CN101048428A - 利用死亡受体配体和cd20抗体的方法 - Google Patents
利用死亡受体配体和cd20抗体的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101048428A CN101048428A CNA2005800364755A CN200580036475A CN101048428A CN 101048428 A CN101048428 A CN 101048428A CN A2005800364755 A CNA2005800364755 A CN A2005800364755A CN 200580036475 A CN200580036475 A CN 200580036475A CN 101048428 A CN101048428 A CN 101048428A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- cell
- apo
- death receptor
- excitability
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
- A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了利用死亡受体配体,诸如Apo-2配体/TRAIL多肽或死亡受体抗体,及CD20抗体来治疗诸如癌症和免疫相关疾病等状况的方法。本发明的实施方案包括将Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体诸如DR5抗体和DR4抗体与CD20抗体联合使用的方法。
Description
相关申请
根据119(e)条款,本申请要求2004年9月8日提交的临时申请60/607,834和2005年3月30日提交的临时申请60/666,550的优先权,在此收入其内容作为参考。
发明领域
本发明涉及利用死亡受体配体和CD20抗体的方法。更具体的说,本发明涉及将Apo-2配体/TRAIL或死亡受体抗体与CD20抗体联合用于治疗诸如癌症和免疫相关疾病等多种病理紊乱的方法。
发明背景
本领域已经鉴定了属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的多种配体和受体。在这些配体中有肿瘤坏死因子-α(“TNF-α”)、肿瘤坏死因子-β(“TNF-β”或“淋巴毒素-α”)、淋巴毒素-β(“LT-β”)、CD30配体、CD27配体、CD40配体、OX-40配体、4-1BB配体、LIGHT、Apo-1配体(也称作Fas配体或CD95配体)、Apo-2配体(也称作Apo2L或TRAIL)、Apo-3配体(也称作TWEAK)、APRIL、OPG配体(也称作RANK配体、ODF或TRANCE)和TALL-1(也称作BlyS、BAFF或THANK)(参见例如Ashkenazi,Nature Review,2:420-430(2002);Ashkenazi and Dixit,Science,281:1305-1308(1998);Ashkenazi andDixit,Curr.Opin.Cell Biol.,11:255-260(2000);Golstein,Curr.Biol.,7:750-753(1997);Wallach,Cytokine Reference,Academic Press,2000,pages377-411;Locksley et al.,Cell,104:487-501(2001);Gruss and Dower,Blood,85:3378-3404(1995);Schmid et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,83:1881(1986);Dealtryet al.,Eur.J.Immunol.,17:689(1987);Pitti et al.,J.Biol.Chem.,271:12687-12690(1996);Wiley et al.,Immunity,3:673-682(1995);Browning et al.,Cell,72:847-856(1993);Armitage et al.,Nature,357:80-82(1992);WO97/01633,公开于1997年1月16日;WO 97/25428,公开于1997年7月17日;Marsters et al.,Curr.Biol.,8:525-528(1998);Chicheportiche et al.,Biol.Chem.,272:32401-32410(1997);Hahne et al.,J.Exp.Med.,188:1185-1190(1998);WO 98/28426,公开于1998年7月2日;WO 98/46751,公开于1998年10月22日;WO 98/18921,公开于1998年5月7日;Moore et al.,Science,285:260-263(1999);Shu et al.,J.Leukocyte Biol.,65:680(1999);Schneider etal.,J.Exp.Med.,189:1747-1756(1999);Mukhopadhyay et al.,J.Biol.Chem.,274:15978-15981(1999))。
由这些TNF家族配体介导的多种细胞应答的诱发通常是通过它们与特定细胞受体结合而开始的。有些但非所有TNF家族配体结合细胞表面“死亡受体”,并由此诱发多种生物学活动以激活胱天蛋白酶或者执行细胞死亡或凋亡途径的酶(Salvesen et al.,Cell,91:443-446(1997))。在迄今为止已经鉴定的TNF受体超家族成员中包括TNFR1、TNFR2、TACI、GITR、CD27、OX-40、CD30、CD40、HVEM、Fas(也称作Apo-1或CD95)、DR4(也称作TRAIL-R1)、DR5(也称作Apo-2或TRAIL-R2)、DcR1、DcR2、护骨蛋白(OPG)、RANK和Apo-3(也称作DR3或TRAMP)(参见例如Ashkenazi,Nature Reviews,2:420-430(2002);Ashkenazi and Dixit,Science,281:1305-1308(1998);Ashkenazi and Dixit,Curr.Opin.Cell Biol.,11:255-260(2000);Golstein,Curr.Biol.,7:750-753(1997);Wallach,Cytokine Reference,Academic Press,2000,pages 377-411;Locksley et al.,Cell,104:487-501(2001);Gruss and Dower,Blood,85:3378-3404(1995);Hohman et al.,J.Biol.Chem.,264:14927-14934(1989);Brockhaus et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:3127-3131(1990);EP 417,563,公开于1991年3月20日;Loetscher et al.,Cell,61:351(1990);Schall et al.,Cell,61:361(1990);Smith et al.,Science,248:1019-1023(1990);Lewis et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,88:2830-2834(1991);Goodwin et al.,Mol.Cell.Biol.,11:3020-3026(1991);Stamenkovic et al.,EMBO J.,8:1403-1410(1989);Mallett et al.,EMBO J.,9:1063-1068(1990);Anderson et al.,Nature,390:175-179(1997);Chicheportiche et al.,J.Biol.Chem.,272:32401-32410(1997);Pan et al.,Science,276:111-113(1997);Pan et al.,Science,277:815-818(1997);Sheridan et al.,Science,277:818-821(1997);Degli-Esposti et al.,J.Exp.Med.,186:1165-1170(1997);Marsters et al.,Curr.Biol.,7:1003-1006(1997);Tsuda et al.,BBRC,234:137-142(1997);Nocentiniet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,94:6216-6221(1997);vonBulow et al.,Science,278:138-141(1997))。
大多数这些TNF受体家族成员共享细胞表面受体的典型结构,包括胞外区、跨膜区和胞内区,而其它成员则天然发现是缺少跨膜和胞内结构域的可溶性蛋白质。典型TNFR的胞外部分包含从NH2-末端起始的多个富含半胱氨酸结构域(CRD)的重复氨基酸序列样式。
数年前,将称作Apo2L或TRAIL的配体鉴定为TNF细胞因子家族的成员(参见例如Wiley et al.,Immunity,3:673-682(1995);Pitti et al.,J.Biol.Chem.,271:12697-12690(1996);WO 97/01633;WO 97/25428;美国专利5,763,223,授权于1998年6月9日;美国专利6,284,236,授权于2001年9月4日)。全长天然序列人Apo2L/TRAIL多肽是281个氨基酸的II型跨膜蛋白质。有些细胞能通过酶促切割多肽的胞外区来生成天然的可溶形式多肽(Mariani et al.,J.Cell.Biol.,137:221-229(1997))。对可溶形式Apo2L/TRAIL的晶体学研究揭示了与TNF和其它相关蛋白质结构类似的同三聚体结构(Hymowitz et al.,Molec.Cell,4:563-571(1999);Cha et al.,Immunity,11:253-261(1999);Mongkolsapaya et al.,Nature Structural Biology,6:1048(1999);Hymowitz et al.,Biochemistry,39:633-644(2000))。但是,与其它TNF家族成员不同,发现Apo2L/TRAIL具有独特的结构特征,即三个半胱氨酸残基(同三聚体中各个亚基的第230位)一起与锌原子配位,而且锌结合对于三聚体稳定性和生物学活性来说是重要的(Hymowitz et al.,见上文;Bodmer etal.,J.Biol.Chem.,275:20632-20637(2000))。
文献中已有报道,Apo2L/TRAIL可能在免疫系统的调节中起作用,包括自身免疫病,诸如类风湿性关节炎(参见例如Thomas et al.,J.Immunol.,161:2195-2200(1998);Johnsen et al.,Cytokine,11:664-672(1999);Griffith etal.,J.Exp.Med.,189:1343-1353(1999);Song et al.,J.Exp.Med.,191:1095-1103(2000))。
还有报道,可溶形式的Apo2L/TRAIL在多种癌细胞中诱导凋亡,包括结肠、肺、乳房、前列腺、膀胱、肾、卵巢和脑肿瘤,以及黑素瘤、白血病和多发性骨髓瘤(参见例如Wiley et al.,见上文;Pitti et al.,见上文;美国专利6,030,945,授权于2000年2月29日;美国专利6,746,668,授权于2004年6月8日;Rieger et al.,FEBS Letters,427:124-128(1998);Ashkenazi et al.,J.Clin.Invest.,104:155-162(1999);Walczak et al.,Nature Med.,5:157-163(1999);Keane et al.,Cancer Research,59:734-741(1999);Mizutani et al.,Clin.Cancer Res.,5:2605-2612(1999);Gazitt,Leukemia,13:1817-1824(1999);Yuet al.,Cancer Res.,60:2384-2389(2000);Chinnaiyan et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,97:1754-1759(2000))。鼠肿瘤模型的体内研究还表明,单独使用Apo2L/TRAIL或者与化疗或放疗联合能发挥实质性的抗肿瘤作用(参见例如Ashkenazi et al.,见上文;Walzcak et al.,见上文;Gliniak et al.,Cancer Res.,59:6153-6158(1999);Chinnaiyan et al.,见上文;Roth et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,265:1999(1999);PCT申请US/00/15512;PCT申请US/01/23691)。与许多类型的癌细胞相反,大多数正常人细胞类型表现出对某些重组形式Apo2L/TRAIL诱导的凋亡有抗性(Ashkenazi et al.,见上文;Walzcak et al.,见上文)。Jo等人报道,多组氨酸标记的可溶形式Apo2L/TRAIL在体外在分离的正常人肝细胞中诱导凋亡,非人源的则不然(Jo et al.,Nature Med.,6:564-567(2000);Nagata,Nature Med.,6:502-503(2000))。认为,某些重组Apo2L/TRAIL制备物在生物化学特性和生物学活性方面对患病细胞和正常细胞可有所不同,这取决于例如标签分子的存在与否、锌含量和三聚体含量百分比(参见Lawrence et al.,Nature Med.,Letter tothe Editor,7:383-385(2001);Qin et al.,Nature Med.,Letter to the Editor,7:385-386(2001))。
已经发现Apo2L/TRAIL结合至少五种不同受体。至少两种结合Apo2L/TRAIL的受体包含功能性胞质死亡结构域。一种这样的受体称作“DR4”(或称作TR4或TRAIL-R1)(Pan et al.,Science,276:111-113(1997);WO 98/32856,公开于1998年7月30日;WO 99/37684,公开于1999年7月29日;WO 00/73349,公开于2000年12月7日;US 6,433,147,授权于2002年8月13日;US 6,461,823,授权于2002年10月8日;US 6,342,383,授权于2002年1月29日)。
另一种这样的Apo2L/TRAIL受体称作DR5(或称作Apo-2、TRAIL-R或TRAIL-R2、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2、或KILLER)(参见例如Sheridan et al.,Science,277:818-821(1997);Pan et al.,Science,277:815-818(1997);WO 98/51793,公开于1998年11月19日;WO 98/41629,公开于1998年9月24日;Screaton et al.,Curr.Biol.,7:693-696(1997);Walczak et al.,EMBO J.,16:5386-5387(1997);Wu et al.,Nature Genetics,17:141-143(1997);WO 98/35986,公开于1998年8月20日;EP 870,827,公开于1998年10月14日;WO 98/46643,公开于1998年10月22日;WO 99/02653,公开于1999年1月21日;WO 99/09165,公开于1999年2月25日;WO 99/11791,公开于1999年3月11日;US 2002/0072091,公开于2002年8月13日;US2002/0098550,公开于2001年12月7日;US 6,313,269,授权于2001年12月6日;US 2001/0010924,公开于2001年8月2日;US 2003/01255540,公开于2003年7月3日;US 2002/0160446,公开于2002年10月31日;US2002/0048785,公开于2002年4月25日;US 6,342,369,授权于2002年2月;US 6,569,642,授权于2003年5月27日;US 6,072,047,授权于2000年6月6日;US 6,642,358,授权于2003年11月4日;US 6,743,625,授权于2004年6月1日)。像DR4一样,DR5据报道包含胞质死亡结构域且能够通过配体结合(或者通过结合诸如模拟配体活性的激动性抗体等分子)发出凋亡信号。Apo-2L/TRAIL和DR5之间形成的复合物的晶体结构描述于Hymowitz et al.,Molecular Cell,4:563-571(1999)。
配体结合后,DR4和DR5都能经由称作FADD/Mort1的含死亡结构域的连接物(adaptor)分子通过募集和活化凋亡起始物胱天蛋白酶-8而独立引发凋亡(Kischkel et al.,Immunity,12:611-620(2000);Sprick et al.,Immunity,12:599-609(2000);Bodmer et al.,Nature Cell Biol.,2:241-243(2000))。
Apo2L/TRAIL据报道还结合那些称作DcR1、DcR2和OPG的受体,认为这些受体发挥信号传递的抑制物而非转换器的功能(参见例如DCR1(也称作TRID、LIT或TRAIL-R3)(Pan et al.,Science,276:111-113(1997);Sheridan et al.,Science,277:818-821(1997);McFarlane et al.,J.Biol.Chem.,272:25417-25420(1997);Schneider et al.,FEBS Letters,416:329-334(1997);Degli-Esposti et al.,J.Exp.Med.,186:1165-1170(1997);Mongkolsapaya et al.,J.Immunol.,160:3-6(1998));DCR2(也称作TRUNDD或TRAIL-R4)(Marsters et al.,Curr.Biol.,7:1003-1006(1997);Pan et al.,FEBS Letters,424:41-45(1998);Degli-Esposti et al.,Immunity,7:813-820(1997));和OPG(Simonet et al.,见上文))。与DR4和DR5相反,DcR1和DcR2受体不发出凋亡信号。
文献中已经报道了某些与DR4和/或DR5受体结合的抗体。例如,针对DR4受体且在某些哺乳动物细胞中具有激动或凋亡活性的抗DR4抗体描述于例如WO 99/37684,公开于1999年7月29日;WO 00/73349,公开于2000年7月12日;WO 03/066661,公开于2003年8月14日。还可参见例如Griffithet al.,J.Immunol.,162:2597-2605(1999);Chuntharapai et al.,J.Immunol.,166:4891-4898(2001);WO 02/097033,公开于2002年12月2日;WO 03/042367,公开于2003年5月22日;WO 03/038043,公开于2003年5月8日;WO03/037913,公开于2003年5月8日。同样已经描述了某些抗DR5抗体,参见例如WO 98/51793,公开于1998年11月8日;Griffith et al.,J.Immunol.,162:2597-2605(1999);Ichikawa et al.,Nature Med.,7:954-960(2001);Hylander et al.,“An Antibody to DR5(TRAIL-Receptor 2)Suppresses theGrowth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice”,Abstract,2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers,Aug.29-Sept.1,2002,Banff,Alberta,Canada;WO 03/038043,公开于2003年5月8日;WO 03/037913,公开于2003年5月8日。另外,已经描述了某些对DR4和DR5受体都具有交叉反应性的抗体(参见例如美国专利6,252,050,授权于2001年6月26日)。
CD20抗原(也称作人B淋巴细胞限制分化抗原,Bp35)是位于前B(pre-B)淋巴细胞和成熟B淋巴细胞上、分子量约35kD的疏水性跨膜蛋白质(Valentine et al.,J.Biol.Chem.,264(19):11282-11287(1989);Einfeld et al.,EMBO J.,7(3):711-717(1988))。该抗原还在超过90%的B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson et al.,Blood,63(6):1424-1433(1984)),但在造血干细胞、原B(pro-B)细胞、正常浆细胞或其它正常组织上没有发现(Tedder et al.,J.Immunol.,135(2):973-979(1985))。CD20调节细胞周期起始和分化的激活过程的早期步骤(Tedder et al.,见上文),而且可能发挥钙离子通道的功能(Tedder et al.,J.Cell.Biochem.,14D:195(1990))。假如CD20在B细胞淋巴瘤中表达,则该抗原可用作“靶向”此类淋巴瘤的候选物。
rituximab(利妥昔单抗,RITUXAN)抗体是针对CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人单克隆抗体。rituximab就是1998年4月7日授权的美国专利5,736,137(Anderson等人)中称为“C2B8”的抗体。RITUXAN指明用于治疗患有复发性或顽固性低级或滤泡性CD20阳性B细胞非何杰金氏淋巴瘤的患者。作用机制的体外研究表明,RITUXAN结合人补体并通过补体依赖性细胞毒性(CDC)溶解淋巴样B细胞系(Reff et al.,Blood,83(2):435-445(1994);Cragg and Marlin,Blood,103:2738-2743(2004))。另外,它在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定法中具有显著活性。最近,RITUXAN在氚标记胸苷掺入测定法中显示出具有抗增殖效果且直接诱导凋亡,而其它抗CD19和CD20抗体则不然(Maloney et al.,Blood,88(10):637a(1996))。在试验中还观察到RITUXAN与化疗和毒素之间的协同作用。具体而言,RITUXAN使耐药性人B细胞淋巴瘤细胞系对多柔比星、CDDP、VP-16、白喉毒素和蓖麻毒蛋白的细胞毒性作用敏感(Demidem et al.CancerChemotherapy & Radiopharmaceuticals,12(3):177-186(1997))。体内临床前研究显示,RITUXAN从猕猴的外周血、淋巴结和骨髓中消减B细胞,可能是通过补体和细胞介导的过程(Reff et al.,Blood,83(2):435-445(1994))。
发明概述
本发明提供了利用死亡受体配体,诸如Apo-2配体/TRAIL多肽或死亡受体抗体,及CD20抗体的方法。本发明的实施方案包括治疗癌症的方法,包括使癌细胞暴露于有效量的Apo2L/TRAIL和CD20抗体。任选的是,使癌细胞暴露于有效量的死亡受体抗体诸如激动性DR4抗体或激动性DR5抗体及CD20抗体。任选的是,所述方法中所采用的Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体和CD20抗体的量有效实现治疗性协同效果,例如它们的联合抗癌效果大于在单独采用Apo2L/TRAIL或抗体作为单一治疗剂时所达到的抗癌效果。所述方法可能需要体外使用或体内使用,其中将Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体和CD20抗体施用于哺乳动物(患者)。任选的是,在所述方法中,用Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体和CD20抗体处理的癌细胞是淋巴瘤细胞。
本发明的其它实施方案包括治疗免疫相关疾病的方法,包括对哺乳动物施用有效量的Apo2L/TRAIL和CD20抗体。任选的是,将有效量的死亡受体抗体诸如激动性DR4抗体或激动性DR5抗体及CD20抗体施用于所述哺乳动物。任选的是,所述方法中所采用的Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体和CD20抗体的量有效实现治疗性协同效果,例如它们在治疗免疫相关疾病中的联合效果大于在单独采用Apo2L/TRAIL或抗体作为单一治疗剂时所达到的效果。任选的是,在所述方法中,所述免疫相关疾病是类风湿性关节炎或多发性硬化。
本发明的方法包括治疗哺乳动物中诸如免疫相关疾病或癌症等紊乱的方法,包括如下步骤:从哺乳动物中获取组织或细胞样品,对所述组织或细胞检验CD20、DR4和/或DR5的表达,并在确定所述组织或细胞样品表达一种或多种所述受体后,对所述哺乳动物施用有效量的Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体和CD20抗体。所述方法中用于检验一种或多种所述受体表达的步骤可以多种测定法方式进行,包括检测mRNA表达的测定法和免疫组织化学测定法。
任选的是,本发明的方法包括,在施用有效量的Apo2L/TRAIL和/或死亡受体抗体及CD20抗体之外,还对哺乳动物施用化疗剂或放疗。
本发明的更多实施方案以举例方式阐述于以下权利要求中:
1.处理癌细胞的方法,包括使哺乳动物癌细胞暴露于协同有效量的激动性死亡受体抗体和CD20抗体。
2.权利要求1的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是抗DR5受体单克隆抗体。
3.权利要求1的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是抗DR4受体单克隆抗体。
4.权利要求1的方法,其中所述癌细胞在体内暴露于所述协同有效量的激动性死亡受体抗体和CD20抗体。
5.权利要求2或3的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
6.权利要求2或3的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是人抗体。
7.权利要求1的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是与超过一种Apo-2配体受体起交叉反应的抗体。
8.权利要求1的方法,其中所述癌细胞是淋巴瘤细胞。
9.权利要求1的方法,进一步包括使癌细胞暴露于一种或多种生长抑制剂。
10.权利要求1的方法,进一步包括使细胞暴露于放射处理。
11.权利要求2的方法,其中所述DR5抗体具有108M-1至1012M-1的DR5受体结合亲和力。
12.权利要求1的方法,其中所述死亡受体抗体和CD20抗体在选自下组的重组宿主细胞中表达:CHO细胞、酵母细胞和大肠杆菌。
13.权利要求1的方法,其中所述CD20抗体是单克隆抗体。
14.权利要求13的方法,其中所述CD20抗体是抗体Rituximab。
15.治疗免疫相关疾病的方法,包括对哺乳动物施用协同有效量的激动性死亡受体抗体和CD20抗体。
16.权利要求15的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是抗DR5受体单克隆抗体。
17.权利要求15的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是抗DR4受体单克隆抗体。
18.权利要求16或17的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
19.权利要求16或17的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是人抗体。
20.权利要求15的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是与超过一种Apo-2配体受体起交叉反应的抗体。
21.权利要求15的方法,其中所述免疫相关疾病是类风湿性关节炎或多发性硬化。
22.权利要求15的方法,其中所述DR5抗体具有108M-1至1012M-1的DR5受体结合亲和力。
23.权利要求15的方法,其中所述死亡受体抗体和CD20抗体在选自下组的宿主细胞中表达:CHO细胞、酵母细胞和大肠杆菌。
24.权利要求15的方法,其中所述CD20抗体是单克隆抗体。
25.权利要求24的方法,其中所述CD20抗体是抗体Rituximab。
26.权利要求1或15的方法,其中所述死亡受体抗体和CD20抗体是顺序施用的。
27.权利要求1或15的方法,其中所述死亡受体抗体和CD20抗体是同时施用的。
附图简述
图1A显示了人Apo-2配体cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。核苷酸第447位的“N”用于指示该核苷酸碱基可以是“T”或“G”。
图2A和2B显示了全长人DR4 cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。人DR4的核苷酸序列和氨基酸序列还报导于Pan et al.,Science,276:111(1997)。
图3A显示了1998年11月19日公开的WO 98/51793中披露的411个氨基酸的人DR5序列(SEQ ID NO:5)。本领域知道人DR5的一种转录剪接变体。此DR5剪接变体编码图3B和3C所示1998年8月20日公开的WO98/35986中披露的440个氨基酸的人DR5序列(SEQ ID NO:6)。
图4描绘了B淋巴瘤细胞系中Apo2L/TRAIL受体的表达。
图5描绘了B淋巴瘤细胞系中CD20的表达。
图6显示了Apo2L/TRAIL、RITUXAN或联合处理对SCID小鼠中皮下预先移植的BJAB淋巴瘤肿瘤异种移植物生长的影响。
图7显示了有关Apo2L/TRAIL、RITUXAN或Apo2L/TRAIL加RITUXAN联合处理对SCID小鼠中皮下预先移植的BJAB淋巴瘤肿瘤异种移植物生长的影响的更多结果。
图8显示了Apo2L/TRAIL、RITUXAN或Apo2L/TRAIL加RITUXAN联合处理对SCID小鼠中生长的皮下预先移植BJAB淋巴瘤肿瘤异种移植物中胱天蛋白酶加工的影响。
图9显示了DR5激动性抗体、RITUXAN或联合处理对SCID小鼠中皮下预先移植的BJAB淋巴瘤肿瘤异种移植物生长的影响。
图10显示了DR5激动性抗体、RITUXAN或联合处理对SCID小鼠中生长的皮下预先移植BJAB淋巴瘤肿瘤异种移植物中胱天蛋白酶加工的影响。
图11描绘了CD20和Apo2L/TRAIL受体在NHL细胞系中的表达。
图12显示了Apo2L/TRAIL、Rituximab或联合处理对SCID小鼠中皮下预先移植的Ramos RA1肿瘤异种移植物生长的影响。
图13显示了Apo2L/TRAIL、Rituximab或联合处理对SCID小鼠中预先移植的DOHH-2滤泡淋巴瘤异种移植物生长的影响。
图14描绘了Apo2L/TRAIL、Rituximab或联合处理对BJAB细胞的细胞杀伤作用的效果和机制。
图15显示了Apo2L/TRAIL、Rituximab或联合处理对SCID小鼠中RamosT1肿瘤异种移植物生长的影响。
图16显示了Apo2L/TRAIL、Rituximab或联合处理对SCID小鼠中BJAB-Luc肿瘤异种移植物的影响。
优选实施方案的详述
除非另有说明,本文所用的所有技术术语、符号及其它科学术语均意图具有本发明所属领域技术人员通常所理解的含意。在有些情况中,为了清楚和/或便于参考,本文对具有通常所理解含意的术语给出了定义,而且本文这些定义的内含不应必然解释为代表了与本领域通常所理解含意的实质差异。本文所描述或参考的技术和流程普遍得到本领域技术人员的充分理解,而且通常利用常规方法得以采用,诸如例如广泛应用的分子克隆方法,参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd.edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y。如果适当,除非另有说明,牵涉使用商品化试剂盒和试剂的流程通常依照制造商规定的方案和/或参数进行。
在描述本发明的方法、试剂盒及其用途之前,应当理解本发明不限于所述具体方法、方案、细胞系、动物种或属、构建物和试剂,因为它们当然可以变化。还应当理解本文所用术语只是为了描述具体实施方案,并非意图限制本发明的范围,只有所附权利要求才对本发明范围进行了限制。
必须注意的是,在用于本文及所附权利要求时,除非另有明确规定,单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数所指物。
在此收入本文提及的所有出版物作为参考,以揭示和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。引用本文所引用的出版物是由于它们是在本申请的提交日之前公开的。凭借较早的优先权日或发明在前日期,本文的任何文字都不应解释为承认本发明的发明人没有资格早于所述出版物公开。此外,实际发表日可能与所显示的有所不同而需要独立查证。
I.定义
术语“Apo-2配体”、“Apo-2L”、“Apo2L”、“Apo2L/TRAIL”、“Apo-2配体/TRAIL”和“TRAIL”在本文中可互换使用,指包含图1所示氨基酸序列的氨基酸残基114-281(含)、残基95-281(含)、残基92-281(含)、残基91-281(含)、残基41-281(含)、残基39-281(含)、残基15-281(含)或残基1-281(含)的多肽序列,以及上述序列的生物学活性片段、删除、插入或替代变体。在一个实施方案中,多肽序列包含图1的残基114-281。任选的是,多肽序列包含图1的残基92-281或残基91-281。Apo-2L多肽可以由图1所示天然核苷酸序列编码。任选的是,编码残基Pro119(图1)的密码子可以是“CCT”或“CCG”。任选的是,片段或变体具有生物学活性,且与任一上述序列具有至少约80%的氨基酸序列同一性,更优选至少约90%的序列同一性,甚至更优选至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。该定义涵盖Apo2配体的替代变体,其中其至少一个天然氨基酸用另一种氨基酸诸如丙氨酸残基替代。任选的替代变体包含一个或多个残基替代。任选的变体可包含与图1的天然序列Apo-2配体多肽序列不同的氨基酸序列,且在图1的残基位置具有一个或多个如下氨基酸替代:S96C;S101C;S111C;R170C;K179C。该定义还涵盖从Apo-2配体来源分离的或者通过重组或合成方法制备的天然序列Apo-2配体。本发明的Apo-2配体包括1997年1月16日公开的WO 97/01633、1997年7月17日公开的WO 97/25428、1999年7月22日公开的WO 99/36535、2001年1月4日公开的WO 01/00832、2002年2月7日公开的WO 02/09755和2000年12月14日公开的WO00/75191中披露的称作Apo-2配体或TRAIL的多肽。这些术语通常用于指Apo-2配体的各种形式,包括多肽的单体、二聚体、三聚体、六聚体或称作寡聚体的形式。除非另有说明,Apo-2L序列中提及的所有氨基酸残基编号采用依照图1的编号。例如,“D203”或“Asp203”指图1提供的序列中第203位的天冬氨酸残基。
术语“Apo-2配体选择性变体”在用于本文时指在天然Apo-2配体序列中包含一个或多个氨基酸突变且对DR4受体或DR5受体具有选择性结合亲和力的Apo-2配体多肽。在一个实施方案中,Apo-2配体变体对DR4受体具有选择性结合亲和力且在天然Apo-2配体序列的第189、191、193、199、201或209位中任一位置包含一个或多个氨基酸替代。在另一实施方案中,Apo-2配体变体对DR5受体具有选择性结合亲和力且在天然Apo-2配体序列的第189、191、193、264、266、267或269位中任一位置包含一个或多个氨基酸替代。优选的Apo-2配体选择性变体包含一个或多个氨基酸突变且呈现出对DR4的结合亲和力等于或大于(≥)天然序列Apo-2配体对DR4受体的结合亲和力,甚至更优选的是,Apo-2配体变体呈现出对DR5受体的结合亲和力小于(<)天然序列Apo-2配体所呈现的对DR5的结合亲和力。当此类Apo-2配体变体对DR4受体的结合亲和力与天然序列Apo-2配体相比大致相等(未改变)或较大(提高了)且Apo-2配体变体对DR5受体的结合亲和力与天然序列Apo-2配体相比较小或几乎可忽略时,为了本发明,认为Apo-2配体变体的结合亲和力对DR4受体有“选择性”。本发明的优选DR4选择性Apo-2配体变体对DR5受体具有至少小10倍的结合亲和力(与天然序列Apo-2配体相比),甚至更优选的是,对DR5受体具有至少小100倍的结合亲和力(与天然序列Apo-2配体相比)。可通过本领域知道的ELISA、RIA和/或BIAcore测定法来测定Apo-2配体变体的各种结合亲和力并与天然Apo-2L(诸如114-281形式)的结合特性进行比较。本发明的优选DR4选择性Apo-2配体变体会在至少一种类型的哺乳动物细胞(优选癌细胞)中诱导凋亡,而且此类凋亡活性可通过本领域知道的方法诸如alamar blue或结晶紫测定法来测定。DR4选择性Apo-2配体变体可具有或不具有对Apo-2L的任何诱饵受体(decoy receptor)的改变的结合亲和力,那些诱饵受体在本领域称作DcR1、DcR2和OPG。
其它优选的Apo-2配体选择性变体包含一个或多个氨基酸突变且呈现出对DR5的结合亲和力等于或大于(≥)天然序列Apo-2配体对DR5受体的结合亲和力,甚至更优选的是,此类Apo-2配体变体呈现出对DR4受体的结合亲和力小于(<)天然序列Apo-2配体所呈现的对DR4的结合亲和力。当此类Apo-2配体变体对DR5受体的结合亲和力与天然序列Apo-2配体相比大致相等(未改变)或较大(提高了)且Apo-2配体变体对DR4受体的结合亲和力与天然序列Apo-2配体相比较小或几乎可忽略时,为了本发明,认为Apo-2配体变体的结合亲和力对DR5受体有“选择性”。本发明的优选DR5选择性Apo-2配体变体对DR4受体具有至少小10倍的结合亲和力(与天然序列Apo-2配体相比),甚至更优选的是,对DR4受体具有至少小100倍的结合亲和力(与天然序列Apo-2配体相比)。可通过本领域知道的ELISA、RIA和/或BIAcore测定法来测定Apo-2配体变体的各种结合亲和力并与天然Apo-2L(诸如114-281形式)的结合特性进行比较。本发明的优选DR5选择性Apo-2配体变体会在至少一种类型的哺乳动物细胞(优选癌细胞)中诱导凋亡,而且此类凋亡活性可通过本领域知道的方法诸如alamar blue或结晶紫测定法来测定。DR5选择性Apo-2配体变体可具有或不具有对Apo-2L的任何诱饵受体的改变的结合亲和力,那些诱饵受体在本领域称作DcR1、DcR2和OPG。
氨基酸标识可采用氨基酸的单字母符号系统或三字母符号系统,即
Asp D 天冬氨酸 Ile I 异亮氨酸
Thr T 苏氨酸 Leu L 亮氨酸
Ser S 丝氨酸 Tyr Y 酪氨酸
Glu E 谷氨酸 Phe F 苯丙氨酸
Pro P 脯氨酸 His H 组氨酸
Gly G 甘氨酸 Lys K 赖氨酸
Ala A 丙氨酸 Arg R 精氨酸
Cys C 半胱氨酸 Trp W 色氨酸
Val V 缬氨酸 Gln Q 谷氨酰胺
Met M 甲硫氨酸 Asn N 天冬酰胺
术语“Apo2L/TRAIL胞外域”或“Apo2L/TRAIL ECD”指基本上不含跨膜域和胞质域的Apo2L/TRAIL形式。通常,ECD具有少于1%的此类跨膜域和胞质域,且优选具有少于0.5%的此类结构域。应当理解,对本发明多肽所鉴定的任何跨膜域是依照本领域常规用于鉴定那种类型的疏水结构域的标准而鉴定的。跨膜域的精确边界可以变化,但最有可能是最初鉴定的结构域的任一末端不超过约5个氨基酸。在优选的实施方案中,ECD由该多肽的可溶性胞外域序列组成,不含跨膜域和胞质或胞内域(且不与膜结合)。具体的Apo-2L/TRAIL胞外域序列记载于PCT公开号WO 97/01633和WO97/25428。
术语“Apo2L/TRAIL单体”或“Apo2L单体”指Apo2L的胞外域序列的共价链。
术语“Apo2L/TRAIL二聚体”或“Apo2L二聚体”指通过二硫键以共价连接相连的两个Apo-2L单体。该术语在用于本文时包括游离存在的Apo2L二聚体和Apo2L三聚体形式内的Apo2L二聚体(即与另一个、第三个Apo2L单体结合)。
术语“Apo2L/TRAIL三聚体”或“Apo2L三聚体”指非共价结合的三个Apo2L单体。
术语“Apo2L/TRAIL聚集体”用于指自结合的较高寡聚物形式的Apo2L/TRAIL,诸如Apo2L/TRAIL三聚体,它们形成例如六聚体和九聚体形式的Apo2L/TRAIL。可采用本领域知道的方法和测定法(并使用商品化材料),诸如天然大小排阻HPLC(“SEC”)、使用十二烷基硫酸钠的变性大小排阻(“SDS-SEC”)、反相HPLC和毛细管电泳来测定Apo2L/TRAIL单体、二聚体或三聚体(或其它聚集体)的存在和数量。
“Apo-2配体受体”包括本领域称作“DR4”和“DR5”的受体,其多核苷酸和多肽序列分别显示于图2和3。Pan等人描述了称作“DR4”的TNF受体家族成员(Pan et al.,Science,276:111-113(1997);WO 98/32856,公开于1998年7月30日;WO 99/37684,公开于1999年7月29日;WO 00/73349,公开于2000年12月7日;US 6,433,147,授权于2002年8月13日;US 6,461,823,授权于2002年10月8日;US 6,342,383,授权于2002年1月29日)。Sheridan等人(Science,277:818-821(1997))和Pan等人(Science,277:815-818(1997))描述了Apo2L/TRAIL的另一种受体(还可参见WO 98/51793,公开于1998年11月19日;WO 98/41629,公开于1998年9月24日)。此受体称作DR5(该受体还可称作Apo-2、TRAIL-R、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2或KILLER;Screaton et al.,Curr.Biol.,7:693-696(1997);Walczak et al.,EMBO J.,16:5386-5387(1997);Wu et al.,Nature Genetics,17:141-143(1997);WO98/35986,公开于1998年8月20日;EP 870,827,公开于1998年10月14日;WO 98/46643,公开于1998年10月22日;WO 99/02653,公开于1999年1月21日;WO99/09165,公开于1999年2月25日;WO 99/11791,公开于1999年3月11日;US 2002/0072091,公开于2002年8月13日;US 2002/0098550,公开于2001年12月7日;US 6,313,269,授权于2001年12月6日;US2001/0010924,公开于2001年8月2日;US 2003/01255540,公开于2003年7月3日;US 2002/0160446,公开于2002年10月31日;US 2002/0048785,公开于2002年4月25日;US 6,569,642,授权于2003年5月27日;US 6,072,047,授权于2000年6月6日;US 6,642,358,授权于2003年11月4日)。如上所述,Apo-2L的其它受体包括DcR1、DcR2和OPG(参见Sheridan et al.,见上文;Marsters et al.,见上文;Simonet et al.,见上文)。术语“Apo-2L受体”在用于本文时涵盖天然序列受体和受体变体。这些术语涵盖在多种哺乳动物包括人中表达的Apo-2L受体。Apo-2L受体可以是内源表达的,如在多种人组织谱系中天然发生的,或者可以是通过重组或合成方法表达的。“天然序列Apo-2L受体”包括与衍生自自然界的Apo-2L受体具有相同氨基酸序列的多肽。因此,天然序列Apo-2L受体可以具有来自任何哺乳动物的天然存在Apo-2L受体的氨基酸序列。此类天然序列Apo-2L受体可以从自然界分离,或者可以通过重组或合成手段生产。术语“天然序列Apo-2L受体”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的受体(例如含有例如胞外域序列的可溶形式)、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位基因变体。受体变体可包括天然序列Apo-2L受体的片段或删除突变体。图3A显示了1998年11月19日公开的WO 98/51793中披露的411个氨基酸的人DR5序列。本领域知道人DR5的一种转录剪接变体。此DR5剪接变体编码图3B和3C所示1998年8月20日公开的WO 98/35986中披露的440个氨基酸的人DR5序列。
“死亡受体抗体”在用于本文时通常指针对肿瘤坏死因子受体超家族中且包含能够发出凋亡信号的死亡结构域的受体的抗体,这样的抗体包括DR5抗体和DR4抗体。
“DR5受体抗体”、“DR5抗体”或“抗DR5抗体”以广义使用,指结合至少一种形式的DR5受体或其胞外域的抗体。任选的是,DR5抗体与异源序列或分子融合或连接。优选的是,异源序列容许或帮助抗体形成更高等级或寡聚复合物。任选的是,DR5抗体结合DR5受体但不与任何其它Apo-2L受体(例如DR4、DcR1或DcR2)结合或发生交叉反应。任选的是,该抗体是DR5信号活性的激动剂。
任选的是,根据BIAcore结合测定法的测量,本发明的DR5抗体在约0.1nM到约20mM的浓度范围内结合DR5受体。任选的是,根据BIAcore结合测定法的测量,本发明的DR5抗体呈现出约0.6nM到约18mM的Ic50值。
“DR4受体抗体”、“DR4抗体”或“抗DR4抗体”以广义使用,指结合至少一种形式的DR4受体或其胞外域的抗体。任选的是,DR4抗体与异源序列或分子融合或连接。优选的是,异源序列允许或帮助抗体形成更高等级或寡聚复合物。任选的是,DR4抗体结合DR4受体但不与任何其它Apo-2L受体(例如DR5、DcR1或DcR2)结合或发生交叉反应。任选的是,该抗体是DR4信号活性的激动剂。
任选的是,根据BIAcore结合测定法的测量,本发明的DR4抗体在约0.1nM到约20mM的浓度范围内结合DR4受体。任选的是,根据BIAcore结合测定法的测量,本发明的DR4抗体呈现出约0.6nM到约18mM的Ic50值。
术语“激动剂”以最广义使用,包括在体外、原位或在体内部分或完全增强、刺激或激活Apo2L/TRAIL、DR4或DR5的一种或多种生物学活性的任何分子。Apo2L/TRAIL结合DR4或DR5的此类生物学活性的例子包括凋亡以及文献中报道的其它活性。激动剂可以直接或间接方式起作用。例如,激动剂可以在体外、原位或在体内由于其直接结合DR4或DR5从而引起受体活化或信号转导的结果起作用而部分或完全增强、刺激或激活DR4或DR5的一种或多种生物学活性。激动剂还可以在体外、原位或在体内由于例如刺激另一种效应分子继而引起DR4或DR5活化或信号转导的结果间接起作用而部分或完全增强、刺激或激活DR4或DR5的一种或多种生物学活性。设想了激动剂可作为间接起作用来增强或提高DR4或DR5活化或活性的增强分子。例如,激动剂可增强哺乳动物中内源Apo-2L的活性。这可通过例如预复合DR4或DR5或者通过稳定各自配体与DR4或DR5受体的复合物(诸如稳定Apo-2L与DR4或DR5之间形成的天然复合物)来实现。
术语“DR4”和“DR4受体”在用于本文时指以下文献中所描述的全长且可溶性胞外域形式的受体:Pan et al.,Science,276:111-113(1997);WO98/32856 published July 30,1998;US Patent 6,342,363 issued January 29,2002;and WO99/37684 published July 29,1999。DR4受体的全长氨基酸序列在此提供于图2中。
术语“DR5”和“DR5受体”在用于本文时指以下文献中所描述的全长且可溶性胞外域形式的受体:Sheridan et al.,Science,277:818-821(1997);Panet al.,Science,277:815-818(1997),US Patent 6,072,047 issued June 6,2000;USPatent 6,342,369;WO98/51793 published November 19,1998;WO98/41629published September 24,1998;Screaton et al.,Curr.Biol.,7:693-696(1997);Walczak et al.,EMBO J.,16:5386-5387(1997);Wu et al.,Nature Genetics,17:141-143(1997);WO98/35986 published August 20,1998;EP870,827published October 14,1998;WO98/46643 published October 22,1998;WO99/02653 published January 21,1999;WO99/09165 published February 25,1999;WO99/11791 published March 11,1999。DR5受体在本领域还称为Apo-2、TRAIL-R、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2或KILLER。术语DR5受体在用于本文时包括图3A中所提供的全长411个氨基酸的多肽和图3B-C中所提供的全长440个氨基酸的多肽。
术语“多元醇”在用于本文时广泛的指多羟基醇化合物。多元醇可以是例如任何水溶性聚(亚烷基氧化物)聚合物,而且可具有线性的或分支的链。优选的多元醇包括那些在一个或多个羟基位置用化学基团诸如具有1至4个碳的烷基取代的多元醇。典型的是,多元醇是聚(亚烷基二醇),优选聚(乙二醇)(PEG)。然而,本领域技术人员认识到,其它多元醇诸如聚(丙二醇)和聚乙烯-聚丙二醇共聚物可利用本文中关于PEG描述的偶联技术得以采用。本发明的多元醇包括本领域众所周知的那些类型以及可公开获得的那些类型,诸如获自商业来源。
术语“偶联(conjugate)”在本文中依照其最广泛的定义使用,指接合或连接到一起。若分子像接合在一起时起作用或运作,则它们是“偶联”的。
术语“胞外域”或“ECD”指基本上不含跨膜域和胞质域的配体或受体形式。通常,可溶性ECD具有少于1%的所述跨膜域和胞质域,优选具有少于0.5%的所述结构域。
术语“二价金属离子”指具有两个正电荷的金属离子。用于本发明的二价金属离子的例子包括但不限于锌、钴、镍、镉、镁和锰。可采用的此类金属的具体形式包括盐形式(例如药学上可接受的盐形式),诸如上述二价金属离子的氯化物、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐形式。如本文所述,优选以足以实现例如以下效果的浓度或数量(例如有效量)使用二价金属离子:(1)在需要的一段时间内提高Apo-2L三聚体的贮藏稳定性,(2)提高重组细胞培养或纯化方法中Apo-2L三聚体的生产或产量,(3)提高Apo-2L三聚体的溶解度(或者降低聚集),或(4)增强Apo-2L三聚体形成。
“分离的”,在用于描述本文所公开的各种蛋白质时,指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的蛋白质。其天然环境的污染成分指通常将会干扰该蛋白质的诊断或治疗用途的物质,可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中,将蛋白质纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度,或(2)根据使用考马斯蓝或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE,达到同质。既然蛋白质的天然环境的至少一种成分不会存在,那么分离的蛋白质包括重组细胞内的原位蛋白质。然而,分离的蛋白质通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
“分离的”核酸分子指已经鉴定且与所述核酸在其天然来源中通常相关的至少一种污染核酸分子分开的核酸分子。分离的Apo-2配体核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的Apo-2配体核酸分子因此与天然细胞中存在的Apo-2配体核酸分子有区别。然而,分离的Apo-2配体核酸分子包括通常表达Apo-2配体的细胞中所包含的Apo-2配体核酸分子,例如所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位。
关于本文所鉴定序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后,且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分,候选序列中与Apo-2配体序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行序列对比以测定百分比氨基酸序列同一性。本领域技术人员可决定测量序列对比的适宜参数,包括指派对所比较的全长序列获得最大对比所需的任何算法。为了本发明,可使用序列比较计算机程序ALIGN-2来获得百分比氨基酸序列同一性值,ALIGN-2程序由Genentech,Inc.编写,其源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office,Washington DC,20559),并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(South SanFrancisco,California)得到ALIGN-2程序。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如,适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
若一条核酸与另一条核酸序列处于功能性相互关系中,则它是“可操作连接”的。例如,若前序列或分泌前导序列的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白,则它与多肽的DNA可操作连接;若启动子或增强子影响编码序列的转录,则它与该序列可操作连接;或者,若核糖体结合位点的位置促进翻译,则它与编码序列可操作连接。通常,“可操作连接”意味着相连的DNA序列是相邻的,且在分泌前导序列的情况中意味着相邻且处于同一读码状态。然而,增强子不必相邻。连接可通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点,那么使用与常规实践一致的合成寡核苷酸衔接头或接头。
“B细胞”是在骨髓中成熟的淋巴细胞,包括幼稚B细胞、记忆B细胞、或效应B细胞(浆细胞)。本文中的B细胞可以是正常的或非恶性的B细胞。
“CD20”抗原是在超过90%来自外周血或淋巴样器官的B细胞表面上发现的约35kDa非糖基化磷蛋白。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞二者上,但在干细胞上不表达。文献中CD20的其它名称包括“B淋巴细胞限制抗原”和“Bp35”。CD20抗原描述于例如Clark et al.,PNAS(USA)82:1766(1985)。
结合CD20抗原的抗体的例子包括:“C2B8”,现在称作“Rituximab”(“RITUXAN”)(美国专利5,736,137);钇[90]标记的2B8鼠源抗体,称作“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan”ZEVALIN,可从Idec Pharmaceuticals公司购买(美国专利5,736,137;2B8于1993年6月22日保藏于ATCC,编号HB11388);鼠源IgG2a“B1”,也称作“Tositumomab”,任选用131I标记以产生“131I-B1”抗体(碘131 Tositumomab,BEXXARTM),可从Corixa购买(还可参见美国专利5,595,721);鼠源单克隆抗体“1F5″(Press et al.,Blood,69(2):584-591(1987))及其变体,包括“框架修补”或人源化1F5(WO 2003/002607,Leung,ATCC保藏物HB-96450);鼠源2H7和嵌合2H7抗体(美国专利5,677,180);人源化2H7;HUMAX-CD20TM完全人的、高亲和力抗体,靶向B细胞细胞膜中的CD20分子(Genmab,丹麦;参见例如Glennie and van deWinkel,Drug Discovery Today,8:503-510(2003);Cragg et al.,Blood,101:1045-1052(2003));WO 04/035607(Teeling等人)中所列的人单克隆抗体;AME-133TM抗体(Applied Molecular Evolution);A20抗体或其变体,诸如嵌合或人源化A20抗体(分别是cA20或hA20)(US 2003/0219433,Immunomedics);及单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2,可从国际白细胞分类研究组(International Leukocyte Typing Workshop)获得(Valentine等人,《Leukocyte Typing III》,McMichael编,p.440,OxfordUniversity Press,1987)。本文中优选的CD20抗体是嵌合的、人源化的、或人的CD20抗体,更优选rituximab、人源化2H7、嵌合或人源化A20抗体(Immunomedics)、和HUMAX-CD20TM人CD20抗体(Genmab)。
术语“rituximab”或“RITUXAN”在本文中指针对CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人单克隆抗体,在美国专利5,736,137中称作“C2B8”,包括其保持结合CD20能力的片段。
纯粹为了本发明且除非另有说明,“人源化2H7”指人源化CD20抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体在体内有效消减灵长类B细胞,该抗体在其重链可变区(VH)中至少包含来自抗人CD20抗体的CDR H3序列和基本上人重链亚型III(VHIII)的人共有框架(FR)残基。
优选的人源化2H7是如下完整抗体或抗体片段,其包含轻链可变区序列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAP
SNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT
KVEIKR(SEQ ID NO:7);
和重链可变区序列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:8)。
当人源化2H7抗体是完整抗体时,优选的是,它包含轻链氨基酸序列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAP
SNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT
KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS
SPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:9);
和重链氨基酸序列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA
LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN
YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK(SEQ ID NO:10)
或重链氨基酸序列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA
LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
REEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAK
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN
YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK(SEQ ID NO:11)。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应,其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体,随后引起靶细胞溶解。介导ADCC的主要细胞,NK细胞,只表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.,9:457-92(1991)中第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性,可进行体外ADCC测定法,诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所描述的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可在体内评估目的分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如Clynes et al.,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所公开的。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应物功能的白细胞。优选的是,该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应物功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞,优选PBMC和NK细胞。
术语“Fc受体”和“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外,优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体),包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体,包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”),它们具有相似的氨基酸序列,区别主要在于其胞质域。活化受体FcγRIIA在其胞质域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见Daron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991);Capel et al.,Immunomethods 4:25-34(1994);de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-341(1995))。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR,包括未来将会鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体,FcRn,它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer etal.,J.Immunol.117:587(1976);Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))。FcR在本文中包括多态性,诸如编码FcγRIIIa的基因中的遗传二态性,它导致位于受体结合IgG1的区域中的氨基酸第158位为苯丙氨酸(F)或缬氨酸(V)。纯合缬氨酸FcγRIIIa(FcγIIIa-158V)已经在体外显示出相对于纯合苯丙氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158F)或杂合(FcγIIIa-158F/V)受体具有更高的对人IgG1的亲和力且介导提高的ADCC。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时分子溶解靶物的能力。补体激活途径是由补体系统第一组分(Clq)结合与关联抗原复合的分子(如抗体)起始的。为了评估补体激活,可进行CDC测定法,例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所描述的。
术语“抗体”在本文中以最广义使用,明确覆盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(如双特异性抗体),及抗体片段,只要它们展现所需生物学活性。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分,优选包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段;双抗体;线性抗体;单链抗体分子;及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“天然抗体”通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接,而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中有所变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变区(VH),接着是多个恒定区。每条轻链在一端具有一个可变区(VL),而另一端是一个恒定区。轻链的恒定区与重链的第一恒定区排列在一起,而轻链的可变区与重链的可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。
术语“可变的”指可变区中的某些部分在抗体序列中差异广泛且用于每种特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而,变异性并非均匀分布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区中称作高变区的三个区段。可变区中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR,它们大多采取β-折叠构象,通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起,并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合,但展现多种效应物功能,诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段,称作“Fab”片段,各自具有一个抗原结合位点,和一个残余“Fc”片段,其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段,它具有两个抗原结合位点,并且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。正是在这种构造中,各个可变区的三个高变区相互作用而在VH-VL二聚体表面确定了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而,即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力,尽管亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文中对其中恒定区半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的,在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”,根据其恒定区氨基酸序列,可归入两种截然不同类型中的一种,称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
根据抗体重链恒定区氨基酸序列,可将其归入不同的类别。完整抗体有五种主要的类别:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些可进一步分为亚类(同种型),如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同抗体类别对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域,其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是,该Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头,使得scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述参见Plückthun,《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》,vol.113,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,pp.269-315,1994。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段,该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对,迫使结构域与另一条链的互补结构域配对,并产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的描述于例如EP 404,097;WO 93/11161;Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指由一群基本上同质的抗体获得的抗体,即构成群体的各个抗体相同,除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异的,针对单一抗原性位点。另外,与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同,每种单克隆抗体针对抗原上的同一决定簇。除了它们的特异性以外,单克隆抗体的优越性体现在它们是通过杂交瘤培养合成的,未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体由基本上同质的抗体群获得的特征,并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如,依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler et al.,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备,或者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库分离。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白),其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及此类抗体的片段,只要它们展现所需生物学活性(美国专利4,816,567;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(如旧大陆猴类(Old World Monkey),诸如狒狒、恒河猴或猕猴等)的可变区抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化(primatized)”抗体(美国专利5,693,780)。
非人(如鼠源)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上,人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中,将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外,人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常,人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区,其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环,且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的FR。任选的是,人源化抗体还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变区中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等人,《Sequences of Proteins ofImmunological Interest》,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991)和/或那些来自“高变环”的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变区中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基指本文定义的高变区残基以外的可变区残基。
“结合”目的抗原例如CD20或者DR4或DR5的抗体指能够以足够亲和力和/或亲合力结合抗原的抗体,使得该抗体可作为治疗剂用于靶向表达该抗原的细胞。
为了本发明,“免疫疗法”指用抗体治疗哺乳动物(优选人类患者)的方法,其中抗体可以是未偶联的或“裸露的”抗体,或者抗体可以偶联或融合有异源分子或试剂,诸如一种或多种细胞毒剂,由此产生“免疫偶联物”。
“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分指将会干扰该拮抗剂或抗体的诊断或治疗用途的物质,可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中,将抗体纯化至(1)根据Lowry方法的测定,抗体重量超过95%,最优选重量超过99%,(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度,或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE,达到同质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存在,那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而,分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
表述“有效量”指有效预防、改善或治疗所讨论疾病或状况的Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体和CD20抗体的量。
术语“免疫抑制剂”在本文中用于辅助疗法时指作用于抑制或掩盖本文所治疗哺乳动物的免疫系统的物质。这将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。此类药剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利4,665,077,在此收入其公开内容作为参考);非类固醇抗炎药(NSAID);硫唑嘌呤(azathioprine);环磷酰胺(cyclophosphamide);溴隐亭(bromocryptine);达扎唑(danazol);氨苯砜(dapsone);戊二醛(它掩盖MHC抗原,如美国专利4,120,649中所述);针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体;环孢菌素A;类固醇,诸如糖皮质类固醇,例如泼尼松(prednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、地塞米松(dexamethasone)和氢化可的松(hydrocortisone);甲氨蝶呤(methotrexate)(口服或皮下);羟氯喹(hydroxychloroquine);柳氮磺吡啶(sulfasalazine);来氟米特(leflunomide);细胞因子或细胞因子受体拮抗剂,包括抗干扰素-γ、-β或-α抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体(infliximab或adalimumab)、抗TNFα免疫黏附素(依那西普(etanercept))、抗肿瘤坏死因子-β抗体、抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体;抗LFA-1抗体,包括抗CD11a和抗CD18抗体;抗L3T4抗体;异源抗淋巴细胞球蛋白;泛T(pan-T)抗体,优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体;含有LFA-3结合域的可溶性肽(90年7月26日公开的WO 90/08187);链激酶;TGF-β;链道酶;来自宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;脱氧精胍菌素(deoxyspergualin);雷帕霉素(rapamycin);T细胞受体(Cohen等人,美国专利5,114,721);T细胞受体片段(Offner et al.,Science251:430-432(1991);WO 90/11294;Ianeway,Nature 341:482(1989);WO91/01133);及T细胞受体抗体(EP 340,109),诸如T10B9。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素,诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素,或其片段。
为了本发明,“协同活性”或“协同作用”或“协同效应”或“协同有效量”意指在采用Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体和CD20抗体的组合时所观察到的效果(1)大于单独(或者个别)使用Apo2L/TRAIL、死亡受体抗体或CD20抗体时所获得的效果,且(2)大于Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体和CD20抗体的效果相加(叠加)总和。这样的协同作用或协同效应可通过本领域技术人员知道的多种手段来测定。例如,可在检验肿瘤细胞数目或肿瘤质量减少/减小的体外或体内测定法形式中观察到Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体和CD20抗体的协同效应。
术语“凋亡”和“凋亡活性”以广义使用,指哺乳动物中有序或受控形式的细胞死亡,通常伴随着一种或多种特征性细胞变化,包括细胞质浓缩、质膜微绒毛丧失、细胞核节段化、染色体DNA降解或线粒体功能丧失。此活性可使用本领域众所周知的方法来测定和测量,例如通过细胞生存力测定法、FACS分析或DNA电泳、膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞碎裂和/或膜囊(称为凋亡小体)形成。测定抗体(例如Rituximab)诱导凋亡的能力的测定法参见例如Shan et al.,Cancer ImmunolImmunther 48:673-83(2000);Pedersen et al.,Blood 99:1314-9(2002);Demidem et al.,Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3):177-186(1997)。
术语“癌症”、“癌性”和“恶性(肿瘤)”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌包括腺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、何杰金氏(Hodgkin)和非何杰金氏淋巴瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌诸如肝的癌和肝细胞瘤(hepatoma)、膀胱癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、骨髓瘤(诸如多发性骨髓瘤)、唾液腺癌、肾癌诸如肾细胞癌和维尔姆斯氏(Wilms)肿瘤、基细胞癌、黑素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌、及各种类型的头和颈癌。
术语“免疫相关疾病”指哺乳动物中由哺乳动物免疫系统成分引起、介导、或以其它方式促成发病的疾病。还包括刺激或干预免疫应答对疾病发展具有改善作用的疾病。该术语包括自身免疫病、免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、传染病和免疫缺陷病。可依照本发明治疗的免疫相关和炎性疾病的例子,其中有些是免疫或T细胞介导的,包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化病(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格伦氏(Sjogren)综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化病、特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、和慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎、炎性和纤维化肺病诸如炎性肠病(溃疡性结肠炎:克罗恩氏(Crohn)病)、麸胶敏感性肠病、和惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫性或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应和荨麻疹、肺的免疫学疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病。传染病包括AIDS(HIV感染)、甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎、细菌感染、真菌感染、原生动物感染和寄生虫感染。
“B细胞恶性肿瘤”指牵涉B细胞的恶性肿瘤。例子包括何杰金氏(Hodgkin)病,包括淋巴细胞为主型的何杰金氏病(LPHD);非何杰金氏淋巴瘤(NHL);滤泡中心细胞(FCC)淋巴瘤;急性淋巴细胞性白血病(ALL);慢性淋巴细胞性白血病(CLL);毛细胞白血病;类浆细胞淋巴细胞性淋巴瘤;套细胞淋巴瘤;AIDS或HIV相关淋巴瘤;多发性骨髓瘤;中枢神经系统(CNS)淋巴瘤;移植后淋巴增殖紊乱(PTLD);瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症(淋巴浆细胞性淋巴瘤);粘膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤;和边缘区淋巴瘤/白血病。
非何杰金氏淋巴瘤(NHL)包括但不限于低级/滤泡NHL、复发性或顽固性NHL、前线(front line)低级NHL、阶段III/IV NHL、化疗耐受性NHL、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡NHL、中级弥漫性NHL、弥漫性大细胞淋巴瘤、攻击性(agressive)NHL(包括攻击性前线NHL和攻击性复发NHL)、自体干细胞移植后复发性或顽固性NHL、高级成免疫细胞NHL、高级成淋巴细胞NHL、高级小非分裂细胞NHL、贮积病(bulky disease)NHL等。
“自身免疫病”在本文中指源于且针对个体自身组织的疾病或紊乱或其共分离(co-segregate)或表现或由其导致的状况。自身免疫性疾病或紊乱的例子包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、和强直性脊柱炎)、银屑病、皮炎包括特应性皮炎、慢性特发性荨麻疹包括慢性自身免疫性荨麻疹、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、系统性硬皮病和硬化症、与炎性肠病(IBD)(克罗恩氏(Crohn)病、溃疡性结肠炎)有关的应答、和伴有坏疽性脓皮症、结节性红斑、原发性硬化性胆管炎、和/或巩膜外层炎共分离的IBD、呼吸窘迫综合征包括成人型呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、IgE介导的疾病诸如过敏性和变应性鼻炎、脑炎诸如拉斯默森氏(Rasmussen)脑炎、葡萄膜炎、结肠炎诸如微观结肠炎(microscopic colitis)和胶原性结肠炎、肾小球肾炎(GN)诸如膜性GN、特发性膜性GN、膜性增殖性GN(MPGN)包括I型和II型、和快速发展的GN、变应性状况、湿疹、哮喘、牵涉T细胞浸润和慢性炎性应答的状况、动脉粥样硬化、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、系统性红斑狼疮(SLE)诸如皮肤SLE、狼疮(包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、儿科狼疮、非肾狼疮、盘状狼疮、狼疮脱发)、幼年期发作的糖尿病、多发性硬化(MS)诸如脊髓-眼(spino-optical)MS、变应性脑脊髓炎、与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和延迟性超敏感有关的免疫应答、结核病、结节病、肉芽肿病包括韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病、粒细胞缺乏、血管炎(包括大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏(Takayasu))动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎(Kawasaki)病和结节性多动脉炎)、CNS血管炎、和ANCA相关血管炎诸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或综合征(CSS))、再生障碍性贫血、库姆斯(Coombs)阳性贫血、戴-布二氏(Diamond Blackfan)贫血、免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血、纯红细胞自身障碍(PRCA)、因子VIII缺乏、血友病A、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、牵涉白细胞渗出的疾病、CNS炎性紊乱、多器官损伤综合征、重症肌无力、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、抗磷脂抗体综合征、变应性神经炎、贝切特氏(Bechet)病、卡斯尔曼氏(Castleman)综合征、古德帕斯丘氏(Goodpasture)综合征、朗-伊二氏(Lambert-Eaton)肌无力综合征、雷诺氏(Reynaud)综合征、斯耶格伦氏(Sjogren)综合征、史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征、实体器官移植排斥(包括预处理针对高反应性抗体滴度组、组织中的IgA沉积、和源自肾移植、肝移植、肠移植、心脏移植等的排斥)、移植物抗宿主病(GVHD)、大疱性类天疱疮、天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、和粘膜类天疱疮型天疱疮)、自身免疫性多内分泌腺病、莱特氏(Reiter)病、僵人(stiff-man)综合征、免疫复合物肾炎、IgM多神经病或IgM介导的神经病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、血小板减少症(例如心肌梗死患者发生的)包括自身免疫性血小板减少症、睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、原发性甲状腺功能减退症;自身免疫性内分泌病包括自身免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎(桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎)、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺功能减退症、阿狄森氏(Addison)病、格雷夫斯氏(Graves)病、自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)、I型糖尿病也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)包括儿科IDDM、和席汉氏(Sheehan)综合征;自身免疫性肝炎、淋巴样间质性肺炎(HIV)、梗阻性细支气管炎(非移植)较之NSIP、格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、贝格尔氏(Berger)病(IgA肾病)、原发性胆汁性肝硬化、口炎性腹泻(麸质肠病)、顽固性口炎性腹泻伴有共分离的疱疹样皮炎、冷球蛋白血症、肌萎缩性侧索硬化(ALS;卢格里克氏(Lou Gehrig)病)、冠状动脉病、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听力损失、视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、多软骨炎诸如顽固性多软骨炎、肺泡蛋白质沉积症、淀粉样变、巨细胞性肝炎、巩膜炎、性质未确定/未知的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、周围神经病、瘤外综合征、通道病诸如癫痫、偏头痛、心率失常、肌肉紊乱、耳聋、盲、周期性瘫痪、和CNS的通道病;孤独症、炎性肌病、和病灶性节段性肾小球硬化(FSGS)。
术语“前体药物”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对癌细胞的细胞毒性较小且能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的药用活性物质的前体和衍生物形式。参见例如Wilman,“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”,Biochemical Society Transactions,14,pp.375-382,615th Meeting Belfast(1986);Stella et al.,“Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”,Directed Drug Delivery,Borchardt et al.,(ed.),pp.247-267,Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于下文描述的那些化疗剂。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素,诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素,包括其片段和/或变体。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents),诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide);磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates),诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶类(aziridines),诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines),包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan);苔藓抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物);隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成类似物,KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海绵抑素(spongistatin);氮芥类(nitrogen mustards),诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard);亚硝脲类(nitrosoureas),诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素类,诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin),尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994));蒽环类抗生素(dynemicin),包括dynemicin A;二膦酸盐类(bisphosphonates),诸如氯膦酸盐(clodronate);埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物类,诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物,诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物,诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine);嘧啶类似物,诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素类,诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺类,诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂,诸如亚叶酸(folinic acid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid);恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);elfomithine;依利醋铵(elliptiniumacetate);埃坡霉素(epothilone);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓;羟脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登木素生物碱类(maytansinoids),诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol);安丝菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidamol);二胺硝吖啶(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼酸(podophyllinic acid);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲兰(sizofiran);螺旋锗(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone);2,2′,2″-三氯三乙胺;单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);达卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”);环磷酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);类紫杉醇(taxoids),例如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor),清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)和TAXOTERE多西他塞(doxetaxel)(
Rorer,Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);GEMZAR吉西他滨(gemcitabine);6-硫鸟嘌呤(thioguanine);巯基嘌呤(mercaptopurine);甲氨蝶呤(methotrexate);铂类似物,诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin);长春碱(vinblastine);铂;依托泊苷(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);长春新碱(vincristine);NAVELBINE长春瑞滨(vinorelbine);能灭瘤(novantrone);替尼泊苷(teniposide);依达曲沙(edatrexate);道诺霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);希罗达(xeloda);伊本膦酸盐(ibandronate);CPT-11;拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类维A酸(retinoids),诸如维A酸(retinoic acid);卡培他滨(capecitabine);及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。
该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene);抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂,诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏罗唑(vorozole)、FEMARA来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole);抗雄激素类,诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸,特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸,诸如例如PKC-α、Ralf和H-Ras;核酶,诸如VEGF表达抑制剂(例如ANGIOZYME核酸)和HER2表达抑制剂;疫苗,诸如基因疗法疫苗,例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗;PROLEUKINrIL-2;LURTOTECAN拓扑异构酶1抑制剂;ABARELIXrmRH;及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此,生长抑制剂是显著降低在S期过表达此类基因的细胞的百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂,诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春花生物碱类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉醇(taxol)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞,例如DNA烷化剂类,诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。其它信息可参见《The Molecular Basis of Cancer》,Mendelsohn和Israel编,第1章,题为“Cell cycle regulation,oncogenes,and antieioplastic drugs”,Murakaini等人,WB Saunders,Philadelphia,1995,尤其是第13页。
术语“细胞因子”指由一种细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。这类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素,诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素;甲状旁腺素;甲状腺素;胰岛素;胰岛素原;松驰素;松驰素原;糖蛋白激素类,诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH);肝生长因子;成纤维细胞生长因子;促乳素;胎盘催乳激素;肿瘤坏死因子-α和-β;穆勒氏(Mullerian)抑制性物质;小鼠促性腺激素相关肽;抑制素;激活素;血管内皮生长因子;整联蛋白;血小板生成素(TPO);神经生长因子;血小板衍生生长因子;转化生长因子(TGF),诸如TGF-α和TGF-β;胰岛素样生长因子-I和-II;促红细胞生成素(EPO);骨诱导因子;干扰素,诸如干扰素-α、-β和-γ;集落刺激因子(CSF),诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF);白介素(IL),诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12;及其它多肽因子,包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时,术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物学活性等效物。
“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品的商品包装中的说明书,它们包含有关涉及此类治疗用产品应用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症、与该包装产品联合的其它治疗用产品、和/或警告的信息。
术语“处理”、“治疗”和“疗法”在用于本文时指治疗性处理、预防性处理、和防范性处理。
术语“哺乳动物”在用于本文时指归入哺乳类的任何哺乳动物,包括人、牛、马、犬和猫。在本发明的一个优选实施方案中,哺乳动物是人。
II.本发明的组合物和方法
与TNF配体家族相关的细胞因子,在本文中鉴别为“Apo-2配体”或“TRAIL”的细胞因子已有描述。天然人Apo-2配体的预测成熟氨基酸序列包含281个氨基酸,具有大约32.5kDa的计算分子量。缺少信号序列及存在内部疏水区表明Apo-2配体是II型跨膜蛋白质。可溶性胞外域Apo-2配体多肽也已有描述。参见例如1997年7月17日公开的WO 97/25428。进一步描述了Apo-2L替代变体。丙氨酸扫描技术已经用于鉴定具有生物学活性的各种替代变体分子。具体的Apo-2配体替代变体包括其中至少一个氨基酸用另一种氨基酸诸如丙氨酸残基替代的那些变体。这些替代变体鉴别为例如“D203A”、“D218A”和“D269A”。此命名法用于鉴别Apo-2配体变体,其中第203、218和/或269位(采用图1所示编号)的天冬氨酸残基用丙氨酸残基替代。任选的是,本发明的Apo-2L变体可包含一个或多个氨基酸替代。任选的是,此类Apo-2L变体将是DR4或DR5受体选择性变体。
下文描述涉及生成Apo-2配体包括Apo-2配体变体的方法,即培养经含Apo-2配体编码核酸的载体转化或转染的宿主细胞并从细胞培养物中回收所述多肽。
编码Apo-2配体的DNA可从任何cDNA文库获得,所述cDNA文库是从认为具有Apo-2配体mRNA且以可检测水平表达它的组织制备的。因此,人Apo-2配体DNA可方便的从以人组织制备的cDNA文库获得,诸如WO97/25428中所述的人胎盘cDNA的噬菌体文库。Apo-2配体编码基因还可从基因组文库或通过寡核苷酸合成获得。
可用为鉴定目的基因或其编码的蛋白质而设计的探针(诸如针对Apo-2配体的抗体或至少约20-80个碱基的寡核苷酸)筛选文库。可使用标准流程用选定探针对cDNA或基因组文库进行筛选,诸如Sambrook等人,《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》,New York,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989中所述。分离编码Apo-2配体的基因的备选方法是采用PCR方法(Sambrook et al.,见上文;Dieffenbach et al.,PCR Primer:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995)。
Apo-2配体的氨基酸序列片段或变体可通过在Apo-2配体DNA中引入适宜的核苷酸变异或者通过合成期望的Apo-2配体多肽来制备。此类片段或变体代表了图1为全长Apo-2配体所示胞内区、跨膜区或胞外区或者氨基酸序列内、或者一端或两端的残基插入、替代和/或删除。可进行插入、替代和/或删除的任意组合以获得最终的构建物,只要最终的构建物具有例如本文所定义的期望生物学活性,诸如凋亡活性。在一个优选的实施方案中,所述片段或变体与本文为Apo-2配体的胞内域、跨膜域或胞外域或者Apo-2配体的全长序列所鉴定的序列具有至少约80%的氨基酸序列同一性、更优选至少约90%的序列同一性、甚至更优选至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。氨基酸变化还可能改变Apo-2配体的翻译后加工,诸如改变糖基化位点的数目或位置或者改变膜锚定特性。
如上所述Apo-2配体序列中的变异可利用美国专利5,364,934中关于保守和非保守突变所列任何技术和指导方针来产生。这些包括寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变。
可采用扫描氨基酸分析沿着连续的序列鉴定一个或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸中是相对较小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是这一类中的优选扫描氨基酸,因为它消除了β-碳的侧链且不大可能改变变体的主链构象(Cunningham et al.,Science,244:1081(1989))。丙氨酸通常还因为它是最常见的氨基酸而成为优选的。此外,在隐藏的和暴露的位置都经常可以找到它(Creighton,《The Proteins》,W.H.Freeman & Co.,NY;Chothia,J.Mol.Biol.,150:1(1976))。
根据其侧链特性的相似性,氨基酸可如下分组(A.L.Lehninger,《Biochemistry》,第2版,pp.73-75,Worth Publishers,New York,1975):
(1)非极性的:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电荷、极性的:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性的:Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性的:Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者,根据共同的侧链特性,天然存在残基可如下分组:
(1)疏水性的:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性、亲水性的:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性的:Asp、Glu;
(4)碱性的:His、Lys、Arg;
(5)影响链取向的残基:Gly、Pro;
(6)芳香族的:Trp、Tyr、Phe。
表1
原始残基 | 例示替代 | 优选替代 |
Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lvs |
Asn(N) | Gln;His;Asp,Lys;Arg | Gln |
Asp(D) | Glu;Asn | Glu |
Cys(C) | Ser;Ala | Ser |
Gln(Q) | Asn;Glu | Asn |
Glu(E) | Asp;Gln | Asp |
Gly(G) | Ala | Ala |
His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸 | Leu |
Leu(L) | 正亮氨酸;Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Trp;Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Tyr |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Val;Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸 | Leu |
同样包括在本发明范围内的Apo-2配体序列中的变异涉及氨基末端衍生物或修饰形式。此类Apo-2配体序列包括本文所述在多肽序列N末端具有甲硫氨酸或经修饰甲硫氨酸(诸如甲酰甲硫氨酰基或其它受封闭甲硫氨酰基类型)的任何Apo-2配体多肽。
可将编码天然或变异Apo-2配体的核酸(例如cDNA或基因组DNA)插入可复制载体以便进一步克隆(DNA扩增)或表达。可公开获得多种载体。载体构件通常包括但不限于如下一种或多种:信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列,它们在下文中都有描述。可采用的任选的信号序列、复制起点、标志基因、增强子元件和转录终止子序列是本领域已知的且更为详细的描述于WO 97/25428。
表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别且与Apo-2配体核酸序列可操作连接的启动子。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5′)(通常在大约100至1000bp内)且控制与其可操作连接的特定核酸序列诸如Apo-2配体核酸序列的转录和翻译的非翻译调控序列。此类启动子通常分成两类,诱导型的和组成性的。诱导型启动子指响应培养条件的某些变化(如营养物的存在与否或温度变化)而启动受其控制的DNA的升高水平转录的启动子。现在,众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入载体,由此将这些启动子与Apo-2配体编码DNA可操作连接。天然Apo-2配体启动子序列和许多异源启动子都可用于指导Apo-2配体DNA的扩增和/或表达。
适用于原核和真核宿主的启动子是本领域已知的,而且更为详细的描述于WO 97/25428。
用于在大肠杆菌中生成可溶性Apo-2L的优选方法采用诱导型启动子来调节产物表达。使用可控的诱导型启动子容许使培养物生长至期望细胞密度,然而诱导产物表达并积聚宿主可能不太耐受的大量产物。
为了表达Apo-2L(114-281形式),申请者评估了几种诱导型启动子系统(T7聚合酶、trp和碱性磷酸酶(AP))。使用这三种启动子之一导致从收获的细胞浆中回收到大量可溶性生物学活性Apo-2L三聚体。因为启动子调控更紧密及在收获的细胞浆中达到的细胞密度和滴度更高,所以AP启动子在这三种测试的诱导型启动子系统中是优选的。
包含一种或多种上述构件的合适载体的构建采用标准连接技术。将分离的质粒或DNA片段切割、剪裁、并以期望方式重新连接以产生所需质粒。
为了进行分析以证实所构建质粒中的序列正确,可用连接混合物转化大肠杆菌K12菌株294(ATCC 31,446)并在适当条件下通过氨苄青霉素或四环素抗性选择成功的转化子。从转化子制备质粒,通过限制性内切核酸酶消化进行分析,和/或使用本领域已知的标准技术进行测序(参见例如Messinget al.,Nucleic Acids Res.,9:309(1981);Maxam et al.,Methods in Enzymology,65:499(1980))。
可采用在哺乳动物细胞中提供编码Apo-2配体的DNA的瞬时表达的表达载体。通常,瞬时表达牵涉使用能够在宿主细胞中高效复制的表达载体,使得宿主细胞积聚许多拷贝的表达载体并继而高水平的合成由该表达载体编码的期望多肽(Sambrook et al.,见上文)。包含合适表达载体和宿主细胞的瞬时表达系统容许方便的正向鉴定(positive identification)由所克隆DNA编码的多肽,以及对所述多肽快速筛选期望生物学或生理学特性。因此,为了鉴定是生物学活性Apo-2配体的Apo-2配体类似物和变体,瞬时表达系统在本发明中特别有用。
适于修改以在重组脊椎动物细胞培养物中合成Apo-2配体的其它方法、载体和宿主细胞描述于Gething et al.,Nature,293:620-625(1981);Mantei etal.,Nature,281:40-46(1979);EP 117,060;EP 117,058。
适于克隆或表达本文载体中DNA的宿主细胞包括原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括但不限于真细菌(Eubacteria),诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体,例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae),诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacteria)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacillus)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公开的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。优选的是,宿主细胞应分泌最小量的蛋白水解酶。
除了原核生物之外,真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适于Apo-2配体编码载体的克隆或表达宿主。适用于表达糖基化Apo-2配体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。所有此类宿主细胞的例子,包括CHO细胞,进一步描述于WO 97/25428。
用上文为Apo-2配体生产而描述的表达或克隆载体转染和优选转化宿主细胞,并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的营养培养基中培养。
转染指宿主细胞对表达载体的摄取,无论任何编码序列事实上是否表达。普通技术人员知道许多转染方法,例如CaPO4和电穿孔。当宿主细胞内出现此载体运转的任何迹象时,通常承认转染是成功的。
转化指将DNA导入生物体,使得该DNA可复制,或是作为染色体外元件或是通过染色体成分(integrant)。根据所用宿主细胞,使用适于此类细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理,如Sambrook et al.,见上文中所述,或者电穿孔,通常用于具有坚固细胞壁屏障的原核生物或其它细胞。使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行的感染用于转化某些植物细胞,如Shaw et al.,Gene,23:315(1983)和1989年6月29日公开的WO89/05859中所述。此外,可使用超声处理转染植物,如1991年1月10日公开的WO 91/00358中所述。
对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞,可采用Graham and van der Eb,Virology,52:456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转化的一般情况描述于美国专利4,399,216。对酵母的转化通常依照Van Solingen etal.,J.Bact.,130:946(1977)和Hsiao et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)的方法进行。然而,还可使用将DNA导入细胞的其它方法,诸如通过核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞融合、或聚阳离子例如polybrene、聚鸟氨酸。关于转化哺乳动物细胞的各种技术参见Keown et al.,Methods in Enzymology,185:527-537(1990)和Mansour et al.,Nature,336:348-352(1988)。
用于生产Apo-2配体的原核细胞可在合适的培养基中培养,通常如Sambrook et al.,见上文中所述。可用于培养大肠杆菌的培养基的具体形式进一步描述于下文实施例。用于生产Apo-2配体的哺乳动物宿主细胞可在多种培养基中培养。
商品化培养基的例子包括Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(“MEM”,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(“DMEM”,Sigma)。任何此类培养基都可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GentamycinTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或相当能源。还可以本领域技术人员知道的适宜浓度包括任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等就是先前为了表达而选择用于宿主细胞的那些培养条件,而且对于普通技术人员是显而易见的。
一般而言,用于使哺乳动物细胞培养物的生产力最大化的原理、方案和实用技术可参阅《Mammalian Cell Biotechnology:A Practical Approach》,M.Butler编,IRL出版社,1991。
依照本发明的一个方面,通常在用于培养或发酵宿主细胞的培养基中加入或包含一种或多种二价金属离子。二价金属离子优选以足以增强贮藏稳定性、提高溶解度、或帮助以一个或多个锌离子配位的稳定Apo-2L三聚体形成的浓度水平存在或加入培养基中。可添加的二价金属离子的量部分取决于培养物中的宿主细胞密度或宿主细胞对此类二价金属离子的潜在敏感性。当培养物中的宿主细胞密度较高时,提高二价金属离子的浓度可能是有益的。如果二价金属离子在宿主细胞表达产物期间或之后加入,那么可能希望随着宿主细胞产物表达的增加而调整或提高二价金属离子浓度。通常认为典型的通常可获得的细胞培养基中可能存在的痕量水平二价金属离子可能对于稳定三聚体形成是不足够的。因此,如本文所述添加更多量的二价金属离子是优选的。
如果在培养物中的宿主细胞的生长期加入二价金属离子,那么优选以不对宿主细胞生长产生不利或消极影响的浓度将二价金属离子加入培养基中。在摇瓶培养中,观察到以大于1mM的浓度加入ZnSO4可导致宿主细胞密度降低。本领域技术人员意识到细菌细胞可通过形成金属离子与细胞基质的复合物而有效鳌合(sequester)金属离子。因此,在细胞培养中,优选在生长期之后(达到期望宿主细胞密度之后)或恰好在宿主细胞表达产物之前将选定的二价金属离子加入培养基中。为了保证存在足够量的二价金属离子,在产物表达期可向细胞培养基中添加或供给额外的二价金属离子。
培养基中的二价金属离子浓度不应超过可能对宿主细胞有害或有毒的浓度。在本发明采用宿主细胞大肠杆菌的方法中,优选培养基中的二价金属离子浓度不超过约1mM(优选≤1mM)。甚至更优选的是,培养基中的二价金属离子浓度是约50微摩尔至约250微摩尔。最优选的是,此类方法中使用的二价金属离子是硫酸锌。希望以其中金属离子和Apo-2配体三聚体可以1∶1摩尔比存在的量将二价金属离子加入细胞培养基中。
二价金属离子可以任何可接受的形式加入细胞培养基中。例如,可用水制备金属离子溶液,然后可向培养基中加入或供给二价金属离子溶液。
可直接测量样品中的Apo-2L表达,例如以本文提供的序列为基础,使用适当标记的探针,通过常规的Southern印迹、对mRNA转录进行定量的Northern印迹(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201-5205(1980))、点印迹(DNA分析)或原位杂交。可采用多种标记物,最常用的是放射性同位素,特别是32P。然而,也可采用其它技术,诸如使用生物素修饰的核苷酸导入多核苷酸中。然后将生物素用作结合亲合素或抗体的位点,所述亲合素或抗体可用极其多种标记物进行标记,诸如放射性核苷酸、荧光剂或酶。或者,可采用能识别特定双链体的抗体,所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体、和DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。抗体继而可进行标记,并可进行这样的测定法,其中使双链体结合到某一表面上,使得在该表面上形成双链体后,可检测与双链体结合的抗体的存在。或者,可通过免疫学方法来测量基因表达,诸如细胞或组织切片的免疫组织化学染色和细胞培养物或体液的测定法,以对基因产物的表达进行直接定量。关于免疫组织化学染色技术,通常通过脱水和固定来制备细胞样品,随后与对所偶联基因产物特异的经标记抗体进行反应,其中标记物通常是可直观检测的,诸如酶标记物、荧光标记物、发光标记物等。
可用于免疫组织化学染色和/或体液样品测定法的抗体可以是单克隆的或多克隆的,而且可以在任何哺乳动物中制备。方便的是,可针对天然Apo-2配体多肽或针对基于本文所提供的DNA序列的合成肽或针对与Apo-2配体DNA融合且编码特异抗体表位的外源序列制备抗体。
Apo-2配体优选作为分泌多肽从培养液中回收,尽管在没有分泌信号而直接产生时也可从宿主细胞裂解物中回收。若Apo-2配体是膜结合的,则可使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)将它从膜上释放下来或者可通过酶促切割释放它的胞外区。
当在人起源的重组细胞以外的重组细胞中生产Apo-2配体时,该Apo-2配体不含人起源的蛋白质或多肽。然而,通常必需从重组细胞蛋白质或多肽中回收或纯化Apo-2配体以获得就Apo-2配体而言基本上同质的制备物。第一步,可将培养液或裂解物离心以除去微粒状细胞碎片。然而通过合适的纯化流程从污染性可溶性蛋白质和多肽中纯化Apo-2配体,例示性流程如下:离子交换柱上的分级分离;乙醇沉淀;反相HPLC;硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE或CM上的层析;层析聚焦;SDS-PAGE;硫酸铵沉淀;使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤;渗滤;和蛋白A Sepharose柱以除去污染物诸如IgG。
在一个优选的实施方案中,可通过亲和层析来分离Apo-2配体。其中有残基已删除、插入或替代的Apo-2配体片段或变体以与天然Apo-2配体相同的方式回收,考虑由于变异引起的任何实质性的特性变化。例如,Apo-2配体与另一蛋白质或多肽例如细菌或病毒抗原的融合物的制备方便了纯化;可使用含有所述抗原之抗体的免疫亲和柱吸附所述融合多肽。
蛋白酶抑制剂诸如苯基甲基磺酰氟(PMSF)也可用于抑制纯化过程中的蛋白水解性降解作用,而且可包括抗生素来防止外来污染物的生长。本领域技术人员意识到由于重组细胞培养中表达的Apo-2配体或其变体的特性改变,适于天然Apo-2配体的纯化方法可能需要进行修改。
在任何这些纯化步骤中,可能希望将回收的Apo-2L暴露于含二价金属离子的溶液或含一种或多种二价金属离子的纯化材料(诸如层析介质或支持物)。在一个优选的实施方案中,在Apo-2L的回收或纯化期间使用二价金属离子和/或还原剂。任选的是,二价金属离子和还原剂,诸如DTT或BME,都可在Apo-2L的回收或纯化期间使用。认为在回收或纯化期间使用二价金属离子会稳定Apo-2L三聚体或保护细胞培养步骤中形成的Apo-2L三聚体。
下文描述还涉及生成共价附着(以下称为“偶联”)有一种或多种化学基团的Apo-2配体的方法。适用于本发明Apo-2L偶联物的化学基团优选没有显著毒性或免疫原性。任选选择化学基团以生成能在适于贮存的条件下贮存和使用的Apo-2L偶联物。可与多肽偶联的多种例示性化学基团是本领域已知的,包括例如碳水化合物,诸如天然存在于糖蛋白上的碳水化合物、多谷氨酸(酯/盐)、和非蛋白质聚合物诸如多元醇(参阅例如美国专利6,245,901)。
例如,多元醇可与多肽诸如Apo-2L在一种或多种氨基酸残基处包括赖氨酸残基偶联,正如WO 93/00109,见上文中所公开的。所采用的多元醇可以是任何水溶性聚(亚烷基氧化物)聚合物,而且可具有线性链或分支链。合适的多元醇包括那些在一个或多个羟基位置用化学基团诸如具有1至4个碳的烷基取代的多元醇。典型的是,多元醇是聚(亚烷基二醇),诸如聚(乙二醇)(PEG),因此,为了便于描述,余下讨论涉及例示性实施方案,其中所采用的多元醇是PEG且将多元醇与多肽偶联的过程称为“PEG化”(pegylation)。然而,本发明技术人员认识到,其它多元醇诸如例如聚(丙二醇)和聚乙烯-聚丙二醇共聚物可利用本文中关于PEG描述的偶联技术得以采用。
Apo-2L PEG化中所采用的PEG的平均分子量可有所变化,通常范围可以是约500至约30,000道尔顿(D)。优选的是,PEG的平均分子量是约1,000至约25,000D,更优选约1,000至约5,000D。在一个实施方案中,使用平均分子量约1,000D的PEG进行PEG化。任选的是,PEG同聚物是未取代的,但是它也可以在烷基的一端取代。优选的是,所述烷基是C1-C4烷基,最优选甲基。PEG制品可商购,通常适用于本发明的那些PEG制品是依照平均分子量出售的非同质制品。例如,商品化PEG(5000)制品通常含有分子量略有变化的分子,通常是±500D。
本发明的Apo-2配体可以是多种形式的,诸如单体形式或三聚体形式(包含三个单体)。任选的是,Apo-2L三聚体是以这样的方式PEG化的,使得PEG分子与构成三聚体Apo-2L的三个单体中的一个、两个或每个连接或偶联。在这样的一个实施方案中,优选所采用的PEG的平均分子量为约1,000至大约5,000D。还设想了Apo-2L三聚体可以是“部分”PEG化的,即其中构成三聚体的三个单体中只有一个或两个与PEG连接或偶联。
本领域知道用于蛋白质PEG化的多种方法。生成与PEG偶联的蛋白质的具体方法包括美国专利4,179,337、美国专利4,935,465和美国专利5,849,535中记载的方法。通常,蛋白质经由该蛋白质的一个或多个氨基酸残基与聚合物的末端反应性基团共价键合,主要取决于反应条件、聚合物的分子量、等等。具有反应性基团的聚合物在本文中称作活化的聚合物。反应性基团选择性的与蛋白质上的游离氨基或其它反应性基团起反应。PEG聚合物可与蛋白质上的氨基或其它反应性基团以随机或位点特异的方式偶联。然而,应当理解,为了获得最佳结果,所选择反应性基团的类型和数量以及所采用聚合物的类型将取决于所采用的具体蛋白质或蛋白质变体,以避免反应性基团与蛋白质上过多的特别活跃的基团起反应。由于这可能不能完全避免,所以通常推荐每摩尔蛋白质使用约0.1至1000摩尔,优选2至200摩尔活化的聚合物,这取决于蛋白质浓度。最终的每摩尔蛋白质使用的活化聚合物的量是维持最佳活性同时,如果有可能,维持最佳蛋白质循环半衰期的平衡。
还设想了还可使用本领域已知的技术将本文所述Apo2L与亮氨酸拉链序列连接或融合。
************************
用于生成死亡受体抗体和CD20抗体的方法在本文中也有描述。将用于生成或筛选抗体的抗原可以是例如可溶形式的抗原或其包含期望表位的一部分。或者/另外,可使用在其细胞表面表达抗原的细胞来生成或筛选抗体。可用于生成抗体的其它形式的抗原对本领域技术人员是显而易见的。
(i)多克隆抗体
多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生化试剂,例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N=C=NR,其中R和R1是不同的烃基,将相关抗原与在待免疫的物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的,例如匙孔血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和,并将溶液皮内注射于多个部位,由此将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后,通过多个部位的皮下注射,用弗氏完全佐剂中肽或偶联物初始量的1/5-1/10对动物进行强化。7-14天后,采集动物的血液,并测定血清的抗体滴度。对动物进行强化直到滴度达到稳定。优选的是,将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行强化。偶联物还可在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备。同样,适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
(ii)单克隆抗体
单克隆抗体是由一群基本上同质的抗体获得的,即构成群体的各个抗体相同,除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。由此,修饰语“单克隆”表示抗体的特征,即不是分立的抗体的混合物。
例如,单克隆抗体可以通过最初由Kohler et al.,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备,或者可通过重组DNA方法来制备(美国专利4,816,567)。
在杂交瘤方法中,如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物,诸如仓鼠,以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞,所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者,可以在体外免疫淋巴细胞。然后,使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养,所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如,如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT),则用于杂交瘤的培养基通常将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基),这些物质阻止缺乏HGPRT的细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持选择的抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的骨髓瘤细胞。在这些细胞中,优选的骨髓瘤细胞系是鼠源骨髓瘤系,诸如可从Salk Institute CellDistribution Center(San Diege,California,USA)购得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的衍生系,以及可从American Type Culture Collection(Manassas,Virginia,USA)购得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是,通过免疫沉淀或通过体外结合测定法,诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA),测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson et al.,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后,所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆,并使用标准方法进行培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外,杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。
可通过常规免疫球蛋白纯化流程,诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析,将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于通过常规流程分离并测序(例如使用能够特异性结合编码鼠源抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离,可将DNA置于表达载体中,然后将该表达载体转染到宿主细胞中,诸如不另外产生免疫球蛋白蛋白质的大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞,以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.5:256-262(1993)和Plückthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一个实施方案中,可从使用McCafferty et al.,Nature 348:552-554(1990)所述技术构建的噬菌体抗体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson etal.,Nature 352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠源和人源抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)),以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.,Nuc.Acids Res.21:2265-2266(1993)),生成高亲和力(nM范围)的人源抗体。由此,这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替换方法。
还可以修饰DNA,例如通过替代即用人重链和轻链恒定区的编码序列代替同源鼠源序列(美国专利4,816,567;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851(1984)),或通过共价接合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。
通常,用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定区,或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变区,产生嵌合二价抗体,它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点以及对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
(iii)人源化抗体
本领域已经描述了用于将非人抗体人源化的方法。优选的是,人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基,它们通常取自“输入”可变区。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法进行(Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-327(1988);Verhoeyen et al.,Science 239:1534-1536(1988)),通过用高变区序列替代相应的人抗体序列。因此,此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567),其中本质上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中,人源化抗体通常是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。
用于制备人源化抗体的人可变区的选择,包括轻链和重链,对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最适(best-fit)”方法,用啮齿类抗体可变区序列对已知的人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚型的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992);Presta et al.,J.Immunol.151:2623(1993))。
更为重要的是,抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力以及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的,依照一种优选的方法,通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的,且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用,即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样,可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合,从而获得所需抗体特征,诸如对靶抗原的亲和力提高。通常,高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
(iv)人抗体
作为人源化的替代方法,可生成人抗体。例如,现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如,已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993);Bruggermann et al.,Year in Immuno.7:33(1993);及美国专利5,591,669、5,589,369和5,545,807。
或者,噬菌体展示技术(McCafferty et al.,Nature 348:552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因全集生成人抗体和抗体片段。根据这种技术,将抗体V区基因克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因的读码框中,并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝,以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。由此,噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行;有关综述参见例如Johnson,Kevin S.and Chiswell,David J.,CurrentOpinion in Structural Biology 3:564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)从衍生自免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。可本质上依照Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith et al.,EMBO J.12:725-734(1993)所述技术,由未免疫人供体构建V基因全集,并分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利5,565,332和5,573,905。
还可通过体外激活B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)来生成人抗体。
(v)抗体片段
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上,通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.,Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan et al.,Science 229:81(1985))。然而,现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如,可从上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者,可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段,并通过化学方法偶联形成F(ab′)2片段(Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992))。依照另一种方法,可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员是显而易见的。在其它实施方案中,选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185;美国专利5,571,894;和美国专利5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”,例如美国专利5,641,870中描述的抗体。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)双特异性抗体
双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合CD20、DR4或DR5受体的两种不同表位。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于B细胞。这些抗体拥有B细胞标志结合臂及结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生成基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达,其中两种链具有不同的特异性(Millstein et al.,Nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配,这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物,其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦,且产物产量低。WO 93/08829及Traunecker et al.,EMBO J.10:3655-3659(1991)中公开了类似的流程。
根据一种不同的方法,将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。优选的是,在至少一种融合物中具有包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及,如果需要,免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体,并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中,这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而,在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率没有特别意义时,有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个载体。
在本方法的一个优选实施方案中,双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链,和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径,因此发现这种不对称结构便于将所需双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的其它细节参见例如Suresh et al.,Methodsin Enzymology 121:210(1986)。根据美国专利5,731,168中描述的另一种方法,可改造一对抗体分子之间的界面,将从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分CH3抗体恒定区。在该方法中,将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链,在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如,异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联,另一种抗体与生物素偶联。例如,此类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980),和用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的,并且连同许多交联技术一起公开于美国专利4,676,980。
文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如,可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.,Science 229:81(1985);Shalaby etal.,J.Exp.Med.,175:217-225(1992)。
还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如,已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al.,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原,形成单体,然后重新氧化,形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替换机制。该片段包含通过接头相连的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此,迫使一个片段上的VH和VL区与另一个片段上的互补VL和VH区配对,由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber etal.,J.Immunol.152:5368(1994)。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如,可制备三特异性抗体。Tutt et al.,J.Immunol.147:60(1991)。WO 01/77342(Miller和Presta)中描述了具有三个或更多抗原结合位点的抗体,在此明确收入作为参考。
任选将本文方法中所使用的或制品中所包含的抗体与细胞毒剂偶联。
上文已经描述了可用于生成此类抗体-细胞毒剂偶联物的化疗剂。
本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素形成的偶联物,诸如加利车霉素、美登素(美国专利5,208,020)、单端孢菌毒素和CC1065。在本发明的一个实施方案中,将抗体与一个和多个美登素分子偶联(例如每个抗体分子偶联约1个至约10个美登素分子)。例如可将美登素转变为May-SS-Me,后者可还原为May-SH3并与经修饰抗体反应(Chari et al.,Cancer Research 52:127-131(1992))以产生美登木素生物碱-抗体偶联物。
或者,将抗体与一个或多个加利车霉素分子偶联。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman et al.,Cancer Research 53:3336-3342(1993)和Lode et al.,Cancer Research 58:2925-2928(1998))。
可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(neomycin)和单端孢菌毒素(tricothecenes)。还可参见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。
本发明还设想了与具有核酸水解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶;DNA酶)偶联的抗体。
有多种放射性同位素可用于生成放射性偶联的拮抗剂或抗体。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和胞毒剂的偶联物,诸如3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚氨基酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羧酸琥珀酰亚氨基酯、亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二酰亚胺酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如,可如Vitetta et al.,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与拮抗剂或抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如,可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari et al.,Cancer Research 52:127-131(1992))。
或者,可例如通过重组技术或肽合成法来制备包含抗体和胞毒剂的融合蛋白。
还可将本发明的抗体与前体药物活化酶偶联,后者将前体药物(例如肽基化疗剂,参见WO 81/01145)转变为活性抗癌药。参见例如WO 88/07378和美国专利4,975,278。
此类偶联物的酶成分包括能够以这样一种方式作用于前体药物从而将其转变为更具活性的细胞毒性形式的任何酶。
可用于本发明方法的酶包括但不限于可将含磷酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸酶;可将含硫酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的芳基硫酸酯酶;可将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶;可将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶,诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L);可转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶;可将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割酶类,诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶;可将β-内酰胺衍生的药物转变为游离药物的β-内酰胺酶;及可将在其氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶,诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者,可使用具有酶活性的抗体,本领域也称作“抗体酶”,将本发明的前体药物转变为游离活性药物(参见例如Massey,Nature 328:457-458(1987))。可如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物,用于将抗体酶投递至肿瘤细胞群。
可通过本领域众所周知的技术将本发明的酶与抗体共价结合,诸如使用上文讨论的异双功能交联剂。或者,可使用本领域众所周知的重组DNA技术构建包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的抗体的至少抗原结合区的融合蛋白(参见例如Neuberger et al.,Nature 312:604-608(1984))。
本文还设想了抗体的其它修饰。例如,可将抗体与多种非蛋白质性质聚合物中的一种连接,例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
为了提高抗体的血清半衰期,可如例如美国专利5,739,277中所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时,术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。或者/另外,可通过改变抗体Fc区氨基酸序列以生成具有改变的FcRn结合的变体来提高或降低血清半衰期。WO00/42072(Presta,L.)中描述了具有改变的FcRn结合和/或血清半衰期的抗体。
*************************************
本发明还提供了包含Apo2L/TRAIL、死亡受体抗体和/或CD20抗体的配制剂。认为此类配制剂特别适于贮存以及治疗性施用。所述配制剂可通过已知技术来制备。例如,可通过凝胶过滤柱上的缓冲液交换来制备所述配制剂。
通常,配制剂中使用适当量的可接受盐或载体使得配制剂等渗。药学可接受载体的例子包括盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。配制剂的pH优选约6至约9,更优选约7至约7.5。对于本领域技术人员显而易见的是,根据例如施用路径及Apo-2配体、死亡受体抗体和/或CD20抗体的浓度,某些载体可能是更优选的。
可如下制备治疗用配制剂,即将具有期望纯度的所需分子与任选的载体、赋形剂或稳定剂混合(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》,第16版,Osol,A.编,1980),以冻干剂型、水溶液或水悬浮液的形式贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂优选在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的,包括缓冲剂,诸如Tris、HEPES、PIPES、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵;氯化己烷双胺;苯扎氯铵、苯索氯铵;酚、丁醇或苯甲醇;对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯;邻苯二酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;糖类,诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成盐相反离子,诸如钠;和/或非离子表面活性剂,诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
此类载体的其它例子包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质诸如人血清清蛋白、缓冲物质诸如甘氨酸、山犁酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐、或电解质诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮和基于纤维素的物质。用于局部的或基于凝胶的形式的载体包括多糖诸如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇、和木蜡醇。对于所有施用,适当使用常规贮存(depot)形式。此类形式包括例如微胶囊、纳米胶囊、脂质体、硬膏剂、吸入形式、鼻腔喷雾、舌下片剂、和持续释放制剂。
将用于体内施用的制剂应当是无菌的。这可容易的通过在冻干和重建之前或之后经无菌滤膜过滤来实现。所述配制剂可以冻干形式或以溶液贮存,如果系统施用的话。如果是冻干形式,它通常联合其它成分一起配制,在使用时用适当的稀释剂重建。液体配制剂的例子是装在单剂药瓶中用于皮下注射的无菌、清澈、无色、无防腐处理(unpreserved)的溶液。
治疗用配制剂通常置于具有无菌存取口的容器中,例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶。配制剂优选以重复的静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、肌肉内(i.m.)注射或灌输,或者作为适于鼻内或肺内投递的气雾剂剂型(关于肺内投递参阅例如EP 257,956)来施用。
Apo2L/TRAIL、死亡受体抗体、和CD20抗体还可以持续释放制剂的形式施用。持续释放制剂的合适例子包括含有蛋白质的固体疏水性聚合物半透性基质,该基质以定型产品的形式存在,例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯),如Langer et al.,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982)所述,或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919、EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman et al.,Biopolymers,22:547-556(1983))、不可降解的乙烯-乙酸乙烯(Langer et al.,见上文)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)、及聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。
本文所述Apo2L/TRAIL、死亡受体抗体和CD20抗体可用于各种治疗应用。在这些应用中有治疗癌症和免疫相关疾病的方法。本领域技术人员可对哺乳动物中本文所述各种病理状况进行诊断。本领域可得到容许例如诊断或检测哺乳动物中的癌症或免疫相关疾病的诊断技术。例如,可通过以下技术来鉴定癌症,包括但不限于触诊、血液分析、x-射线、NMR等等。免疫相关疾病也很容易鉴定。在系统性红斑狼疮中,疾病的重要媒介是产生了针对自身蛋白质/组织的自身反应性抗体并随后产生了免疫介导的炎症。在临床上多种器官和系统受到影响,包括肾、肺、肌骨骼系统、粘膜与皮肤、眼、中枢神经系统、心血管系统、胃肠道、骨髓和血液。类风湿性关节炎(RA)是主要牵涉多个关节的滑膜且导致关节软骨损伤的慢性系统性自身免疫性炎性疾病。发病机理是T淋巴细胞依赖性的,且与类风湿因子,针对自身IgG的自身抗体的产生有关,导致免疫复合物的形成并在关节液和血液中达到高水平。关节中的这些复合物可诱导淋巴细胞和单核细胞显著渗透进入滑膜及随后显著的滑液改变;关节间隙/关节液,如果受到相似细胞的渗透及添加了众多嗜中性粒细胞(the joint space/fluid if infiltrated by similar cells with theaddition of numerous neutrophils)。受影响的组织主要是关节,通常是对称模式。然而,还有关节外疾病以两种主要形式出现。一种形式是关节外损伤的发展,伴随着正在发展的进行性关节病和典型的肺纤维化损伤、脉管炎和皮肤溃疡。第二种形式的关节外疾病是在RA疾病进程晚期发生的所谓费尔提氏(Felty)综合征,有时在关节病沉寂后,牵涉嗜中性白血球减少、血小板减少和脾大的出现。这可伴随着多个器官中的脉管炎以及梗塞、皮肤溃疡和坏疽的形成。患者常常还在覆盖受影响关节的皮下组织中形成类风湿结节;节结晚期具有由混合的炎性细胞渗入物环绕的坏死中心。RA中可能发生的其它表现包括:心包炎、胸膜炎、冠状动脉炎、伴有肺纤维化的间质性肺炎、干燥性角膜结膜炎和类风湿结节。
Apo2L/TRAIL、死亡受体抗体、和CD20抗体可依照已知方法施用,诸如静脉内施用像推注或一段时间的持续灌输,通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入路径。任选的是,可使用各种商品化装置通过微型泵灌输进行施用。
施用Apo2L/TRAIL、死亡受体抗体、和CD20抗体的有效剂量和进度表可凭经验决定,而且做出这样的决定在本领域技术范围内。可采用单个剂量或多个剂量。目前认为单独使用Apo2L/TRAIL的有效剂量或数量的范围可以是每天约1μg/kg至约100mg/kg体重或更多。可以本领域已知的方式进行剂量的物种间定标,例如可参阅Mordenti et al.,Pharmaceut.Res.,8:1351(1991)。
在采用体内施用Apo2L/TRAIL时,正常剂量的范围可以是每天约10ng/kg至高达100mg/kg哺乳动物体重或更多,优选约1μg/kg/天至10mg/kg/天,取决于施用路径。文献中提供了有关具体剂量和投递方法的指导;参阅例如美国专利4,657,760;5,206,344;或5,225,212。预期不同配制剂将对不同治疗用化合物和不同紊乱有效,即例如靶向一种器官或组织的施药可能必须以不同于另一器官或组织的方式投递。本领域技术人员将理解,必须施用的Apo2L/TRAIL剂量将根据例如将接受Apo2L/TRAIL的哺乳动物、施用路径、和正施用于该哺乳动物的其它药品或疗法而变化。
CD20抗体可以是未与细胞毒剂偶联的抗体,诸如Rituximab或人源化2H7。未缀合抗体的合适剂量例如在约20mg/m2至约1000mg/m2的范围内。在一个实施方案中,所述抗体的剂量不同于目前所推荐的Rituximab剂量。CD20抗体的例示性剂量方案包括375mg/m2每周一次×4或8;或者1000mg×2(例如在第1天和第15天)。
设想了可在所述方法中采用另外的疗法。所述一种或多种其它疗法可包括但不限于施行本领域已知且具体在上文章节I中进一步定义的放射疗法、细胞因子、生长抑制剂、化疗剂、细胞毒剂、酪氨酸激酶抑制剂、ras法呢基转移酶抑制剂、血管发生抑制剂和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。
例示性治疗用抗体包括抗HER2抗体,包括rhuMAb 4D5(HERCEPTIN)(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285-4289(1992);美国专利5,725,856);抗IL-8(St John et al.,Chest,103:932(1993);国际公开号WO95/23865);抗VEGF抗体,包括人源化的和/或亲和力成熟的抗VEGF抗体,诸如人源化抗VEGF抗体huA4.6.1 AVASTIN(Kim et al.,Growth Factors,7:53-64(1992);国际公开号WO 96/30046;和1998年10月15日公开的WO98/45331);抗PSCA抗体(WO 01/40309);抗CD40抗体,包括S2C6及其人源化变体(WO 00/75348);抗CD11a抗体,包括RaptivaTM(美国专利5,622,700;WO 98/23761;Steppe et al.,Transplant Intl.4:3-7(1991);及Hourmant et al.,Transplantation 58:377-380(1994));抗IgE抗体(Presta et al.,J.Immunol.151:2623-2632(1993);国际公开号WO 95/19181;1998年2月3日授权的美国专利5,714,338;1992年2月25日授权的美国专利5,091,313;1993年3月4日公开的WO 93/04173;1998年6月30日提交的国际申请PCT/US98/13410;美国专利5,714,338);抗CD18抗体(1997年4月22日授权的美国专利5,622,700;或1997年7月31日公开的WO 97/26912);抗Apo-2受体抗体抗体(1998年11月19日公开的WO 98/51793);抗TNF-α抗体,包括cA2(REMICADE)、CDP571和MAK-195(参阅1997年9月30日授权的美国专利5,672,347;Lorenz et al.J.Immunol.156(4):1646-1653(1996);及Dhainaut et al.Crit.CareMed.23(9):1461-1469(1995));抗组织因子(TF)抗体(1994年11月9日授权的欧洲专利0 420 937 B1);抗人α4-β7整联蛋白抗体(1998年2月19日公开的WO 98/06248);抗EGFR抗体(如1996年12月19日公开的WO 96/40210中的嵌合或人源化225抗体);抗CD3抗体,诸如OKT3(1985年5月7日授权的美国专利4,515,893);抗CD25或抗Tac抗体,诸如CHI-621(SIMULECT)和ZENAPAX(参阅1997年12月2日授权的美国专利5,693,762);抗CD4抗体,诸如cM-7412抗体(Choy et al.Arthritis Rheum 39(1):52-56(1996));抗CD52抗体,诸如CAMPATH-1H(Riechmann et al.Nature 332:323-337(1988));抗Fc受体抗体,诸如针对Fc_RI的M22抗体,见Graziano et al.J.Immunol.155(10):4996-5002(1995);抗癌胚抗原(CEA)抗体,诸如hMN-14(Sharkey etal.Cancer Res.55(23 Suppl):5935s-5945s(1995);针对乳房上皮细胞的抗体,包括huBrE-3、hu-Mc 3和CHL6(Ceriani et al.Cancer Res.55(23):5852s-5856s(1995);及Richman et al.Cancer Res.55(23 Supp):5916s-5920s(1995));结合结肠癌细胞的抗体,诸如C242(Litton et al.Eur J.Immunol.26(1):1-9(1996));抗CD38抗体,例如AT 13/5(Ellis et al.J.Immunol.155(2):925-937(1995));抗CD33抗体,诸如Hu M195(Jurcic et al.Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s(1995))和CMA-676或CDP771;抗CD22抗体,诸如LL2或LymphoCide(Juweid et al.Cancer Res 55(23Suppl):5899s-5907s(1995);抗EpCAM抗体,诸如17-1A(PANOREX);抗GpIIb/IIIa抗体,诸如abciximab或c7E3 Fab(REOPRO);抗RSV抗体,诸如MEDI-493(SYNAGIS);抗CMV抗体,诸如PROTOVIR;抗HIV抗体,诸如PRO542;抗肝炎抗体,诸如抗Hep B抗体OSTAVIR;抗CA 125抗体OvaRex;抗独特型GD3表位抗体BEC2;抗.v.3抗体VITAXIN;抗人肾细胞癌抗体,诸如ch-G250;ING-1;抗人17-1A抗体(3622W94);抗人结肠直肠肿瘤抗体(A33);针对GD3神经节苷脂的抗人黑素瘤抗体R24;抗人鳞状细胞癌(SF-25);及抗人白细胞抗原(HLA)抗体,诸如Smart ID10和抗HLADR抗体Oncolym(Lym-1)。
化疗剂的制备和剂量给药方案可依照制造商的说明书进行,或者由技术人员凭经验决定。此类化学疗法的准备和剂量给药方案也可参阅《Chemotherapy Service》,M.C.Perry编,Williams & Wilkins,Baltimore,MD,1992。化疗剂可在施用Apo2L/TRAIL、死亡受体抗体、和/或CD20抗体之前或之后施用,或者可同时给药。
有时,额外施用一种或多种细胞因子或生长抑制剂可能是有益的。
Apo2L/TRAIL、死亡受体抗体、和CD20抗体(及一种或多种其它疗法)可同时或顺序施用。施用后,可分析体外处理细胞。在体内处理的情况中,可用技术人员众所周知的多种方式监测接受处理的哺乳动物。例如,可对癌细胞进行病理学检查以测定坏死情况,或者可对血清分析免疫系统应答。
对于RA和其它自身免疫病,Apo2L/TRAIL、死亡受体抗体、和/或CD20抗体可与如下药剂联合:上文定义部分所列举的任何一种或多种免疫抑制剂、化疗剂和/或细胞因子;任何一种或多种减轻疾病的抗风湿药(DMARD),诸如羟氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、甲氨喋呤(methotrexate)、来氟米特(leflunomide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、D-青霉胺、金(口服)、金(肌肉内)、米诺环素(minocycline)、环孢菌素(cyclosporine)、葡萄球菌蛋白A免疫吸附;静脉内免疫球蛋白(IVIG);非类固醇抗炎药(NSAID);糖皮质激素(例如经由关节注射);皮质类固醇(例如甲泼尼龙(methylprednisolone)和/或泼尼松(prednisone));叶酸;抗肿瘤坏死因子(TNF)抗体,例如etanercept/ENBRELTM、infliximab/REMICADETM、D2E7(Knoll)或CDP-870(Celltech);IL-1R拮抗剂(例如Kineret);IL-10拮抗剂(例如Ilodecakin);血液凝结调质(例如WinRho);IL-6拮抗剂/抗TNF(CBP 1011);CD40拮抗剂(例如IDEC 131);Ig-Fc受体拮抗剂(MDX33);免疫调节物(例如沙利度胺(thalidomide)或ImmuDyn);抗CD5抗体(例如H5g1.1);巨噬细胞抑制剂(例如MDX 33);共刺激封闭剂(例如BMS 188667或Tolerimab);补体抑制剂(例如h5G1.1、3E10或抗衰变加速因子(DAF)抗体);或IL-2拮抗剂(zxSMART)。
对于例如B细胞恶性肿瘤,Apo2L/TRAIL、死亡受体抗体、和/或CD20抗体可与如下药剂联合:化疗剂;细胞因子,例如淋巴因子诸如IL-2、IL-12或干扰素诸如干扰素α-2a;其它抗体,例如放射性标记抗体,诸如ibritumomabtiuxetan(ZEVALIN)、碘I131 tositumomab(BEXXARTM)、131I Lym-1(ONCOLYMTM)、90Y-LYMPHOCIDETM;抗CD52抗体,诸如alemtuzumab(CAMPATH-1HTM),抗HLA-DR-β抗体,诸如apolizumab,抗CD80抗体(例如IDEC-114),epratuzumab,Hu1D10(SMART 1D10TM),CD19抗体,CD40抗体或CD22抗体;免疫调节剂(例如沙利度胺(thalidomide)或ImmuDyn);血管发生抑制剂(例如抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体,诸如AVASTINTM或沙利度胺(thalidomide));独特型疫苗(EPOCH);ONCO-TCSTM;HSPPC-96(ONCOPHAGETM);脂质体疗法(例如柠檬酸柔红霉素(daunorubicin)脂质体),等等。
在本发明的另一个实施方案中,提供了包含可用于治疗上文所述癌症或免疫相关疾病的物质的制品。一方面,该制品包括:(a)装有CD20抗体的容器(优选装有该抗体和药学可接受载体或稀释剂的容器);(b)装有Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体的容器(优选装有Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体和药学可接受载体或稀释剂的容器);和(c)附有在患者中治疗癌症或免疫相关疾病的说明书的包装插页,其中所述说明书指出对患者施用一定量的CD20抗体和Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体以在疾病的治疗中有效提供协同作用。
在所有这些方面,所述包装插页贴在所述容器上或与其相关。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。所述容器可以用各种材料诸如玻璃或塑料制成。该容器装有有效治疗癌症或免疫相关疾病的组合物,可具有无菌存取口(例如该容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管)。所述组合物中的至少一种活性剂是CD20抗体、Apo2L/TRAIL或死亡受体抗体。所述标签或包装插页表明该组合物用于在符合治疗条件的患者或受试者中治疗癌症或免疫相关疾病,所述治疗遵循关于所提供的抗体和任何其它药物的剂量给药数量和间隔的具体指示。该制品还可包括另外的容器,其中装有药学可接受的稀释缓冲液,诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和/或右旋糖溶液。该制品还可包括商业和使用者立场上所需的其它物质,包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
下文实施例只用于例示目的,并非意图以任何方式限制本发明的范围。
下文实施例只用于例示目的,并非意图以任何方式限制本发明的范围。在此完整收入本说明书中引用的所有专利和参考文献作为参考。
实施例
除非另有说明,实施例中提及的商品化试剂依照制造商的说明书使用。下文实施例和整篇说明书中所鉴定的那些细胞的来源ATCC指美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,Virginia)。
实施例1:B淋巴瘤细胞系中Apo2L/TRAIL受体表达的分析
为了检验人淋巴瘤细胞系中Apo2L/TRAIL受体(DR4、DR5、DcR1和DcR2)的细胞表面表达,使用对DR4(mAb 4H6.17.8;ATCC HB-12455)、DR5(mAb 3H3.14.5;HB-12534)、DcR1(mAb 6G9;Genentech,Inc.)或DcR2(mAb1G9,Genentech,Inc.)特异的单克隆抗体通过FACS分析B淋巴瘤细胞系Ramos、Daudi、Raji和BJAB(ATCC)。对于Ramos细胞,进行了两次分析以保证再现性(RAMOS A和B)。
如图4所示,DR4和DR5在所有四种细胞系中以显著水平表达(平均荧光变化大约0.5-1.7个单位),而DcR1和DcR2则以较低或极小水平表达(平均荧光变化大约0-0.3个单位)。
实施例2:B淋巴瘤细胞系中CD20表达的分析
为了检验人淋巴瘤细胞系中CD20的细胞表面表达,使用对CD20特异的单克隆抗体(RITUXAN,Genentech,Inc.)通过FACS分析B淋巴瘤细胞系Ramos、Daudi、Raji和BJAB(ATCC)。对于Ramos细胞,进行了两次分析以保证再现性(RAMOS A和B)。
如图5所示,所有四种细胞系都表达高水平的CD20,表现为5-15个单位的平均荧光变化。
实施例3:Apo2L/TRAIL、RITUXAN或联合处理对SCID小鼠中皮下预先移植的BJAB淋巴瘤肿瘤异种移植物生长的影响
给SCID小鼠皮下注射人B细胞非何杰金氏BJAB淋巴瘤细胞(ATCC)(每只小鼠注射2×107个细胞),并使肿瘤生长至约200mm3。然后将小鼠分成4个研究组(每组8只小鼠),并如下处理:两周内每周五剂(即第0-4天和第7-11天)腹膜内(IP)媒介物(0.5M Arg-琥珀酸/20mM Tris/0.02%Tween 20 pH=7.2)、Apo2L/TRAIL(图1的氨基酸第114-281位)(60mg/kg)、或两周内每周一剂(即第0天和第7天)IP RITUXAN(4mg/kg,Genentech,Inc.)、或者后两种Apo2L/TRAIL和RITUXAN方案的组合(图6)。
用媒介物处理的小鼠中肿瘤生长迅速,而单一药剂Apo2L/TRAIL或RITUXAN处理则显著延缓肿瘤生长。Apo2L/TRAIL组中的一只小鼠显示出肿瘤完全消融,留下7/8的肿瘤发生率(TI)。RITUXAN处理未消融任何肿瘤,但显示出更长时间的效果。重要的是,Apo2L/TRAIL和RITUXAN联合处理在所有小鼠中都引起肿瘤体积显著缩小,在至少28天内,8只小鼠中有5只显示出肿瘤完全消融且3/8显示出肿瘤生长极低。这些结果表明,Apo2L/TRAIL和RITUXAN可针对淋巴瘤异种移植物发挥协同抗肿瘤作用。
实施例4:Apo2L/TRAIL、RITUXAN或联合处理对SCID小鼠中生长的皮下预先移植BJAB淋巴瘤肿瘤异种移植物生长的影响
进行了与实施例3所述相似的研究。给SCID小鼠皮下注射人B细胞非何杰金氏BJAB淋巴瘤细胞(ATCC)(每只小鼠注射2×107个细胞),并使肿瘤生长至约200mm3。然后将小鼠分成4个研究组(每组8只小鼠),并如下处理:两周内每周五剂(即第0-4天和第7-11天)腹膜内(IP)媒介物(0.5MArg-琥珀酸/20mM Tris/0.02%Tween 20 pH=7.2)、Apo2L/TRAIL(“Apo2L.0”;图1的氨基酸第114-281位)(60mg/kg)、或两周内每周一剂(即第0天和第7天)IP RITUXAN(4mg/kg)、或者后两种Apo2L/TRAIL和RITUXAN方案的组合。
结果显示于图7。用媒介物处理的小鼠中肿瘤生长迅速,而单一药剂Apo2L/TRAIL或RITUXAN处理则显著延缓肿瘤生长。Apo2L/TRAIL或RITUXAN单独处理都未引起任何完全消退,而RITUXAN显示出更长时间的效果。正如实施例3中所述研究,Apo2L/TRAIL和RITUXAN联合处理在所有小鼠中都引起肿瘤体积显著缩小,7只小鼠中有6只显示出肿瘤完全消融。这些结果表明,Apo2L/TRAIL和RITUXAN可针对淋巴瘤异种移植物发挥协同抗肿瘤作用。
实施例5:Apo2L/TRAIL、RITUXAN或联合处理对SCID小鼠中生长的皮下预先移植BJAB淋巴瘤肿瘤异种移植物中胱天蛋白酶加工的影响
为了检验所处理肿瘤中介导凋亡的胱天蛋白酶加工(表现为蛋白水解性胱天蛋白酶加工),给SCID小鼠皮下注射人B细胞非何杰金氏BJAB淋巴瘤细胞(ATCC)(每只小鼠注射2×107个细胞),并使肿瘤生长至约200mm3。然后如下处理小鼠:媒介物(0.5M Arg-琥珀酸/20mM Tris/0.02%Tween 20pH=7.2)(n=1)、1剂IP Apo2L/TRAIL(60mg/kg)(n=1)、或1剂IP RITUXAN(4mg/kg,Genentech,Inc.)(n=2)、或者后两种Apo2L/TRAIL和RITUXAN药剂的组合(n=2)。处理后两天,获取肿瘤,在裂解缓冲液中裂解,并用针对胱天蛋白酶8、3、9和7的特异性抗体进行免疫印迹(用抗β肌动蛋白抗体作为加样对照)以显现胱天蛋白酶加工(图8)。
与媒介物对照(V)相比,Apo2L/TRAIL处理(A)诱导胱天蛋白酶8、3、9和7的加工增加,而RITUXAN(R)则不诱导胱天蛋白酶加工。值得注意的是,与Apo2L/TRAIL单独处理相比,Apo2L/TRAIL和RITUXAN联合处理(AR)没有进一步增加胱天蛋白酶加工。这些结果表明,Apo2L/TRAIL和RITUXAN之间的协同抗肿瘤作用不是必然通过凋亡的增强来介导的,表明Apo2L/TRAIL介导的凋亡激活和补体依赖性裂解的组合以及RITUXAN介导的ADCC可能是所观察到的抗肿瘤协同作用的基础。
实施例6:激动性DR5抗体、RITUXAN或联合处理对SCID小鼠中皮下预先移植的BJAB淋巴瘤肿瘤异种移植物生长的影响
给SCID小鼠皮下注射人B细胞非何杰金氏BJAB淋巴瘤细胞(ATCC)(每只小鼠注射2×107个细胞),并使肿瘤生长至约200mm3。然后将小鼠分成4个研究组(每组7只小鼠),并如下处理:两周内每周一次(即第0天和第7天)腹膜内(IP)注射媒介物(0.5M Arg-琥珀酸/20mM Tris/0.02%Tween 20 pH=7.2)、激动性DR5单克隆抗体(“Apomab”)(10mg/kg)、或RITUXAN(4mg/kg)、或者后两种DR5抗体和RITUXAN方案的组合(图9)。
用媒介物处理的小鼠中肿瘤生长迅速,而单一药剂DR5抗体或RITUXAN处理则显著延缓肿瘤生长。重要的是,DR5抗体和RITUXAN联合处理在所有小鼠中都引起肿瘤体积显著缩小,在至少35天内,7只小鼠中有5只显示出肿瘤完全消融且2/7显示出肿瘤生长极低。这些结果表明,激动性DR5抗体和RITUXAN可针对淋巴瘤异种移植物发挥协同抗肿瘤作用。
实施例7:激动性DR5抗体、RITUXAN或联合处理对SCID小鼠中生长的皮下预先移植BJAB淋巴瘤肿瘤异种移植物中胱天蛋白酶加工的影响
为了检验所处理肿瘤中介导凋亡的胱天蛋白酶加工(表现为蛋白水解性胱天蛋白酶加工),给SCID小鼠皮下注射人B细胞非何杰金氏BJAB淋巴瘤细胞(ATCC)(每只小鼠注射2×107个细胞),并使肿瘤生长至约200mm3。然后如下处理小鼠:媒介物(0.5M Arg-琥珀酸/20mM Tris/0.02%Tween 20pH=7.2)(n=1)、或1剂IP RITUXAN(4mg/kg)(n=2)、或1剂IP激动性DR5抗体(10mg/kg)(n=2)、或者后两种DR5抗体和RITUXAN药剂的组合(n=2)。处理后两天,获取肿瘤,在裂解缓冲液中裂解,并用针对胱天蛋白酶8、3、9和7的特异性抗体进行免疫印迹(用抗β肌动蛋白抗体作为加样对照)以显现胱天蛋白酶加工(图10)。
与媒介物对照(V)相比,激动性DR5抗体处理(A)诱导胱天蛋白酶8、3、9和7的加工增加,而RITUXAN(R)则不诱导胱天蛋白酶加工。值得注意的是,与DR5抗体单独处理相比,DR5抗体和RITUXAN联合处理(AR)没有进一步增加胱天蛋白酶加工。这些结果说明,DR5和RITUXAN之间的协同抗肿瘤作用不是必然通过凋亡的增强来介导的,而是激动性DR5抗体介导的凋亡激活和补体依赖性裂解的组合以及RITUXAN介导的ADCC可能是所观察到的抗肿瘤协同作用的基础。
图11-16提供了更多的数据,阐明NHL细胞系中CD20和Apo2L/TRAIL受体表达以及Rituximab、Apo2L/TRAIL及其组合对癌细胞的作用。
Claims (27)
1.处理癌细胞的方法,包括使哺乳动物癌细胞暴露于协同有效量的激动性死亡受体抗体和CD20抗体。
2.权利要求1的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是抗DR5受体单克隆抗体。
3.权利要求1的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是抗DR4受体单克隆抗体。
4.权利要求1的方法,其中所述癌细胞在体内暴露于所述协同有效量的激动性死亡受体抗体和CD20抗体。
5.权利要求2或3的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
6.权利要求2或3的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是人抗体。
7.权利要求1的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是与超过一种Apo-2配体受体起交叉反应的抗体。
8.权利要求1的方法,其中所述癌细胞是淋巴瘤细胞。
9.权利要求1的方法,进一步包括使癌细胞暴露于一种或多种生长抑制剂。
10.权利要求1的方法,进一步包括使细胞暴露于放射处理。
11.权利要求2的方法,其中所述DR5抗体具有108M-1至1012M-1的DR5受体结合亲和力。
12.权利要求1的方法,其中所述死亡受体抗体和CD20抗体在选自下组的重组宿主细胞中表达:CHO细胞、酵母细胞和大肠杆菌。
13.权利要求1的方法,其中所述CD20抗体是单克隆抗体。
14.权利要求13的方法,其中所述CD20抗体是抗体Rituximab。
15.治疗免疫相关疾病的方法,包括对哺乳动物施用协同有效量的激动性死亡受体抗体和CD20抗体。
16.权利要求15的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是抗DR5受体单克隆抗体。
17.权利要求15的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是抗DR4受体单克隆抗体。
18.权利要求16或17的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
19.权利要求16或17的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是人抗体。
20.权利要求15的方法,其中所述激动性死亡受体抗体是与超过一种Apo-2配体受体起交叉反应的抗体。
21.权利要求15的方法,其中所述免疫相关疾病是类风湿性关节炎或多发性硬化。
22.权利要求15的方法,其中所述DR5抗体具有108M-1至1012M-1的DR5受体结合亲和力。
23.权利要求15的方法,其中所述死亡受体抗体和CD20抗体在选自下组的宿主细胞中表达:CHO细胞、酵母细胞和大肠杆菌。
24.权利要求15的方法,其中所述CD20抗体是单克隆抗体。
25.权利要求24的方法,其中所述CD20抗体是抗体Rituximab。
26.权利要求1或15的方法,其中所述死亡受体抗体和CD20抗体是顺序施用的。
27.权利要求1或15的方法,其中所述死亡受体抗体和CD20抗体是同时施用的。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US60783404P | 2004-09-08 | 2004-09-08 | |
US60/607,834 | 2004-09-08 | ||
US66655005P | 2005-03-30 | 2005-03-30 | |
US60/666,550 | 2005-03-30 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101048428A true CN101048428A (zh) | 2007-10-03 |
Family
ID=35788041
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2005800364755A Pending CN101048428A (zh) | 2004-09-08 | 2005-09-07 | 利用死亡受体配体和cd20抗体的方法 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20090175854A1 (zh) |
EP (1) | EP1802660A2 (zh) |
JP (1) | JP2008512479A (zh) |
KR (1) | KR20070050951A (zh) |
CN (1) | CN101048428A (zh) |
AU (1) | AU2005282397A1 (zh) |
BR (1) | BRPI0515604A (zh) |
CA (1) | CA2577828A1 (zh) |
IL (1) | IL181315A0 (zh) |
NO (1) | NO20071789L (zh) |
NZ (1) | NZ553171A (zh) |
RU (1) | RU2007112952A (zh) |
WO (1) | WO2006029275A2 (zh) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005044859A2 (en) | 2003-11-05 | 2005-05-19 | Glycart Biotechnology Ag | Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function |
AU2005227322A1 (en) | 2004-03-23 | 2005-10-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof |
WO2008066854A2 (en) * | 2006-11-28 | 2008-06-05 | Novartis Ag | Methods and compositions for inducing apoptosis in cancer cells |
WO2009040811A2 (en) | 2007-09-24 | 2009-04-02 | Bar-Ilan University | Polymer nanoparticles coated by magnetic metal oxide and uses thereof |
AR073295A1 (es) | 2008-09-16 | 2010-10-28 | Genentech Inc | Metodos para tratar la esclerosis multiple progresiva. articulo de fabricacion. |
AR078161A1 (es) | 2009-09-11 | 2011-10-19 | Hoffmann La Roche | Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento. |
KR101853702B1 (ko) | 2009-12-07 | 2018-05-03 | 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 | 항-종양 항체 치료를 향상시키는 방법 |
SI2516469T1 (sl) | 2009-12-22 | 2016-05-31 | Roche Glycart Ag | Protitelesa proti her3 in uporabe le-teh |
AR094403A1 (es) | 2013-01-11 | 2015-07-29 | Hoffmann La Roche | Terapia de combinación de anticuerpos anti-her3 |
AU2015380455A1 (en) | 2015-01-26 | 2017-08-03 | Macrogenics, Inc. | Multivalent molecules comprising DR5-binding domains |
US20180206726A1 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-26 | Progenity Inc. | Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems |
US20210138213A1 (en) | 2017-03-30 | 2021-05-13 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device |
US20230041197A1 (en) | 2018-06-20 | 2023-02-09 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator |
WO2019246317A1 (en) | 2018-06-20 | 2019-12-26 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm |
WO2020106704A2 (en) | 2018-11-19 | 2020-05-28 | Progenity, Inc. | Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract |
WO2021119482A1 (en) | 2019-12-13 | 2021-06-17 | Progenity, Inc. | Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5871996A (en) * | 1994-02-04 | 1999-02-16 | Bio Merieux | Retrovirus agents MSRV1 and MSRV2 associated with multiple sclerosis |
IL85035A0 (en) * | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
US5736137A (en) * | 1992-11-13 | 1998-04-07 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
JP4435304B2 (ja) * | 1995-06-29 | 2010-03-17 | イミュネックス・コーポレーション | アポトーシスを誘導するサイトカイン |
US6030945A (en) * | 1996-01-09 | 2000-02-29 | Genentech, Inc. | Apo-2 ligand |
US6998116B1 (en) * | 1996-01-09 | 2006-02-14 | Genentech, Inc. | Apo-2 ligand |
PT1012274E (pt) * | 1997-01-28 | 2007-08-14 | Craig A Rosen | Receptor 4 contendo um domínio de morte (dm4; receptor de morte 4), membro da super-família do ftn e ligação a liart (ap02) |
US6433147B1 (en) * | 1997-01-28 | 2002-08-13 | Human Genome Sciences, Inc. | Death domain containing receptor-4 |
US6072047A (en) * | 1997-02-13 | 2000-06-06 | Immunex Corporation | Receptor that binds trail |
US20020160446A1 (en) * | 2000-11-14 | 2002-10-31 | Holtzman Douglas A. | Novel genes encoding proteins having prognostic diagnostic preventive therapeutic and other uses |
US20010010924A1 (en) * | 1997-03-14 | 2001-08-02 | Keith Charles Deen | Tumor necrosis factor related receptor, tr6 polynecleotides |
US6313269B1 (en) * | 1997-03-14 | 2001-11-06 | Smithkline Beecham Corporation | Tumor necrosis factor related receptor, TR6 |
US6872568B1 (en) * | 1997-03-17 | 2005-03-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Death domain containing receptor 5 antibodies |
CN1184315C (zh) * | 1997-03-17 | 2005-01-12 | 人类基因组科学公司 | 包含死亡结构域的受体-5 |
AU7126498A (en) * | 1997-04-16 | 1998-11-11 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Tumor necrosis factor receptor related proteins tango-63d and tango-63e |
US6342369B1 (en) * | 1997-05-15 | 2002-01-29 | Genentech, Inc. | Apo-2-receptor |
IL137176A0 (en) * | 1998-01-26 | 2001-07-24 | Genentech Inc | Antibodies to 4dr and uses thereof |
US6252050B1 (en) * | 1998-06-12 | 2001-06-26 | Genentech, Inc. | Method for making monoclonal antibodies and cross-reactive antibodies obtainable by the method |
EP1401476A4 (en) * | 2001-03-14 | 2006-03-08 | Genentech Inc | IGF ANTAGONIST PEPTIDES |
CA2465314C (en) * | 2001-11-01 | 2013-12-10 | The Uab Research Foundation | Combinations of antibodies selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and other therapeutic agents |
-
2005
- 2005-09-07 CN CNA2005800364755A patent/CN101048428A/zh active Pending
- 2005-09-07 CA CA002577828A patent/CA2577828A1/en not_active Abandoned
- 2005-09-07 RU RU2007112952/13A patent/RU2007112952A/ru not_active Application Discontinuation
- 2005-09-07 KR KR1020077005375A patent/KR20070050951A/ko not_active Application Discontinuation
- 2005-09-07 JP JP2007531333A patent/JP2008512479A/ja active Pending
- 2005-09-07 NZ NZ553171A patent/NZ553171A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-09-07 AU AU2005282397A patent/AU2005282397A1/en not_active Abandoned
- 2005-09-07 BR BRPI0515604-1A patent/BRPI0515604A/pt not_active IP Right Cessation
- 2005-09-07 WO PCT/US2005/032015 patent/WO2006029275A2/en active Application Filing
- 2005-09-07 EP EP05795474A patent/EP1802660A2/en not_active Withdrawn
- 2005-09-07 US US11/662,315 patent/US20090175854A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-10-03 US US11/542,330 patent/US20070231324A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-02-13 IL IL181315A patent/IL181315A0/en unknown
- 2007-04-04 NO NO20071789A patent/NO20071789L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2577828A1 (en) | 2006-03-16 |
WO2006029275A3 (en) | 2006-07-27 |
JP2008512479A (ja) | 2008-04-24 |
IL181315A0 (en) | 2007-07-04 |
NZ553171A (en) | 2010-03-26 |
US20070231324A1 (en) | 2007-10-04 |
KR20070050951A (ko) | 2007-05-16 |
BRPI0515604A (pt) | 2008-07-29 |
EP1802660A2 (en) | 2007-07-04 |
NO20071789L (no) | 2007-06-05 |
RU2007112952A (ru) | 2008-10-20 |
WO2006029275A2 (en) | 2006-03-16 |
US20090175854A1 (en) | 2009-07-09 |
AU2005282397A1 (en) | 2006-03-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101048428A (zh) | 利用死亡受体配体和cd20抗体的方法 | |
JP2008513367A (ja) | デスレセプターリガンド及びcd20抗体の使用方法 | |
CN1692127A (zh) | Taci抗体及其用途 | |
CN101014623A (zh) | Dr5抗体及其用途 | |
CN1464908A (zh) | 多价抗体及其应用 | |
MX2007002856A (es) | Metodos para el uso de ligandos receptores de muerte y anticuerpos c20. | |
CN1860367A (zh) | 人抗cd20抗体的测定法及其用途 | |
CN1599754A (zh) | 抗trail-r抗体 | |
CN1993143A (zh) | 用于治疗多发性硬化的方法 | |
CN1636067A (zh) | TACls和BR3多肽及其用途 | |
US20060188498A1 (en) | Methods of using death receptor agonists and EGFR inhibitors | |
CN1446104A (zh) | 利用b细胞排除抗体和免疫调制抗体联合治疗b细胞恶性肿瘤的相关应用 | |
CN1568198A (zh) | 免疫调节抗体在治疗肿瘤性疾病中的用途 | |
CN1802176A (zh) | 治疗对tnf-alpha抑制剂应答不充分的患者中的自身免疫病 | |
CN1441677A (zh) | 抗细胞因子抗体或拮抗剂与抗-cd20在b细胞淋巴瘤治疗中的联合应用 | |
CN1961003A (zh) | 人源化抗TGF-β抗体 | |
CN1905897A (zh) | 拮抗性抗-cd40单克隆抗体和它们的使用方法 | |
CN101056655A (zh) | 治疗cd30阳性淋巴瘤的方法 | |
KR20150031459A (ko) | Tweak 및 fn14 활성을 조절하는 방법 및 조성물 | |
CN1929862A (zh) | 拮抗性抗-cd40单克隆抗体治疗慢性淋巴细胞性白血病的应用 | |
CN1918181A (zh) | 移植排斥中cd20的检测 | |
CN1917901A (zh) | 自身免疫病疗法中cd20的检测 | |
US20120189573A1 (en) | Methods of using death receptor agonists and EGFR inhibitors | |
CN101048424A (zh) | 利用死亡受体配体和cd20抗体的方法 | |
CN1835972A (zh) | B细胞疾病的联合治疗 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20071003 |