CN101014623A - Dr5抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了特异性结合DR5受体的抗体。抗DR5抗体可选择地含有用噬菌体展示技术鉴定的CDR序列。DR5抗体可用于例如期望调节Apo-2L和/或Apo-2L受体的生物学活性的方法中,包括癌症和免疫相关疾患。
Description
相关申请
根据第119条,本申请要求享有2004年4月6日提交的临时申请60/559,928的优先权,在此引入其内容作为参考。
发明领域
本发明涉及结合DR5受体的抗体。这类抗体可用于例如期望调节Apo-2L和/或Apo-2L受体的生物学活性的方法中。
发明背景
多种分子已经鉴定为细胞因子中的肿瘤坏死因子(“TNF”)家族的成员,诸如肿瘤坏死因子-α(“TNF-α”)、肿瘤坏死因子-β(“TNF-β”或“淋巴毒素-α”)、淋巴毒素-β(“LT-β”)、CD30配体、CD27配体、CD40配体、OX-40配体、4-1BB配体、Apo-1配体(也称作Fas配体或CD95配体)、Apo-2配体(也称作Apo2L或TRAIL)、Apo-3配体(也称作TWEAK)、APRIL、OPG配体(也称作RANK配体、ODF或TRANCE)和TALL-1(也称作BlyS、BAFF或THANK)(参见例如Gruss和Dower,
Blood,
85:3378-3404(1995);Schmid等人,
Proc.Natl.Acad.Sci.,
83:1881(1986);Dealtry等人,
Eur.J. Immunol.,
17:689(1987);Pitti等人,
J.Biol.Chem.,
271:12687-12690(1996);Wiley等人,
Immunity,
3:673-682(1995);Browning等人,
Cell,72:847-856(1993);Armitage等人,
Nature,
357:80-82(1992);1997年1月16日公开的WO 97/01633;1997年7月17日公开的WO 97/25428;Marsters等人,
Curr.Biol.,
8:525-528(1998);Chicheportiche等人,
Biol. Chem.,
272:32401-32410(1997);Hahne等人,
J.Exp.Med.,
188:1185-1190(1998);1998年7月2日公开的WO 98/28426;1998年10月22日公开的WO 98/46751;1998年5月7日公开的WO 98/18921;Moore等人,
Science,285:260-263(1999);Shu等人,
J.Leukocyte Biol.,
65:680(1999);Schneider等人,
J.Exp.Med.,
189:1747-1756(1999);Mukhopadhyay等人,
J.Biol. Chem.,
274:15978-15981(1999))。在这些分子中,TNF-α、TNF-β、CD30配体、4-1BB配体、Apo-1配体、Apo-2配体(Apo2L/TRAIL)和Apo-3配体(TWEAK)已有报道与凋亡性细胞死亡有关。
数年前,Apo2L/TRAIL被鉴定为细胞因子中的TNF家族的成员(参见例如Wiley等人,
Immunity,
3:673-682(1995);Piti等人,
J.Biol.Chem.,271:12687-12690(1996))。全长的人Apo2L/TRAIL多肽是281个氨基酸的II型跨膜蛋白。一些细胞能够通过酶促切割多肽的胞外区来生成天然的可溶形式的多肽(Mariani等人,
J.Cell.Biol.,
137:221-229(1997))。对可溶形式的Apo2L/TRAIL的晶体学研究揭示了与TNF和其它相关蛋白质的结构相类似的同三聚体结构(Hymowitz等人,
Molec.Cell,
4:563-571(1999);Hymowitz等人,
Biochemistry,
39:633-644(2000))。但是,与其它TNF家族成员不同的是,发现Apo2L/TRAIL具有独特的结构特征,其三个半胱氨酸残基(同三聚体中各个亚基的第230位)一起与锌原子配位,且锌原子结合对于三聚体稳定性和生物学活性来说是重要的(Hymowitz等人,
同 上文;Bodmer等人,
J.Biol.Chem.,
275:20632-20637(2000))。
文献中已有报道,Apo2L/TRAIL可能在免疫系统的调节中,包括自体免疫疾病诸如类风湿性关节炎,及在HIV的治疗中起作用(参见例如Thomas等人,
J.Immunol.,
161:2195-2200(1998);Johnsen等人,
Cytokine,
11:664-672(1999);Griffith等人,
J.Exp.Med.,
189:1343-1353(1999);Song等人,
J.Exp.Med.,
191:1095-1103(2000);Jeremias等人,
Eur.J.Immunol.,28:143-152(1998);Katsikis等人,
J.Exp.Med.,
186:1365-1372(1997);Miura等人,
J.Exp.Med.,
193:651-660(2001))。
还有报道,可溶形式的Apo2L/TRAIL在体外诱导多种癌细胞凋亡,包括结肠、肺、乳房、前列腺、膀胱、肾、卵巢和脑的肿瘤,以及黑素瘤、白血病和多发性骨髓瘤(参见例如Wiley等人,
同上文;Pitti等人,
同上文;Rieger等人,
FEBS Letters,
427:124-128(1998);Ashkenazi等人,
J.Clin. Invest.,
104:155-162(1999);Walczak等人,
Nature Med.,
5:157-163(1999);Keane等人,
Cancer Research,
59:734-741(1999);Mizutani等人,
Clin.Cancer Res.,
5:2605-2612(1999);Gazitt,
Leukemia,
13:1817-1824(1999);Yu等人,
Cancer Res.,
60:2384-2389(2000);Chinnaiyan等人,
Proc.Natl. Acad.Sci.,
97:1754-1759(2000))。鼠肿瘤模型的体内研究还表明,单独使用Apo2L/TRAIL或者与化疗或放疗结合能够发挥实质性的抗肿瘤作用(参见例如Ashkenazi等人,
同上文;Walzcak等人,
同上文;Gliniak等人,Cancer Res.,
59:6153-6158(1999);Chinnaiyan等人,
同上文;Roth等人,Biochem.Biophys.Res.Comm.,
265:1999(1999))。与许多类型的癌细胞相反,大多数正常的人细胞类型表现出对某些重组形式Apo2L/TRAIL诱导凋亡具有抵抗性(Ashkenazi等人,
同上文;Walzcak等人,
同上文)。Jo等人已经报道,多聚组氨酸标记的可溶形式的Apo2L/TRAIL在体外诱导分离的正常人肝细胞凋亡,非人源的则不然(Jo等人,
Nature Med.,
6:564-567(2000);还可参见Nagata,
Nature Med.,
6:502-503(2000))。认为,某些重组Apo2L/TRAIL制备物对患病细胞与正常细胞相比在生物化学特性和生物学活性方面可能是不同的,这取决于例如标签分子(tag molecule)的存在与否、锌含量和三聚体的百分比含量(参见Lawrence等人,
Nature Med.,Letter to the Editor,
7:383-385(2001);Qin等人,
Nature,Med.,
Letter to the Editor,
7:385-386(2001))。
认为,由这类TNF家族细胞因子介导的各种细胞应答的诱导是由它们结合特异的细胞受体启动的。先前鉴定了约55kDa(TNFR1)和75kDa(TNFR2)的两种截然不同的TNF受体(Hohman等人,
J.Biol.Chem.,
264:14927-14934(1989);Brockhaus等人,
Proc.Natl.Acad.Sci.,
87:3127-3131(1990);1991年3月20日公开的EP 417,563;Loetscher等人,
Cell,
61:351(1990);Schall等人,
Cell,
61:361(1990);Smith等人,
Science,248:1019-1023(1990);Lewis等人,
Proc.Natl.Acad.Sci.,
88:2830-2834(1991);Goodwin等人,
Mol.Cell.Biol.,
11:3020-3026(1991))。发现那些TNFR共有典型的细胞表面受体结构,包括胞外区、跨膜区和胞内区。自然地,发现这两种受体的胞外部分也是可溶性TNF结合蛋白(Nophar,Y.等人,
EMBO J.,
9:3269(1990);Kohno,T.等人,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87:8331(1990);Hale等人,
J.Cell.Biochem. 增刊15F,1991,第113页(P424))。
1型和2型TNFR(TNFR1和TNFR2)的胞外部分含有4个富含半胱氨酸结构域(CRD)的重复氨基酸序列模式,从NH2末端开始,称作1-4(Schall等人,
同上文;Loetscher等人,
同上文;Smith等人,
同上文;Nophar等人,
同上文;Kohno等人,
同上文;Banner等人,
Cell,
73:431-435(1993))。类似的CRD重复模式存在于几种其它细胞表面蛋白中,包括p75神经生长因子受体(NGFR)(Johnson等人,
Cell,
47:545(1986);Radeke等人,Nature,
325:593(1987))、B细胞抗原CD40(Stamenkovic等人,
EMBO J.,
8:1403(1989))、T细胞抗原OX40(Mallet等人,
EMBO J.,
9:1063(1990))和Fas抗原(Yonehara等人,
同上文及Itoh等人,
Cell,
66:233-243(1991))。CRD还发现于Shope和粘液瘤痘病毒的可溶性TNFR(sTNFR)样T2蛋白中(Upton等人,
Virology,
160:20-29(1987);Smith等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,
176:335(1991);Upton等人,
Virology,184:370(1991))。这些序列的最佳排列表明半胱氨酸残基的位置非常保守。这些受体有时集体称作TNF/NGF受体超家族的成员。
除了淋巴毒素-β之外,迄今鉴定的TNF家族配体通常为II型跨膜蛋白,其C-末端位于细胞外。相反,至今鉴定的TNF受体(TNFR)家族的大多数受体通常为I型跨膜蛋白。然而,在TNF配体和受体两个家族中,发现家族成员间鉴定的同源性主要存在于胞外域(“ECD”)中。几种TNF家族细胞因子,包括TNF-α、Apo-1配体和CD40配体,在细胞表面受到蛋白水解切割;在各种情形下生成的蛋白质通常形成同三聚体分子,作为可溶性细胞因子起作用。TNF受体家族蛋白质通常也受到蛋白水解切割来释放可溶性受体ECD,能作为同源细胞因子的抑制剂起作用。
Pan等人揭示了另一种TNF受体家族成员,称作“DR4”(Pan等人,Science,
276:111-113(1997);还可参见1998年7月30日公开的WO98/32856;1999年7月29日公开的WO 99/37684;2000年12月7日公开的WO 00/73349;2002年8月13日公布的US 6,433,147;2002年10月8日公布的US 6,461,823;及2002年1月29日公布的US 6,342,383)。DR4报道含有胞质死亡结构域,它能引入细胞自杀机制。Pan等人揭示,认为DR4是称为Apo2L/TRAIL的配体的受体。
在Sheridan等人,
Science,
277:818-821(1997)和Pan等人,
Science,277:815-818(1997)中描述了认为是Apo2L/TRAIL的受体的另一种分子(还可参见1998年11月19日公开的WO 98/51793;1998年9月24日公开的WO 98/41629)。该分子称作DR5(也可选择性地称作Apo-2、TRAIL-R、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2或KILLER(参见例如Screaton等人,Curr.Biol.,
7:693-696(1997);Walczak等人,
EMBO J.,
16:5386-5387(1997);Wu等人,
Nature Genetics,
17:141-143(1997);1998年8月20日公开的WO 98/35986;1998年10月14日公开的EP 870,827;1998年10月22日公开的WO 98/46643;1999年1月21日公开的WO 99/02653;1999年2月25日公开的WO 99/09165;1999年3月11日公开的WO 99/11791;2002年8月13日公开的US 2002/0072091;2001年12月7日公开的US2002/0098550;2001年12月6日公布的US 6,313,269;2001年8月2日公开的US 2001/0010924;2003年7月3日公开的US 2003/01255540;2002年10月31日公开的US 2002/0160446;2002年4月25日公开的US2002/0048785;2003年5月27日公布的US 6,569,642;2000年6月6日公布的US 6,072,047;2003年11月4日公布的US 6,642,358)。与DR4一样,报道DR5含有胞质死亡结构域且能够发出信号诱导凋亡。Hymowitz等人,Molecular Cell,
4:563-571(1999)中描述了Apo-2L/TRAIL和DR5之间形成的复合物的晶体结构。
还有一组最近鉴定的受体称作“诱捕受体”(decoy receptors),认为其作为信号传导的抑制物而非转导物起作用。该组包括DCR1(也称作TRID、LIT或TRAIL-R3)(Pan等人,
Science,
276:111-113(1997);Sheridan等人,
Science,
277:818-821(1997);McFarlane等人,
J.Biol.Chem.,
272:25417-25420(1997);Schneider等人,
FEBS Letters,
416:329-334(1997);Degli-Esposti等人,
J.Exp.Med.,
186:1165-1170(1997);及Mongkolsapaya等人,
J.Immunol.,
160:3-6(1998))和DCR2(也称作TRUNDD或TRAIL-R4)(Marsters等人,
Curr.Biol.,
7:1003-1006(1997);Pan等人,
FEBS Letters,424:41-45(1998);Degli-Esposti等人,
Immunity,
7:813-820(1997)),二者都是细胞表面分子,以及OPG(Simonet等人,
同上文;Emery等人,见下文)和DCR3(Pitti等人,
Nature,
396:699-703(1998)),二者都是分泌的、可溶性蛋白质。有报道,Apo2L/TRAIL结合那些称作DcR1、DcR2和OPG的受体。
认为,Apo2L/TRAIL通过细胞表面“死亡受体”DR4和DR5激活胱天蛋白酶或执行细胞死亡程序的酶来起作用。在配体结合后,DR4和DR5都能通过称作FADD/Mortl的含死亡结构域的连接物分子,募集和激活凋亡起始物胱天蛋白酶-8,独立引发凋亡(Kischkel等人,
Immunity,
12:611-620(2000);Sprick等人,
Immunity,
12:599-609(2000);Bodmer等人,
Nature Cell Biol.,
2:241-243(2000))。与DR4和DR5相反,DcR1和DcR2受体不发出信号诱导凋亡。
关于细胞因子的TNF家族及其受体的综述参见Ashkenazi和Dixit,Science,
281:1305-1308(1998);Ashkenazi和Dixit,
Curr. Opin.Cell Biol.,11:255-260(2000);Golstein,
Curr.Biol.,
7:750-753(1997);Gruss和Dower,
同上文;Nagata,
Cell,
88:355-365(1997);Locksley等人,
Cell,104:487-501(2001);Wallach,“TNF Ligand and TNF/NGF Receptor Families”,Cytokine Reference,Academic Press,2000,第377-411页。
发明概述
本发明提供了结合DR5受体的抗体。可选择地,该抗体为单体、二聚体、三聚体、四聚体或者更高级的寡聚物形式。可选择地,该抗体是嵌合分子或者融合蛋白,包括与促进寡聚复合物形成的异源肽序列融合的抗体。在一个实施方案中,该抗体抑制Apo-2L与DR5受体的相互作用。可选择地,该抗体是至少一种Apo-2L相关生物学活性的激动剂,例如通过DR5受体诱导凋亡。
在某些实施方案中,抗DR5抗体包含图6、7或8中作为CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3提供的一种或多种氨基酸残基或序列。可选择地,抗DR5抗体包含与图6、7或8中称作CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3的那些序列具有至少80%同一性的一种或多种氨基酸序列。在另一些实施方案中,抗DR5抗体可包含与图6、7或8中称作CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3的那些序列具有至少90%或至少95%同一性的一种或多种氨基酸序列。可选择地,正如BIAcore结合测定法的测量(诸如下文实施例中所公开的),本发明的DR5抗体在约0.1nM到约20mM的浓度范围内结合DR5受体。可选择地,正如BIAcore结合测定法的测量(诸如下文实施例中所公开的),本发明的DR5抗体展现约0.6nM到约18mM的Ic50值。
本发明的相关实施方案包括编码包含一种或多种这类氨基酸序列的抗体的核酸分子。本发明的另一些实施方案包括包含编码这类抗体的核酸分子的载体以及包含这些载体的宿主细胞(如大肠杆菌)。本发明的其它实施方案包括制备DR5受体抗体的方法,包括如下步骤:(a)提供具有如下载体的宿主细胞,该载体包含编码本发明抗体的核酸序列;(b)提供培养基;(c)在足以表达该抗体的条件下在所述培养基中培养所述宿主细胞;(d)从宿主细胞或培养基回收抗体;并(e)纯化该抗体。
本发明的DR5受体抗体可以用本领域知晓的极其多种方法之一修饰。在本发明的优选实施方案中,本发明的抗体与异源分子或多肽序列相连。可选择地,异源多肽序列是亮氨酸拉链结构域。可选择地,该异源序列包含氨基酸序列甘氨酸-甘氨酸-甲硫氨酸。可选择地,该抗体可与一种或多种接头分子或多羟基化合物基团(polyol groups)偶联或连接。
在本发明的某些实施方案中,该抗体阻断或抑制Apo-2L和DR5之间的相互作用。可选择地,该抗体在一种或多种哺乳动物细胞中诱导凋亡。
在此还提供了在载体中包含至少一种上述抗体的组合物。优选地,该组合物是无菌的。此外,本发明提供了用于制备上述组合物的方法。在特别期望的实施方案中,所得组合物是药学上可接受的制剂。
还提供了编码在此描述的抗体的分离核酸,该核酸可用于如体内或离体基因疗法。
本发明的其它实施方案为调节哺乳动物细胞中Apo-2L和/或Apo-2L受体的生物学活性的方法。本发明的一个优选实施方案是在哺乳动物细胞中诱导凋亡的方法,包括将哺乳动物细胞暴露于有效量的在此描述的DR5受体抗体。哺乳动物细胞可以是如癌细胞。在还有一个方面,本发明提供了用于治疗哺乳动物中病症的方法,诸如癌症或免疫相关病症,包括可选择地通过注射或灌注,对哺乳动物施用有效量的本发明提供的DR5受体抗体。可选择地,所述病症为癌症,更具体地为乳房、肺、结肠(或结肠直肠)或神经胶质瘤的癌症。在此描述的抗体可以单独或者与另外的试剂联合施用。
在其它实施方案中,本发明提供了一种试剂盒,其包括装有在此描述的抗体的容器和使用该抗体的说明书;诸如用该抗体来治疗该抗体对其有效的病症。可选择地,该病症是癌症,更具体地为乳房、肺、结肠(结肠直肠)或神经胶质瘤的癌症。
本发明的还有一个实施方案是一种产品,其包括装有在此描述的抗体的容器和使用该抗体的印刷说明书。可选择地,所述容器是瓶、小瓶、注射器或试管。可选择地,该产品包括装有注射用水、盐水、Ringer氏溶液或右旋糖溶液的第二容器。
具体而言,提供了以权利要求形式列举的如下实施方案:
1.分离的抗DR5抗体,包含图6、7或8所列一种或多种氨基酸序列。
2.分离的抗DR5抗体,包含重链和轻链,其中所述重链包含可变区,该可变区包含图6、7或8所列一种或多种氨基酸序列。
3.权利要求2的抗体,其中所述重链和轻链通过柔性接头连接形成单链抗体。
4.权利要求3的抗体,其是单链Fv抗体。
5.权利要求2的抗体,其是Fab抗体。
6.权利要求2的抗体,其完全是人源的。
7.权利要求1或2的抗体,其特异性结合DR5受体而不结合DR4受体、DcR1受体或DcR2受体。
8.权利要求1或2的抗体,其在至少一类哺乳动物癌细胞中诱导凋亡。
9.权利要求1或2的抗体,其阻断或抑制Apo-2配体结合DR5受体。
10.一种组合物,其包含权利要求1-9任一项的抗体和载体。
11.治疗哺乳动物中病症的方法,包括施用权利要求10的组合物。
12.权利要求11的方法,其中所述病症是免疫相关病症。
13.权利要求11的方法,其中所述病症是癌症。
附图简介
图1显示了人Apo-2配体cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。核苷酸位置447上的“N”用于指示该核苷酸碱基可以是“T”或“G”。
图2A和2B显示了全长的人DR4的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。Pan等人,
Science,
276:111(1997)中也报道了人DR4的核苷酸序列和氨基酸序列。
图3A显示了1998年11月19日的WO 98/51793中所公开的人DR5的411个氨基酸的序列(SEQ ID NO:5)。人DR5的转录剪接变体是本领域已知的。这种DR5剪接变体编码图3B和3C中所示的人DR5的440个氨基酸的序列(SEQ ID NO:6),如1998年8月20的WO 98/35986中所公开的。
图4A-F显示了编码实施例1中提到的载体pS2072的多核苷酸序列(SEQ ID NO:7)。轻链和重链的各个CDR的编码序列标有下划线。
图5A-G显示了编码实施例3中提到的载体pV-0350-2的多核苷酸序列(SEQ ID NO:8)。轻链和重链的各个CDR的编码序列标有下划线。
图6A-C显示了为从scFv文库选得的各个克隆指派的I.D.(标识符)(实施例1)以及重链CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)的各个氨基酸序列(SEQ ID NO:9-77)。
图7显示了为从scFv文库选得的各个克隆指派的I.D.(标识符)(实施例2)以及重链CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)的各个氨基酸序列(SEQID NO:78-110)。
图8显示了为从Fab文库选得的各个克隆指派的I.D.(标识符)(实施例3)以及重链CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)的各个氨基酸序列(SEQID NO:111-115)。
图9图解了测试Fab抗体BdF2结合人DR5-ECD多肽的ELISA的结果。
图10显示了测试Apo2L和Fab抗体BdF2在体外诱导Colo205肿瘤细胞凋亡的能力的AlamarBlue生物测定的结果。
发明详述
A.定义
“TNF家族成员”以广义使用,指在结构或功能上与肿瘤坏死因子(TNF)共享一定相似性的各种多肽。与TNF家族多肽相关的某些结构和功能特征在本领域是已知的,并在例如上面的发明背景中有描述。这类多肽包括但不限于在本领域中称作TNF-α、TNF-β、CD40配体、CD30配体、CD27配体、OX-40配体、4-1BB配体、Apo-1配体(也称作Fas配体或CD95配体)、Apo-2L/TRAIL(也称作TRAIL)、Apo-3配体(也称作TWEAK)、APRIL、OPG配体(也称作RANK配体、ODF或TRANCE)、和TALL-1(也称作BlyS、BAFF或THANK)的那些(参见例如Gruss和Dower,Blood 1995,85:3378-3404;Pitti等人,J.Biol.Chem.1996,271:12687-12690;Wiley等人,Immunity 1995,3:673-682;Browning等人,Cell1993,72:847-856;Armitage等人,Nature 1992,357:80-82;PCT公开号WO 97/01633;和WO 97/25428;Marsters等人,Curr.Biol.1998,8:525-528;Chicheportiche等人,Biol.Chem.1997,272:32401-32410;Hahne等人,J.Exp.Med.1998,188:1185-1190;PCT公开号WO 98/28426;WO 98/46751;和WO 98/18921;Moore等人,Science 1999,285:260-263;Shu等人,J.Leukocyte Biol.1999,65:680;Schneider等人,J.Exp.Med.1999,189:1747-1756;Mukhopadhyay等人,J.Biol.Chem.1999,274:15978-15981)。
“DR5受体抗体”、“DR5抗体”或“抗DR5抗体”以广义使用,指结合至少一种形式的DR5受体的抗体。可选择地,DR5抗体与异源序列或分子融合或连接。优选地,异源序列容许或辅助抗体形成更高等级或寡聚复合物。可选择地,DR5抗体结合DR5受体但不结合任何其它Apo-2L受体(例如DR4、DcR1或DcR2)或者不与其发生交叉反应。可选择地,该抗体是DR5信号传导活性的激动剂。
可选择地,根据BIAcore结合分析(诸如例如下面的实施例中所公开的)的测量,本发明的DR5抗体在约0.1nM到约20mM的浓度范围内结合DR5受体。可选择地,根据BIAcore结合分析(诸如例如下面的实施例中所公开的)的测量,本发明的DR5抗体展示约0.6nM到约18mM的Ic50值。
术语“Apo2L/TRAIL”、“Apo-2L”和“TRAIL”在此用于指包含图1所示氨基酸序列的氨基酸残基114-281(含)、残基95-281(含)、残基92-281(含)、残基91-281(含)、残基41-281(含)、残基15-281(含)或残基1-281(含)的多肽序列,以及上述序列的生物学活性片段、删除、插入或替代变体。在一个实施方案中,多肽序列包含图1的残基114-281,且可选择地,由图1的残基114-281组成。可选择地,多肽序列包括图1的残基92-281或残基91-281。Apo-2L多肽可以由图1所示天然核苷酸序列所编码。可选择地,编码图1残基Pro119的密码子可以是“CCT”或“CCG”。在其它实施方案中,片段或变体具有生物学活性,且与任一上述Apo2L/TRAIL序列具有至少80%氨基酸序列同一性,更优选至少约90%序列同一性,甚至更优选至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。可选择地,Apo2L/TRAIL多肽由在严格条件下与图1中所提供的编码多核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码。该定义涵盖Apo2L/TRAIL的替代变体,其中其至少一个天然氨基酸用丙氨酸残基替代。具体的Apo2L/TRAIL替代变体包括其中至少一个氨基酸用丙氨酸残基替代的那些。这些替代变体包括鉴定为例如“D203A”、“D218A”和“D269A”的那些。此命名法用于鉴别Apo2L/TRAIL变体,其中位置203、218和/或269(采用图1所示的编号)上的天冬氨酸残基用丙氨酸残基替代。可选择地,Apo2L变体可包含已公开的PCT申请WO 01/00832的表I中描述的一个或多个丙氨酸替代。替代变体包含2001年1月4日公开的WO 01/00832的表I中鉴定的一个或多个残基替代。该定义还涵盖从Apo2L/TRAIL来源分离的或者通过重组或合成方法制备的天然序列Apo2L/TRAIL。本发明的Apo2L/TRAIL包括在PCT公开号WO 97/01633和WO 97/25428中揭示的称作Apo2L/TRAIL或TRAIL的多肽。术语“Apo2L/TRAIL”或“Apo2L”一般用于指Apo2L/TRAIL的形式,包括多肽的单体、二聚体或三聚体形式。除非特别指出,Apo2L序列中提及的所有氨基酸残基编号采用按照图1的编号。例如,“D203”或“Asp203”指在图1提供的序列中位置203上的天冬氨酸残基。
术语“Apo2L/TRAIL胞外域”或“Apo2L/TRAIL ECD”指Apo2L/TRAIL的形式,基本上不含跨膜域和胞质域。通常,ECD具有少于1%的所述跨膜域和胞质域,且优选具有少于0.5%的所述结构域。应当理解,所鉴定的本发明多肽的任何跨膜域是按照本领域常规用来鉴定那种类型的疏水结构域的标准而鉴定的。跨膜域的精确边界可以变化,但最可能在最初鉴定的结构域的任一末端不超过约5个氨基酸。在优选的实施方案中,ECD由该多肽的可溶性胞外域序列组成,不含跨膜域和胞质或胞内域(且不与膜结合)。具体的Apo-2L/TRAIL胞外域序列公开在PCT公开号WO 97/01633和WO97/25428中。
术语“Apo2L/TRAIL单体”或“Apo2L单体”指Apo2L的胞外域的共价链。
术语“Apo2L/TRAIL二聚体”或“Apo2L二聚体”指通过二硫键以共价连接相连的两个Apo-2L单体。在此所用的术语包括游离存在的Apo2L二聚体和存在于Apo2L三聚体形式中的Apo2L二聚体(即与另一个、第三个Apo2L单体结合)。
术语“Apo2L/TRAIL三聚体”或“Apo2L三聚体”指非共价结合的三个Apo2L单体。
术语“Apo2L/TRAIL集合物(aggregate)”用于指自我结合的较高寡聚物形式的Apo2L/TRAIL,诸如Apo2L/TRAIL三聚体,其形成例如六聚体和九聚体形式的Apo2L/TRAIL。可以采用本领域知晓的方法和分析(并使用可购买到的材料),诸如天然大小排阻HPLC(“SEC”)、使用十二烷基硫酸钠的变性大小排阻(“SDS-SEC”)、反相HPLC和毛细管电泳,测定Apo2L/TRAIL单体、二聚体或三聚体(或其它集合物)的存在与数量。
“Apo-2配体受体”包括本领域称为“DR4”和“DR5”的受体,其多核苷酸和多肽序列分别示于图2和3。Pan等人描述了称作“DR4”的TNF受体家族成员(Pan等人,
Science,
276:111-113(1997);还可参见1998年7月30日公开的WO 98/32856;1999年7月29日公开的WO 99/37684;2000年12月7日公开的WO 00/73349;2002年8月13日公布的US 6,433,147;2002年10月8日公布的US 6,461,823;和2002年1月29日公布的US 6,342,383)。有报道,DR4受体含有胞质死亡结构域,它能启动使细胞自杀的装置。Pan等人揭示,认为DR4是称作Apo2L/TRAIL的配体的受体。Sheridan等人,Science,
277:818-821(1997)和Pan等人,
Science,
277:815-818(1997)描述了Apo2L/TRAIL的另一种受体。(还可参见1998年11月19日公开的WO 98/51793;1998年9月24日公开的WO 98/41629)。此受体称作DR5(该受体还选择性地称作Apo-2、TRAIL-R、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2或KILLER;Screaton等人,
Curr.Biol.,
7:693-696(1997);Walczak等人,EMBO J.,
16:5386-5387(1997);Wu等人,
Nature Genetics,
17:141-143(1997);1998年8月20日公开的WO 98/35986;1998年10月14日公开的EP 870,827;1998年10月22日公开的WO 98/46643;1999年1月21日公开的WO 99/02653;1999年2月25日公开的WO 99/09165;1999年3月11日公开的WO 99/11791;2002年8月13日公开的US 2002/0072091;2001年12月7日公开的US 2002/0098550;2001年12月6日公布的US 6,313,269;2001年8月2日公开的US 2001/0010924;2003年7月3日公开的US2003/01255540;2002年10月31日公开的US 2002/0160446;2002年4月25日公开的US 2002/0048785;2003年5月27日公布的US 6,569,642;2000年6月6日公布的US 6,072,047;2003年11月4日公布的US 6,642358)。与DR4一样,报道DR5含有胞质死亡结构域且能够发出信号诱导凋亡。如上所述,Apo-2L的其它受体包括DcR1、DcR2和OPG(参见Sheridan等人,同上文;Marsters等人,
同上文;和Simonet等人,
同上文)。在此所用时术语“Apo-2L受体”涵盖天然序列受体和受体变体。这些术语涵盖在多种哺乳动物中表达的Apo-2L受体,包括人。Apo-2L受体可以是内源表达的,如在多种人组织谱系中天然发生,或者可以是通过重组或合成方法表达的。“天然序列Apo-2L受体”包括与衍生自自然界的Apo-2L受体具有相同氨基酸序列的多肽。因此,天然序列Apo-2L受体可以具有来自任何哺乳动物的天然存在Apo-2L受体的氨基酸序列。这类天然序列Apo-2L受体可以从自然界分离,或者可以通过重组或合成手段生产。术语“天然序列Apo-2L受体”具体涵盖天然存在的截短或分泌形式的受体(例如含有例如胞外域序列的可溶形式)、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位基因变体。受体变体可以包括天然序列Apo-2L受体的片段或删除突变体。图3A显示了1998年11月19日的WO 98/51793中公开的人DR5的411个氨基酸的序列。人DR5的转录剪接变体在本领域是已知的。此DR5剪接变体编码图3B和3C所示人DR5的440个氨基酸的序列,如1998年8月20日的WO 98/35986中所公开的。下面的表9也提供了DR5和DR5融合蛋白的多肽序列。
术语“拮抗剂”以广义使用,包括在体外、原位或在体内部分或完全阻断、抑制或中和Apo2L/TRAIL、DR4或DR5的一种或多种生物学活性的任何分子。Apo2L/TRAIL、DR4或DR5的这类生物学活性的例子包括Apo2L/TRAIL结合DR4或DR5,诱导凋亡,以及文献中报道的其它活性。拮抗剂可以直接或间接方式起作用。例如,拮抗剂可以在体外、原位或在体内由于其直接结合DR4或DR5的结果起作用而部分或完全阻断、抑制或中和Apo2L/TRAIL的一种或多种生物学活性。拮抗剂还可以在体外、原位或在体内由于例如阻断或抑制另一种效应分子的结果间接起作用而部分或完全阻断、抑制或中和Apo2L/TRAIL、DR4或DR5的一种或多种生物学活性。拮抗剂分子可包括“双重”拮抗剂活性,其中该分子能够部分或完全阻断、抑制或中和Apo2L/TRAIL、DR4或DR5的生物学活性。
术语“激动剂”以广义使用,包括在体外、原位或在体内部分或完全增强、刺激或激活Apo2L/TRAIL、DR4或DRS的一种或多种生物学活性的任何分子。这类生物学活性的例子包括Apo2L/TRAIL结合DR4或DR5,凋亡,以及文献中报道的其它活性。激动剂可以直接或间接方式起作用。例如,激动剂可以在体外、原位或在体内由于其直接结合DR4或DR5从而引起受体活化或信号转导的结果起作用而部分或完全增强、刺激或激活DR4或DR5的一种或多种生物学活性。激动剂还可以在体外、原位或在体内由于例如刺激另一种效应分子继而引起DR4或DR5活化或信号转导的结果间接起作用而部分或完全增强、刺激或激活DR4或DR5的一种或多种生物学活性。设想激动剂可作为间接起作用来增强或提高DR4或DR5活化或活性的增强分子。例如,激动剂可以增强哺乳动物中内源Apo-2L的活性。这可通过例如预复合DR4或DR5或者通过稳定各自配体与DR4或DR5受体的复合物(诸如稳定Apo-2L与DR4或DR5之间形成的天然复合物)来完成。
术语“标记的(tagged)”用于此时指包含与“标签多肽(tag polypeptide)”融合的抗体或多肽的嵌合分子。该标记多肽具有足够残基以提供针对其可制备抗体的表位,或者提供一些其它功能,诸如寡聚化能力(例如具有亮氨酸拉链结构域的肽所产生的),但又足够短,使得其通常不干扰抗体或多肽的活性。标记多肽优选还是相当独特的(unique),使得标签特异性抗体基本上不与其它表位发生交叉作用。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基且通常在约8个到约50个氨基酸残基之间(优选在约10个到约20个残基之间)。
术语“二价金属离子”指具有两个正电荷的金属离子。二价金属离子的例子包括但不限于锌、钴、镍、镉、镁和锰。可采用的这类金属的具体形式包括盐形式(例如药学上可接受的盐形式),诸如氯化物、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐形式的上面提及的二价金属离子。可选择地,用于本发明的二价金属离子为锌,且优选盐形式、硫酸锌或氯化锌。
在用于描述在此公开的各种肽或蛋白质时,“分离的”指已经鉴定且与其天然环境的一种成分分开和/或回收的肽或蛋白质。其天然环境的杂质成分是通常会干扰该肽或蛋白质的诊断或治疗用途的物质,包括酶、激素和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中,肽或蛋白质将纯化至:(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度,(2)通过使用考马斯蓝或优选银染的非还原或还原条件下的SDS-PAGE达到同质,或(3)通过质谱或肽作图技术达到同质。既然其天然环境的至少一种成分不会存在,那么分离的材料包括重组细胞内的原位肽或蛋白质。然而,通常,分离的肽或蛋白质将通过至少一个纯化步骤来制备。
至于在此鉴定的序列的“氨基酸序列同一性百分率(%)”定义为根据需要在进行序列对比和导入缺口以获得最大序列同一性百分率后,且不将任何保守替代视为部分序列同一性时,候选序列中与参比序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为了测定氨基酸序列同一性百分率而进行的对比可以本领域技术范围内的、能够确定用于测量对比的合适参数的多种方式来实现,包括获得所比较全长序列的最大对比所需要的赋值算法。为此,可以采用序列比较计算机程序ALIGN-2来获得氨基酸同一性百分率,ALIGN-2由Genentech有限公司编写,源代码已经与用户文件一起以美国版权登记号TXU510087提交给美国版权局(华盛顿特区,20559)。公众可以通过Genentech有限公司(South San Francisco,CA)来获得ALIGN-2程序。ALIGN-2程序设定了所有的序列比较参数且不再改变。
杂交反应的“严格性”很容易由本领域普通技术人员确定,且通常根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。通常,较长的探针需要较高的温度以恰当退火,而较短的探针要求较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于解链温度以下的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同一性程度越高,可采用的相对温度也越高。结果,由此推断较高的相对温度将趋向于使反应条件更为严格,而较低的温度也就较不严格。对于杂交反应严格性的其它细节和解释,参见Ausubel等人,
Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience Publishers,(1995)。
在此定义的“高严格条件”如下确定:(1)使用低离子强度和高温进行洗涤;在50℃使用0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠;(2)在杂交过程中使用变性剂;在42℃使用含0.1%牛血清清蛋白的50%(v/v)甲酰胺/0.1%菲可/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/含750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠的pH6.5的50mM磷酸钠缓冲液;或(3)在42℃使用50%甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl,0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1%焦磷酸钠、5x Denhardt氏溶液、超声波处理的鲑鱼精DNA(50ug/ml)、0.1%SDS和10%硫酸右旋糖苷,在42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中和在55℃在50%甲酰胺中洗涤,接着在55℃用含EDTA的0.1x SSC进行高严格性洗涤。
“中等严格条件”可以如Sambrook等人,
Molecular Cloning:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Press,1989所述确定,包括在37℃在含:20%甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6),5x Denhardt氏溶液、10%硫酸右旋糖苷和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜,接着在约37-50℃在1x SSC中洗涤滤膜。熟练技术人员将认识到如何根据需要调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
术语“调控序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如,适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当一条核酸与另一条核酸序列处于功能性相互关系中时,则它是“可操作连接的”。例如,若前序列或分泌前导序列的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白,则它与多肽的DNA可操作连接;若启动子或增强子影响编码序列的转录,则它与该序列可操作连接;或者,若核糖体结合位点的位置促进翻译,则它与编码序列可操作连接。通常,“可操作连接”指DNA序列邻近相连,且在分泌前导序列的情况中指邻近且以读码状态相连。然而,增强子不必邻近。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接反应来完成。如果没有这些位点,那么使用与常规实践一致的合成寡核苷酸衔接头或接头。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应,其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体,随后促使靶细胞溶解。介导ADCC的初级细胞NK细胞只表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92,1991第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性,可进行体外ADCC分析,诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所描述的。可用于这类分析的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可在体内评估目的分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如Clynes等人,PNAS(USA)95:652-656,1998中所公开的。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应物功能的白细胞。优选地,该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应物功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞;优选PBMC和NK细胞。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外,优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体),包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体,包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括Fcγ则IA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”),它们具有相似的氨基酸序列,区别主要在于它们的胞质域。激活受体FcγRIIA在其胞质域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见Daёron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234,1997)。FcR的综述参见Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92,1991;Capel等人,Immunomethods4:25-34,1994;及de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41,1995。)术语“FcR”在此涵盖其它FcR,包括未来将会鉴定的那些。该术语还包括新生儿受体FcRn,它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587,1976和Kim等人,J.Immunol.24:249,1994)。FcR在此包括多态性,诸如编码FcγRIIIa的基因中导致氨基酸位置158或为苯丙氨酸(F)或为缬氨酸(V)的遗传二态性,该位置位于受体中结合IgG1的区域。已经证明,纯合的缬氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158V)相对于纯合的苯丙氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158F)或杂合的FcγRIIIa(FcγRIIIa-158F/V)受体,在体外对人IgG1具有较高的亲和力并介导升高的ADCC。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时分子溶解靶的能力。补体激活途径是由补体系统第一组分(Clq)结合与关联抗原复合的分子(如抗体)起始的。为了评估补体激活,可进行CDC分析,例如如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163,1996中所描述的。
术语“抗体”在此以最广义使用,具体覆盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(如双特异性抗体)、及抗体片段,只要它们展示所需生物学活性。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分,优选包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段;双抗体;线性抗体;单链抗体分子;及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“天然抗体”通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接,而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中有所变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变区(VH),接着是多个恒定区。每条轻链在一端具有一个可变区(VL),而另一端是一个恒定区;轻链的恒定区与重链的第一个恒定区排列在一起,而轻链的可变区与重链的可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。
术语“可变的”指可变区中的某些部分在不同抗体的序列中差异广泛且用于每种特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而,变异性并非均匀分布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区中称作高变区或互补决定区的三个区段。可变区中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区都包含四个FR,它们大多采取β-折叠构象,通过形成环状连接且在某些情况中形成β-折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起,并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等,《Sequencesof Proteins of Immunological Interest》,第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991)。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合,但展示多种效应物功能,诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段,称作“Fab”片段,各自具有一个抗原结合位点,和一个残余“Fc”片段,其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段,它具有两个抗原结合位点且仍能使抗原交联。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。正是在这种构造中,每个可变区的三个高变区相互作用而在VH-VL二聚体的表面上确定了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而,即使是单一可变区(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力,尽管亲和力低于完整的结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。在此Fab’-SH是其中恒定区的半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的,在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”,根据其恒定区的氨基酸序列,可归入两种截然不同类型中的一种,称作κ和λ。
根据其重链恒定区的氨基酸序列,可将抗体归入不同的类别。完整抗体有五种主要的类别:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些可进一步分为亚类(同种型),如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。将与不同抗体类别对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域,其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选地,该Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头,使得scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述参见Plückthun,《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,269-315,1994。
术语“双抗体(diabodies)”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段,该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对,迫使结构域与另一条链的互补结构域配对,并产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的描述于例如EP 404,097;WO 93/11161;和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448,1993。
术语“单克隆抗体”在用于此时指由基本上同质的抗体群获得的抗体,即构成群体的各个抗体相同,除了通常以极少量存在的可能的天然存在突变以外。单克隆抗体是高度特异的,即针对单一抗原位点。另外,与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品不同,每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性以外,单克隆抗体的优越性体现在可以通过杂交瘤培养合成它们而不受其它抗体的污染。修饰语“单克隆”指示抗体由基本上同质的抗体群获得的特征,并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如,依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler等人,Nature 256:495,1975描述的杂交瘤法来制备,或者可通过重组DNA法来制备(参见例如美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等人,Nature 352:624-628,1991和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597,1991中描述的技术由噬菌体抗体库分离。
在此的单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白),其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及这类抗体的片段,只要它们展示所需生物学活性(美国专利4,816,567;Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855,1984)。在此感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(如旧大陆猴类(Old World Monkey),诸如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变区抗原结合序列及人恒定区序列的“灵长类化(primatized)”抗体(美国专利5,693,780)。
非人源(如鼠源)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人源免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上,人源化抗体指人源免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替代的免疫球蛋白。在有些情况中,将人源免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人源残基替代。此外,人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常,人源化抗体将包含基本上不少于至少一个、通常两个如下可变区,其中所有或基本上所有的高变环对应于非人源免疫球蛋白的高变环,且所有或基本上所有的FR是人源免疫球蛋白序列的FR。任选的是,人源化抗体还将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人源免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等人,Nature 321:522-525,1986;Riechmann等人,Nature 332:323-329,1988;及Presta,Curr Op.Struct.Biol.2:593-596,1992。
术语“高变区”在用于此时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变区中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等人,《Sequences of Proteins ofImmunological Interest》,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991)和/或来自“高变环”的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变区中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917,1987)。“框架”或“FR”残基指在此定义的高变区残基以外的可变区残基。
“结合”目的抗原如DR5受体的抗体指能够以足够亲和力和/或亲合力结合抗原的抗体,使得该抗体可用作治疗剂或诊断剂,用于靶向表达该抗原的细胞。
为了本发明的目的,“免疫疗法”指用抗体处理哺乳动物(优选人类患者)的方法,其中抗体可以是未偶联的或“裸露的”抗体,或者抗体可以与异源分子或试剂偶联或融合,诸如一种或多种胞毒剂,从而产生“免疫偶联物”。
“分离的”抗体指已经鉴别并由其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的杂质成分指将会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质,可包括酶、激素和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中,将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定,抗体重量超过95%,最优选重量超过99%,(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度,或(3)通过使用考马斯蓝或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE达到同质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存在,那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而,通常,分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
表述“治疗有效量”指有效预防、改善或治疗所研究疾病或疾患的DR5抗体数量。
术语“细胞因子”指由一种细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。这类细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素,诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素;甲状旁腺素;甲状腺素;胰岛素;胰岛素原;松驰素;松驰素原;糖蛋白激素类,诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH);肝生长因子;成纤维细胞生长因子;促乳素;胎盘催乳激素;肿瘤坏死因子-α和-β;Mullerian氏抑制性物质;小鼠促性腺激素相关肽;抑制素;激活素;血管内皮生长因子;整联蛋白;血小板生成素(TPO);神经生长因子;血小板生长因子;转化生长因子(TGF),诸如TGF-α和TGF-β;胰岛素样生长因子-I和-II;促红细胞生成素(EPO);骨诱导因子;干扰素,诸如干扰素-α、-β和-γ;集落刺激因子(CSF),诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF);白介素(IL),诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-1 3、IL-17;及其它多肽因子,包括LIF和kit配体(KL)。在用于此时,术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物学活性等效物。
术语“胞毒剂”在用于此时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意欲包括放射性同位素(如I131、I125、Y90和Re186)、化疗剂、和毒素,诸如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素,或其片段。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂,诸如噻替哌(thiotepa)和环膦酰胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN);烷基磺酸酯,诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶类(aziridines),诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines),包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))、苔藓抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物);隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他丁(dolastatin);duocarmycin(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海绵抑素(spongistatin);氮芥(nitrogen mustards),诸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥;硝基脲类(nitrosureas),诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine);抗生素类,诸如烯二炔类(enediyne)抗生素(如加利车霉素(calicheamicin),尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素I1(参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186,1994));蒽环类(dynemicin)抗生素,包括dynemicin A;二碳磷酸盐(bisphosphonate),诸如氯膦酸盐(clodronate);埃斯波霉素(esperamicin);以及新抑癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(Adriamycin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素诸如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物,诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物,诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物,诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤;嘧啶类似物,诸如安西他滨(ancitabine、)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷;雄激素类,诸如卡鲁睾酮(calusterone)、羟甲雄酮丙酸酯、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺类,诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂,诸如亚叶酸;醋葡内酯;醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基酮戊酸(aminolevulinic acid);恩尿嘧啶(eniluracil);氨苯吖啶(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);defofamine;地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);依洛尼塞(elfornithine);醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate);epothilone;依托格鲁(etoglucid);硝酸镓;羟脲;香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登木素生物碱类(maytansinoids),诸如美登素(maytansine)和美坦西醇(ansamitocin));米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidamol);二胺硝吖啶(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼酸(podophyllinic acid);2-乙基酰肼;丙卡巴肼(procarbazine);PSK;雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲兰(sizofiran);锗螺胺(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone);2,2′,2″-三氯三乙胺;单端孢菌素类(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);达卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(“Ara-C”);环磷酰胺;塞替哌(thiotepa);类紫杉醇类(taxoids)),如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE,
-Poulenc Rorer,Antony,France);苯丁酸氮芥;吉西他滨(gemcitabine)(Gemzar);6-硫鸟嘌呤;巯基嘌呤;甲氨喋呤;铂类似物,诸如顺铂和卡铂;长春碱(vinblastine);铂;依托泊苷(etoposide)(VP-16);异磷酰胺;米托蒽醌;长春新碱(vincristine);长春瑞宾(vinorelbine)(Navelbine);诺安托(novantrone);替尼泊甙(teniposide);依达曲沙(edatrexate);柔红霉素;氨基蝶呤;希罗达(xeloda);伊拜膦酸盐(ibandronate);CPT-11;拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类维A酸,诸如视黄酸;卡培他滨(capecitabine);以及上述任何物质的制药学可接受的盐、酸或衍生物。该定义还包括承担调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂,诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂(SERM),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括Nolvadex)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FARESTONTM);抑制调节肾上腺中雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂,诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MegaseTM)、依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)(RivisorTM)、来曲唑(letrozole)(FemaraTM)和阿纳托唑(anastrozole)(ArimidexTM);及抗雄激素类,诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);以及上述任何物质的制药学可接受的盐、酸或衍生物。
“生长抑制剂”在用于此时指在体外或在体内抑制细胞,尤其是过表达在此鉴定的任何基因的癌细胞生长的化合物或组合物。因此,生长抑制剂可以是显著降低S期过表达这类基因的细胞百分比的试剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的试剂,诸如诱导G1停滞和M期停滞的试剂。经典的M期阻断剂包括长春花生物碱类(长春新碱和长春碱)、紫杉醇、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。那些阻滞G1的试剂也溢出进入S期停滞,例如DNA烷化剂诸如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、双氯乙基甲胺、顺铂、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。其它信息可参见Mendelsohn和Israel编的《The Molecular Basis of Cancer》中,Murakami等人著的第1章,题为“Cellcycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs”,W B Saunders,Philadelphia,1995,尤其是第13页。
“有生物学活性的”或“生物学活性”用于在此的目的时指(a)单独作为单一试剂或者与另一种试剂诸如化疗剂组合,具有在至少一类哺乳动物癌细胞或受病毒感染的细胞中,在体内或者离体诱导或刺激或抑制凋亡的能力,(b)能够结合和/或刺激DR5受体;或(c)具有天然或天然存在Apo2L/TRAIL多肽的有些活性。用于测定生物学活性的分析可以用本领域知晓的方法进行,诸如DNA片段化(参见例如Marsters等人,Curr.Biology,6:1669(1996))、胱天蛋白酶灭活、DR5结合(参见例如1998年11月19日公开的WO 98/51793)以及PCT公开号WO 97/01633、WO 97/25428、WO01/00832和WO 01/22987中描述的分析方法。
术语“凋亡”和“凋亡活性”以广义使用,指哺乳动物中有序或受控形式的细胞死亡,通常伴随着一种或多种特征性细胞变化,包括细胞质浓缩、质膜微绒毛丧失、细胞核节段化、染色体DNA降解或线粒体功能丧失。例如可以通过本领域知晓的细胞活力分析(例如Alamar蓝分析或MTT分析)、FACS分析、胱天蛋白酶活化、DNA片段化(参见例如Nicoletti等人,
J. Immunol.Methods,
139:271-279(1991)),以及多聚ADP核糖聚合酶、“PARP”、分裂分析来测定和测量这种活性。
如用于此,术语“紊乱”一般指将会从在此描述的组合物处理中获益的任何疾患,包括可用有效量的DR5抗体处理的任何疾病或紊乱。这包括慢性和急性病症,以及那些使哺乳动物趋向于所讨论紊乱的病理状况。待治疗紊乱的非限制性例子包括良性和恶性癌症;炎性、血管发生性和免疫学紊乱、自身免疫性紊乱、关节炎(包括类风湿性关节炎)、多发性硬化及HIV/AIDS。
术语“癌症”、“癌性”或“恶性”指或描述哺乳动物中通常特征在于细胞生长失调的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、白血病、母细胞瘤和肉瘤。这类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌(renal cancer)、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜瘤、肾癌(kidney cancer)、前列腺癌、甲状腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈癌。
术语“免疫相关疾病”指哺乳动物中哺乳动物免疫系统成分引起、介导、或以其它方式促成发病的疾病。还包括刺激或干预免疫应答对疾病发展具有改善作用的疾病。该术语包括自身免疫病、免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、传染病和免疫缺陷病。可依照本发明处理的免疫相关和炎性疾病的例子,其中有些是免疫或T细胞介导的,包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化病(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格伦氏综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯氏病、桥本氏甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化病、特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏综合征、和慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎、炎性和纤维化肺病诸如炎性肠病(溃疡性结肠炎:克罗恩氏病)、麸胶敏感性肠病、和惠普尔氏病、自身免疫性或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应和荨麻疹、肺的免疫学疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病。传染病包括AIDS(HIV感染)、甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎、细菌感染、真菌感染、原生动物感染和寄生虫感染。
“自身免疫病”在此以广泛的、一般的含义使用,指哺乳动物中因个别哺乳动物对其自身组织成分的体液或细胞免疫应答而发生破坏正常或健康组织的紊乱或疾患。例子包括但不限于红斑狼疮、甲状腺炎、类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化病、自身免疫性糖尿病和炎性肠病(IBD)。
术语“治疗”和“疗法”在用于此时指治疗性疗法、预防性疗法和防止性疗法。连续处理或施药指在至少一天基础上进行一天或数天而无间断的处理。间歇处理或施药,或间歇方式的处理或施药指不连续的处理,但是实质上是循环的。
术语“哺乳动物”在用于此时指归入哺乳类的任何哺乳动物,包括人、牛、马、犬和猫。在本发明的一个优选实施方案中,哺乳动物是人。
在本申请中,除非另外特别指出,单数的使用包括复数。
B.本发明的例示性材料和方法
在此描述的本发明涉及结合DR5受体的抗体。可选择地,该抗体是抑制Apo-2L与DR5相互作用的拮抗剂。可替代地,该抗体是DR5信号传导活性的激动剂。
在此描述了用于生成本发明DR5抗体的方法。用于生产或筛选抗体的抗原可以是如可溶形式的抗原或其含有期望表位的部分。可替代地,或者另外地,在细胞表面表达抗原的细胞可用于生成或筛选抗体。可用于生成抗体的其它形式的抗原对于本领域技术人员来说是显然的。
(i)多克隆抗体
多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能剂或衍生剂,例如马来酰亚胺苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N=C=NR,其中R和R1是不同的烃基,将相关抗原与在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的,如匙孔戚血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和,并将溶液皮内注射于多个部位,由此将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后,通过多个部位的皮下注射,用弗氏完全佐剂中肽或偶联物初始量的1/5-1/10对动物进行强化。7-14天后,采集动物的血液,并测定血清的抗体效价。对动物进行强化直到效价达到稳定。优选的是,将动物用相同抗原的但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行强化。偶联物还可在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备。此外,适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫反应。
(ii)单克隆抗体
单克隆抗体是由基本上同质的抗体群获得的,即构成群体的各个抗体相同,除了通常以极少量存在的可能的天然存在突变以外。如此,修饰语“单克隆”表示抗体的特征即不是分立的抗体的混合物。
例如,单克隆抗体可通过最初由Kohler等,Nature 256:495,1975描述的杂交瘤方法来制备,或者可通过重组DNA方法来制备(美国专利4,816,567)。
在杂交瘤方法中,如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物,诸如仓鼠,以引发生成或能够生成特异结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者,可在体外免疫淋巴细胞。然后,使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细胞(Goding,《MonoclonalAntibodies:Principles and Practice》,59-103,Academic Press,1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养,该培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如,如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT),那么杂交瘤培养基通常将含有阻止缺乏HGPRT的细胞生长的次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)。
优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持选择的抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的骨髓瘤细胞。在这些细胞中,优选的骨髓瘤细胞系是鼠源骨髓瘤系,诸如可从Salk Institute CellDistribution Center(San Diege,California USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的衍生系,及可从American Type Culture Collection(Manassas,Virginia USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。用于生成人源单克隆抗体的人源骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor,J.Immunol.133:3001,1984;Brodeur等人,《Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications》,51-63,Marcel Dekker Inc.,New York,1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是,通过免疫沉淀或通过体外结合测定法,诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA),测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等人,Anal.Biochem.107:220,1980的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后,该克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆,并使用标准方法进行培养(Goding,《Monoclonal Antibodies:Principles and Practice》,59-103,Academic Press,1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外,杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。
可通过常规免疫球蛋白纯化流程,诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析,将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分离。
编码单克隆抗体的DNA易于通过常规流程分离并测序(例如使用能够特异结合编码鼠源抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞用作这类DNA的优选来源。一旦分离,可将DNA置于表达载体中,然后将该表达载体转染到宿主细胞中,诸如不另外产生免疫球蛋白的大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞,以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性文章包括Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.5:256-262,1993和Plückthun,Immunol.Revs.130:151-188,1992。
在另一个实施方案中,可从使用McCafferty等人,Nature 348:552-554,1990中描述的技术构建的噬菌体抗体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等,Nature 352:624-628,1991和Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597,1991分别描述了使用噬菌体文库分离鼠源和人源抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks等,Bio/Technology 10:779-783,1992),以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等,Nuc.Acids.Res.21:2265-2266,1993),生成高亲和力(nM范围)的人源抗体。如此,这些技术是用于分离单克隆抗体的常规单克隆抗体杂交瘤技术的可行替换方法。下面的实施例部分更加详细地描述了用于鉴定本发明DR5抗体的其它噬菌体展示技术。
在某些实施方案中,可以将轻链和重链可变区的互补决定区(CDR)移植到来自相同或另一物种的框架区(FR)中。在某些实施方案中,可以将轻链和重链可变区的CDR移植到共有的人FR中。在某些实施方案中,为了产生共有的人FR,将来自多种人源重链或轻链氨基酸序列的FR进行比对以鉴定共有氨基酸序列。在某些实施方案中,所移植可变区可以与来源抗体的恒定区不同的恒定区一同使用。在某些实施方案中,所移植的可变区是单链Fv抗体的一部分。美国专利6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089和5,530,101中描述了CDR移植。
还可以修饰DNA,例如通过替代即用人源重链和轻链恒定区的编码序列代替同源鼠源序列(美国专利4,816,567;Morrison等,Proc.Natl Acad.Sci.USA 81:6851,1984),或通过共价接合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。
通常,用这类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定区,或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变区,以产生嵌合二价抗体,它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点及对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
(iii)人源化抗体
本领域已经描述了用于将非人源抗体人源化的方法。优选的是,人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人源氨基酸残基常常称作“输入”残基,它们通常取自“输入”可变区。人源化可本质上依照Winter及其同事的方法进行(Jones等,Nature 321:522-525,1986;Riechmann等,Nature 332:323-327,1988;Verhoeyen等,Science 239:1534-1536,1988),通过用高变区序列替代人源抗体的相应序列。因此,这类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567),其中基本上少于整个人源可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中,人源化抗体通常是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基所替代的人源抗体。
用于制备人源化抗体的人源可变区的选择,包括轻链和重链,对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最适(best-fit)”方法,用啮齿类抗体可变区序列对已知的人源可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人源序列作为人源化抗体的人源框架区(FR)(Sims等,J.Immunol.151:2296,1993;Chothia等,J.Mol.Biol.196:901,1987)。另一种方法使用由特定轻链或重链亚群的所有人源抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等,Proc.Natl.Acad Sci.USA 89:4285,1992;Presta等,J.Immunol.151:2623,1993)。
更为重要的是,抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力以及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的,依照一种优选的方法,通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。通常可获得三维免疫球蛋白模型,且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得图解和显示选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用,即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样,可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合,从而获得所需抗体特征,诸如对靶抗原的亲和力提高。通常,高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
(iv)人抗体
作为人源化的替代方法,可生成人源抗体。例如,现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况中能够在免疫后生成人源抗体完整全集的转基因动物(如小鼠)。例如,已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在这类种系突变小鼠中转移大量人源种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人源抗体。参见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551,1993;Jakobovits等,Nature 362:255-258,1993;Bruggermann等,Year in Immuno.7:33,1993;和美国专利5,591,669、5,589,369和5,545,807。
或者,噬菌体展示技术(McCafferty等,Nature 348:552-553,1990)可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因全集生成人源抗体和抗体片段。根据这一技术,将抗体V区基因克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因的读码框中,并在噬菌体颗粒表面展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝,以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码显示那些特性的抗体基因的选择。如此,噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行;有关综述参见例如Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,CurrentOpinion in Structural Biology 3:564-571,1993。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等,Nature 352:624-628,1991从衍生自免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。可本质上依照Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597,1991或Griffith等,EMBOJ.12:725-734,1993描述的技术,由未免疫人供体构建V基因全集,并分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利5,565,332和5,573,905。
(v)抗体片段
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上,通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等,Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24:107-117,1992和Brennan等,Science 229:81,1985)。然而,现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如,可从上文讨论的噬菌体抗体文库分离抗体片段。或者,可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段,并通过化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter等,Bio/Technology 10:163-167,1992)。依照另一种方法,可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练技术人员是显而易见的。在其它实施方案中,选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185;美国专利5,571,894;和美国专利5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”,例如美国专利5,641,870中描述的抗体。这类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)双特异性抗体
双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(如F(ab′)2双特异性抗体)。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生成是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达,其中两种链具有不同的特异性(Millstein等,Nature 305:537-539,1983)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配,这些杂交瘤(四源杂交瘤quadromas)生成10种不同抗体分子的潜在混合物,其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化非常麻烦,且产量低。WO93/08829和Traunecker等,EMBO J.10:3655-3659,1991中公开了类似的方法。
根据一种不同的方法,将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。优选的是,在至少一种融合物中具有包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物及,如果需要,免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体,并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中,这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而,在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率没有特别意义时,有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。
在本方法的一个优选实施方案中,双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链,和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径,因此发现这种不对称结构促进所需双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO94/04690。关于制备双特异性抗体的其它细节参见例如Suresh等,Methods inEnzymology 121:210,1986。
根据美国专利5,731,168中描述的另一种方法,可改造抗体分子对之间的界面,将从重组细胞培养物中回收的异型二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分CH3抗体恒定区。在该方法中,将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链,在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同型二聚体提高异型二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如,异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联,另一种抗体与生物素偶联。例如,这类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980),及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域所熟知的,且连同许多交联技术一起公开于美国专利4,676,980。
文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如,可使用化学键合制备双特异性抗体。Brennan等,Science 229:81,1985;Shalaby等人,J.Exp.Med.175:217-225,1992。
还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如,已使用亮氨酸拉链生产出双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol.148(5):1547-1553,1992。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同型二聚体在铰链区还原,形成单体,然后重新氧化,形成抗体异型二聚体。该方法还可用于生产抗体同型二聚体。由Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448,1993描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替换机制。该片段包含通过接头相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),该接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此,迫使一个片段上的VH和VL结构域不得不与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对,由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等,J.Immunol.152:5368,1994。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如,可制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60,1991。WO 01/77342(Miller和Presta)中描述了具有三个或更多抗原结合位点的抗体,在此明确引入作为参考。
任选将在此方法中所使用的或产品中所包含的抗体与胞毒剂偶联。
上文已经描述了可用于生成这类抗体-胞毒剂偶联物的化疗剂。
在此还设想了抗体与一种或多种小分子毒素形成的偶联物,诸如加利车霉素、美登素(美国专利5,208,020)、单端孢菌素和CC1065。在本发明的一个实施方案中,将抗体与一个和多个美登素分子偶联(如每个抗体分子偶联约1个至约10个美登素分子)。例如可将美登素转化为May-SS-Me,后者可还原为May-SH3并与经修饰抗体反应(Chari等,Cancer Research 52:127-131,1992)产生美登木素生物碱-抗体偶联物。
或者,将抗体与一个或多个加利车霉素分子偶联。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman等,Cancer Research 53:3336-3342,1993和Lode等,Cancer Research 58:2925-2928,1998)。
可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲毒素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(neomycin)和单端孢菌毒素类(tricothecenes)。参见例如1993年10月28日出版的WO 93/21232。
本发明还设想了与具有核酸水解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶;DNA酶)偶联的拮抗剂。
有多种放射性同位素可用于生成放射性偶联拮抗剂或抗体。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和胞毒剂的偶联物,诸如3-(2-吡啶基二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如盐酸二甲基己二酰亚胺酯、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如,可如Vitetta等,Science 238:1098,1987中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与拮抗剂或抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如,可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Research 52:127-131,1992)。
或者,可通过例如重组技术或肽合成法来制备包含抗体和胞毒剂的融合蛋白。
还可将本发明的抗体与前体药物活化酶偶联,后者将前体药物(如肽基化疗剂,参见WO 81/01145)转化为活性抗癌药。参见例如WO 88/07378和美国专利4,975,278。
这类偶联物的酶成分包括能够以这样一种方式作用于前体药物从而将其转化为更具有活性的细胞毒性形式的任何酶。
可用于本发明方法的酶包括但不限于可将含磷酸盐的前体药物转化为游离药物的碱性磷酸酶;可将含硫酸盐的前体药物转化为游离药物的芳基硫酸酯酶;可将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶;可将含肽的前体药物转化为游离药物的蛋白酶,诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L);可转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶;可将糖基化前体药物转化为游离药物的碳水化合物切割酶类,诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶;可将β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物的β-内酰胺酶;及可将在其氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转化为游离药物的青霉素酰胺酶,诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者,可使用具有酶活性的抗体,本领域也称作“抗体酶”,将本发明的前体药物转化为游离的活性药物(参见例如Massey,Nature 328:457-458,1987)。可如此处所述制备抗体-抗体酶偶联物,用于将抗体酶投递至肿瘤细胞群。
可通过本领域众所周知的技术将本发明的酶与抗体共价结合,诸如使用上文讨论的异双功能交联剂。或者,可使用本领域众所周知的重组DNA技术构建包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明抗体的至少抗原结合区的融合蛋白(参见例如Neuberger等,Nature 312:604-608,1984)。
在此还设想了抗体的其它修饰。例如,可将抗体与多种非蛋白质聚合物中的一种连接,如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
为了延长抗体的血清半衰期,可如例如美国专利5,739,277中所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于此处时,术语“补救受体结合表位”指IgG分子(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。或者/另外,可通过改变抗体Fc区的氨基酸序列,生成FcRn结合改变的变体,来延长或缩短血清半衰期。WO 00/42072(Presta,L.)中描述了FcRn结合和/或血清半衰期改变的抗体。
可通过聚合来稳定本发明的抗体。这可通过直接或间接地用多功能交联剂使单体链交联,经由多功能聚合物来实现。通常,用双功能交联剂使两个基本上相同的多肽在其C-或N-末端交联。该试剂用于使末端氨基和/或羧基交联。一般,使两个末端羧基或者两个末端氨基彼此交联,尽管通过选择合适的交联剂,将一条多肽的α氨基与另一条多肽的末端羧基交联。优选的是,用半胱氨酸替代该多肽的C-末端。在本领域众所周知的条件下,可在末端半胱氨酸之间形成二硫键,从而使多肽链交联。例如,通过金属催化的游离半胱氨酸的氧化,或者通过适当修饰的半胱氨酸残基的亲核替代,方便的形成二硫键。交联剂的选择取决于多肽中存在的氨基酸反应性侧链的身份。例如,如果多肽中在C-末端之外的其它位置存在半胱氨酸,那么二硫键交联将不是优选的。本发明的范围还包括以亚甲基桥交联的肽。
除了N-末端氨基和C-末端羧基以外,抗体上的合适交联位点包括赖氨酸残基上的ε氨基,以及肽内部残基或导入侧翼序列中的残基的侧链上的氨基、亚氨基、羧基、巯基和羟基。经由外部添加交联剂的交联可合适的使用例如本领域技术人员熟悉的许多试剂中的任何一种来实现,例如经由碳二亚胺(carbodiimide)处理多肽。合适的多功能(通常为双功能)交联剂的其它例子可以在文献中找到。
C.本发明的典型制剂的制备
应当注意,在本文的典型制剂的制备中,所用成分的推荐质量或“等级”将取决于该制剂的最终用途。对于治疗用途,优选该成分具有作为药用产品的添加剂的允许等级(诸如“GRAS”)。
在某些实施方案中,提供了包含DR5受体抗体和一种或多种赋形剂的组合物,所述赋形剂提供足够的离子强度以提高抗体的可溶性和/或稳定性,其中组合物的pH为6(或约6)到9(或约9)。可通过实现期望蛋白质纯度的任何合适方法,例如按照上述方法来制备抗体。在某些实施方案中,在宿主细胞中重组表达DR5抗体,或者通过化学合成来制备。制剂中抗体的浓度可随着例如制剂的计划用途而改变。本领域技术人员无需过度试验就能够确定DR5抗体的期望浓度。
制剂中提供足够离子强度以提高DR5抗体的可溶性和/或稳定性的一种或多种赋形剂任选为多离子的有机或无机酸、天冬氨酸盐/酯、硫酸钠、琥珀酸钠、醋酸钠、氯化钠、CaptisolTM、Tris、精氨酸盐或其它氨基酸、糖和多元醇诸如海藻糖和蔗糖。优选的是,制剂中提供足够离子强度的一种或多种赋形剂是盐。可使用的盐包括但不限于钠盐和精氨酸盐。所用盐的类型和盐的浓度优选使得该制剂具有相对高的离子强度,使得DR5抗体在制剂中稳定。可选择地,该盐在制剂中以约20mM到约0.5M的浓度存在。
组合物的pH优选为6(或约6)到9(或约9),更优选约6.5到约8.5,甚至更优选约7到约7.5。在此实施方案的一个优选方面,组合物还将包含缓冲剂,以便将组合物的pH维持在至少约6到约8。可使用的缓冲剂的例子包括但不限于Tris、HEPES和组氨酸。在使用Tris时,可任选将pH调至约7到8.5。在使用HEPES或组氨酸时,可任选将pH调至约6.5到7。可选择地,制剂中所用的缓冲剂的浓度在约5mM到约50mM。
特别对于液体制剂(或重建冻干制剂)来说,可能期望在组合物中包含一种或多种表面活性剂。这类表面活性剂可包括例如非离子表面活性剂,像TWEENTM或PLURONICSTM(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆)。优选的是,表面活性剂包括聚山梨醇酯20(“吐温20”)。表面活性剂将任选以约0.005%到约0.2%的浓度使用。
除了DR5抗体和上述那些成分之外,本发明的制剂还包含多种其它赋形剂或成分。可选择地,用于肠胃外施用的制剂可包含药学上或肠胃外可接受的载体,即在所用剂量和浓度对接受者无毒且与制剂中的其它成分相容的载体。可选择地,载体是肠胃外载体,诸如与接受者的血液等渗的溶液。这类载体媒介的例子包括水、盐水或缓冲液,诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。《Remington′s PharmaceuticalSciences》,第16版,Osol,A.编,1980中进一步描述了各种任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。
本文的制剂还可含有一种或多种防腐剂。例子包括氯化十八烷基二甲基苄基铵、氯化己烷双胺、苯扎氯铵(氯化烷苄基二甲基铵的混合物,其中烷基为长链化合物)和苯索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇、对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、和间甲酚。抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵;氯化乙烷双胺;苯扎氯铵、苯索氯铵;丁醇;对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯;邻苯二酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;糖类,诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;或聚乙二醇(PEG)。
这类载体的其它例子包括卵磷脂、血清蛋白质诸如人血清清蛋白、缓冲物质诸如甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质诸如硫酸鱼精蛋白、氯化钠、聚乙烯吡咯烷酮和基于纤维素的物质。基于凝胶形式的载体包括多糖,诸如羧甲基纤维素或甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和木蜡醇(wood wax alcohol)。常规的存储形式包括例如微胶囊、纳米胶囊、脂质体、硬膏剂、吸入形式、鼻喷雾和持续释放制剂。
本发明的组合物可包括液体制剂(液体溶液或液体悬浮液)和冻干制剂,以及其中DR5抗体为晶体或无定形沉淀物形式的悬浮制剂。
如果是液体,最终制剂优选冷冻存储在≤20℃。或者,可冻干该制剂并作为与注射用水重建的粉剂提供,该粉剂任选可存储在2-30℃。
用于治疗性施用的制剂必须是无菌的。通过除菌滤膜(例如0.2微米滤膜)过滤可轻易实现灭菌。通常将治疗性组合物置于具有灭菌存取口的容器中,例如具有可用皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶。
作为水溶液或用于重建的冻干制剂,通常将组合物存储在单个单位或多剂量容器中,例如密封的安瓿或药瓶。该容器可以是本领域可获得的任何容器,并用常规方法填充。可选择地,该制剂可装入注射笔装置(或装入笔装置的药筒),诸如那些本领域可获得的装置(参见例如美国专利5,370,629),它们适合制剂的治疗性投递。例如,可使用注射用水重建冻干的DR5抗体制剂来制备注射液。
D.使用方法和其它应用
在此描述的DR5抗体用于多种治疗性和非治疗性应用。在这些应用中,包括治疗紊乱的方法,诸如癌症、免疫相关疾患或病毒疾患。这类治疗性和非治疗性应用进一步描述于例如WO 97/25428、WO 97/01633和WO01/22987。
本发明设想了使用基因疗法来治疗哺乳动物,使用编码DR5抗体的核酸。编码DR5抗体的核酸可用于该目的。一旦知道氨基酸序列,就能采用遗传密码简并性生成多种氨基酸分子,并选择某种用于基因疗法。
有两种主要方法使核酸(任选包含在载体中)为了基因疗法的目的进入患者的细胞,即体内和回体(ex vivo)。对于体内投递,通常在需要DR5抗体的部位将核酸直接注射到患者体内。对于回体治疗,采集患者的细胞,将核酸导入这些分离的细胞,并将经过修饰的细胞或是直接施用于患者,或是例如装入多孔膜内并植入患者体内。参见例如美国专利4,892,538和5,283,187。
有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移至体外培养细胞还是目的宿主的体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行的转染。在有些情况中,希望与靶向靶细胞的试剂一起提供核酸源,诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体、靶细胞上受体的配体等。在采用脂质体时,与胞吞作用相关细胞表面膜蛋白结合的蛋白质可用于靶向和/或促进摄入,例如对特定细胞类型具有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中进行内在化的蛋白质的抗体、和靶向细胞内定位和增加细胞内半衰期的蛋白质。例如Wu等,
J.Biol. Chem.,
262:4429-4432(1987)和Wagner等,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
87:3410-3414(1990)中描述了受体介导的胞吞技术。关于目前已知的基因标记和基因疗法方案的综述参见Anderson等,
Science,
256:808-813(1992)。还可参见WO 1993/25673及其引用的参考文献。
在用于治疗紊乱的本发明方法中,可通过任何合适技术,包括灌注或注射,将DR5抗体制剂直接施用于哺乳动物。具体的施用路径将取决于例如患者的病史,包括任何使用DR5抗体察觉的或预料的副作用以及待矫正的具体紊乱。肠胃外施用的例子包括皮下、肌肉内、静脉内、动脉内和腹膜内施用组合物。制剂优选作为重复静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、肌肉内(i.m.)注射或灌注、颅内灌注,或者作为适于鼻内或肺内投递的气雾剂施用(关于肺内投递参见例如EP 257,956)。
应当注意,在皮下和肌肉内注射中,注射剂的渗透压可能是重要的。当注射溶液为低渗或高渗时,在灌注时会使患者感觉到疼痛。通常,对于本文的治疗性注射制剂来说,优选注射液的相对渗透压为约300mosm到约600mosm。
还可以口服或持续释放制剂的形式来施用DR5抗体制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有蛋白质的固体疏水性聚合物半透性基质,该基质以定型产品的形式存在,如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素)、溶于非水性介质中的蔗糖-醋酸异丁酸酯(SABERTM)、聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.1981,15:167-277;Langer,Chem.Tech.1982,12:98-105或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919、EP 58,481)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物(Sidman等人,Biopolymers 1983,22:547-556)、不可降解的乙烯-乙酸乙烯(Langer等人,同上文)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。用于施用系统作用药物的一种可选方法包括通过连续灌注(采用如缓慢释放装置或微型泵诸如渗透泵或皮肤贴片)或者通过注射(采用如静脉内或皮下方式,包括单次推注施用)进行施用。
将以与良好医疗实践一致的方式,考虑个体患者的临床状况、投递组合物的部位、施用的方法、施药的时程表和医务人员所知道的其它因素,配制和施用将用于治疗中的组合物。
设想了在该方法中还可以采用其它额外疗法。一种或多种其它疗法可包括但不限于施用放疗、细胞因子、生长抑制剂、化疗剂、胞毒剂、酪氨酸激酶抑制剂、ras法尼基转移酶抑制剂、血管发生抑制剂和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,这些都是本领域已知的且进一步定义的特性如上,它们可以与DR5抗体联合施用(例如同时地或顺序地)。此外,还包括基于靶向肿瘤或其它细胞抗原的治疗性抗体的疗法,所述治疗性抗体诸如CD20抗体(包括RituxanTM)或Her受体抗体(包括HerceptinTM)以及抗血管发生抗体诸如抗VEGF或靶向其它Apo2L受体诸如DR4的抗体。
可按照制造商的指示或由熟练技术人员凭经验确定化疗剂的制剂和服药时程安排。这类化疗的制剂和服药时程安排还描述于《ChemotherapyService》,M.C.Perry编,Williams & Wilkins,Baltimore,MD,1992。在有些情形中,在施用DR5抗体之前,使细胞暴露于一种或多种化疗剂可能是有益的。举例来说,有些类型的癌细胞可能对DR5抗体诱导的凋亡有抗性,但是能在用化疗剂预处理后变得对这种DR5抗体敏感。
可能期望还施用针对其它抗原的抗体,诸如结合CD20、CD11a、CD18、CD40、ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4、血管内皮因子(VEGF)或其它TNFR家族成员(诸如OPG、DR4、TNFR1、TNFR2)的抗体。或者/另外,可将在此公开的结合相同或两种或多种不同抗原的两种或多种抗体共施用于患者。有时,还对患者施用一种或多种细胞因子可能是有益的。
在本申请描述的任何治疗方法中,DR5抗体制剂可例如同时或顺序地与例如本申请上文定义部分明确提供的其它试剂、细胞因子、化疗、抗体等联合施用。例如,DR5抗体制剂可作为预处理施用(在施用任何这类其它试剂之前),诸如预处理否则对其它化疗剂的凋亡作用可能有抗性的细胞。
如上指出,本发明的DR5抗体具有多种用途。例如,DR5激动肽可用于治疗哺乳动物中病理疾患的方法,例如癌症或免疫相关疾病。熟练技术人员可以在哺乳动物中诊断在此描述的各种病理疾患。诊断技术在本领域是可获得的,这使得可以例如在哺乳动物中诊断或检测癌症或免疫相关疾病。例如,可通过多种技术鉴定癌症,包括但不限于触诊、血液分析、x-射线、NMR等等。免疫相关疾病也能容易的鉴定。在系统性红斑狼疮中,疾病的中枢介导物是生成对于自身蛋白质/组织的自身反应性抗体及随后产生的免疫介导的炎症。多种器官和系统在临床上受到影响,包括肾脏、肺部、肌肉骨骼系统、粘膜与皮肤、眼睛、中枢神经系统、心血管系统、胃肠道、骨髓和血液。
医务人员熟悉许多这样的疾病,其中对免疫和/或炎性应答进行干涉是有益的。例如,类风湿性关节炎(RA)是主要涉及各处关节滑膜,导致关节软骨损伤的慢性系统性自身免疫炎性疾病。发病机理依赖T淋巴细胞且与类风湿因子、针对自身IgG的自身抗体的生成有关,导致在关节液和血液中达到高水平的免疫复合物的形成。关节中的这些复合物可诱导显著的淋巴细胞和单核细胞渗透到滑膜中,随后导致显著的滑液变化;关节腔/液体中渗透了类似细胞,还增加了大量嗜中性粒细胞。受侵害的组织主要是关节,通常是对称样式。然而,关节外疾病也以两种主要形式发生。一种形式为发生关节外损伤,具有渐进性关节病和典型的肺纤维化、血管炎和皮肤溃疡。关节外疾病的第二种形式是所谓的费尔提氏综合征,它发生在RA疾病过程的晚期,有时在关节病已经遏制后,且牵涉出现嗜中性白血球减少症、血小板减少症和脾肿大。这可伴随着多个器官中出现的血管炎,及梗塞形成、皮肤溃疡和坏疽。患者还常常在受侵害关节上面的皮下组织中产生类风湿性节结;晚期的节结具有由混合的炎性细胞渗透物包围的坏死中心。可在RA中出现的其它表现包括:心包炎、胸膜炎、冠状动脉炎、发生肺纤维化的间质性肺炎、角膜结膜炎和类风湿性结节。
青少年慢性关节炎是通常开始于16岁之前的慢性先天性炎性疾病。其表型与RA有些相似;类风湿因子阳性的某些患者归入青少年类风湿性关节炎。该病细分为三种主要类别:少数关节的、多关节的和系统性的。关节炎可以是严重的,通常是破坏性的,并导致关节僵硬和生长迟缓。其它表现可包括慢性前葡萄膜炎和系统性淀粉样变。
脊椎关节病是具有一些普遍临床特征且普遍与HLA-B27基因产物的表达相关的一组紊乱。这些紊乱包括:强直性脊柱炎、莱特尔氏综合征(反应性关节炎)、与炎性肠病相关的关节炎、与银屑病相关的脊椎炎、青少年发作的脊椎关节病及无差别(undifferentiated)脊椎关节病。区别性特征包括具有或没有脊椎炎的骶髂关节炎;炎性不对称关节炎;与HLA-B27相关(血清学上定义的MHC I型HLA-B基因座的等位基因);眼炎症,与其它类风湿性疾病相关的自身抗体的缺乏。对于诱导疾病来说关键的最相关细胞是CD8+T淋巴细胞,靶向由MHC I型分子呈递的抗原的细胞。CD8+T可与MHC I型等位基因HLA-B27反应,只要它是由MHC I型分子表达的外源肽。已有假设,HLA-B27的表位可能模拟细菌或其它微生物的抗原性表位,从而诱导CD8+T细胞应答。
系统性硬化(硬皮病)的病因学未知。该病的特点是皮肤硬化;这可能是由活性炎性过程诱导的。硬皮病可以是局部的或系统性的;血管损坏是普遍的,而且微血管系统中的内皮细胞损伤是系统性硬化症发展中的早期而重要的事件;血管损伤可能由免疫介导。皮肤损伤中存在单核细胞渗透以及在许多患者中存在抗核抗体暗示免疫学基础。ICAM-1通常在皮肤损伤的成纤维细胞的细胞表面上调,表明T细胞与这些细胞相互作用可能在疾病的发病机理中起作用。其它相关器官包括:胃肠道:平滑肌萎缩和纤维化导致异常蠕动/运动;肾脏:同中心内皮下内膜增生影响小弓形和叶间动脉,从而降低肾皮质血流,导致蛋白尿、氮血症和高血压;骨骼肌:萎缩、间质性纤维化、炎症;肺:间质性肺炎和间质性纤维化;及心脏:收缩带坏死、疤痕化/纤维化。
先天性炎性肌病包括皮肌炎、多肌炎和其它疾病,是导致肌肉软弱的未知病因的慢性肌肉发炎紊乱。肌肉损伤/发炎通常是对称的和渐进的。自身抗体与大多数形式相关。这些肌炎特异性自身抗体针对并抑制与蛋白质合成相关的成分、蛋白质和RNA的功能。
斯耶格伦氏综合征是由免疫介导的炎症及随后泪腺和唾液腺功能破坏引起的。该病可能与炎性结缔组织疾病相关或伴随着炎性结缔组织疾病。该病与针对Ro和La抗原的自身抗体生成相关,这两种抗原都是小RNA-蛋白质复合物。损害导致干燥性角膜结膜炎、口干燥、及其它表现或关联,包括胆汁性肝硬化、外周或感觉神经病和可触知的紫癜。
系统性血管炎是这样的疾病,其中原发性损害是炎症,后续对血管的损伤导致由受侵害血管供应的组织缺血/坏死/变性,且在某些情形下最终导致终端器官功能障碍。血管炎病还可作为其它免疫-发炎介导疾病诸如类风湿性关节炎、系统性硬化等的继发损害或后遗症发生,特别是在还与免疫复合物形成相关的疾病中。原发性系统性血管炎组中的疾病包括:系统性坏死性血管炎:节结性多动脉炎、过敏性脉管炎和肉芽肿病、多脉管炎;韦格纳氏肉芽肿病;淋巴瘤样肉芽肿病;和巨细胞性动脉炎。各种各样的血管炎病包括:粘膜与皮肤淋巴结综合征(MLNS或川畸氏病)、分离的CNS血管炎、贝切特氏病、闭塞性血栓性血管炎(伯格氏病)和皮肤坏死性小静脉炎。所列大多数类型的血管炎的发病机理认为主要是由于免疫球蛋白复合物在血管壁上沉积,随后通过ADCC、补体活化或者两者诱导的炎症应答。
节结病是病因学未知,特征在于几乎机体任何组织中都存在上皮样肉芽肿的疾患;最普遍的是涉及肺。发病机理包括患病部位持续存在活化的巨噬细胞和淋巴样细胞,随后由这些细胞类型释放局部和系统性活性产物而导致慢性后遗症。
自身免疫性溶血性贫血,包括自身免疫性溶血性贫血、免疫性全血细胞减少症和阵发性夜间血红蛋白尿是由于生成与红细胞(和在有些情形下其它血细胞,包括血小板等)表面表达的抗原反应的抗体的结果,是通过补体介导的溶解和/或ADCC/Fc受体介导的机制去除这些抗体包裹细胞的反映。
在包括血小板减少性紫癜的自身免疫性血小板减少症,和其它临床背景中的免疫介导的血小板减少症中,由于抗体或补体附着到血小板上随后通过补体溶解、ADCC或Fc受体介导的机制去除而发生血小板破坏/去除。
甲状腺炎,包括格雷夫斯氏病、桥本氏甲状腺炎、青少年淋巴细胞性甲状腺炎和萎缩性甲状腺炎是由于针对甲状腺抗体的自身免疫反应及产生与存在于甲状腺中且通常对甲状腺特异的蛋白质反应的抗体。现有的实验模型包括自发性模型:大鼠(BUF和BB大鼠)和鸡(肥胖鸡品系);可诱导模型:用甲状腺球蛋白、甲状腺微粒体抗原(甲状腺过氧化物酶)免疫动物。
I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病是胰岛β细胞的自身免疫破坏;该破坏由自身抗体和自身反应性T细胞的介导。胰岛素或胰岛素受体的抗体也会产生胰岛素不响应的表型。
免疫介导的肾病,包括肾小球肾炎和肾小管间质性肾炎是由于抗体或T淋巴细胞介导的对肾脏组织产生的损伤,可能是直接由于产生针对肾脏抗原的自身反应性抗体或T细胞,或者可能是间接由于对其它非肾脏抗原有反应性的抗体和/或免疫复合物在肾脏中沉积。因此,导致免疫复合物形成的其它免疫介导的疾病也可作为间接后遗症诱导免疫介导的肾病。直接和间接的免疫机制都导致炎症反应,它在肾脏组织中产生/诱导损害发生,结果器官功能受损,在某些情形下发展成肾衰竭。体液和细胞两种免疫机制都可与损害的发病机理相关。
中枢和外周神经系统的脱髓鞘疾病,包括多发性硬化;先天性脱髓鞘多神经病或格巴二氏综合征;和慢性炎性脱髓鞘多神经病认为具有自身免疫基础,且由于对少突细胞或对髓鳞脂直接造成损害而导致神经脱髓鞘。在MS中,有证据表明该疾病的诱导和进展依赖T淋巴细胞。多发性硬化是依赖T淋巴细胞的炎性脱髓鞘病,且具有复发-缓和过程或漫长的渐进过程。病因未知;但是,病毒感染、遗传易患病质、环境和自身免疫性都会起作用。损伤含有主要由T淋巴细胞介导的渗透物、微胶质细胞和渗透的巨噬细胞;CD4+T淋巴细胞是损伤处的主要细胞类型。少突细胞死亡和随后脱髓鞘的机理未知,但是可能是由T淋巴细胞驱动的。
炎性和纤维化肺病,包括嗜曙红细胞肺炎;特发性肺纤维化和超敏性肺炎,可能牵涉不受调控的免疫-发炎反应。抑制该反应将具有治疗益处。
自身免疫或免疫介导的皮肤病,包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎,由自身抗体介导,其发生依赖T淋巴细胞。
银屑病是T淋巴细胞介导的炎性疾病。损伤中含有T淋巴细胞、巨噬细胞和抗原加工细胞的渗透物,以及一些嗜中性粒细胞。
变应性疾病,包括哮喘;变应性鼻炎;特异性皮炎;食物超敏性;和荨麻疹,依赖T淋巴细胞。这些疾病主要由T淋巴细胞诱导的炎症、IgE介导的炎症或二者组合介导。
移植相关性疾病,包括移植排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD),依赖T淋巴细胞;抑制T淋巴细胞功能具有改善作用。
其中对免疫和/或发炎反应进行干涉具有益处的其它疾病为传染病,包括但不限于病毒感染(包括但不限于AIDS,甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎)、细菌感染、真菌感染、及原生动物和寄生虫感染(刺激MLR的分子(或者衍生物/激动剂)在治疗上可用于增强对感染因子的免疫应答),免疫缺陷疾病(刺激MLR的分子/衍生物/激动剂在治疗上可用于增强对遗传性、获得性、感染性诱导的(如HIV感染)或医原性(即如由化疗引起的)免疫缺陷疾患的免疫应答),以及瘤形成。
在此还提供了诊断方法。例如,DR5抗体可用于在已知或怀疑具有Apo-2L或DR5相关病理疾患的哺乳动物中检测对应DR5受体。结合肽可用于例如在测定法中检测或者量化样品中的DR5。可在存在经标记结合肽时将样品诸如从哺乳动物获得的细胞温育,并检测样品中结合的经标记结合肽。这类测定法,包括各种临床测定流程,在本领域是已知的,例如Voller等人,
Immunoassays,University Park,1981中所描。
本发明还提供了包含在此描述的DR5抗体的试剂盒。典型的试剂盒将包括容器,优选小瓶,装有一种或多种上述赋形剂中的DR5抗体;和说明书,诸如产品插页或标签,指导使用者如何使用DR5抗体制剂。这优选提供药用制剂。优选的是,该药用制剂用于治疗癌症或免疫相关疾患。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以用各种材料制成,诸如玻璃或塑料。该容器装有有效用于诊断或治疗紊乱的DR5抗体制剂,可具有无菌存取口(例如,该容器可以是带有能用皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。容器上的或者与容器相关的标签指示该制剂用于诊断或治疗所选的紊乱。该产品还可包括第二容器,其中装有注射用水、药学上可接受的溶液、盐水、Ringer氏溶液或右旋糖溶液。还可包括符合商业和使用者立场的其它想要的材料,包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器和具有使用说明的包装插页。
将本申请全文中引用的所有专利、专利申请、出版物、产品描述和方案的公开内容完整引入本文作为参考。在此所用的章节标题仅用于组织的目的,而不应解释为限定所述主题。
实施例
下述实施例只是为了例示的目的而提供,并非旨在以任何方式限定本发明的范围。除非另外指出,实施例中提及的商品化试剂按照制造商的指示使用。在下述实施例和整篇说明书中用ATCC编号确定的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,Virginia)。在下一组实施例中,当提及中间物和终产物时,用标准的一个或三个字母的氨基酸代码描述常见的α-氨基酸。常见的α-氨基酸是指那些在mRNA引导下掺入蛋白质的氨基酸。标准缩写列举在Merck Index,第10版,pp Misc-2-Misc-3中。除非另外指定,常见的α-氨基酸在α-碳原子上具有天然的或“L”-构型。如果代码前有“D”,这表示常见的α-氨基酸的相反对映体。经过修饰的或者不常见的α-氨基酸诸如正亮氨酸(Nle)和鸟氨酸(Orn)的指定描述在1990年5月15日的美国专利和商标局公报(U.S.Patent andTrademark Office Official Gazette)1114 TMOG中。
实施例1:scFv文库LSS-2331B的构建
用噬菌粒载体构建称作“LSS-2331B”的噬菌体展示scFv文库,通过在scFv和基因3次要外壳蛋白(P3C)的C末端结构域之间插入亮氨酸拉链结构域而二聚化,导致双价scFv模块(moiety)的展示。该载体命名为“pS2072a”,且包含图4所示序列。该载体包含人源化抗体4D5可变区,受碱性磷酸酶(phoA)启动子控制。人源化抗体4D5是在重链和轻链中主要具有人共有序列框架区且具有来自对Her-2特异的小鼠单克隆抗体的CDR区的抗体。美国专利5,821,337和6,054,297提供了制备抗Her-2抗体和鉴定可变区序列的方法。
用全部三个重链CDR中的随机化残基构建LSS-2331B。随机化的具体残基如下:CDR-H1中的残基28、30、31、32和33;CDR-H2中的残基50、52、53、54、56和58;CDR-H3中的残基95、96、97、98、99和100。通过用不同数目(3-14个)的简并密码子替换位置95到100之间的6个野生型密码子,将额外多样性导入CDR-H3。
用Kunkel等人,Methods Enzymol.(1987),154:367-382)的方法以及前述方法(Sidhu,S.S.等人,Methods Enzymol.(2000),328:333-363)构建文库LSS-2331B。通过用TAA终止密码子替代重链位置30、31、32、33、53、54、56、98、99、100和100a的密码子,构建独特的“终止模板”型的pS2072a(命名为pS2072c)。使用在待多样化位置上具有简并密码子的诱变寡核苷酸同时引入CDR多样性并修复终止密码子。所述寡核苷酸序列示于下面的表1。
表1:用于文库LSS-2331B构建的诱变寡核苷酸。IUB代码代表等摩尔DNA简并性(W=A/T,R=A/G,V=G/A/C,N=A/G/C/T,M=A/C,Y=C/T,D=G/A/T,B=G/T/C,K=G/T,S=G/C,H=A/T/C)。
名称 | 序列 |
H1-1 | TGT GCA GCT TCT GGC TTC WCC ATT RVN RVN WMY RNT ATA CAC TGGGTG CGT CAG (SEQ ID NO:116) |
H2-1 | GGC CTG GAA TGG GTT GCA DBG ATT DHT CCA NMY DMT GGT DMTACT DMT TAT GCC GAT AGC GTC AAG (SEQ ID NO:117) |
H3-1 | GCC GTC TAT TAT TGT AGC CGC DVK DVK NNK TAC GCT ATG GAC TACTGG GG (SEQ ID NO:118) |
H3-2 | GCC GTC TAT TAT TGT AGC CGC DVK DVK DVK NNK TAC GCT ATG GACTAC TGG GG (SEQ ID NO:119) |
H3-3 | GCC GTC TAT TAT TGT AGC CGC DVK DVK DVK DVK NNK TAC GCT ATGGAC TAC TGG GG (SEQ ID NO:120) |
H3-4 | GCC GTC TAT TAT TGT AGC CGC DVK DVK DVK DVK DVK NNK TAC GCTATG GAC TAC TGG GG (SEQ ID NO:121) |
H3-5 | GCC GTC TAT TAT TGT AGC CGC DVK DVK DVK DVK DVK DVK NNK TACGCT ATG GAC TAC TGG GG ((SEQ ID NO:122) |
H3-6 | GCC GTC TAT TAT TGT AGC CGC DVK DVK DVK DVK DVK DVK DVKNNK TAC GCT ATG GAC TAC TGG GG (SEQ ID NO:123) |
H3-7 | GCC GTC TAT TAT TGT AGC CGC DVK DVK DVK DVK DVK DVK DVKDVK NNK TAC GCT ATG GAC TAC TGG GG (SEQ ID NO:124) |
H3-8 | GCC GTC TAT TAT TGT AGC CGC DVK DVK DVK DVK DVK DVK DVKDVK DVK NNK TAC GCT ATG GAC TAC TGG GG (SEQ ID NO:125) |
H3-9 | GCC GTC TAT TAT TGT AGC CGC DVK DVK DVK DVK DVK DVK DVKDVK DVK DVK NNK TAC GCT ATG GAC TAC TGG GG (SEQ ID NO:126) |
H3-10 | GCC GTC TAT TAT TGT AGC CGC DVK DVK DVK DVK DVK DVK DVKDVK DVK DVK DVK NNK TAC GCT ATG GAC TAC TGG GG (SEQ IDNO:127) |
H3-11 | GCC GTC TAT TAT TGT AGC CGC DVK DVK DVK DVK DVK DVK DVKDVK DVK DVK DVK DVK NNK TAC GCT ATG GAC TAC TGG GG (SEQ IDNO:128) |
H3-12 | GCC GTC TAT TAT TGT AGC CGC DVK DVK DVK DVK DVK DVK DVKDVK DVK DVK DVK DVK DVK NNK TAC GCT ATG GAC TAC TGG GG(SEQ ID NO:129) |
分别用寡核苷酸H1-1和H2-1将多样性导入CDR-H1和CDR-H2。用寡核苷酸H3-1、H3-2、H3-3、H3-4、H3-5、H3-6、H3-7、H3-8、H3-9、H3-10、H3-11和H3-12的等摩尔混合物将多样性导入CDR-H3。在一个诱变反应中,将用于所有待随机化CDR的诱变寡核苷酸同时掺入pS2027c模板,因此所有诱变寡核苷酸的同时掺入导致在各个位置上引入设计的多样性并同时修复所有TAA终止密码子,从而生成编码与同二聚化亮氨酸拉链和P3C融合的scFv文库成员的可读框。
将诱变反应物电穿孔到大肠杆菌SS320(Sidhu,S.S.等人,MethodsEnzymol.(2000),328:333-363)中,并将转化细胞在存在M13-KO7辅助噬菌体(New England Biolabs,Beverly,MA)下培养过夜以生成噬菌体颗粒,它们包裹噬菌粒DNA并在其表面展示Fab片段。文库LSS-2331B含有3×1010个独特成员。
在构建文库后,如下所述采用三步分选技术进行分选:
分选1
1.以2ug/ml、100ul/孔的人DR5-ECD(参见下文表9)包被Maxisorp免疫板的12个孔,并在4℃温育过夜。
2.封闭平板:添加200ul含酪蛋白的PBS,并在室温温育1小时。
3.封闭噬菌体:以1∶1的比例将封闭缓冲液(酪蛋白)加到噬菌体溶液中,并在室温温育1小时。
4.用PT缓冲液(PBS+0.05%吐温20)洗涤平板5次。
5.将100ul文库噬菌体溶液(来自步骤4)加到孔中,在室温温育2小时并轻轻摇晃。
6.用PT缓冲液洗涤平板10次。
7.前12个孔用50ul 0.1M HCl,pH2洗脱20分钟;用1.0M tris碱(约1/6体积)中和洗脱液。
8.用1.5ml噬菌体洗脱液感染5ml Xl1-blue细胞(OD600=1.0)。在37℃培养20分钟。在LB/carb平板上滴定并将培养液转移到50ml 2YT/carbVCS中,并在37℃培养过夜。
9.旋转离心细胞并保留上清液,该上清液可用于下一步分选。
分选2
1.用人DR5-ECD包被12个孔。
2.封闭平板:添加200ul超级封闭液(super block)(Pierce Chemicals,产品号37515),并在室温温育1小时。
3.封闭噬菌体:以1∶1的比例将酪蛋白加到噬菌体上清液(来自分选1,步骤12)中,并在室温温育1小时。
4.用0.3ml噬菌体洗脱液感染1ml Xl1-blue细胞(OD600=1.0)。在37℃培养20分钟。在LB/carb平板上滴定并将培养液转移到25ml 2YT/carbVCS中,并在37℃培养过夜。
5.旋转离心细胞并保留上清液,该上清液可用于下一步分选。
分选3
1.用人DR5-ECD包被12个孔。
2.封闭平板:添加200ul PBS/BSA,并在室温温育1小时。
3.封闭噬菌体:以1∶1的比例将超级封闭液加到噬菌体上清液中,并在室温温育1小时。
4-5.同上。
实施例2:scFv文库LSS-2344F的构建
除了如下不同之处,如实施例1中关于LSS-2331B所述构建称作“LSS-2344F”的文库。
终止模板(pG4503f)在一个密码子上与pS2072c不同,导致重链中的一个点突变(H91S)。用于文库构建的诱变寡核苷酸的序列示于下面的表2。
表2:用于文库LSS-2344F构建的诱变寡核苷酸。IUB代码代表等摩尔DNA简并性(W=A/T,R=A/G,V=G/A/C,N=A/G/C/T,M=A/C,Y=C/T,D=G/A/T,B=G/T/C,K=G/T,S=G/C,H=A/T/C)。
名称 | 序列 |
H1-2 | GCA GCT TCT GGC TTC ACC ATT AVT RRT WMY KMT ATA CAC TGG GTGCGT CAG (SEQ ID NO:130) |
H1-3 | GCA GCT TCT GGC TTC ACC ATT AVT RRT WMY KGG ATA CAC TGG GTGCGT CAG (SEQ ID NO:131) |
H1-4 | GCA GCT TCT GGC TTC ACC ATT AVT RVM WMY KMT ATA CAC TGGGTG CGT CAG (SEQ ID NO:132) |
H1-5 | GCA GCT TCT GGC TTC ACC ATT AVT RVM WMY KGG ATA CAC TGGGTG CGT CAG (SEQ ID NO:133) |
H2-2 | AAG GGC CTG GAA TGG GTT GST DHT ATT WMT CCT DMT RRC GGT DMTACT DAC TAT GCC GAT AGC GTC AAG GG (SEQ ID NO:134) |
H2-3 | AAG GGC CTG GAA TGG GTT GST DGG ATT WMT CCT DMT RRC GGTDMT ACT DAC TAT GCC GAT AGC GTC AAG GGC (SEQ ID NO:135) |
H2-4 | AAG GGC CTG GAA TGG GTT GST DHT ATT DMT CCT NMT RRC GGC DMTACT DAC TAT GCC GAT AGC GTC AAG GGC (SEQ ID NO:136) |
H2-5 | AAG GGC CTG GAA TGG GTT GST DGG ATT DMT CCT NMT RRC GGC DMTACT DAC TAT GCC GAT AGC GTC AAG GGC (SEQ ID NO:137) |
H3-13 | ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCT CGT NNS NNS NNS NNS TAC GBT ATGGAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO:138) |
H3-14 | ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCT CGT NNS NNS NNS NNS KSG GBT ATGGAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO:139) |
H3-15 | ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCT CGT NNS NNS NNS NNS NNS TAC GBTATG GAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO:140) |
H3-16 | ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCT CGT NNS NNS NNS NNS NNS KSG GBTATG GAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO:141) |
H3-17 | ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCA ARA DVK DVK DVK DVK DVK NNK TACGCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO:142) |
H3-18 | ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCA ARA TGG NVT DVK DVK DVK DVK DSGGCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO:143) |
H3-19 | ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCA ARA DVK DVK DVK DVK DVK DVK KSGGCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO:144) |
H3-20 | ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCA CGT DVK DVK DVK DVK DVK DVK DVKTAC GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO:145) |
H3-21 | ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCA CGT DVK DVK DVK DVK DVK DVK DVKDSG GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO:146) |
H3-22 | ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCA CGT DVK DVK DVK DVK DVK DVK DVKDVK TAC GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO:147) |
H3-23 | ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCA CGT DVK DVK DVK DVK DVK DVK DVKDVK DSG GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO:148) |
用寡核苷酸H1-2、H1-3、H1-4和H1-5(2∶1∶2∶1的比例)将多样性引入CDR-H1。用寡核苷酸H2-2、H2-3、H3-4和H4-5(2∶1∶2∶1的比例)将多样性引入CDR-H2。用寡核苷酸H3-13、H3-14、H3-15、H3-16、H3-17、H3-18、H3-19、H3-20、H3-21、H3-22和H3-23的等摩尔混合物将多样性引入CDR-H3。文库LSS-2344F含有1.5×1010个独特成员。
然后用实施例1中描述的三步分选方法来进行分选。
实施例3:构建Fab文库LSS-2369B
用噬菌粒载体构建噬菌体展示Fab文库“LSS-2369B”,导致与基因3次要外壳蛋白(P3C)的C-末端结构域融合的Fab模块的展示。该载体命名为pV-0350-2,且包含图5所示序列。该载体包含在轻链中具有三个突变(N30S、R66G和H91S)的人源化抗体4D5 Fab,受碱性磷酸酶(phoA)启动子控制。人源化抗体4D5是在重链和轻链中主要具有人共有序列框架区且具有来自对Her-2特异的小鼠单克隆抗体的CDR区的抗体。美国专利5,821,337和6,054,297提供了制备抗Her-2抗体和鉴定可变区序列的方法。
用全部三个重链CDR中的随机化残基构建LSS-2369B。随机化的具体残基如下:CDR-H1中的残基28、30、31、32和33;CDR-H2中的残基50、52、53、54、56和58;CDR-H3中的残基95、96、97、98、99、100、100a、100b和100c。通过用不同数目(7、8、9、10或12个)的简并密码子替换位置95到100之间的9个野生型密码子,将额外多样性引入CDR-H3。
用Kunkel等人,Methods Enzymol.(1987),154:367-382)的方法以及前述方法(Sidhu,S.S.等人,Methods Enzymol.(2000),328:333-363)构建文库LSS-2369B。通过用TAA终止密码子替代重链位置30、31、32、33、53、54、56、98、99、100和100a的密码子,构建独特的“终止模板”型的pV-0350-2(命名为pV-0350-2b)。使用在待多样化位置上具有简并密码子的诱变寡核苷酸同时引入CDR多样性并修复终止密码子。分别用寡核苷酸H1-1和H2-1(示于上面的表1)将多样性引入CDR-H1和CDR-H2。用寡核苷酸H3-24、H3-25、H3-26、H3-2和H3-28的等摩尔混合物(示于下面的表3)将多样性引入CDR-H3。
表3:用于文库LSS-2369B构建的诱变寡核苷酸。IUB代码代表等摩尔DNA简并性(W=A/T,R=A/G,V=G/A/C,N=A/G/C/T,M=A/C,Y=C/T,D=G/A/T,B=G/T/C,K=G/T,S=G/C,H=A/T/C)。
名称 | 序列 |
H3-24 | GCC GTC TAT TAT TGT GCT CGC NNK NNK NNK NNK NNK WTK GAC TACTGG GGT CAA (SEQ ID NO:149) |
H3-25 | GCC GTC TAT TAT TGT GCT CGC NNK NNK NNK NNK NNK NNK WTKGAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO:150) |
H3-26 | GCC GTC TAT TAT TGT GCT CGC NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNKWTK GAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO:151) |
H3-27 | GCC GTC TAT TAT TGT GCT CGC NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNKNNK WTK GAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO:152) |
H3-28 | GCC GTC TAT TAT TGT GCT CGC NNK NNK NNK NNK NNK NNK NNKNNK NNK WTK GAC TAC TGG GGT CAA (SEQ ID NO:153) |
在一个诱变反应中,将用于所有待随机化CDR的诱变寡核苷酸同时掺入pV-0350-2b模板,因此所有诱变寡核苷酸的同时掺入导致在各个位置上引入设计的多样性并同时修复所有TAA终止密码子,从而生成编码与P3C融合的Fab文库成员的可读框。
将诱变反应物电穿孔到大肠杆菌SS320(Sidhu,S.S.等人,MethodsEnzyymol.(2000),328:333-363),并将转化细胞在存在M13-KO7辅助噬菌体(New England Biolabs,Beverly,MA)下培养过夜以生成噬菌体颗粒,它们包囊噬菌粒DNA并在其表面展示Fab片段。文库LSS-2369B含有6.2×1010个独特成员。
然后用实施例1中描述的三步分选方法进行分选。
实施例4:从噬菌体文库中选择特异性抗体
对来自上述各个文库的噬菌体(实施例1、2和3)分别进行循环,通过数轮结合选择来富集结合人DR5-ECD的克隆(参见下面的表9)。用先前描述的方法进行结合选择(Sidhu等人,
同上文)。
NUNC 96孔Maxisorp免疫板在4℃用捕获靶(以5ug/ml溶于PBS的hDR5-ECD)包被过夜,并用牛血清清蛋白(BSA)(Sigma)封闭2小时。如先前所述(Sidhu等人,
同上文),噬菌体在37℃生长过夜后,用PEG/NaCl沉淀浓缩并重悬在PBS、0.5%BSA、0.1%吐温20(Sigma)中。将噬菌体溶液(1012个噬菌体/ml)加到包被好的免疫板上。温育2小时以便噬菌体结合后,用PBS、0.05%吐温20洗涤10次。用0.1M HCl洗脱结合的噬菌体10分钟,并用1.0M Tris碱中和洗脱液。在大肠杆菌XL1-blue中扩增洗脱的噬菌体,用于下一轮选择。对文库LSS-2344F和LSS-2331B分别进行3轮或4轮结合hDR5-ECD的选择。文库LSS-2369B进行2轮针对hDR5-ECD的选择,接着进行一轮针对抗gD表位抗体的选择(第2a轮),以富集展示Fab(有一个gD表位融合到轻链C末端上)的克隆,接着进行第三轮针对hDR5-ECD的选择。
对于各个文库来说,将来自最后一轮选择的各个克隆以96孔形式在500ul添加羧苄青霉素和M13-KO7的2YT肉汤中培养,并将培养物上清液直接用于噬菌体ELISA(Sidhu等人,
同上文)来检测结合用hDR5-ECD包被的平板但不结合用BSA包被的平板的噬菌体展示抗体。阳性结合克隆定义成是那些在包被hDR5-ECD的平板上呈现的ELISA信号比包被BSA(对照)的平板上的信号强至少10倍的克隆。还进行ELISA分析测试,以确定阳性结合克隆是对DR5受体特异的,且不展示与DR4、DcR1或DcR2受体(例如Apo-2配体结合的其它受体)的交叉反应性(数据未显示)。使用标准方法,对来自各个文库的阳性结合克隆进行DNA测序分析。对于LSS-2331B,对180个克隆进行的测序揭示了65个独特序列(图6)。对于LSS-2344F,对176个克隆进行的测序揭示了33个独特序列(图7)。对于LSS-2369B,对96个克隆进行的测序揭示了3个独特序列(图8)。
从文库LSS-2331B中选择的克隆(参见实施例1)的噬菌体ELISA的结果示于下面的表4。表4中的“标识符”是指指派给特定克隆抗体的名称或代码,而各个标识符对应于图6中包括的那些。用于比较,这些抗体的每一个与人DR5-ECD和猿猴(cynomolgous)(“cyno”)DR5-IgG(参见下面的表9)的结合示于表4。
表4:
噬菌体scFv ELISA
标识符 | 人DR5-ECD(nM) | 猿猴DR5-IgG(nM) | |
SB | 63 | >500 | |
SD | 200 | >500 | |
SE | 100 | >500 | |
SG | 200 | >500 | |
SI | 125 | >500 | |
SP | 39 | >500 | |
SJ | 50 | >500 | |
SK | 80 | 79.4 | |
ST | 100 | 100 | |
SS | 100 | >500 | |
SV | 25 | 20 | |
SY | 50 | 105 | |
SZ | 50 | >500 |
从Fab文库(参见实施例3)中选出的克隆的噬菌体ELISA结果示于下面的表5。表5中的“标识符”是指指派给特定克隆抗体的名称或代码,而各个标识符对应于图8中包括的那些。用于比较,这些抗体的每一个与人DR5-ECD(“HDR5-ECD”)、人DR5-IgG(“HDR5-IgG”,表9)、鼠DR5-IgG(“MDR5-IgG”,表9),以及与猿猴DR5-IgG(“CDR5-IgG”,表9)的结合示于表5。“N.D.”是指“未测定”。
表5:
标识符 | HDR5-ECDIc50(nM) | HDR5-IgGIc50(nM) | MDR5-IgGIc50(nM) | CDR5IgGIc50(nM) |
95 96 98BdF1 Fab R L A L V R M W MBd001 Fab N V R R R K P T FBd002 Fab N V R M R K P T L | 25742 | 35022 | N.D.N.D.N.D. | 27935 |
实施例5:用大肠杆菌表达制备Fab蛋白质
将菌落(在34B8中)挑到5ml 2YT+50ug/ml carb中,并将细胞在37℃培养到1.5-2.5 OD。将5ml培养物接种500ml完全C.R.A.P培养基+50ug/mlcarb,然后在30℃培养18-24小时。旋转离心细胞并倒去上清液。将沉淀物在-20℃冷冻过夜。
在冰上解冻细胞沉淀物,并添加如下物质:a)20ml TE(5ml/g);20ulPMSH(5ul/g);4ul1M苯甲脒(1ul/g);2ml 250mM EDTA(0.4ml/g)。将细胞完全重悬并在冰上放置至少1小时。将休克细胞(shocked cell)以15Krpm旋转离心60分钟。纯化上清液或者将细胞匀浆(ultraturex)5分钟。用微型流化器(microfluidizer)破碎细胞,并以15K旋转离心60分钟。将上清液过滤通过0.45um滤器,并加载到蛋白质柱上(柱用TE缓冲液预先洗涤)。柱用TE缓冲液洗涤,然后用0.1M乙酸+1mM EDTA洗脱,用1MTris,pH8中和,随后交换到PBS缓冲液中。然后在OD 280(浓度=1OD/0.4=mh/ml)进行测量。
然后在如下的ELISA中测试所表达的蛋白质。微量滴定板孔用80ul1ug/ml人DR5-ECD(表9)(在50mM碳酸钠pH 9.6中)在4℃包被过夜。去除包被液,用200ul PBS/0.1%BSA/0.05%吐温20封闭,并在室温温育1小时。制备竞争性受体溶液(100ul/样品),并以不同浓度用DR5受体制备适当不完全饱和生物素标记的抗体(由系列抗体稀释液预先测定)。将混合液在室温温育2小时。摇晃用DR5-ECD包被的平板,并用PBS+0.05%吐温20漂洗10次。将80ul竞争性受体和生物素标记的抗体的混合液从无粘性平板转移到DR5包被的平板上,并在室温温育20分钟。在结合缓冲液中进行HRP偶联的链霉亲合素(Zymed)的1∶5000稀释。用PBS/吐温20漂洗平板10次,加入80ul HRP-链霉亲合素稀释液并在室温温育1小时。将TMB过氧化物酶底物和过氧化物酶溶液B等体积混合。用PBS/吐温20漂洗平板10次,加入80ul底物,然后按照显色所需进行温育,并用80ul 2.5M H2SO4终止反应。
测试抗体“BdF2”(参见图8中的抗体I.D.)的此ELISA结果示于下面的表6。为了比较,抗体BdF2与人DR5-ECD、人DR5-IgG(参见表9)、人DR4-IgG(参见表9)、鼠DR5-IgG(表9),以及与猿猴DR5-IgG(“猿猴DR5-IgG”,表9)的结合示于表6。“N.D.”指“未测定”。
表6:
Fab abs
标识符(I.D.) | 人DR5-ECD(nM) | 人DR5IgG(nM) | 人DR4IgG(nM) | 猿猴DR5IgG(nM) | 鼠DR5ECD(nM) | 鼠DR5IgG(nM) |
BdF2 | 6.6 | / | N.D. | 1995 | N.D. | N.D. |
分析结果显示Bdf2结合人DR5-ECD,这也示于图9。
实施例6:结合分析
用BIAcore分析进行结合分析。加热CM5芯片(Biocare)到室温至少半小时。开启BIAcore仪器,并将芯片装载到该仪器中。用工作缓冲液(PBS/0.05%吐温20/0.01%叠氮化钠)进行起动(prime),然后用70%甘油进行标准化。按照制造商的指示运行传感程序(sensogram),制备固定蛋白质溶液(乙酸缓冲液pH5.5)并将蛋白质稀释至20ug/mL。用ECD和NHS活化芯片。以20ul/分注入5-30ul蛋白质(人DR5-ECD、猿猴DR5-IgG、鼠DR5-ECD或人DR4-IgG,都描述在表9中),直到固定的蛋白质达到100 RU。然后用1M乙醇胺封闭芯片。样品以50nnM-500nM的浓度起始,然后1∶1稀释。
用Biaevaluation软件程序分析数据以测量蛋白质动力学。
从实施例1描述的文库中选择的scFv抗体的Biacore分析结果报道在下面的表7中:
表7
标识符 | 人DR5ECDnM | 猿猴DR5IgGnM |
SB | 304 | |
SD | 149 | |
SE | 472 | |
SJ | 18000 | |
SK | 24 | 13 |
SP | 86 | |
SS | 167 | |
ST | 18 | 2 |
SV | 2 | 2 |
SY | 554 | 92000 |
SZ | 1575 |
从实施例2描述的文库中选择的Fab抗体的Biacore分析结果报道在下面的表8中:
表8
标识符AbsFc | 人DR5ECD(nM) | 人DR4IgG(nM) | 猿猴DR5ECD(nM) | 鼠DR5ECD(nM) |
BdF2* | 0.6 | N.D | 31 | N.D |
BdF2** | 0.71 | N.D | 27 | N.D |
AbsFab | ||||
BdF1 | 4.8 | N.D. | 12.3 | N.D |
BdF2 | 11 | N.D. | 5.5 | N.D |
BdF3 | 8.5 | N.D | 3.0 | N.D |
*从CHO细胞纯化的蛋白质
**从大肠杆菌纯化的蛋白质
N.D.-指“未测定”
对称作“BdF1”的Fab抗体进行的X-射线晶体结构分析揭示了在其结合人DR5受体时,抗体的CDR-H3区与DR5受体中与Apo2L/TRAIL结合位点交叠的一个区域大面积接触,而且该CDR-H3区中的残基掩埋在界面中。(Apo-2L/TRAIL和DR5之间形成的复合物的晶体结构描述在Hymowitz等人,
Molecular Cell,
4:563-571(1999)中;还可参见2001年3月22日公开的WO 01/19861)。虽然尚未完全理解,认为这可能代表了DR5受体表面上用于结合的潜在热点,它被Apo-2配体/TRAIL和实施例3中描述的噬菌体展示技术中鉴定的Fab抗体利用。
实施例7:选定抗体的体外生物学分析
在96孔组织培养板(Falcon)中对对照标准物和抗体“BdF2”进行两倍连续稀释(参见图8)。测试Apo-2配体(氨基酸114-281,在PCT US00/17579中描述),用作比较。将Colo-205(20000个细胞/孔)人结肠癌细胞(ATCC)接种到96孔板中。将平板在37℃温育24小时。在24小时温育时间的最后3小时,将AlamarBlue(Trek Diagnostic Systems,Inc.)加到孔中。用96孔荧光计读取荧光,530nm激发和590nm发射。结果以相对荧光单位(RFU)表示。对于数据分析,使用4参数曲线拟合程序(Kaleidagraph)。
生物测定的结果示于图10。
本发明不限于在此描述的具体实施方案的范围。实际上,对本领域技术人员来说,根据前面的描述和附图,除了在此描述的那些实施方案,对本发明的各种修改将是显然的。这类修饰意图落入所附权利要求书的范围内。
表
9:实施例测定法中所使用的试剂的多肽序列
1.人DR5-ECD多肽
MSALLILALVGAAVADYKDDDDKLSALITQQDLAPQQRVAPQQKRSSPSEGLCPPGHH
ISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFR
EEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEAPAVEETVTSSP
GTPASPCSLS (SEQ ID NO:154)
2.人DR4-IgG融合多肽
MAPPPARVHLGAFLAVTPNPGSAASGTEAAAATPSKVWGSSAGRIEPRGGGRGALPTS
MGQHGPSARARAGRAPGPRPAREASPRLRVHKTFKFVVVGVLLQVVPSSAATIKLHD
QSIGTQQWEHSPLGELCPPGSHRSERPGACNRCTEGVGYTNASNNLFACLPCTACKSD
EEERSPCTTTRNTACQCKPGTFRNDNSAEMCRKCSTGCPRGMVKVKDCTPWSDIECV
HKESGNGHNDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN
KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK (SEQ ID NO:155)
3.人DR5-IgG融合多肽
MEQRGQNAPAASGARKRHGPGPREARGARPGLRVPKTLVLVVAAVLLLVSAESALIT
QQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLR
CTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTP
WSDIECVHKESGLAFQDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE
YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN
HYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:156)
4.猕猴DR4-IgG融合多肽
MGQQGPSAQARAGRVVGPRSAQGASPGLRVHKTLKFVVVGVLLQVVPGSAATIKVH
DQSVGTQQWEHSPLGELCPPGSHRSEHSGACNQCTEGVGYTSASNNLFSCLPCTACKS
DEEERSACTRTRNTACQCKPGTFRNDDSAEMCRKCSTGCPRGKVKVKDCTPWSDIEC
VHNESGNGHNVWAILIVTVVILVVLLLLVAVLMFCRRIGSGCGGNPKCMHRVFLWCL
GLLRGPGAEDNAHNMILNHGDSLSTFISEQQMESQEPADLTGVTVQSPGEAQCLLGPA
EPEGSQRRRLLVPANGADPTETMMLFFDNFADIVPFNSWDQLMRQLGLTNNEIHMVR
ADTAGPGDALYAMLMKWVNKTGQDASIHTLLDALERIGERHAKERIQDLLVDSGKFI
YVEDGTGSAVSLE (SEQ ID NO:157)
5.猕猴DR5-IgG融合多肽
MGQLRQSAPAASVARKGRGPGPREARGARPGLRVLKTLVLVVAAARVLLSVSADCAP
ITRQSLDPQRRAAPQQKRSSPTEGLCPPGHHISEDSRECISCKYGQDYSTHWNDFLFCLR
CTKCDSGEVEVNSCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEICRKCRTGCPRGMVKVKDCTPW
SDIECVHKESGIIIGVIVLVVIVVVTVIVWKTSLWKKVLPYLKGVCSGDGGDPEHVDSSS
HSPQRPGAEDNALNEIVSIVQPSQVPEQEMEVQEPAEQTDVNTLSPGESEHLLEPAKAE
GPQRRGQLVPVNENDPTETLRQCFDDFAAIVPFDAWEPLVRQLGLTNNEIKVAKAEAA
SSRDTLYVMLIKWVNKTGRAASVNTLLDALETLEERLAKQKIQDRLLSSGKFMYLEDN
ADSATS (SEQ ID NO:158)
Claims (13)
1.分离的抗DR5抗体,包含图6、7或8所列一种或多种氨基酸序列。
2.分离的抗DR5抗体,包含重链和轻链,其中所述重链包含可变区,该可变区包含图6、7或8所列一种或多种氨基酸序列。
3.权利要求2的抗体,其中所述重链和轻链通过柔性接头连接形成单链抗体。
4.权利要求3的抗体,其是单链Fv抗体。
5.权利要求2的抗体,其是Fab抗体。
6.权利要求2的抗体,其完全是人源的。
7.权利要求1或权利要求2的抗体,其特异性结合DR5受体而不结合DR4受体、DcR1受体或DcR2受体。
8.权利要求1或权利要求2的抗体,其在至少一类哺乳动物癌细胞中诱导凋亡。
9.权利要求1或权利要求2的抗体,其阻断或抑制Apo-2配体结合DR5受体。
10.一种组合物,其包含权利要求1-9任一项的抗体和载体。
11.治疗哺乳动物病症的方法,包括施用权利要求10的组合物。
12.权利要求11的方法,其中所述病症是免疫相关病症。
13.权利要求11的方法,其中所述病症是癌症。
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