidos nucleicos são "variações silenciosas", que são uma espécie de variações conservadora modificados. Cada sequência de ácido nucleico na presente invenção que codifica um polipeptídeo também descreve qualquer possível variação silenciosa do ácido nucleico. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é normalmente o códon apenas para metionina, e TGG, que é normalmente o códon apenas para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Por conseguinte, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica para um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.

[00188] Para sequências polipeptídicas, "variantes modificadas de forma conservadora" inclui as substituições individuais, deleções ou adições a uma sequência polipeptídica que resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente semelhante. As tabelas de substituição conservativas que fornecem funcionalmente os aminoácidos semelhantes são bem conhecidas na técnica. Tais variantes modificadas conservadoramente são em adição a, e não excluem as variantes polimórficas, homólogos entre espécies, e alelos da presente invencao. Os seguintes oito grupos contêm aminoácidos que são substituições conservativas de uns dos outros : 1) Alanina (A), Glicina (G) ; Asparagina 3) (N), Glutamina (, 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E) Q), e 4) Arginina (R), Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V) e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W), 7) Serina (S), Treonina (T), e 8) cisteína (C), Metionina (M) (vide, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)). Em algumas modalidades, o termo "sequência de modificações conservadoras" e utilizado para se referir a modificações de aminoácidos que não afetam ou alteram as características de ligação do anticorpo, contendo a sequência de aminoácidos.

[00189] Os termos "competicao cruzada" e "concorrente cruzado" são usados na presente invenção de maneira indiferente para designar a capacidade de um anticorpo ou outro agente de ligação para interferir com a ligação de anticorpos ou outros agentes de ligação a HER3 em um ensaio competitivo de ligação padrão.

[00190] A capacidade de um anticorpo ou outro agente de ligação é capaz de interferir com a ligação de outro anticorpo ou molécula de ligação a HER3, e, portanto, se o mesmo pode ser dito para competir cruzado de acordo com a presente invenção, pode ser determinado utilizando os ensaios de ligação com de petição padrão. Um ensaio adequado envolve a utilização da tecnologia Biacore (por exemplo, utilizando o instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Suécia)), que pode medir a extensão da interação utilizando a tecnologia de ressonância plasmonica de superfície. Um outro ensaio para medir a competicao cruzada utiliza uma abordagem baseada em ELISA.

[00191] O termo "otimizado", tal como usado na presente invenção refere-se a uma sequência nucleotídica que tenha sido alterada com a finalidade de codificar uma sequência de aminoácidos utilizando códon que são preferidos na produção de células ou organismo, em geral, uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de Pi chi a, uma célula de Trichoderma, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou uma célula humana. A sequência de nucleotídeos é optimizada concebida para reter completamente ou tanto quanto possível a sequência de aminoácido originalmente codificada pela sequência de nucleotídeos de partida, que é também conhecida como sequência "parental".

[00192] Os ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação dos anticorpos para HER3 de várias espécies são conhecidos na técnica, incluindo por exemplo, ELISAs, RIAs e western blots. Ensaios adequados são descritos em detalhe nos Exemplos. A cinética de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) dos anticorpos também pode ser avaliada por meo dos ensaios padrão conhecidos na técnica, tais como por meio da análise Biacore, ou FACS afinidade relativa (Scatchard). Os ensaios para avaliar os efeitos dos anticorpos nas propriedades funcionais dos ensaios de HER3 (por exemplo, receptor de ligação, via o seu modulador) são descrioas em maior detalhe nos Exemplos.

[00193] As frases "por cento idêntico" ou "porcentagem de identidade", no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou de polipeptídeos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são a mesma. Duas sequências são "substancialmente idênticas" se duas sequências têm uma percenetiquetaem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos (isto é, identidade de 60 %, opcionalmente, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 99 % de identidade ao longo de uma região determinada, ou, quando não especificada, ao longo de toda a sequência), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação, ou região designada como medido utilizando um dos algoritmos de comparação de sequências seguintes ou pelo alinhamento manual e inspeção visual. Opcionalmente, a identidade existe ao longo de uma região que é pelo menos cerca de 50 nucleotídeos (ou 10 aminoácidos) de comprimento, ou mais de preferência ao longo de uma região que é de 100 a 500 ou 1000 ou mais nucleotídeos (ou 20, 50, 200 ou mais aminoácidos ácidos) de comprimento.

[00194] Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como sequência de referência, em que as sequências de teste são comparadas. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências de teste, e as sequências de referência são introduzidas em um computador, são designadas as subsequências coordenadas, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são designados. Os parâmetros do programa padrão podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequências calcula então a percenetiquetaem de identidades de sequência para as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.

[00195] Uma "janela de comparação", tal como usado na presente invenção, inclui referência a um segmento de qualquer uma das várias posições contíguas selecionadas a partir do grupo que consiste em desde 20 a 600, geralmente cerca de 50 a cerca de 200, mais habitualmente cerca de 100 a cerca de 150, em que uma sequência pode ser comparada com uma sequência referência do mesmo número de posições contíguas, após as duas sequências terem sido alinhadas optimamente. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser realizado, por exemplo, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2 : 482 c, por meio do algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. Biol. 48 : 443, por meio da pesquisa para o método de similaridade de Pearson e Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85 : 2444, por meio das implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no pacote de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Ciência Dr., Madison, WI), ou por meio do alinhamento manual e inspeção visual (vide, por exemplo, Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology).

[00196] Dois exemplos de algoritmos que são adequados para determinar a percenetiquetaem de identidade de sequência e semelhança de sequências sao o BLAST e BLAST 2,0 de algoritmos, que são descritos em Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25 : 3389 a 3402 e Altschul et al, (1990) J. Mol. Biol.. Biol. 215 : 403 a 410, respectivamente. O software para realização de análises BLAST está publicamente disponível através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia. Este algoritmo envolve primeiramente identificar os pares de pontuação de alta sequência (HSPs), identificando as palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, o que pode vir a corresponder ou satisfazer alguns valores positivos com T limiar quando alinhados com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é referido como o limite de pontuação das palavras vizinhas (Altschul et al., Supra). Estes palavras vizinhas iniciais agem como sementes para iniciar as buscas para encontrar HSPs mais que os contenham. Os acertos de palavras são estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência, tão longe quanto a pontuação de alinhamento cumulativo pode ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas utilizando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes ; sempre > 0) e N (pontuação de penalização para resíduos de desacoplamento ; sempre < 0). Para as sequências de aminoácidos, uma matriz de classificação é utilizada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acessos de palavras em cada direção e interrompida quando : a pontuação de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X a partir do seu valor máximo alcançado ; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa, ou o fim de qualquer sequência é atingida. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) utiliza como defeito um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) ou 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para as sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como defeito um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (vide Henikoff e Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. 89 : 10915 ) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as cadeias.

[00197] O algoritmo BLAST realiza também uma análise estatística da semelhança entre as duas sequências (vide, por exemplo, Karlin e Altschul, Proc (1993). Natl. Acad. Sei. U.S. 90 : 5873 a 5787). Uma medida da similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade da menor soma (P (N)), a qual fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos que ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a probabilidade da soma menor em uma comparação entre o ácido nucleico teste com o ácido nucleico de referência for menor do que cerca de 0,2, mais preferivelmente menos do que cerca de 0,01, e mais preferivelmente menos do que cerca 0.001.

[00198] A percenetiquetaem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode também ser determinada utilizando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4 : 11 a 17), que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), utilizando uma tabela de resíduos PAM120 de peso, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Além disso, a percenetiquetaem de identidade entre as duas sequências de aminoácidos pode ser determinada utilizando o Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. Biol. 48 : 444a453) o algoritmo que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em www.gcg.com), utilizando quer uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1,2, 3, 4, 5, ou 6.

[00199] Exceto a percenetiquetaem de identidade da sequência mencionada acima, uma outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos são substancialmente idênticas é que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico é imunologicamente de reação cruzada com os anticorpos criado contra o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico, como descrito abaixo. Dessa maneira, um polipeptídeo é tipicamente substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por meio das substituições conservativas. Outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas ou seus complementos hibridam uma à outra sob condições estringentes, como descrito abaixo. Ainda uma outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é a de que os mesmos iniciadores podem ser utilizados para amplificar a sequência.

[00200] A frase "ácido nucleico" é usada na presente invenção alternadamente com o termo "polinucleotídeo" refere-se ao desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros destes na forma, quer simples ou de cadeia dupla. O termo engloba os ácidos nucleicos contendo os análogos de nucleotídeos conhecidos ou resíduos ou ligações de estrutur principal modificados, que são sintéticos, que ocorrem de forma natural, e que ocorrem de forma não natural, que têm propriedades de ligação semelhantes, como o ácido nucleico de referência e que são metabolizados de um modo semelhante ao nucleotídeos de referência. Exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metila, fosfonatos de quiral-metila, peptídeo de ácidos nucleicos 2-O-metil-ribonucleotídeos (PNA).

[00201] A menos que seja usado de uma outra maneira, uma sequência de ácido nucleico particular engloba também implicitamente as variantes modificadas de forma conservadora dos mesmos (por exemplo, substituições de códon degenerados) e sequências complementares, assim como a sequência indicada explicitamente. As substituições de códon especificamente, como detalhado abaixo, degeneradas podem ser conseguidas por meio da geração de sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códon selecionado (ou todos) está substituído com resíduos de bases mistas e/ou desoxiinosina (Batzer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19 : 5081,. Ohtsuka et al, (1985) J. Biol Chem 260 : 2605 a 2608, e Rossolini et al, (1994) Mol. Cell Probes 8 : 91 a 98).

[00202] A frase "operacionalmente ligado" refere-se a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de polinucleotídeos (por exemplo, DNA). Tipicamente, ele refere-se à relação funcional de uma sequência reguladora da transcrição de uma sequência transcrita. Por exemplo, uma sequência promotora ou potenciadora está operativamente ligada a uma sequência codificante que estimula ou modula a transcrição da sequência de codificação em uma célula hospedeira adequada ou outro sistema de expressão. Geralmente, os promotores de transcrição que são sequências reguladoras operativamente ligadas a uma sequência transcrita são fisicamente contíguos à sequência transcrita, ou seja, são cis-ating. No entanto, algumas sequências reguladoras da transcrição, tais como potenciadores, não precisam de estar fisicamente localizadas contíguas ou em estreita proximidade com as sequências codificantes cuja transcrição venham a melhoram.

[00203] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são utilizados alternadamente na presente invenção para referir um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um produto químico artificial mimético de um aminoácido que ocorre de uma maneira natural correspondente, bem como os polímeros de aminoácidos não naturais do polímero de aminoácido que ocorrem de maneira natural. A menos que seja usado de uma outra maneira, uma determinada sequência de polipeptídeo engloba também implicitamente as variantes modificadas de forma conservadora da mesma.

[00204] O termo "sujeito" inclui animais humanos e não-humanos. Animais não-humanos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não-humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios e répteis. Exceto quando indicado de uma outra maneira, os termos "paciente" ou "sujeito" são usados na presente invençãos de maneira indiferente.

[00205] O termo "agente anti-câncer" designa qualquer agente que possa ser usado para tratar um distúrbio da proliferação celular tais como o câncer, incluindo os agentes citotóxicos, agentes quimioterapêuticos, radioterapia e agentes radioterapêuticos, agentes anti-cancerígenos orientados e agentes imunoterapêuticos.

[00206] O termo "tumor" refere-se ao crescimento de células neoplásicas e de proliferação, seja maligno ou benigno, e todas as células pré-cancerosas e cancerosas e tecidos.

[00207] O termo "atividade anti-tumor" significa uma redução na taxa de proliferação de células de tumor, a viabilidade, ou a atividade metastática. Uma maneira possível de mostrar a atividade anti-tumor mostra um declínio na taxa de crescimento de células anormais que surgem durante o tratamento ou a estabilidade do tamanho do tumor ou a redução. Tal atividade pode ser avaliada utilizando aceites in vitro ou em modelos de tumores in vivo, incluindo, mas não limitado a modelos de xenoenxerto, modelos de aloenxerto, modelos de MMTV, e outros modelos conhecidos conhecidos na técnica para investigar a atividade anti-tumor.

[00208] A "neoplasia maligna" refere-se a um tumor benigno ou não-câncer. Tal como usado na presente invenção, o termo "câncer" inclui uma malignidade caracterizada por meio do crescimento celular desregulado ou descontrolado. Os cânceres exemplares incluem : carcinomas, sarcomas, leucemias, e linfomas. O termo "câncer" inclui tumores primários malignos (por exemplo, aqueles em que as células não migradas para locais no corpo do sujeito que não seja o local do tumor original) e tumores malignos secundários (por exemplo, os provenientes de metástases, a migração de células tumorais para locais secundários, que são diferentes do local do tumor original).

[00209] Vários aspectos da presente invenção são descritos em maior detalhe nas seções e subseções seguintes.

Estrutura e mecanismo de ativação de receptores HER

[00210] Todos os quatro receptores HER têm um domínio de ligação ao ligante extracelular, um domínio transmembranar único e um domínio contendo tirosina-quinase citoplasmática. O domínio intracelular da tirosina-quinase dos receptores HER é altamente conservado, embora o domínio de cinase de HER3 contenha substituições de aminoácidos críticos e, por conseguinte, não possui atividade de cinase (Guy et al, (1994) : PNAS 91, 8132 a 8136). A dimerização induzida pelo ligante dos receptores HER induz a ativação da cinase, transfosforilação do receptor em resíduos de tirosina na cauda do terminal C, seguido de recrutamento e ativação dos efectores intracelulares de sinalização (Yarden e Sliwkowski, (2001) Nature Rev 2, 127 a 137 ; Jorissen et al, (2003) Exp. Cell Res. 284, 31 a 53 .

[00211] As estruturas cristalinas dos domínios extracelulares de HERS tem fornecido algum esclarecimento sobre o processo de ativação induzida pelo ligante do receptor (Schlessinger, (2002) Cell 110, 669 a 672). O domínio extracelular do receptor HER cada consiste em quatro subdomínios : subdomínio I e III cooperam na formação do local de ligação ao ligante, enquanto que o subdomínio II (e talvez também subdomínio IV) participa na dimerização do receptor via interações direta do receptor-receptor . Nas estruturas de ligante ligado a HER1, um grampo β (denominado o loop de dimerização) do subdomínio II interage com o circuito de dimerização do receptor parceiro, mediando a dimerização do receptor (Garrett et al, (2002) Cell 110, 763 a 773 ; Ogiso et al., (2002) Cell 110, 775 a 787). Em contrapartida, nas estruturas do HER1, HER3 e HER4 inativo, o loop de dimerização está envolvido em interações intramoleculares com subdomínio IV, o que impede a dimerização do receptor na ausência de ligante (Cho e Leahy, (2002) Science 297, 133 a 1333 ; Ferguson et al, (2003) Mol Cell 12, 541 a 552, Bouyan et al, (2005) PNAS102, 15024 a 15029). A estrutura do HER2 é única entre as dela. Na ausência de um ligante, HER2 tem uma conformação que se assemelha ao estado de ligante ativado de HER1 com um loop de dimerização saliente, disponível para interagir com outros receptores HER (Cho et al, (2003) Nature 421, 756 a 760,. Garrett et al., (2003) Mol Cell 11, 495 a 505). Isto pode explicar a capacidade heterodimerização melhorada do HER2.

[00212] Apesar das estruturas cristalinas do receptor HER fornecer um modelo para a homo- e heterodimerização do receptor HER, o pano de fundo para a prevalência de alguns homo e heterodímeros HER em detrimento de outros (Franklin et al., (2004) Cancer Cell 5, 317-328) bem como o papel conformacional de cada um dos domínios em dimerização do receptor e auto-inibição (Burgess et al, (2003) Mol. Cell 12, 541-552,.. Mattoon et al, (2004) PNAS101, 923-928) permanece pouco clara. Como descrito abaixo, estrutura cristalina de raios X HER3 fornece uma mais visões internas.

Estrutura HER3 e epítopos conformacionais

[00213] Um epítopo conformacional ao ual as proteínas se ligam ao antigênio, por exemplo, anticorpos anti-HER3 de ligação, é proporcionadona presente invenção. Pela primeira vez, a estrutura tridimensional de uma forma truncada (resíduos 20 a 640) do domínio extracelular de HER3 complexada com um anticorpo têm sido mostradas. O complexo HER3-Fab MOR09823 e o HER3-MOR09825 foram determinados a uma resolução 3.2a e 3,4 Å de, respectivamente, e mostrado na Figura 5A. A presente invenção também demonstra pela primeira vez um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a um estado inativo de HER3 e estabiliza o receptor no estado inativo. Os anticorpos da presente invenção também permitem a ligação simultânea de um ligante de HER3, tais como a neuregulina, com o receptor HER3.

[00214] Apesar de não ser obrigado a fornecer uma teoria, um possível modelo para o mecanismo de ação é que normalmente HER3 existe em um estado inativo (fechado, amarrado) ou ativo (aberto). A ligação do ligante induz uma alteração conformacional que tal HER3 existe no estado (aberto) ativo que é capaz de parceiros heterodímero de ligação, resultando em ativação de sinalização a jusante. Anticorpos como o MOR09823 ligam o estado inativo (tethered) de HER3 mas não bloqueam o local de ligação do ligante. Anticorpos, tais como MOR09823 inibem HER3, impedindo os rearranjos estruturais ligantes induzidos necessários para HER3 a transição para a conformação ativa, evitando assim a transdução de sinal. Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção ou os os fragmentos dos mesmos se ligam ao estado (com amarras) inativo de HER3, mas não bloqueiam o local de ligação do ligante. Em uma outra modalidade, os anticorpos ou o fragmentos dos mesmos inibem a HER3, impedindo os rearranjos do ligante induzidas estruturais necessários para HER3 a transição para a conformação ativa, evitando assim a transdução de sinal. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo estabiliza (diretamente mantém, trava, amarras, mantém, de preferência, liga, ou favorece) o receptor HER3 no estado inativo ou conformação. Em uma modalidade, o receptor HER3 inativo pode ser susceptível a internalização ou degradação preferencial de tal forma que leva a perda de receptores de superfície celular HER3. Os dados biológicos apresentados na seção dos Exemplos suporta estas modalidades.

[00215] Os cristais de HER3 podem ser preparados por meio da expressão de uma sequência de nucleotídeos codificando HER3 ou uma sua variante em uma célula hospedeira adequada, e depois cristalizando a (s) proteína (s) purificada (s) na presença do Fab HER3 relevantes visados.

[00216] Os polipeptídeos HER3 podem também ser produzidos como proteínas de fusão, por exemplo para auxiliar na extração e purificação. Os exemplos de parceiros de fusão incluem a proteína glutationa-S-transferase (GST), histidina (HIS), hexa-histidina (6HIS), ligante GAL4 (DNA e/ou domínios de ativação da transcrição) e beta-galactosidase. Também pode ser conveniente incluir um local de clivagem proteolítica entre o parceiro da proteína de fusão e a sequência protéica de interesse com a finalidade de permitir a remoção de sequências de proteínas de fusão.

[00217] Após expressão, as proteínas podem ser purificadas e/ou concentradas, por exemplo, por meio da cromatografia de afinidade com metal imobilizado, cromatografia de troca iônica, e/ou filtração em gel.

[00218] A (s) proteína (s) pode (m) ser cristalizada (s) utilizando as técnicas descritas na presente invenção. Geralmente, em um processo de cristalização, contendo uma gota da solução de proteína é misturada com o tampão de cristalização e deixada equilibrar em um recipiente selado. O equilíbrio pode ser conseguido por meio das técnicas conhecidas, tais como a "gota em suspensão" ou método de "sentamento da gota". Nestes métodos, a gota é pendurada acima ou sentada ao lado de um reservatório muito maior do tampão de cristalização e o equilíbrio é atingido por meio de difusão de vapor. Alternativamente, o equilíbrio pode ocorrer através de outros métodos, por exemplo, sob óleo, através de uma membrana semi-permeável, ou através da difusão livre de interface (Vide, por exemplo, Chayen et al, Methods (2008) Nature, 147 a 153.

[00219] Uma vez que os cristais tenham sido obtidos, a estrutura pode ser resolvida através de técnicas conhecidas de difração de raios X. Muitas técnicas usam cristais quimicamente modificados, tais como os modificados por meio da derivatização de átomo pesado para as fases aproximados. Na prática, um cristal é embebido em uma solução que contém os sais de metais pesados de átomos, ou compostos organometálicos, cloreto, por exemplo, chumbo, tiomalato de ouro, timerosal ou acetato de uranila, que se pode difundir através do cristal e ligar à superfície da proteína. A (s) localização (ões) do (s) átomo (s) de metal pesado ligado pode então ser determinado por meio da análise de raios-X de difração do cristal embebido. Os padrões obtidos na difração de um feixe monocromático de raios X pelos átomos (centros de dispersão) do cristal pode ser resolvido por meio de equações matemáticas para dar coordenadas matemáticas. Os dados de difração são utilizados para calcular um mapa da densidade eletrônica da unidade repetitiva do cristal. Outro método de obtenção de informação de fase está a utilizar uma técnica conhecida como a substituição molecular. Neste método, os algorítimos de rotação e de translação são aplicados a um modelo de pesquisa derivado de uma estrutura relacionada, que resulta em uma orientação aproximada para a proteína de interesse (vide Rossmann, (1990) Acta Crystals A 46, 73 a 82). Os mapas de densidade eletrônica são utilizados para estabelecer as posições dos átomos individuais dentro da célula unitária do cristal (Blundel et al., (1976) Protein Crystallography, Academic Press).

[00220] A presente memória descritiva descreve, pela primeira vez, a estrutura tridimensional de HER3 e um Fab de um anticorpo anti-HER3. Os limites do domínio aproximados de domínio extracelular de HER3 são como se segue ; domínio 1 : 20 a 207 aminoácidos; domínio 2 : 208 a 328 aminoácidos; domínio 3 : 329 a 498 aminoácidos, e do domínio 4 : 499 a 642aminoácidos. A estrutura tridimensional de HER3 e o anticorpo também permite a identificação de locais de ligação alvo para potenciais moduladores de HER3. Os locais alvo preferenciais de ligação são aqueles envolvidos na ativação de HER3. Em uma modalidade, o local de ligação alvo está localizado dentro do domínio 2 e do domínio 4 de HER3. Dessa maneira, um anticorpo ou o fragmento que se liga a um ou outro domínio 2 ou domínio 4, e de preferência de ambos os domínios são capazes de modular a ativação por HER3 ou impedindo os domínios de dissociação entre si ou mediante a alteração das posições relativas dos domínios. Dessa maneira, a ligação de um anticorpo ou um fragmento do mesmo, para os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 ou domínio 4 pode causar a proteína para adoptar uma conformação que impede a ativação. A presente invenção também demonstra pela primeira vez um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que pode simultaneamente ligar-se com um ligante de HER3, tais como a neuregulina.

[00221] Em algumas modalidades, o anticorpo ou um fragmento do mesmo reconhece um estado específico de conformação de HER3 tal que o anticorpo ou o fragmento do mesmo impede HER3 de interagir com um co-receptor (incluindo, mas não limitado a, HER1, HER2 e HER4). Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento do mesmo impede HER3 de interagir com um co-receptor, estabilizando o receptor HER3 em um estado inativo ou fechado. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo, estabiliza o receptor HER3 ligando-se aos resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 de HER3. Neste estado inativo, o circuito de dimerização localizado dentro do domínio 2, não é exposto e, por conseguinte, disponível para a dimerização com outros co-receptores (incluindo, mas não limitado a, HER1, HER2 e HER4). Em algumas modalidades, o anticorpo ou um fragmento do mesmo liga-se à proteína HER3 humana tendo um epítopo conformacional que compreende (i) os 265 a 277 resíduos de aminoácidos HER3 e 315 (de domínio 2) e (ii) 571 Resíduos HER3 de aminoácidos, 582 a 584, 596 a 597, 600 a 602, 609 a 615 (domínio de 4) de SEQ ID NO : 1, ou um subconjunto do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou um fragmento do mesmo liga-se a aminoácidos dentro ou sobrepostos aos 265 a 277 resíduos de aminoácidos e 315 (de domínio 2) e (ii) 571 Resíduos HER3 de aminoácidos, 582 a 584, 596 a 597, 600 a 602, 609 a 615 (domínio de 4) de SEQ ID NO : 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou um fragmento do mesmo liga-se a aminoácidos dentro (e/ou sequências de aminoácidos que consistem em) dos 265 a 277 resídeuos aminoácidos e 315 (de domínio 2) e (ii) 571 Resíduos HER3 de aminoácidos, 582 a 584, 596 a 597, 600 a 602, 609 a 615 (domínio de 4) de SEQ ID NO : 1, ou um subconjunto do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou um fragmento do mesmo se liga ao epítopo conformacional tal que restringe a mobilidade de domínio 2 e do domínio 4, estabilizando-o em uma conformação inativa ou fechada. A incapacidade com a finalidade de formar o resultado de conformação ativa a incapacidade para ativar a transdução de sinal. Em algumas modalidades, o anticorpo ou um fragmento do mesmo se liga ao epítopo conformacional de tal modo que o circuito de dimerização oclui dentro do domínio 2, tornando-o disponível para interação receptor-receptor. A incapacidade com a finalidade de formar homo- ou heterodímeros resulta em uma incapacidade para ativar a transdução de sinal.

[00222] Em um outro aspecto, o anticorpo ou um fragmento do mesmo se liga a um epítopo conformacional do receptor HER, tal como um receptor HER3. Em uma modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo, estabiliza o receptor HER3, no estado inativo. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo liga-se para o estado ativo do receptor HER3 e dirige-o no estado inativo como o estado inativo. Dessa maneira, o anticorpo ou um fragmento do mesmo pode ligar-se tanto o estado ativo ou inativo de HER3, mas favorece a formação do estado inativo e impulsiona o estado ativo de HER3 para o estado inativo, o que resulta em uma incapacidade de ativar a transdução de sinal.

[00223] Em um outro aspecto, o anticorpo ou um fragmento do mesmo se liga a um epítopo conformacional do receptor HER, tal como um receptor HER3, onde a ligação do anticorpo ou um fragmento do mesmo, estabiliza o receptor HER3 em um estado inativo de tal forma que o receptor HER3 falha de dimerizar com um co- receptor, com a finalidade de formar um complexo receptor-receptor. A incapacidade com a finalidade de formar um complexo receptor-receptor impede a ativação da transdução do sinal, tanto a dependente do ligante quanto a independente do ligante.

[00224] Em um outro aspecto, o anticorpo ou um fragmento do mesmo se liga a um epítopo conformacional do receptor HER tais como o receptor de HER3, em que a ligação do anticorpo ou o fragmento do mesmo para o receptor HER3 permite a dimerização com um coreceptor com a finalidade de formar um complexo receptor-receptor inativo. A formação do complexo receptor-receptor impede a ativação inativa da transdução de sinal independente do ligante. Por exemplo, a transdução de sinal independente do ligante, HER3 pode existir em um estado inativo, no entanto, a sobre-expressão de HER2 causa HER2 -HER3 a formação do complexo, no entanto, estes complexos resultantes são inativos e previnem a ativação da transdução de sinal independente do ligante.

[00225] A estrutura descrita também permite identificar os Resíduos de aminoácidos HER3 específicos do núcleo para a interface de interação de um fragmento do mesmo de anticorpo, ou (por exemplo, MOR09823) com HER3. Esta foi definida como os resíduos que se encontram dentro da 5A da cadeia VH de proteína MOR09823. Os resíduos do núcleo são os seguintes : Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597.

[00226] As estruturas também podem ser utilizadas para identificar os limites dos Resíduos HER3 de aminoácidos para a interface de interação com um anticorpo ou um fragmento do mesmo (por exemplo, MOR09823). Estes resíduos podem ser Resíduos HER3 que eram 5 a 8A da cadeia de proteína VH MOR09823. Os resíduos de contorno são os seguintes : Pro262, Val264, Tyr265, Phe270, Leu272, Thr278, Lys314, Gly316, Glu321, Asn566, Ser568, Gly569, Ser570, Thr572, Arg580, Asp581, Gly582, Gly595, Gly598, Ile600.

[00227] A estrutura descrita também permite identificar os Resíduos de aminoácidos HER3 específicos do núcleo para a interface de interação de um fragmento do mesmo de anticorpo, ou (por exemplo, MOR09823) com HER3. Esta foi definida como os resíduos que se encontram dentro de 5a da cadeia VL da proteína MOR09823. Os resíduos do núcleo são os seguintes : Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615.

[00228] As estruturas foram igualmente utilizadas para identificar os limites dos Resíduos HER3 de aminoácidos para a interface de interação com um anticorpo ou um fragmento do mesmo (por exemplo, MOR09823). Estes resíduos foram os Resíduos HER3 que eram 5 a 8A da cadeia VL de proteína MOR09823. Os resíduos de contorno são os seguintes : Asn266, Thr269, Asp571, Arg580, Asp581, His584, Pro590, Ala596, Pro599, Tyr601, Tyr603, Asp605, Gln607, Cys610, Asn616, Cys617, Cys621, Gly623, Pro624.

[00229] Como pode ser observado nas Tabelas 11 e 12 (MOR09823) e as Tabelas 13 e 14 (MOR09825), respectivamente, a cadeia pesada é principalmente envolvida na ligação ao antigênio da proteína de ligação para os resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 do epítopo com menos interações com os resíduos de aminoácido de domínio 4, enquanto que a cadeia leve é principalmente envolvida com a ligação a resíduos de aminoácidos dentro do domínio 4 de interações com o epítopo com menos resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2.

[00230] Como tal, um versado na técnica, tendo em conta os presentes ensinamentos, pode prever que os resíduos e as superfícies das proteínas de ligação ao antigênio podem ser variadas sem interferir indevidamente com a capacidade da proteína de ligação ao antigênio se ligar a HER3.

[00231] Os aminoácidos essenciais de interação da interface aminoácidos foram determinados como sendo todos os resíduos de aminoácidos com pelo menos um átomo de menos do que ou igual a 5-a a partir da proteína parceira de HER3. 5A foi escolhido como a distância de corte de núcleo para permitir a região de átomos dentro de um raio de van der Waals mais uma possível ligação de hidrogênio mediada pela água. Os aminoácidos da interface de fronteira de interação foi determinada como todos os resíduos de aminoácidos com pelo menos um átomo menos do que ou igual a 8-A a partir da proteína parceira de HER3, mas não incluídos na lista de interação núcleo.

[00232] Em algumas modalidades, qualquer proteína de ligação do antigênio que se liga a, tampas, ou impede MOR09823 de interagir com qualquer dos resíduos acima referidos podem ser empregues para se ligar ou neutralizar a HER3. Em algumas modalidades, os anticorpos ou o fragmentos dos mesmos se liga a ou interage com, pelo menos, um dos seguintes resíduos de HER3 (SEQ ID NO : 1) : Asn266, Lys267, Thr269, Leu268, Gln271, Glu273, Pro274, Pro276, Asn275, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. Em algumas modalidades, os anticorpos e fragmentos dos mesmos se liga a ou interage com, pelo menos, um dos seguintes resíduos de HER3 (SEQ ID NO : 1) : Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Lys602, Ile600, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. Em algumas modalidades, os anticorpos ou o fragmentos dos mesmos se liga a ou interage com, pelo menos, um dos seguintes resíduos de HER3 (SEQ ID NO : 1) : Asn266, Lys267, Thr269, Leu268, Gln271, Glu273, Pro274, Pro276, Asn275, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. Em algumas modalidades, os anticorpos ou o fragmentos dos mesmos se liga a ou interage com uma combinação dos seguintes Resíduos HER3 (SEQ ID NO : 1) : Asn266, Lys267, Thr269, Leu268, Gln271, Glu273, Pro274, Pro276, Asn275, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. Em algumas modalidades, os anticorpos ou o fragmentos dos mesmos se liga a ou interage com todas os seguintes resíduos HER3 (SEQ ID NO : 1) : Asn266, Lys267, Thr269, Leu268, Gln271, Glu273, Pro274, Pro276, Asn275, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento do mesmo é 5 angstroms, de um ou mais dos resíduos acima mencionados. Em algumas modalidades, o anticorpo ou um fragmento do mesmo é 5 a 8 angstroms de um ou mais dos resíduos acima mencionados. Em algumas modalidades, o anticorpo ou um fragmento do mesmo interage, bloqueia, ou seja dentro de 8 angstroms de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 dos resíduos acima.

[00233] A disponibilidade de estruturas 3D de HER3 e do complexo de HER3 : MOR09823, por exemplo, fornece a estrutura para explorar outros anticorpos HER3 mais detalhadamente. A estrutura 3D de HER3 permite que os epítopos para os anticorpos monoclonais a ser mapeada e seu modo de ação inferido, uma vez que alguns inibem, estimulam alguns e outros não têm qualquer efeito sobre o crescimento celular. O epítopo conformacional de MOR09823 foi localizado para os domínios 2 e 4 de HER3. A disponibilidade das estruturas 3D deste receptor irá facilitar a determinação do mecanismo de ação preciso destes agentes inibidores e concepção de novas abordagens para interferir com a função do receptor HER3. Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção se ligam ao mesmo epítopo conformacional como MOR09823.

[00234] Em algumas modalidades, o epítopo conformacional ligado por meio de qualquer um dos anticorpos enumerados na tabela 1 é especialmente útil. Em certas modalidades, um epítopo conformacional HER3 pode ser utilizado para isolar os anticorpos de fragmentos de ligação que a HER3. Em certas modalidades, um epítopo conformacional HER3 pode ser utilizada para gerar os anticorpos ou os fragmentos dos mesmos que se ligam a HER3. Em certas modalidades, um epítopo conformacional HER3 pode ser utilizado como um imunogênio para produzir os anticorpos de fragmentos que se ligam ao epítopo conformacional HER3. Em certas modalidades, um epítopo conformacional HER3 pode ser administrado a um animal, e os anticorpos que se ligam a HER3 pode, subsequentemente, ser obtido a partir do animal.

[00235] Em algumas modalidades, o (s) domínio (s) / região (ões) que contenham os resíduos que estão em contato com ou são enterrados por meio de um anticorpo podem ser identificados através da mutação de resíduos específicos em HER3 (por exemplo, um antigênio do tipo selvagem) e determinar se o anticorpo ou o fragmento do mesmo pode ligar os mutantes ou variante HER3 da proteína ou medr as diferenças de afinidade do tipo selvagem. Fazendo uma série de mutações individuais, os resíduos que desempenham um papel direto na ligação ou que estão em proximidade suficientemente estreita para que o anticorpo de tal modo que a mutação possa afetar a ligação entre o anticorpo e o antigênio pode ser identificada. A partir de um conhecimento destes aminoácidos, o (s) domínio (s) ou da região (ões) do antigênio (HER3), que contém os resíduos em contato com o anticorpo ou coberto pelo anticorpo pode ser elucidado. A muetiquetaênese utilizando técnicas conhecidas, tais como varrimento de alanina pode ajudar a definir os epítopos funcionalmente relevantes. A muetiquetaênese utilizando um protocolo de ácido arginina / glutâmico de varrimento pode também ser empregue (vide, por exemplo, Nanevicz et al., (1995), J. Biol. Chem. 270 (37) : 21619 a 21625 e Zupnick et al., (2006), J. Biol. Chem. 281 (29) : 20464 a 20473). Em geral, arginina e ácido glutâmico são substituídos (tipicamente individualmente) para um aminoácido no polipeptídeo do tipo selvagem, pois estes aminoácidos estão carregadas e volumosos e, portanto, têm o potencial para destruir a ligação entre uma proteína de ligação ao antigênio e um antigênio da região do antigênio em que a mutação é introduzida. Argininas que existem no antigênio de tipo selvagem são substituídos com ácido glutâmico. Uma variedade de tais mutantes individuais pode ser obtida e os resultados de ligação recolhidos e analisados para determinar quais os resíduos afetam a ligação. Uma série de mutantes de antigênios HER3 pode ser criada, com cada antigênio mutante possuindo uma única mutação. A ligação de cada antigênio HER3 mutante com vários anticorpos HER3 ou os fragmentos dos mesmos pode ser medida e comparada com a capacidade do anticorpo selecionado um ou os os fragmentos dos mesmos se ligam a HER3 do tipo selvagem (SEQ ID NO : 1).

[00236] Uma alteração (por exemplo, uma redução ou aumento) de ligação entre um anticorpo ou o fragmento do mesmo e um HER3 mutante ou variante, tal como usado na presente invenção, significa que há uma alteração na afinidade de ligação (por exemplo, tal como medido por meio dos métodos conhecidos, tais como o teste ou o ensaio Biacore baseado no grânulo abaixo descrito nos exemplos), EC50, e/ou uma alteração (por exemplo, uma redução) na capacidade total de ligação da proteína de ligação ao antigênio (por exemplo, como evidenciado por meio de uma diminuição no Bmax em uma parcela de ligação do antigênio na concentração da proteína em função da concentração de antigênio). Uma alteração significativa na ligação indica que o resíduo mutado está envolvido na ligação do anticorpo ou o fragmento do mesmo.

[00237] Em algumas modalidades, uma redução significativa em meio de ligação, que a afinidade de ligação, EC50, e/ou a capacidade entre um anticorpo, ou os fragmentos dos mesmos, e um antigênio de HER3 mutante é reduzido em mais de 10 %, superior a 20 %, superior a 40 %, superior a 50 %, superior a 55 %, superior a 60 %, superior a 65 %, superior a 70 %, superior a 75 %, superior a 80 %, superior a 85 %, superior a 90 % ou superior a 95 % relativamente a ligação entre o anticorpo ou o fragmento um HER3 e um tipo selvagem (por exemplo, NO, SEQ ID NO : 1).

[00238] Em algumas modalidades, a ligação de um anticorpo ou o fragmentos dos mesmos é significativamente reduzida ou aumentada para uma proteína HER3 mutante que tem uma ou mais (por exemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais ) mutações em comparação com uma proteína HER3 do tipo selvagem (por exemplo, NO, SEQ ID NO : 1).

[00239] Embora as formas variantes sejam referenciados em relação à sequência do tipo selvagem mostrada na SEQ ID NO : 1, será apreciado que, nas variantes alélicas de fatiamento HER3 os aminoácidos podem diferir. Os anticorpos ou os fragmentos dos mesmos que mostram a ligação significativamente alterada (por exemplo, inferior ou superior de ligação) para tais formas alélicas de HER3 estão também contemplados.

[00240] Em adição aos aspectos estruturais gerais de anticorpos, uma interação mais específica entre o paratopo e o epítopo pode ser examinada através de abordagens estruturais. Em uma modalidade, a estrutura dos CDRs contribuir para um paratopo, através do qual um anticorpo é capaz de se ligar a um epítopo. A forma de tais paratopo pode ser determinada de uma série de maneiras. As abordagens tradicionais de exame estruturais podem ser utilizadas, tais como NMR ou cristalografia de raios-x. Estas abordagens podem examinar a forma do paratopo sozinho, ou enquanto ele está ligado para o epítopo. Alternativamente, os modelos moleculares podem ser gerados in silico. A estrutura pode ser gerada através de modelagem por homologia, com a ajuda de uma embalagem comercial, como pacote de modelagem de InsightII Accelrys (San Diego, Calif.) Resumidamente, pode-se utilizar a sequência do anticorpo a ser analisada para pesquisa contra uma base de dados de proteínas de estruturas conhecidas, tais como o Protein Data Bank. Depois de uma identificação das proteínas homólogas com estruturas conhecidas, estas proteínas homólogas são utilizadas como modelos de modelagem. Cada um dos modelos possíveis podem ser alinhados, produzindo assim os alinhamentos de sequências de estrutura base de entre os moldes. A sequência do anticorpo com a estrutura desconhecida pode então ser alinhada com estes modelos com a finalidade de gerar um modelo molecular do anticorpo com a estrutura desconhecida. Como será apreciado por um versado na técnica, existem muitos métodos alternativos para a produção de tais estruturas in silico, qualquer um dos quais pode ser utilizado. Por exemplo, um processo semelhante ao descrito no Hardman et al., emitida Patente U.S. No. 5.958.708 QUANTA empregando (polygen Corp, Waltham, Massachusetts) e CHARM (Brooks et al., (1983), J. Comp. Chem. 4 : 187) podem ser utilizados (na presente invenção incorporada na sua totalidade por referência).

[00241] Não é apenas a forma da paratopo importante para determinar se e como um paratopo possível irá ligar-se a um epítopo, mas a própria interação entre o epítopo e o paratopo é uma fonte de grande informação na concepção dos anticorpos variantes. Conforme apreciado por um versado na técnica, existe uma variedade de maneiras em que esta interação pode ser estudada. Uma forma consiste em usar o modelo estrutural gerado, talvez, como descrito acima, e, em seguida, usar um programa como o InsightII (Accelrys, San Diego, Califórnia), que tem um módulo de encaixe, o qual, entre outras coisas, é capaz de realizar uma pesquisa Monte Carlo sobre os espaços conformacionais e orientacional entre o paratopo e o seu epítopo. O resultado é que a pessoa é capaz de estimar onde e como o epítopo interage com o paratopo. Em uma modalidade, apenas um fragmento, ou variante, do epítopo é utilizado para ajudar a determinar as interações relevantes. Em uma modalidade, o epítopo inteiro é utilizado na modelação da interação entre o paratopo e o epítopo.

[00242] Através da utilização destas estruturas modeladas, um é capaz de prever quais os resíduos são os mais importantes na interação entre o epítopo e o paratopo. Dessa maneira, em uma modalidade, é capaz de escolher facilmente quais os resíduos para alterar de forma a alterar as características de ligação do anticorpo. Por exemplo, pode ser evidente a partir dos modelos de encaixe que as cadeias laterais de determinados resíduos em o paratopo pode impedir estericamente a ligação do epítopo, alterando esses resíduos para os resíduos com cadeias laterais menores que podem ser benéficos. Pode-se determinar isto de muitas maneiras. Por exemplo, pode-se simplesmente olhar para os dois modelos e interações baseados em grupos funcionais e de proximidade. Alternativamente, pode-se realizar emparelhamentos repetidos de epítopo e paratopo, como descrito acima, a fim de obter as trocas de energia mais favoráveis. Pode-se também determinar estas interações para uma variedade de variantes do anticorpo para determinar formas alternativas em que o anticorpo pode ligar ao epítopo. Pode-se também combinar os vários modelos para determinar como deve-se alterar a estrutura dos anticorpos, a fim de obter um anticorpo com as características particulares que são desejadas.

[00243] Os modelos determinados acima podem ser testados por meio de várias técnicas. Por exemplo, a energia de interação pode determinar com os programas acima discutidos, a fim de determinar qual das variantes de continuar a analisar. Além disso, as interações coulumbic e van der Waals são usadas para determinar as energias de interação do epítopo e os paratopos variantes. Também, a muetiquetaênese dirigida é utilizada para verificar se previu as mudanças na estrutura do anticorpo, na verdade, causando as alterações desejadas nas características de ligação. Alternativamente, podem ser feitas as alterações ao epítopo para verificar que os modelos estão corretos ou para determinar os temas gerais de ligação que podem estar ocorrendo entre o paratopo e o epítopo.

[00244] Como será apreciado por um versado na técnica, ao passo que estes modelos irão proporcionar a orientação necessária para fazer os anticorpos e suas variantes das modalidades presentes, pode ainda ser desejável efetuar os testes de rotina dos modelos in silico, talvez através de Estudos in vitro. Além disso, como será evidente para um versado na técnica, qualquer modificação pode também ter efeitos secundários adicionais sobre a atividade do anticorpo. Por exemplo, enquanto nenhuma alteração prevista para resultar em uma maior ligação, pode induzir uma maior ligação, pode também causar outras alterações estruturais que possam reduzir ou alterar a atividade do anticorpo. A determinação de se este é ou não o caso, é de rotina na técnica e pode ser alcançada de várias maneiras. Por exemplo, a atividade pode ser testada através de um teste de ELISA. Alternativamente, as amostras podem ser testadas por meio da utilização de um dispositivo de ressonância plasmônico de superfície.

Anticorpos HER3

[00245] A presente invenção proporciona os anticorpos que reconhecem um epítopo conformacional de HER3. A presente invenção baseia-se na descoberta surpreendente de que uma classe de anticorpos contra HER3, bloquea ambas as vias de transdução de sinal dependente do ligante e independente do ligante HER3. Uma classe de anticorpos que se ligam ao epítopo específico de conformação de HER3 é descrita na Tabela 1. Em uma modalidade, os anticorpos inibem tanto as vias de sinalização dependente do ligante HER3 e indedependente do ligante. Em uma outra modalidade, os anticorpos ligam-se a HER3 e não bloqueia a ligação do ligante HER para o local de ligação do ligante (isto é, tanto o ligante e anticorpo pode ligar HER3 simultaneamente).

[00246] A presente invenção proporciona os anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína HER3 (por exemplo, HER3humanos e/ou cinomólogos), os referidos anticorpos compreendem um domínio VH possuindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 15, 33, 51,69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231,249, 267, 285, 303, 321,339, 357, e 375. A presente invenção proporciona os anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína HER3 (por exemplo, HER3humanos e/ou cinomólogos), os referidos anticorpos compreendem um domínio VL possuindo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356, e 374. A presente invenção também proporciona anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína HER3 (por exemplo, HER3 humanos e/ou cinomólogos), os referidos anticorpos compreendem um CDR VH possuindo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VH listados na Tabela 1, infra. Em particular, a presente invenção proporciona os anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína HER3 (por exemplo, HER 3humanos e/ou cinomólogos), os referidos anticorpos que compreendem (ou, em uma maneira alternativa, que consiste em) CDRs um, dois, três, quatro, cinco ou mais VH possuindo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VH listado na Tabela 1, infra.

[00247] Outros anticorpos da presente invenção incluem os aminoácidos que foram mutados, ainda, pelo menos, 60, 70, 80, 90, 95, ou 98 por cento de identidade, nas regiões CDR, com as regiões CDR descritas nas sequências descritas na Tabela 1. Em algumas modalidades, que inclui as sequências de aminoácidos mutantes, em que não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados nas regiões CDR, quando comparada com as regiões CDR descritas na Tabela 1 a sequência descrita, mantendo simultaneamente a sua especificidade para epítopos do anticorpo original

[00248] Outros anticorpos da presente invenção incluem os aminoácidos que foram mutados, ainda, pelo menos, 60, 70, 80, 90, 95, ou 98 por cento de identidade, em regiões estruturais com as regiões estruturais descritos nas sequências descritas na Tabela 1. Em algumas modalidades, que inclui as sequências de aminoácidos mutantes, em que não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 aminoácidos foram mutados nas regiões de estrutura, quando comparada com as regiões estruturais representadas na sequência descrita Tabela 1, mantendo ainda a sua especificidade para o epítopo do anticorpo original. O presente invento proporciona também sequências de ácido nucleico que codificam VH, VL, a cadeia pesada de comprimento total, e a cadeia leve de comprimento total dos anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína HER3 (por exemplo, HER3humanos e/ou cinomólogos).

[00249] Os anticorpos HER3 da presente invenção ligam-se ao epítopo conformacional de HER3 que compreende os resíduos de aminoácidos do domínio 2 e do domínio 4 de HER3.
Tabela 1 : Exemplos de Anticorpos HER3 da Presente Invenção

[00250] Outros anticorpos da presente invenção incluem aqueles em que os aminoácidos e os ácidos nucleicos que codificam para os aminoácidos que foram mutados, mas tem, pelo menos, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, e 99 por cento de identidade com as sequências descritas na Tabela 1. Em algumas modalidades, os mesmos incluem as sequências de aminoácidos mutantes, em que não mais do que 1,2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados em regiões variáveis, quando comparado com as regiões variáveis ilustradas na sequência descrita na Tabela 1, enquanto retém substancialmente a mesma atividade terapêutica.

[00251] Uma vez que cada um destes anticorpos ou os fragmentos dos mesmos podem ligar-se a HER3,, a cadeia leve de comprimento total, VH, VL, e as sequências da cadeia pesada de comprimento total (sequências de aminoácidos e as sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos) podem ser "misturadas e combinadas" para criar outros Anticorpos HER3 de ligação da presente invenção. Tais anticorpos de ligação HER3 "misturados e combinados" podem ser testados usando os ensaios de ligação conhecidos na técnica (por exemplo, ELISA e ensaios de outros descritos na seção de Exemplos). Quando estas cadeias são misturadas e combinadas, uma sequência de VH a partir de um emparelhamento VH / VL particular deve ser substituída por meio de uma sequência VH estruturalmente semelhante. Da mesma forma uma sequência da cadeia pesada de comprimento total a partir de uma determinada cadeia pesada de comprimento total/cadeia leve de emparelhamento de comprimento total deve ser substituída por uma sequência de comprimento completo da cadeia pesada estruturalmente semelhante. Da mesma forma, uma sequência de VL a partir de um par VH / VL particular deve ser substituída por meio de uma sequência estruturalmente semelhante VL. Da mesma forma um comprimento total de sequência de cadeia leve de comprimento total a partir de uma determinada cadeia pesada / cadeia leve de emparelhamento de comprimento total deve ser substituída por meio de uma sequência de comprimento completo da cadeia leve estruturalmente semelhante. Deste modo, em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado ou um fragmento do mesmo, tendo : uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO : 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357, e 375, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356, e 374 ; em que o anticorpo se liga especificamente para HER3 (por exemplo, humanos e/ou cinomólogos).

[00252] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona os anticorpos de ligação HER3que formam a cadeia pesada e cadeia leve, CDR1s CDR2s e CDR3 tal como descrito na Tabela 1, ou as combinações dos mesmos. As sequências de aminoácidos da VH de CDR1s dos anticorpos são apresentadas na SEQ ID NOs : 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, e 368. As sequências de aminoácidos da VH de CDR2s os anticorpos e estão apresentadas em SEQ ID NOs : 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291,297, 309, 315, 327, 333, 345, 351,363, e 369. As sequências de aminoácidos do CDR3 de VH de anticorpos são apresentadas na SEQ ID NOs : 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, e 370. As sequências de aminoácidos das CDR1s VL dos anticorpos são apresentadas na SEQ ID NOs : 5, 11,23, 29, 41,47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365, e 371. As sequências de aminoácidos VL das CDR2s dos anticorpos são apresentadas na SEQ ID NOs : 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, e 372. As sequências de aminoácidos das CDR3 de VL de anticorpos são apresentadas na SEQ ID NOs : 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301,313, 319, 331,337, 349, 355, 367, e 373. As regiões CDR são delineadas utilizando o sistema de Kabat (Kabat et al, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interesting, Fifth Edition, U.S. Departamento de Saúde e Serviços Humanos, NIH Publication No. 91 a 3242,. Chothia et al, (. . 1987) J. Mol. Biol 196 : 901-917 ; Chothia et al, (1989) Nature 342 : 877 a 883, e Al-Lazikani et al, (1997) J. Mol. Biol 273, 927 a 948).

[00253] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 2, uma CDR2 da SEQ ID NO : 3 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 4, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 5, uma CDR2 da SEQ ID NO : 6, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 7.

[00254] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 20, uma CDR2 da SEQ ID NO : 21, uma CDR3 de SEQ ID NO : 22, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 23, uma CDR2 da SEQ ID NO : 24, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 25.

[00255] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 38, uma CDR2 da SEQ ID NO : 39, uma CDR3 de SEQ ID NO : 40, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 41, uma CDR2 da SEQ ID NO : 42, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 43.

[00256] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 56, uma CDR2 da SEQ ID NO : 57, uma CDR3 de SEQ ID NO : 58, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 59, uma CDR2 da SEQ ID NO : 60, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 61.

[00257] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 74, uma CDR2 da SEQ ID NO : 75 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 76, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 77, uma CDR2 da SEQ ID NO : 78, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 79.

[00258] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 92, uma CDR2 da SEQ ID NO : 93 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 94, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 95, uma CDR2 da SEQ ID NO : 96, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 97.

[00259] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 110 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 111 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 112, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 113 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 114, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 115.

[00260] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 128 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 129 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 130, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 131 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 132, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 133.

[00261] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 146 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 147 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 148 ; uma CDR1 da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO : 149 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 150, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 151.

[00262] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 164 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 165 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 166, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 167 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 168, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 169.

[00263] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 182 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 183 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 184, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 185 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 186, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 187.

[00264] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 200 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 201 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 202, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 203 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 204, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 205.

[00265] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 218 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 219 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 220, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 221 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 222, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 223.

[00266] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 236 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 237 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 238, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 239 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 240, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 241.

[00267] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 254 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 255 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 256, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 257 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 258, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 259.

[00268] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 272 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 273 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 274, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 275 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 276, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 277.

[00269] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 290 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 291 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 292, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 293 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 294, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 295.

[00270] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 308 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 309 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 310, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 311 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 312, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 313.

[00271] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 326 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 327 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 328, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 329 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 330, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 331.

[00272] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 344 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 345 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 346, uma região variável da cadeia leve de CDR1 SEQ ID NO : 347 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 348, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 349.

[00273] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma cadeia pesada de CDR1 da região variável de SEQ ID NO : 362 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 363 ; uma CDR3 de SEQ ID NO : 364 ; uma CDR1 da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO : 365 ; uma CDR2 da SEQ ID NO : 366, e uma CDR3 de SEQ ID NO : 367.

[00274] Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO. 15 e VL de SEQ ID NO : 14. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 33 e VL de SEQ ID NO : 32. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 51 e VL de SEQ ID NO : 50. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma SEQ ID NO : 69 e VL de SEQ ID NO : 68. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 87 e VL de SEQ ID NO : 86. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 105 e VL de SEQ ID NO : 104. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 123 e VL de SEQ ID NO : 122. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 141 e VL de SEQ ID NO : 140. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 159 e VL de SEQ ID NO : 158. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 177 e VL de SEQ ID NO : 176. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 195 e VL de SEQ ID NO : 194. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 213 e VL de SEQ ID NO : 212. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 231 e VL de SEQ ID NO : 230. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 249 e VL de SEQ ID NO : 248. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 267 e VL de SEQ ID NO : 266. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 285 e VL de SEQ ID NO : 284. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 303 e VL de SEQ ID NO : 302. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 321 e VL de SEQ ID NO : 320. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 339 e VL de SEQ ID NO : 338. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 357 e VL de SEQ ID NO : 356. Em uma modalidade específica, um anticorpo que se liga a HER3 compreende uma VH de SEQ ID NO : 375 e VL de SEQ ID NO : 374.In modalidade um, os Anticorpos HER3 são anticorpos anetiquetaonistas. Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a HER3 é um anticorpo que é descrito na Tabela 1.

[00275] Como usado na presente invenção, um anticorpo humano compreende as regiões variáveis de cadeia pesada ou leve ou cadeias pesadas de comprimento completo ou leve, que são "o produto de" ou "derivado de" uma sequência da linhagem germinativa em particular se as regiões variáveis de cadeias de comprimento completo ou do anticorpo forem obtidos a partir de um sistema que utiliza os genes de imunoglobulina humana da linha germinal. Tais sistemas incluem a imunização de um camundongo transgênico portadores de genes de imunoglobulina humana, com o antigênio de interesse, ou a pesquisa de uma biblioteca de genes de imunoglobulina humana apresentada em fagos com o antigênio de interesse. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina humana da linha germinal pode ser identificado como tal por comparação da sequência de aminoácidos do anticorpo humano com as sequências de aminoácidos das imunoglobulinas da linha germinal humana e selecionar a imunoglobulina da linha germinal humana sequência que está mais próximo em sequência (isto é, % maior de identidade ) com a sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina da linhagem germinativa humana em particular pode conter diferenças de aminoácidos, em comparação com a sequência da linhagem germinativa, devido a, por exemplo, mutações somáticas que ocorrem de uma maneira natural ou introdução intencional de local-dirigida mutações. No entanto, as regiões estruturais VH ou VL, de um anticorpo humano selecionado é tipicamente pelo menos 90 % idênticas na sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos codificada por um gene humano da linhagem germinativa de imunoglobulina e contém os resíduos de aminoácidos que identificam o anticorpo humano como sendo humanos quando comparados com os da linhagem germinativa de imunoglobulina sequências de aminoácidos de outras espécies (por exemplo, as sequências da linhagem germinativa de murídeo). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser, pelo menos, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, ou, pelo menos, 95 %, ou mesmo pelo menos 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idênticos na sequência de aminoácidos para a sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linhagem germinativa . Tipicamente, um anticorpo humano recombinante irá exibir mais de 10 diferenças de aminoácidos a partir da sequência de aminoácidos codificada pelo gene humano da linhagem germinativa de imunoglobulina na VH ou VL regiões de estrutura. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir mais do que 5, ou mesmo não mais do que 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácidos a partir da sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linhagem germinativa . As diferentes versões da linhagem germinativa usando o VH e VL da linhagem germinativa de sequências de um número representativo de Anticorpos HER3 está apresentado na Tabela 2, usando Kabat. As posições do CDR são destacadas em negrito. A notação utilizada nas Tabelas com as sequências da linhagem germinativa é a seguinte : -MOR10701 VH_3-07 significa MOR10701 os loops CDR em regiões de estrutura de VH da linhagem germinativa de sequência 3 a 07 (nomenclatura está de acordo com a Vbase), MOR10703-VK_L1 significa CDR de MOR10703 na linhagem germinativa das regiões de estrutura de VK_L1, onde VK é a cadeia leve kappa.
Tabela 2: Diferentes versões da linhagem germinativa de um número selecionado de anticorpos representativos

Tabela 3: Segmentos JH

Tabela 4: Segmentos JK

[00276] Qualquer combinação nas SEQuências de linhagem germinativa VH com os segmentos JH pode ser usada. Exemplos representativos de combinações são mostrados na Tabela 5.
Tabela 5: Exemplos representativos de combinações nas SEQuências de linhagem germinativa VH com um segmento JH.

[00277] Qualquer combinação nas SEQuências de linhagem germinativa VL com um segmento JK pode ser usada. Exemplos representativos de combinações são mostrados na Tabela 6.
Tabela 6: Exemplos representativos de combinações nas SEQuências de linhagem germinativa VK com um segmento JK

[00278] Uma vez VH foi combinado com JH e VK com JK, então qualquer combinação de VH ou JH com VK ou JK, pode ser usado. Em uma modalidade, qualquer uma das regiões da linhagem germinativa VH podem ser combinadas com qualquer uma das regiões da linhagem germinativa (VL) VK para cada anticorpo. Um número representativo de exemplos de combinações é mostrado na Tabela 7.
Tabela 7: Exemplos representativos de combinações de sequências da linhagem germinativa

[00279] Em uma modalidade, a presente invenção diz respeito a uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de Xaa1-Xaa2--HCDR1 HCDR2 HCDR3-Xaa3-Xaa4-em que a cadeia pesada HCDR1, HCDR2, HCDR3 sao quaisquer CDRs de cadeia pesada selecionadas a partir das Tabelas 1 e 2 . Somente para fins ilustrativos, a sequência pode ser :

[00280] Xaa1 - SYAMS - Xaa2 - AINSQGKSTYYADSVKG - Xaa3 -WGDEGFDI - Xaa4 (SEQ ID NO : 493), em que,

[00281] Xaa1 é região de estrutura de qualquer 30 aminoácidos;

[00282] Xaa2 é qualquer região de estrutura de 14 aminoácidos;

[00283] Xaa3 é região de estrutura de 32 aminoácidos;

[00284] Xaa4 é região de estrutura de qualquer 11 aminoácidos;

[00285] Em uma modalidade, a presente invenção diz respeito a uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de Xaa1-LCDR1 LCDR2-Xaa2-Xaa3-Xaa4--LCDR3, em que a cadeia leve de LCDR1, LCDR2, LCDR3 sao quaisquer CDRs de cadeia leve selecionadas a partir das Tabelas 1 e 2. Somente para fins ilustrativos, a sequência pode ser :

[00286] Xaa1 - RASQGISNWLA - Xaa2 - GASSLQS - Xaa3 -QQYSSFPTT - Xaa4 (SEQ ID NO : 494), em que,

[00287] Xaa1 é uma região de estrutura de qualquer 23 aminoácidos;

[00288] Xaa2 é uma região de estrutura de qualquer 15 aminoácidos;

[00289] Xaa3 é uma região de estrutura de qualquer 32 aminoácidos; e

[00290] Xaa4 é uma região de estrutura de qualquer 10 aminoácidos.

[00291] Os anticorpos descritos na presente invenção podem ser derivados de anticorpos de cadeia simples, diacorpos, anticorpos de domínio, nanocorpos, e unicorpos. Um "anticorpo de cadeia única" (scFv) é constituído por uma única cadeia polipeptídica compreendendo um domínio VL ligado a um domínio VH, em que o domínio VL e o domínio VH são emparelhados de modo a formar uma molécula monovalente. O anticorpo de cadeia simples pode ser preparado de acordo com o método conhecido na técnica (vide, por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242 : 423-426 e Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. 85 : 5879 a 5883). Um "disbud" consiste em duas cadeias, cada cadeia compreende uma região variável da cadeia pesada ligada a uma região variável da cadeia leve na mesma cadeia polipeptídica ligada por meio de um ligante peptídico curto, em que as duas regiões na mesma cadeia não fazem par umas com as outras mas com os domínios complementares de outra cadeia, com a finalidade de formar uma molécula biespecífica. Métodos de preparação de diacorpos são conhecidos na técnica (Vide, por exemplo, Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. 90 : 6444 a 6448, e Poljak et al., (1994) Structure 2 : 1121 a 1123). Os anticorpos de domínio (DABS) são pequenas unidades funcionais de ligação de anticorpos, o que corresponde a as regiões variáveis de ambos as cadeias pesadas ou leves de anticorpos. Os anticorpos de domínio são bem expressa em leveduras, bactérias, e sistemas de células de mamíferos. Detalhes adicionais de anticorpos de domínio e os métodos de produção destes são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente U.S. Nos 6.291.158; . 6582915 ; 6593081 ; 6172197 ; 6696245 ; Patentes Europeias 0.368.684 e 0.616.640 ; WO05 / 035572, WO04 / 101790, nanocorpos WO04 / 081026, WO04 / 058821, WO04 / 003019 e WO03 / 002609. são derivados das cadeias pesadas de um anticorpo. Um nanocorpo compreende tipicamente um único domínio variável e dois domínios constantes (CH2 e CH3) e retém a capacidade de ligação ao antigênio do anticorpo original aos. nanocorpos podem ser preparados por meio dos métodos conhecidos na técnica (Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 6.765.087, Patente U.S. No. 6.838.254, WO 06 / 079372). Unicorpos consistem em uma cadeia leve e uma cadeia pesada de um anticorpo IgG4. Unicorpos podem ser feitos através da remoção da região de dobradiça de anticorpos IgG4. Mais detalhes dos unicorpos e métodos para a sua preparação pode ser encontradps na WO2007 / 059782.

Anticorpos Homólogos

[00292] Em ainda outra modalidade, a presente invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento do mesmo que compreende as sequências de aminoácidos que são homólogas às sequências descritas na Tabela 1, e o referido anticorpo se liga a uma proteína HER3 (por exemplo, HER3 humanos e/ou cinomólogos), e retém as propriedades funcionais desejadas desses anticorpos descritos na Tabela 1.

[00293] Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado (ou um fragmento do mesmo funcional), que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, ou pelo menos 95 % idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357, e 375, a região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, ou pelo menos 95 % idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356, e 374, o anticorpo se liga a HER3 (por exemplo, HER3 humanos e/ou cinomólogos) e neutraliza a atividade de sinalização de HER3, que pode ser medida em um ensaio de fosforilação ou outra medida de sinalização de HER (por exemplo, fosfo-ensaios de HER3, fosfo- ensaios de Akt, proliferação celular, e ensaios de bloqueio ao ligante tal como descrito nos Exemplos). Incluido também dentro do âmbito da presente invenção estão as variáveis de cadeia pesada e leve parentais nas SEQuências de nucleotídeos e as sequências de comprimento total da cadeia pesada e leve optimizadas para a expressão em uma célula de mamífero. Outros anticorpos da presente invenção incluem os aminoácidos ou os ácidos nucleicos que foram mutados, ainda, pelo menos, 60, 70, 80, 90, 95, ou 98 por cento de identidade % às sequências descritas acima. Em algumas modalidades, incluem as sequências de aminoácidos mutantes, em que não mais do que 1,2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutante por meio da deleção de aminoácidos, inserção ou substituição de regiões variáveis, quando comparado com as regiões variáveis ilustradas na sequência descrita acima.

[00294] Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos VH e/ou VL podem ser 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica às sequências estabelecidas na Tabela 1. Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos VH e/ou VL podem ser idênticas exceto uma substituição de aminoácido em não mais do que 1,2,3,4 ou 5 posições de aminoácido. Um anticorpo que possui regiões VH e VL com elevado (isto é, 80 % ou mais) para a identidade de regiões VH e VL dos anticorpos descritos na Tabela 1 pode ser obtido através de muetiquetaênese (por exemplo, muetiquetaênese dirigida ao local ou mediada por PCR), seguido por meio de testes do anticorpo codificado alterado para a função retida usando os ensaios funcionais descritos na presente invenção.

[00295] Em outras modalidades, as regiões variáveis nas SEQuências de nucleotídeos de cadeia leve e/ou de cadeia pesada podem ser de 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica às sequências definidas acima.

[00296] Como usado na presente invenção, a "percenetiquetaem de identidade" entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (isto é, % de identidade é igual ao número de posições idênticas / número total de posições x 100), tendo em conta o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna que necessita de ser introduzido para alinhamento óptimo das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da percenetiquetaem de identidade entre as duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático, tal como descrito nos exemplos não limitativos que se seguem.

[00297] Adicionalmente ou em alternativa, as sequências de proteína da presente invenção podem ainda ser utilizadas como uma "sequência de busca" para realizar uma pesquisa em bases de dados públicas para, por exemplo, identificar as sequências relacionadas. Por exemplo, estas pesquisas podem ser realizadas utilizando o programa BLAST (versão 2.0) de Altschul et al., (1990) J.Mol. Biol. 215 : 403 a 10.

Anticorpos com Modificações conservadoras

[00298] Em certas modalidades, um anticorpo da presente invenção tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 e as sequências de uma região variável da cadeia leve compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3, em que uma ou mais destas sequências de CDR tem as sequências de aminoácido especificadas com base nos anticorpos descritos neste documento ou as modificações conservadoras dos mesmos, e em que os anticorpos mantem as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos de ligação de HER3 da presente invenção.

[00299] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal isolado HER3, ou um fragmento do mesmo, que consiste em uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 e as sequências de uma região variável da cadeia leve compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 sequências, em que : as sequências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada CDR1 são selecionadas de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, e 368, e as modificações conservadoras dos mesmos ; as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada da CDR2 são selecionadas de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363, e 369 e modificações conservadoras dos mesmos ; as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de CDR3 são selecionadas de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, e 370 e modificações conservadoras dos mesmos ; as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve de CDR3 são selecionadas de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 5, 11,23, 29, 41,47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365, e 371 e as modificações conservadoras dos mesmos ; as sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve CDR2 são selecionadas de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, e 372, e as modificações conservadoras dos mesmos ; as sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve CDR3 são selecionadas de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 7, 13, 25, 31,43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367, e 373, e as modificações conservadoras dos mesmos ; o anticorpo ou o fragmento do mesmo se liga especificamente a HER3, e neutraliza a atividade de HER3 que inibe uma via de sinalização de HER, o que pode ser medido em um ensaio de fosforilação ou pode ser medida por meio de outra sinalização de HER (por exemplo, fospo-ensaios de HER3, fosfo- ensaios de Akt, proliferação celular, e os ensaios de bloqueio de ligacao tal como descrito nos Exemplos).

Anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo

[00300] A presente invenção fornece anticorpos que interage com (por exemplo, por meio do impedimento, da ligação estérica, da estabilizacao / distribuição espacial desestabilizadora) o mesmo epítopo tal como os anticorpos de ligação a HER3 descritos na Tabela 1 e na fig. 7. Os anticorpos adicionais podem, portanto, ser identificados com base na sua capacidade para competir de forma cruzada (por exemplo, com a finalidade de inibir competitivamente a ligação de uma maneira estatisticamente significativa) com outros anticorpos da presente invenção em ensaios de ligação de HER3. A capacidade de um anticorpo de teste para inibir a ligação dos anticorpos da presente invenção a uma proteína HER3 (por exemplo, HER3 humanos e/ou cinomólogos) demonstra que o anticorpo de teste pode competir com o anticorpo de ligação de HER3, um anticorpo tal pode, de acordo com a teoria não limitante, se ligar ao mesmo epítopo ou a um (por exemplo, uma estrutura semelhante ou espacialmente proximal) relacionado com a proteína HER3 como o anticorpo com o qual compete. Em uma certa modalidade, o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em HER3 como os anticorpos da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isolados como descrito neste documento.

[00301] Em uma modalidade, o anticorpo ou os os fragmentos dos mesmos se liga a ambos domínio 2 e do domínio 4 de HER3 para segurar a HER3 em uma conformação inativa que evita a exposição de um circuito presente no interior do domínio de dimerização 2. Isto impede a heterodimerizacao com outros membros da família, tais como HER1, HER2 e HER4. Os anticorpos de fragmentos inibem tanto a transdução de sinal dependente do ligante e quanto a independente do ligante de HER3.

[00302] Em uma outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo liga-se tanto ao domínio 2 quanto ao domínio 4 de HER3 e sem bloquear a ligação simultânea de um ligante tal como a neuregulina HER3. Embora não seja necessário para proporcionar uma teoria, é possível que o anticorpo ou um fragmento do mesmo de ligação para o domínio 2 e o domínio 4 de HER3, HER3 prende em uma conformação inativa, sem bloquear o local de ligação do ligante em HER3. Dessa maneira, um ligante de HER3 (por exemplo, neuregulina) é capaz de se ligar a HER3, ao mesmo tempo que o anticorpo ou o fragmento do mesmo.

[00303] Os anticorpos da presente invenção ou os fragmentos dos mesmos, inibem tanto a ativação do dependente e independente do ligante de HER3, sem impedir a ligação do ligante. Isto é considerado vantajoso pelas seguintes razões :

[00304] (I) O anticorpo terapêutico terá utilidade clínica de um largo espectro de tumores do que um anticorpo alvo de um único mecanismo de ativação de HER3 (isto é, indedependente do ligante ou dedependente do ligante), uma vez que distintos tipos de tumores são accionados por cada mecanismo.

[00305] (Ii) O anticorpo terapêutico seria eficaz em tipos de tumores em que ambos os mecanismos de ativação HER3 são simultaneamente envolvidos. Um anticorpo alvejando um único mecanismo de ativação de HER3 (isto é, dedependente do ligante ou independente do ligante) que exibem pouca ou nenhuma eficácia nestes tipos de tumores

[00306] (Iii) A eficácia de um anticorpo que inibe a ativação dependente do ligante de HER3, sem impedir a ligação do ligante seria menos susceptível de ser adversamente afetada por meio das concentrações crescentes de ligante. Tal procedimento implicaria tanto na eficácia em um tipo de tumor impulsionado por meio das concentrações muito elevadas de HER3 ligante quanto em uma sanção da resistência reduzida aos farmacos, onde a resistência é mediada pormeio da sobre-regulação de Ligantes HER3.

[00307] (Iv) um anticorpo que inibe a ativação por HER3 por meio da estabilizacao da forma inativa seria menos propenso à resistência a medicamentos acionados por meio dos mecanismos alternativos de ativação de HER3.

[00308] Consequentemente, os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados para tratar condições em que os anticorpos terapêuticos existentes são clinicamente ineficazes.

Engenharia e Anticorpos Modificados

[00309] Um anticorpo da presente invenção pode ser preparado utilizando um anticorpo que possui uma ou mais das sequências de VH e/ou VL mostradas na presente invenção como material de partida para engendrar um anticorpo modificado, o qual o anticorpo modificado pode ter alterado as propriedades do anticorpo de partida. Um anticorpo pode ser manipulado através da modificação de um ou mais resíduos dentro de uma ou de ambas as regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões de CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de estrutura. Adicionalmente ou em alternativa, um anticorpo pode ser manipulado por meio da modificação de resíduos no interior da (s) região (oes) constante (s), por exemplo, para alterar a ( s) função (oes) efetora (s) do anticorpo.

[00310] Um tipo de engenharia da região variável que pode ser realizado é enxerto de CDR. Os anticorpos interagem com antigênios alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que estão localizados na complementaridade da cadeia pesada e leve de seis regiões determinantes (CDR). Por esta razão, as sequências de aminoácidos dentro de CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que as sequências fora de CDRs. Porque as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antigênio, é possível expressar os anticorpos recombinantes que imitem as propriedades de anticorpos específicos que imitam as propriedades dos anticorpos queocorrem de uma maneira natural através da construção de vetores de expressão que incluem as sequências de CDR do anticorpo específico que ocorre de forma natural enxertado nas sequências estruturais de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (vide, por exemplo, Riechmann et al, (1998) Nature 332 : 323 a 327; . Jones et al, (1986) Nature 321 : 522 a 525; . Queen et al, (1989) Proc Natl. Acad, U.S. 86 : 10029 a 10033,. Patente U.S. No. 5.225.539 to Winter, e Patente U.S. Nos 5.530.101 ; 5.585.089 ; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al).

[00311] Por conseguinte, uma outra modalidade da presente invenção diz respeito a um anticorpo monoclonal de ligação HER3 isolado, ou o fragmento do mesmo, que compreende as sequências de uma região variável de cadeia pesada CDR1 possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, e 368 ; sequências CDR2 possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363, e 369 ; sequências CDR3 possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, e 370, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve possuindo as sequências CDR1 possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 5, 11, 23, 29, 41,47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365, e 371 ; sequências CDR 2possuindo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, e 372, e sequências CDR3 que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 7, 13, 25, 31,43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367, e 373, respectivamente. Dessa maneira, os anticorpos que contenham as sequências de CDR VH e VL de anticorpos monoclonais, mas que podem conter as sequências estruturais diferentes dessas sequências estruturais anticorpos. Os mesmos podem ser obtidos a partir de bases de dados de DNA públicas ou referências publicadas que incluem as sequências de genes da linhagem germinativa de anticorpos. Por exemplo, as sequências de DNA da linhagem germinativa humana para cadeia pesada e leve de genes da região variável podem ser encontradas no "vaso" de banco de dados de sequência da linhagem germinativa humana (disponível na Internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk / Vbase), bem como em Kabat et al, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Departamento de Saúde e Serviços Humanos, NIH Publication No. 91 a 3242,. Chothia et al, (1987) J. Mol. Biol.. Biol. 196 : 901 a 917 ; Chothia et al, (1989) Nature 342 : 877 a 883; . E Al-Lazikani et al, (1997) J. Mol. Biol.. Biol. 273 : 927 a 948 ; Tomlinson et al, (1992) J. fol.. Biol. 227 : 776 a 98, e Cox et al, (1994) Eur.. J Immunol. 24 : 827 a 836 ; os conteúdos de cada um dos quais são na presente invenção expressamente incorporados por referência.

[00312] Um exemplo de sequências estruturais para utilização nos anticorpos da presente invenção são aqueles que são estruturalmente semelhantes aos nas SEQuências estruturais utilizados por anticorpos selecionados da presente invenção, por exemplo, sequências de consenso e/ou sequências estruturais utilizados pelos anticorpos monoclonais da presente invenção. O VH CDR1, 2 e 3, bem como a sequências de VL CDR1, 2 e 3, as sequências podem ser enxertados em regiões estruturais que têm a sequência idêntica à encontrada no gene da imunoglobulina da linha germinal da qual a sequência de quadro derivar, ou nas sequências de CDR pode ser enxertados em regiões estruturais que contêm uma ou mais mutações em comparação com as sequências da linhagem germinativa . Por exemplo, verificou-se que, em certos casos, é benéfico para mutar resíduos nas regiões de estrutura para manter ou melhorar a capacidade de ligação ao antigênio do anticorpo (vide, por exemplo, Patente U.S. №s 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al).

[00313] Outro tipo de modificação da região variável é a mutação dos resíduos de aminoácidos dentro das regiões VH e/ou VL de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de para, dessa maneira, melhorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, a afinidade) do anticorpo de interesse, conhecidos como "afinidade dematuração ". A muetiquetaênese dirigida ao local ou a muetiquetaênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a (s) mutação (ões) e o efeito sobre a ligação do anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliada in vitro ou em ensaios in vivo, tal como descrito na presente invenção e fornecido nos Exemplos. As modificações conservadoras (como discutido acima) podem ser introduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoácidos. Além disso, normalmente não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos de uma região CDR estão alterados.

[00314] Por conseguinte, em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona anticorpos de ligação monoclonais de HER3 isolados, ou os fragmentos dos mesmos, consistindo em uma região variável da cadeia pesada possuindo : uma região VH CDR1 que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que tem SEQ ID NOs : 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134,146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, e 368, ou uma sequência de aminoácidos que possui um, dois, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos, em comparação com as SEQ ID NOs : 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, e 368, uma região VH CDR2 tendo uma sequência de aminoácido selecionada de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261,273, 279, 291,297, 309, 315, 327, 333, 345, 351,363, e 369, ou uma sequência de aminoácido possuindo um, dois, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos, em comparação com as SEQ ID NOs : 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201,207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351,363, e 369, uma região CDR3 de VH possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, e 370, ou uma sequência de aminoácidos que possui um, dois, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos, em relação à SEQ ID NO : 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, e 370, uma região CDR1 VL possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 5, 11,23, 29, 41,47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365, e 371, ou uma sequência de aminoácidos que possui um, dois, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições, de aminoácidos, em comparação com as SEQ ID NOs : 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311,317, 329, 335, 347, 353, 365, e 371, uma região VL CDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, e 372, ou uma sequência de aminoácidos que possui um, dois, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos, em comparação com as SEQ ID NOs : 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, e 372, e uma região CDR3 de VL possuindo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 7, 13, 25, 31,43, 49, 61,67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367, e 373, ou uma sequência de aminoácidos que possui um, dois, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos, em relação à SEQ ID NO : 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331,337, 349, 355, 367, e 373.

Enxertia de fragmentos de anticorpos em estruturas ou andaimes alternativos

[00315] Uma grande variedade de estruturas ou andaimes de anticorpo / imunoglobulina pode ser utilizada, desde que o polipeptídeo resultante inclua pelo menos uma região de ligação que se liga especificamente HER3. Tais estruturas ou andaimes incluem os 5 idiotipos principais de imunoglobulinas humanas, ou os fragmentos dos mesmos, e incluem imunoglobulinas de outras espécies animais, de preferência com aspectos humanizados. As novas estruturas, andaimes e fragmentos continuam a ser descobertas e desenvolvidas por aqueles que são versados na técnica.

[00316] Em um aspecto, a presente invenção refere-se à geração de anticorpos com base na não imunoglobulina utilizando andaimes não imunoglobulina em que CDRs da presente invenção podem ser enxertadas. Conhecidas ou futura estruturas e andaimes de não imunoglobulina podem ser empregues, contanto que compreendam uma região de ligação específica para a proteína alvo HER3 (por exemplo, HER3 humanos e/ou cinomólogos). As estruturas ou andaimes conhecidas de não imunoglobulina incluem, mas não estão limitados a, a fibronectina (Composto Therapeutics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Parceiros AG, Zurique, Suiça), anticorpos de domínio (Domantis, Ltd., Cambridge, MA e Ablynx nv, Zwijnaarde, Bélgica), lipocalina (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemanha), pequenos modulares imuno-fármacos (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), (maxycorpos Avidia, Inc., Mountain View, CA), proteína A (Afficorpo AG, Suécia), e affilin (gama-cristalina ou ubiquitina) (Scil Proteínas GmbH, Halle, Alemanha).

[00317] Os suportes são baseados em fibronectina de fibronectina de domínio tipo III (por exemplo, o módulo décimo da fibronectina de tipo III (10 domínios FN3)). A fibronectina de domínio de tipo III tem 7 ou 8 cadeias beta que são distribuídas entre duas folhas beta, que eles próprios embalar um contra o outro com a finalidade de formar o núcleo da proteína, e outros loops contendo (análogo ao CDRs) que ligam as cadeias beta umas às outras e são solventes expostos. Existem pelo menos três loops em cada extremidade da folha beta sanduíche, em que a borda é o limite da proteína perpendicular à direção das cadeias beta (vide U.S. 6.818.418). Estes suportes à base de fibronectina não são uma imunoglobulina, embora a dobra global eseja estreitamente relacionada com o do menor fragmento de anticorpo funcional, a região variável da cadeia pesada, que compreende toda a unidade de reconhecimento do antigênio de camelo e lhama IgG. Devido a esta estrutura, o anticorpo não imunoglobulina imita as propriedades de ligação ao antigênio que são semelhantes em natureza e afinidade para os anticorpos. Estes suportes podem ser usados em uma randomização loop e estratégia de baralhamento in vitro que é semelhante ao processo de maturação de afinidade dos anticorpos in vivo. Estas moléculas com base em fibronectina podem ser usadas como suportes onde as regiões de loop da molécula podem ser substituídas com CDR da presente invenção, utilizando as técnicas de clonagem convencionais.

[00318] A tecnologia anquirina é baseada o uso de proteínas com módulos de repetição anquirina derivados como andaimes para suportar as regiões variáveis que podem ser usadas para se ligarem a diferentes alvos. O módulo de repetição de anquirina é um polipeptídeo de 33 aminoácidos consistindo em duas α-hélices anti-paralelas e um β-turn. A ligação das regiões variáveis é principalmente optimizada usando a exibição ribossoma.

[00319] Os avímeros são derivados do domínio A natural contendo proteína tal como HER3. Estes domínios são usados pela natureza para interações proteína-proteína e em humanos com mais de 250 proteínas são estruturalmente baseados nos domínios A. Os avímeros consistem em um número de diferentes monômeros de " domínio A" (2-10) ligados através de elementos de ligação de aminoácidos. Os avímeros podem ser criados, que pode ligar-se ao antigênio alvo usando a metodologia descrita em, por exemplo, o Pedido de Patente U.S. №s de publicação 20040175756 ; 20050053973 ; 20050048512 e 20060008844.

[00320] Os ligantes de afinidade Afficorpo são proteínas simples, pequenas compostas por um feixe de três hélices com base no andaime de um dos domínios de ligação a IgG da proteína A. A proteína A é uma proteína de superfície da bactéria Staphylococcus aureus. Este domínio de andaime composto de 58 aminoácidos, dos quais 13 são escolhidos aleatoriamente para gerar bibliotecas afficorpo com um grande número de variantes de ligantes (Vide, por exemplo, U.S. 5.831.012). Moléculas de anticorpos Afficorpo imitar, têm um peso molecular de 6 kDa, em comparação com o peso molecular dos anticorpos, que é de 150 kDa. Apesar do seu tamanho reduzido, o local de ligação das moléculas de afficorpo é semelhante ao de um anticorpo.

[00321] Anticalins são produtos desenvolvidos pela empresa Pieris ProteoLab AG. Eles são derivados de lipocalinas, um grupo amplo de proteínas pequenas e sólidas, que são normalmente envolvidas no transporte ou armazenamento fisiológica de compostos quimicamente sensíveis ou insolúvel. Vários lipocalinas naturais ocorrem em tecidos humanos ou de líquidos corporais. A arquitetura de proteína é reminiscente das imunoglobulinas, com loops hipervariáveis no topo de uma estrutura rígida. No entanto, em contraste com os anticorpos ou os fragmentos dos mesmos recombinantes, lipocalinas são compostos de uma única cadeia polipeptídica com 160 a 180 resíduos de aminoácidos, sendo apenas ligeiramente maior do que um único domínio de imunoglobulina. O conjunto de quatro voltas, o que torna a bolsa de ligação, apresenta plasticidade estrutural pronunciado e tolera uma variedade de cadeias laterais. O local de ligação pode, dessa maneira, ser remodelado de um processo próprio para reconhecer moléculas alvo prescritas de forma diferente, com elevada afinidade e especificidade. Uma proteína da família de lipocalina, a proteína de ligação a bilin (BBP) de Brassicae Pieris tem sido utilizada para desenvolver anticalins por muetiquetaênese do conjunto de quatro voltas. Um exemplo de um pedido de patente que descreve anticalins está na Publicação PCT No.WO 199916873.

[00322] As moléculas affilinas são pequenas proteínas não-imunoglobulina que são concebidas para afinidades específicas para proteínas e pequenas moléculas. as novas moléculas affilinas podem ser rapidamente selecionadas a partir de duas bibliotecas, cada um dos quais tem por base uma proteína humana derivada diferente andaime. As moléculas affilina não apresentam qualquer homologia estrutural com as proteínas da imunoglobulina. Atualmente, existem dois suportes affilina são empregados, uma das quais é cristalina gama, uma proteína estrutural da lente do olho humano e o outro são as proteínas da superfamília "ubiquitina". Ambos os suportes humanos são muito pequenos, mostram estabilidade a altas temperaturas e são quase resistente a alterações de pH e agentes desnaturantes. Esta alta estabilidade é devido principalmente à estrutura expandida folha beta das proteínas. Exemplos de proteínas derivadas de gama cristalinas são descritos em WO200104144 e exemplos de proteínas do tipo "ubiquitina" são descritos em WO2004106368.

[00323] Os miméticos de proteínas de epítopo (PEM) são de tamanho médio, de peptídeos cíclicos, moléculas semelhantes (MW 12 kDa) que imitam estruturas beta-hairpin secundárias das proteínas, a estrutura secundária principal envolvida em interações proteína-proteína.

[00324] Em algumas modalidades, os Fabs são convertidos para o formato IgG1 silencioso, alterando a região Fc. Por exemplo, os anticorpos da Tabela 1 podem ser convertidos para o formato de IgG.

Anticorpos humanos ou humanizados

[00325] A presente invenção proporciona os anticorpos completamente humanos que se ligam especificamente a uma proteína HER3 (por exemplo, humanos e/ou cinomólogos / camundongo / rato HER3). Em comparação com os anticorpos quiméricos ou humanizados, os humanos Anticorpos de ligação a HER3 da presente invenção reduziram ainda mais a antigenicidade quando administrados a seres humanos.

[00326] Os anticorpos de ligação humanos HER3 podem ser gerados usando métodos que são conhecidos na técnica. Por exemplo, a tecnologia utilizada para a conversão de humanização de anticorpos não humanos em engenharia de anticorpos humanos. A Patente U.S. No. de publicação 20050008625 descreve um método in vivo para a substituição de uma região variável não humana de anticorpo com uma região variável humana de um anticorpo, mantendo ao mesmo ou a proporcionar melhores características de ligação em relação à do anticorpo não humano. O método baseia-se na substituição guiada do epítopo de regiões variáveis de um anticorpo de referência não-humano com um anticorpo totalmente humano. O anticorpo resultante humano é geralmente relacionado estruturalmente com o anticorpo não humano de referência, mas liga-se ao mesmo epítopo no antigênio mesmo que o anticorpo de referência. Resumidamente, a série de abordagem de substituição de complementaridade de epítopo guiada é ativada através da criação de uma competição em células entre um "concorrente" e uma biblioteca de híbridos diversos do anticorpo de referência ("anticorpos teste") para a ligação de limitar as quantidades de antígeno na presença de um sistema repórter que responde à ligação do anticorpo ao antigênio de teste. O competidor pode ser o anticorpo de referência, ou de um seu derivado como um fragmento Fv de cadeia única. O competidor pode também ser um ligante natural ou artificial do antigênio que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência. As únicas exigências são do competidor que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência, e que compete com o anticorpo de referência para a ligação ao antigênio. Os anticorpos de teste tem uma ligação ao antigênio da região V em comum a partir do anticorpo de referência não-humano, e a outra região V selecionadas aleatoriamente a partir de uma fonte diversa, tais como uma biblioteca de repertório de anticorpos humanos. A região V comum do anticorpo de referência serve como um guia, o posicionamento dos anticorpos de teste no mesmo epítopo no antigênio, e na mesma orientação, de modo que a seleção é inclinado para a mais alta fidelidade de ligação ao antigênio ao anticorpo de referência.

[00327] Muitos tipos de sistema repórter podem ser utilizados para detectar as interações entre anticorpos de teste e de antigênios desejados. Por exemplo, os fragmentos de complemento repórter podem ser ligados a antigênio e anticorpo de teste, respectivamente, de modo que a ativação do repórter por complementação fragmento só ocorre quando o anticorpo de teste liga-se ao antigênio. Quando o dispositivo de teste de fusões de anticorpo-antigênio e repórter-fragmento são co-expressos com um concorrente, a ativação repórter torna-se dependente da capacidade do anticorpo de teste para competir com o competidor, que é proporcional à afinidade do anticorpo para o antigênio de teste. Outros sistemas repórter, que podem ser usados incluem o reativador de um sistema de auto-inibição de reativação repórter (RAIR) tal como descrito no Pedido de Patente U.S. No. De Ser. 10 / 208, 730 (Publicação No. 20030198971), ou do sistema de ativação competitivo descrito na Pedido de Patente U.S. No. De Ser. 10 / 076, 845 (Publicação No. 20030157579).

[00328] Com a série sistema de substituição guiada de complementaridade de epítopo, a seleção é feita para identificar as células expressa um anticorpo único teste junto com o concorrente, o antígeno e componentes repórter. Nestas células, cada anticorpo de teste compete um-a-um com o concorrente para a ligação a uma quantidade limitante de antigênio. Atividade do repórter é proporcional à quantidade de antigênio ligado ao anticorpo de teste, que por sua vez é proporcional à afinidade do anticorpo de teste para o antigênio e a estabilidade do anticorpo de teste. Os anticorpos utilizados são inicialmente selecionados com base na sua atividade em relação à do anticorpo de referência, quando expressa como o anticorpo de teste. O resultado da primeira volta de seleção é um conjunto de "híbridos" de anticorpos, cada uma das quais é constituída por o mesmo não humanos da região V do anticorpo de referência e uma região V humana a partir da biblioteca, e cada um dos quais se liga ao mesmo epítopo no antigênio, como o anticorpo de referência. Um ou mais dos anticorpos híbridos selecionados no primeiro turno vão ter uma afinidade para o antigênio que é comparável ou superior ao do anticorpo de referência.

[00329] Na segunda etapa de substituição da região V, as regiões V humanas selecionados na primeira etapa são usadas como guia para a seleção de substituições humanas para a região V de anticorpo não-humano de referência remanescente com uma biblioteca diversificada de regiões V humanas cognatas. Os anticorpos híbridos selecionados na primeira rodada também podem ser usados como concorrentes para a segunda rodada de seleção. O resultado da segunda ronda de seleção é um conjunto de anticorpos completamente humanos que diferem estruturalmente a partir do anticorpo de referência, mas que competem com o anticorpo de referência para a ligação com o mesmo antigênio. Alguns dos anticorpos selecionados humanos se ligam ao mesmo epítopo no antigênio mesmo que o anticorpo de referência. Entre estes anticorpos humanos selecionados, um ou mais se liga ao mesmo epítopo com uma afinidade que é comparável a ou superior ao do anticorpo de referência.

[00330] Usando um dos anticorpos de ligação dos camundongo ou quiméricos HER3 acima descritos como o anticorpo de referência, este método pode ser facilmente utilizado para gerar anticorpos humanos que se ligam a HER3 humana com a mesma especificidade de ligação e afinidade de ligação igual ou melhor. Além disso, tais HER3 humanos de ligação de anticorpos podem também ser obtidos comercialmente a partir de empresas que habitualmente produzem os anticorpos humanos, por exemplo, KaloBios, Inc. (Mountain View, CA).

Anticorpos Camelídeos

[00331] As proteínas de anticorpos obtidas de membros da família do camelo e dromedário (Camelus bactrianus e Calelus dromaderius) incluindo membros do novo mundo, como espécies de lhama (Lama paccos, Dalai Lama e glama vicugna) foram caracterizados quanto ao tamanho, complexidade estrutural e antigenicidade para os sujeitos humanos. Certos anticorpos IgG a partir desta família de mamíferos como se encontram na natureza possuem cadeias leves, e são, dessa maneira, estruturalmente distintos da estrutura da cadeia típica de quatro quaternário tendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves de anticorpos, a partir de outros animais. Vide PCT / EP93 / 02214 (WO 94 / 04678 publicado em 3 de Março de 1994).

[00332] A região do anticorpo camelídeo que é o único domínio variável pequeno identificado como VHH pode ser obtida por meio da engenharia genética com a finalidade de produzir uma proteína pequena com uma elevada afinidade para o alvo, o que resulta em um baixo peso molecular do anticorpo derivado de proteína conhecida como uma "nanocorpo camelídeo". Vide Patente U.S. número 5.759.808 concedida 02 junho de 1998, vide também Stijlemans et al, (2004) J Biol Chem 279 : 1256 a 1261; . Dumoulin et al, (2003) Nature 424 : 783 a 788, Pleschberger et al, (2003) Bioconjugate Chem 14 : 440-448 ; Cortez-Retamozo et al, (2002) Int J Cancer 89 : 456 a 62, e Lauwereys et al, (1998) EMBO J 17 : 3512 a 3520. As bibliotecas engenheiradas de anticorpos e fragmentos de anticorpos camelídeos estão comercialmente disponíveis, por exemplo, a partir de Ablynx, Ghent, Bélgica. (Por exemplo, US20060115470,. Domantis (US20070065440, US20090148434) Tal como acontece com outros anticorpos de origem não humana, uma sequência de aminoácidos de um anticorpo camelídeo pode ser alterada de forma recombinante para se obter uma sequência que se assemelha mais a sequência humana, isto é, o Nanocorpo pode ser "humanizado". Dessa maneira, a antigenicidade natural baixa de anticorpos camelídeos para os seres humanos pode ser ainda mais reduzida.

[00333] O Nanocorpo de camelídeo tem um peso molecular de aproximadamente um décimo de uma molécula de IgG humana, e a proteína tem um diâmetro físico de apenas alguns nanômetros. Uma consequência de o pequeno tamanho é a capacidade de nanocorpos de camelídeos para se ligar a locais antigênicos que são funcionalmente invisível para proteínas maiores de anticorpos, ou seja, nanocorpos de camelídeos são úteis como reagentes de deteção de antigênios, que são de outro modo críptico utilizando técnicas imunológicas clássicas, e, como possíveis agentes terapêuticos . Dessa maneira, ainda uma outra consequência da pequena dimensão é a de que um Nanocorpo de camelídeo pode inibir, como resultado de se ligar a um local específico, com uma ranhura ou fenda estreita de uma proteína alvo, e, portanto, pode servir em uma capacidade que se assemelha mais a função de um clássico droga de baixo peso molecular do que a de um anticorpo clássica.

[00334] O baixo peso molecular e o tamanho compacto resulta ainda mais em nanocorpos de camelídeos sendo extremamente termoestável, estável a um pH extremo e à digestão proteolítica, e mal antigênico. Outra consequência é que os nanocorpos de camelídeos facilmente deslocam a partir do sistema circulatório para os tecidos, e até atravessar a barreira sangue-cérebro, e pode tratar distúrbios que afetam o tecido do sistema nervoso. Os nanocorpos podem facilitar ainda mais o transporte da fármaco através da barreira hematoencefálica. Vide o pedido de patente U.S. 20040161738 publicado 19 de agosto de 2004. Estas características combinadas com a baixa antigenicidade para os seres humanos indicam grande potencial terapêutico. Além disso, estas moléculas podem ser totalmente expressas em células procarióticas, tais como E. coli, e são expressas como proteínas de fusão com bacteriófago e são funcionais.

[00335] Por conseguinte, uma característica da presente invenção é um anticorpo ou Nanocorpo decamelídeo tendo elevada afinidade para HER3. Em certas modalidades da presente invenção, o anticorpo ou Nanocorpo de camelídeo é produzido naturalmente no animal camelídeo, ou seja, é produzido por meio da imunização de camelídeo seguinte com HER3 ou um fragmento do mesmo de peptídeo, utilizando técnicas descritas na presente invenção para outros anticorpos. Alternativamente, o Nanocorpo de camelídeo de ligação a HER3 foi concebido, ou seja, produzido por meio da seleção, por exemplo, a partir de uma biblioteca de fago exibindo apropriadamente os nanocorpos de camelídeos de proteínas muetiquetaenizadas utilizando procedimentos panning com HER3 como um alvo, tal como descrito nos exemplos na apresentados presente invenção. Os nanocorpos manipulados podem ser ainda personalizados por meio da engenharia genética para ter uma semi-vida de um indivíduo receptor de desde 45 minutos até duas semanas. Em uma modalidade específica, o anticorpo ou Nanocorpo de camelídeo é obtido por enxerto de CDR as sequências da cadeia pesada ou leve dos anticorpos humanos da presente invenção em Nanocorpo ou únicas sequências de anticorpo de domínio da estrutura, como por exemplo descritos em PCT / EP93 / 02214. Em uma modalidade, o anticorpo ou Nanocorpo de camelídeo se liga a pelo menos um dos seguintes resíduos : HER3 Asn266, Lys267, Thr269, Leu268, Gln271, Glu273, Pro274, Pro276, Asn275, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. Em uma modalidade, o anticorpo ou Nanocorpo decamelídeo se liga a pelo menos um dos seguintes resíduos : HER3 Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Lys602, Ile600, Arg611, Glu609, Pro612, Cys613, His614, Glu615.

Moléculas biespecíficas e anticorpos multivalentes

[00336] Em outro aspecto, a presente invenção apresenta, moléculas biparatópicas biespecíficas ou multiespecíficas compreendendo um anticorpo de ligação de HER3, ou um fragmento do mesmo, da presente invenção. Um anticorpo da presente invenção, ou os fragmentos dos mesmos, podem ser derivatizados ou ligados a outra molécula funcional, por exemplo, um outro peptídeo ou proteína (por exemplo, um outro anticorpo ou um ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a, pelo menos, dois diferente locais de ligação ou moléculas-alvo. O anticorpo da presente invenção pode, de fato, ser derivatizado ou ligado a mais do que uma outra molécula funcional para gerar moléculas biparatópicas ou multi-específicas que se ligam a mais do que dois tipos diferentes de locais de ligação e/ou moléculas-alvo; tais moléculas biparatópicas ou multi-específica. Para criar uma molécula biespecífica da presente invenção, um anticorpo do presente invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tais como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, o peptídeo de ligação ou mimético, de tal modo que resulta uma molécula biespecífica.

[00337] Outros benefícios clínicos podem ser fornecidos por meio da ligação de dois ou mais antigênios de dentro um anticorpo (Coloma et al, (1997),. Merchant et al, (1998), Alt et al, (1999), Zuo et al, (2000) ; Lu et al, (2004),. Lu et al, (2005), Marvin et al, (2005), Marvin et al, (2006), Shen et al, (2007), Wu et al, (2007), DiMasi et al, (2009), Michaelson et al, (2009)). (Morrison et al, (1997) Nature Biotech 15 : 159 a 163, Alt et al Letters (1999) FEBS 454 : 90 a 94 ; Zuo et al, (2000) Protein Engineering 13 : 361 a 367,. Lu et al, (2004) JBC 279 : 2856 a 2865; . Lu et al, (2005) JBC 280 : 19665 a 19672,. Marvin et al, (2005) Acta Pharmacologica Sinica 26 : 649 a 658; . Marvin et al., (2006) Curr Opin Drugs Disco Desenvolver 9 : 184-193 ; Shen et al, (2007) Methods J Immun 218 : 65 a 74; . Wu et al, (2007) Nat Biotechnol 11 : 1290 a 1297, DiMasi et al, (2009) J Mol Biol 393 : 672 a 692, e Michaelson et al, (2009) mAbs 1 : 128 a 141.

[00338] As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas através da conjugação das especificidades constituintes de ligação, utilizando-se os métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e, em seguida, conjugada com um outro. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de acoplamento ou agentes de reticulação podem ser utilizados para a conjugação covalente. Exemplos de agentes de ligação cruzada incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5 '-ditiobis (2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), propionato de N- succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), e 4 - (N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato de sulfossuccinimidila (sulfo-SMCC) (vide, por exemplo, Karpovsky et al, (1984) J. Exp. Med. 160 : 1686, Liu et al, (1985) Proc Natl Acad Sci U.S. 82 : 8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78 : 118 a 132, Brennan et al, (1985) Science 229 : 81 a 83), e Glennie et al, (1987) J. Immunol. 139 : 2367 a 2375). Os agentes de conjugação são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[00339] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles podem ser conjugados com a ligação sulfidrila das regiões Terminal C de dobradiça das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particular, a região de dobradiça é modificada para conter um número ímpar de resíduos sulfidrila, por exemplo, um, antes da conjugação.

[00340] Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil quando a molécula biespecífica é uma mAb mAb x, mAb x Fab, Fab x F (ab ') 2 ou ligante x Fab da proteína de fusão. Uma molécula biespecífica da presente invenção pode ser uma molécula de cadeia única compreendendo um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única compreendendo dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas podem compreender, pelo menos, duas moléculas de cadeia simples. Os métodos para preparar as moléculas biespecíficas são descritas por exemplo, na Patente U.S. N 5260203, Patente U.S. número 5.455.030, Patente U.S. número 4.881.175, Patente U.S. número 5.132.405, Patente U.S. número 5.091.513, Patente U.S. número 5.476.786, Patente U.S. número 5.013.653, Patente U.S. número 5.258.498 ; e Número de Patente U.S. 5.482.858.

[00341] A ligação das moléculas biespecíficas para os seus objetivos específicos pode ser confirmada através de, por exemplo, ensaio imuossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (REA), a análise de FACS, bioensaio (por exemplo, inibição do crescimento), ou ensaio de Western Blot. Cada um destes ensaios detecta, geralmente na presença de proteína-anticorpo de particular interesse empregando um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse.

[00342] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona os compostos multivalentes que compreendem pelo menos dois fragmentos idênticos ou diferentes dos anticorpos da presente invenção para ligação HER3. Os fragmentos de anticorpos podem ser ligados em conjunto por meio de fusão ou proteína de ligação covalente ou não covalente. O compostos tetravalentes podem ser obtidos por exemplo por meio da ligação cruzada dos anticorpos. Os anticorpos da presente invenção com um anticorpo que se liga às regiões constantes dos anticorpos da presente invenção, por exemplo, a região de dobradiça ou de Fc. O domínio de Trimerização são descritos por exemplo na patente EP 1012280B1 Borean. Os módulos de Pentamerização são descritos por exemplo em PCT / EP97 / 05897.

[00343] Em uma modalidade, um biparatópico / biespecífico se liga a resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 de HER3.

[00344] Em uma outra modalidade, a presente invenção diz respeito a anticorpos de função dupla em que um anticorpo monoclonal único foi modificado de tal modo que o local de ligação ao antigênio se liga a mais do que um antigênio, tal como um anticorpo que se liga a dupla função tanto HER3 e um outro antigênio (por exemplo, HER1, HER2 e HER4). Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a um anticorpo que tem como alvo dupla função antigênios possuindo a mesma conformação, por exemplo, um antigênio que tem a mesma conformação do HER3 no estado "fechado" ou "inativo". Exemplos de antigênios, com a mesma conformação da HER3 no estado "fechado" ou "inativo" incluem, mas não estão limitados a, HER1 e HER4. Dessa maneira, um anticorpo pode ligar-se a função dupla de ambos HER3 e HER1, HER3 e HER4, ou HER1 e HER4. A especificidade dupla ligação do anticorpo função dupla pode ainda traduzir em dupla atividade, ou a inibição de atividade. (Vide, por exemplo, Jenny Bostrom et al, (2009) Science : 323 ; 1610 a 1614.).

Anticorpos com meia vida Estendida

[00345] A presente invenção proporciona anticorpos que se ligam especificamente à proteína HER3 que têm uma semi-vida prolongada in vivo.

[00346] Muitos fatores podem afetar a meia vida de uma proteína in vivo. Para exemplos, filtração dos rins, o metabolismo no fígado, a degradação por enzimas proteolíticas (proteases), e as respostas imunogênicas (por exemplo, proteína de neutralização por meio dos anticorpos e absorção por meio dos macrófagos e células dendríticas). Uma variedade de estratégias pode ser usada para prolongar a semi-vida dos anticorpos da presente invenção. Por exemplo, por ligação química com polietilenoglicol (PEG), recodificar PPOR EXEMPLO, andaime de anticorpo, ácido polissialico (PSA), hidroxietilamido (HES), albumina de ligação de ligantes, e escudos de hidratos de carbono ; por meio da fusão genética de proteínas de ligação a proteínas do soro, tais como albumina, IgG, FcRn, e transferir, por acoplamento (genética ou quimicamente) para outras porções de ligação que se ligam a proteínas do soro, tais como, nanocorpos, Fabs DARPins, avimeros, afficorpos e anticalins ; por meio da fusão genética para rPPOR EXEMPLO, albumina, domínio de albumina, proteínas de ligação à albumina, e Fc ; ou por meio da incorporação em nanopartículas, formulações de liberação lenta ou dispositivos médicos.

[00347] Para prolongar a circulação no soro de anticorpos in vivo, as moléculas poliméricas inertes, tais como PEG de alto peso molecular podem ser ligadas aos anticorpos ou um fragmento do mesmo, com ou sem um ligante multifuncional, quer através do local específico de conjugação do PEG com um terminal N ou C dos anticorpos ou via os grupos epsilan-amino presentes em resíduos de lisina. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo, ou um fragmento do mesmo, tipicamente faz-se reagir com polietilenoglicol (PEG), tal como um éster reativo ou um derivado aldeído de PPOR EXEMPLO, sob condições em que um ou mais grupos de PEG tornaram ligado ao anticorpo ou o fragmento de anticorpo . A peguilação poderá ser levada a cabo por meio de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um análogo de polímero solúvel em água reativo). Como usado na presente invenção, o termo "polietileno glicol" destina-se a englobar qualquer uma das formas de PEG que tenham sido utilizadas para transformar outras proteínas, tais como mono (C1-C10) alcoxi- ou ariloxi-polietileno-glicol ou polietileno-glicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser tratado com PEG é um anticorpo aglicosilado. A derivatização linear ou ramificada de do polímero que resulta em uma perda mínima de atividade biológica sera utilizada. O grau de conjugação pode ser cuidadosamente monitorizada por SDS-PAGE e espectrometria de massa para assegurar a conjugação adequada de moléculas de PEG com os anticorpos. PEG que não reagiu pode ser separado do anticorpo conjugados de PEG por meio da exclusão de tamanho ou por meio da cromatografia de troca iónica. Os anticorpos derivatizados de PEG podem ser testados para atividade de ligação, bem como para a eficácia in vivo, utilizando métodos bem conhecidos por aqueles que sao versados na técnica, por exemplo, por meio dos imunoensaios descritos na presente invenção. Métodos para proteínas peguilacao são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da presente invenção. Vide, por exemplo, EP 0 154 316 por Nishimura et al. e EP 0 401 384 por Ishikawa et al.

[00348] Outras tecnologias de peguilação modificadas incluem a reconstituicao tecnologia de engenharia química ortogonal dirigida (recodificar PEG), que incorpora as cadeias laterais quimicamente especificadas em proteínas biossintéticas através de um sistema que inclui tRNA sintetase e tRNA reconstituída. Esta tecnologia permite a incorporação de mais de 30 novos aminoácidos em proteínas biossintéticas em E. coli, levedura e células de mamíferos. O tRNA incorpora um aminoácido não nativo em qualquer lugar de um códon âmbar está posicionado, a conversão do âmbar a partir de um códon de paragem para um que sinaliza a incorporação do aminoácido quimicamente especificado.

[00349] A tecnologia recombinante de peguilação (rPEG) também pode ser utilizada para a extensão de semi-vida sérica. Esta tecnologia envolve geneticamente a fusão de 300 a 600 aminoácidos da proteína de cauda não estruturada para uma proteína farmacêutica existente. Uma vez que o peso molecular aparente da proteína de uma tal cadeia não estruturada é cerca de 15 vezes maior do que o seu peso molecular real, a semi-vida sérica da proteína é muito maior. Em contraste com a peguilação tradicional, o que requer a conjugação química e a repurificacao, o processo de fabricação é muito simplificado e o produto é homogêneo.

[00350] Polisializacao é uma outra tecnologia, que utiliza o polímero natural, ácido poliasilico (PSA) para prolongar a vida ativa e melhorar a estabilidade de peptídeos e proteínas terapêuticas. O PSA é um polímero de ácido siálico (um açúcar). Quando utilizado para a proteína e a entrega da droga terapêutica peptídica, o ácido polisialico fornece um microambiente de proteção em conjugação. Isto aumenta a vida ativa da proteína terapêutica na circulação e impede-o de ser reconhecido pelo sistema imunitário. O polímero PSA é naturalmente encontrado no corpo humano. Foi adotado por certas bactérias que evoluíram ao longo de milhões de anos para revestir suas paredes com ele. Estas bactérias naturalmente polissialiladas foram capazes, em virtude de mimetismo molecular, para despistar o sistema de defesa do organismo. PSA, a tecnologia da natureza furtiva final, podem ser facilmente produzidos a partir de tais bactérias em grandes quantidades e com pré-determinadas características físicas. PSA bacteriana é completamente não-imunogênica, mesmo quando associado a proteínas, uma vez que é quimicamente idêntico ao PSA no corpo humano.

[00351] Outra tecnologia inclui a utilização de amido de derivados dehidroxietila ("HES") associados a anticorpos. HES é um polímero natural modificado derivado de amido de milho ceroso e pode ser metabolizado pelas enzimas do corpo. As soluções HES são geralmente administradas para substituir o volume de sangue deficiente e para melhorar as propriedades reológicas do sangue. HESilacao de um anticorpo permite o prolongamento da semi-vida de circulação, aumentando a estabilidade da molécula, bem como através da redução da depuração renal, resultando em um aumento da atividade biológica. Ao variar os diferentes parâmetros, tais como o peso molecular de HES, uma ampla gama de anticorpos conjugados HES pode ser personalizado.

[00352] Anticorpos tendo uma maior semi-vida in vivo podem também ser gerados introduzindo uma ou mais modificações de aminoácidos (isto é, substituições, inserções ou deleções) para um domínio constante de IgG, ou um fragmento de ligação daí FcRn (de preferência, um fragmento Fc ou domínio dobradiça Fc) . Vide, por exemplo, a Publicação Internacional No. WO 98 / 23289 ; Publicação Internacional No. WO 97 / 34631, e Patente U.S. No. 6.277.375.

[00353] Além disso, os anticorpos podem ser conjugados com a albumina, a fim de tornar o anticorpo ou o fragmento de anticorpo mais estáveis in vivo, ou ter uma meia vida mais longa in vivo. As técnicas são bem conhecidas na técnica, vide, por exemplo, a Publicação Internacional №s WO 93 / 15199, WO 93 / 15200, e WO 01 / 77137 e Patente Europeia N ° EP 413622.

[00354] O anticorpo HER3 ou um fragmento do mesmo pode também ser fundido com uma ou mais albumina de soro humano (HSA), polipeptídeos, ou uma parte do mesmo. HSA, uma proteína de 585 aminoácidos na sua forma madura, é responsável por uma proporção significativa da pressão osmótica do soro e funciona também como um transportador de ligantes endógenos e exógenos. O papel da albumina como uma molécula transportadora e a sua natureza inerte são propriedades desejáveis para utilização como um transportador e transportador de polipeptídeos in vivo. A utilização da albumina como um componente de uma proteína de fusão de albumina como um portador para várias proteínas foi sugerido no documento WO 93 / 15199, WO 93 / 15200 e EP 413 622. A utilização de fragmentos N-terminais de HSA para fusões com polipeptídeos foi também proposta (EP 399 666). Por conseguinte, pela fusão genética ou quimicamente ou conjugar os anticorpos ou os fragmentos dos mesmos para a albumina, pode estabilizar ou aumentar o período de vida útil, e/ou para reter a atividade da molécula, por períodos de tempo prolongados em solução, in vitro e/ou in vivo.

[00355] A fusão de albumina a uma outra proteína pode ser obtida por manipulação genética, de tal modo que o DNA que codifica para a HSA, ou um fragmento do mesmo, é unido ao DNA que codifica para a proteína. Um hospedeiro adequado é então transformado ou transfectado com as sequências nucleotídicas fundidas, dispostas de modo a um plasmídeo adequado para expressar um polipeptídeo de fusão. A expressão pode ser efectuada in vitro a partir de, por exemplo, as células procarióticas ou eucarióticas, ou in vivo, por exemplo a partir de um organismo transgênico. Métodos adicionais referentes a fusões de HSA podem ser encontrados, por exemplo, no documento WO 2001077137 e WO 200306007, na presente invenção incorporado por referência. Em uma modalidade específica, a expressão da proteína de fusão é realizada em linhagens de célula de mamíferos, por exemplo, as linhagens de célula CHO. Ligação diferenciais alteradas de um anticorpo a um receptor a pHs baixos ou altos é também contemplados como estando dentro do âmbito da presente invenção. Por exemplo, a afinidade de um anticorpo pode ser modificada de tal modo que permanece ligado ao seu receptor, a um pH baixo, por exemplo, o pH baixo no interior de uma lyzozome, modificando o anticorpo de modo a incluir aminoácidos adicionais, tais como um histine em uma CDR de o anticorpo (Vide, por exemplo, Tomoyuki Igawa et al (2010) Nature Biotechnology,. 28, 1203-1207).

Os conjugados de anticorpos

[00356] A presente invenção proporciona anticorpos ou os fragmentos dos mesmos que se ligam especificamente a uma proteína HER3 recombinantemente fundida ou conjugada quimicamente (incluindo ambas as conjugações covalentes e não covalentes) a uma proteína ou polipeptídeo heterólogo (ou o fragmento do mesmo, de preferência, a um polipeptídeo de pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo menos 100 aminoácidos) para gerar proteínas de fusão. Em particular, a presente invenção fornece proteínas de fusão compreendendo um fragmento de anticorpo na presente invenção descrito (por exemplo, um fragmento Fab, Fd, fragmento Fv, fragmento F (ab ') 2 fragmentos, um domínio VH, uma CDR de VH, um domínio VL ou de uma CDR de VL) e uma proteína heteróloga, polipeptídeo ou peptídeo. Métodos para a fusão ou a conjugação de proteínas, polipeptídeos ou peptídeos, a um anticorpo ou um fragmento de anticorpo são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patente U.S. Ns 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851, e 5.112.946 ; Europeu de Patentes №s EP 307434 e EP 367166 ; Publicação Internacional №s WO 96 / 04388 e WO 91 / 06570 ; Ashkenazi et al,. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 88 : 10535-10539,. Zheng et al, (1995) J. Immunol. 154 : 5590-5600 ; e Vil et al, (1992) Proc.. Natl. Acad. Sci. U.S. 89 : 11337 - 11341.

[00357] As proteínas de fusão adicionais podem ser geradas através de técnicas de embaralhamento de gene, embaralhamento de motivo, embaralhamento de exon e/ou embaralhamento de códon (coletivamente referidas como "embaralhamento de DNA "). O embaralhamento de DNA pode ser utilizado para alterar as atividades dos anticorpos da presente invenção ou os os fragmentos dos mesmos (por exemplo, anticorpos ou os fragmentos dos mesmos com afinidades maiores e menores taxas de dissociação). vide, de uma maneira geral, Patente U.S. №s 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252, e 5.837.458 ; Patten et al, (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8 : 724-33 ; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16 (2) : 76 a 82; Hansson et al, (1999) J. Mol. Biol. 287 : 265-76, e Lorenzo e Blasco, (1998) Biotechniques 24 (2) : 308 a 313 (cada uma destas patentes e publicações são na presente invenção incorporadas por referência na sua totalidade). Os anticorpos ou o fragmentos destes, ou os anticorpos codificados ou o fragmentos dos mesmos, podem ser alterados por ser submetido a muetiquetaênese aleatória por PCR propensa a erros, de inserção aleatória de nucleotídeos ou outros métodos anteriores à recombinação. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente a uma proteína HER3 podem ser recombinados com um ou mais componentes, motivos, perfis, peças, domínios, fragmentos, etc, de uma ou mais moléculas heterólogas.

[00358] Além disso, os anticorpos ou os fragmentos dos mesmos podem ser fundidos com as sequências de marcador, tal como um peptídeo para facilitar a purificação. Em modalidades preferidas, o marcador de sequência de aminoácidos é um peptídeo hexa-histidina, tal como a etiqueta fornecida em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponível. Como descrito em Gentz et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 86 : 821 a 824, por exemplo, hexa-histidina proporciona para purificação conveniente da proteína de fusão. Outras marcas de peptídeos úteis para a purificação incluem, mas não estão limitadas a, o etiqueta hemaglutinina ("HA"), o que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina da gripe (Wilson et al., (1984) Cell 37 : 767), e a "bandeira" etiqueta.

[00359] Em uma outras modalidades, os anticorpos da presente invenção ou os fragmentos dos mesmos conjugaram-se com um agente de diagnóstico ou detectável. Tais anticorpos podem ser úteis para a monitorização ou prognóstico do aparecimento, desenvolvimento, progressão e/ou a gravidade de uma doença ou distúrbio, como parte de um procedimento de testes clínicos, tais como a determinação da eficácia de uma terapia particular. Tal diagnóstico e deteção pode conseguida por meio do acoplamento do anticorpo a substâncias detectáveis incluem, mas não se limitam a, várias enzimas, tais como, mas não se limitando a, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase ; grupos prostéticos, tais como, mas não limitado a, streptavidinlbiotin e avidina / biotina ; materiais fluorescentes, tais como, mas não limitado a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato fluoresceína, rodamina, fluoresceína diclorotriazinilamina, cloreto de dansila ou ficoeritrina ; materiais luminescentes, tais como, mas não limitado a, luminol, materiais bioluminescentes, tais como mas não limitados a, luciferase, luciferina, e aquorina ; materiais radioativos, tais como, mas não limitado a, iodo (131I,125I, 123I, e 121I), carbono (14C), enxofre ( 35S), trítio (3H), Índio (115In, 113In, 112In, e 111In), tecnécio (99Tc), tálio (201Ti), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), Molibdénio (99Mo), xenon ( 133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, e 117Tin e metais emissores de pósitrons utilizando várias tomografias de emissão de pósitrons, e íons metálicos não-radiativos paramagnéticos.

[00360] A presente invenção abrange ainda as utilizações de anticorpos ou os fragmentos dos mesmos conjugados com uma porção terapêutica. Um anticorpo ou o fragmento pode ser conjugado com uma porção terapêutica tal como uma citotoxina, por exemplo, um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou de um ion de metal radioativo, por exemplo, alfa-emissores. Uma citotoxina ou agente citotóxico, inclui qualquer agente que seja prejudicial para as células.

[00361] Além disso, um anticorpo ou o fragmento pode ser conjugado com uma porção terapêutica ou molécula de droga que modifica uma dada resposta biológica. Radicais ou porções terapêuticas de drogas não são para ser interpretados como limitados aos agentes químicos clássicos terapêuticos. Por exemplo, a molécula de droga pode ser uma proteína, peptídeo, ou um polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina da cólera, ou toxina da difteria, uma proteína tal como o fator de necrose tumoral, α-interferon, β-interferon, fator de crescimento dos nervos, de crescimento derivado de plaquetas fator ativador de plasminogênio tecidular, um agente de apoptose, um agente anti-angiogênico, ou, um modificador de resposta biológica, tais como, por exemplo, uma linfoquina. Em uma modalidade, o anticorpo anti-HER3, ou um fragmento do mesmo, conjugada com uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imunossupressor), ou um radiotoxin. Tais conjugados são na presente invenção referidos como "imunoconjugados". Imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas". Uma citotoxina ou agente citotóxico, inclui qualquer agente que seja prejudicial para (por exemplo, kills) células. Exemplos incluem taxon, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposide, vincristina, vinblastina, t. colchicin, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxi anthracin diona, mitoxantrona, mitramicina, atinomicina D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e seus análogos ou homólogos dos mesmos. Agentes terapêuticos adicionais incluem, por exemplo, anti-metabolitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazine), agentes de ablação (por exemplo, mecloretamina, thioepa chloraxnbucil, meiphalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU ), cyclothosphamide, busulfan, dibromomannitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis dichlorodiamine-platina (II) com cisplatina (DDP), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, datinomicina (anteriormente atinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)), e anti- mitóticos (por exemplo, os agentes, a vincristina e vinblastina). (Vide, por exemplo, Seattle Genetics US20090304721).

[00362] Outros exemplos de citotoxinas terapêuticas que podem ser conjugadas a um anticorpo da presente invenção, incluem, duocarmicinas calicheamicinas, maitansinas e auristatinas, e os derivados dos mesmos. Um exemplo de um conjugado de anticorpo de calicheamicina está comercialmente disponível (MylotargTm ; Wyeth-Ayerst).

[00363] Citoxinas podem ser conjugadas com os anticorpos da presente invenção utilizando a tecnologia de ligação disponíveis na técnica. Exemplos de tipos de ligantes que tenham sido usados para conjugar uma citotoxina com um anticorpo incluem, mas não estão limitados a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfuretos e contendo os peptídeos ligantes. Um ligante pode ser escolhido, ou seja, por exemplo, susceptível à clivagem por pH baixo no interior do compartimento lisossomal ou susceptível à clivagem por proteases, tais como proteases, preferencialmente expressas em tecido de tumor, tais como as catepsinas (por exemplo, as catepsinas B, C, D).

[00364] Para uma discussão adicional de tipos de citotoxinas, ligantes e os métodos para conjugar agentes terapêuticos a anticorpos, vide também a Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55 : 199 a 215 ; Trail et al, (2003) Cancer Immunol.. Immunother. 52 : 328 a 337 ; Payne (2003) Cancer Cell 3 : 207 a 212 ; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2 : 750 a 763 ; Pastan e Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3 : 1089 a 1091 ; Senter e Springer, (2001) ADV. Drug Deliv. Rev. 53 : 247 a 264.

[00365] Os anticorpos da presente invenção também podem ser conjugados com um isótopo radioativo para gerar radiofármacos citotóxicos, também referidos como radioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioativos que podem ser conjugados com anticorpos para utilização em diagnóstico ou terapêutica incluem, mas não estão limitados a, iodinel31, indium111, yttrium90 e lutetium177. O método para a preparação de radioimunoconjugados e estabelecido na técnica. Exemplos de radioimunoconjugados estão comercialmente disponíveis, incluindo ZevalinTM (DEC Pharmaceuticals) e BexxarTM (Corixa Pharmaceuticals), e métodos semelhantes podem ser utilizados para preparar radioimunoconjugados, utilizando os anticorpos da presente invenção. Em certas modalidades, o agente quelante é macrocíclico ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N, N ', N'', N'"-tetra-acético (DOTA), que pode ser ligado ao anticorpo através de uma molécula ligante. Tais moléculas ligantes são geralmente conhecidos na técnica e descritos em Denardo et al., (1998), Clin Cancer Res. 4 (10) : 2483 a 90; . Peterson et al, (1999) Bioconjug. Chem. 10 (4) : 553 a 7, e Zimmerman et al, (1999) Nucl.. Med. Biol. 26 (8) : 943 a 50, cada uma incorporada por referência na sua totalidade.

[00366] As técnicas para a conjugação de porções terapêuticas de anticorpos são bem conhecidas, vide, por exemplo, Arnon et al. "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (Eds.), pp 243 a 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985) ; Hellstrom et al, "Antibodies for Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2 ed.), Robinson et al.. (Eds.), pp 623 a 53 (Marcel Dekker, Inc., 1987) ; Thorpe, "Antibodies Carriers of Citotoxic Agents in Cancer Therapy : A Review", em Monoclonal Antibodies 84 : Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (Eds.), pp 475 a 506 (1985), "Anlysis,Results and Future prospective of theTherapeutic Use ofRadiolabeled Antibody in Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (Eds.), pp 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., (1982) Immunol. Rev. 62 : 119 a 58.

[00367] Os anticorpos também podem ser ligados a suportes sólidos, os quais são particularmente úteis para imunoensaios ou purificação do antigênio alvo. Tais suportes sólidos incluem, mas não estão limitados a, vidro, celulose, poliacrilamida, cloreto de nailon, de polivinila, poliestireno ou polipropileno.

Combinações de anticorpos

[00368] Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a Anticorpos HER3, ou os fragmentos dos mesmos da presente invenção utilizado com outros agentes terapêuticos, tais como anticorpos, inibidores de outras moléculas pequenas, inibidores mTOR e inibidores PI3Kinase. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, o seguinte:

[00369] Inibidores HER1 : Os Anticorpos HER3 ou os fragmentos dos mesmos podem ser usado com inibidores de HER1, que incluem, mas não estão limitados a, Matuzumab (EMD72000), Erbitux ® Cetuximab / (Imclone), Vectibix ® / Panitumumab (Amgen), mAb 806, e Nimotuzumab (TheraCIM), Iressa ® / Gefitinib (AstraZeneca), IC-1033 (PD183805) (Pfizer), lapatinib (GW-572016) (GlaxoSmithKline), o Tykerb ® / lapatinib ditosilato (SmithKlineBeecham), Tarceva ® / erlotinib HCL (OSI-774 ) (OSI Pharma) e PKI-166 (Novartis), e vendido sob a marca registada Tovok ® por Boehringer Ingelheim).

[00370] Inibidores HER2 : Os anticorpos HER3 ou o fragmentos dos mesmos podem ser usados com os inibidores de HER2, que incluem, mas não estão limitados a, pertuzumab (vendido sob a marca comercial Omnitarg ®, por Genentech), trastuzumab (vendido sob a marca comercial de Herceptin ® pela Genentech / Roche), MM-111, neratinib (também conhecido como HKI-272, e descrito Publicação PCT No. WO 05 / 028443), lapatinib ou ditosilato de lapatinib (vendido sob a marca comercial Tykerb ® por GlaxoSmithKline.

[00371] Inibidores HER3 : Os Anticorpos HER3 ou os fragmentos dos mesmos podem ser usados com inibidores de HER3, que incluem, mas não estão limitados a, MM-121, MM-111, IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203 ( Aveo), MEHD7945A (Genentech), e as moléculas pequenas que inibem a HER3.

[00372] Inibidores HER4 : Os Anticorpos HER3 ou os fragmentos dos mesmos podem ser usados com inibidores de Her4.

[00373] Inibidores de PI3K : Um Anticorpos HER3 ou os fragmentos dos mesmos podem ser usados com inibidores de quinase PI3, que incluem, mas não estão limitados a, (Também conhecido como GDC 0941 e descrito na Publicação PCT №s WO 09 / 036082 e WO 09 / 055730), (Também conhecido como BEZ 235 ou NVP-BEZ 235, e descritos na Publicação PCT No. WO 06 / 122806), e BMK120 BYL719.

[00374] inibidores de mTOR : Os Anticorpos HER3 ou os fragmentos dos mesmos podem ser usados com inibidores de mTOR, que incluem, mas não estão limitados a, Temsirolimus (vendido sob o nome comercial Torisel ® pela Pfizer), ridaforolimus (formalmente conhecida como deferolimus, (1R, 2R, 4S) -4 - [(2R) -2 [(1R, 9S, 12S, 15R, 16E, 18R, 19R, 21R, 23S, 24E, 26E, 28Z, 30S, 32S, 35R) -1,18-di-hidroxi-19, 30-dimetoxi-15, 17,21,23, 29,35-hexametil-2-pentaoxo ,3,10,14,20-11 ,36-dioxa-4-azatriciclo [30.3.1.04,9] hexatriaconta-16, 24,26,28-tetraen-12-il] propil] -2-metoxiciclo dimetilfosfinato, também conhecido como Deforolimus, AP23573 e MK8669 (Ariad Pharm.), e descrito na Publicação PCT N ° WO 03 / 064383), everolimus (RAD001 ) (vendido sob o nome comercial de ® Afinitor Novartis), um ou mais agentes terapêuticos podem ser administrados tanto em simultâneo, ou antes ou depois da administração de um anticorpo ou um fragmento do mesmo HER3 da presente invenção.

Métodos de produção de anticorpos da presente invenção (I) ácidos nucleicos que codificam os anticorpos

[00375] A presente invenção proporciona substancialmente asmoléculas de ácido nucleico purificadas de codificam os polipeptídeos compreendendo os segmentos ou domínios de cadeias de ligação de Anticorpos HER3 descritos acima. Alguns dos ácidos nucleicos da presente invenção compreendem a sequência de nucleotídeos que codifica para o anticorpo HER3 região variável da cadeia pesada, e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia leve. Em uma modalidade específico, as moléculas de ácido nucleico são aquelas identificadas na Tabela 1. Algumas outras moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção compreendem as sequências de nucleotídeos que são substancialmente idênticos (por exemplo, pelo menos 65, 80 %, 95 % ou 99 % ) com as sequências nucleotídicas de os identificados na Tabela 1. Quando expresso a partir de vetores de expressão apropriados, polipeptídeos codificados por esses polinucleotídeos são capazes de exibir HER3 capacidade de ligação ao antigênio.

[00376] Também fornecido na presente invenção são os polinucleotídeos que codificam pelo menos uma região CDR e, geralmente, todas as três regiões CDR de cadeia pesada ou leve do anticorpo de ligação de HER3 estabelecido acima. Alguns outros polinucleotídeos codificam toda ou substancialmente toda a sequência da região variável da cadeia pesada e/ou da cadeia leve do anticorpo de ligação de HER3 estabelecido acima. Devido à degenerescência do código, várias sequências de ácidos nucleicos que codificam cada uma nas sequências de aminoácidos de imunoglobulina.

[00377] As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem codificar tanto a região variável quanto uma região constante do anticorpo. Algumas nas sequências de ácidos nucleicos da presente invenção compreendem os nucleotídeos que codificam a cadeia pesada madura sequência da região variável, que é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos, 80 %, 90 % ou 99 % ) para a sequência da cadeia pesada madura da região variável de um conjunto de anticorpos HER3 apresentados na Tabela 1. Algumas outras sequências de ácidos nucleicos que compreendem de nucleotídeos codificadora de uma cadeia leve madura sequência da região variável, que é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos, 80 %, 90 % ou 99 % ) para a sequência da cadeia leve madura da região variável de um anticorpo de HER3 apresentados na Tabela 1.

[00378] As sequências de polinucleotídeos podem ser produzidas por meio da nova síntese de DNA em fase sólida ou por muetiquetaênese por PCR de uma sequência existente (por exemplo, as sequências tal como descrito nos Exemplos a seguir) que codifica um anticorpo de ligação de HER3, ou o fragmento do mesmo de ligação. A síntese química direta de ácidos nucleicos pode ser realizada por meio dos métodos conhecidos na técnica, tais como o método do fosfotriéster de Narang et al., (1979) Meth. Enzymol. 68 : 90, o método do fosfodiéster de Brown et al, (1979) Meth. Enzymol. 68 : 109, o método de dietilfosforamidite de Beaucage et al, (1981) Tetra. Lett, 22 : 1859; e o método em suporte sólido da Patente U.S. No. 4.458.066. as mutações que introduzem a uma sequência de polinucleotídeos por PCR podem ser realizadas como descrito em, por exemplo, PCR Technology : Principies and Applications for DNA Amplification, HA Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992 ; PCR Protocolos : A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; . Mattila et al, (1991) Nucleic Acids Res. 19 : 967 ; e Eckert et al, (1991) PCR Methods and Applications 1 : 17 .

[00379] Também fornecido na presente invenção são os vetores de expressão e células hospedeiras para produção de anticorpos de ligação a HER3 descritos acima. Os vetores de expressão diferentes podem ser utilizados para expressar os polinucleotídeos que codificam as cadeias de ligação de Anticorpos HER3 ou o fragmentos de ligação. Ambos os vetores de expressão baseados em vírus e não virais podem ser usados para produzir os anticorpos de uma célula hospedeira de mamífero. Vetores não virais e sistemas incluem plasmídeos, vetores epissomais, tipicamente com uma cassete de expressão para a expressão de uma proteína ou RNA, e cromossomas artificiais humanos (vide, por exemplo, Harrington et al., (1997) Nat Genet 15 : 345). Por exemplo, os vetores não virais úteis para a expressão dos polinucleotídeos e polipeptídeos HER3 de ligação em células de mamíferos (por exemplo, humanos) incluem pThioHis A, B e C, pcDNA3.1 / His, pEBVHis A, B e C, (Invitrogen, San Diego, CA), os vetores de MPSV, e numerosos outros vetores conhecidos na técnica para a expressão de outras proteínas. Os vetores virais Úteis incluem os vetores baseados em retrovírus, adenovírus, vírus adenoassociados, vírus do herpes, vetores baseados em SV40, vírus do papilama, vírus Epstein Barr HBP, os vetores do vírus vaccinia e vírus da Floresta Semliki (SFV). Vide, Brent et al, (1995) supra; . Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49 : 807, e Rosenfeld et al, (1992) Cell 68 : 143.

[00380] A escolha do vetor de expressão depende das células hospedeiras pretendidas, em que o vetor é para ser expresso. Tipicamente, os vetores de expressão contêm um promotor e outras sequências reguladoras (por exemplo, intensificadores) que são operacionalmente ligados aos polinucleotídeos que codificam para uma cadeia de ligação de anticorpo ou o fragmento HER3. Em algumas modalidades, um promotor indutível é utilizado para prevenir a expressão de sequências inseridas excepto sob condições de indução. Os promotores indutíveis incluem, por exemplo, arabinose, lacZ, o promotor de metalotioneína ou um promotor de choque térmico. As culturas de organismos transformadas podem ser expandidas em condições não-indutivas sem polarização da população de sequências de codificação cujos produtos de expressão são bem tolerados pelas células hospedeiras. Para além de promotores, outros elementos reguladores também podem ser necessários ou desejados para a expressão eficiente de uma cadeia de ligação de anticorpo ou o fragmento HER3. Estes elementos incluem, tipicamente, um códon de iniciação ATG e local de ligação ao ribossoma adjacente ou outras sequências. Além disso, a eficiência de expressão pode ser aumentada pela inclusão de promotores apropriados para o sistema celular em uso (vide, por exemplo, Scharf et al, (1994) Results Probl celular Differ 20 : 125, E Bittner et al., (1987) Meth. Enzymol., 153 : 516). Por exemplo, o potenciador de SV40 ou o intensificador CMV pode ser usado com a finalidade de aumentar a expressão em células hospedeiras de mamíferos.

[00381] Os vetores de expressão podem também proporcionar uma sequência de sinal de secreção de posição de modo a formar uma proteína de fusão com polipeptídeos codificados por meio das sequências inseridas aos anticorpos de ligação de HER3. Mais frequentemente, as sequências inseridas aos anticorpos de ligação de HER3 estão ligadas a uma sequência de sinais antes da inclusão no vetor. Os vetores a serem utilizados para receber sequências que codificam para anticorpos de ligação de HER3 da cadeia leve e os domínios variáveis de cadeia pesada, por vezes, também codificam as regiões constantes, ou partes dos mesmos. Estes vetores permitem a expressão das regiões variáveis, como proteínas de fusão com as regiões constantes assim que conduzem à produção de anticorpos intatos ou os fragmentos dos mesmos. Tipicamente, essas regiões constantes são humanas.

[00382] As células hospedeiras para abrigar e expressar as cadeias de ligação de Anticorpos HER3 podem ser procarióticas ou eucarióticas. A E. coli é um hospedeiro procariótico útil para a clonagem e expressão dos polinucleotídeos da presente invenção. Outros hospedeiros microbianos adequados para utilização incluem bacilas, tais como Bacillus subtilis e outras enterobacteriáceas, tais como Salmonella, Serratia, e várias espécies de Pseudomonas. Nestes hospedeiros procarióticos, pode-se também fazer vetores de expressão, que normalmente contêm sequências de controle da expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Além disso, um número qualquer de uma variedade de promotores bem conhecido estara presente, tais como o sistema promotor da lactose, um sistema promotor de triptofano (trp), um sistema promotor da beta-lactamase, ou um sistema promotor do fago lambda. Os promotores tipicamente controlam a expressão, opcionalmente com uma sequência operadora, e têm sequências do local de ligação ao ribossoma e semelhantes, para iniciar e completar a transcrição e tradução. Outros micróbios, tais como leveduras, podem também ser empregues para expressar HER3 de ligação a polipeptídeos da presente invenção. As células de insetos em conjunto com vetores de baculovírus também podem ser usadas.

[00383] Em algumas modalidades preferidas, as células hospedeiras de mamíferos são utilizadas para expressar e produzir os polipeptídeos de ligação a HER3 da presente invenção. Por exemplo, elas podem ser uma linhagem celular de hibridoma que expressa genes de imunoglobulina endógenos (por exemplo, o clone de mieloma 1D6.C9 de hibridoma tal como descrito nos exemplos) ou uma linhagem celular de mamífero abrigando um vetor de expressão exógeno (por exemplo, a células SP2 / 0 de mieloma exemplificado a seguir). Estes incluem qualquer animal mortal ou normal ou anormal normal, imortal ou célula humana. Por exemplo, um número de linhagens de células hospedeiras adequadas, capazes de imunoglobulinas secretoras intactas foram desenvolvidos, incluindo as linhagens de célula CHO, várias linhagens de célula Cos, células HeLa, linhagens de célula de mieloma, as células B transformadas e hibridomas. O uso de cultura de células e tecidos de mamíferos para expressar polipeptídeos é discutido em geral, por exemplo, Winnacker, DE GENES DE CLONES, VCH Publishers, NY, NY, 1987. Os vetores de expressão para células hospedeiras de mamífero podem incluir as sequências de controle da expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor e um potenciador (vide, por exemplo, Queen et al., (1986) Immunol. Rev. 89 : 49 a 68), e os locais de processamento necessárias informações, como locais de ligação dos ribossomas, locais de emenda de RNA, locais de poliadenilação, e sequências de terminação da transcrição. Estes vetores de expressão contêm normalmente promotores derivados de genes de mamíferos ou a partir de vírus de mamíferos. Os promotores adequados podem ser constitutivos, o tipo de célula específico, o estágio específico, e/ou modulável ou regulável. Os promotores úteis incluem, mas não estão limitados a, o promotor de metalotioneína, o constituinte principal promotor tardio do adenovírus, o promotor induzível por dexametasona MMTV, o promotor SV40, o promotor MRP polIII, o promotor MPSV constitutivo, a tetraciclina induzível promotor CMV (tal como o promotor CMV humano imediato precoce), o promotor de CMV constitutivo, e as combinações promotor-potenciador conhecidas na técnica.

[00384] Os métodos para introduzir os vetores de expressão contendo as sequências polinucleotídicas de interesse variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é vulgarmente utilizada para células procarióticas, enquanto que o tratamento com fosfato de cálcio ou a eletroporação podem ser utilizados para outros hospedeiros celulares. (Vide geralmente, Sambrook, et al., Supra). Outros métodos incluem, por exemplo, a eletroporação, o tratamento com fosfato de cálcio, transformação mediada por lipossomas, a injeção e micro-injeção, os métodos balísticos, virossomas, imunolipossomas, policatião : conjugados de ácidos nucleicos, DNA nu, viriões artificiais, a fusão com a proteína estrutural VP22 do vírus herpes (Elliot e O'Hare, (1997) Cell 88 : 223), um agente de realce da absorção de DNA, e a transdução ex vivo. Para longo prazo, a produção de alto rendimento de proteínas recombinantes, a expressão estável, muitas vezes, a desejar. Por exemplo, as linhagens de célula que expressam estavelmente as cadeias de ligação de anticorpos HER3 ou o fragmentos de ligação podem ser preparadas utilizando os vetores de expressão da presente invenção que contêm origens virais de replicação ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável. Após a introdução do vetor, as células podem ser deixadas a crescer durante 1 a 2 dias em um meio enriquecido antes de serem comutadas para os meios seletivos. O objetivo do marcador de seleção é o de conferir resistência à seleção, e a sua presença permite o crescimento das células que expressam com sucesso as sequências introduzidas em meios seletivos. As células resistentes, estavelmente transfectadas podem ser proliferadas utilizando técnicas de cultura de tecidos apropriadas para o tipo de célula.

(Ii) Produção de anticorpos monoclonais da presente invenção

[00385] Os anticorpos monoclonais (mAb) podem ser produzidos por meio de uma variedade de técnicas, incluindo por exemplo, a metodologia convencional de anticorpo monoclonal, o padrão da célula somática técnica de hibridação de Kohler e Milstein, (1975) Nature 256 : 495. Muitas técnicas para a produção de anticorpo monoclonal podem ser empregues, por exemplo, transformação viral ou oncogênica dos linfócitos B.

[00386] Um sistema animal para preparar hibridomas é o sistema de murino. A produção Hibridoma no camundongo é um procedimento bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para o isolamento de esplenitos imunizados para a fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e os procedimentos de fusão também são conhecidos.

[00387] Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal de rato preparado como descrito acima. DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeia pesada e leve pode ser obtido a partir do hibridoma de murídeo de interesse e de engenharia para conter as sequências não murinas (por exemplo,. Humana) de imunoglobulina, utilizando técnicas padrão de biologia molecular. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis de murideo podem ser ligadas a regiões constantes humanas, utilizando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente U.S. N° 4816567 de Cabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR de murino podem ser inseridas em uma estrutura humana, utilizando métodos conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patente U.S. N° 5225539 de Winter, e Patente U.S. №s 5530101 ; 5585089 ; 5693762 e 6180370 de Queen et al.

[00388] Em uma modalidade determinada, os anticorpos da presente invenção são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra HER3 podem ser gerados utilizando os camundongos transgênicos ou transcromossômicos que transportam partes do sistema imunitário humanas em vez do sistema do camundongo. Estes camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos na presente invenção referidos como camundongos e ratos AcMHu km, respectivamente, e são referidos na presente invenção coletivamente como "camundongos Ig humana."

[00389] O camundongo AcMHu ® (Medarex, Inc.) contém imunoglobulina do gene minilaci humano que codifica a cadeia pesada humano não-reorganizada (μ e γ) e as sequências de imunoglobulina de cadeia leve k, juntamente com mutações específicas que inativam o μ endógeno e locais κ da cadeia (vide, por exemplo, Lonberg et al, (1994) Nature 368 (6474) : 856 a 859). Consequentemente, os camundongos apresentam uma expressão reduzida de IgM de camundongoou k, e em resposta à imunização, os transgenes introduzidos de cadeia pesada humana e da leve sofrem classe de comutação e de mutação somática para gerar alta afinidade humana IgGK monoclonal (Lonberg et al., (1994) supra ; revisto em Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113 : 49-101; Lonberg e Huszar, (1995) Intern Rev. Immunol.13 : 65 a 93, e Harding e Lonberg, (1995) Ann NY Acad. Sei. 764 : 536 a 546). A preparação e utilização de camundongos AcMHu, e as modificações genómicas transportados por esses camundongos, é ainda descrita em Taylor et al, (1992) Nucleic Acids Research 20 : 6287 a 6295 ; Chen et al, (1993) International Immunology 5 : 647 a 656,. Tuaillon et al, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 94 : 3720 a 3724 ; Choi et al, (1993) Nature Genetics 4 : 117 a 123; . Chen et al, (1993) EMBO J. 12 : 821 a 830; Tuaillon et al, (1994) J. Immunol. 152 : 2912 a 2920 ; Taylor et al, (1994) International Immunology 579 a 591, E Fishwild et al, (1996) Nature Biotechnology 14 : 845 a 851, os conteúdos de todos os quais são na presente invenção expressamente incorporados por referência a sua totalidade. Vide, ainda, Patentes dos U.S. Nos 5.545.806 ; 5.569.825 ; 5.625.126 ; 5.633.425 ; 5.789.650 ; 5.877.397 ; 5.661.016 ; 5.814.318 ; 5.874.299 e 5.770.429, todas para Lonberg e Kay, Patente U.S. No. 5.545.807 de Surani et al,. Publicação PCT №s WO 92103918, WO 93 / 12227, WO 94 / 25585, WO 97113852, WO 98 / 24884 e WO 99 / 45962, todas de Lonberg e Kay, e Publicação PCT N ° WO 01 / 14424 de Korman et al.

[00390] Em uma outra modalidade, os anticorpos humanos da presente invenção podem ser levantadas utilizando um camundongo que transporta as sequências de imunoglobulinas humanas em transgenes e transcromossomas tais como um camundongo que transporta um transgene de cadeia pesada humana e uma cadeia leve humana. Tais camundongos, na presente invenção referidos como "camundongos KM", são descritas em detalhe na Publicação PCT WO 02 / 43478 para Ishida et al.

[00391] Além disso ainda, os sistemas alternativos de animais transgênicos que expressam genes da imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para aumentar a ligação de Anticorpos HER3 da presente invenção. Por exemplo, um sistema alternativo transgênico referido como o Xenocamundongo (Abgenix, Inc.) pode ser utilizado. Tais camundongos são descritos em, por exemplo, Patentes dos U.S. №s 5.939.598 ; 6.075.181 ; 6.114.598, 6, 150584 e 6162963 de Kucherlapati et al.

[00392] Além disso, sistemas alternativos de animais transcromossômicos que expressam genes da imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para aumentar a ligação de Anticorpos HER3 da presente invenção. Por exemplo, os ratos que transportam tanto um transchromosome cadeia pesada humana e uma cadeia leve humana trancromossoma, referidos como "camundongos TC" pode ser usado, tais camundongos são descritos em Tomizuka et al, Proc (2000). Natl. Acad. Sci. U.S. 97 : 722-727. Além disso, os transcromossomas humanos portadores de cadeias leve e pesada têm sido descritos na técnica (Kuroiwa et al., (2002) Nature Biotechnology 20 : 889-894) e pode ser utilizado para aumentar a ligação de Anticorpos HER3 da presente invenção.

[00393] Os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção também podem ser preparados utilizando métodos de apresentação de fagos para pesquisa de bibliotecas de genes de imunoglobulina humana. Tais métodos de fagos de exibição para isolamento de anticorpos humanos são estabelecidos na técnica e descritos nos exemplos abaixo. Vide, por exemplo : Patentes dos U.S. Nos 5.223.409 ; 5.403.484, e 5.571.698 de LDNAer et al ; Patentes dos U.S. Nos 5.427.908 e 5.580.717 de Dower et al ; Patentes dos U.S. Nos 5.969.108 e 6.172.197 de McCafferty et al, e da Patente U.S. n... . 5.885.793 ; 6.521.404 ; 6.544.731 ; 6.555.313 ; 6.582.915 e 6.593.081 para Griffiths et al.

[00394] Os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção podem também ser preparados utilizando camundongos SCID no qual as células imunes foram reconstituídas de tal modo que uma resposta de anticorpos humanos podem ser gerados por imunização. Tais camundongos são descritos em, por exemplo, Patente U.S. №s 5.476.996 e 5.698.767 para Wilson et al.

(Iii) Estrutura ou engenharia Fc

[00395] A engenharia de anticorpos da presente invenção incluem aqueles nos quais as modificações foram feitas para resíduos estruturais dentro de VH e/ou VL, por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente tais modificações de estrutura são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é "remudada" de um ou mais resíduos de estrutura com a sequência da linhagem germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos da estrutura que diferem da sequência da linhagem germinativa do qual o anticorpo é derivada. Estes resíduos podem ser identificados por comparação nas sequências estruturais de anticorpos para as sequências da linhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado. Para retornar as sequências da região da estrutura para a sua configuração da linhagem germinativa, as mutações somáticas podem ser "remudadas" com a sequência da linhagem germinativa, por exemplo, muetiquetaênese dirigida ao local. Tais anticorpos "remudados" também se destinam a ser abrangidos pela presente invenção.

[00396] Outro tipo de modificação envolve a estrutura mutante de um ou mais resíduos dentro da região de estrutura, ou mesmo dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover epítopos de células T, para desse modo reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Esta abordagem também é conhecida como "desimunização" e é descrito em maior detalhe na Patente U.S. No. de publicação 20030153043 por Carr et al.

[00397] Em adição ou em alternativa, as modificações feitas nas regiões de estrutura ou CDR, os anticorpos da presente invenção podem ser modificados de modo a incluir modificações dentro da região Fe, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tais como a semi-vida sérica, fixação do complemento, receptor de Fc de ligação, e/ou a citotoxicidade dependente do antigênio celular. Além disso, um anticorpo da presente invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, um ou mais grupos químicos podem ser ligados ao anticorpo), ou ser modificado com a finalidade de alterar a sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas modalidades é descrita em detalhe mais abaixo. A numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU de Kabat.

[00398] Em uma modalidade, a região de dobradiça de CH1 é modificada de tal forma que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça é alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é descrito mais adiante na Patente U.S. No. 5.677.425 por Bodmer et al. O número de resíduos de cisteína na região de dobradiça de CH1 é alterado para, por exemplo, facilitar a monetiquetaem das cadeias leves e pesadas ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

[00399] Em uma outra modalidade, a região de dobradiça Fc de um anticorpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento da dobradiça Fc de tal modo que o anticorpo tem dificultado a ligação da proteína Staphylococcyl A parente (SpA) ao domínio SpA nativo da dobradiça Fc de ligação. Esta abordagem está descrita em mais pormenor na Patente U.S. No. 6.165.745 por Ward et al.

[00400] Em ainda outras modalidades, a região Fc é alterada através da substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar as funções efetoras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente tal que o anticorpo tenha uma afinidade alterada para um ligante efector, mas retém a capacidade de ligação ao antigênio do anticorpo progenitor. O ligante efetor a que se altera a afinidade pode ser, por exemplo, um receptor de Fc ou do componente C1 do complemento. Esta abordagem está descrita em mais pormenor na Patente U.S. №s 5624821 e 5648260, ambas por Winter et al.

[00401] Em uma outra modalidade, um ou mais aminoácidos selecionados dos resíduos de aminoácidos pode ser substituído com um resíduo de aminoácido diferente tal que o anticorpo C1q alterou a ligação e/ou reduziu ou aboliu a citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Esta abordagem está descrita em mais pormenor na Patente U.S. №s 6.194.551 por Idusogie et al.

[00402] Em uma outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácidos são alterados para assim alterar a capacidade do anticorpo para fixar o complemento. Esta abordagem é descrita mais adiante na Publicação PCT WO 94 / 29351 por Bodmer et al.

[00403] Em ainda uma outra modalidade, a região Fc é modificado para aumentar a capacidade do anticorpo para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo para um receptor Fcy por meio da modificação de um ou mais aminoácidos. Esta abordagem é descrita mais adiante na Publicação PCT WO 00 / 42072 por Presta. Além disso, os pontos de ligação da IgG1 humana para FcγRI, FcyRII, e FcyRIII FcRn foram mapeados e variantes com ligação melhoradas têm sido descritas (ver Shields et al., (2001) J. Biol. Chen. 276 : 6591 a 6604).

[00404] Em ainda outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo pode ser feita não-glicolisado (isto é, o anticorpo carece de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, com a finalidade de aumentar a afinidade do anticorpo para "antigênio". Tais modificações de hidratos de carbono pode ser conseguida por, por exemplo, alterar um ou mais locals de glicosilação dentro da sequência do anticorpo. Por exemplo, um ou mais amino substituições de ácidos podem ser feitas que resultam na eliminação de um ou mais locals de glicosilação da região variável da estrutura, para assim eliminar a glicosilação nesse local. Tal não-glicolização pode aumentar a afinidade do anticorpo para o antigênio. Tal abordagem está descrita em mais pormenor na Patente U.S. n ° s . 5.714.350 e 6.350.861 por Co et al.

[00405] Adicionalmente ou em alternativa, um anticorpo pode ser feito que tem um tipo de glicosilação alterado, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos fucosila ou um anticorpo tendo aumentado as estruturas bissectriz GlcNAc. Tais padrões de glicosilação alterados foram demonstrados para aumentar a capacidade de anticorpos ADCC. Tais modificações de hidratos de carbono pode ser conseguida por, por exemplo, expressando o anticorpo em uma célula hospedeira com mna presente invençãonaria de glicosilação alterado. As células com máquinas glicosilação alterada foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras para expressar os anticorpos recombinantes da presente invenção, para desse modo produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, EP 1176195 por Hang et al. descreve uma linhagem celular com um gene funcionalmente corrompido FUT8, que codifica uma transferase fucosila, de tal forma que os anticorpos expressos em tal hipofucosilazação exposição da linhagem celular. A Publicação PCT WO 03 / 035835 descreve por Presta uma variante da linhagem celular CHO, células Lecl3, com capacidade reduzida para anexar fucose para hidratos de carbono ligados a Asn (297)-, também resulta em hipofucosilazação de anticorpos expressos na célula hospedeira (vide também Shields et al ., (2002) J. Biol. Chem. 277 : 26733-26740). A Publicação PCT WO 99 / 54342 por Umana et al. descreve as linhagens de célula modificadas para expressar a glicoproteína modificando transferases de glicosila (por exemplo, beta (1,4)-N acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) de tal modo que os anticorpos expressos em linhagens de célula manipuladas apresentam maior estruturas bissectriz GlcNAc o que resulta em aumento da atividade de ADCC do anticorpos (vide também Umana et al., (1999) Nat. Biotech. 17 : 176 a 180).

[00406] Em uma outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentar a sua semi-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações pode ser introduzidas : T252L, T254S, T256F, como descrito na Patente U.S. No. 6.277.375 de Ward. Alternativamente, para aumentar a semi-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro do CH1 ou a região CL para conter um epítopo de ligação de receptor de salvamento tomado a partir de duas voltas de um domínio CH2 da região Fc de uma IgG, tal como descrito na Patente U.S. №s 5.869.046 e 6.121.022 por Presta et al.

(Iv) Métodos de Engenharia de anticorpos alterados

[00407] Como discutido acima, os anticorpos de ligação a HER3 tendo as sequências de VH e VL ou sequências de comprimento total da cadeia pesada e leve mostrados na presente invenção podem ser usados com a finalidade de criar novos anticorpos de ligação a HER3 através da modificação da cadeia pesada de comprimento total e/ou de sequências de cadeia leve, sequências de VH e/ou de VL, ou a (s) região (ões) constante (s) a ele ligado. Dessa maneira, em um outro aspecto da presente invenção, as características estruturais de um anticorpo de ligação a HER3 da presente invenção são usados para criar estruturalmente relacionadas anticorpos de ligação a HER3 que retêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da presente invenção, tal como a ligação a humana HER3 e também inibem uma ou mais propriedades funcionais de HER3 Por exemplo, uma ou mais regiões CDR de anticorpos da presente invenção, ou suas mutações, podem ser combinadas de forma recombinante com regiões estruturais conhecidas e/ou outras CDR para criar adicional, recombinantemente engenharia, os anticorpos de ligação a HER3 da presente invenção, como discutido acima. Outros tipos de modificações incluem os descritos na seção anterior. O material de partida para o método de engenharia é um ou mais das sequências VH e/ou VL proporcionadas na presente invenção, ou uma ou mais regiões CDR dos mesmos. Para criar o anticorpo de engenharia, que não é necessário para preparar efectivamente (ou seja, expressa como uma proteína), um anticorpo que possui uma ou mais das VH e/ou VL sequências na presente invenção proporcionadas, ou uma ou mais regiões CDR dos mesmos. Em vez disso, a informação contida na (s) sequência (s) é utilizada como material de partida para criar uma "segunda geração" de sequência (s) derivado da (s) sequência (s) original (is) e, em seguida, a "segunda geração" de sequência (s) é preparada e expressa como uma proteína.

[00408] Por conseguinte, em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para a preparação de um anticorpo de ligação de HER3 que consiste em : uma sequência variável de cadeia pesada de anticorpo tendo uma região de sequência CDR1 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, e 368 ; uma sequência CDR2 selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363, e 369, e/ou uma sequência de CDR3 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 75, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, e 370, e uma sequência variável de cadeia leve de anticorpo tendo uma região de sequência CDR1 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 5, 11,23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311,317, 329, 335, 347, 353, 365, e 371, uma sequência de CDR2 selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, e 372, e/ou uma sequência de CDR3 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 7, 13, 25, 31,43, 49, 61,67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367, e 373 ; alterando pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência da cadeia pesada variável do anticorpo região e/ou a sequência da cadeia leve de anticorpo da região variável de criar pelo menos uma sequência de anticorpo alterado, e expressar a sequência de anticorpo alterado, como uma sequência de anticorpo protein.The alterada pode também ser preparado por bibliotecas de rastreio de anticorpos que possuem as sequências CDR3 fixos ou mínimos essenciais determinantes de ligação tal como descrito em US20050255552 e diversidade nas sequências CDR1 e CDR2. O rastreio pode ser realizado de acordo com qualquer tecnologia de rastreio adequado para anticorpos de rastreio de bibliotecas de anticorpos, tais como a tecnologia de exibição de fagos.

[00409] As técnicas de biologia molecular podem ser usadas para preparar e expressar a sequência de anticorpo alterado. O anticorpo codificado pela sequência de anticorpo (s) alterado (s) é aquele que mantém a um, alguns ou todas as propriedades funcionais dos anticorpos de ligação a HER3 na presente invenção descrito, o qual as propriedades funcionais incluem, mas não estão limitados a, que se liga especificamente ao HER3 humano e/ou cinomólogos, o anticorpo se liga a HER3 e neutraliza a atividade biológica HER3 por meio da inibição da atividade de sinalização HER em um ensaio fosfo-HER.

[00410] As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser avaliadas utilizando ensaios padrão disponíveis na técnica e/ou descritos na presente invenção, tais como os descritos nos exemplos (por exemplo, ELISA).

[00411] Em certas modalidades dos métodos de engenharia de anticorpos da presente invenção, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou seletiva ou parte de uma sequência de anticorpo de ligação a HER3 codificação e os anticorpo de ligação a HER resultantes podem ser rastreados para a atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais como descrito na presente invenção. Os métodos Mutacionais têm sido descritos na técnica. Por exemplo, a Publicação PCT WO 02 / 092780 por Short descreve métodos para criar e rastrear mutações de anticorpos utilizando a muetiquetaênese de saturação, a monetiquetaem de ligação sintético, ou uma combinação dos mesmos. Em alternativa, a publicação PCT WO 03 / 074679 por Lazar et al. descreve os métodos para a utilização dos métodos de rastreio computacionais para optimizar as propriedades físico-químicas de anticorpos.

Caracterização dos Anticorpos da Presente Invenção

[00412] Os anticorpos da presente invenção pode ser caracterizada por vários ensaios funcionais. Por exemplo, eles podem ser caracterizados pela sua capacidade de neutralizar a atividade biológica, inibindo a sinalização HER em um ensaio fosfo-HER tal como na presente invenção descrito, a sua afinidade para a proteína HER3 (por exemplo, HER3 humanos e/ou cinomólogos), o epítopo binning, seus a resistência à proteólise, e a sua capacidade para bloquear a sinalização a jusante HER3. Vários métodos podem ser usados para medir a sinalização mediada por HER3. Por exemplo, a via de sinalização HER pode ser monitorado por (i) medição da fosfo-HER3, (ii) a medição da fosforilação de jusante HER3 ou outras proteínas de sinalização (por exemplo, Akt), ensaios de (iii) de ligante de bloqueio, como na presente invenção descrito, (iv ) formação de heterodímeros, (v) HER3 assinatura de expressão dependente do gene, (vi) a internalização do receptor, e (vii) HER3 fenótipos celulares motor (por exemplo, a proliferação).

[00413] A capacidade de um anticorpo para se ligar a HER3 pode ser detectada por meio da marcação do anticorpo de interesse diretamente, ou o anticorpo pode ser não marcado e de ligação detectada indiretamente utilizando vários formatos de ensaio de sanduíche conhecidos na técnica.

[00414] Em algumas modalidades, os anticorpos de ligação a HER3 do bloco de invenção competem com a ligação de um anticorpo de referência HER3 de ligação para um polipeptídeo ou proteína HER3. Estas podem ser completamente humanos, Anticorpos de ligação a HER3 acima descritos. Eles também podem ser outros anticorpos de ligação a HER3 de camundongo ou humanizado, quimérico que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência. A capacidade de bloquear ou competir com a ligação do anticorpo de referência indica que um anticorpo de ligação de HER3 em teste se liga ao mesmo epítopo ou semelhante que o definido pelo anticorpo de referência, ou a um epítopo que é suficientemente próximo do epítopo ligado pelo referencial HER3 de ligação do anticorpo. Tais anticorpos são especialmente propensos a partilhar as propriedades vantajosas identificadas para o anticorpo de referência. A capacidade de bloquear ou competir com o anticorpo de referência pode ser determinada por meio de, por exemplo, um ensaio de ligação de competição. Com um ensaio de ligação de competição, o anticorpo a ser testado é examinado quanto à capacidade para inibir a ligação específica do anticorpo a um antigênio de referência comum, tal como um polipeptídeo ou proteína HER3. Um anticorpo de teste compete com o anticorpo de referência para a ligação específica ao antigênio se um excesso do anticorpo de teste inibe substancialmente a ligação do anticorpo de referência. A inibição substancial significa que o anticorpo de teste reduz a ligação específica do anticorpo de referência geralmente por pelo menos 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, ou 90 %.

[00415] Há uma série de ensaios de competição de ligação conhecidos que podem ser usados para avaliar a concorrência de um anticorpo de ligação de HER3 com o anticorpo de referência HER3 de ligação para a ligação a uma proteína HER3. Estes incluem, por exemplo, radioimunoensaio de fase sólida direta ou indireta (RIA), imunoensaio enzimático de fase sólida direta ou indireta (EIA), ensaio de competição em sanduíche (ver Stahli et al, (1983) Methods in Enzymology 9 : 242 a 253.); ensaio de fase direta Sólido biotina-avidina EIA (ver Kirkland et al, (1986) J. Immunol 137 : 3614-3619..); ensaio direto marcado de fase sólida, em fase sólida, ensaio em sanduíche direto marcado (vide Harlow e Lane, supra) ; fase sólida direta de etiqueta RIA usando etiqueta I-125 (vide Morel et al, (1988) Molec Immunol 25 : 7 a 15); . fase sólida direta biotina-avidina EIA (Cheung et al, (1990) Virology 176 : 546 a 552), e etiquetas diretas RIA (Moldenhauer et al, (1990.) Scand J. Immunol 32 : 77 a 82). Tipicamente, tal ensaio envolve a utilização de antigênio purificado ligado a uma superfície sólida ou células tendo um deles, um teste de ligação não marcada HER3 anticorpo e um anticorpo de referência marcado. A inibição competitiva é medida através da determinação da quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou células na presença do anticorpo de teste. Normalmente, o anticorpo de teste está presente em excesso. Os anticorpos identificados por ensaio de competição (anticorpos concorrentes) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente proximal ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que ocorra impedimento espacial.

[00416] Para determinar se os selecionados Anticorpos de ligação a HER3 monoclonais ligar-se a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado utilizando reagentes comercialmente disponíveis (por exemplo, reagentes de Pierce, Rockford, IL). Estudos de competição, usando anticorpos monoclonais não marcados e anticorpos monoclonais biotinilados podem ser realizados utilizando um polipeptídeo de placas HER3-ELISA revestidas. MAb biotinilado de ligação pode ser detectado com uma sonda de fosfatase estrepavidina alcalina. Para determinar o isotipo de um anticorpo de ligação a HER3 purificado, os testes ELISA do isotipo podem ser realizados. Por exemplo, os cavidades de placas de microtitulação podem ser revestidos com 1 ug / ml de IgG anti-humano durante a noite a 4°C. Após bloqueio com BSA a 1 %, as placas são feitas reagir com 1 ug / ml ou menos, do anticorpo monoclonal de ligação de HER3 ou purificado controles isotípicos, a temperatura ambiente durante uma a duas horas. As cavidades podem em seguida ser feitas reagir com ou IgGl humana ou IgM humanos específicos conjugados com sondas de fosfatase alcalina. As placas são então desenvolvidas e analisadas de modo a que o isotipo do anticorpo purificado pode ser determinado.

[00417] Para demonstrar a ligação de anticorpos monoclonais de ligação a anticorpos HER3 as células vivas que expressam um polipeptídeo de HER3, a citometria de fluxo pode ser utilizada. Resumidamente, as linhagens de célula que expressam HER3 (cultivadas sob condições de crescimento normais) podem ser misturadas com várias concentrações de um anticorpo de ligação de HER3 em PBS contendo BSA a 0,1 % e soro de vitela fetal a 10 %, e incubadas a 4°C durante 1 hora. Após lavagem, as células são feitas reagir com anticorpo marcado com fluoresceína IgG anti-humana sob as mesmas condições que a coloração do anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas por instrumento de FACScan utilizando as propriedades de dispersão de leve e de um lado para o portão em células individuais. Um ensaio alternativo utilizando microscopia de fluorescência pode ser utilizado (para além de ou em vez de) o ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser coradas exatamente como descrito acima e examinadas por meio da microscopia de fluorescência. Este método permite a visualização de células individuais, mas pode ter diminuído a sensibilidade, dependendo da densidade do antigênio.

[00418] Os anticorpos de ligação a HER3 da presente invenção podem ser adicionalmente testados quanto à reatividade com um fragmento de HER3 polipeptídeo antigênico ou por Western blotting. Resumidamente, os polipeptídeos HER3 purificadosou proteínas de fusão, ou de extractos celulares a partir de células que expressam HER3, podem ser preparados e submetidos a electroforese em gel de dodecil sulfato de poliacrilamida. Após a eletroforese, os antigênios separados são transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com soro de vitela fetal a 10 %, e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados. IgG humana de ligação pode ser detectada utilizando anticorpo anti-IgG humana de fosfatase alcalina e desenvolvidos com comprimidos de BCIP / NBT de substrato (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).

[00419] Uma série de leituras pode ser usada para avaliar a eficácia e a especificidade, de Anticorpos HER3 em ensaios baseados em células induzida pelo ligante de formação de heterodímeros. A atividade pode ser avaliada através de uma ou mais das seguintes características:

[00420] (I) Inibição da heterodimerização induzida pelo ligante de HER2 com outros membros da família EGF de uma linhagem celular-alvo, por exemplo, células de câncer da mama MCF-7. A imunoprecipitação de complexos HER2 de lisados de células pode ser realizada com um anticorpo para o receptor específico, e à ausência / presença de outros receptores de EGF e os seus ligantes biologicamente relevantes dentro do complexo podem ser analisados após electroforese / transferência de Western por meio da sondagem com anticorpos para os outros receptores de EGF .

[00421] (Ii) inibição da ativação de vias de sinalização por meio dos heterodímeros ativados pelo ligantes. Associação com HER3 parece chave para os outros membros da família de receptores de EGF para suscitar resposta celular máxima após a ligação do ligante. No caso de a HER3 quinase deficiente, HER2 fornece um domínio de cinase de tirosina funcional para permitir que a sinalização para ocorrer após a ligação dos ligantes do fator de crescimento. Dessa maneira, as células que co-expressam HER2 e HER3 podem ser tratadas com o ligante, por exemplo, heregulina, na ausência e na presença de inibidor e o efeito sobre a fosforilação de tirosina HER3 monitorizado por uma série de maneiras, incluindo a imunoprecipitação de lisados de células de HER3 tratados e subsequente western- blotting utilizando anticorpos anti-fosfotirosina (ver Agus op. cit. para mais detalhes). Alternativamente, um ensaio de elevado débito pode ser desenvolvido por aprisionamento HER3 de lisados solubilizados para as cavidades de uma placa de 96 cavidades revestida com um anticorpo anti-receptor de HER3, e o nível de fosforilação de tirosina medida utilizando, por exemplo, európio -fosfotirosina anti-marcado, tal como definidos por Waddleton et al., (2002) Anal. Biochem. 309 : 150 a 157.

[00422] De forma mais ampla extensão desta abordagem, as moléculas efetoras que se sabe serem ativadas a jusante de heterodimeros de receptores ativados, tais como quinases ativadoras mitogênicas (MAPK) e Akt, pode ser analisada diretamente, através de imunoprecipitação de lisados tratados e imunodeteção com anticorpos que detectam as formas ativadas destas proteínas, ou por meio da análise da capacidade destas proteínas para modificar / ativar os substratos específicos.

[00423] (Iii) inibição da proliferação induzida pelo ligante celular. Uma variedade de linhagens de células são conhecidas por co-expressarem as combinações de receptores ErbB, por exemplo, linhagens de célula de câncer da mama e da próstata. Os ensaios podem ser realizados em formatos de 24 / 48 / 96- cavidade com a leitura de base em torno de síntese de DNA (incorporação de timidina tritiada), aumento do número de células (coloração com violeta de cristal), etc

[00424] Uma série de leituras pode ser usada para avaliar a eficácia e a especificidade, de Anticorpos HER3 em ensaios baseados em células de formação de homo- e heterodímeros indedependente do ligante. Por exemplo, a sobre-expressão de HER2 desencadeia a ativação independente do ligante do domínio cinase, como resultado da formação de dímero espontânea. A sobre-expressão de HER2 gera tanto homo ou heterodímeros com outras moléculas tais como HER HER1, HER3 e HER4.

[00425] Capacidade dos anticorpos ou o fragmentos dos mesmos para bloquear o crescimento in vivo de xenoenxertos de tumores de linhagens de célula de tumores humanos cujas fenótipo tumorigênico é conhecido por ser, pelo menos, parcialmente dependente da ativação pelo ligante de HER3, por exempo, as células de sinalização deheterodímero BxPC3, as células pancreáticas cancerosas etc Isto pode ser avaliado em camundongos imunocomprometidos, quer isoladamente ou em combinação com um agente citotóxico apropriado para a linhagem celular em questão. Exemplos de ensaios funcionais também são descritos na seção de Exemplo abaixo.

Usos profilático e terapêutico

[00426] A presente invenção proporciona os métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio associado com o percurso de sinalização HER3 por administração a um sujeito que o necessite de uma quantidade eficaz dos anticorpos da presente invenção. Em uma modalidade específica, a presente invenção proporciona um método de tratamento ou prevenção de cânceres (por exemplo, câncer da mama, câncer colorretal, câncer do pulmão, mieloma múltiplo, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer da próstata, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, osteossarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores bainha dos nervos periféricos, schwannoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de esôfago, glioblastoma, sarcoma de células claras de tecidos moles, o mesotelioma maligno, neurofibromatose, câncer renal e melanoma), por meio da administração a um sujeito que o necessite de uma quantidade eficaz dos anticorpos da presente invenção. Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona métodos de tratamento ou prevenção de cânceres associados a uma via de sinalização HER, por administração a um sujeito que o necessite de uma quantidade eficaz dos anticorpos da presente invenção.

[00427] Em uma modalidade específica, a presente invenção proporcionaos métodos de tratamento de cânceres associados a uma via de sinalização HER que incluem, mas não se limitam ao câncer da mama, câncer colorretal, câncer do pulmão, mieloma múltiplo, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de próstata, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, osteossarcoma, carcinoma de células escamosas, bainha de nervos periféricos tumores Schwannoma, cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de esôfago, glioblastoma, sarcoma de células claras de tecidos moles, mesotelioma maligno, neurofibromatose, renal câncer, e melanoma.

[00428] Anticorpos HER3 podem também ser utilizados para tratar ou prevenir outros distúrbios associados com aberrante ou deficiente sinalização HER, incluindo, mas não estão limitados a doenças respiratórias, osteoporose, osteoartrite, doença policística dos rins, diabetes, esquizofrenia, doença vascular, doença cardíaca, não oncogênicos doenças proliferativas, fibrose, e doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer.

[00429] Os agentes adequados para o tratamento de combinação com anticorpos de ligação a HER3 incluem is agentes de assistência padrão conhecidos na técnica que são capazes de modular a via de sinalização de ErbB. Os exemplos adequados de agentes de cuidados padrão a HER2 incluem, mas não estão limitados a Herceptin e Tykerb. Os exemplos adequados de agentes padrão de cuidados para EGFR incluem, mas não estão limitados a Iressa, Tarceva, Erbitux e Vectibix. Outros agentes que podem ser adequados para o tratamento de combinação com Anticorpos de ligação a HER3 incluem, mas não estão limitados a aqueles que modulam os receptores tirosina-quinase, a proteína G de receptores acoplados, crescimento / sobrevivência vias de transdução de sinal, receptores hormonais nucleares, vias apoptóticas, ciclo celular e angiogênese.

Usos Diagnósticos

[00430] Em um aspecto, a presente invenção inclui os testes de diagnóstico para a determinação de proteína HER3 e/ou expressão de ácido nucleico, assim como a função da proteína HER3, no contexto de uma amostra biológica (por exemplo, sangue, soro, células, tecidos) ou de indivíduo afligido com câncer, ou está em risco de desenvolver câncer.

[00431] Ensaios diagnóstico, tais como ensaios competitivos assentam na capacidade de um análogo marcado (o "marcador") para competir com o analito da amostra de teste para um número limitado de locals de ligação em um parceiro de ligação comum. O parceiro de ligação geralmente é insolubilizado antes ou após a competição e em seguida o traçador e analito ligados ao parceiro de ligação são separados do traçador e analito não ligado. Esta separação é realizada por meio da decantação (quando o parceiro de ligação foi preinsolubilizado) ou por meio da centrifugação (quando o parceiro de ligação foi precipitado após a reação competitiva). A quantidade de analito de amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de traçador ligado tal como medido pela quantidade de substância marcadora. Curvas dose-resposta com quantidades conhecidas de analito são preparadas e comparadas com os resultados do teste de modo a determinar quantitativamente a quantidade de analito presente na amostra de teste. Estes ensaios são chamados sistemas ELISA quando as enzimas são utilizadas como marcadores detectáveis. Em um ensaio desta forma, a ligação competitiva entre anticorpos e os resultados de ligação de anticorpos HER3 na proteína HER3 ligado, de preferência, os epítopos de HER3 da presente invenção, sendo uma medida dos anticorpos na amostra de soro, mais particularmente, anticorpos neutralizantes na amostra de soro .

[00432] Uma vanetiquetaem significativa do ensaio é que a medição é feita diretamente de anticorpos neutralizantes (isto é, aqueles que interferem com a ligação da proteína HER3, especificamente, os epítopos). Um tal ensaio, em particular sob a forma de um teste ELISA tem aplicações consideráveis em ambiente clínico e na pesquisa sanguínea de rotina.

[00433] Um outro aspecto da presente invenção proporciona métodos para a determinação da expressão de ácido nucleico HER3 ou atividade da proteína HER3 em um indivíduo, para desse modo selecionar os agentes terapêuticos ou profiláticos apropriados para aquele indivíduo (na presente invenção referida como "farmacoge-nômicos"). Farmacogenômicos permite a seleção de agentes (por exemplo, fármacos) para o tratamento terapêutico ou profilático de um indivíduo com base no genótipo do indivíduo (por exemplo, o genótipo do indivíduo examinado para determinar a capacidade do indivíduo para responder a um agente particular. )

[00434] Ainda um outro aspecto da presente invenção refere-se à monitorização da influência de agentes (por exemplo, fármacos) sobre a expressão ou atividade de HER3 proteína em ensaios clínicos.

Composições farmacêuticas

[00435] Para preparar as composições farmacêuticas ou estéreis que incluem um anticorpo de ligação a HER3 de fragmentos intactos (ou ligação), os anticorpos de ligação a HER3 (fragmentos intactos ou de ligação) são misturados com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. As composições podem adicionalmente conter um ou mais outros agentes terapêuticos que são adequados para o tratamento ou prevenção de câncer (câncer da mama, câncer colorretal, câncer do pulmão, mieloma múltiplo, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer da próstata, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, osteossarcoma, carcinoma de células escamosas, bainha de nervos periféricos tumores Schwannoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de esôfago, glioblastoma, sarcoma de células claras de tecidos moles, mesotelioma maligno, neurofibromatose, câncer renal e melanoma).

[00436] As formulações dos agentes terapêuticos e de diagnóstico podem ser preparadas por meio da mistura com veículos, excipientes, ou estabilizadores, fisiologicamente aceitáveis sob a forma de, por exemplo, pós liofilizados, pastas fluidas, soluções aquosas, loções, suspensões ou (vide, por exemplo, Hardman et al., ( 2001) Goodman e Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY ; Gennaro (2000) Remington : The Science and Pratice of Pharmacy, Lippincott, Williams e Wilkins, New York, NY ; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms : Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY ; Lieberman, et al (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms : Tablets, Marcel Dekker, NY ; Lieberman, et al (eds... ) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms : Disperse Systems, Marcel Dekker, NY ; Weiner e Kotkoskie Toxicidade Excipiente (2000) e de segurança, Marcel Dekker, Inc., New York, NY).

[00437] Seleção de um regime de administração de um agente terapêutico depende de vários fatores, incluindo a taxa de rotação de soro ou tecido da entidade, o nível de sintomas, da imunogenicidade da entidade e da acessibilidade das células alvo na matriz biológica. Em certas modalidades, um regime de administração maximiza a quantidade de terapêutica ao doente consistente com um nível aceitável de efeitos secundários. Por conseguinte, a quantidade de produto biológico entregue depende em parte da entidade particular e da gravidade da condição a ser tratada. A orientação na seleção de doses adequadas de anticorpos, citocinas, e moléculas pequenas estão disponíveis (vide, por exemplo, Wawrzynczak (1996) Anticorpo Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; . Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, citocinas e Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY ; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibody and Peptide Therapy, in Autoimmune Diseases, Mareei Dekker, New York, NY,. Baert et al, (2003) New Engl J. Med. 348 : 60 a 608 ; Milgrom et al, (1999) New Engl J. Med. 341 : 1966 a 1973, Slamon et al, (2001) New Engl J. Med. 344 : 783 a 792 ; Beniaminovitz et . al, (2000) New Engl J. Med. 342 : 613 a 619; . Ghosh et al, (2003) New Engl J. Med. 348 : 24-32, Lipsky et al, (2000) New Engl. . J. Med. Chem. 343 : 1594 a 1602).

[00438] A determinação da dose apropriada é feita pelo clínico, por exemplo, utilizando-se os parâmetros ou fatores conhecidos ou suspeitos na técnica, para afetar o tratamento ou previsto para afetar o tratamento. Geralmente, a dosagem inicia-se com uma quantidade um pouco menos do que a dose óptima e é aumentada por meio de pequenos incrementos até que depois disso o efeito desejado ou óptimo é alcançado em relação a quaisquer efeitos secundários negativos. Importantes medidas de diagnóstico incluem aquelas dos sintomas de, por exemplo, a inflamação ou o nível de citoquinas inflamatórias produzidas.

[00439] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade de farmacocinética das composições particulares da presente invenção utilizado, ou do seu éster, sal ou amida, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular a ser utilizado, a duração do tratamento, outras drogas, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições particulares empregues, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente a ser tratado, e como fatores conhecidos nas artes médicas.

[00440] As composições que compreendem os anticorpos ou os fragmentos dos mesmos da presente invenção podem ser fornecidos por meio da infusão contínua ou por meio das doses em intervalos de, por exemplo, um dia, uma semana, ou 1 a 7 vezes por semana. As doses podem ser proporcionadas por via intravenosa, subcutânea, tópica, oral, nasal, retal, intramuscular, intracerebral ou por inalação. Um protocolo de dose específica é uma que envolve a dose ou a frequência da dose máxima que evita efeitos secundários indesejáveis significativos. Uma dose semanal total pode ser de pelo menos 0,05 μg / kg de peso corporal, de pelo menos 0,2 μg / kg, pelo menos, 0,5 pg / kg, pelo menos, 1 μg / kg, pelo menos, 10 μg / kg, pelo menos 100 μg / kg, de pelo menos 0,2 mg / kg, pelo menos, 1,0 mg / kg, pelo menos, 2,0 mg / kg, pelo menos, 10 mg / kg, pelo menos, 25 mg / kg, ou, pelo menos, 50 mg / kg (vide, por exemplo, Yang et al, (2003) New Engl J. Med. 349 : 427-434, Herold et al, (2002) New Engl J. Med. 346 : 1692 a 1698, Liu et al, (1999) J. Neurol Neurosurg Psych 67 : 451 a 456; . Portielji et al, (2003) Cancer Immunol Immunother 52 : 133 a 144). A dose desejada de anticorpos ou o fragmentos dos mesmos é aproximadamente a mesma que para um anticorpo ou polipetídeo, em uma base moles / kg de peso corporal. A concentração plasmática desejada dos anticorpos ou o fragmentos destes é aproximadamente, em um moles / kg de peso corporal de base. A dose pode ser de pelo menos 15 g de pelo menos 20 pg, pelo menos, 25 pg, pelo menos, 30 pg, pelo menos, 35 pg, pelo menos, 40 pg, pelo menos, 45 pg, pelo menos, 50 pg, pelo menos, 55 pg, pelo menos, 60 pg, pelo menos, 65 pg, pelo menos, 70 pg, pelo menos, 75 pg, pelo menos, 80 pg, pelo menos, 85 pg, pelo menos, 90 pg, em pelo menos 95 pg, ou, pelo menos, 100 pg. As doses administradas a um sujeito pode enumerar pelo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12, ou mais.

[00441] Para os anticorpos ou os fragmentos dos mesmos da presente invenção, a dosagem administrada a um paciente pode ser de 0,0001 mg / kg a 100 mg / kg de peso do corpo do paciente. A dosagem pode situar-se entre 0,0001 mg / kg e 20 mg / kg, 0,0001 mg / kg e 10 mg / kg, 0,0001 mg / kg e 5 mg / kg, 0,0001 e 2 mg / kg, 0,0001 e 1 mg / kg, 0,0001 mg / kg e 0,75 mg / kg, 0,0001 mg / kg e 0,5 mg / kg, 0,0001 mg / kg a 0,25 mg / kg, 0,0001 a 0,15 mg / kg, 0,0001 a 0,10 mg / kg, 0,001 a 0,5 mg / kg, ,01 a 0,25 mg / kg ou 0,01 a 0,10 mg / kg de peso do corpo do paciente.

[00442] A dosagem dos anticorpos ou os fragmentos dos mesmos da presente invenção pode ser calculada utilizando o peso do paciente em quilagramas (kg), multiplicada pela dose a ser administrada em mg / kg. A dosagem dos anticorpos ou o fragmentos dos mesmos da presente invenção pode ser de 150 μg / kg ou menos, 125 μg / kg ou menos, 100 μg / kg ou menos, 95 μg / kg ou menos, 90 μg / kg ou menos, 85 pg / kg ou menos, 80 μg / kg ou menos, 75 μg / kg ou menos, 70 μg / kg ou menos, 65 μg / kg ou menos, 60 μg / kg ou menos, 55 μg / kg ou menos, 50 μg / kg ou menos, 45 μg / kg ou menos, 40 μg / kg ou menos, 35 μg / kg ou menos, 30 μg / kg ou menos, 25 μg / kg ou menos, 20 μg / kg ou menos, 15 μg / kg ou menos, 10 μg / kg ou menos, 5 μg / kg ou menos, 2,5 pg / kg ou menos, 2 μg / kg ou menos, 1,5 μg / kg ou menos, 1 μg / kg ou menos, 0,5 μg / kg ou menos, ou 0,5 μg / kg ou menos de peso corporal do paciente.

[00443] Dose unitária dos anticorpos ou o fragmentos dos mesmos da presente invenção pode ser de 0,1 mg a 20 mg, 0,1 mg e 15 mg, 0,1 mg e 12 mg, 0,1 mg e 10 mg, 0,1 mg e 8 mg, 0,1 mg a 7 mg, 0,1 mg a 5 mg, 0,1 a 2,5 mg, 0,25 mg a 20 mg, 0,25 a 15 mg, 0,25 a 12 mg, 0,25 a 10 mg, 0,25 a 8 mg, 0,25 mg a 7 mg, 0,25 mg a 5 mg, 0,5 mg a 2,5 mg, 1 mg a 20 mg, 1 mg a 15 mg, 1 mg a 12 mg, 1 mg a 10 mg, 1 mg a 8 mg, 1 mg a 7 mg, 1 mg a 5 mg, ou 1 mg a 2,5 mg.

[00444] A dosagem dos anticorpos ou o fragmentos dos mesmos da presente invenção podem atingir um título sérico de pelo menos 0,1 μg / mL, pelo menos, 0,5 μg / mL, pelo menos, 1 μg / mL, pelo menos, 2 μg / ml, pelo menos 5 μg / mL, pelo menos, 6 μg / mL, pelo menos, 10 μg / mL, pelo menos, 15 μg / mL, pelo menos, 20 μg / mL, pelo menos, 25 μg / mL, pelo menos, 50 μg / ml, pelo menos 100 μg / ml, pelo menos 125 μg / mL, pelo menos, 150 μg / ml, pelo menos 175 μg / mL, pelo menos, 200 μg / ml, pelo menos 225 μg / ml, pelo menos 250 μg / ml, pelo menos 275 μg / ml, pelo menos 300 μg / ml, pelo menos 325 μg / mL, pelo menos, 350 μg / ml, pelo menos 375 μg / ml, ou pelo menos 400 μg / ml em um sujeito. Alternativamente, a dosagem dos anticorpos ou o fragmentos dos mesmos da presente invenção podem atingir um título sérico de pelo menos 0,1 μg / mL, pelo menos, 0,5 μg / mL, pelo menos, 1 μg / mL, pelo menos, 2 μg / ml, pelo menos, 5 μg / mL, pelo menos, 6 μg / mL, pelo menos, 10 pg / mL, pelo menos, 15 μg / mL, pelo menos, 20 ng / ml, pelo menos, 25 μg / ml, pelo menos 50 μg / ml, pelo menos 100 μg / ml, pelo menos 125 μg / mL, pelo menos, 150 μg / ml, pelo menos 175 μg / mL, pelo menos, 200 μg / ml, a pelo menos 225 μg / ml, pelo menos 250 μg / ml, pelo menos 275 μg / ml, pelo menos 300 μg / ml, pelo menos 325 μg / mL, pelo menos, 350 μg / mL, pelo menos, 375 μg / ml, ou pelo menos 400 μg / ml no assunto.

[00445] As doses de anticorpos ou o fragmentos dos mesmos da presente invenção podem ser repetidas e as administrações podem ser separadas por pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou pelo menos 6 meses.

[00446] Uma quantidade eficaz para um paciente particular pode variar dependendo de fatores tais como a condição a ser tratada, da saúde geral do paciente, a via e dose de método de administração e da gravidade de efeitos secundários (vide, por exemplo, Maynard et al., (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla.; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK).

[00447] A via de administração pode ser através de, por exemplo, injeção, aplicação, tópica ou cutânea, ou por infusão intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial, intracerebrospinal, intralesional, ou por sistemas de liberação controlada ou de implante (vide, por exemplo, Sidman et al., (1983) Biopolymers 22:547-556; Langer et al., (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15 : 167 a 277; Langer (1982) Chem. Tech. 12 : 98 a 105; Epstein et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 3688 a 3692; Hwang et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 4030 a 4034; U.S. Pat. Nos. 6,350,466 e 6,316,024). Sempre que necessário, a composição pode também incluir um agente solubilizante e um anestésico local como a lidocaína para aliviar a dor no local da injeção. Além disso, a administração pulmonar também pode ser empregues, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador, e a formulação com um agente de formação de aerossóis. Vide, por exemplo, Patente U.S. №s 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540, e 4.880.078, e Publicação PCT №s WO 92 / 19244, WO 97 / 32572, WO 97 / 44013, WO 98 / 31346, e WO 99 / 66903, cada uma das quais é na presente invenção incorporada por referência a sua totalidade.

[00448] A composição da presente invenção pode também ser administrada através de uma ou mais vias de administração, utilizando uma ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Tal como será entendido pelo versado na técnica, a via e/ou modo de administração irão variar dependendo dos resultados desejados. Rotas selecionadas de administração para os anticorpos ou o fragmentos de thereofof invenção incluem intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias de administração parentérica, por exemplo por injeção ou infusão. A administração parentérica pode representar modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, usualmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, injeção intra epidural e intrasternal e infusão. Alternativamente, uma composição da presente invenção pode ser administrado através de uma via não-parenteral, tal como uma via tópica, epidérmica ou mucosa de administração, por exemplo, por via intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica. Em uma modalidade, os anticorpos ou os fragmentos dos mesmos da presente invenção são administrados por meio da infusão. Em uma outra modalidade, a proteína de ligação de epítopo multiespecífico da presente invenção é administrada por via subcutânea.

[00449] Se os anticorpos ou os fragmentos dos mesmos da presente invenção são administrados de uma liberação controlada ou um sistema de liberação controlada, uma bomba pode ser utilizada para conseguir uma liberação controlada ou sustentada (vide, Langer, supra ; Sefton (1987) CRC Crit Ref Biomed Eng. 14 : 20 ; Buchwald et al, (1980), Surgery 88 : 507, Saudek et al, (1989) N. Engl J. Med. 321 : 574). Os materiais poliméricos podem ser usados para conseguir uma liberação controlada ou sustentada das terapias da presente invenção (vide, por exemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Flórida. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, (1983) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; vide também, Levy et al., (1985) Science 228 : 190; During et al., (1989) Ann. Neurol. 25 : 351; Howard et al., (1989) J. Neurosurg. 71 : 105); U.S. Pat. No. 5,679,377; U.S. Pat. No. 5,916,597; U.S. Pat. No. 5,912,015; U.S. Pat. No. 5,989,463; U.S. Pat. No. 5,128,326; Publicação PCT N ° WO 99 / 15154, e Publicação PCT N ° WO 99 / 20253. Exemplos de polímeros usados em formulações de liberação controlada incluem, mas não estão limitados a, poli (metacrilato de 2-hidroxietila), poli (metacrilato de metila), poli (ácido acrílico), poli (etileno-co-acetato de vinila), poli (ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianidridos, poli (N-vinil-pirrolidona), poli (álcool vinílico), poliacrilamida, poli (etileno glicol), polilatidos (PLA), poli (latido-co-glicólidos) (PLGA), e poliortoésteres. Em uma modalidade, o polímero usado em uma formulação de liberação sustentada é inerte, isento de impurezas lixiviáveis, estável em armazenagem, estéril, e biodegradável. Um sistema de liberação controlada ou sustentada pode ser colocado na proximidade do alvo profilático ou terapêutico, requerendo assim só uma fração da dose sistémica (vide, por exemplo, Goodson, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp 115 a 138 (1984)).

[00450] Os sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer, (1990), Science 249 : 1527 a 1533). Qualquer técnica conhecida de um versado na técnica pode ser usada para produzir as formulações de liberação controlada compreendendo um ou mais anticorpos ou o fragmentos dos mesmos invenção. Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 4.526.938, publicação PCT WO 91 / 05548, a publicação PCT WO 96 / 20698, Ning et al., (1996), Radiotherapy & Oncology 39 : 179-189, Song et al., (1995) Journal of Science PDA Pharmaceutical & Tecnologia 50 : 372-397, Cleek et al., (1997) Pro. Int'l. Symp. Controlar. Rel. Bioact. Mater. 24 : 853 a 854, e Lam et al., (1997) Proc. Int'l. Symp. Controlar Rel. Bioact. Mater. 24 : 759 a 760, cada uma das quais é na presente invenção incorporada por referência na sua totalidade.

[00451] Se os anticorpos ou os fragmentos dos mesmos da presente invenção são administrados por via tópica, podem ser formulados sob a forma de um unguento, creme, emplastro transdérmico, loção, gel, shampoo, spray, aerossol, solução, emulsão, ou qualquer outra forma bem conhecida um versado na técnica. Vide, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, ed 19., Pub Mack. Co., Easton, Pa. (1995). Para as formas farmacêuticas não-pulverizáveis tópicas, as formas viscosas as semi-sólidas ou sólidas compreendem um veículo ou um ou mais excipientes compatíveis com a aplicação tópica e tendo uma viscosidade dinâmica, em alguns casos, maior do que a água são tipicamente empregues. As formulações adequadas incluem, sem limitação, soluções, suspensões, emulsões, cremes, pomadas, pós, linimentos, unguentos, e outros semelhantes, os quais são, se desejado, esterilizados ou misturados com agentes auxiliares (por exemplo, conservantes, estabilizantes, agentes molhantes, tampões, ou os seus sais) para influenciar várias propriedades, tais como, por exemplo, pressão osmótica. Outras formas de dosagem adequadas incluem preparações tópicas de aerossóis pulverizáveis, em que o ingrediente ativo, em alguns casos, em combinação com um transportador inerte sólido ou líquido, é embalado em uma mistura com um pressurizado volátil (por exemplo, um propulsor gasoso, tal como freon) ou uma garrafa squeeze. Hidratantes ou humectantes podem ser também adicionados a composições farmacêuticas e formas de dosagem se desejado. Exemplos de tais ingredientes adicionais são bem conhecidos na técnica.

[00452] Se as composições que compreendem os anticorpos ou o fragmentos dos mesmos são administrados por via intranasal, pode ser formulado em uma forma de aerossol, spray, névoa ou sob a forma de gotas. Em particular, os agentes profiláticos ou terapêuticos para a utilização de acordo com a presente invenção podem ser convenientemente administrados na forma de uma apresentação de spray aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com a utilização de um propulsor adequado (por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, carbono, diclorotetrafluo-roetano dióxido ou outro gás adequado). No caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para libertar uma quantidade medida. As cápsulas e cartuchos (composto por, por exemplo, de gelatina) para utilização em um inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido.

[00453] Os métodos para a co-administração ou tratamento com um segundo agente terapêutico, por exemplo, uma citoquina, agente quimioterapêutico de esteróides, antibióticos, ou radiação, são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Hardman et al., (Eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice : A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.). Uma quantidade eficaz do terapêutico pode diminuir os sintomas de pelo menos 10 % ; por pelo menos 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos 40 %, ou, pelo menos, 50 %.

[00454] As terapias adicionais (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos), que podem ser administradas em combinação com os anticorpos ou o fragmentos dos mesmos da presente invenção podem ser administradas a menos de 5 minutos de intervalo, inferior a 30 minutos de intervalo, 1 hora de intervalo, a cerca de 1 hora de intervalo, em cerca de 1 a cerca de 2 horas de intervalo, a cerca de 2 horas até cerca de 3 horas de intervalo, a cerca de 3 horas a cerca de 4 horas de intervalo, a cerca de 4 horas a cerca de 5 horas de intervalo, a cerca de 5 horas a cerca de 6 horas de intervalo, em cerca de 6 horas a cerca de 7 horas de intervalo, a cerca de 7 horas e cerca de 8 horas de intervalo, a cerca de 8 horas até cerca de 9 horas de intervalo, a cerca de 9 horas a cerca de 10 horas de intervalo, a cerca de 10 horas para cerca de 11 horas de intervalo, em cerca de 11 horas a cerca de 12 horas de intervalo, a cerca de 12 horas para 18 horas de intervalo, 18 horas e 24 horas de intervalo, 24 horas e 36 horas de intervalo, 36 horas e 48 horas de intervalo, 48 horas a 52 horas de intervalo, 52 horas a 60 horas de intervalo, 60 horas a 72 horas de intervalo, 72 horas a 84 horas de intervalo, 84 horas e 96 horas de intervalo, ou 96 horas a 120 horas de intervalo a partir dos anticorpos ou o fragmentos dos mesmos presente invenção. As duas ou mais terapias podem ser administradas dentro de uma visita do mesmo paciente.

[00455] Os anticorpos ou o fragmentos do mesmo da presente invenção e as outras terapias podem ser administrados ciclicamente. A terapia cíclica envolve a administração de uma primeira terapia (por exemplo, um primeiro agente profilático ou terapêutico), por um período de tempo, seguindo-se a administração de uma segunda terapia (por exemplo, um segundo agente profilático ou terapêutico), por um período de tempo, opcionalmente, seguindo-se a administração de uma terapia de terceiros (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico), por um período de tempo e assim por diante, e repetindo esta administração sequencial, ou seja, o ciclo de modo a reduzir o desenvolvimento de resistência a uma das terapias, para evitar ou reduzir os efeitos secundários de uma das terapias, e/ou para melhorar a eficácia das terapias.

[00456] Em certas modalidades, os anticorpos ou o fragmentos dos mesmos da presente invenção podem ser formulados para assegurar uma distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, a barreira sangue-cérebro (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrófilas. Para assegurar que os compostos terapêuticos da presente invenção atravessam a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para os métodos de fabricação de lipossomas, vide, por exemplo, Patente U.S. №s 4.522.811 ; 5.374.548 e 5.399.331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais unidades que são seletivamente transportadas em células ou órgãos específicos, dessa maneira, melhorar a entrega do fármaco alvo (vide, por exemplo, Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29 : 685). Exemplos de porções de direccionamento incluem folato ou biotina (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.416.016 de Low et al.) ; Manosídeos (Umezawa et al, (1988) Biochem Biophys Res Commun 153 : 1038), Anticorpos (Bloeman et al, (1995) FEBS Lett 357 : 140; Owais et al, (1995) Antimicrob Agents Chemother 39 : 180) ; receptor da proteína (. Briscoe et al, (1995) Am. J. Physiol. 1233 : 134), p 120 (Schreier et al, (1994) J. Biol Chem 269 : 9090), vide também K. Keinanen ; ML Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346 : 123 ; JJ Killion ; IJ Fidler (1994) Immunomethods 4 : 273.

[00457] A presente invenção proporciona os protocolos para a administração de anticorpos composição farmacêutica compreendendo os fragmentos dos mesmos da presente invenção sozinho ou em combinação com outras terapias para um sujeito em necessidade do mesmo. As terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) das terapias de combinação da presente invenção podem ser administrados concomitantemente ou sequencialmente a um sujeito. O tratamento (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) das terapias de combinação da presente invenção pode também ser administrada de forma cíclica. Terapia cíclica envolve a administração de uma terapia de primeira (por exemplo, um primeiro agente profilático ou terapêutico), por um período de tempo, seguindo-se a administração de uma segunda terapia (por exemplo, um segundo agente profilático ou terapêutico), por um período de tempo e repetindo esta administração sequencial, ou seja, o ciclo, de modo a reduzir o desenvolvimento de resistência a uma das terapias (por exemplo, agentes) para evitar ou reduzir os efeitos secundários de uma das terapias (por exemplo, agentes), e/ou para melhorar, a eficácia das terapias.

[00458] As terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) das terapias de combinação da presente invenção podem ser administradas a um paciente ao mesmo tempo. O termo "concorrentemente", não está limitado à administração de terapias (por exemplo, de agentes profiláticos ou terapêuticos) a exatamente ao mesmo tempo, mas em vez disso, entende-se que uma composição farmacêutica compreendendo os anticorpos ou o fragmentos do mesmo da presente invenção são administrados a um sujeito com um sequência e dentro de um intervalo de tempo de tal modo que os anticorpos da presente invenção podem atuar em conjunto com a terapia de outro (s) para proporcionar um benefício maior do que se fossem administrados de outra forma. Por exemplo, cada terapia pode ser administrada a um indivíduo ao mesmo tempo ou sequencialmente em qualquer ordem a diferentes pontos no tempo, no entanto, se não for administrado ao mesmo tempo, devem ser administrados suficientemente próximos no tempo de modo a proporcionar o desejado efeito terapêutico ou profilático. Cada terapia pode ser administrada a um indivíduo em separado, por qualquer forma adequada e por qualquer via adequada. Em várias modalidades, as terapias (por exemplo, de agentes profiláticos ou terapêuticos) são administrados a um paciente a menos de 15 minutos, menos de 30 minutos, menos de 1 hora de intervalo, a cerca de 1 hora de intervalo, a cerca de 1 hora até cerca de 2 horas de intervalo, a cerca de 2 horas até cerca de 3 horas de intervalo, a cerca de 3 horas a cerca de 4 horas de intervalo, a cerca de 4 horas a cerca de 5 horas de intervalo, a cerca de 5 horas a cerca de 6 horas de intervalo, a cerca de 6 horas a cerca de 7 horas de intervalo, em cerca de 7 horas a cerca de 8 horas de intervalo, a cerca de 8 horas a cerca de 9 horas de intervalo, a cerca de 9 horas a cerca de 10 horas de intervalo, a cerca de 10 horas a cerca de 11 horas de intervalo, a cerca de 11 horas a cerca de 12 horas de intervalo, 24 horas de intervalo, 48 horas de intervalo, 72 horas de intervalo, ou 1 semana. Em uma outras modalidades, duas ou mais terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) são administrados a um paciente na mesma visita.

[00459] Os agentes profiláticos ou terapêuticos das terapias de combinação podem ser administrados a um sujeito com a mesma composição farmacêutica. Alternativamente, os agentes profiláticos ou terapêuticos das terapias de combinação podem ser administrados simultaneamente a um sujeito em composições farmacêuticas separadas. Os agentes profiláticos ou terapêuticos podem ser administrados a um paciente pelas vias iguais ou diferentes de administração.

[00460] A presente invenção tendo sido totalmente descrita, é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos e reivindicações, que são ilustrativos e não se destinam a ser ainda limitados.

Exemplos Exemplo 1 : Métodos, materiais e triagem de anticorpos (I) Linhagens de células

[00461] BXPC-3, SK-BR-3, BT-474, MDA-MB-453, FADU e linhagens de células MCF-7 foram adquiridos a partir de ATCC e rotineiramente mantidas em meio de crescimento suplementado com 10 % de soro fetal bovino (FBS).

(Ii) Geração de Vetores HER3 humano, cino, camundongo e rato recombinante

[00462] O domínio extracelular HER3 de murino foi amplificado por PCR a partir de cDNA de cérebro de camundongo (Clontech) e a sequência verificada por meio da comparação com RefSeq NM_010153. HER3 de Camundongo ECD foi transcrito de forma inversa a partir de Rat-2 mRNA celular e a sequência verificada por comparação com NM_017218. O modelo de cDNA de HER3 cinomólogo foi gerado usando RNA a partir de vários tecidos (cyno Zyagen Laboratories), e do produto de RT-PCR clonado em pCR-TOPO ®-XL (Invitrogen) antes da sequenciação de ambas as cadeias. HER3 humana foi derivada de uma biblioteca de cDNA de cérebro fetal humano (fonte) e a sequência verificada por comparação com NM_001982.

[00463] Para gerar proteínas recombinantes marcadas, HER3 humano, cino, camundongo e rato foi amplificado por PCR usando polimerase Taq Pwo (Roche Diagnostics). Os produtos amplificados por PCR foram purificados em gel e clonados em um vetor de entrada pDonR201 (Invitrogen) gateway que anteriormente tinha sido modificada para incluir uma moldura no terminal N de sequência de comando de CD33 e um ETIQUETA do terminal C, por exemplo, ETIQUETA FLAG. O ETIQUETA permite a purificação de proteínas monoméricas através de um anticorpo anti-ETIQUETA monoclonal. Os genes alvo foram flanqueados com attB1 e attB2 permitindo a recombinação em vetores adaptados gateway destino propriedade (por exemplo, pcDNA3.1), utilizando a tecnologia de clonagem Gateway ® (Invitrogen). As reações de recombinação foram realizadas usando uma reação Gateway LR com vetores de destino proprietários contendo um promotor de CMV para criar os vetores de expressão de ETIQUETA, embora qualquer vetor comercialmente disponível pode ser utilizado.

[00464] Além disso as proteínas recombinantes foram gerados HER3 que fundiu a HER3 ECD a montante de um Terminal C local de clivagem Fator X e a dobradiça de IgG humana e do domínio Fc para criar uma proteína Fc-etiqueta. Para alcançar este objetivo, a PCR eram os vários HER3 ECD de amplificado e clonado em um vetor (por exemplo, pcDNA3.1) modificado para conter uma estrutura interna de fusão do Terminal C do Fator X do local da dobradiça HFC-. A estrutura de leitura aberta foi gerada flanqueada com os locais attB1 e attB2 para clonagem adicional com a tecnologia de clonagem recombinante Gateway ® (Invitrogen). Uma reação de Gateway LR foi utilizada para transferir HER3-Fc para uma expressão de constructo de destino contendo um promotor de CMV. Os constructos de expressão de mutações HER3 foram gerados utilizando protocolos padrão do local de muetiquetaênese dirigida e a sequência de vetores resultante verificada.
Tabela 8. Geração de vetores de expressão de HER3. Numeração de aminoácido HER3 baseia-se NP_001973 (humano), NP_034283 (camundongo) e NP_058914 (rato).

(lii) A expressão de proteínas recombinantes HER3

[00465] As desejadas proteínas recombinantes HER3 foram expressas em linhagens de células HEK293 derivadas previamente adaptadas para cultura em suspensão e cultivadas em um meio isento de soro, proprietário Novartis. A verificação de expressão em pequena escala foi realizada em ensaios transientes de 6 cavidades de placa de transfeção em função da lipofeção. Produção de proteínas em larga escala através de transfeção transiente e foi realizada a 10 a 20 escala L do sistema de biorreactor Wave ™ (Wave Biotech). DNA polietilenoimina (Polysciences) foi utilizado como um plasmídeo transportador, na proporção de 1 : 3 (p : p). Os sobrenadantes das culturas celulares foram colhidos 7 a 10 dias após a transfeção e concentrados por meio da filtração de fluxo cruzado e de diafiltração antes da purificação.

(Iv) Purificação da Proteína marcadas

[00466] As proteínas HER3 recombinantes marcadas (por exemplo, ETIQUETA-HER3) foram purificadas através da recolha do sobrenadante da cultura de células e concentração de 10 vezes por filtração de fluxo cruzado com um 10 kDa cortadas do filtro (Fresenius). Uma coluna de anti-ETIQUETA foi preparada por meio do acoplamento de um anticorpo monoclonal anti-ETIQUETA de CNBr Sepharose 4B ativada com uma proporção final de 10 mg de anticorpo por mL de resina. O sobrenadante concentrado foi aplicado a uma coluna anti-Etiqueta 35ml, com um caudal de 1 a 2 ml / minuto. Depois da linhagem de base de lavagem com PBS, o material ligado foi eluído com glicina a 100 mM (pH 2,7), neutralizado e esterilizado por meio da filtração. As concentrações de proteína foram determinadas através da medição da absorvância a 280 nm e utilizando um fator de conversão teórica de 0,66 AU / mg. A proteína purificada foi caracterizada por fim através de SDS-PAGE, sequenciação do terminal N e LC-MS.

(V) Purificação Etiqueta Fc

[00467] O sobrenadante de cultura concentrado de células foi aplicado a uma proteína de 50 ml Uma coluna de Sepharose Fast Flow com uma taxa de fluxo de 1 ml / min. Após lavagem com PBS de linha de base, a coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de 10 mM de NaH2PO4 / 30 % (v / v) de isopropanol, pH 7,3 seguido de 5 volumes de coluna de PBS. Finalmente, o material ligado foi eluído com Citrato a 50 mM / NaCl a 140 mM (pH 2,7), neutralizado e esterilizad por meio da filtração.

(Vi) A aeração de linhas de sobre-expressão de células

[00468] Para gerar uma linhagem celular que expressa os níveis elevados de HER3 sobre a superfície da célula, um vetor de expressão de mamífero foi construído contendo um inserto codificador de uma sequência líder de CD33 a montante dos resíduos de aminoácidos 20 a 667 de HER3 humano fundido em enquadramento para os 669 a 1210 resíduos de aminoácidos de EGFR humano. Quando expresso em células de mamíferos, a proteína quimérica resultante contém um Terminal N do domínio extracelular HER3 e transmembranar e um domínio Terminal C do EGFR citoplasmático. O vetor de HER3 / 1 foi transfectado em células CHO-S (Invitrogen) e piscinas estáveis geradas após seleção com antibióticos. A linhagem celular resultante (CHO HER3 / 1) expressou os niveis elevados de domínio extracelular HER3 na superfície celular.

(Vii) Pannings de OURO ® HuCAL

[00469] Para a seleção de anticorpos que reconhecem os HER3 humanos múltiplos, estratégias de panning foram empregadas. Os anticorpos terapêuticos contra proteína HER3 humana foram gerados através da seleção de clones que possuem elevadas afinidades de ligação, utilizando-se como fonte do anticorpo de proteínas variante de uma biblioteca de apresentação de fagos disponíveis comercialmente, a biblioteca MorphoSys OURO HuCAL ®. A biblioteca de fagemídeo se baseia no conceito ® HuCAL (Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296 : 57 a 86) e emprega a tecnologia CysDisplay ® para exibir o Fab à superfície do fago (WO01 / 05950 para Lohning).

[00470] Para o isolamento de anticorpos anti-HER3, padrão, bem como RapMAT, as estratégias de panning foram realizadas usando fase sólida, solução, e de células inteiras de células inteiras diferenciais de abordagens de panning.

(Viii) Panning em Fase Sólida

[00471] Para identificar os anticorpos anti-HER3, uma variedade de estratégias de panning em fase sólida foi realizada utilizando diferentes proteínas recombinantes HER3. Para realizar cada ronda de panning em fase sólida, placas Maxisorp (Nunc) foram revestidas com a proteína HER3. Proteínas marcadas ou foram capturadas utilizando placas previamente revestidas com anticorpo anti-Fc (de cabra ou camundongo anti-IgG humana, Jackson Immuno Research), anti-Etiqueta ou anticorpo via adsorção passiva. As placas revestidas foram lavadas com PBS e bloqueadas. As placas revestidas foram lavadas duas vezes com PBS antes da adição do fago de anticorpos OURO ® HuCAL- durante 2 horas à temperatura ambiente em um agitador. Os fagos ligados foram eluídos foram adicionados a E. coli TG-1 e incubados durante a infeção do fago. Subsequentemente, as bactérias infectadas foram isoladas e plaqueadas em placas de agar. As colônias foram raspadas das placas e os fagos foram resgatados e amplificados. Cada estratégia HER3 panorâmica ccontinha rodadas individuais de panning e continha antígenos únicos, as concentrações de antígenos e o rigor de lavagem.

(Ix) Fase de Solução de Panning

[00472] Cada ronda de fase de solução panning foi realizada utilizando várias proteínas HER3 recombinantes biotiniladas na presença ou ausência de neuregulina 1-β1 (R & D Systems). As proteínas foram biotiniladas utilizando o EZ-link Sulfo-NHS-LC kit de biotinilação (Pierce) de acordo com as instruções do fabricante. 800μΙ de contas magnéticas ligadas a estreptavidina (Dynabeads, Dynal) foram lavadas uma vez com PBS e bloqueadas durante a noite com Chemiblocker (Chemicon). Os anticorpos OURO® HuCAL em fagos e a HER3 biotinilado apropriado foram incubadas em um tubo de reação. As contas magnéticas de estreptavidina foram adicionadas durante 20 minutos e foram recolhidas com um separador de partículas magnéticas (Dynal). Os fagos ligados foram eluídos a partir das Dynabeads adicionando contendo tampão DTT a cada tubo e adicionadoa E. coli TG-1. A infecção do fago foi realizada de forma idêntica à descrita de panning em fase sólida. Cada estratégia HER3 panorâmica continha as rodadas individuais de panning e continha antígenos únicos, as concentrações de antígenos e de rigor de lavagem.

(X) Célula com base panning

[00473] Para pannings celulares, os fago-anticorpos GOLD HuCAL ® foram incubados com cerca de 107 células em um rotador durante 2 horas à temperatura ambiente, seguido de centrifugação . O pélete de células foi isolado em fagos que foram eluídos a partir das células. O sobrenadante foi recolhido e adicionado a cultura de E. coli TG-1 continuado pelo processo descrito acima. Duas estratégias à base de células foram utilizadas para identificar os anticorpos anti-HER3 :

[00474] a) panning de células inteiras: Nesta estratégia de uma variedade de linhagens de células intactas foram utilizadas como antigênios.

[00475] b) panning de células inteiras Diferenciais : Nesta estratégia consistiu sequencialmente nos antigênios de células e proteínas recombinantes HER3 (vide 1981,09 como um exemplo). Os pannings à base de células foram realizados tal como descrito acima ao passo que protocolos de panning em fase sólida foram utilizados quando as proteínas recombinantes foram utilizadas como antigênios. As lavagens foram realizadas utilizando PBS (2-3X) e PBST (2-3X).

(Xi) Geração da biblioteca e pannings RapMAT ™

[00476] A fim de aumentar a afinidade de ligação do anticorpo enquanto mantêm a diversidade da biblioteca, a segunda saída da rodada de ambos pannings em solução e em fase sólida foram introduzidos no processo RapMAT ™ enquanto a terceira saída rodada de estratégias de panning de célula inteira e de células inteiras diferenciais foram inseridas (Prassler et al ., Immunotherapy (2009), 1 : 571 a 583. RapMAT ™ bibliotecas foram gerados por sub-clonagem de Fab de codificação de inserções de fagos selecionadas por panning no mostrador vetor pMORPH ® 25_bla_LHCand foram digeridas para gerar bibliotecas H-CDR2 RapMAT ™ e bibliotecas L-CDR3 RapMAT ™ usando enzimas de restrição específicas. As inserções foram substituídas por cassetes de maturação (TRIM Virnekas et al, (1994) Nucleic Acids Research 22 : 5600 a 5607) de H-CDR2 ou L-CDR3 de acordo com piscina dos tamanhos da composição. As bibliotecas foram estimados entre 8x106-1x108 clones. O anticorpo-fago RapMAT foram produzidos e sujeitos a dois ciclos adicionais de solução de fase sólida, ou de células com base de panning utilizando os métodos experimentais descritos anteriormente.

Exemplo 2 : Expressão transiente de IgG de anti-HER3

[00477] Suspensão adaptada de células HEK293-6E foi cultivada em um BioWave20 a uma densidade de aproximadamente 2 x 106 células viáveis / mL. As células foram transitoriamente transfectadas com o DNA relevante estéril : PEI-MIX e ainda cultivadas. Sete dias após a transfeção, as células foram removidas por meio da filtração de fluxo cruzado utilizando filtros de 0,2 um (Fresenius). O material livre de células foi concentrado com filtração de fluxo cruzado utilizando um cut off 10 kDa filtro (Fresenius) e o concentrado foi esterilizado por meio da filtração através de um filtro stericup (0,22 nm). O sobrenadante foi esterilizado armazenado a 4°C.

Exemplo 3 : Purificação de anticorpos anti-IgG de HER3

[00478] A purificação de IgG foi realizado em explorador 100 Akta Air de sistema de cromatografia a 6°C em um armário de resfriamento, utilizando-se uma coluna XK16 / 20 com 25 mL de resina Sure MabSelect auto-embalada (todos GE Healthcare). Todos os caudais foram de 3,5 mL / min, excepto para a carga, a um limite de pressão de 5 bar. A coluna foi equilibrada com três volumes de coluna de PBS antes de carregar o sobrenadante de fermentação filtrado a 2,0 mL / min. A coluna foi lavada com 8 volumes de coluna de PBS. IgG foi eluída com um gradiente de pH, a partir de citrato a 50 mM / NaCl a 70 mM (pH 4,5), indo para baixo de forma linear em 12 volumes de coluna de citrato a 50 mM / NaCl a 70 mM (pH 2,5), seguido por meio de uma etapa de volume constante de coluna 2 do mesmo tampão de pH 2,5. As frações contendo IgG foram reunidas e imediatamente neutralizadas e esterilizada por meio da filtração (Millipore Steriflip, 0,22 um). OD280 foi medida e a concentração de proteína calculada com base nos dados de sequência. As piscinas foram testadas separadamente para a agregação (SEC-MALS) e pureza (SDS-PAGE e MS).

Exemplo 4 : Expressão e Purificação de anticorpos Fab-HuCAL ® em E. coli

[00479] A expressão de fragmentos de Fab codificada por pMORPH ® X9_Fab_MH em células TG-1 foi realizada em culturas em frascos de agitação com 500 ml de meio de YT suplementado com 2x 34 ug / ml de cloranfenicol. As culturas foram agitadas a 30°C até que a OD600nm atingiu 0,5. A expressão foi induzida pela adição de 0,75 mM de IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido), durante 20 horas a 30°C. As células foram rebentadas utilizando lisozima. Os fragmentos Fab His6-etiqueta foram isolados através de IMAC (Bio-Rad). O tampão de troca de PBS 1x de Dulbecco (pH 7,2) foi realizado utilizando colunas PD10. As amostras foram esterilizadas por meio da filtração (0,2 mm). As concentrações de proteína foram determinadas por meio da espectrofotometria de UV. A pureza das amostras foi analisada no desnaturante, reduzindo de 15 % SDS-PAGE. A homogeneidade da preparação de Fab foi determinada em estado nativo por meio da cromatografia de exclusão de tamanho (HP-SEC) com padrões de calibração

Exemplo 5 : Afinidade de anticorpos HER3 (KD) Medida por meio da Titulação da solução de equilíbrio (SET)

[00480] A determinação de afinidade em solução foi realizada essencialmente como descrito anteriormente (Friguet et al., (1985) J Immunol Methods 77 : 305 a 19). A fim de melhorar a sensibilidade e a exatidão do método SET, o mesmo foi transferido a partir de ELISA clássico para tecnologia baseada em ECL (Haenel et al., (2005) Anal Biochem 339 : 182 a 84).

[00481] Etiqueta HER3 não-marcada (humano, rato, camundongo ou cino) descrito anteriormente foi utilizado para a determinação de afinidade por SET.

[00482] Os dados foram avaliados com software XLfit (Business Solutions ID) a aplicação de modelos personalizados de monetiquetaem. Para a determinação de cada um KD de IgG no modelo que se segue foi utilizado (modificado de acordo com Piehler, et al (Piehler et al., (1997) J Immunol Methods 201 : 189 a 206).

[00483] [IgG] : concentração aplicada de IgG total

[00484] x : concentração de antígeno solúvel aplicada total (locais de ligação)

[00485] Bmax : sinal máximo de IgG sem antigênio

[00486] KD : afinidade

Exemplo 6 : Determinação de anticorpos de ligação celular por FACS

[00487] A ligação dos anticorpos ao antigênio humano endógeno expresso em células cancerígenas humanas foi avaliada por FACS. A fim de determinar os valores de EC50 de anticorpo, as células SK-BR-3 foram colhidas com Accutase e diluídas para células 1 x106 / mL em tampão FACS (PBS / 3 % FBS / 0,2 % de NaN3). As células 1 x105 / cavidade foram adicionadas a cada cavidade de uma placa de 96 cavidades (Nunc) e centrifugadas a 210 g durante 5 minutos a 4°C antes da remoção do sobrenadante. As diluições em série de anticorpos de teste (diluídas em etapas de diluição a 1 : 4 com tampão FACS) foram adicionadas às células peletizadas e incubadas durante 1 hora em gelo. As células foram lavadas e sedimentadas por três vezes com 100 uL de tampão de FACS. PE conjugado de cabra anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch) diluído a 1 / 200 com tampão FACS foram adicionados às células e incubados em gelo durante 1 hora. As etapas de lavagem adicionais foram realizadas três vezes com 100 uL de tampão de FACS seguidas por meio das etapas de centrifugação a 210 g durante 5 minutos a 4°C. Finalmente, as células foram ressuspensas em 200 ul de tampão de FACS e os valores da fluorescência foram medidos com um FACSArray (BD Biosciences). A quantidade de superfície celular ligado anticorpo anti-HER3 foi avaliada através da medição da fluorescência de canal médio.

Exemplo 7 : Domínio HER3 e Ligação Mutante

[00488] As placas de 96 cavidades Maxisorp (Nunc) foram revestidas durante a noite a 4°C com 200 ng da proteína recombinante humano apropriado (HER3-Etiqueta, D1-2-Etiqueta, D2-Etiqueta, D3-4-Etiqueta, D4-Etiqueta, HER3 K267A-Etiqueta, HER3 L268A-Etiqueta, HER3 K267A / L268A e um controle marcado irrelevante). Todas as cavidades foram então lavadas três vezes com PBS / 0,1 % de Tween-20, bloqueadas por uma hora, com PBS / BSA a 1 % / 0,1 % de Tween-20 e lavadas três vezes com PBS / 0,1 % de Tween-20. Anti-Anticorpos HER3 foram adicionadas as cavidades correspondentes até uma concentração final de 10 ng / ml foram adicionadas as cavidades adequadas e incubadas à temperatura ambiente durante duas horas. As placas foram lavadas três vezes com PBS / 0,1 % de Tween-20, antes da adição do anticorpo de detecção apropriada de peroxidase ligada diluído a 1 / 10000 em PBS / BSA a 1 % / 0,1 % de Tween-20. Os anticorpos de detecção utilizados eram de cabra anti-camundongo (Pierce, 31432), de coelho anti-cabra (Pierce, 31402), e de cabra anti-humano (Pierce, 31412). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante uma hora antes de se lavar três vezes com PBS / 0,1 % de Tween-20. 100 ul de TMB (3,3 ', 5,5' tetrametilbenzidina), solução de substrato (BioFx) foi adicionada a todas as cavidades durante 6 minutos antes de parar a reação com 50 ul de H2SO4 a 2,5 % . A extensão da ligação do anticorpo HER3 para cada proteína recombinante foi determinada medindo a DO450 utilizando um leitor de placa SpectraMax (Molecular Devices). Quando apropriado, as curvas de resposta de dose foram analizadas usando Graphpad Prism.

Exemplo 8 : Mapeamento de Epítopos HER3 usando Espectrometria de Massa de troca de hidrogênio / deutério Materiais

[00489] O tampão D2O foi preparado dissolvendo TBS a 25 mM (pH 7,5) / NaCl a 500 mM em água pesada (Sigma). A solução de redução foi de tampão de formiato a 50 mM (pH 4) TCEP a 500 mM e a solução de têmpera de 0,5 % (v / v) de ácido trifluoroacético (TFA) em água. O tampão A foi de 0,25 % de ácido fórmico / metanol a 10 % / 10 % de etileno-glicol em água, e tampão B foi de 0,25 % de ácido fórmico em acetonitrila. Todos os produtos químicos foram adquiridos da Sigma, e os solventes foram de grau HPLC da Fisher Scientific.

Manuseio e Cromatografia líquida

[00490] Os experimentos de espectrometria de Massa de troca de hidrogênio / deutério automzatizada (MS HDX) foram concebidos com base em métodos e equipamentos descritos por Gales et al., (2006) Anal. Chem. 78 : 1005 a 1014). Em suma, todas as operações de manipulação de líquidos usaram um manipulador líquido Pal HTS-(Tecnologias LEAP) alojado em um gabinete refrigerado mantido a 2°C. A válvula de porta de injeção 6 e uma estação de lavagem foram montadas sobre o trilho de líquido e de injeção de amostra manipulador facilitado no sistema cromatográfico e lavagem da seringa. O sistema cromatográfico, consistiu em uma válvula de 10 portas adicionais, uma coluna 2,1 mm x 30 mm de Poroszyme pepsina (Applied Biosystems), de fase reversa de 0,5 mm x 2 mm de cartucho Cap Armadilha (Michrom Bioresources), e um emissor auto-embalado eletrospray como coluna analítica (100 mm x 60 mm ~, Kinetex 2,6 uM C18, Phenomenex). A cabeça 10 da válvula de porta, o cartucho de armadilha e a coluna analítica foram alojadas em uma caixa separada construída em alumínio e mantida à temperatura de -5°C por pilhas Peltier. As válvulas e as colunas foram configuradas de tal forma a permitir a entrada de linha de cromatografia de digestão da proteína, peptídeo de dessalinização e de fase reversa antes da introdução da amostra na fonte de ionização por meio da eletrospray (ESI) do espectrômetro de massa (LTQ-Orbitrap, Thermo Scientific).

[00491] As correntes de fluido necessários para a operação foram fornecidas por duas bombas separadas por HPLC. O primeiro HPLC (bomba Surveyor MS, Thermo Scientific) entregou o tampão A, a um fluxo constante de 125 ul / min e foi utilizado para transferir a amostra através do cartucho de pepsina imobilizada sobre o cartucho de armadilha de fase reversa, montado do outro lado da válvula de 10 portas. Após o período de carregamento e dessalinização, a válvula de porta 10 foi transferida para eluir a amostra com a ajuda de uma bomba de gradiente (AQUITY UPLC, Waters) a partir do cartucho de armadilha de fase inversa, por meio da coluna analítica e na fonte de íons do espectrômetro de massa. O cartucho de enzima imobilizado foi isolado para o lixo durante a eluição gradiente. A bomba de gradiente entregou os segmentos gradientes lineares de 0 a 40 % de fase móvel B durante 35 minutos a 5 uL / min e 40 a 95 % de fase móvel B em 5 mL / min durante 10 minutos. O fluxo a partir da bomba de gradiente foi dividido na válvula de porta 10 usando um divisor passivo de modo a que o caudal real através do cartucho armadilha e coluna analítica para a eluição de gradiente foi de ~ 1 mL / min. A corrida cromatográfica inteira foi de 70 minutos de duração, incluindo a lavagem e as etapas de equilíbrio.

Espectrometria de Massa

[00492] Para efeitos de identificação dos fragmentos proteolíticos resultantes da digestão em várias linhagens de dados dependentes de MS / MS foram realizados os experimentos. Para estas na presente aquisições, os espectros MS tandem foram adquiridos com o analisador de LTQ do espectrômetro de massa LTQ Orbitrap-híbrido. A seleção de massa precursora foi baseada em exames de MS adquiridos pelo analisador Orbitrap. As aquisições realizadas em fase única de MS com o objetivo de determinação do nível de deuteração foram adquiridos em uma resolução de 60.000 pelo analisador Orbitrap (mais de m / z 400 a 2000).

Preparação de proteína e proteína : Complexos de Fab

[00493] A proteína HER3 foi preparada por meio da diluição de 50 ug HER3-Etiqueta com TBS a 25 mM (pH 7,5) / NaCl a 500 mM, para se obter um volume final de 50 uL. Proteína : Os complexos de Fab foram preparados através da mistura de 50 ug da HER3-Etiqueta em uma razão molar de 1 : 1 com o Fab são estudados. Proteína : as misturas Fab foram então diluídas para um volume final de 50 mL com TBS 25 a mM (pH 7,5) / NaCl a 500 mM.

[00494] Proteína : Os complexos de Fab foram preparados e deixados a incubar durante pelo menos 2 horas a 4°C. Quatro placas de 96 cavidades contendo amostras, soluções de têmpera, diluente, e redução foram carregadas para o manipulador de líquidos, antes do início de cada experimento. Para a troca de experiências 50 uL de HER3 ou HER3 : complexo Fab foi diluído com 150 ul de tampão D2O. A mistura foi reduzida por meio da adição de 200 uL de tampão de redução durante 1 minuto antes de se extinguir com 600 uL de tampão de têmpera. O volume total depois de todos as etapas de manuseamento de líquidos foi de ~ 1 mL. Uma vez misturada, a solução neutralizada foi injetada no sistema cromatográfico em que foi digerido automaticamente, separada e analisada por LCMS. A variação média de deuteração entre a amostra e de controle foi calculada como a diferença entre os níveis de captação do deutério da amostra e de controle.

Processamento de Dados

[00495] Os arquivos RAW Orbitrap foram convertidos em arquivos mzXML usando um programa em casa (RawXtract). Posteriormente, as aquisições em tandem MS foram pesquisadas utilizando Sequest (Yates Lab, Instituto de Pesquisa Scripps, em La Jolla, CA) e os resultados da pesquisa foram automaticamente filtrados usando DTASelect 2,0 (Yates Lab, Instituto de Pesquisa Scripps, em La Jolla, CA). Usando as identificações de sequência de peptídeos, um programa interno escrito foi utilizado para extrair automaticamente um único íon de cromatogramas para cada sequência identificada e gerar espectros médios em todo o pico cromatográfico. Os espectros médios foram suavizados e centroidificados. O nível de captação de deutério foi tomado como a diferença em massa entre uma amostra de referência deuterada e não deuterada. Os dados processados manualmente foram validados e ajustados para corrigir as imprecisões e erros de etapas de processamento automatizadas. Os níveis de captação de deutério foram atribuídos a cada um dos resíduos da sequência da proteína por meio da deslocalização do teor de deutério em cada peptídeo (isto é, divide o nível deuteração observada pelo número de aminoácidos em que o peptídeo). Se um resíduo foi coberto por mais do que um peptídeo, as absorções de deutério normalizadas de todos os peptídeos que cobrem resíduo foram calculadas.

Exemplo 9 : Determinação da estrutura cristalográfica de raio X dos complexos HER3 / MOR09823 Fab humano e HER3 / MOR09825 Fab humanos

[00496] O presente exemplo apresenta a estrutura de cristal de HER3 de comprimento completo ligado com o fragmento Fab de MOR09823 e o fragmento Fab de MOR09825, determinado na resolução e 3.2a 3.4a, respectivamente. Os HER3 humanos etiquetados foram ainda purificados sobre uma Hilaad 26 / 60 Superdex coluna PrepGrade 200 (GE Healthcare), equilibrada em PBS (pH 7,3). E. coli e MOR09823 MOR09825 Fabs expressos foram isolados por meio da lise das células com lisozima e fragmentos Fab His6-etiqueta foram capturados sobre uma coluna HisTrap_HP (GE Healthcare). Os fragmentos Fab MOR09823 foram adicionalmente purificados por meio da cromatografia de filtração em gel utilizando uma coluna Superdex 75 16 / 60 (GE Healthcare), equilibrada em Tris a 25 mM (pH 7,5), NaCl a 150 mM.

[00497] Os complexos de HER3 Fab foram preparados através de mistura com excesso de Fab HER3 marcado em uma razão molar de 1.3 a 1.8 : 1 (concentração estimada por meio da absorvância a 280 nm, utilizando coeficientes de extinção calculados de 0,9 e 1,4 (mg / ml)-1cm-1 para HER3 e Fab, respectivamente) e a purificação dos complexos de uma coluna 200 10 / 300 Superdex (GE Healthcare), equilibrada em Tris 25 mM (pH 7,5), NaCl a 150 mM. As frações do pico foram analisadas por SDS-PAGE e LCMS. Para cada complexo, as frações contendo ambos HER3 e Fab em uma proporção aproximada equimolar foram reunidas e concentradas. Os cristais HER3 / MOR09823 foram cultivadas a 293 K por meio da difusão de gota de vapor a partir de gotas contendo 150 nl de complexo HER3 / MOR09823 e 150 nl de solução de reservatório (100 mM de citrato de sódio pH 5,6, 20 % de PEG 4000 e 20 % de isopropanol). Os cristais foram transferidos para a solução de reservatório contendo 8 % de glicerol e resfriado instantaneamente no nitrogênio líquido. Os cristais HER3 / MOR09825 foram cultivados a 293 K por meio da difusão sentada de gota de vapor a partir de gotas contendo complexo 150 nl HER3 / MOR09825 e 150 nl de solução de reservatório (bis-tris a 100 mM pH 6,5, 16 % de PEG 10000). Os cristais foram transferidos para bis-tris a 100 mM pH 6,5, 18 % de PEG 10.000 e 22 % de glicerol e resfriado instantaneamente no nitrogênio líquido.

[00498] Os dados foram coletados na linha leve 17-ID no Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory). Os dados dos complexos HER3 / MOR09823 Fab foram processados e escalados em 3.2a usando HKL2000 (HKL Research Inc) no espaço do grupo I222 com dimensões celulares a = 124,16, b = 139,44, c = 180,25 Â, com boas estatísticas. A estrutura Fab HER3 / MOR09823 foi resolvida por meio da substituição molecular utilizando Phaser (McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40 : 658 a 674) com fragmentos de um Fab e os HER3 publicados da estrutura 1 mb6 de DPI como modelos de pesquisa. O modelo final, que contém uma molécula do complexo Fab HER3 / MOR09823 por meio da unidade assimétrica, foi construído em COOT (Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60 : 2126 a 2132) e refinado para R e Rfree de valores de 19,0 e 24,5 %, respectivamente, com um RMSD de 0,010 Â e 1,37 ° para os comprimentos de ligação e ângulos de ligação, respectivamente, usando BUSTER (Global Faseamento, LTD). Os resíduos de HER3, que contêm os átomos de dentro de 5A de qualquer átomo em Fab MOR09823, como indicado nos PyMOL (Schrödinger, LLC) são listados nas Tabelas 11 e 12. Os dados dos complexos HER3 / MOR09825 Fab foram processados e escalados em 3.4a usando autoPROC (Global Faseamento, LTD) no grupo I222 com dimensões de célula a = 124,23, b = 140,94, c = 180,25 Â, com boas estatísticas. A estrutura Fab HER3 / MOR09825 foi resolvida por meio da substituição molecular utilizando Phaser (McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40 : 658 a 674) com a estrutura Fab HER3 / MOR09823 como modelo de busca. O modelo final, que contém uma molécula do complexo Fab HER3 / MOR09825 por meio da unidade assimétrica, foi construído em COOLT (Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60 : 2126 a 2132) e refinado para R e Rfree de valores de 18,8 e 24,9 %, respectivamente, com um RMSD de 0,009 Â e 1,21 ° para os comprimentos de ligação e ângulos de ligação, respectivamente, usando BUSTER (Global Faseamento, LTD). Os resíduos de HER3, que contêm átomos de dentro 5A de qualquer átomo em Fab MOR09825, como indicado nos PyMOL (Schrödinger, LLC) são listados nas Tabelas 13 e 14.

Exemplo 10 : Phospho-HER3 em ensaios de células in vitro.

[00499] As células MCF-7 foram habitualmente mantidas em DMEM / F12, HEPES a 15mM, L-glutamina, 10 % FCS e SK-BR-3 em 5a de McCoy, 10 % de FCS, L-glutamina a 1,5 mM. Sub-confluente MCF7 ou SK-BR-3 de células cultivadas em meio completo foram colhidos com Accutase (PAA Laboratories) e ressuspensos no meio de crescimento apropriado na concentração final de 5 x 105 células / mL. 100 ul de suspensão de células foi então adicionada a cada cavidade de uma placa de 96 cavidades de fundo plano (Nunc), para dar uma densidade final de 5 x 104 células / cavidade. MCF7 células foram deixadas a aderir durante aproximadamente 3 horas antes de o meio foi trocado por meio de fome, contendo 0,5 % de FBS. Todas as placas foram então incubadas durante a noite a 37°C antes do tratamento com a concentração apropriada de Anticorpos HER3 (diluídas em meios apropriados) durante 80 minutos a 37°C. As células MCF7 foram tratadas com 50 ng / mL neuregulina 1-β1 do domínio EGF (R & D Systems) para os 20 minutos finais para estimular a fosforilação HER3. Todos os meios foram cuidadosamente aspirados e as células foram lavadas com PBS gelado contendo CaCl2 a 1 mM e MgCl2 a 0,5 mM (Gibco). As células foram lisadas por adição de 50 uL de tampão de lise resfriadas em gelo (Tris a 20 mM (pH 8,0) / NaCl a 137 mM / glicerol a 10 % / EDTA a 2 mM / 1 % de NP-sódio a 40 mM / 1 ortovanadato /, aprotinina (10 ug / mL) / Leupeptin (10μg / mL)) e incubado em gelo, com agitação, durante 30 minutos. Os lisados foram então recolhidos e centrifugados a 1800 g durante 15 minutos a 4°C para remover os restos celulares. 20 ul de lisado foi adicionado a uma placa de captura de pré-preparada.

[00500] As placas de captura HER3 foram geradas usando uma placa de carbono (Mesoscale Discovery) revestidas durante a noite a 4°C com 20 uL de 4 ug / mL MAB3481 de anticorpo de captura (R & D Systems) diluída em PBS e, subsequentemente, bloqueadas com 3 % de albumina de soro bovino em 1x tampão Tris (Mesoscale Discovery) / 0,1 % Tween-20. HER3 foi capturada a partir do lisado por meio da incubação da placa à temperatura ambiente durante uma hora com agitação antes do lisado foi aspirado e as cavidades lavadas com 1x tampão de Tris (Mesoscale Discovery) / 0,1 % Tween-20. HER3 fosforilada foi detectada usando 0,75 ug / mL de anticorpo anti-fosfotirosina biotinilado (R & D Systems), preparado em 1 % de BSA / 1x Tris / 0,1 % de Tween-20 por meio da incubação com agitação à temperatura ambiente durante 1 hora. As cavidades foram lavadas quatro vezes com 1x Tris / 0,1 % de proteínas de Tween-20 e biotinilado foram detectados através da incubação com S-Etiqueta Estreptavidina marcada (Mesoscale Discovery) diluída em BSA a 1 % / 1x Tris / 0,1 % Tween-20 durante uma hora a temperatura ambiente. Cada cavidade foi aspirada e lavada quatro vezes com 1x Tris / 0,1 % de Tween-20 antes da adição de 20 ul de tampão T Ler com tensoativo (Mesoscale Discovery) e o sinal quantificado utilizando um gerador de imagens Sector Mesoscale. Anticorpos MOR06391 ou MOR03207 foram incluídos em experimentos de sinalização como controles isotípicos.

Exemplo 11 : fosfo-Akt (S473) em ensaios de células in vitro.

[00501] Sub-confluente de células SK-BR-3 e BT-474 cultivadas em meio completo foram colhidos com Accutase (PAA Laboratories) e ressuspensos no meio de crescimento apropriado na concentração final de 5 x 105 células / mL. 100 uL da suspensão de células foi então adicionada a cada cavidade de uma placa de 96 cavidades de fundo plano (Nunc), para se obter uma densidade final de 5 x 104 células / cavidade. Todas as placas foram então incubadas durante a noite a 37°C antes do tratamento com a concentração apropriada de Anticorpos HER3 (diluídas em meios apropriados) durante 80 minutos a 37°C. Todos os meios foram cuidadosamente aspirados e as células foram lavadas com PBS gelado contendo CaCl2 a 1 mM e MgCl2 a 0,5 mM (Gibco). As células foram lisadas por adição de 50 uL de tampão de lise resfriado em gelo (Tris a 20 mM (pH 8,0) / NaCl a 137 mM / glicerol a 10 % / EDTA a 2 mM / ortovanadato de sódio a 1 % de NP-40 mM / 1 / aprotinina (10μg / mL ) / Leupeptin (10μg / mL)) e incubado em gelo, com agitação, durante 30 minutos. Os lisados foram então recolhidas e centrifugadas a 1800 g durante 15 minutos a 4°C para remover os restos celulares. 20 ul de lisado foi adicionado a um local de 384 multi- cavidades Phospho-Akt de carbono placa (Mesoscale Discovery) que tinham sido previamente bloqueados com BSA a 3 % / 1x Tris / 0,1 % Tween-20. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante duas horas com agitação antes do lisado foi aspirado e os cavidades lavados quatro vezes com 1x tampão Tris (Mesoscale Discovery) / 0,1 % Tween-20. Akt fosforilada foi detectado utilizando-se 20 uL de SULFO-ETIQUETA anti-fosfo-Akt (S473) de anticorpo (Mesoscale Discovery) diluído 50 vezes em 1 % de BSA / 1x Tris / 0,1 % de Tween-20 por meio da incubação com agitação à temperatura ambiente durante 2 horas. As cavidades foram lavadas quatro vezes com 1x Tris / 0,1 % de Tween-20 antes da adição de 20 ul de tampão T Ler com tensoativo (Mesoscale Discovery) e o sinal quantificado utilizando um gerador de imagens Sector Mesoscale. Anticorpos MOR06391 ou MOR03207 foram incluídos em experimetos de sinalização como controles isotípicos.

Exemplo 12 : Ensaios de linhagem celular de proliferação.

[00502] SK-BR-3 de células foram rotineiramente cultivadas em meio de McCoy 5A modificado, suplementado com 10 % de soro fetal bovino e 474 BT-células foram cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 10 % . Sub-confluentes de células foram tripsinizadas, lavadas com PBS, diluídas para 5x 104 células / ml com meio de crescimento e plaqueadas em placas de 96 cavidades com fundo transparente preto (Costar 3904), a uma densidade de 5000 células / cavidade. As células foram incubadas durante a noite a 37°C antes da adição de uma concentração adequada de HER3 anticorpo (tipicamente concentrações finais de 10 ou 1 ug / mL). As placas foram devolvidas ao incubador durante 6 dias antes de avaliar a viabilidade celular utilizando CellTiter-Glo (Promega). 100 L de solução CellTiter-Glo foi adicionada a cada cavidade e incubada à temperatura ambiente com agitação suave durante 10 minutos. A quantidade de luminescência foi determinada usando um leitor de placa SpectraMax (Molecular Devices). A extensão da inibição do crescimento obtido com cada um dos anticorpos foi calculada comparando os valores obtidos em cada luminscence HER3 anticorpo para um anticorpo padrão de isotipo de controle (MOR06391).

[00503] Para os ensaios de proliferação de células MCF-7 foram rotineiramente cultivadas em DMEM / F12 (1 : 1) contendo L-glutamina a 4 mM / 15mM a HEPES / FBS a 10 %. Sub-confluentes de células foram tripsinizadas, lavadas com PBS e diluídas para uma x105 células / ml com DMEM / F12 (1 : 1) contendo L-glutamina a 4 mM / 15mM a HEPES / 10 ug / mL de transferrina humana / BSA a 0,2 % . As células foram plaqueadas em placas de 96 cavidades com fundo transparente preto (Costar) a uma densidade de 5000 células / cavidade. A concentração apropriada de anticorpo HER3 (típicas concentrações finais de 10 ou 1 ug / mL) foi então adicionado. 10 ng / ml de EGF NRG1-β1 domínio (R & D Systems) foi também adicionada aos cavidades apropriados para estimular o crescimento celular. As placas foram devolvidas ao incubador durante 6 dias antes de avaliar a viabilidade celular utilizando CellTiter-Glo (Promega). A extensão da inibição do crescimento obtida com cada um dos anticorpos foi calculada subtraindo-se o fundo (não neuregulina) valores luminscence e comparando-se os valores resultantes obtidos com cada um dos anticorpos anti-HER3 para um anticorpo padrão de isotipo de controle (MOR06391).

Exemplo 13 : Ensaios celulares de bloqueio de ligantes

[00504] As células MCF-7 cultivadas em MEM suplementado com FBS 10 % e 1 ug de insulina / mL (Sigma) foram lavadas e recolhidas em um pequeno volume de tampão de dissociação celular FACSmax (Genlantis) antes da adição de 5 mL de tampão de FACS (PBS / FBS a 1 % de azida de sódio / 0,1 % ). A densidade de células foi contada e ajustadas para uma concentração final de 1 x106 células / mL. 100 ul de suspensão de célula foi adicionado a cada cavidade de uma placa de 96 cavidades e as células peletizadas através de centrifugação (220 g, 3 minutos, 4°C). Os sedimentos celulares foram ressuspensos em 100 ul de anticorpos de ensaio adequados diluídos em tampão FACS (típicas concentrações finais de anticorpos variaram entre 100 a 0,1 nM) e a placa foi incubada em gelo durante 45 minutos. O ligante de anticorpo bloqueador MAB3481 (R & D Systems) foi incluído como um controle positivo. As células foram lavadas duas vezes com tampão de coloração antes da adição de 10 nM NRG1-β1 EGF domínio (R & D Systems) diluída em tampão de FACS e incubação em gelo durante 45 minutos. As células foram lavadas duas vezes com tampão de coloração e neuregulina ligado detectado por meio da incubação das células com 10 nM anti-humano NRG1-β1 anticorpos de domínio EGF (R & D Systems) em gelo durante 45 minutos. As células foram lavadas duas vezes com tampão de coloração e incubadas em gelo durante 45 minutos com PE-ligado anticorpo anti-cabra (Jackson ImmunoResearch) diluído a 1 / 500 com tampão FACS. As células foram então sedimentadas por centrifugação e o sedimento ressuspenso em 200 ul de tampão de FACS. Para quantificar cada amostra 10000 células vivas foram contadas em um LSR Citómetro de Fluxo II (BD Biosciences) e a quantidade de superfície celular ligado neuregulina foi avaliada através da medição da fluorescência de canal médio.

Exemplo 14 : Ensaios bioquímicos de bloqueio de ligantes

[00505] O método da presente invenção inclui um utilitário de ressonância de superfície plasmônica (SPR) baseado no biosensor (BiacoreTM, GE Healthcare, Uppsala, Suécia), para examinar a capacidade de HER3 / anticorpo para se ligar aos complexos de neuregulina.

[00506] BiacoreTM utiliza o fenômeno de ressonância de superfície plasmônica (SPR) para detectar e medir a interação de ligação. Em uma experiência típica Biacore, uma das moléculas que interagem (neuregulina) é imobilizado em uma matriz, enquanto o parceiro de interação (HER3) flui sobre a superfície. A ligação de interação resulta em um aumento da massa na superfície do sensor e a correspondente alteração direta no índice de refração do meio na proximidade da superfície do sensor. Alterações no índice de refração ou de sinal são registados em unidades de ressonância (RU) devido a alterações dos sinais de associação e dissociação de complexos são monitorizados de forma não-invasiva, de forma contínua e em tempo real, cujos resultados são apresentados sob a forma de um sensorgram.

[00507] BiacoreTM T100 (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) foi utilizado para realizar todas as experiências relatadas na presente invenção. Preparação do sensor de superfície e as análises foram realizadas a interação 250C. Reagentes de tampão e Biacore foram adquiridos da GE Healthcare. O tampão de corrida contendo Hepes a 10 mM, pH 7,4 / NaCl a 150 mM, 0,05 % de P20, 0,5 % de BSA foi utilizado ao longo do ensaio.

[00508] O domínio extracelular NRG-1β1 (R & D Systems) foi incubado em gelo durante 45 minutos com o EZ-link Sulfo-NHS-LC-LC- Biotina (Pierce) a uma razão molar de 5 : 1. A reação foi temperada por meio da adição em excesso de etanolamina e biotina desacoplada removida do biotinilado-NRG utilizando colunas de centrifugação (dessalinizar Zeba). Biotinilado-NRG foi capturado sobre um chip sensor CAP pré-imobilizada com aproximadamente 3000 RU de ssDNA-estreptavidina (Biotina kit de captura) para produzir densidades de superfície neuregulina na faixa de 400 a 600 RU A célula de fluxo foi gerada por meio da referência omitindo biotinilado-NRG a partir das etepas de injeção de tal forma que apenas DNA-estreptavidina estava presente na superfície da célula de fluxo.

[00509] Os complexos HER3 / anticorpo foram gerados através da incubação de HER3-Fc humano a 10 nM com as concentrações crescentes (0 a 50 nM) do anticorpo de teste apropriado durante 15 minutos à temperatura ambiente, antes da incubação na BiacoreTM a 10°C. As análises foram realizadas por interação injectando HER3 / anticorpo de referência e os complexos mais neuregulina superfícies em série durante 180 segundos a uma taxa de fluxo de 60 μL / min. O complexo de dissociação foi monitorado durante 180 segundos a uma taxa de fluxo de 60 μL / min. A regeneração da superfície foi realizada no final de cada ciclo de análise utilizando uma injeção de 120 segundo guanidina 8M : NaOH 1 M (3 : 1) seguida por uma segunda injeção de 120 de 30 % de acetonitrila / NaOH a 0,25 M, a uma taxa de fluxo de 30 μL / min.

Exemplo 15 : Estudos in vivo PD

[00510] As células BxPC3 e BT-474 foram cultivadas e implantadas em fêmeas atímicas nu / nu Balb / C fêmeas (Harlan Laboratories) tal como descrito nos Exemplos 16 e 17.

[00511] Uma vez que os tumores tinham atingido um tamanho adequado, os animais foram examinados quanto à qualidade do tumor. Os animais com tumores ulcerados ou animais com tumores cheios de líquido foram excluídos do estudo. Os animais restantes foram doseados por via intravenosa com anticorpos por via de injeção na veia da cauda laterais. Nos pontos de tempo determinados, os animais foram sacrificados por meio de asfixia com CO2 e de sangue total foi recolhido através de punção cardíaca e colocado em um tubo de recolha de 1,5 mL Eppendorf. O tecido do tumor foi imediatamente dissecado, colocado em um tubo de amostra de tampa de rosca de polipropileno e congelados em nitrogênio líquido. O tecido foi armazenado a -80°C até que os lisados foram preparados.

Exemplo 16 : estudos de eficácia in vivo BT-474

[00512] As células BT-474 foram cultivadas em DMEM contendo 10 % de soro inativado por calor fetal bovino sem antibióticos, até o momento da implantação.

[00513] Um dia antes da inoculação das células, as fêmeas atímicas nu / nu Balb / C fêmeas (Harlan Laboratories) foram implantadas subcutaneamente com uma liberação sustentada de pélete 17 β-estradiol (Innovative Research of America), para manter os níveis de estrogênio no soro. Um dia após a implantação do pélete β 17-estradiol, 5 x106 células foram injetadas ortotopicamente na fatpad 4 mamária em uma suspensão contendo 50 % de matrigel isento de vermelho de fenol (BD Biosciences) em solução salina equilibrada de Hank. O volume total de injeção, contendo as células em suspensão foi de 200 μL. 20 dias após implantação de células de animais, com um volume de tumor de aproximadamente 200 mm3 foram inscritos no estudo de eficácia. Em geral, um total de 10 animais por grupo foram incluídos em estudos de eficácia.

[00514] Para o agente único estudos, os animais foram doseados por via intravenosa através de injeção na veia da cauda lateral, com um ou outro ou MOR10701 MOR10703. Uma dose de carga inicial de 40 mg / kg foi administrado durante a primeira dose. Após a dose inicial, os animais estavam em um 20 mg / kg, a cada dois dias cronograma para a duração do estudo. Para os estudos de combinação, os animais foram doseados com ou MOR10701 ou MOR10703 (20mg / kg, iv, q2d) e uma dose sub-óptima de trastuzumab (1mg / kg, iv, 2QW).

[00515] Para a duração dos estudos, o volume do tumor foi medido por calipering duas vezes por semana. Percenetiquetaem de tratamento / controle (T / C) foram calculados usando a seguinte fórmula :
% T / C = 100 '...T / ...C se ...T > 0

[00516] em que :

[00517] T = média do volume do tumor do grupo tratado com fármaco no dia final do estudo;

[00518] ...T = média do volume do tumor do grupo tratado com fármaco no dia final do estudo - volume médio do tumor do grupo tratado com fármaco no dia inicial de dosagem;

[00519] C = média do volume do tumor do grupo de controle no último dia do estudo, e

[00520] ...C = média do volume do tumor do grupo de controle no último dia do estudo - média do volume do tumor do grupo de controle no dia inicial de dosagem.

[00521] O peso corporal foi medido duas vezes por semana e dose foi peso corporal ajustado. A % de alteração no peso corporal foi calculado como (BWcurrent - BWinitial) / (BWinitial) x 100. Os dados são apresentados como porcentagem de mudança de peso corporal ao dia do início do tratamento.

[00522] Todos os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (SEM). Delta volume do tumor e peso corporal foram usados para a análise estatística. Entre os grupos de comparações foram realizadas usando uma ANOVA one-way seguido de um post hoc de Tukey. Para todas as avaliações estatísticas do nível de significância foi estabelecido em p <0,05. Significado em comparação com o grupo de controle do veículo é relatado.

Exemplo 17: Estudos de eficácia in vivo BxPC3

[00523] As células BxPC3 foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 10 % de soro inativado por calor fetal bovino sem antibióticos, até o momento da implantação.

[00524] As fêmeas atímicas nu / nu Balb / C fêmeas (Harlan Laboratories) foram implantadas subcutaneamente com células 10 x106 em uma mistura de 50 % de fosfato de solução salina tamponada com matrigel 50 % . O volume total de injeção, contendo as células em suspensão foi de 200 μL. Uma vez que os tumores tinham atingido aproximadamente 200mm3 em tamanho, os animais foram inscritos no estudo de eficácia. Em geral, um total de 10 animais por grupo foram incluídos nos estudos. Os animais foram excluídos da inscrição se exibissem características incomuns de crescimento do tumor antes da inscrição.

[00525] Os animais foram doseados por via intravenosa através da veia da cauda injeção lateral. Uma dose de carga inicial de 40 mg / kg foi administrado durante a primeira dose. Após a dose inicial, os animais estavam em um 20 mg / kg, em dias alternados programação para o período de duração do estudo (25 dias de tratamento). Os valores do volume do tumor e T / C foram calculadas como anteriormente detalhado.

Exemplo 18 : Ensaios DP in vivo com fosfo-Akt (S473).

[00526] Aproximadamente 50 mm3 do tumor congelado (por exemplo, BT-474 ou BXPC-3) de tecido foi descongelado em gelo e 100 - 300 ul de tampão T-PER (Pierce) contendo fosfatase (Roche) e os inibidores de protease (Roche) foi adicionado a cada amostra. O volume de tampão de lise adicionado estava dependente do tamanho da amostra de tumor. O tecido foi dividido utilizando um pilão de 1,5 ml (Fisher Scientific) e as suspensões resultantes foram incubadas em gelo durante 15 minutos antes de ser congelada durante a noite a -80°C. As amostras foram descongeladas e centrifugadas durante 15 minutos a 13000 g, 4°C, antes da quantificação do teor de proteína sobrenadante por BCA ensaio (Thermo Scientific). Sobrenadantes de tecido foram diluídos com tampão de lise (Mesoscale Discovery) e 25 ug adicionados a um local de 96multi- cavidades Phospho-Akt da placa de carbono (Mesoscale Discovery) que tinha sido previamente bloqueada com solução de bloqueio-A. (Mesoscale Discovery) A placa foi incubada à temperatura ambiente durante uma hora com agitação antes do lisado foi aspirado e as cavidades lavadas quatro vezes com tampão Tris tampão de lavagem (Mesoscale Discovery). Akt fosforilada foi detectada utilizando 25 ul de SULFO-ETIQUETA anti-fosfo-Akt (S473) de anticorpo (Mesoscale Discovery) diluída em tampão de diluição do anticorpo, por meio da incubação com agitação à temperatura ambiente durante uma hora. As cavidades foram lavadas quatro vezes com tampão Tris de lavagem antes da adição de 150 uL de tampão de leitura T (com tensoativo) (Mesoscale Discovery) e o sinal quantificado utilizando um gerador de imagens Sector Mesoscale.

Exemplo 19 : Ensaios in vivo PD com Phospho HER3 (Y1197)

[00527] Aproximadamente 50 mm3 tumor congelado (por exemplo, BXPC-3) de tecido foi descongelada em gelo e 100 - 300 ul de tampão T-PER (Pierce) contendo fosfatase (Roche) e os inibidores da protease (Roche) foi adicionado a cada amostra. O tecido foi dividido utilizando um pilão de 1,5 ml (Fisher Scientific) e as suspensões resultantes foram incubadas em gelo durante 15 minutos antes de ser congelada durante a noite a -80°C. As amostras foram descongeladas e centrifugadas durante 15 minutos a 13000 g, 4°C, antes da quantificação do teor de proteína sobrenadante por BCA ensaio (Thermo Scientific). Sobrenadantes de tecido foram diluídos com tampão de lise e 150 ug adicionados a um local de multi-placa de 96 cavidades de carbono (Mesoscale Discovery) que tinham sido previamente revestidas durante a noite com 4 ug / mL MAB3481 (R & D Systems) e bloqueadas com leite a 3 % . A placa foi incubada à temperatura ambiente durante duas horas com agitação antes do lisado foi aspirada e as cavidades lavadas quatro vezes com tampão Tris de lavagem (Mesoscale Discovery). HER3 fosforilado foi ligado usando anti-HER3 pY1197 diluído a 1 / 8000 com tampão de bloqueio. Após a incubação à temperatura ambiente durante uma hora, os cavidades foram lavados com tampão Tris de lavagem e o anticorpo anti-pY1197 detectada usando S-Etiqueta anticorpo marcado com anti-coelho (Mesoscale Discovery) diluído a 1 / 1000 em tampão de bloqueio, por meio da incubação com agitação à temperatura ambiente durante uma hora. As cavidades foram lavadas quatro vezes com tampão Tris de lavagem antes da adição de 150 ul de 1 / 4 de tampão diluída Leia T (com tensoativo) (Mesoscale Discovery) e o sinal quantificado utilizando um gerador de imagens Sector Mesoscale.

Exemplo 20 : Estudos de combinação de fármacos in vitro

[00528] Para avaliar a capacidade de anticorpos HER3 alvo para combinar com terapias direcionadas MOR09825 ou MOR10703 foram combinados com trastuzumab, lapatinib, BEZ235, BKM120, BYL719, RAD001, erlotinib e cetuximab em ensaios de viabilidade celular. Aproximadamente 1000 a 1500 SK-Br-3 (McCoy), MDA-MB-453 (RPMI), FADU (EMEM) ou L3.3 (RPMI), as células foram semeadas em placas de 384 cavidades em meios de cultura adequados suplementados com 2 % FBS e deixadas aderir durante a noite a 37°C. As combinações de fármacos adequadas (típicas concentrações de droga finais para lapatinib, BKM120 e BYL719 variou de 3μΜ a 13 nM ; para RAD001 variou de 27NM para 0.0041nM ; por erlotinib variou de 1 uM a 0.0025nM ; para MOR1073 variou de 100 nm para 0.01nm ; para cetuximab variou de 100 nM para 0.0015nM, e para o trastuzumab foi de 300 nM para 0.046nM)) foram posteriormente adicionadas aos cavidades de modo a que cada placa continha uma curva de dose-resposta de cada fármaco em uma matriz bidimensional. As placas foram devolvidas ao incubador durante 3 a 6 dias antes de avaliar a viabilidade celular utilizando CellTiter-Glo (Promega). CellTiter-Glo solução foi adicionada a cada cavidade e incubou-se à temperatura ambiente com agitação suave durante 10 minutos. A quantidade de luminescência foi determinada usando um leitor de placa SpectraMax (Molecular Devices). A extensão da inibição do crescimento obtido com cada combinação foi calculada e atividade de combinação realçada usando o modelo de aditividade Loewe.

Exemplo 21 : Estudos de combinação de fármacos in vivo em células L3.3

[00529] As células L3.3 Pancreáticas foram cultivadas em meio DMEM contendo 10 % inativado pelo calor de soro fetal bovino, até o momento da implantação. Foxn1 camundongos nus do sexo feminino (Harlan Laboratories) foram implantados subcutaneamente com células 3 x106 em DMEM isento de FBS. O volume total de injeção, contendo as células em suspensão foi de 100 μL. 12 dias após o implante celular, os animais foram inscritos no estudo de eficácia, com um volume médio do tumor de aproximadamente 100mm3 para todos os grupos. Em geral, um total de 8 animais por grupo foram incluídos nos estudos. Os animais foram excluídos da inscrição se exibissem características incomuns de crescimento do tumor antes da inscrição.

[00530] Os animais foram doseados por via intravenosa com MOR10703 através de injeção na veia da cauda lateral, sobre a 20 mg / kg, em dias alternados programação para o período de duração do estudo (14 dias de tratamento). Erlotinib foi administrado em doses de 50mg / kg (PO) em uma agenda diária, quer seja como um agente único ou em combinação com MOR10703. Os valores do volume do tumor e T / C foram calculadas como anteriormente detalhado.

Resultados e Discussão

[00531] Colectivamente, estes resultados mostram que uma classe de anticorpos ligam-se aos resíduos de aminoácidos dentro do domínio 2 e do domínio 4 de um epítopo conformacional de HER3 e estabiliza HER3 em uma conformação inativa ou fechada. A ligação desses anticorpos inibe tanto a sinalização dependente do ligante e independente do ligante. Estes anticorpos são também capazes de se ligar simultaneamente com um ligante HER3.

Determinação de Afinidade

[00532] Afinidade dos anticorpos foi determinada por meio da titulação da solução de equilíbrio (SET), tal como descrito acima. Os resultados estão resumidos na Tabela 9 e exemplo curvas de titulação para MOR10701 estão contidos na Figura 1. Os dados indicam que um certo número de anticorpos foram identificados que intimamente ligado a HER3 humano, cino, rato e camundongo.
Tabela 9: Valores de KD de anti-HER3 IgGs conforme determinado por meio da titulação de uma solução de equilíbrio (SET). Hu (humano), Ci (cinomolgo), Mu (murino) e ra (rato)

(ii) Determinação EC50 de SK-BR-3 celular

[00533] A capacidade dos anticorpos identificados para se ligar as células que expressam HER3 foi determinada calculando os valores de EC50 para a sua ligação com a linhagem celular de HER2 amplificado SK-Br-3 (vide Figura 2 e Tabela 10).
Tabela 10: valores de EC50 de FACS de IgG anti-HER3 em células SK-BR-3. n.d. (não determinado)

(Iii) Domínio de ligação de HER3

[00534] Um subconjunto de anticorpos anti-HER3 foi caracterizado pela sua capacidade de se ligar os vários domínios extracelulares de HER3 humano em um ensaio de ELISA. Para alcançar este objetivo, o domínio extracelular de HER3 foi dividido nos seus quatro domínios constitutivos e várias combinações destes domínios foram clonados, expressos e purificados como proteínas independentes, tal como descrito acima. Usando esta estratégia, os domínios que se seguem foram gerados com sucesso como proteínas solúveis : domínios 1 e 2 (D1-2), do domínio 2 (D2), os domínios 3 e 4 (D3-4) e do domínio 4 (D4). Um certo número de Anticorpos HER3 gerados internamente de rato anti-humano (8D7, 1F5 e 8P2) também foram testados como controles positivos para demonstrar a integridade de cada domínio isolado.

[00535] Como mostrado na Figura 3 e MOR09823 MOR09825 foram observados tanto para se ligar com sucesso o domínio extracelular HER3, mas pouca ligação aos domínios isolados foi observada neste ensaio com estes anticorpos. Há várias explicações possíveis para esse padrão de ligação :

[00536] a) MOR09823 e MOR09825 pode ligar um epítopo linear que abrange um limite de domínio, portanto, parte do epítopo de ligação seria perdida quando os domínios foram expressos como proteínas isoladas.

[00537] b) MOR09823 e MOR09825 pode ligar um epítopo não linear que liga vários domínios. Consequentemente, a separação de HER3 em suas unidades componentes podem destruir o local de ligação.

[00538] c) A forma / conformação de HER3 pode ser um componente da ligação de MOR09823 e MOR09825 para HER3 de tal modo que apenas o domínio de comprimento completo extracelular de HER3 é capaz de adoptar esta forma / conformação, enquanto que os domínios isolados não podem assumir totalmente esta conformação.

(Vi) Mapeamento de Epítopos HER3 no uso da Espectrometria de Massa de troca de hidrogênio / deutério

[00539] O epítopo de HER3 foi explorado por meio da análise HDX-MS de HER3 ECD, na presença e ausência de versões de Fab MOR09823, MOR09824, MOR09825 e MOR09974. A Figura 4A mostra que, na ausência de Fab ligado, aproximadamente 69 % da sequência de HER3 ECD foi coberta por pelo menos um peptídeo. Lacunas de cobertura podem ser devidas a glicosilação de resíduos dentro dessas regiões ou redução insuficiente de ligações dissulfureto cisteína nas regiões ricas, o que é particularmente evidente no domínio 2. Curiosamente, apesar de cada Fab produziram padrões de proteção individual, uma região de forte proteção foi observada de forma consistente com MOR09823, MOR09824, MOR09825 e MOR09974 (ver Figura 4B), indicando que estes família altamente relacionado de anticorpos ligam-HER3 de uma maneira idêntica. A mais forte foi observada para a proteção do domínio 2 resíduos 269-286 (TFQLEPNPHTKYQYGGVC) (SEQ ID NO : 146), indicando que os resíduos nessa proximidade pode ser importante para a ligação do mAb. Mapeamento dos resíduos Fab protegido para a estrutura cristalina publicada HER3 (Cho & Leahy, (2002) Science 297 : 1330 a 1333) salienta que os 269 a 286 resíduos estão dentro e proximal de um loop funcionalmente β-hairpin importante dentro do domínio 2 (vide Figura 4C).

(Vii) a estrutura HER3 / MOR09823 cristal

[00540] A resolução 3.2A estrutura de cristal de raios-x de MOR09823 do fragmento Fab ligado ao domínio extracelular HER3 foi resolvido para definir melhor o epítopo de HER3, que é reconhecido por esta família de anticorpos relacionados (vide Figura 5A). Além disso, a estrutura de MOR09825 3.4a do fragmento Fab ligado a HER3 humano foi resolvido. Em ambos os MOR09823 / HER3 e MOR09825 / HER3 estruturas cristalinas, HER3 é na conformação (inativo) tethered (ver Figura 5A, B, C e D). Esta conformação é caracterizado por uma interface de interação significativa entre os domínios 2 e 4, mediada por um circuito de dimerização β-hairpin no domínio 2. A conformação observada de HER3 é semelhante ao anteriormente descrito por Cho et al. (Cho & Leahy, (2002), Science 297 : 1330 a 1333), que publicou a estrutura cristalina do domínio extra-celular HER3 na ausência de neuregulina. Desde neuregulina pode ativar HER3, a conformação de tethered HER3 se presume ser inativa. As conformações semelhantes cativas também foram observadas quando os membros da família relacionados EGFR HER4 (Bouyain et al., (2005) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S., 102 : 15024 a 15029) e HER1 (Ferguson et al., (2003) Molec. Cell 11 : 507 a 517) foram cristalizados.

[00541] As relações espaciais entre os domínios 1 a 4 de HER3 no estado (tethered) inativos são significativamente diferente da do Estado (ativo) estendido. Esta conclusão baseia-se nas estruturas cristalinas de membros relacionados da família do EGFR e HER2-ligante ligado HER1 (Cho et al, (2003) Nature 421 : 756 a 760; . Ogiso et al, (2002) Cell 110 : 775 a 787, Garrett et al, (2002) Cell 110 : 763 a773) ambos os quais estão em um estado (ativo) estendida. No estado estendido, o domínio de dimerização do loop 2 β-hairpin é libertado da sua interação inibitória com 4 e é, portanto, livre para interagir com os seus parceiros proteínas de dimerização. Dessa maneira, o domínio de dimerização ciclo 2 β-hairpin é funcionalmente importante tanto para a manutenção do estado (inativo) tethered e na mediação de dimerização de receptores de EGF no seu estado estendido, conduzindo à ativação do domínio quinase intracelular. As estruturas cristalinas MOR09823 / HER3 e MOR09825 / HER3 (vide Figura 5), portanto, sugerem que a função tanto MOR09823 e MOR09825, estabilizando a conformação inativa do HER3.

[00542] A estrutura cristalina revelou também que o epítopo reconhecido por ambos HER3 e MOR09823 MOR09825 é um epítopo não linear que inclui os resíduos de ambos os domínios 2 e 4 (vide a Figura 5C e D, Tabelas 11, 12, 13 e 14). O epítopo reconhecido por HER3 esta família de anticorpos altamente relacionados podem, portanto, ser definido como :

[00543] Domínio 2 : 265 a 277, 315resíduos

[00544] Domínio 4 : 571,582 a 584, 596 a 597, 600 a 602, 609 a 615 resíduos

[00545] A ligação de ambos os dois domínios e 4 por MOR09823 ou MOR09825, por consequência, a estabilizar a conformação tethered de HER3 assim antoganizam a sua capacidade para sinalizar.

[00546] O modo de ligação MOR09823 / MOR09825 observado na estrutura cristalina é consistente com os nossos estudos de mapeamento de epítopos de outros. Especificamente, as experiências de ELISA do domínio de ligação mostram que a afinidade de MOR09823 e MOR09825 são significativamente maiores para a proteína extracelular intacto HER3 do que para quaisquer domínios isolados (por exemplo, D1, D1-D2, D3, D4 ou D3-fragmentos) (ver Figura 3) . Há também acordo com a HDX-MS HER3 de dados (vide Figura 4B), o qual identifica o domínio 2 β-hairpin como parte do reconhecimento do epítopo do anticorpo. Finalmente, ambas as estruturas cristalinas indicam que a superfície de ligação ao ligante de HER3, que foi mapeado por analogia com HER1 para os domínios 1 e 3 (Ogiso et al, (2002) Cell, 110 : 775 a 787, Garrett et al, (2002) Cell, 110 : 763 a 773), não é obstruído por meio de qualquer ligação MOR09823 ou MOR09825 (vide Figura 5B). Isto é consistente com as nossas constatações de que nem MOR09823 nem MOR09825 neuregulina no bloco de ligação de células MCF7 (vide Figura 9), e que complexos HER3 / MOR09823 podem ligar-se a neuregulina imobilizada em estudos BIAcore (vide Figura 10).
Tabela 11: Interações entre MOR09823 de cadeia pesada Fab e HER3 humana. Resíduos de VH de Fab são numerados com base na sua sequência de aminoácido linear (SEQ ID NO : 15). Os resíduos HER3 estão numerados com base NP_001973. Resíduos HER3 mostrados possuem pelo menos um átomo no interior 5a de um átomo no Fab MOR09823.

Tabela 12: nterações entre MOR09823 de cadeia leve Fab e HER3 humana. Resíduos de Fab VL são numerados com base na sua sequência de aminoácido linear (SEQ ID NO : 14). Resíduos HER3 estão numerados com base NP_001973. Resíduos HER3 mostrados possuem pelo menos um átomo no interior 5a de um átomo no Fab MOR09823.

Tabela 13: Interações entre MOR09825 de cadeia pesada Fab e HER3 humana. Resíduos de VH de Fab são numerados com base na sua sequência de amino ácido linear (SEQ ID NO : 51). Resíduos HER3 estão numerados com base NP_001973. Resíduos HER3 mostrados possuem pelo menos um átomo no interior 5a de um átomo no Fab MOR09825.

Tabela 14: nterações entre MOR09825 de cadeia leve Fab e HER3 humana. Resíduos de Fab VL são numerados com base na sua sequência de amino ácido linear (SEQ ID NO : 50). Resíduos HER3 estão numerados com base NP_001973. Resíduos HER3 mostrados possuem pelo menos um átomo no interior 5a de um átomo no Fab MOR09825.

[00547] A inspeção visual das estruturas MOR09823 / MOR09825 de cristal realçaram os Resíduos HER3 Lys267 Leu268 formados de múltiplas interações com os vários anticorpos CDR, sugerindo que possam ser importantes para a ligação do anticorpo. Consequentemente, Lys267 e/ou Leu268 foram mutados para alanina, expressos e as proteínas recombinantes purificadas resultantes, a fim de avaliar o seu impacto sobre a ligação de anticorpos. Ensaios de ELISA de ligação indicaram que a mutação de Lys267 ou Leu268 ou abolido MOR10703 ligação a HER3 (Figura 5F), sugerindo que ambos os resíduos são uma parte integrante do epítopo HER3 e suportando assim as interações entre as propostas MOR09823 / MOR09825 e HER3.

(viii) A inibição da sinalização da célula

[00548] Para determinar o efeito de anticorpos anti-HER3 sobre atividade dependentes de ligantes HER3 de MCF7, as células foram incubadas com IgG antes da estimulação com neuregulina. As curvas de inibição de exemplo são ilustradas na Figura 6A e resumidos na Tabela 15. O efeito de Anticorpos HER3 anti-HER2 mediante a ativação mediada HER3 também foi estudado usando a linhagem celular de HER2 amplificado SK-Br-3 (Figura 6B e Tabela 15).
Tabela 15: pHER3 IC50 e extensão dos valores de inibição de anticorpos anti-IgG de HER3 em células MCF7 e SK-BR-3.

[00549] Para determinar se a inibição da atividade de HER3 impactou a jusante da célula de sinalização Akt, a fosforilação foi determinada em células de HER2 amplificada após o tratamento com anti-Anticorpos HER3 (vide Figura 7 e Tabela 16).
Tabela 16: IC50 pAkt (S473) e extensão dos valores de inibição de anticorpos anti-HER3 IgG em 3-SK-Br BT-474 e células MCF7.

[00550] Em resumo MOR09823, MOR09824, MOR09825, MOR09974, MOR10701, MOR10702 MOR10703, MOR12609 e MOR12610 são cada um capaz de inibir a atividade de HER3 celular tanto em forma de um dependente do ligante e independente do ligante.

(ix) Inibição da proliferação

[00551] Desde MOR09823, MOR09824, MOR09825, MOR09974, MOR10701, MOR10702 e MOR10703 todo inibida HER3 e atividade a jusante de sinalização eles foram testados quanto à sua capacidade para bloquear o dedependente do ligante e independente in vitro o crescimento de células (dados de exemplo é mostrado na figura 8 e resumidos na Tabela 17). Os anticorpos anti-HER3 testados foram todos os inibidores eficazes da proliferação de células.
Tabela 17: Inibição da proliferação após tratamento com 10 ug / ml de IgG anti-HER3 em 3-SK-Br, BT-474 e células MCF7.

(X) Avaliação de ligante de bloqueio

[00552] A capacidade dos anticorpos anti-HER3 descritos para bloquear a ligação do ligante foi determinada examinando-se a ligação de neuregulina para células MCF7 previamente tratadas com qualquer MOR09823 ou MOR09825. A presença de um ou outro ou MOR09823 MOR09825 não teve nenhum efeito significativo sobre a capacidade de se ligar a células MCF7 neuregulina, enquanto que o controle positivo utilizado na experiência (Mab3481) foi capaz de interferir com a ligação neuregulina profundamente (vide Figura 9). Estes resultados são consistentes com a estrutura de cristal desde MOR09823 interage com os domínios 2 e 4 enquanto que os pontos de contacto principais de interação com HER3 neuregulina são hipoteticamente para ser principalmente agrupadas dentro de domínios 1 e 3. Dado que a neuregulina é capaz de se ligar a conformação inativa de HER3 (Kani et al, (2005) Biochemistry 44 : . 15842 a 15857), é provável que a função MOR09823 e MOR09825 impediu os rearranjos de domínio HER3 necessários para a sinalização ou por interferência com o receptor dimerização.

(Xi) Avaliação de ligante de bloqueio (bioquímico)

[00553] Para explorar se MOR09823 e neuregulina pode ligar HER3 simultaneamente um ensaio bioquímico foi criado usando a tecnologia BiacoreTM. As análises foram realizadas por meio da interação da captura de neuregulina biotinilada na superfície de um chip de sensor de CAP BiacoreTM (GE Healthcare) utilizando um kit de captura de biotina (GE Healthcare). Os complexos HER3 foram gerados através da incubação humano HER3-Fc com concentrações crescentes de qualquer MOR09823, 105,5 (Thermo Scientific) ou IgG humana. Complexos pré-formados HER3 / anticorpo foram injetados mais de referência e superfícies ativas e da interação de HER3 com neuregulina observado.

[00554] IgG de controle não teve nenhum efeito sobre a HER3 / neuregulina da formação do complexo, enquanto foi observado 105,5 para inibir significativamente a capacidade de se ligar HER3 a neuregulina confirmando a sua descrição como um anticorpo do ligante de bloqueio (Figura 10). Em contraste, os complexos HER3 / MOR09823 foram capazes de demonstrar que a neuregulina ligação MOR09823 não impede a ligação do ligante. Curiosamente, um aumento dependente da dose dos valores de RU foi exclusivamente observado aos complexos MOR09823 / HER3 foram injetados. Estes dados indicam que um complexo trimérico contendo neuregulina, HER3 e MOR09823 é gerada na superfície do chip. A capacidade deste complexo trimérico a forma é previsto pela estrutura cristalina HER3 / MOR09823 desde MOR09823 ligação não ocluir o local de ligação do ligante de HER3, sugerindo que a ligação da neuregulina e MOR09823 não são mutuamente exclusivas.

[00555] Em uma outra modalidade, o anticorpo ou um fragmento do mesmo liga-se tanto domínio 2 e do domínio 4 de HER3 e sem bloquear a ligação simultânea de um ligante tal como a neuregulina HER3. Embora não seja necessário para proporcionar uma teoria, é possível que o anticorpo ou um fragmento do mesmo de ligação para o domínio 2 e do domínio 4 de HER3, HER3 prende em uma conformação inativa, sem bloquear o local de ligação do ligante em HER3. Dessa maneira, um ligante de HER3 (por exemplo, neuregulina) é capaz de se ligar a HER3, ao mesmo tempo que o anticorpo.

[00556] Os anticorpos da presente invenção ou os fragmentos dos mesmos, inibem tanto a ativação do dedependente do ligante e independente de HER3, sem impedir a ligação do ligante. Isto é considerado vantajoso por meio das seguintes razões :

[00557] (I) O anticorpo terapêutico terá utilidade clínica de um largo espectro de tumores do que um anticorpo que alvo de um único mecanismo de HER3 ativação (isto é, ligante independente ou dedependente do ligante), uma vez que distintos tipos de tumores são acionados por meio de cada mecanismo.

[00558] (Ii) O anticorpo terapêutico seria eficaz em tipos de tumores em que ambos os mecanismos de ativação HER3 são simultaneamente envolvidos. Um anticorpo como alvo um único mecanismo de ativação de HER3 (isto é, dedependente do ligante ou independente do ligante) que exibem pouca ou nenhuma eficácia nestes tipos de tumores

[00559] (Iii) A eficácia de um anticorpo que inibe a ativação dependente do ligante de HER3, sem impedir a ligação do ligante seriam menos susceptíveis de serem adversamente afetados por meio das concentrações crescentes de ligante. Tal implica, quer maior eficácia, em um tipo de tumor impulsionado por meio das concentrações muito elevadas de HER3 ligante ou uma resistência reduzida de fármacos, onde a resistência é mediada por sobre-regulação de Ligantes HER3.

[00560] (Iv) um anticorpo que inibe a ativação por HER3 estabiliza a forma inativa que seria menos propensa à resistência a medicamentos acionados por meio dos mecanismos alternativos de ativação de HER3.

[00561] Consequentemente, os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados para tratar as condições em que os anticorpos terapêuticos existentes são clinicamente ineficazes.

(Xii) A inibição in vivo da atividade de HER3 e efeito sobre o crescimento do tumor

[00562] Para determinar a atividade in vivo dos descritos anticorpos anti-HER3, MOR09823 foi testado em ambos BxPC-3 e BT-474 modelos de tumores. MOR09823, foi demonstrado que inibe a atividade de HER3 como evidenciado por meio de uma redução significativa dos níveis de tumor pHER3 (Figura 11). A jusante de sinalização de HER3 foi inibida de forma semelhante, como demonstrado pelos níveis reduzidos de ambos pAkt BxPC-3 e BT-474 (Figura 11). Em um estudo de eficácia BT-474 orientado HER2, o tratamento repetido MOR10701 produziu uma inibição de 74 % do crescimento do tumor (ver a Figura 12A), enquanto MOR10703 produziu 83 % de inibição. No modelo de tumor de crescimento BxPC3, tanto MOR10703 e MOR10701 inibiram muito eficazmente o crescimento do tumor ligante dirigido (vide Figura 13).

(Xiii) A combinação de fármacos in vitro e impacto sobre o crescimento celular.

[00563] Uma vez que o crescimento de células tumorais é muitas vezes dirigido por meio das múltiplas vias de sinalização foi avaliado se as combinações de MOR09823 ou MOR10703 com vários agentes alvo seria de benefício no bloqueio da proliferação celular. Os agentes direcionados escolhidas principalmente inibida HER2 (trastuzumab, lapatinib) EGFR (cetuximab, erlotinib), PI3K / mTOR (BEZ235), PI3K (BKM120), PIK3CA (BYL719) e mTOR (RAD001) uma vez que estes alvos são normalmente ativados em tumores humanos. A análise de Isobolograma (vide Figura 14) indicou que MOR09823 e MOR10703 exibiu as combinações sinérgicas de fármacos com trastuzumab, lapatinib, erlotinib, o cetuximab, BEZ235, BKM120, BYL719 e RAD001. Estes dados sugerem que a inibição da sinalização de HER3 é particularmente vantajosa para os inibidores que têm como alvo receptores tirosina-quinase ou a via de sinalização de PI3K.

(Xiv) Combinações de fármacos MOR10703 in vivo

[00564] Uma vez que a inibição de HER3 combinou com os agentes do receptor tirosina quinase alvo in vitro, foi avaliado o impacto de qualquer MOR10701 ou MOR10703 em combinação com trastuzumab e erlotinib in vivo. BT-474 em xenoenxertos (vide Figura 15A), a combinação de um ou outro ou MOR10701 MOR10703 (20mg / kg) com uma dose sub-óptima de trastuzumab (1mg / kg) foi suficiente para induzir a regressão do tumor (T / C % = -50 e -37, respectivamente). Em L3.3 xenoenxertos pancreáticas, combinação de MOR10703 (20mg / kg) com diária erlotinib (50mg / kg) resultou em estase tumoral ( % T / C 15B = 3, ver figura). Em ambos os modelos, a combinação dos dois medicamentos foi significativamente mais eficaz do que qualquer um dos fármacos sozinhos apoiando assim a nossa anterior in vitro encontrando do benefício de combinar anticorpos HER3-alvo com os agentes ErbB alvo.

[00565] Em resumo, a capacidade única desta família de anticorpos para estabilizar a conformação inativa de HER3 resulta em significativa eficácia in vivo em modelos onde HER3 é ativada em qualquer um ligante de uma forma dependente ou independente. Além disso, a inibição HER3 por esta família de anticorpos parece benéfica em combinação com uma ampla variedade de terapias específicas.

Incorporação por referência

[00566] Todas as referências na presente invenção citadas, incluindo as patentes, aplicações de patentes, papéis, livros e similares, e nas referências aí citadas, na medida em que elas já não estão, são incorporados na presente invenção por referência na sua totalidade.

Equivalentes

[00567] A especificação escrita anterior é considerada suficiente para permitir que um versado na técnica pratique a presente invenção. A descrição anterior e os exemplos em detalhe de certas modalidades preferidas da presente invenção e descrevem o melhor modo contemplado pelos inventores. Será apreciado, no entanto, que não importa quão detalhado o que precede pode aparecer no texto, a presente invenção pode ser praticada de muitas maneiras, e a presente invenção deve ser interpretada de acordo com as reivindicações anexas e todos os seus equivalentes.

Claims

Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao receptor HER3, caracterizado pelo fato de que compreende sequências selecionadas do grupo que consiste em
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 2; CDR2 da SEQ ID NO: 3; CDR3 da SEQ ID NO: 4; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 5; CDR2 da SEQ ID NO: 6; e CDR3 da SEQ ID NO: 7;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 20; CDR2 da SEQ ID NO: 21; CDR3 da SEQ ID NO: 22; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 23; CDR2 da SEQ ID NO: 24; e CDR3 da SEQ ID NO: 25;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 38; CDR2 da SEQ ID NO: 39; CDR3 da SEQ ID NO: 40; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 41; CDR2 da SEQ ID NO: 42; e CDR3 da SEQ ID NO: 43;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 56; CDR2 da SEQ ID NO: 57; CDR3 da SEQ ID NO: 58; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 59; CDR2 da SEQ ID NO: 60; e CDR3 da SEQ ID NO: 61;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 74; CDR2 da SEQ ID NO: 75; CDR3 da SEQ ID NO: 76; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 77; CDR2 da SEQ ID NO: 78; e CDR3 da SEQ ID NO: 79;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 92; CDR2 da SEQ ID NO: 93; CDR3 da SEQ ID NO: 94; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 95; CDR2 da SEQ ID NO: 96; e CDR3 da SEQ ID NO: 97;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 110; CDR2 da SEQ ID NO: 111; CDR3 da SEQ ID NO: 112; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 113; CDR2 da SEQ ID NO: 114; e CDR3 da SEQ ID NO: 115;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 128; CDR2 da SEQ ID NO: 129; CDR3 da SEQ ID NO: 130; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 131; CDR2 da SEQ ID NO: 132; e CDR3 da SEQ ID NO: 133;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 146; CDR2 da SEQ ID NO: 147; CDR3 da SEQ ID NO: 148; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 149; CDR2 da SEQ ID NO: 150; e CDR3 da SEQ ID NO: 151;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 164; CDR2 da SEQ ID NO: 165; CDR3 da SEQ ID NO: 166; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 167; CDR2 da SEQ ID NO: 168; e CDR3 da SEQ ID NO: 169;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 182; CDR2 da SEQ ID NO: 183; CDR3 da SEQ ID NO: 184; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 185; CDR2 da SEQ ID NO: 186; e CDR3 da SEQ ID NO: 187;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 200; CDR2 da SEQ ID NO: 201; CDR3 da SEQ ID NO: 202; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 203; CDR2 da SEQ ID NO: 204; e CDR3 da SEQ ID NO: 205;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 218; CDR2 da SEQ ID NO: 219; CDR3 da SEQ ID NO: 220; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 221; CDR2 da SEQ ID NO: 222; e CDR3 da SEQ ID NO: 223;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 236; CDR2 da SEQ ID NO: 237; CDR3 da SEQ ID NO: 238; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 239; CDR2 da SEQ ID NO: 240; e CDR3 da SEQ ID NO: 241;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 254; CDR2 da SEQ ID NO: 255; CDR3 da SEQ ID NO: 256; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 257; CDR2 da SEQ ID NO: 258; e CDR3 da SEQ ID NO: 259;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 272; CDR2 da SEQ ID NO: 273; CDR3 da SEQ ID NO: 274; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 275; CDR2 da SEQ ID NO: 276; e CDR3 da SEQ ID NO: 277;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 290; CDR2 da SEQ ID NO: 291; CDR3 da SEQ ID NO: 292; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 293; CDR2 da SEQ ID NO: 294; e CDR3 da SEQ ID NO: 295;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 308; CDR2 da SEQ ID NO: 309; CDR3 da SEQ ID NO: 310; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 311; CDR2 da SEQ ID NO: 312; e CDR3 da SEQ ID NO: 313;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 326; CDR2 da SEQ ID NO: 327; CDR3 da SEQ ID NO: 328; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 329; CDR2 da SEQ ID NO: 330; e CDR3 da SEQ ID NO: 331;
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 344; CDR2 da SEQ ID NO: 345; CDR3 da SEQ ID NO: 346; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 347; CDR2 da SEQ ID NO: 348; e CDR3 da SEQ ID NO: 349; e
uma região variável de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 362; CDR2 da SEQ ID NO: 363; CDR3 da SEQ ID NO: 364; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 365; CDR2 da SEQ ID NO: 366; e CDR3 da SEQ ID NO: 367.
Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao receptor HER3, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variavel de cadeia pesada CDR1 da SEQ ID NO: 128; CDR2 da SEQ ID NO: 129; CDR3 da SEQ ID NO: 130; uma região variável de cadeia leve CDR1 da SEQ ID NO: 131; CDR2 da SEQ ID NO: 132; e CDR3 da SEQ ID NO: 133.
Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao receptor HER3, caracterizado pelo fato de que compreende sequências selecionadas do grupo que consiste em
uma VH compreendendo SEQ ID NO: 15 e uma VL compreendendo SEQ ID NO: 14;
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 33 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 32;
uma VH compreendendo SEQ ID NO: 51 e uma VL compreendendo SEQ ID NO: 50;
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 69 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 68;
uma VH compreendendo SEQ ID NO: 87 e uma VL compreendendo SEQ ID NO: 86;
uma VH compreendendo SEQ ID NO: 105 e uma VL compreendendo SEQ ID NO: 104;
uma VH compreendendo SEQ ID NO: 123 e uma VL compreendendo SEQ ID NO: 122;
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 141 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 140;
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 159 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 158;
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 177 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 176;
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 195 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 194;
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 213 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 212;
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 231 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 230;
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 249 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 248;
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 267 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 266;
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 285 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 284;
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 303 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 302;
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 321 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 320;
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 339 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 338;
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 357 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 356; e
uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 375 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 374.
Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma VH compreendendo a SEQ ID NO: 141 e uma VL compreendendo a SEQ ID NO: 140.
Um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência variável da cadeia pesada tendo a SEQ ID NO: 493 e uma sequência variável da cadeia leve tendo a SEQ ID NO: 494.
Fragmento isolado de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o fragmento é selecionado do grupo que consiste em Fab, F (ab2) 'e scFv.
Composição farmacêutica para o tratamento de câncer, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a6, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente terapêutico adicional.
Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um inibidor de HER1 selecionado do grupo que consiste em Matuzumab (EMD72000), Erbitux® / Cetuximab, Vectibix® / Panitumumab, mAb 806, Nimotuzumab, Iressa® / Gefitinib, CI-1033 (PD183805), Lapatinib (GW-572016), Tykerb® / Ditosilato de Lapatinib, Tarceva® / Erlotinib HCL (OSI-774), PKI-166 e Tovok®; um inibidor de HER2 selecionado do grupo que consiste em Pertuzumab, Trastuzumab, MM-111, neratinibe, lapatinibe ou lapitosibe ou ditosilato de lapatinibe / Tykerb®; um inibidor de HER3 selecionado do grupo que consiste em, MM-121, MM-111, IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203 (Aveo), MEHD7945A (Genentech) e pequenas moléculas que inibem HER3; ou um inibidor de HER4.
Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um inibidor de HER2.
Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um inibidor de HER2 selecionado do grupo que consiste em Pertuzumab, Trastuzumab, MM-111, neratinibe, lapatinibe ou ditosilato de lapatinibe.
Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um inibidor de mTOR selecionado do grupo que consiste em Temsirolimus, ridaforolimus e everolimus.
Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um inibidor da PI3 quinase selecionado do grupo que consiste em GDC 0941, BEZ235, BMK120 e BYL719.
Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que é para o tratamento de um câncer mediado por uma transdução de sinal dependente de ligante de HER3 ou via de transdução de sinal independente de ligante selecionada do grupo que consiste em câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão, mieloma múltiplo, câncer de ovário, câncer de fígado, gástrico câncer, câncer de pâncreas, câncer de próstata, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, osteossarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores de bainha de nervo periférico, schwannoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de esôfago, glioblastoma, sarcoma de células moles de tecidos moles, maligno mesotelioma, neurofibromatose, câncer renal e melanoma, compreendendo um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1-5.
Composição farmacêutica para o tratamento de um câncer, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno com VH da SEQ ID NO: 141 e VL da SEQ ID NO: 140.
Uso de anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1-5, ou de uma composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 15, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um câncer mediado por uma transdução de sinal dependente de ligante de HER3 ou via de transdução de sinal independente de ligante selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão, mieloma múltiplo, câncer de ovário, câncer de fígado, gástrico câncer, câncer de pâncreas, câncer de próstata, leucemia mielóide aguda, leucemia mieloide crônica, osteossarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores de bainha de nervo periférico, schwannoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de esôfago, glioblastoma, sarcoma de células moles de tecidos moles, maligno mesotelioma, neurofibromatose, câncer renal e melanoma.