KR20140130751A

KR20140130751A - 항-ｈｅｒ3 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20140130751A
Application number: KR20147029079A
Authority: KR
Inventors: 비르짓 보쎈마이에르; 니콜라오스 디무디스; 토마스 프리에쓰; 구이 게오르게스; 이렌 콜름; 한스-윌리 크렐; 발레리아 리프케; 에케하르드 모에쓰네르
Original assignee: 로슈 글리카트 아게
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2014-11-11
Also published as: US20110171222A1; CY1117563T1; US20140377272A1; HK1175183A1; CL2012001649A1; NZ600262A; UA107821C2; PL2516469T3; RS54795B1; US10196456B2; SI2516469T1; CA2782571A1; SG181894A1; TW201130510A; US8859737B2; IL220162A0; JP2013514793A; IL220162A; AR079551A1; HUE029026T2

Abstract

본 발명은 인간 HER3(항-HER3 항체)에 결합하는 항체, 이의 제조 방법, 상기 항체를 포함하는 약학 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

항-ＨＥＲ3 항체 및 이의 용도{ANTI-HER3 ANTIBODIES AND USES THEREOF}

본 발명은 인간 HER3에 결합하는 항체(항-HER3 항체), 이들의 제조 방법, 상기 항체를 포함하는 약학 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.

인간 HER3(ErbB-3, ERBB3, c-erbB-3, c-erbB3, 수용체 티로신-단백질 키나아제(kinase) erbB-3, 서열 번호 17)은, HER1(EGFR로도 공지됨), HER2, 및 HER4를 또한 포함하는 수용체 티로신 키나아제의 표피 성장 인자 수용체(EGFR: epidermal growth factor receptor)의 구성원을 코딩한다(Kraus, M.H. et al, PNAS 86 (1989) 9193-9197; Plowman, G.D. et al, PNAS 87 (1990) 4905-4909; Kraus, M.H. et al, PNAS 90 (1993) 2900-2904). 원형적 표피 성장 인자 수용체와 유사하게, 막간 수용체 HER3은 세포외 리간드-결합 도메인(ECD: extracellular ligand-binding domain), ECD 내의 이량체화 도메인, 막간 도메인, 세포내 단백질 티로신 키나아제 도메인(TKD: tyrosyine kinase domain) 및 C-말단 인산화 도메인으로 구성된다. 이러한 막-결합된 단백질은 HER3 헤레굴린(HRG: Heregulin) 결합 도메인을 활성 키나아제 도메인이 아닌 세포외 도메인에 갖는다. 따라서 이는 상기 리간드에 결합할 수 있지만 단백질 인산화를 통해 세포내로 신호를 수송할 수 없다. 그러나, 이는 키나아제 활성을 갖는 다른 HER 계열 구성원과 이종이량체를 형성한다. 이종이량체는 수용체-중재된 신호전달 경로의 활성화 및 그의 세포내 도메인의 인산전이반응을 유도한다. HER 계열 구성원 간의 이량체 형성은 HER3의 신호전달 가능성을 확장시키고, 이는 신호 다양화 뿐만 아니라 신호 증폭을 위한 수단이다. 예를 들면 HER2/HER3 이종이량체는 HER 계열 구성원 사이에서 PI3K 및 AKT 경로를 통해 가장 중요한 미토겐성 신호중 하나를 유도한다(Sliwkowski M.X., et al, J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665; Alimandi M, et al, Oncogene. 10 (1995) 1813-1821; Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276 (2001) 42153-4261; Singer, E., J. Biol. Chem. 276 (2001) 44266-44274; Schaefer, K.L., Neoplasia 8 (2006) 613-622).

이러한 유전자의 증폭 및/또는 그의 단백질의 과발현은 전립선암, 방광암 및 유방암을 비롯한 다수의 암에서 보고되고 있다. 상이한 이소형(isoform)을 코딩하는 교대 전사 스플라이스(alternate transcriptional splice) 변형체가 특징화되어 있다. 하나의 이소형은 막간 영역이 결핍되어 있고, 세포 밖으로 분비된다. 이러한 형태는 막-결합된 형태의 활성을 조율하는 작용을 한다. 추가의 스플라이스 변형체가 또한 보고되어 있지만, 이들은 완벽히 특징화되지 않았다.

국제 특허출원 공개공보 WO 제97/35885호는 HER3 항체에 관한 것이다. 국제 특허출원 공개공보 WO 제2003/013602호는 HER 항체를 비롯한 HER 활성의 저해제에 관한 것이다. 국제 특허출원 공개공보 WO 제2007/077028호 및 WO 제2008/100624호는 HER3 항체에 관한 것이다.

본 발명은 중쇄 가변성 도메인이 서열 번호 1의 CDR3H 영역, 서열 번호 2의 CDR2H 영역, 및 서열 번호 3의 CDR1H 영역을 포함하고, 경쇄 가변성 도메인이 서열 번호 4의 CDR3L 영역, 서열 번호 5의 CDR2L 영역, 및 서열 번호 6의 CDR1L 영역 또는 서열 번호 7의 CDR1L 영역을 포함함을 특징으로 하는, 인간 HER3에 결합하는 항체를 포함한다.

본 발명은 추가로 중쇄 가변성 도메인 VH가 서열 번호 8이고; 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 9이거나, 또는 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 10이거나, 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 11이거나, 또는 이의 인간화된 형태임을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체를 포함한다.

본 발명은 추가로 서열 번호 1의 CDR3H 영역, 서열 번호 2의 CDR2H 영역, 및 서열 번호 3의 CDR1H 영역을 포함하는 중쇄 가변성 도메인, 및 서열 번호 4의 CDR3L 영역, 서열 번호 5의 CDR2L 영역, 및 서열 번호 6의 CDR1L 영역을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하는 항체를 포함한다.

본 발명은 추가로 서열 번호 8의 중쇄 가변성 도메인 VH; 및 서열 번호 9 또는 서열 번호 11의 경쇄 가변성 도메인 VL을 포함하는 항체를 포함한다.

본 발명은 추가로 서열 번호 1의 CDR3H 영역, 서열 번호 2의 CDR2H 영역, 및 서열 번호 3의 CDR1H 영역을 포함하는 중쇄 가변성 도메인, 및 서열 번호 4의 CDR3L 영역, 서열 번호 5의 CDR2L 영역, 및 서열 번호 7의 CDR1L 영역을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하는 항체를 포함한다.

본 발명은 추가로 서열 번호 8의 중쇄 가변성 도메인 VH; 및 서열 번호 10의 경쇄 가변성 도메인 VL을 포함하는 항체를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 인간 HER3에 결합하는 항체를 제공하고, 여기서 항체는 서열 번호 8에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변성 도메인 VH, 및 서열 번호 9, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 11에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.

한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 항체가 단일클론성임을 특징으로 한다.

한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 항체가 인간화됨을 특징으로 한다.

한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 항체가 IgG1, 또는 IgG4 하위부류의 항체임을 특징으로 한다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 항체를 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물을 포함한다.

본 발명은 추가로 암의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체를 포함한다.

본 발명은 추가로 암의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 항체를 환자에게 투여함을 특징으로 하는, 암을 앓는 환자의 치료 방법을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 본원에 제공된 항-HER3 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 제공한다. 한 실시태양에서, 항체는 서열 번호 8에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변성 도메인 VH 및 서열 번호 9, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 11에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변성 도메인 VL을 포함한다.

본 발명은 추가로 항체가 서열 번호 8의 가변성 도메인 VH; 및 서열 번호 8, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 11의 경쇄 가변성 도메인 VL을 포함하거나; 또는 이의 인간화된 형태임을 특징으로 하는, 인간 HER3에 결합하는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함한다.

본 발명은 추가로 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 발명에 따른 항체의 발현을 위해 본 발명에 따른 핵산을 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터를 포함한다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 포함한다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 핵산을 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 단계, 및 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 항체를 회수하는 단계를 특징으로 하는, 본 발명에 따른 재조합 항체의 생산 방법을 포함한다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 항체는 매우 중요한 특성, 예컨대 암 세포를 발현하는 HER3의 강한 성장 저해, 암 세포 증식과 연관된 HER3 중재된 신호 변환(예컨대, HER3 인산화 및 AKT 인산화)의 강한 저해, HER3으로의 높은 결합 친화도, 또는 탁월한 약물동력학적 특성(예컨대 긴 반감기 등)을 갖는다.

도 1a 및 도 1b: MCF7 세포에서의 수용체 인산화에 대한 상이한 농도의 항-HER3 항체의 저해율(%)
도 1c: Mel-Juso 세포에서의 수용체 인산화에 대한 상이한 농도의 항-HER3 항체의 저해율(%)
도 2: Mab 205(1O ㎎/㎏ q7dx3, 복강내)에 의한 처리는 FaDu SCCHN 이식된 이종이식편의 종양 정체를 일으켰다.
도 3: Mab 205(10 ㎎/㎏ q7d, 복강내)에 의한 처리는 MAXF449 유방암 이식된 이종이식편의 종양 정체를 일으켰다.
도 4: Mab 205(25 ㎎/㎏ q7d, 복강내)에 의한 처리는 7177 NSCLC 이식된 이종이식편의 종양 정체를 일으켰다.

본 발명은 추가로 중쇄 가변성 도메인 VH가 서열 번호 8이고; 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 9이거나, 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 10이거나, 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 11이거나, 또는 이의 인간화된 형태임을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체를 포함한다.

본 발명은 추가로 중쇄 가변성 도메인 VH가 서열 번호 8이고; 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 9이거나, 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 10이거나, 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 11임을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체를 포함한다.

한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 중쇄 가변성 도메인이 서열 번호 1의 CDR3H 영역, 서열 번호 2의 CDR2H 영역, 및 서열 번호 3의 CDR1H 영역을 포함하고, 경쇄 가변성 도메인이 서열 번호 4의 CDR3L 영역, 서열 번호 5의 CDR2L 영역, 및 서열 번호 6의 CDR1L 영역을 포함함을 특징으로 한다.

한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 중쇄 가변성 도메인 VH가 서열 번호 8이고; 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 9 또는 서열 번호 11임을 특징으로 한다.

한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 중쇄 가변성 도메인이 서열 번호 1의 CDR3H 영역, 서열 번호 2의 CDR2H 영역, 및 서열 번호 3의 CDR1H 영역을 포함하고, 경쇄 가변성 도메인이 서열 번호 4의 CDR3L 영역, 서열 번호 5의 CDR2L 영역, 및 서열 번호 7의 CDR1L 영역을 포함함을 특징으로 한다.

한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 중쇄 가변성 도메인 VH가 서열 번호 8이고; 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 10임을 특징으로 한다.

한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 단일클론성이다. 한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 인간화되거나 인간 항체이다. 한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 IgG1 또는 IgG4 하위부류의 항체이다. 한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 IgG1 하위부류의 단일클론성 인간화된 항체이다. 한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 상기 항체가 Asn297에서 당 쇄에 의해 글리코실화되고, 여기서 상기 당 쇄내의 푸코스의 양이 65% 이하임을 특징으로 한다.

본 발명은 각각 VH 및 VL 또는 CDR을 갖는 인간화된 항체 Mab 205.10.1, Mab 205.10.2 및 Mab 205.10.3을 포함한다.

한 실시태양에서, 이러한 항체는 인간 기원의 불변성 영역, 예를 들어 서열 번호 12 내지 16, 바람직하게는 서열 번호 12 및 13을 포함한다.

용어 "항체"는, 제한되지 않지만, 전체 항체 및 항체 단편을 비롯한 다양한 형태의 항체 구조물을 내포한다. 본 발명에 따른 항체는, 본 발명에 따른 특징적인 성질이 보유되기만 한다면, 바람직하게는 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라성 항체, 또는 추가로 유전자 조작된 항체이다.

"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 바람직하게는 이의 가변성 도메인, 또는 적어도 이의 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 단편의 예로는 디아바디(diabody), 단일-쇄 항체 분자, 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다. scFv 항체는, 예를 들어, 문헌[Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88]에 기재되어 있다. 또한, 항체 단편은 VH 도메인의 특징, 즉 VL 도메인과 함께 조립될 수 있는 특징, 또는 HER3에 결합하는 VL 도메인의 특징, 즉 작용성 항원 결합 부위에 VH 도메인과 함께 조립될 수 있는 특징을 갖고, 이로써 본 발명에 따른 항체의 특성을 제공하는 단일 쇄 폴리펩티드를 포함한다.

용어 "단일클론성 항체" 또는 "단일클론성 항체 조성물"은 본원에 사용될 경우 단일 아미노산 조성물의 항체 분자의 제조물을 지칭한다.

용어 "키메라성 항체"는 마우스로부터의 가변성 영역, 즉, 결합 영역, 및 상이한 공급원 또는 종으로부터 유도된 불변성 영역의 적어도 일부를 포함하는, 대개 재조합 DNA 기법으로부터 제조되는 단일클론성 항체를 지칭한다. 마우스 가변성 영역 및 인간 불변성 영역을 포함하는 키메라성 항체가 특히 바람직하다. 이러한 래트/인간 키메라성 항체는 래트 면역글로불린 가변성 영역을 코딩하는 DNA 분절 및 인간 면역글로불린 불변성 영역을 코딩하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 본 발명에 의해 내포되는 "키메라성 항체"의 다른 형태는 부류 또는 하위부류가 기원 항체로부터 변경되거나 변형된 것이다. 이러한 "키메라성" 항체는 또한 "부류-전환된 항체"로 지칭된다. 키메라성 항체를 생산하는 방법은 종래의 재조합 DNA 및 당분야에 현재 공지된 유전자 형질감염 기법을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Morrison, S.L., et al, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; 미국 특허 제5,202,238호 및 미국 특허 제5,204,244호를 참조한다.

용어 "인간화된 항체" 또는 "항체의 인간화된 형태"는 골격구조(framework) 또는 "상보성 결정 영역"(CDR: complementarity determining region)이 모 면역글로불린과 비교하여 상이한 특이성의 면역글로불린의 CDR을 포함하도록 변형된 항체를 지칭한다. 한 바람직한 실시태양에서, VH 및 VL의 CDR은 인간 항체의 골격구조 영역으로 그라프팅(grafting)되어 "인간화된 항체"를 제조한다. 예를 들어 문헌[Riechmann, L., et al, Nature 332 (1988) 323-327]; 및 [Neuberger, M.S., et al, Nature 314 (1985) 268-270]을 참조한다. 중쇄 및 경쇄 가변성 골격구조 영역은 동일하거나 상이한 인간 항체 서열로부터 유도될 수 있다. 인간 항체 서열은 천연 발생 인간 항체의 서열일 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 가변성 골격구조 영역은 예를 들어 문헌[Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology (2000) - Appendix IP A.1P.1-A.1P.37]에 열거되어 있고, IMGT, 국제 이뮤노제네틱스(ImMunoGeneTics) 정보 시스템(등록상표)(http://imgt.cines.fr)을 통해 또는 http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk를 통해 이용할 수 있다. 임의적으로 골격구조 영역은 추가의 돌연변이에 의해 변형될 수 있다. 특히 바람직한 CDR은 키메라성 항체에 대해 상기 주지된 항원을 인식하는 서열을 나타내는 것에 상응한다. 바람직하게는 이러한 인간화된 형태는 인간 불변성 영역으로 키메라화된다(예를 들어 서열 번호 12 내지 16 참조). 용어 "인간화된 항체"는 본원에 사용될 경우 또한 본 발명에 따른 특성을 생성하는 불변성 영역에서, 특히 Clq 결합 및/또는 FcR 결합과 관련하여, 예를 들어 "부류 전환", 즉 Fc 부분의 변화 또는 돌연변이(예를 들어 IgG1에서 IgG4로 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이)에 의해 변형된 이러한 항체를 포함한다.

용어 "인간 항체"는, 본원에 사용될 경우, 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변성 및 불변성 영역을 갖는 항체를 포함하고자 한다. 인간 항체는 당분야에 잘 공지되어 있다(van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 인간 항체는 또한 면역화시 내생성 면역글로불린 생산의 부재하에 인간 항체의 선택부 또는 전체 레파토리(repertoire)를 생산할 수 있는 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)에서 생산될 수 있다. 이러한 생식계열 돌연변이체 마우스에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이(array)의 전달은 항원 챌린지(challenge)시에 인간 항체를 생성할 것이다(예를 들어, 문헌[Jakobovits, A., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555]; [Jakobovits, A., et al, Nature 362 (1993) 255-258]; [Brueggemann, M.D., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40]을 참조한다). 인간 항체는 또한 파아지 디스플레이 라이브러리(phage display library)에서 생산될 수 있다(문헌[Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388]; 및 [Marks, J.D., et al, J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597]). 콜(Cole, A.) 등 및 뵈르너(Boerner, P.) 등의 기법이 또한 인간 단일클론성 항체의 제조에 이용가능하다(문헌[Cole, A., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Liss, A.L., p. 77 (1985)]; 및 [Boerner, P., et al, J. Immunol. 147 (1991) 86-95]). 본 발명에 따른 인간화된 항체에 대해 이미 언급된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 본원에 사용될 경우 또한 본 발명에 따른 특성을 생성하는 불변성 영역에서, 특히 Clq 결합 및/또는 FcR 결합과 관련하여, 예를 들어 "부류 전환", 즉 Fc 부분의 변화 또는 돌연변이(예를 들어 IgG1에서 IgG4로 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이)에 의해 변형된 이러한 항체를 포함한다.

용어 "재조합 인간 항체"는, 본원에 사용될 경우, 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 모든 인간 항체를 포함하고자 하고, 예컨대 숙주 세포, 예컨대 NS0 또는 CHO 세포로부터 단리된 항체, 또는 인간 면역글로불린 유전자에 대해 형질전환성 동물(예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체, 또는 숙주 세포내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체이다. 이러한 재조합 인간 항체는 재배열된 형태로 가변성 및 불변성 영역을 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체내 체세포 초돌연변이를 겪는다. 이에 따라, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 이에 관련되는 한편, 생체내 인간 항체 생식계열 레파토리에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.

본원에 사용될 경우, 용어 "인간 HER3으로의 결합", "인간 HER3으로의 특이적 결합", 또는 "항-HER3 항체"는 상호교환가능하고, 25℃에서 1.0 x 10^-8 몰/ℓ 이하의 K_D-값, 한 실시태양에서, 25℃에서 1.0 xlO^-9 몰/ℓ 이하의 K_D-값의 결합 친화도를 갖고 인간 HER3 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 결합 친화도는 25℃에서 표준 결합 검정, 예컨대 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 기법[비아코어(BIAcore: 등록상표), 스웨덴 웁살라 소재의 지이-헬쓰케어(GE-Healthcare) 제품]에 의해 결정된다. 결합 친화도의 K_D-값을 결정하기 위한 방법은 실시예 2b에 기재되어 있다. 따라서 "인간 HER3에 결합하는 항체"는 본원에 사용될 경우 25℃에서 1.0 x 10^-8 몰/ℓ 이하(바람직하게는 1.0 x 10^-8 몰/ℓ 내지 1.0 x 10^-12 몰/ℓ) 의 K_D-값의 결합 친화도를 갖고 인간 HER3 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.

인간 HER3(ErbB-3, ERBB3, c-erbB-3, c-erbB3, 수용체 티로신-단백질 키나아제 erbB-3, 서열 번호 17)은, 또한 HER1(EGFR로도 공지됨), HER2, 및 HER4를 포함하는 수용체 티로신 키나아제의 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 계열의 구성원을 코딩한다(Kraus, M.H. et al, PNAS 86 (1989), 9193-9197; Plowman, G.D. et al, PNAS 87 (1990), 4905-4909; Kraus, M.H. et al, PNAS 90 (1993), 2900-2904). 원형적 표피 성장 인자 수용체와 같이, 막간 수용체 HER3은 세포외 리간드-결합 도메인(ECD), ECD내의 이량체화 도메인, 막간 도메인, 세포내 단백질 티로신 키나아제 도메인(TKD) 및 C-말단 인산화 도메인으로 구성된다. 이러한 막-결합된 단백질은 HER3 헤레굴린(HRG) 결합 도메인을 활성 키나아제 도메인이 아닌 세포외 도메인내에 갖는다. 따라서, 이는 상기 리간드에 결합할 수 있지만 리간드 단백질 인산화를 통해 세포내로 신호를 수송할 수 없다. 그러나, 이는 키나아제 활성을 갖는 다른 HER 계열 구성원과 이종이량체를 형성한다. 이종이량체는 수용체-중재된 신호전달 경로의 활성화 및 그의 세포내 도메인의 인산전이반응을 유도한다. HER 계열 구성원 간의 이량체 형성은 HER3의 신호전달 가능성을 확장시키고, 이는 신호 다양화 뿐만 아니라 신호 증폭을 위한 수단이다. 예를 들면 HER2/HER3 이종이량체는 HER 계열 구성원 사이에서 PI3K 및 AKT 경로를 통해 가장 중요한 미토겐성 신호중 하나를 유도한다(Sliwkowski, M.X., et al, J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665; Alimandi, M., et al, Oncogene 10 (1995) 1813-1821; Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276 (2001) 42153-421561; Singer, E., J. Biol. Chem. 276 (2001) 44266-44274; Schaefer, K.L., Neoplasia 8 (2006) 613-622).

HER3 항체 Mab205.10.1, Mab205.10.2, 및 Mab205.10.3은 HER3에 대해 리간드 헤레굴린(HRG)과 경쟁적 결합을 나타내었다.

이러한 유전자의 증폭 및/또는 그의 단백질의 과발현은 전립선암, 방광암 및 유방암을 비롯한 다수의 암에서 보고되고 있다. 상이한 이소형을 코딩하는 교대 전사 스플라이스 변형체가 특징화되어 있다. 하나의 이소형은 막간 영역이 결핍되어 있고, 세포 밖으로 분비된다. 이러한 형태는 막-결합된 형태의 활성을 조율하는 작용을 한다. 추가의 스플라이스 변형체가 또한 보고되어 있지만, 이들은 완벽히 특징화되지 않았다.

용어 "에피토프"는 항체로의 특이적 결합이 가능한 임의의 폴리펩티드 결정자를 포함한다. 특정 실시태양에서, 에피토프 결정자는 분자, 예컨대 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 또는 설포닐의 화학적 활성 표면 그룹을 포함하고, 특정 실시태양에서, 3차원 구조적 특징, 또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다.

"본 발명에 따른 항체의 가변성 도메인"(경쇄(VL)의 가변성 도메인, 중쇄 (VH)의 가변성 도메인)은 본원에 사용될 경우 항체가 항원에 결합하는데 직접적으로 관여되는 경쇄 및 중쇄 도메인 쌍을 각각 표시한다. 가변성 경쇄 및 중쇄 도메인은 동일한 일반적 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 골격구조(FR) 영역을 포함하며, 그의 서열은 광범위하게 보존되고, 3개의 "고가변성 영역"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 연결된다. 골격구조 영역은 β-시이트 입체배좌를 채택하고, CDR은 β-시이트 구조를 연결하는 루우프(loop)를 형성할 수 있다. 각각의 쇄중 CDR은 골격구조 영역에 의해 이들의 3차원 구조로 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화도에 있어서 특히 중요한 역할을 하고, 이에 따라 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.

용어 "항체의 항원-결합 부분"은 본원에 사용될 경우 항원-결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체의 항원-결합 부분은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 용어 본 발명의 항체의 "항원-결합 부분"은 항원에 대한 결합 부위의 친화도에 다양한 정도로 기여하는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 3개의 중쇄 가변성 도메인 CDR(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 3개의 경쇄 가변성 도메인 CDR(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)이 존재한다. 용어 "CDRH1"은 카밧(Kabat)에 따라 계산된 중쇄 가변성 영역의 CDR1 영역을 표시한다. CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 중쇄(H) 또는 경쇄(L)로부터의 각각의 영역을 의미한다. CDR 및 골격구조 영역(FR)의 범위는 아미노산 서열의 컴파일링된 데이터베이스와 비교하여 결정되고, 여기서 이들 영역은 문헌[Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 따라 서열 사이의 다양성에 따라서 규정된다.

항체의 "Fc 부분"은 항원으로의 항체의 결합에 직접적으로 관여되지 않지만, 다양한 효과자(effector) 기능을 나타낸다. "항체의 Fc 부분"은 당분야에 공지된 용어이고, 항체의 파파인(papain) 분할에 기초하여 규정된다. 이들의 중쇄의 불변성 영역의 아미노산 서열에 의존하여, 항체 또는 면역글로불린은 다음과 같은 부류로 나눠지고: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM; 이들중 몇몇은 추가로 하위부류(이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, IgA1, 및 IgA2로 나눠진다. 중쇄 불변성 영역에 따라서, 면역글로불린의 상이한 부류는 각각 a, δ, ε, γ, 및 μ로 지칭된다. 항체의 Fc 부분은 보체 활성화, Clq 결합 및 Fc 수용체 결합에 기초하여 ADCC(항체-의존성 세포-중재된 세포독성) 및 보체-의존성 세포독성(CDC: complement-dependent cytotoxicity)에 직접적으로 관여된다. 용어 "보체-의존성 세포독성(CDC)"은 보체 인자 Clq가 대부분의 IgG 항체 하위부류의 Fc 부분으로 결합함으로써 개시되는 과정을 표시한다. Clq의 항체로의 결합은 소위 결합 부위에서 규정된 단백질-단백질 상호작용에 의해 초래된다. 이러한 결합 부위는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Boackle, R.J., et al, Nature 282 (1979) 742-743, Lukas, T.J., et al, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560, Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917, Burton, D.R., et al, Nature 288 (1980) 338-344, Thommesen, J.E., et al, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004, Idusogie, E.E., et al, J. Immunol.164 (2000) 4178-4184, Hezareh, M., et al, J. Virology 75 (2001) 12161-12168, Morgan, A., et al, Immunology 86 (1995) 319-324], 및 EP 제O 307 434호에 기재되어 있다. 이러한 결합 부위는 예를 들어 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329(카밧 이.에이.의 EU 지수에 따른 번호매김; 이하 참조)이다. 하위부류 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체는 대개 보체 활성화, 및 Clq 및 C3 결합을 나타내는 반면, IgG4는 보체 시스템을 활성화하지 않고 Clq 및 C3에 결합하지 않는다.

한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 인간 기원으로 유도된 FC 부분, 바람직하게는 인간 불변성 영역의 모든 다른 부분을 포함한다. 본원에 사용될 경우 용어 "인간 기원으로부터 유도된 Fc 부분"은 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 Fc 부분인 Fc 부분을 표시하고, 예를 들어 인간 IgG1 하위부류의 Fc 부분, 인간 IgG1 하위부류로부터 돌연변이된 Fc 부분(바람직하게는 L234A + L235A 상에서의 돌연변이에 의함), 인간 IgG4 하위부류로부터의 Fc 부분 또는 인간 IgG4 하위부류로부터의 돌연변이된 Fc 부분(바람직하게는 S228P 상에서의 돌연변이에 의해)이다. 서열 번호 13(인간 IgG1 하위부류), 서열 번호 14(돌연변이 L234A 및 L235A를 갖는 인간 IgG1 하위부류)의 인간 중쇄 불변성 영역이 바람직하다.

한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 인간 IgG1 하위부류 또는 인간 IgG3 하위부류의 항체이다. 한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 인간 IgG1 하위부류의 항체이다.

한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 불변성 쇄가 인간 기원의 쇄임을 특징으로 한다. 이러한 불변성 쇄는 당분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 카밧 이.에이.에 의해 기재되어 있다(예를 들어 문헌[Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218] 참조). 예를 들면, 유용한 인간 중쇄 불변성 영역은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 유용한 인간 경쇄 불변성 영역은 서열 번호 12의 카파-경쇄 불변성 영역의 아미노산 서열을 포함한다.

용어 "아미노산"은, 본 명세서에 사용될 경우, 알라닌(3문자 코드: ala, 1문자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소로이신(ile, I), 로이신(leu, L), 라이신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(tyr, Y), 및 발린(val, V)을 포함하는 천연 발생 카복시 α-아미노산의 그룹을 표시한다.

용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는, 본원에 사용될 경우, DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하고자 한다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다. 핵산은 이것이 또 다른 핵산과 작용적 관계에 놓일 경우 "작동적으로 연결된다". 예를 들면, 예비서열 또는 분비 리더(leader)를 위한 DNA는, 이것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비단백질로서 발현된다면, 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터(promoter) 또는 인헨서(enhancer)는, 이것이 서열의 전사에 영향을 끼친다면, 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나, 리보솜 결합 부위는, 이것이 번역을 촉진시키도록 위치된다면, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은, 연결된 DNA 서열이 동일선상에 있고, 분비 리더의 경우에, 인접하고 판독 프레임에 존재함을 의미한다. 그러나, 인헨서는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(adaptor) 또는 연결기가 종래의 실행에 따라 사용된다. 본원에 사용될 경우, 발현 "세포", "세포주", 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 이러한 모든 표시는 자손(progeny)을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전환 수와 무관하게 주요 대상 세포 및 이로부터 유도된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손은 고의적 또는 부주의적 돌연변이에 의해 DNA 내용이 정확하게 동일하지 않을 수 있음을 알아야 한다. 고유적으로 형질전환된 세포에서 스크리닝될 경우 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변형체 자손이 포함된다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 불변성 쇄가 인간 기원의 것임을 특징으로 한다. 이러한 불변성 쇄는 당분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 카밧(Kabat) 등에 의해 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 기재되어 있다. 예를 들면, 유용한 인간 경쇄 불변성 영역은 서열 번호 12의 카파-경쇄 불변성 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 유용한 인간 중쇄 불변성 영역은 서열 번호 13 내지 16을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시태양은 본 발명에 따른 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산이다.

본 발명에 따른 항체는 또한 본 발명에 따른 항체의 상기 언급된 특징에 영향을 주지 않거나 이를 변경시키는 "보존적 서열 변형"(변형 항체), 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형을 갖는 이러한 항체를 포함한다. 변형은 당분야에 공지된 표준 기법, 예컨대 부위-유도된 돌연변이생성 및 PCR-중재된 돌연변이생성에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환으로는, 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이 포함된다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당분야에 규정되어 있다. 이들 계열로는 염기성 측쇄(예를 들어 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어 트레오닌, 발린, 이소로이신) 및 방향족 측쇄(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산이 포함된다. 이와 같이, 인간 항-HER3 항체중 예측된 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 계열로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. "변형" 항-HER3 항체는, 따라서 본원에 모 항체의 하나 이상의 가변성 영역에서 10개 이하, 바람직하게는 약 2개 내지 약 5개의 첨가, 결실 및/또는 치환에 의해 아미노산 서열이 "모" 항-HER3 항체 아미노산 서열과 상이한 분자를 지칭한다. 아미노산 치환은 문헌[Riechmann, L., et al, Nature 332 (1988) 323-327] 및 [Queen, C, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]에 의해 기재된 바와 같이 분자 모델링에 기초한 돌연변이에 의해 수행될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 항-HER3 항체는 서열 번호 8의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변성 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비교하여 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항 HER3 항체는 HER3에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열 번호 8에서 치환, 삽입 및 결실된다. 특정 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 바깥쪽 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 임의적으로, 항-HER3 항체는 이러한 서열의 번역후 변형을 포함하는 서열 번호 8에서의 VH 서열을 포함한다. 한 구체적인 실시태양에서, VH는 다음으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다: (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1H, (b) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2H, 및 (c) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3H.

또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 항-HER3 항체는 서열 번호 9, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 11의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변성 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비교하여 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항-HER 항체는 HER에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열 번호 9, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 11에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 바깥쪽 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 임의적으로, 항-HER3 항체는 이러한 서열의 번역후 변형을 포함하는 서열 번호 9, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 11에서의 VL 서열을 포함한다. 한 구체적인 실시태양에서, VL은 다음으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다: (a) 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1L, (b) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2L, 및 (c) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3L.

또 다른 양태에서, 항체가 상기 제공된 실시태양중 임의의 실시태양에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 실시태양중 임의의 실시태양에서와 같은 VL을 포함하는, 항-HER3 항체가 제공된다. 한 실시태양에서, 항체는 각각 서열 번호 8 및 서열 번호 10에서 VH 및 VL 서열을 포함하고, 이는 이들 서열의 번역후 변형을 포함하고, 하나 이상의 하기 특성(실시예 3 및 2에 기재된 바와 같은 검정에서 결정됨)을 갖는다:

- 항-HER3 항체는 종양 세포, 예컨대 MCF7 세포, FaDu 세포 또는 Mel-Juso 세포에서 HER3 인산화를 저해한다[한 실시태양에서, 항-HER3 항체는 적어도 80%(한 실시태양에서, 적어도 90%)의 MCF7 세포에서의 HER3 인산화의 저해를 1.0 ㎍/㎖의 농도에서 나타내고; 한 실시태양에서, 항-HER3 항체는 적어도 80%(한 실시태양에서, 적어도 90%)의 FaDu 세포에서의 HER3 인산화의 저해를 0.1 ㎍/㎖의 농도에서 나타내고; 한 실시태양에서, 항-HER3 항체는 적어도 60%(한 실시태양에서, 적어도 70%)의 Mel-Juso 세포에서의 HER3 인산화의 저해를 0.1 ㎍/㎖의 농도에서 나타낸다];

- 항-HER3 항체는 종양 세포, 예컨대 Mel-Juso 세포에서 AKT 인산화를 저해한다(한 실시태양에서, 항-HER3 항체는 Mel-Juso 세포에서 AKT 인산화를 0.50 ㎍/㎖ 미만의 IC₅₀ 값으로, 한 실시태양에서, 0.35 ㎍/㎖ 미만의 IC₅₀ 값으로 저해한다);

- 항-HER3 항체는 종양 세포, 예컨대 MDA-MB-175 세포의 증식을 저해한다(한 실시태양에서, 항-HER3 항체는 MDA-MB-175 세포의 증식을 10 ㎍/㎖ 미만의 IC₅₀ 값으로 저해한다);

- 항-HER3 항체는 5.0 x 10^-9 M 미만의 K_D 값, 한 실시태양에서, 3.0x 10^-9 M 미만의 K_D 값으로 HER3에 결합한다.

또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 항-HER3 항체는 서열 번호 8의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변성 도메인(VH) 서열을 포함하고 서열 번호 9, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 11의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변성 도메인(VL)을 포함하고; 하나 이상의 하기 특성(실시예 3 및 2에 기재된 바와 같은 검정에서 결정됨)을 갖는다: 항-HER3 항체는 종양 세포, 예컨대 MCF7 세포, FaDu 세포 또는 Mel-Juso 세포에서 HER3 인산화를 저해한다[한 실시태양에서, 항-HER3 항체는 적어도 80%(한 실시태양에서, 적어도 90%)의 MCF7 세포에서의 HER3 인산화의 저해를 1.0 μg/㎖의 농도에서 나타내고; 한 실시태양에서, 항-HER3 항체는 적어도 80%(한 실시태양에서, 적어도 90%)의 FaDu 세포에서의 HER3 인산화의 저해를 0.1 μg/㎖의 농도에서 나타내고; 한 양태에서, 항-HER3 항체는 적어도 60%(한 실시태양에서, 적어도 70%)의 Mel-Juso 세포에서의 HER3 인산화의 저해를 0.1 μg/㎖의 농도에서 나타낸다];

- 항-HER3 항체는 종양 세포, 예컨대 Mel-Juso 세포에서 AKT 인산화를 저해한다(한 실시태양에서, 항-HER3 항체는 Mel-Juso 세포에서 0.50 μg/㎖ 미만의 IC₅₀ 값으로, 한 실시태양에서, 적어도 0.35 μg/㎖의 IC₅₀ 값으로 AKT 인산화를 저해한다);

- 항-HER3 항체는 종양 세포, 예컨대 MDA-MB-175 세포의 증식을 저해한다(한 실시태양에서, 항-HER3 항체는 10 μg/㎖ 미만의 IC₅₀ 값으로 MDA-MB-175 세포의 증식을 저해한다);

본 발명의 한 실시태양은 서열 번호 8에 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변성 도메인 VH, 및 서열 번호 9, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 11에 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변성 도메인 VL을 포함하는, 인간 HER3에 결합하는 항체이다.

본 발명의 한 실시태양은 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 9에 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 상기 항체이다.

본 발명의 한 실시태양은 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 10에 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 상기 항체이다.

본 발명의 한 실시태양은 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 11에 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 상기 항체이다.

본 발명의 한 실시태양은 서열 번호 8에 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변성 도메인 VH, 및 서열 번호 9, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 11에 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변성 도메인 VL을 포함하는, 인간 HER3에 결합하고 하나 이상의 하기 특성(실시예 3 및 2에 기재된 바와 같은 검정에서 결정됨)을 갖는 항체이다:

- 항-HER3 항체는 종양 세포, 예컨대 MCF7 세포, FaDu 세포 또는 Mel-Juso 세포에서의 HER3 인산화를 저해한다[한 실시태양에서, 항-HER3 항체는 적어도 80%(한 실시태양에서, 적어도 90%)의 MCF7 세포에서의 HER3 인산화의 저해를 1.0 ㎍/㎖의 농도에서 나타내고; 한 실시태양에서, 항-HER3 항체는 적어도 80%(한 실시태양에서, 적어도 90%)의 FaDu 세포에서의 HER3 인산화의 저해를 0.1 ㎍/㎖의 농도에서 나타내고; 한 실시태양에서, 항-HER3 항체는 적어도 60%(한 실시태양에서, 적어도 70%)의 Mel-Juso 세포에서의 HER3 인산화의 저해를 0.1 ㎍/㎖의 농도에서 나타낸다].

- 항-HER3 항체는 종양, 세포 예컨대 Mel-Juso 세포에서 AKT 인산화를 저해한다(한 실시태양에서, 항-HER3 항체는 Mel-Juso 세포에서 AKT 인산화를 0.50 ㎍/㎖ 미만의 IC₅₀ 값으로, 한 실시태양에서, 0.35 ㎍/㎖ 미만의 IC₅₀ 값으로 저해한다).

- 항-HER3 항체는 종양 세포, 예컨대 MDA-MB-175 세포의 증식을 저해한다(한 실시태양에서, 항-HER3 항체는 MDA-MB-175 세포의 증식을 10 ㎍/㎖ 미만의 IC₅₀ 값으로 저해한다).

- 항-HER3 항체는 5.O x 10^-9 M 미만의 K_D 값, 한 실시태양에서, 3.Ox 10^-9 M 미만의 K_D 값으로 HER3에 결합한다.

서열에 대한 동일성 또는 상동성은, 필요할 경우 최대 서열 동일성(%)을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 모 서열과 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로서 본원에 정의된다. N-말단, C-말단, 또는 항체 서열로의 내부 연장, 결실 또는 삽입은 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 주는 것으로 간주될 것이다. 변형체는 인간 HER3의 가변성 도메인에 결합하는 능력을 보유하고, 바람직하게는 모 항체의 특성보다 우수한 특성을 갖는다. 예를 들면, 변형체는 처리 동안 부작용을 감소시킬 수 있다.

예시적인 "모" 항체는 항체 Mab 205.10.2의 CDR 영역을 포함하고, 바람직하게는 변형체의 제조를 위해 사용된다. 바람직하게는, 모 항체는 인간 골격구조 영역을 갖고, 존재할 경우, 인간 항체 불변성 도메인을 갖는다. 예를 들면, 모 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체일 수 있다.

용어 "항체-의존성 세포 세포독성(ADCC: antibody-dependent cellular cytotoxicity)"은 효과자 세포의 존재하에 본 발명에 따른 항체에 의한 인간 표적 세포의 용해를 지칭하다. ADCC는 바람직하게는 HER3 발현 세포의 제조물을 본 발명에 따른 항체에 의해, 효과자 세포, 예컨대 새롭게 단리된 PBMC 또는 버피 코트(buffy coat)로부터의 정제된 효과자 세포, 예로서 단핵백혈구 또는 중성 킬러(NK: natural killer) 세포 또는 영구적으로 성장하는 NK 세포주의 존재하에 처리함으로써 측정된다.

단일클론성 항체의 ADCC와 같은 세포-중재된 효과자 기능은 문헌[Umana, P., et al, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180] 및 미국 특허 제6,602,684호에 기재된 바와 같이 이들의 올리고당 성분을 조작함으로써 향상될 수 있다. 가장 흔히 사용되는 치료 항체인 IgG1 유형 항체는 각각의 CH2 도메인에서 Asn297에서 보존된 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 결합된 2종의 복합 2중촉각(biantennary) 올리고당은 CH2 도메인 사이에 매립되어, 폴리펩티드 주쇄와 광범위한 접촉을 형성하고, 이들의 존재는 효과자 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 중재하기 위해 항체에 필수적이다(Lifely, M.R., et al, Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al, Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). 문헌[Umana, P., et al. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180] 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제99/54342호는, β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전이효소 III("GnTIII")(이분화된 올리고당의 형성을 촉매화하는 글리코실전이효소)의 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포에서의 발현이 항체의 시험관내 ADCC 활성을 크게 증가시킴을 보여주었다. Asn297 탄수화물의 조성의 변화 또는 이의 제거는 FcγR 및 Clq로의 결합에 영향을 준다(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J., et al, Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., et al, J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S., et al, J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L., et al, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L., et al, J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C., et al, J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147).

단일클론성 항체의 당조작(glycoengineering)을 통한 세포-중재된 효과자 기능을 향상시키기 위한 방법이 예를 들어 국제 특허출원 공개공보 WO 제2005/044859호, WO 제2004/065540호, WO 제2007/031875호, 문헌[Umana, P., et al, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180], WO 제99/154342호, WO 제2005/018572호, WO 제2006/116260호, WO 제2006/114700호, WO 제2004/065540호, WO 제2005/011735호, WO 제2005/027966호, WO 제1997/028267호, US 제2006/0134709호, US 제2005/0054048호, US 제2005/0152894호, WO 제2003/035835호 및 WO 제2000/061739호 또는 예를 들어 문헌[Niwa, R., et al, J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T., et al, J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473]; WO 제03/055993호 및 US 제2005/0249722호에 기재되어 있다.

본 발명의 한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 푸코스제거되고(afucosylated), 이는 항체가 Asn297에서 당 쇄에 의해 글리코실화됨(이는 IgG1 또는 IgG3 하위부류의 Fc 부분을 포함할 경우)을 의미하고, 이로써 상기 당 쇄내의 푸코스의 양이 80% 이하(카밧(Kabat)에 따른 번호매김), 예를 들어 80% 내지 1%임을 의미한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 당 쇄내의 푸코스의 양은 65% 이하이고, 한 실시태양에서는, 5% 내지 65%이고, 한 실시태양에서는, 상기 당 쇄내의 푸코스의 양은 0%이다. 이러한 항체는 하기에서 "푸코스제거된 항체" 또는 "비-푸코실화된 항체"로 지칭된다. 이러한 푸코스제거된 항체는 향상된 ADCC를 나타내는 반면, 다른 항체 특성은 실질적으로 영향을 받지 않은 채로 남는다.

추가의 실시태양에서, N-글리콜릴뉴라민산(NGNA: N-glycolylneuraminic acid)의 양은 1% 이하이고/이거나 N-말단 알파-1,3-갈락토스의 양은 상기 당 쇄내에서 1% 이하이다. 당 쇄는 바람직하게는 CHO 세포에서 재조합적으로 발현된 항체의 Asn297에 결합된 N-연결된 글리칸의 특징을 나타낸다.

본 발명에 따른 "Asn297"은 Fc 영역에서 약 위치 297에 위치된 아미노산 아스파라긴을 의미한다. 항체의 미미한 서열 변형에 기초하여, Asn297는 또한 위치 297의 상류 또는 하류, 즉 294 내지 300 사이에 위치된 몇몇 아미노산(대체적으로 ±3 이하의 아미노산)일 수 있다.

"당 쇄는 CHO 세포에서 재조합적으로 발현된 항체의 Asn297에 결합된 N-연결된 글리칸의 특징을 나타낸다"라는 표현은, 예를 들어 국제 특허출원 공개공보 WO 제2006/103100호에 보고된 것과 같이, 본 발명에 따른 전장 모 항체의 Asn297에서의 당 쇄가 푸코스 잔기를 제외하고는 변형되지 않은 CHO 세포에서 발현된 동일한 항체와 동일한 구조 및 당 잔기 서열을 가짐을 나타낸다.

용어 "NGNA"는 본원에서 사용될 경우 당 잔기 N-글리콜릴-뉴라민산을 표시한다.

핵심 푸코실화된 2중촉각 착체 올리고당 글리코실화가 2개 이하의 Gal 잔기로 종료됨에 따라, 인간 IgG1 또는 IgG3에서의 글리코실화는 Asn297에서 초래된다. IgG1 또는 IgG3 하위부류의 인간 불변성 중쇄 영역은 문헌[Kabat, E., A., et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]; [Brueggemann, M., et al, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361]; 및 [Love, T.W., et al, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527]에 상세히 보고되어 있다. 이들 구조는 말단 Gal 잔기의 양에 따라 G0, G1(α-1,6- 또는 α-1,3-), 또는 G2 글리칸 잔기로서 표시된다(Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53). 항체 Fc 부분의 CHO 유형 글리코실화는 예를 들어 문헌[Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207]에 기재되어 있다. 당변형되지 않은 CHO 숙주 세포에서 재조합적으로 발현된 항체는 일반적으로 적어도 85%의 양으로 Asn297에서 푸코실화된다. 전장 모 항체의 변형된 올리고당은 하이브리드(hybrid) 또는 착체일 수 있다. 바람직하게는 이분화되고, 환원되고/푸코실화되지 않은 올리고당은 하이브리드이다. 또 다른 실시태양에서, 이분화되고, 환원되고/푸코실화되지 않은 올리고당은 착체이다.

본 발명에 따라서, "푸코스의 양"은 MALDI-TOF 질량 분석법(예를 들어 LC/MS 시스템)에 의해 측정되고 평균값으로서 계산된(예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 WO 제2008/077546호 참조) Asn297에 결합된 모든 당구조물(예를 들어 착체, 하이브리드 및 고 만노스 구조물)의 합에 대한 Asn297에서의 당 쇄내에서 상기 당의 양을 의미한다. 푸코스의 상대량은 MALDI-TOF에 의해 N-글리코시다아제(Glycosidase) F 처리된 샘플(예를 들어 착체, 하이브리드 및 올리고- 및 고-만노스 구조물 각각)에서 확인된 모든 당구조물에 대한 푸코스-함유 구조물의 백분율이다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 재조합 수단에 의해 생산된다. 이러한 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고, 항체 폴리펩티드의 후속적 단리 및 약학적으로 허용가능한 순도로의 일반적 정제가 수반되는 원핵 및 진핵 세포에서의 단백질 발현을 포함한다. 단백질 발현을 위해, 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산 또는 이의 단편은 표준 방법에 의해 발현 벡터내로 삽입된다. 발현은 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, 효모, 또는 이. 콜라이(E. coli) 세포에서 수행되고, 항체는 세포로부터(상청액으로부터 또는 세포 용해 이후) 회수된다. 항체의 재조합 생산은 당분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282]; [Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161]; 및 [Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880]에 기재되어 있다. 항체는 전 세포에, 세포 용해물에, 또는 부분적으로 정제되거나, 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 정제는 다른 세포 성분 또는 기타 오염원, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해, 칼럼 크로마토그래피 및 당분야에 공지된 다른 기법을 비롯한 표준 기법에 의해 수행된다(문헌[Ausubel Fl, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pubilshing and Wiley Interscience, New York (1987)] 참조). NS0 세포에서의 발현은, 예를 들어 문헌[Barnes, L.M., et al, Cytotechnology 32 (2000) 109-123]; [Barnes, L.M., et al, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270]에 기재되어 있다. 일과성 발현은, 예를 들어 문헌[Durocher, Y., et al, Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9]에 기재되어 있다. 가변성 도메인의 클로닝은 문헌[Orlandi, R., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837]; [Carter, P., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289]; [Norderhaug, L., et al, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87]에 기재되어 있다. 바람직한 일과성 발현 시스템(HEK 293)은 문헌[Schlaeger, E.-J. and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83], 및 [Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199]에 기재되어 있다. 단일클론성 항체는 종래의 면역글로불린 정제 절차, 예컨대, 예를 들면, 단백질 A-세파로즈(Sepharose), 하이드록실아파타이트(hydroxylapatite) 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지로부터 적절히 분리된다. 단일클론성 항체를 코딩하는 DNA 및 RNA는 쉽게 단리되고, 종래의 절차를 사용하여 서열화된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA 및 RNA의 공급원으로 작용할 수 있다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터내로 삽입될 수 있고, 이어서 이는 다르게는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 HEK 293 세포, CHO 세포, 또는 골수종 세포내로 형질감염되어, 숙주 세포에서 재조합 단일클론성 항체를 합성한다. 상기 세포주로부터 수득가능한 항체는 본 발명의 바람직한 실시태양이다. 푸코스제거된 항체는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 당조작을 통해 제조된다.

항-HER3 항체의 아미노산 서열 변형체는 적절한 뉴클레오티드 변경을 항체 코딩 DNA내로 도입하거나, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 그러나, 이러한 변형은 단지 매우 제한된 범위에서, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들면, 변형은 상기 언급된 항체 특징, 예컨대 IgG 이소형 및 에피토프 결합을 변경시키지 않지만, 재조합 생산의 수율, 단백질 안정성을 개선시키거나, 정제를 용이하게 할 수 있다. 항-HER3, 항체의 적절한 입체배좌를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 또한 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 비정상적인 가교결합을 방지한다. 역으로, 시스테인 결합(들)은 항체에 첨가되어 그의 안정성을 개선시킬 수 있다(특히 항체가 항체 단편, 예컨대 Fv 단편인 경우). 항체의 아미노산 변형체의 또 다른 유형은 항체의 고유의 글리코실화 패턴을 변경한다. "변경하는"은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기를 제거하고/하거나, 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 첨가함을 의미한다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결된다. "N-연결된"은 아스파라긴 잔기의 측쇄로의 탄수화물 잔기의 결합을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서 X는 프롤린을 제외한 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄로의 탄수화물 잔기의 효소적 결합을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드중 이들 트리펩티드 서열이 존재하면 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. 항체의 글리코실화 부위의 첨가는, 이것이 상기 기재된 하나 이상의 트리펩티드 서열(N-연결된 글리코실화 부위를 위함)을 포함하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다.

항-HER3 항체의 아미노산 서열 변형체를 코딩하는 핵산 분자는 당분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법으로는, 제한되지 않지만, 천연 공급원으로부터의 단리(천연 발생 아미노산 서열 변형체의 경우), 또는 인간화된 항-HER3 항체의 초기 제조된 변형체 또는 비-변형체 형태의 올리고뉴클레오티드-중재된(또는 부위-유도된) 돌연변이생성, PCR 돌연변이생성, 및 카세트(cassette) 돌연변이생성에 의한 제조가 포함된다.

항체의 공유결합 변형의 또 다른 유형은 항체를 다양한 비단백질성 중합체중 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호; 제4,179,337호에 제시된 방식으로 연결시킴을 포함한다.

본 발명에 따른 중쇄 및 경쇄 가변성 도메인은 프로모터, 번역 개시, 불변성 영역, 3' 비번역된 영역, 다중아데닐화(polyadenylation), 및 전사 종결의 서열과 조합되어 발현 벡터 작성물을 형성한다. 중쇄 및 경쇄 발현 작성물은 숙주내로 단일 벡터내로 조합되거나, 공동-형질감염되거나, 순차적으로 형질감혐되거나, 별도로 형질감염되고, 이는 이어서 양쪽 쇄를 발현하는 단일 숙주 세포를 형성한다.

본 발명의 한 양태는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물이다. 본 발명의 또 다른 양태는 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다. 본 발명의 추가의 양태는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 약학 담체와 함께 제형화된, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물, 예를 들어 약학 조성물을 제공한다.

추가로, 본 발명에 따른 항-HER3 항체는 암의 치료에 특히 유용한 것으로 판명되었다.

따라서, 본 발명의 한 양태는 암의 치료를 위한 상기 약학 조성물이다.

본 발명의 또 다른 양태는 암을 치료하기 위한 본 발명에 따른 항체이다.

본 발명의 또 다른 양태는 암의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 항체를 암의 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써 암을 앓는 환자를 치료하는 방법이다.

본원에 사용될 경우, "약학 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항생제 및 항곰팡이제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 상피 투여에 적합한다(예를 들어 주사 또는 주입에 의해).

본 발명의 조성물은 당분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 당분야의 숙련가라면 이해할 수 있듯이, 투여의 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 특정 투여 경로에 의해 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물은 그의 실활을 방지하는 물질로 코팅되거나 이와 함께 공동-투여될 필요가 있을 수 있다. 예를 들면, 화합물은 적절한 담체, 예를 들면, 리포솜(liposome), 또는 희석제중에서 피험체에게 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제로는 염수 또는 수성 완충 용액이 포함된다. 약학 담체로는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 주사가능한 멸균 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당분야에 공지되어 있다.

"비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"이라는 문구는 본원에 사용될 경우, 대체적으로 주사에 의한, 장성(enteral) 투여 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 제한없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 관절낭내, 안와내(intraorbital), 심장내, 피내, 복강내, 경기관(transtracheal), 피하, 큐티클하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다.

용어 "암"은 본원에 사용될 경우, 예를 들면, 폐암, 비소세포 폐(NSCL: non small cell lung)암, 기관지폐포암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피하 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역 암, 복부암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 음문 암종, 호지킨병(Hodgkin's Disease), 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 암종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장 세포 암종, 신우요관 암종, 중피종, 간세포암, 쓸개암, 중추신경계(CNS)의 신생물, 척추 종양, 뇌간 신경교종, 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 뇌수막종, 편평상피 세포 암종, 뇌하수체 선종, 림프종, 림프성 백혈병, 및 상기 임의의 암의 난치성 형태, 또는 하나 이상의 상기 암의 조합이 포함된다. 바람직하게는 이러한 암은 유방암, 폐암, 두경부암, 또는 췌장암, 바람직하게는 폐암, 두경부암, 또는 췌장암이다. 바람직하게는 이러한 암은 추가로 HER3 발현 또는 과발현, 더 바람직하게는 HER3 과발현을 특징으로 한다.

이들 조성물은 또한 보조제, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 상기 멸균 절차, 및 다양한 항생제 및 항곰팡이제, 예를 들면, 파라벤(paraben), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함 둘 다에 의해 확보될 수 있다. 또한, 등장성 제제, 예컨대 당, 염화 나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 요망될 수 있다. 더욱이, 주사가능한 약학 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 혼입에 의해 야기될 수 있다.

선택된 투여 경로와 무관하게, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 약학 조성물은 당분야의 숙련가에게 공지된 종래의 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 투여 형태로 제형화된다.

본 발명의 약학 조성물중 활성 구성성분들의 실제 투여량 수준은 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대한 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적이지만 환자에게 무독성인 활성 구성성분의 양을 수득하도록 다양할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 분비 속도, 치료의 기간, 사용된 특정 조성물과 조합된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 증상, 일반적 건강 및 이전 의학적 병력, 및 의학 분야에 공지된 유사한 인자를 비롯한 다양한 약물동력학적 인자에 따라 달라진다.

조성물은 멸균되어야 하고 주사기에 의해 분배가능한 정도로 유동성이어야 한다. 물에 더하여, 담체는 바람직하게는 등장성 완충된 염수 용액이다.

적절한 유동성은, 예를 들면, 코팅물, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 조성물에 등장성 제제, 예를 들면, 당, 다가알코올, 예컨대 만니톨 또는 솔비톨, 및 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직하다.

하기 실시예, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되고, 이의 진정한 범주는 첨부된 특허청구범위에 제시된다. 본 발명의 취지에서 벗어나지 않고 제시된 절차로 변형이 이루어질 수 있음을 알아야 한다.

서열 목록에 대한 설명

서열 번호 1 중쇄 CDR3H, Mab 205.10

서열 번호 2 중쇄 CDR2H, Mab 205.10

서열 번호 3 중쇄 CDR1H, Mab 205.10

서열 번호 4 경쇄 CDR3L, Mab 205.10

서열 번호 5 경쇄 CDR2L, Mab 205.10

서열 번호 6 경쇄 CDR1L(변형체 1), Mab 205.10

서열 번호 7 경쇄 CDR1L(변형체 2), Mab 205.10

서열 번호 8 중쇄 가변성 도메인 VH, Mab 205.10

서열 번호 9 경쇄 가변성 도메인 VL, Mab 205.10.1

서열 번호 10 경쇄 가변성 도메인 VL, Mab 205.10.2

서열 번호 11 경쇄 가변성 도메인 VL, Mab 205.10.3

서열 번호 12 인간 카파 경쇄 불변성 영역

서열 번호 13 IgG1으로부터 유도된 인간 중쇄 불변성 영역

서열 번호 14 L234A 및 L235A 상에서 성숙된 IgG1로부터 유도된 인간 중쇄 불변성 영역

서열 번호 15 IgG4로부터 유도된 인간 중쇄 불변성 영역

서열 번호 16 S228P 상에서 성숙된 IgG4로부터 유도된 인간 중쇄 불변성 영역

서열 번호 17 인간 HER3

실시예

실시예 1

면역화

NMRI 마우스를 hHER3-ECD(인하우스: inhouse)로 면역화시키고, hu-HER3-ECD로 부스팅(boosting)시켰다. HER1/2/3-ECD-ELISA에 대하여 혈청 샘플을 시험함으로써 면역 반응을 모니터링하였다. 충분한 역가의 항-HER3 면역글로불린과 함께 마우스로부터의 비장 세포를, 마우스 골수종 세포주 P3X63 Ag8.653와의 융합에 의한 이후의 불멸화를 위해 냉동시켰다. 1회의 융합을 수행하고, 교차-반응성을 보이지 않지만 HER3-ECD에 결합하는 하이브리도마 상청액을 HER1/2/-ECD-ELISA로 스크리닝하고, 항-HER3 선택성 하이브리도마를 선택하였다. 관련 하이브리도마를 단일 세포 FACS 분류화에 의해 클로닝하였다. 상이한 하이브리도마로부터의 단일 세포 클론을 시험관내에서 배양하여 특징화를 위해 조직 배양 배지에서 항체를 생산하였다. HER3 인산화, AKT 인산화 및 MDA-MB-175 세포의 종양 세포 증식을 저해하는 이들의 능력에 대해 항체를 선택적으로 결정하였다(아래 실시예 참조). 수득된 항체로부터, 하나를 추가로 인간화하여 각각 VH 및 VL 또는 CDR을 갖는 하기 항체 Mab 205.10.1, Mab 205.10.2 및 Mab 205.10.3을 제공하였다.

한 실시태양에서, 인간 기원의 불변성 영역, 예를 들어 서열 번호 12 및 13을 사용하여 이러한 항체를 제조하였다.

실시예 2

결합 검정

a) 인간 HER3 ECD 로의 결합을 위한 항원 특이적 ELISA

스트렙타비딘 결합 단백질(SBP: Streptavidin Binding Protein)에 융합된 가용성 인간 HER3 세포외 도메인을 스트렙타비딘 플레이트 상에 포획하였다. 항체의 SPB-CDCP1로의 최적 결합을 정의하기 위해, 마이크로코트(MicroCoat)(독일 베른리에드)(확인 번호 1734776-001)에 의해 전달된 384-웰 폴리스티렌 플레이트(NUNC, 스트렙타비딘-코팅됨)를 순수하고 단계별로 희석된 HEK293 상청액[BSA/IMDM 완충액중: 100 mg/㎖ BSA 분별물 V, 로슈(Roche) 10735078001, 이소코브의 변형된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbeccos Medium)에 용해됨]으로 코팅하였다. 키메라성 205 항체의 마우스 보정 곡선을 사용하여, 미세역가 플레이트의 스트렙타비딘 결합 용량에 대한 HEK293 상청액의 최적 희석 인자를 확인하였다. 표준 코팅을 위해, SBP-HER3 포함 HEK293 상청액을 희석하고(1:15 내지 1:40) 2 내지 8℃에서 하룻밤 처리하였다(웰당 25 ㎕). 남아있는 미결합된 SBP-HER3을 제거하기 위해 미세역가 플레이트를 철저히 세척해야 한다.

본 발명에 따른 항체를 희석하지 않거나 12-단계-희석을 사용하여 시험하였다. 웰당 12.5㎕의 각각의 샘플을 90분 동안 실온에서 항온처리하였다. PBS-T[PBS중 0.1% 트윈(Tween) 20]를 사용하여 철저히 세척한 후, 인간 항체용 HRP[잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 코드 번호: 109-036-098, 희석 1:10000]와 커플링된 25 ㎕의 염소 항-인간 IgG 항체를 첨가하고 1시간 동안 항온처리하였다. 철저히 세척한 후, 항체의 결합을 ABTS 태블릿(tablet)[로슈 디애그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 카탈로그 번호: 1112422]으로 검출하였다. 405 nm/492 nm에서의 흡광도를 표준 광도계로 측정하였다.

하기 표는 상이한 항체의 상대적 결합 비를 보여준다.

항체	hu_HER3-ECD-ELISA c(㎍/㎖)	IgG-ELISA c(㎍/㎖)	활성(hu_HER3-ECD/IgG로의 결합 비)
Mab 205.10.1	583.1	785.0	0.74
Mab 205.10.2	396.4	508.0	0.78
Mab 205.10.3	505.4	608.4	0.83

b) 비아코어 분석에 의한 인간 HER3 의 세포외 -도메인-( ECD ) 단편으로의 항-HER3 항체의 결합 특징:

친화도 측정을 위해, 30 μg/㎖의 항 Fcγ 항체[염소로부터, 잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research)]를 SPR 기기(비아코어 T100) 상에서 표준 아민-커플링 및 블로킹 화학에 의해 CM-5 센서 칩의 표면에 커플링시켰다. 컨쥬게이션 후, 항-HER3 항체를 25℃에서 5 ㎕/분의 유동 속도로 주입한 후, 인간 HER3 ECD를 30 ㎕/분으로 연속적으로 희석하였다(0 nM에서 1000 nM). 결합 실험을 위한 이동 완충액으로서, PBS/0.1% BSA를 사용하였다. 이어서 칩을 10 mM 글리신-HCl, pH 2.0 용액의 60s 펄스로 재생시켰다.

열동력학적 매개변수(K_D, HER3으로의 결합 상수)를 랑뮤(Langmuir) 1:1 결합 모델에 의해 계산하였다.

항체	결합 친화도 K_D[M]
Mab 205.10.1	2.0×10^-9
Mab 205.10.2	1.1×10^-9
Mab 205.10.3	2.0×10^-9

경쟁 결합 검정(비아코어)에서 Mab205.10.1, Mab205.10.2, 및 Mab205.10.3은 모두 동일한 에피토프에 결합하였다. 국제 특허출원 공개공보 WO 제2007/077028호에 기재된 항-HER3-항체 U1-7, U-53 및 U1-59, 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2008/100624호에 기재된 Ab#6을 이러한 검정에서 조사하였고, 이는 항체 Mab205.10.1. Mab205.10.2, 및 Mab205.10.3과 상이한 에피토프에 결합한 것으로 밝혀졌다.

실시예 3

a) MCF7 , FaDu 및 Mel - Juso 세포에서의 HER3 인산화의 저해

검정을 하기 프로토콜에 따라 MCF7 및 FaDu 세포에서 수행하였다: 10% FCS를 갖는 RPMI1640 배지에서 500,000 세포/웰로 폴리-D-라이신 코팅된 6-웰 플레이트에 세포를 식종(seeding)한다. 24 시간 동안 항온처리한다. 흡출에 의해 배지를 제거하고, 하룻밤 500 ㎕/웰 RPMI 1640(0.5% FCS 함유)과 함께 항온처리한다. 500 ㎕ RPMI 1640(0.5% FCS 함유)에 항체를 첨가한다. 1시간 동안 항온처리한다. HRG-1b(최종 농도 500ng/㎖)를 10분 동안 첨가한다. 세포를 용해시키기 위해 배지를 제거하고 80 ㎕의 빙냉 트리톤(Triton)-X-100 세포 용해 완충액을 첨가하고 5분 동안 얼음 위에서 항온처리한다. 용해물을 1.5 ㎖의 반응 관내로 전달하고 14000 rpm에서 15분 동안 4℃에서 원심분리한 후, 상청액을 새로운 반응 관으로 옮긴다. SDS 적재 완충액중 동량의 단백질을 함유한 샘플을 SDS PAGE 상에서 분리하고, 반-건조 웨스턴 블롯(Western Blot)을 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 블로팅한다. 막을 1xNET-완충액 + 0.25% 겔라틴으로 1시간 동안 블로킹하고, pHER3을 항체 α-포스포-HER3/ErbB3(Tyrl289)(21D3)에 의해, 세포 신호화, #4791 및 HER3을 항체 α-ErbB3(C-17), 산타 크루즈(Santa Cruz), #sc-285에 의해 각각 검출한다. 세척하고 POD 커플링된 2차 항체에 의한 신호를 검출한 후, 밴드를 덴소미터(densometer)에 의해 스캐닝한다. 항-HER3 항체 Mab205.10.1, Mab205.10.2, 및 Mab205.10.3, 및 또한 국제 특허출원 공개공보 WO 제2007/077028호에 기재된 항-HER3-항체 U1-7, U-53 및 U1-59, 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2008/100624호에 기재된 Ab#6을 조사하였다. MCF7 세포에서 수용체 인산화에 대한 항-HER3 항체의 저해율(%)은 하기 및 도 1a에 제시된다.

추가의 실험에서, 항-HER3 항체 Mab205.10.2, 및 또한 국제 특허출원 공개공보 WO 제97/35885호에 기재된 항-HER3-항체 8B8.2D9, 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2003/013602호에 기재된 1B4C3 및 2D1D12를 조사하였다. MCF7 세포에서 수용체 인산화에 대한 항-HER3 항체의 저해율(%)은 하기 및 도 1b에 제시된다.

FaDu 세포에서 수용체 인산화에 대한 항-HER3 항체의 저해율(%)은 하기에 제시된다.

추가의 실험에서, 항-HER3 항체 Mab205.10.2, 및 또한 국제 특허출원 공개공보 WO 제97/35885호에 기재된 항-HER3-항체 8B8.2D9, 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2003/013602호에 기재된 1B4C3 및 2D1D12, 및 105.5[밀리포어(Millipore), 카탈로그 번호 05-47, 국제 특허출원 공개공보 W0 제2003/013602호에서 α-HER^ECD로 지칭됨)를 Mel-Juso 세포에서 조사하였다. Mel-Juso 세포에서의 검정을 MCF7 및 FaDu 세포에 대해 전술된 프로토콜에 따라 수행하였다. 세포 수 및 배지 부피를 12-웰 플레이트에 적응시켰다. Mel-Juso 세포에서 수용체 인산화에 대한 항-HER3 항체의 저해율(%)은 하기 및 도 1c에 제시된다.

b) AKT 인산화( ELISA )

검정을 하기 프로토콜에 따라 MCF7 세포에서 수행하였다: 10% FCS를 갖는 RPMI1640 배지에서 30000 세포/웰로 폴리-D-라이신 코팅된 96-웰 플레이트로 MCF7 세포를 식종하고, 24 시간 동안 항온처리한다. 깨끗한 종이 타월 상에서 두드려서 배지를 제거하고, 200 ㎕의 혈청-부재 배지로 조심스럽게 세척하고, 하룻밤 100 ㎕/웰의 RPMI 1640(0.5% FCS 함유)과 함께 항온처리한다. 상기와 같이 배지를 제거하고; 100 ㎕의 RPMI 1640(0.5% FCS 함유)에 항체를 첨가하고 1.5 시간 동안 항온처리한다.

HRG-1b(최종 농도 5ng/㎖)를 10분 동안 첨가한다. 상기와 같이 배지를 제거한다. 세포를 용해시키기 위해 얼음상의 100 ㎕ 빙냉 세포 용해 완충액에 세포를 첨가하고, 약 5회 피페팅(pipetting)하여 재현탁시킨다. 플레이트를 3000 rpm으로 1O분 동안 4℃에서 원심분리하고 80 ㎕ 상청액(또는 분취량)을 새로운 폴리프로필렌 플레이트로 옮기고 LN2에서 충격-동결시킨다. 검정할 때까지 -80℃에서 저장한다.

AKT1,2(포스포-Ser473) EIA 키트 어세이 디자인스(Kit Assay Designs) #900-162:샘플(1:10 희석됨)을 AKT의 N-말단에 특이적인 마우스 MAB로 코팅된 플레이트에 첨가한다. 실온에서 진탕하에 1 시간 동안 항온처리한다. 5배 세척하고, 비오티닐화된(biotinylated) 항-포스포-AKT(Ser473)와 1 시간 동안 실온에서 진탕하에 항온처리한다. 5회 세척하고, 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이트와 함께 30분 동안 실온에서 진탕하에 항온처리한다. 5회 세척하고, TMB 기질과 함께 30분 동안 실온에서 진탕하에 항온처리한다. 중단하고 450 nm에서 판독한다.

Mab 205.10.2는 0.06 μg/㎖의 AKT 인산화 저해에 대한 IC₅₀을 나타내었다.

MCF7 세포에 대해 기재된 바와 같이 수행된 Mel-Juso 세포에서의 pAKT ELISA에서, Mab 205.10.2는 0.28 μg/㎖의 AKT 인산화 저해에 대한 IC₅₀을 나타내었고, 모든 다른 분석 항체는 50을 초과하는 IC₅₀을 나타낸다.

c) 종양 세포 증식의 저해

세포 증식 검정에서 HER3 항체 Mab205.10.1, Mab205.10.2, 및 Mab205.10.3의 항-종양 효능을, MDA-MB-175 세포(VII 인간 유방 암종, ATCC 카탈로그 번호 HTB-25)를 사용하여 평가하였다. 웰당 20,000개 세포를, DMEM/F12 세포 배양 배지(10% FCS 함유)를 갖는 멸균 96 웰 조직 배양 플레이트에 식종하고, 37℃±1℃에서 5% ±1% C0₂와 함께 1일 동안 항온처리하였다. 세포는 약 1.5일의 2배 시간을 갖는 느린 성장 세포이다. 항-HER3 항체를 일련의 희석비로 첨가하고, 추가로 6일 동안 항온처리하였다. 이어서 세포 생존능력을 알라마블루(alamarBlue: 등록상표) 판독기로 평가하였다. 세포 생존능력이 대조표준의 50% 이상 감소한 경우, IC₅₀ 값을 각각의 항체 농도에 대한 3중값의 평균에 의해 계산하였으며; 달리는, 가장 높은 농도에서의 세포 생존능력의 저해율%이 50% 미만으로 감소한 경우, IC₅₀은 계산될 수 없었고, 이는 IC₅₀[㎍/㎖]이 가장 높은 농도를 초과함을 지시한다. 또한, 국제 특허출원 공개공보 WO 제2007/077028호에 기재된 항-HER3-항체 U1-59, 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2008/100624호에 기재된 Ab#6을 조사하였다.

추가의 실험에서, 국제 특허출원 공개공보 WO 제97/35885호에 기재된 항-HER3-항체 8B8.2D9, 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2003/013602호에 기재된 1B4C3을 조사하였다.

항체	IC₅₀[㎍/㎖]
8B8.2D9	> 100 ㎍/㎖(100 ㎍/㎖에서 29% 저해)
1B4C3	> 100 ㎍/㎖(100 ㎍/㎖에서 26% 저해)

실시예 5

1 ㎍/㎖ 특정 용해율%에 의한 KPL -4 종양 세포에서의 시험관내 ADCC

RPMI1640 + 2 mM L-알라닐-L-글루타민 + 10% FCS중 표적 세포 KPL4(ADCC), 유방 암종, 배양물을 트립신/EDTA[깁코(Gibco) # 25300-054]에 의해 급속 성장기에서 수집하였다. 세척 단계 및 세포 수와 생존능력 검사 이후, 필요한 분취물을 칼세인(calcein)[인비트로겐(Invitrogen) #C3100MP; 5 ㎖ 배지중에서 5 Mio 세포를 위해 1 바이알을 50 ㎕ DMSO에 재현탁시킴]과 함께 세포 항온처리기에서 30분 동안 37℃에서 표지화하였다. 이후, 세포를 AIM-V 배지로 3회 세척하고, 세포 수 및 생존능력을 검사하고, 세포 수를 0.3 Mio/㎖로 조정하였다.

한편, 효과자 세포로서의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 밀도 구배 원심분리[히스토파크(Histopaque)-1077, 시그마(Sigma) # H8889]에 의해 제조업체의 프로토콜(세척 단계: 400g에서 1회 및 350g에서 2회; 각각 10분)에 따라 제조하였다. 세포 수 및 생존능력을 검사하고 세포 수를 15 Mio/㎖로 조정하였다.

100 ㎕의 칼세인-염색된 표적 세포를 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 50 ㎕ 희석되고, 푸코스제거된 항체(Mab205.10.1, Mab205.10.2, Mab205.10.3, 제조는 이후 참조) 및 50 ㎕ 효과자 세포를 첨가하였다. 몇몇 실시예에서, 표적 세포를 레디뮨(등록상표) NF 액체[ZLB 베링(Behring)]와 10 mg/㎖ 레디뮨의 농도로 혼합하였다.

표적과 효과자 세포를 항체없이 동시배양하여 결정되는 자발적 용해, 및 단지 표적 세포의 1% 트리톤 X-100 용해에 의해 결정되는 최대 용해를 대조표준에 대해 수행하였다. 플레이트를 4 시간 동안 37℃에서 습윤화된 세포 항온처리기에서 항온처리하였다.

제조업체의 지시에 따라 세포독성 검출 키트(LDH 검출 키트, 로슈 # 1 644 793)를 사용하여 손상된 세포로부터의 락테이트 탈수소효소(LDH: Lactate Dehydrogenase) 방출을 측정함으로써 표적 세포의 사멸을 평가하였다. 간단히, 각각의 웰로부터의 100 ㎕ 상청액을 키트로부터의 100 μ㎕ 기질과 편평한 바닥의 투명한 96웰 플레이트에서 혼합하였다. 기질의 색 반응의 V_최대 값을 적어도 10분 동안 ELISA 판독기에서 490 nm에서 결정하였다. 특정 항체-중재된 사멸의 백분율을 다음과 같이 계산하였다: ((A - SR)/(MR - SR)) x l00, 여기서 A는 특정 항체 농도에서의 V_최대의 평균이고, SR은 자발적 방출의 V_최대의 평균이고, MR은 최대 방출의 V_최대의 평균이다.

추가의 판독으로서, 손상되지 않은 표적 세포의 칼세인 보유를, 보레이트 완충액(5 mM 붕산 나트륨 + 0.1% 트리톤)에서 남아 있는 표적 세포를 용해시키고 형광 플레이트 판독기에서 칼세인 형광물질을 측정함으로써 평가하였다. Mab205.10.1, Mab205.10.2, Mab205.10.3은 1 ㎍/㎖에 의해 약 40 내지 60%의 특이적 용해의 ADCC[KPL-4]를 나타내었다.

푸코스제거된 항체(Mab205.10.1, Mab205.10.2, Mab205.10.3)를, 4개의 플라스미드[항체 발현을 위해 2개, 융합 GnTIII 폴리펩티드 발현을 위해 1개(GnT-III 발현 벡터), 및 만노시다아제(mannosidase) II 발현을 위해 1개(골지(Golgi) 만노시다아제 II 발현 벡터)]에 의해 각각 4:4:1:1의 비로 HEK293 또는 CHO 세포에서 공동-형질감염시킴으로써 제조하였다.

전체 항체 중쇄 및 경쇄 DNA 서열을 포유동물 발현 벡터내로(하나는 경쇄를 위해서, 하나는 중쇄를 위해서) MPSV 프로모터의 제어하에 합성 폴리A 부위의 업스트림에서 서브클로닝하였고, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 운반한다. HEK293-EBNA 세포 또는 CHO 세포를 항체 중쇄 및 경쇄 발현 벡터에 의해 칼슘 포스페이트-형질감염 접근법을 사용하여 공동-형질감염시킴으로써 항체를 생산하였다. 기하급수적으로 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 칼슘 포스페이트 방법에 의해 형질감염시켰다. 당조작된 항체의 생산을 위해, 4개의 플라스미드[항체 발현을 위해 2개, 융합 GnTIII 폴리펩티드 발현을 위해 1개(GnT-III 발현 벡터), 및 만노시다아제 II 발현을 위해 1개(골지 만노시다아제 II 발현 벡터)]에 의해 각각 4:4:1:1의 비로 공동-형질감염시킴으로써 세포를 제조하였다. 10% FCS로 보충된 DMEM 배양 배지를 사용하여 T 플라스크에서 접착 단일층 배양물로서 세포를 성장시키고, 이들이 50 내지 80% 융합(cofluent)될 경우 형질감염시켰다. T150 플라스크의 형질감염을 위해, 1500만개의 세포를 형질감염 24 시간 전에 FCS(10% V/V 최종)로 보충된 25 ㎖의 DMEM 배양 배지에서 식종하고, 세포를 하룻밤 37℃에서 5% C0₂ 대기를 갖는 항온처리기에 두었다. 생산되는 모든 항체를 위해, DNA, CaC1₂ 및 물의 용액을, 188 ㎍의 총 플라스미드 벡터 DNA[4개의 플라스미드(항체 발현을 위해 2개(하나는 경쇄이고, 하나는 중쇄임)), 융합 GnTIII 폴리펩티드 발현을 위해 1개(GnT-III 발현 벡터), 및 만노시다아제 II 발현을 위해 1개(골지 만노시다아제 II 발현 벡터), 각각 4:4:1:1의 비], 938 ㎕의 최종 부피로의 물, 및 938 ㎕의 1M CaC1₂ 용액을 혼합하여 제조하였다. 이 용액에, 1876 ㎕의 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na₂HP0₄ 용액(pH 7.05)을 첨가하고, 즉시 10초 동안 혼합하고, 실온에서 20초 동안 정치시켰다. 현탁액을 2% FCS로 보충된 46 ㎖의 DMEM으로 희석하고, 존재하는 배지 대신 2개의 T150 플라스크로 나눴다.

세포를 37℃에서, 5% C0₂의 존재하에 17 내지 20 시간 동안 항온처리한 후, 배지를 25 ㎖ DMEM(10% FCS)으로 대체하였다. 조건화된 배양 배지를 형질감염 7일 후 15분 동안 210 x g에서 원심분리하여 수확하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 ㎛ 필터), 0.01% w/v의 최종 농도의 나트륨 아자이드를 첨가하고, 4℃에서 유지시켰다.

분비된 푸코스제거된 항체를 정제하고, 항체의 Fc 영역에 결합된 올리고당을, MALDI/TOF-MS(예를 들어 국제 특허출원 공개공보 WO 제2008/077546호에 기재된 바와 같음)에 의해 분석하였다. 상기 분석을 위해, 올리고당을 PNGaseF 소화에 의해 항체로부터 효소적으로 방출하고, 이때 항체는 PVDF 막 상에 고정화되거나 용액중에 존재한다. 방출된 올리고당을 함유하는 생성된 소화 용액을 MALDI/TOF-MS 분석을 위해 직접 제조하거나, 추가로 EndoH 글리코시다아제로 소화시킨 후 MALDI/TOF-MS 분석을 위해 동일하게 제조하였다. Asn297에서 당 쇄내에 푸코스의 분석된 양은 50 내지 20%였다.

실시예 6

생체내 항종양 효능

항체 Mab205.10.1, Mab205.10.2, Mab205.10.3의 생체내 항종양 효능을 SCID 베이지 또는 누드 마우스 상에 이식된 다양한 종양 기원(예를 들어 폐암, SCCHN, 유방암 및 췌장암)의 모델에 기초한 세포 및 단편에서 검출할 수 있었다. 실시예 데이터는 SCCHN 이종이식 모델 FaDu(세포주-기초함), 유방암 모델 MAXF449(단편-기초함) 및 NSCLC 모델 7177(단편-기초함)에 대해 제시된다.

시험 제제

푸코스제거된 Mab205.10.2(도 2, 3, 4에서 지정된 Mab 205)를 독일 펜츠버그 소재의 로슈로부터의 스톡(stock) 용액으로서 제공하였다. 항체 완충액은 히스티딘을 포함하였다. 항체 용액을 주사 전에 스톡으로부터의 완충액중에 적절히 희석하였다.

세포주 및 배양 조건

FaDu 인간 HNSCC 세포를 ATCC로부터 기원적으로 수득하였다. 종양 세포주를 10% 태내 소 혈청, 2 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨 및 0.1 mM NEAA가 보충된 MEM 이글(Eagle) 배지에서 수-포화된 대기중에서 37℃ 및 5% C0₂하에 통상적으로 배양하였다. 계대배양을 3일에 한번씩 트립신/EDTA 스플리팅(splitting)(1회)에 의해 수행하였다.

종양 단편

종양 단편을 환자로부터 고유적으로 취하고 누드 공여자 마우스에게 피하로 이식하였다. 후속적으로 종양 단편을 생체내로 연속 계대배양하였다. 임상전 연구를 위해, 작은 종양 단편을 공여자 마우스로부터 생성하고 추가의 누드 마우스에 피하로 위치시켰다(MAXF449, 7177).

동물

암컷 SCID 베이지 또는 누드 마우스를 사육자[예를 들어, 독일 슐츠펠트 소재의 칼스 리버(Charles River)]로부터 구입하고, 인가된 지침[GV-솔라스(GV-Solas); 펠라사(Felasa); 티에르쉬게(TierschG)]에 따라 매일 12 시간의 명/12 시간의 암 주기로 특정-병원체-부재 조건하에 유지시켰다. 실험적 연구 프로토콜은 지역 정부에 의해 검토되고 승인되었다. 도착 후, 동물을 1주일 동안 동물 시설의 격리 부분에서 유지시켜 새로운 환경에 익숙하게 하고 관찰하였다. 연속적인 건강 모니터링을 규칙적인 기초하에 수행하였다. 식이 음식[프로비미 클리바(Provimi Kliba) 3337] 및 물(산성화됨, pH 2.5 내지 3)을 자유식으로 제공하였다.

모니터링

동물을 임상적 증후 및 부작용의 검출을 위해 매일 조절하였다. 실험 전체를 통해 모니터링하기 위해 동물의 체중을 기록하였다.

동물의 치료

종양 크기 중앙값이 약 100 내지 150 ㎜³인 경우 동물을 랜덤화하여 세포 또는 단편을 이식한 후 동물 치료를 시작하였다. 항체를 단일 제제로서 모델에 따라 3 내지 6주 동안 매주 1회 10 또는 25 ㎎/㎏으로 복강내로(q7d) 투여하였다. 상응하는 비히클을 동일한 날짜에 투여하였다.

항체 효능

A) FaDu HNSCC 이종이식편

FaDu HNSCC 이종이식편을 갖는 마우스를 연구 14일에서 35일까지 항체 Mab205.10.2로 치료하였다. 결과로서, Mab205.10.2 항체로 치료한 결과 피하 FaDu 이종이식편의 종양 정체에 의한 상당한 항-종양 효능을 나타냈다. 종양 성장 저해(TGI: Tumor Growth Inhibition)는 98%로 계산되었다.

Mab 205(10 ㎎/㎏ q7dx3, 복강내)에 의한 치료 결과 FaDu SCCHN 이식된 이종이식편의 종양 정체가 초래되었다(도 2 참조).

B) MAXF449 유방암 이종이식편

MAXF449 유방암 이종이식편을 갖는 마우스를 항체 Mab205.10.2로 연구 64일에서 91일까지 치료하였다. 결과로서, Mab205.10.2 항체에 의한 치료는 MAXF449 이종이식편의 종양 정체에 의한 상당한 항-종양 효능을 나타냈다. 종양 성장 저해(TGI)는 100% 이상이었다.

Mab 205(1O ㎎/㎏ q7d, 복강내)에 의한 치료 결과 MAXF449 유방암 이식된 이종이식편의 종양 정체가 초래되었다(도 3 참조).

C) 7177 NSCLC 이종이식편

7177 NSCLC 이종이식편을 갖는 마우스를 항체 Mab205.10.2로 연구 28일에서 56일까지 치료하였다. 결과로서, Mab205.10.2 항체에 의한 치료는 7177 NSCLC 이종이식편의 종양 정체에 의한 상당한 항-종양 효능을 나타냈다. 종양 성장 저해(TGI)는 100% 이상이었다.

Mab 205(25 ㎎/㎏ q7d, 복강내)에 의한 치료 결과 7177 NSCLC 이식된 이종이식편의 종양 정체가 초래되었다(도 4 참조).

Claims

서열 번호 8과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변성 도메인 VH, 및 서열 번호 9, 서열 번호 10 또는 서열 번호 11과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변성 도메인 VL을 포함하는, 인간 HER3에 결합하는 항체.
제 1 항에 있어서,
경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 9와 95% 이상의 서열 동일성을 갖는, 항체.
제 1 항에 있어서,
경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 10과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는, 항체.
제 1 항에 있어서,
경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 11과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는, 항체.
제 1 항에 있어서,
중쇄 가변성 도메인 VH가 서열 번호 8이고; 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 9, 서열 번호 10 또는 서열 번호 11이거나; 또는 이의 인간화된 형태인 것을 특징으로 하는, 항체.
제 5 항에 있어서,
중쇄 가변성 도메인 VH가 서열 번호 8이고; 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 9 또는 서열 번호 11인 것을 특징으로 하는, 항체.
제 5 항에 있어서,
중쇄 가변성 도메인 VH가 서열 번호 8이고; 경쇄 가변성 도메인 VL이 서열 번호 10인 것을 특징으로 하는, 항체.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
단일클론성인 것을 특징으로 하는, 항체.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간화된 것을 특징으로 하는, 항체.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
IgG4 하위부류의 항체인 것을 특징으로 하는, 항체.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
IgG1 하위부류인 것을 특징으로 하는, 항체.
제 7 항에 있어서,
Asn297에서 당 쇄에 의해 글리코실화되고, 이로써 상기 당 쇄 내의 푸코스의 양이 65% 이하인 것을 특징으로 하는, 항체.
제 8 항에 있어서,
당 쇄 내의 푸코스의 양이 5 내지 65%인, 항체.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 치료를 위한 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
암 치료를 위한, 항체.
인간 HER3에 결합하는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하고, 상기 항체가 제 1 항에 따른 가변성 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키기 위해 제 13 항에 따른 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 14 항에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
제 14 항에 따른 핵산을 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키고, 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체의 제조 방법.