ES2328234T3

ES2328234T3 - Anticuerpos dr4 humanos y utilizaciones de los mismos.

Info

Publication number: ES2328234T3
Application number: ES02805988T
Authority: ES
Inventors: Anan Chuntharapai; Kyung Jin Kim
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2001-07-03
Filing date: 2002-06-29
Publication date: 2009-11-11
Anticipated expiration: 2022-06-29
Also published as: US7252994B2; JP4509570B2; US7744881B2; EP1409544A2; AU2002366430B2; EP2192130A1; CA2451680A1; PT1409544E; JP2005517021A; IL159527A0; DK1409544T3; WO2003066661A2; CA2451680C; DE60232660D1; WO2003066661A3; AU2008260311A1; EP1409544B1; HK1065323A1; ATE433996T1; AU2002366430A1

Abstract

Anticuerpo monoclonal anti-DR4 humano, que comprende un anticuerpo que se une a un receptor DR4 que comprende los aminoácidos 1 a 218 de SEQ 10 NO:1, en el que el anticuerpo se une al mismo epítope receptor DR4 al cual se une el anticuerpo monoclonal producido mediante el hibridoma depositado como ATCC PTA-3359 o ATCC PTA-3360 o ATCC PTA-3361 y tiene una afinidad de unión a dicho receptor DR4 de por lo menos 10 6 M-1 a 10 12 M -1 , e inhibe la unión de ligando Apo-2 al receptor DR4 e induce la apóptosis al unirse al receptor DR4 en por lo menos un tupo de célula de mamífero.

Description

Anticuerpos DR4 humanos y utilizaciones de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a anticuerpos DR4 humanos, incluyendo anticuerpos que pueden ser anticuerpos agonísticos, antagonísticos o de bloqueo.

Antecedentes de la invención

Varias moléculas, tales como factor-\alpha de necrosis tumoral ("TNF-\alpha"), factor-\beta de necrosis tumoral ("TNF-\beta" o "linfotoxina-\alpha"), linfotoxina-\beta ("LT-\beta"), ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40, ligando OX-40, ligando 4-1BB, ligando Apo-1 (también llamado como ligando Fas o ligando CD95), ligando Apo-2 (también llamado como TRAIL), ligando Apo-3 (también llamado como TWEAK), APRIL, ligando OPG (también llamado como ligando RANK, ODF, o TRANCE), y TALL-1 (también llamado como BlyS, BAFF o THANK) se han identificado como elementos la familia de citocinas del factor de necrosis tumoral ("TNF") [Ver, por ejemplo, Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992), WO 97/01633 publicada el 16 de enero de 1997; WO 97/25428 publicada el 17 de julio de 1997; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); WO98/28426 publicada el 2 de julio de 1998; WO98/46751 publicada el 22 de octubre de 1998; WO/98/18921 publicada el 7 de mayo de 1998; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)]. Entre estas moléculas, TNF-\alpha, TNF-\beta, ligando CD30, ligando 4-1BB, ligando Apo-1, ligando Apo-2 (Apo2L/TRAIL) y ligando Apo-3 (TWEAK) se han indicado que están implicadas en la muerte celular apoptótica.

El Apo2L/TRAIL se identificó hace varios años como miembro de la familia TNF de las citocinas. [ver, por ejemplo, Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996)]. El polipéptido Apo2L/TRAIL humano de longitud completa es una proteína transmembrana de tipo II con una longitud de 281 aminoácidos. Algunas células pueden producir una forma soluble natural del polipéptido, a través de división enzimática de la región extracelular del polipéptido [Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)]. Los estudios cristalográficos de las formas solubles de Apo2L/TRAIL revelan una estructura homotrimérica similar a las estructuras de TNF y otras proteínas relacionadas [Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)]. El Apo2L/TRAIL, a diferencia de otros miembros de la familia TNF, sin embargo, se encontró que tenía una característica estructural única en que tres residuos de cisteína (en la posición 230 de cada subunidad en el homotrímero) juntos coordinan un átomo de zinc, y que la unión del zinc es importante para la estabilidad del trímero y la actividad biológica. [Hymowitz et al., supra; Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)]. Se ha indicado en la literatura que el Apo2L/TRAIL puede jugar un papel en la modulación del sistema inmune, incluyendo enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide [ver, por ejemplo, Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)].

También se han indicado formas solubles de Apo2L/TRAIL para inducir la apóptosis en una variedad de células cancerígenas in vitro, incluyendo tumores de colon, pulmón, mama, próstata, vejiga, riñón, ovario y cerebro, así como melanoma, leucemia, y mieloma múltiple [ver, por ejemplo, Wiley et al., supra; Pitti et al., supra; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)]. Los estudios in vivo en los modelos de tumores de murina también sugieren que el Apo2L/TRAIL, aislado o en combinación con terapia de quimioterapia o radiación, puede ejercer efectos substanciales contra los tumores [ver, por ejemplo, Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra; Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., supra; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)]. A diferencia de muchos tipos de células cancerígenas, la mayoría de tipos de células humanas normales parecen que son resistentes a la inducción de apóptosis mediante ciertas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL [Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra]. Jo et al. ha indicado que una forma soluble marcada con polihistidina de Apo2L/TRAIL indujo la apóptosis in vitro en hepatocitos humanos aislados normales, pero no humano [Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); ver también, Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)]. Se cree que ciertas preparaciones de Apo2L/TRAIL recombinante pueden variar en términos de propiedades bioquímicas y actividades biológicas en células enfermas respecto a las células normales, dependiendo, por ejemplo, de la presencia o ausencia de una molécula de marca, contenido de zinc, y % de contenido de trímero [Ver, Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)].

Las diferentes moléculas en la familia TNF también han tenido papel(es) en la función o el desarrollo del sistema inmune [Gruss et al., Blood, 85:3378 (1995)]. Zheng et al. han indicado que el TNF-\alpha está implicado en la apóptosis posterior a la estimulación de las células T positivas CD8 [Zheng et al., Nature, 377:348-351 (1995)]. Otros investigadores han indicado que el ligando CD30 puede estar implicado en la eliminación de células T autoreactivas en el timo [Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Abstr. No. 10, (1995)]. El ligando CD40 activa cualquier función de las células B, incluyendo la proliferación, secreción de inmunoglobulina, y supervivencia [Renshaw et al., J. Exp. Med., 180:1889 (1994)]. Se ha informado que otra citocina de la familia TNF identificada recientemente, TALL-1 (BlyS), induce la proliferación de células B y la secreción de inmunoglobulina. [Moore et al., supra; Schneider et al., supra; Mackay et al., J. Exp. Med., 190:1697 (1999)].

Las mutaciones en los genes de receptor o ligando Fas/Apo-1 de ratón (llamados lpr y gld, respectivamente) se han asociado con algunos desórdenes autoinmunes, que indican que el ligando Apo-1 puede jugar un papel en la regulación de la eliminación clónica de linfocitos autoreactivos en la periferia [Krammer et al., Curr. Op. Immunol., 6:279-289 (1994); Nagata et al., Science, 267:1449-1456 (1995)]. También se indica que el ligando Apo-1 induce apóstosis posterior a la estimulación en linfocitos T positivos CD4 y en linfocitos B, y puede estar implicado en la eliminación de linfocitos activados cuando su función ya no es necesaria [Krammer et al., supra; Nagata et al., supra]. Se han indicado anticuerpos monoclonales de ratón agonista que se unen específicamente al receptor Apo-1, que presentan una actividad para matar células que es comparable o similar a la del TNF-\alpha [Yonehara et al., J. Exp. Med., 169:1747-1756 (1989)].

El ligando relacionado con TNF llamado ligando OPG (también llamado como ligando RANK, TRANCE, o ODF) se ha indicado en la literatura como que tiene alguna implicación en ciertas actividades inmunoreguladoras. El documento WO98/28426 publicado el 2 de julio de 1998 describe el ligando (llamado aquí como ligando RANK) como una proteína transmembrana de tipo 2, que en una forma soluble se ha encontrado que induce la maduración de células dendríticas, mejorar la capacidad aloestimulatoria de las células dendríticas Cdla+ en un MLR, y mejora el número de células T de sangre periférica humana viables in vitro en presencia de TGF-beta. [ver también, Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997)]. La referencia WO98/28426 también describe la producción mejorada de ligando de TNF-alpha mediante una línea celular de tumor macrófago (llamada RAW264.7; ATCC TIB71), pero no estimula la producción de óxido nítrico mediante esas células tumorales.

Los papeles putativos de del ligando OPG/TRANCE/ODF en la modulación de la actividad de las células dendríticas [ver, por ejemplo, Wong et al., J. Exp. Med., 186:2075-2080 (1997); Wong et al., J. Leukocyte Biol., 65:715-724 (1999); Josien et al., J. Immunol., 162:2562-2568 (1999); Josien et al., J. Exp. Med., 191495-501 (2000)] y en la influencia de la activación de las células T en una respuesta inmune [ver, por ejemplo, Bachmann et al., J. Exp. Med., 189:1025-1031 (1999); Green et al., J. Exp. Med., 189:1017-1020 (1999)] han sido explorados en la literatura. Kong et al., Nature, 397:315-323 (1999) indica que los ratones con un gen opgl transtornado mostró una osteoporosis severa, osteoclastos faltantes, y presentó defectos en la diferenciación temprana de linfocitos T y B. Kong et al. también han informado que la activación sistémica de las células T in vivo provocaban un aumento mediado con OPGL en la osteoclastogénesis y en la pérdida ósea [Kong et al., Nature, 402:304-308 (1999)].

La inducción de varias respuestas celulares mediadas mediante estas citocinas de familia TNF se cree que se inicia mediante su unión a receptores celulares específicos. Previamente, se identificaron dos receptores TNF distintos de aproximadamente 55-kDa (TNFR1) y 75-kDa (TNFR2) [Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); EP 417 563, publicada el 20 de marzo de 1991; Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991)]. Se encontraron que aquellos TNFRs compartían la estructura típica de los receptores de superficie celular incluyendo regiones extracelulares, transmembrana e intracelulares. Las porciones extracelulares de ambos receptores se encontraron de manera natural también como proteínas de unión TNF solubles [Nophar, Y. et al., EMBO J., 9:3269 (1990); and Kohno, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:8331 (1990); Hale et al., J. Cell. Biochem. Supplement 15F, 1991, p. 113 (P424)].

La porción extracelular de TNFRs de tipo 2 y tipo 2 (TNFR1 y TNFR2) contiene un diseño de secuencia de aminoácido repetitiva de cuatro dominios ricos en cisteína (CRDs) designados 1 a 4, empezando desde el terminal NH_{2}. [Schall et al., supra; Loetscher et al., supra; Smith et al., supra; Nophar et al., supra; Kohno et al., supra; Banner et al., Cell, 73:431-435 (1993)]. Un diseño repetitivo similar de CRDs existe en varias otras proteínas de superficie celular, incluyendo el receptor de factor de crecimiento de nervios p75 (NGFR) [Johnson et al., Cell, 47:545 (1986); Radeke et al., Nature, 325:593 (1987)], el antígeno celular B CD40 [Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403 (1989)], el antígeno celular T OX40 [Mallet et al., EMBO J., 9:1063 (1990)] y el antígeno Fas [Yonehara et al., supra y Itoh et al., Cell, 66:233-243 (1991)]. Los CRDs también se encuentran en las proteínas T2 a modo de (sTNFR) TNFR solubles de los poxvirus Shope y mixoma [Upton et al., Virology, 160:20-29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:335 (1991); Upton et al., Virology, 184:370 (1991)]. La alineación óptima de estas secuencias indica que las posiciones de los residuos de cisteína están bien conservados. Estos receptores se indican de manera colectiva como miembros de la superfamilia de receptores TNF/NGF.

Los ligandos de la familia TNF identificados hasta la fecha, con la excepción de la linfotoxina-\alpha, son típicamente proteínas de transmembrana de tipo II, cuyo terminal C es extracelular. Por el contrario, la mayoría de receptores en la familia de los receptores TNF (TNFR) identificados hasta la fecha son típicamente proteínas de transmembrana de tipo I. En las familias de ligandos y receptores TNF, sin embargo, la homología identificada entre los miembros de la familia se ha encontrado principalmente en el dominio extracelular ("ECD"). Varias de las citocinas de la familia TNF, incluyendo TNF-\alpha, ligando Apo-1 y ligando CD40, están divididos de manera proteolítica en la superficie celular; la proteína resultante en cada caso típicamente forma una molécula homotrimérica que funciona como una citosina soluble. Las proteínas de la familia de receptores TNF están también divididas usualmente de manera proteolítica para liberar ECDs de receptores solubles que pueden funcionar como inhibidores de las citocinas cognadas.

El miembro de la familia TNFR, llamado como RANK, se ha identificado como un receptor para el ligando OPG (ver WO98/28426 publicada el 2 de julio de 1998; Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997); Lacey et al., Cell, 93:165-176 (1998)). Otra molécula relacionada con TNFR, llamada OPG (FDCR-1 o OCIF), también se ha identificado como un receptor para el ligando OPG. [Simonet et al., Cell, 89:309 (1997); Yasuda et al., Endocrinology, 139:1329 (1998); Yun et al., J. Immunol., 161:6113-6121 (1998)]. Yun et al., supra, describe que el OPG/FDCR-1/OCIF se expresa en una forma unida a la membrana y una forma secretada y tiene un diseño de expresión restringida en células del sistema inmune, incluyendo células dendríticas, líneas celulares B transformadas EBV y células B tonsilares. Yun et al. también describe que en células B y células dendríticas, la expresión del OPG/FDCR-1/OCIF se puede regular mediante CD40, una molécula implicada en la activación de células B. Sin embargo, Yun et al. acepta que se desconoce cómo funciona el OPG/FDCR-1/OCIF la regulación de la respuesta inmune.

Más recientemente, se han identificado otros miembros de la familia TNFR. En von Bulow et al., Science, 278:138-141 (1997), los investigadores describen un receptor de membrana de plasma indicado como activador de transmembrana e interactor CAML o "TACI". El receptor TACI se indica que contiene un motivo rico en cisteína característico de la familia TNFR. En un ensayo in vivo, la reticulación TACI sobre la superficie de las células Jurkat transfectadas con anticuerpos específicos TACI provocó la activación de NF-KB. [ver también, WO 98/39361 publicada el 18 de septiembre de 1998].

Laabi et al., EMBO J., 11:3897-3904 (1992) indicó la identificación de un nuevo gen llamado "BCM" cuya expresión se encontró que coincide con la maduración del terminal de las células B. El marco de lectura abierta del ADNc normal del BCM predijo un polipéptido con una longitud de 184 aminoácidos con un único dominio de transmembrana. Estos investigadores posteriormente llamaron a este gen "BCMA" [Laabi et al., Nucleic Acids Res., 22:1147-1154 (1994)]. La expresión del ARNm del BCMA se informó que estaba ausente en líneas de células B malignas humanas, que presentan la etapa de linfocitos pro-B, y así, se cree que está vinculado con la etapa de diferenciación de linfocitos [Gras et al., Int. Immunology, 7:1093-1106 (1995)]. En Madry et al., Int. Immunology, 10:1693-1702 (1998), se describió la clonación de ADNc del BCMA de murina. Se indica que el ADNc del BCMA de murina codifica un polipéptido con una longitud de 185 aminoácidos que tiene un 62% de identidad con el polipéptido del BCMA humano. La alineación de la murina y las secuencias de proteínas de BCMA humano revelaron un motivo conservado de seis cisteínas en la región del terminal N, sugiriendo que la proteína del BCMA pertenece a la superfamilia TNFR [Madry et al., supra].

En Marsters et al., Curr. Biol., 6:750 (1996), los investigadores describen un polipéptido humano de secuencia nativa de longitud completa, llamado Apo-3, que presenta similitudes con la familia TNFR en sus repeticiones extracelulares ricas en cisteína y se parece al TNFR1 y CD95 en que contiene una secuencia de dominio de muerte citoplásmica [ver también Marsters et al., Curr. Biol., 6:1669 (1996)]. Apo-3 también ha sido citada por otros investigadores como DR3, wsl-1, TRAMP, y LARD [Chinnaiyan et al., Science, 274:990 (1996); Kitson et al., Nature, 384:372 (1996); Bodmer et al., Immunity, 6:79 (1997); Screaton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:4615-4619 (1997)].

Pan et al. ha descrito otro elemento de la familia del receptor TNF llamado como "DR4" [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); ver también WO98/32856 publicada el 30 de julio de 1998]. Se indicó que el DR4 contiene un dominio de muerte citoplásmica capaz de acoplarse al aparato suicida de la célula. Pan et al. describe que se cree que el DR4 es un receptor para el ligando conocido como Apo2L/TRAIL.

En Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) y Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), se describe que se cree que otra molécula es un receptor para Apo2L/TRAIL [ver también, WO98/51793 publicada el 19 de noviembre de 1998; WO98/41629 publicada el 24 de septiembre de 1998]. Esa molécula es llamada como DR5 (también se ha llamado alternativamente como Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 o KILLER [Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO98/35986 publicada el 20 de agosto de 1998; EP 870 827 publicada el 14 de octubre de 1998; WO98/46643 publicada el 22 de octubre de 1998; WO99/02653 publicada el 21 de enero de 1999; WO99/09165 publicada el 25 de febrero de 1999; WO99/11791 publicada el 11 de marzo de 1999]. Como el DR4, se indica que el DR5 contiene un dominio de muerte citoplásmica y es capaz de apóptosis de señalización. La estructura cristalina del complejo formado entre Apo-2L/TRAIL y DR5 se describe en Hymowitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1999).

Otro receptor que contiene dominio de muerte, DR6, se identificó recientemente [Pan et al., FEBS Letters, 431:351-356 (1998)]. Además de contener cuatro dominios extracelulares putativos ricos en cisteína y un dominio de muerte citoplásmica, el DR6 se cree que contiene una secuencia de cierre de leucina putativa que se solapa con un motivo rico en prolina en la región citoplásmica. El motivo rico en prolina se parece a secuencias que se unen a dominio de src-homología-3, que se encuentran en muchas moléculas de transducción de señal intracelulares. A diferencia de otros receptores que contienen dominios de muerte indicados anteriormente, el DR6 no induce la muerte celular en la línea celular del indicador sensible a la apóptosis, MCF-7, sugiriendo una función alternativa para este receptor. Consistente con esta observación, el DR6 se cree actualmente que no se asocia con moléculas de adaptador que contienen dominios de muerte, tales como FADD, RAIDD y RIP, que media en la señalización posterior desde los receptores de muerte activados [Pan et al., FEBS Lett., 431:351 (1998)].

Otro grupo de receptores recientemente identificados se indican como "receptores de reclamo", que se creen que funcionan como inhibidores, más que como transductores de señalización. Este grupo incluye DCR1 (también llamado TRID, LIT o TRAIL-R3) [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334, (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); y Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998)] y DCR2 (también llamado TRUNDD o TRAIL-R4) [Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)], ambas moléculas de la superficie celular, así como OPG [Simonet et al., supra; Emery et al., infra] y DCR3 [Pitti et al., Nature, 396:699-703 (1998)], las cuales son proteínas solubles secretadas.

Los elementos adicionales nuevamente identificados de la familia TNFR incluyen CAR1, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1, y TNFL1 [Brojatsch et al., Cell, 87:845-855 (1996); Montgomery et al., Cell, 87:427-436 (1996); Marsters et al., J. Biol. Chem., 272:14029-14032 (1997); Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6216-6221 (1997); Emery et al., J. Biol. Chem., 273:14363-14367 (1998); WO99/04001 publicada el 28 de enero de 1999; WO99/07738 publicada el 18 de febrero de 1999; WO99/33980 publicada el 8 de julio de 1999].

Tal como se ha revisado recientemente por parte de Tewari et al., TNFR1, TNFR2 y CD40 modulan la expresión de citocinas proinflamatorias y costimulatorias, receptores de citosina, y moléculas de adhesión celular a través de la activación del factor de transcripción, NF-\kappaB [Tewari et al., Curr. Op. Genet. Develop., 6:39-44 (1996)]. NF-\kappaB es el prototipo de una familia de factores de transcripción diméricos cuyas subunidades contienen regiones Rel conservadas [Verma et al., Genes Develop., 9:2723-2735 (1996); Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14:649-681 (1996)]. En su forma latente, el NF-\kappaB es complejo con elementos de la familia del inhibidor I\kappaB; bajo la inactivación del I\kappaB en respuesta a ciertos estímulos, el NF-\kappaB liberado se desplaza al núcleo, donde se une a secuencias de ADN específicas y activa la transcripción génica. Tal como se ha descrito anteriormente, los elementos TNFR identificados hasta la fecha incluyen o no una región de dominio de muerte intracelular. Algunas moléculas de TNFR que no disponen de un dominio de muerte, tal como TNFR2, CD40, HVEM, y GITR, son capaces de modular la actividad del NF-\kappaB. [ver, por ejemplo, Lotz et al., J. Leukocyte Biol., 60:1-7 (1996)].

Para una revisión de la familia TNF de citocinas y sus receptores, ver Ashkenazi y Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997); Gruss y Dower, supra, Nagata, Cell, 88:355-365 (1997); y Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001). El documento WO 00/73349 describe anticuerpos anti DR4 de ratón. El anticuerpo 4H6, actualmente utilizado por comparación, se describe en este documento.

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción de la invención

La invención proporciona anticuerpos DR4 humanos que son capaces de unirse específicamente a DR4 humano y/o son capaces de modular actividades biológicas asociadas con DR4 y/o su(s) ligando(s), en particular apóptosis, y así son útiles en el tratamiento de varias enfermedades y condiciones patológicas, incluyendo cáncer o enfermedades inmunes relacionadas, tal como se define en las reivindicaciones.

La invención aquí descrita tiene una serie de realizaciones. Una realización típica de la invención es un anticuerpo anti-DR4 aislado que tiene las mismas características biológicas de un anticuerpo monoclonal producido mediante una línea celular de hibridoma seleccionada entre el grupo que consiste en American Type Culture Collection Accession Numbers: PTA-3359, PTA-3360 and PTA-3361. La invención proporciona un anticuerpo monoclonal receptor anti-DR4 aislado, que comprende un anticuerpo que se une a un receptor DR4 que comprende los aminoácidos 1 a 218 de SEQ ID NO:1 e inhible de manera competitiva la unión de un anticuerpo monoclonal producido mediante un hibridoma despositado como PTA-3359, PTA-3360 o PTA-3361 en el receptor DR4, se une al mismo epítope del receptor DR4 al cual se une un anticuerpo monoclonal producido mediante un hibridoma depositado como PTA-3359, PTA-3360 o PTA-3361, que tiene una afinidad de unión con el receptor DR4 de por lo menos 10^{8} M^{-1} a 10^{12} M^{-1}, es un anticuerpo humano, que inhibe la unión del ligando Apo-2 que comprende los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO: 3 al receptor DR4 que comprende los aminoácidos 1 a 218 de SEQ ID NO:1, e induce la apóptosis en por lo menos un tipo de célula de mamífero. Las realizaciones específicas de la invención incluyen los hibridomas depositados como ATCC PTA-3359, PTA-3360 y PTA-3361. Realizaciones específicas relacionadas de la invención incluyen los anticuerpos monoclonales producidos mediante los hibridomas depositados como ATCC PTA-3359, PTA-3360 y PTA-3361. Típicamente, los anticuerpos del receptor anti-DR4 del ligando Apo-2 del bloque de la invención indujeron apóptosis en por lo menos un tipo de células de mamífero. En una realización opcional, los anticuerpos de receptor anti-DR4 de la invención neutralizan la actividad apoptótica del ligando Apo-2 que comprende los aminoácidos 114-281 de SEQ ID NO:3 en por lo menos un tipo de células cancerígenas de mamífero. Preferiblemente, las células cancerígenas de mamífero son células cancerígenas de colon o colorectales, células de cáncer de mama, o células de cáncer de pulmón (células pequeñas o células no pequeñas). Típicamente, los anticuerpos del receptor anti-DR4 aquí descrito, al unirse al receptor DR4 expresado en una célula de mamífero, activan una o más moléculas seleccionadas entre el grupo que consiste en caspasa 3, caspasa 8, caspasa 10 y FADD en el citoplasma de la célula de mamífero. Realizaciones muy preferidas de la invención incluyen un anticuerpo monoclonal del receptor anti-DR4 aislado, que comprende un anticuerpo que se une al receptor DR4 que comprende los aminoácidos 1 a 218 de SEQ ID NO:1, inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo monoclonal producido mediante un hibridoma depositado como ATCC PTA-3359, PTA-3360 o PTA-3361 en el receptor DR4 e induce la apóptosis en por lo menos un tipo de célula de mamífero. En realizaciones representativas, las células de mamífero son células cancerígenas, típicamente de cáncer de colon o colorectal, células de cáncer de mama, o células de cáncer de pulmón (células pequeñas o células no pequeñas). En una realización específica, las células de mamífero son células 9D.

Otra realización de la invención es un anticuerpo monoclonal del receptor de anti-DR4 aislado, que comprende un anticuerpo que se une al receptor de DR4 que comprende los aminoácidos 1 a 218 de SEQ ID NO:1, en el que el anticuerpo inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo monoclonal producido mediante el hibridoma depositado como ATCC PTA-3359, PTA-3360 o PTA-3361 con el receptor DR4, y en el que el anticuerpo inhibe la unión del ligando Apo-2 que comprende los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO:3 con el receptor DR4 que comprende los aminoácidos 1 a 218 de SEQ ID NO:1, y también en el que, al unirse al receptor DR4 expresado en una célula de mamífero, activa una o más moléculas seleccionadas entre el grupo que consiste en caspasa 3, caspasa 8, caspasa 10 y FADD en el citoplasma de una célula de mamífero.

Realizaciones adicionales de la invención incluyen un anticuerpo receptor anti-DR4 aquí descrito que está vinculado con uno o más polímeros no-proteináceos seleccionados entre el grupo que consiste en polietileno glicol, polipropileno glicol, y polioxialquileno. En una realización alternativa, un anticuerpo receptor anti-DR4 aquí descrito está vinculado con un agente o enzima citotóxica. En otra realización un anticuerpo receptor anti-DR4 aquí descrito está vinculado con un radioisótopo, un compuesto fluorescente o un compuesto quemiluminiscente. Opcionalmente, un anticuerpo receptor anti-DR4 aquí descrito es glicosilatado o alternativamente, no glivosilatado.

Otra realización de la invención incluye la utilización de un anticuerpo anti-DR4 aquí descrito para la preparación de un medicamento para inducir apóptosis en células de mamíferos. En estos procedimientos, las células de mamífero son típicamente células cancerígenas. El anticuerpo receptor anti-DR4 utilizando en estos procedimientos es un anticuerpo humano.

La invención también proporciona composiciones que comprenden uno o más anticuerpos DR4 y un portador, tal como un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición se puede incluir en un artículo de fabricación o equipo.

Se prevén procedimientos terapéuticos para la utilización de anticuerpos DR4.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-1B muestran la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:2) de un ADNc para DR4 humano de longitud completa y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:1). Las respectivas secuencias de nucleótidos y aminoácidos también se indican en Pan et al., Science, 276:111 (1997).

La figura 2 es un gráfico que muestra los resultados de un ELISA de prueba del título de anticuerpos DR4 y CD4-IgG endógenos en suero de xenoratón.

Las figuras 3A y 3B son gráficos que muestran la reactividad de los anticuerpos anti-DR4 1E10, 1G11, y 2A2 con DR4-IgG y Apo-2-IgG.

La figura 4 muestra los resultados de un ensayo (PARP) (poli (ADP-ribosa) polimerasa) (PARP). En este ensayo, se incubaron células 9D en 1,0 \mug de anti DR4 humano y se reticularon con IgG Fc anti humano. Durante la apóptosis, la PARP se separó del 116 kD de 116 kD a 85 y 26 kD. La separación de la PARP se considera que es un marcado temprano de apóptosis.

Las figuras 5A-5F muestra el análisis FACS de los anticuerpos anti-DR4 4H6 y 1G11 en un ensayo de apóptosis mediante teñido con anexina V.

La figura 6 es un gráfico que muestra la inducción de apóptosis en células 9D variando las concentraciones de anticuerpos anti-DR4 de murina 4H6 y hu1G11.

Las figuras 7A-7B son gráficos de barras que muestran los resultados de un ELISA que evalúa el mapa de epítope de anticuerpos anti-DR4 1E10, 1G11 y 2A2 en mu4H6.

La figura 8 es un gráfico que muestra los resultados de un ELISA que prueba la capacidad de los anticuerpos DR4 1E10, 2A2 y 1G11 de bloquear la unión de la biotina-Apo2L a DR4-IgG.

Las figuras 9A-9C son gráficos que muestra la inducción de muerte celular en células SK-MES variando las concentraciones de anticuerpos anti-DR4 2A2, 1G11, y 1E10.

Las figuras 10A-10C son gráficos que muestran la inducción de muerte celular en células H460 variando las concentraciones de anticuerpos anti-DR4 2A2, 1G11, y 1E10.

Las figuras 11A-11C son gráficos que muestra la inducción de muerte celular en células Colo205 variando las concentraciones de anticuerpos anti-DR4 2A2, 1G11, y 1E10.

Las figuras 12A-12C son gráficos que muestra la inducción de muerte celular en células MDA-MB-231 variando las concentraciones de anticuerpos anti-DR4 2A2, 1G11, y 1E10.

Las figuras 13A-13C son gráficos que muestran la inducción de muerte celular en células de rabdomiosarcoma KYM-1 variando las concentraciones de anticuerpos anti-DR4 2A2, 1G11, y 1E10.

La figura 14 muestra los resultados de un ensayo de activación de caspasa y western blot que muestra la activación del anticuerpo DR4 de las caspazas 8 y 3.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Tal como se usa aquí, el término "ligando Apo-2" o "Apo-2L" (también conocido como TRAIL) se refiere a un elemento específico de la familia de ligandos de factor de necrosis tumoral (TNF) que, entre otras cosas, induce la apóptosis en una variedad de células cancerígenas [ver WO 97/25428 publicada el 17 de julio de 1997; WO97/01633 publicada el 16 de enero de 1997; Pitti et al., J. Biol. Chem, 271:12687 (1996); Marsters et al., Curr. Biol., 6:79 (1997); Wiley, S. et al., Immunity, 3:637 (1995)]. El término Apo-2L tal como se usa aquí incluye polipéptidos descritos en esas referencias, así como fragmentos adicionales y variantes de los mismos que son biológicamente activos en términos de unión a por lo menos uno de los receptores DR4, Apo-2 (DR-5), DcR1 o DcR2 o capaces de inducir apóptosis en por lo menos un tipo de célula de mamífero. Opcionalmente, para propósitos de los ensayos biológicos aquí descritos, el ligando Apo-2 es un polipéptido que tiene los aminoácidos 114-281 (SEQ ID NO: 3) y no incluye una secuencia de marca de epítope (ver, por ejemplo, el ligando Apo-2 descrito en Ashkenazi et al., J. Clin. Invest. 104: 155-162 (1999).

Un receptor para Apo-2L se ha identificado e indicado como DR4, un elemento de la familia de receptores de TNF que contiene un "dominio de muerte" citoplasmático capaz de acoplar el aparato suicida celular [ver Pan et al., Science, 276:111 (1997)]. El DR4 también se ha descrito en el documento WO98/32856 publicado el 30 de julio de 1998. El término "Receptor de Muerte 4" o "DR4" cuando se utiliza aquí abarca el DR4 de secuencia nativa y variantes de DR4 (que también se definen aquí). Estos términos abarcan DR4 expresado en una variedad de mamíferos, incluyendo humanos. El DR4 se puede expresar de manera endógena como se produce de manera natural en una variedad de líneas de tejido humano, o se puede expresar mediante procedimientos recombinantes o sintéticos. Un "DR4 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácido que un DR4 derivado de la naturaleza. Así, un DR4 de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácido de DR4 que se produce de manera natural a partir de cualquier mamífero. Este DR4 de secuencia nativa se puede aislar de la naturaleza o se puede producir mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "R4 de secuencia nativa" abarca específicamente formas truncadas o secretadas que se producen de manera natural del DR4 (por ejemplo, una forma soluble que contiene, por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas variantes que se producen de manera natural (por ejemplo, formas empalmadas alternativamente) y variantes alélicas que se producen de manera natural del DR4. En una realización de la invención, el DR4 de secuencia nativa es un DR4 de secuencia nativa maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 468 de la figura 1 (SEQ ID NO:1).

Los términos "dominio extracelular" o "ECD" se refieren aquí a una forma de DR4 que está esencialmente libre los dominios de transmembrana y citoplásmicos del DR4. Ordinariamente, el ECD del DR4 tendrá menos del 1% de estos dominios de transmembrana y/o citoplásmicos y preferiblemente tendrá menos del 0,5% de estos dominios. Opcionalmente, el ECD del DR4 comprenderá los residuos de aminoácido 1 a 218 o los residuos 24 a 218 de la figura 1 (SEQ ID NO:1).

"Variante de DR4" significa un DR4 biológicamente activo que tiene por lo menos una identidad de la secuencia de aminoácidos del 80% o 85% con el DR4 que tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO:1) para una secuencia nativa de longitud completa o secuencia de dominio extracelular de DR4 humano. Estas variantes de DR4 incluyen, por ejemplo, polipéptidos DR4 en los que se añaden uno o más residuos de aminoácido, o se eliminan (es decir, fragmentos), en el termina N o C de la secuencia de la figura 1 (SEQ ID NO:1). Ordinariamente, una variante de DR4 tendrá por lo menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 80% aproximadamente, más preferiblemente por lo menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 90% aproximadamente, e incluso más preferiblemente por lo menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 95% aproximadamente con la secuencia de aminoácidos de la figura 1 (SEQ ID NO:1).

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" respecto a las secuencias de DR4 (o secuencias de anticuerpos de DR4) aquí identificado se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácido en la secuencia DR4 (o secuencia de anticuerpos de DR4), después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de la secuencia, y no considerando cualquier sustitución conservativa como parte de la identidad de la secuencia. La alineación para propósitos de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos se puede conseguir de diferentes maneras que están dentro de los conocimientos de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente tal como ALIGN^{TM}, Megalign (DNASTAR), o ALIGN-2 (autoría de Genentech, Inc. y presentados en la U.S. Copyright Office el 10 de diciembre de 1991). El software ALIGN-2 está disponible públicamente por parte de Genentech, Inc. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de la secuencia se determinan mediante el programa ALIGN-2 y no varían. Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para la medición de la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la máxima alineación en toda la longitud de las secuencias que se comparan.

"Aislado", cuando se usa para describir los diferentes polipéptidos aquí descritos, significa un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podría interferir típicamente con usos de diagnóstico o terapéutico para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácido de terminal N o intensa mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) para homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones de no recucción o reducción usando Coomassie azul o, preferiblemente, tinte de plata. El polipéptido aislado incluye polipéptido in situ en células recombinantes, ya que por lo menos un componente del ambiente natural del DR4 o anticuerpo de DR4 no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que está identificada y separada de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual está ordinariamente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del polipéptido. Una molécula de ácido nucleico aislada es diferente en la forma o en el ajuste en el cual se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico porque existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido núcleo contenida en células que ordinariamente expresan el polipéptido donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una posición cromosómica diferente de las células naturales.

La "estringencia" de reacciones de hibridización se puede determinar fácilmente por parte de un experto en la materia, y generalmente es un cálculo empírico que depende de al longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas mayores para un recocido adecuado, mientras que sondas más cortas necesitan menores temperaturas. La hibridización generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado de volverse a recocer cuando cadenas complementarias están presentes en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de identidad deseada entre la sona y la secuencia que se puede hibridar, mayor será la temperatura relativa que se puede usar. Como resultado, sigue que temperaturas relativas mayores tenderán a hacer las condiciones de la reacción más estringentes, mientras temperaturas menores, menos. Para detalles adicionales y explicación de la estringencia de reacciones de hibridización, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Condiciones estringentes" o "condiciones de alta estringencia" tal como se definen aquí, se identifican mediante aquellas que: (1) utilizan baja resistencia iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo 0,015 M de cloruro de sodio/0,0015 M de citrato de sodio/0,1% de sultafo dodecil de sodio a 50ºC; (2) utilizan durante la hibridización un agentes desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo 50% (v/v) formamida con 0,1% de albúmica de suero bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50mM de tampón de fostato de sodio con pH 6,5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM de citrato de sodio a 42ºC; o (3) utilizan un 50% de formamida, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 6,8), 0,1% pirofosfato de sodio, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), 0,1% SDS, y 10% sulfato de dextrano a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% formamida a 55ºC, seguido por un lavado de alta estringencia de 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

"Condiciones moderadamente estringentes" se identifican como las descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold. Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de condiciones de solución de lavado e hibridización (por ejemplo, temperatura, resistencia iónica y %SDS) menos estringentes que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente estringentes es la incubación a lo largo de toda la noche a 37ºC en una solución que comprende: 20% formamida, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM citrato de trisodio), 50 mM fosfato de sodio (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, 10% sulfato de dextrano, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido por el lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, la resistencia iónica, etc. como sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de código enlazada de manera operativa en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión de ribosoma. Las células eucarióticas se conocen que usan promotores, señales de poliadenilación y mejoradores.

El ácido nucleico está "enlazado de manera operativa" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está enlazado de manera operativa con el ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador está enlazado de manera operativa a una secuencia de código si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosoma está enlazado de manera operativa a una secuencia de codificación si está colocado para facilitar la traducción. Generalmente, "enlazado de manera operativa" significa que las secuencias de ADN que están enlazadas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los mejoradores no han de ser contiguos. El enlace se realiza mediante ligado en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, se usan adaptadores o revestimientos de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional.

Los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los aminoácidos L-alfa que se producen naturalmente. Esta definición está pensada para incluir norleucina, ornitina, y homocisteína. Los aminoácidos se identifican mediante designaciones de una sola letra o de tres letras.

1

En el listado de secuencias y en las figuras se pueden utilizar otras designaciones de una sola letra o de tres letras para referirse e identificar dos o más aminoácidos o nucleótidos en una posición dada en la secuencia.

Los términos "agonista" y "agonístico" cuando se utilizan aquí se refieren o describen una molécula que es capaz de, directa o indirectamente, inducir, promover o mejorar substancialmente la actividad o activación biológica del DR4. Opcionalmente, un "anticuerpo de DR4 agonista" es un anticuerpo que tiene una actividad comparable con el ligando para el DR4, conocido como ligando Apo-2 (TRAIL), o es capaz de activar el receptor de DR4 que produce una activación de una o más trayectorias de señalización intracelular que pueden incluir la activación de caspasa 3, caspasa 8, caspasa 10 o FADD.

Los términos "antagonista" y "antagonístico" cuando se utilizan aquí se refieren o describen una molécula que es capaz, directa o indirectamente, de contrarrestrar, reducir o inhibir substancialmente la actividad biológica del DR4 o la activación del DR4. Opcionalmente, un antagonista es una molécula que neutraliza la actividad biológica resultante de la activación o formación del DR4 de un complejo entre el DR4 y su ligando, tal como ligando Apo-2.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales de anti-DR4 simples (incluyendo agonista, antagonista, y anticuerpos de neutralización o bloqueo) y composiciones de anticuerpos de anti-DR4 con especificidad poliepitópica. "Anticuerpo" tal como se usa aquí incluye inmonoglobulina intacta o moléculas de anticuerpos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (es decir, anticuerpos biespecíficos formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos) y fragmentos de inmunoglobulina (tales como Fab, F(ab')_{2}, o Fv), mientras presenten cualquiera de las propiedades agonísticas o antagonísticas deseadas aquí descritas.

Los anticuerpos son típicamente proteínas o polipéptidos que presentan especificidad de unión a un antígeno específico. Los anticuerpos nativos son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Típicamente, cada cadena ligera está enlazada con una cadena pesada mediante una unión de disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro entre cadenas separados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido por una pluralidad de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V_{L}) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadenas ligeras y pesadas [Chothia et al., J. Mol. Biol., 186:651-663 (1985); Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596 (1985)]. Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie vertebrada se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa y lambda, basados en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varias de éstas también se pueden dividir en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-1, IgG-2, IgG-3, and IgG-4; IgA-1 y IgA-2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman alpha, delta, epsilon, gamma, y mu, respectivamente.

"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, generalmente la unión del antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab',
F(ab')2, y Fv, diacuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena simple y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

El término "variable" se usa aquí para describir ciertas porciones de los dominios variables que difieren en secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y en la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad usualmente no está distribuida de manera uniforme a través de los dominios variables de los anticuerpos. Típicamente está concentrada en tres segmentos llamados regiones de determinación de complementariedad (CDRs) o regiones hipervariables en los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se llaman el marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, adoptando en gran medida una configuración de lámina \beta, conectada mediante tres CDRs, que forman bucles de conexión de, y en algunos casos forman parte de, la estructura de la lámina \beta. Los CDRs en cada cadena se mantienen juntos en proximidad cercana mediante las regiones FR y, con los CDRs desde la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión del antígeno de los anticuerpos [ver Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)]. Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentar varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en toxicidad celular dependiente del anticuerpo.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa aquí se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno.

Los anticuerpos monoclonales aquí incluyen anticuerpos quiméricos, híbridos y recombinantes producidos mediante el empalme de un dominio variable (que incluyendo hipervariable) de un anticuerpo de anti-DR4 con un dominio constante (por ejemplo, anticuerpos "humanizados"), o una cadena ligera con una cadena pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie, o fusiones con proteínas heterólogas, independientemente de las especies de origen o designación de la clase o subclase de la inmunoglobulina, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2}, y Fv), mientras presenten la actividad o las propiedades biológicas deseadas. Ver, por ejemplo, la patente US 4.816.567 y Mage et al., in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97 (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987).

Así, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogénea, y no se construye como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usan según la presente invención se pueden hacer mediante el procedimiento de hibridoma, descrito primero por parte de Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975), o se pueden hacer mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como el descrito en la patente US 4.816.567. Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de librerías de fagos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990), por ejemplo.

Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murina) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulina, o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen a los antígenos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en las que los residuos de una región de determinación complementaria (CDR) del recipiente se reemplazan mediante residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de marco (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan mediante correspondientes residuos no humanos. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni el anticuerpo recipiente ni en la CDR importada o las secuencias de marco. Estas modificaciones se hacen para refinar y optimizar más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todos de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o substancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o substancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá, de manera óptima, por lo menos una porción de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente el de una inmunoglobulina humana.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido mediante un humano y/o se ha hecho usando cualquiera de las técnicas para hacer anticuerpos humanos conocidas en la técnica o tal como se describe aquí. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos que comprenden por lo menos un polipéptido humano de cadena pesada o por lo menos un polipéptido humano de cadena ligera, por ejemplo un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena ligera de murina y de cadena pesada humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando varias técnicas conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo humano se selecciona entre una librería de fagos, donde la librería de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al. Nature Biotechnology, 14:309-314 (1996): Sheets et al. PNAS, (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Los anticuerpos humanos también se pueden hacer introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado parcial o completamente. Bajo estimulación, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se parece mucho a lo que se aprecia en humanos en todos los respectos, incluyendo redisposición de los genes, agrupación y repertorio de los anticuerpos. Esta proximación se describe, por ejemplo, en las patentes US 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995). Alternativamente, el anticuerpo humano se puede preparar a través de la inmortalización de linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno objetivo (estos linfocitos B se pueden recuperar de un individuo o se pueden haber inmunizado in vitro). Ver, por ejemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991); y patente US 5.750.373.

El término "región Fc" se usa para definir la región terminal C de una cadena pesada de inmunoglobulina que se puede generar mediante digestión de papaína de un anticuerpo intacto. La región Fc puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región Fc de cadena pesada IgG humana se define usualmente como un tramo desde un residuo de aminoácido en aproximadamente la posición Cys226, o desde la posición Pro230, al terminal carboxil de la región Fc (usando aquí el sistema de numeración según Kabat et al., supra). La región Fc de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente comprende un dominio CH4.

Mediante "cadena de región Fc" aquí significa una de las dos cadenas de polipéptido de una región Fc.

El "dominio CH2" de una región Fc IgG humana (también llamada como dominio "C\gamma2") usualmente se extiende desde un residuo de aminoácido en aproximadamente la posición 231 a un residuo de aminoácido en aproximadamente la posición 340. El dominio CH2 es único porque no está emparejado de manera próxima con otro dominio. Además, dos cadenas de carbohidrato ramificadas enlazadas con N están interpuestas entre los dos dominios CH2 de una molécula IgG nativa intacta. Se ha especulado que el carbohidrato puede proporcionar un sustituto para la pareja dominio-dominio y ayudar a estabilizar el dominio CH2. Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985). El dominio CH2 aquí puede ser un dominio CH2 de secuencia nativa o un dominio CH2 variante.

El "dominio CH3" comprende un tramo de residuos de terminal C a un dominio CH2 en una región Fc (es decir, desde un residuo de aminoácido en aproximadamente la posición 341 a un residuo de aminoácido en aproximadamente la posición 447 de un IgG). La región CH3 aquí puede ser un dominio CH3 de secuencia nativa o un dominio CH3 variante (por ejemplo un dominio CH3 con una "protuberancia" introducida en una cadena del mismo y una "cavidad" introducida correspondiente en su otra cadena; ver la patente US 5.821.333). Estos dominios CH3 variantes se pueden usar para hacer anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos) tal como se describen aquí.

"Región de articulación" se define generalmente como un tramo desde aproximadamente Glu216, o aproximadamente Cys226, a aproximadamente Pro230 de IgG1 humana (Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985)). Las regiones de articulación de otros isotipos de IgG se pueden alinear con la secuencia IgG1 mediante la colocación del primer y último residuos de cisteína que forman las uniones S-S entre la cadena pesada en las mismas posiciones. La región de articulación aquí puede ser una región de articulación de secuencia nativa o una región de articulación variante. Las dos cadenas de polipéptido de una región de articulación variante generalmente retienen por lo menos un residuo de cisteína por cadena de polipéptido, de manera que las dos cadenas de polipéptido de la región de articulación variante pueden formar una unión de disulfuro entre las dos cadenas. La región de articulación aquí preferida es una región de articulación humana de secuencia nativa, por ejemplo una región de articulación de IgG1 humana de secuencia nativa.

Una "región Fc funcional" posee por lo menos una "función efectora" de una región Fc de secuencia nativa. "Funciones efectoras" de ejemplo incluye unión C1q; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión del receptor Fc; citoxicidad mediada con células dependiente del anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación inferior de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. Estas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y se puede determinar usando varios ensayos conocidos en la técnica para evaluar estas funciones efectoras del anticuerpo.

Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de una región Fc de secuencia nativa en por lo menos una modificación de aminoácido. Preferiblemente, la región Fc variante tiene por lo menos una sustitución de aminoácido comparada con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido pariente, por ejemplo, entre aproximadamente uno y aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferiblemente entre aproximadamente una y aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido pariente. La región Fc variante poseerá aquí preferiblemente por lo menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido pariente, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia con la misma, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia con la misma.

"Citotoxicidad mediada con células dependiente del anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada con células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcRs) (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) reconocen un anticuerpo unido en una célula objetivo y posteriormente causan la lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar la ADCC, las células NK, expresan Fc\gammaRIII solamente, mientras que los monocitos expresan Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII. La expresión FcR en células hematopoiéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes US 5.500.362 ó 5.821.337. Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede determinar in vivo, por ejemplo en un modelo animal, tal como el descrito en Clynes et al. PNAS (USA), 95:652-656 (1998).

"Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan una o más FcRs y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan por lo menos Fc\gammaRIII y realizan la función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; prefiriéndose las células PBMCs y NK. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa de las mismas, por ejemplo, de sangre o PBMCs, tal como se describe aquí.

Los términos "receptor Fc" y "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. La FcR preferida es una FcR humana de secuencia nativa. Además, una FcR preferida es una que se une a un anticuerpo IgG (un gamma receptor) y incluye receptores de las subclases Fc\gammaRI, Fc\gammaRII, y Fc\gammaRIII, incluyendo variantes alélicas y, alternativamente, formas empalmadas de estos receptores. Los receptores Fc\gammaRII incluyen Fc\gammaRIIA (un "receptor de activación") y Fc\gammaRIIB (un "receptor de inhibición"), que tiene secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor de activación Fc\gammaRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunoreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición Fc\gammaRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmunoreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico (revisado en Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Los FcRs son revisados en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcRs, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, están cubiertos mediante el término "FcR" aquí. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternos al feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976); y Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).

"Citotoxicidad dependiente del complemento" y "CDC" se refieren al lisado de un objetivo en presencia del complemento. La trayectoria de activación del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo un anticuerpo) compleja con un antígeno cognado. Para determinar la activación del complemento se puede realizar un ensayo CDC, por ejemplo tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

Un anticuerpo de "afinidad madurada" es uno con una o más alteraciones en una o más CDRs del mismo que producen una mejora en la afinidad del anticuerpo para el antígeno, comparada con un anticuerpo padre que no posee esas alteraciones. Los anticuerpos de afinidad madurada preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos de afinidad madurada se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al. Bio/Technology, 10:779-783 (1992) describe la maduración de la afinidad mediante recomposición de dominio VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de marco se describe por parte de: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene, 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol., 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992).

El término "inmunoespecífico" tal como se usa en "unión inmunoespecífica de anticuerpos" por ejemplo, se refiere a la interacción de unión específica del antígeno que se produce entre el sitio de combinación del antígeno de un anticuerpo y el antígeno específico reconocido mediante ese anticuerpo.

"Biológicamente activo" y "actividad biológica deseada" para los propósitos aquí significan que tienen la capacidad de modular la actividad del DR4 o la activación del DR4, incluyendo, a modo de ejemplo, apóptosis (en una manera agonística o estimulante o en una manera antagonística o de bloqueo) en por lo menos un tipo de célula de mamífero in vivo o ex vivo, uniéndose al ligando Apo-2 (TRAIL), o modulando la activación de una o más moléculas en la trayectoria de señalización intracelular tal como caspasa 3, caspasa 8, caspasa 10 o FADD. Los ensayos para determinar la activación de estas moléculas intracelulares son conocidos en la técnica, por ejemplo, Boldin et al., J. Biol. Chem., 270:7795-7798 (1995); Peter, Cell Death Differ., 7:759-760 (2000); Nagata, Cell, 88:355-365 (1998); Ashkenazi et al., Science, 281:1305-1308 (1999).

Los términos "apóptosis" y "actividad apoptótica" se usan en un sentido amplio y se refieren a la forma ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que está acompañada típicamente mediante uno o más cambios celulares característicos, incluyendo condensación del citoplasma, pérdida de micropilos de membrana de plasma, segmentación del núcleo, degradación del ADN cromosómico o pérdida de función mitocondrial. Esta actividad se puede determinar y medir, por ejemplo, mediante ensayos de viabilidad celular, ensayos de unión de anexina V, ensayos PARP, análisis FACS o electroforesis de ADN, todos conocidos en la técnica. Opcionalmente, la actividad apoptótica se determinará mediante una anexina V o ensayo PARP.

Los términos "cáncer", "canceroso" y "maligno" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no están limitados a los mismos, carcinoma, incluyendo adenocarcinoma, linfoma, blastoma, melanoma, glioma, sarcoma, mieloma (tal como mieloma múltiple) y leucemia. Ejemplos más particulares de estos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer gastrointestinal, linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer cervical, glioma, cáncer de ovarios, cáncer de hígado tal como carcinoma y hepatoma hepático, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer de riñón tal como carcinoma de células renales y tumores de Wilms, carcinoma de células basales, melanoma, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer de esófago, y varios tipos de cáncer de cabeza y de cuello.

El término "enfermedad relacionada inmune" significa una enfermedad en la cual un componente del sistema inmume de un mamífero provoca, media o contribuye de otra manera a una morbosidad en el mamífero. También se incluyen enfermedades en las que la estimulación o intervención de la respuesta inmune tiene un efecto de mejora en la progresión de la enfermedad. Se incluyen en este término enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias mediadas inmunes, enfermedades inflamatorias no mediadas inmunes, enfermedades infecciosas y enfermedades de inmunodeficiencia. Ejemplos de enfermedades inmunes relacionadas e inflamatorias, algunas de las cuales son inmunes con mediadas con células T, que se pueden tratarse una invención incluyen eritematosis de lupus sistémica, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, espondiloartropatías, esclerosis sistémica (escleroderma), miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis), síndrome de Sjogren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturnal paroxismal), trombocitopenia autoinmune (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia inmune mediada), tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis limfocítica juvenil, tiroiditis atrófica), diabetes mellitus, enfermedades renales inmunes mediadas (glomerulonefritis, nefritis tubulointerstitial), enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico tales como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré, y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosas (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos), hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa, colangitis esclerosante, enfermedades de pulmón inflamatorias o fibróticas tales como enfermedad de intestino inflamatoria (colitis ulcerativa: enfermedad de Crohn), enteropatía sensible al gluten, y enfermedad de Whipple, enfermedades de piel autoinmunes o inmunes mediadas que incluyen enfermedades de piel bullar, eritema multiforme y dermatitis de contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad alimenticia y urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón tales como neumonías eosinofílicas, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis de hipersensibilidad, enfermedades asociadas con los trasplantes incluyendo rechazo de injertos y enfermedades del injerto contra huésped. Las enfermedades infecciosas incluyen SIDA (infección VIH), hepatitis A, B, C, D, y E, infecciones bacterianas, infecciones fúngicas, infecciones con protozoos de infecciones de parásitos.

"Enfermedad autoinmune" se utiliza aquí en un sentido general amplio para referirse a desórdenes o condiciones en mamíferos en los cuales la destrucción de tejido normal cosa no se produce a partir de respuestas inmunes humorales o celulares del individuo mamífero a sus propios constituyentes del tejido. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a los mismos, lupus eritematoso, tiroiditis, artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple, diabetes autoinmune, y enfermedades de intestino inflamatorias (IBD).

Un "agente inhibitorio de crecimiento" cuando se utiliza aquí se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula in vitro y/o in vivo. Así, el agente inhibitorio de crecimiento puede ser uno que reduzca de manera significativa el porcentaje de células en fase S. Ejemplos de agentes inhibitorio de crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar diferente que la fase S), tal como agentes que inducen arresto G1 y arresto de fase M. Los bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), TAXOL®, e inhibidores topo II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido, y bleomicina. Esos agentes de arresto G1 también se derraman en el arresto de fase S, por ejemplo agentes de alquilación de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracil, y ara-C. Más información se puede encontrar en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13.

El término "promedicamento" tal como se usa en esta solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células cancerígenas comparada con el medicamento pariente y es capaz de activarse de manera enzimática o convertirse en la forma pariente más activa. Ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los promedicamentos de esta invención incluyen, pero no están limitados a los mismos, promedicamentos que contienen fosfato, promedicamentos que contienen tiofosfato, promedicamentos que contienen sulfato, promedicamentos que contienen péptidos, promedicamentos modificados de aminoácidos D, promedicamentos glicosilatados, promedicamentos que contienen beta-lactamo, promedicamentos que contienen fenoxiacetamida o promedicamentos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5-fluorocitosina y otros promedicamentos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en medicamentos citotóxicos libres más activos. Ejemplos de medicamentos citotóxicos que se pueden derivar en forma de promedicamento para su uso en esta invención incluyen, pero no están limitados a los mismos, los agentes de quimioterapia descritos posteriormente.

El término "agente citotóxico" tal como se usa aquí se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o provoca la destrucción de las células. El término se pretende que incluya isótopos radiactivos (por ejemplo, At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, p^{32} e isótopos radiactivos de Lu), agentes de quimioterapia, y toxinas tales como toxina de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, de planta o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos.

Un "agente de quimioterapia" es un compuesto químico útil en el tratamiento de condiciones como el cáncer. Ejemplos de agentes de quimioterapia incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y cicloesfosfamida (CYTOXAN^{TM}); alquil sulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosfaoramida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el topotecán análogo sintético); briostatina; callistatina; CC-1065 (incluyendo sus adozelesina, carzelesina y bizelesina análogos sintéticos); criptoficinas (particularmente criptofycina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mustardos de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hipocloruro de óxido de mecloretamina, melfalano, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, uracil mustardo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como los antibióticos de enedina (por ejemplo caliqueamicina, especialmente caliqueamicina \gamma_{1}^{I}, y caliqueamicina \theta^{I}_{1}, ver, por ejemplo, Agnew Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos antibióticos de cromoproteínas relacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexata y 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; replenedores de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; actetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazido; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2''-triclorotrietilamina; tricotecenes (especialmente T-2 toxina, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) and doxetaxel (TAXOTERE®, Rhône-
Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ádico retinoico; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptablesde cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las hormonas en tumores tales como anti-estrógenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, aromatasa que inhibe 4(5)-imidazoles, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas mediante una población celular que actúan en otra célula como mediadores intracelulares. Ejemplos de estas citocinas son linfocinas, monocinas, y hormonas que polipéptidos tradicionales. Entre las citocinas están incluidas hormonas de crecimiento tales como hormona de crecimiento humano, hormona de crecimiento humano N-metionil, y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteínas tales como hormona de estimulación de folículos (FSH), hormona de estimulación de la tiroides (TSH), y hormona de luteinización (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placental; factor alpha y beta de necrosis tumoral; sustancia de inhibición de mulleriana; péptido asociado con gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); factores de crecimiento de nervios tales como NGF-alpha; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento de transformación (TGFs) tales como TGF-alpha y TGF-beta; factor-I y -II de crecimiento a modo de insulina; eritropoietina (EPO); factores osteoinductivos; interferonas tales como interferona-alpha, -beta y -gamma; factores de estimulación de colonias (CSFs) tales como macrófago-CSF (M-CSF); granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tales como IL-1, IL-1alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alpha o TNF-beta; y otros factores de polipéptido incluyendo LIF y ligando de equipo (KL). Tal como se usa aquí, el término citocina incluye proteínas a partir de fuentes naturales o a partir de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.

Los términos "tratando", "tratamiento" y "terapia" tal como se usan aquí se refieren a terapia curativa, terapia profiláctica, y terapia preventiva.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere una cantidad de un fármaco efectivo para tratar una enfermedad o desorden en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéutica efectiva que fármaco puede reducir el número de células cancerígenas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar alguna extensión y preferiblemente detener) e infiltración de células cancerígenas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en alguna extensión y preferiblemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en alguna extensión, el crecimiento del tumor; y/o aliviar en alguna extensión uno o más de los síntomas asociados con el desorden. En la extensión que el fármaco puede evitar el crecimiento y/o matar las células cancerígenas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia del cáncer, por ejemplo, la terapia in vivo se puede medir determinando los límites por volumen del tumor, el tiempo de la progresión de la enfermedad (TTP) y/o determinando los índices de respuesta (RR).

El término "mamífero" tal como se usa que se refiere a cualquier mamífero clasificado como mamífero, incluyendo humanos, vacas, caballos, perros y gatos. En una realización preferida de la invención, el mamífero es un humano.

\vskip1.000000\baselineskip

II. Composiciones y procedimientos de la invención A. Anticuerpos de DR4

En una realización de la invención, se proporcionan anticuerpos de DR4 humanos tal como se describe aquí.

\vskip1.000000\baselineskip

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos de la invención pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos de preparación de los anticuerpos policlonales son conocidos por parte de los expertos en la materia. Los anticuerpos policlonales pueden crecer en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o el adyuvante se inyectarán el mamífero mediante múltiples inyecciones son cutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido de DR4 (o un DR4 ECD) o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante en una proteína conocida que es inmunogénica el mamífero que se inmuniza. Ejemplos de estas proteínas y inmunogénicas incluyen, pero no están limitadas a las mismas, hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de soja. Ejemplos de adyuvantes que se pueden utilizar incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM (Lípido A monofosforil, dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de inmunización se puede seleccionar por parte de un experto en la materia sin experimentación indebida. Al mamífero se le puede a continuación saca sangre, y analizar el suelo para el título de anticuerpo de DR4. Si se desea, el mamífero se puede reforzar hasta que el título de anticuerpo aumenta o platea.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos de la invención, alternativamente, puede ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando procedimientos de hibridoma, tal como los descritos por parte de Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un procedimiento de hidridoma, un ratón, hámster, otro animal huésped apropiado, típicamente se inmuniza con un agente inmunizante para extraer linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.

El agente inmunizante incluirá típicamente el polipéptido DR4 (o un DR4 ECD) o una proteína de fusión del mismo, tal como una proteína de fusión DR4 ECD-IgG. El agente inmunizante puede comprender alternativamente un fragmento o porción de DR4 que tiene uno o más aminoácidos que participan en la unión del Apo-2L a DR4. En una realización preferida, el agente inmunizante comprende una secuencia de dominio extracelular de DR4 fundida con una secuencia IgG, tal como se describe en el ejemplo 1.

Generalmente, se utilizan linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si se desea en células de origen humano, o se utilizan células del bazo o células del nódulo linfático si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Los linfocitos se funden a continuación con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietileno glicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas se transforman usualmente en células de mamífero, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Usualmente, se utilizan líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fundidas. Por ejemplo, si las células parentales no tienen la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina ("medio HAT"), cuyas substancias evitan el crecimiento de células con deficiencia de
HGPRT.

Líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se funden de manera eficiente, soportan un alto nivel de expresión estable de anticuerpos mediante las células que producen anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma de murina, que se pueden obtener, por ejemplo, en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Un ejemplo de esta línea celular de mieloma de murina es P3X63Ag8U.1, (ATCC CRL 1580) descrita en el ejemplo 2 a continuación. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].

El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma se han cultivado se podrá analizar a continuación por la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el DR4. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos mediante las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayoinmunoabsorbente de relacionado con las enzimas (ELISA). Estas técnicas y ensayos son conocidos en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, se puede determinar mediante análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de identificarse las células de hibridoma deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de disolución de limitación y crecer mediante procedimientos estándar [Goding, supra]. Con medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, el medio de Eagle modificado de Dulbecco o medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecer in vivo como ascitas en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados mediante los subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o fluido de ascitas mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis de gel, diálisis, o cromatografía de afini-
dad.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden hacer mediante procedimientos de ADN recombinante, tal como los descritos en la patente US 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se puede aislar y secuenciar fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas del oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de ese ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped tales como células E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otra manera proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, mediante la sustitución de la secuencia de codificación para los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias de murina homólogas, Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984), o mediante la unión covalente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido de no inmunoglobulina. De esa manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tiene la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti-DR4 aquí.

Típicamente, estos polipéptido dos de no inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio que combina antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para DR4 y otros sitios de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente.

Los anticuerpos quiméricos o híbridos también se pueden preparar in vitro utilizando procedimientos conocidos en química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de una unión tioéter. Ejemplos de reagentes adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimi-
dato.

También se pueden producir fragmentos Fv de cadena simple, tal como se describe en Iliades et al., FEBS Letters, 409:437-441 (1997). El acoplamiento de estos fragmentos de cadena simple utilizando varios enlaces se describe en Kortt et al., Protein Engineering, 10:423-433 (1997). Una variedad de técnicas para la producción recombinante y la manipulación de anticuerpos son bien conocidas en la técnica. A continuación se describen en mayor detalle ejemplos ilustrativos de estas técnicas que se utilizan típicamente por parte de los expertos en la materia.

\vskip1.000000\baselineskip

(i) Anticuerpos humanizados

Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos en el mismo a partir de una fuente no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se llaman a menudo como residuos "de importación", que se toman típicamente de un dominio variable "de importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], mediante la sustitución de CDRs o secuencias de CDR de roedor para las correspondientes secuencias y un anticuerpo humano.

En consecuencia, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto sea sustituido mediante las correspondientes secuencias de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se han sustituido por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

Es importante que los anticuerpos se humanice en con la retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, según un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la materia. Están disponibles programas de ordenador que ilustran y muestran las estructuras de conformación tridimensionales probables de las secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas fiscalizaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que pueden influenciar en la capacidad de la inmunoglobulina candidata a unirse a su antígeno. De esta manera, se puede seleccionar y combinar residuos FR a partir de la secuencia de consenso y de importación, de manera que la característica del anticuerpo deseada, tal como la afinidad aumentada para el antíge-
no(s) objetivo, se consigue. En general, los residuos CDR están directamente y más sustancialmente implicados en la influencia de la unión del antígeno.

\vskip1.000000\baselineskip

(ii) Anticuerpos humanos

Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden hacer mediante el procedimiento de hibridoma. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos se han descrito, por ejemplo, por parte de Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), y Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

Ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, bajo inmunización, de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (J_{H}) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal produce la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la disposición génica de inmunoglobulina de línea germinal humana en estos ratones mutantes de línea germinal producida la producción de anticuerpos humanos bajo la provocación de antígenos. Ver, por ejemplo Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993).

Mendez et al. (Nature Genetics 15: 146-156 [1997]) han mejorado más la tecnología y han generado una línea de ratones transgénicos designada como "Xenoratón II" que, cuando son tratados con un antígeno, genera anticuerpos humanos completos de alta afinidad. Esto se consiguió mediante integración de línea germinal de loci de cadena pesada y de cadena ligera humanos de megabase en ratones con retirada en el segmento J_{H} endógeno, tal como se describe anteriormente. El Xenoratón II abriga 1.020 kb de locus de cadena pesada humana que contienen aproximadamente 66 genes V_{H}, D_{H} completo y regiones J_{H} y tres diferentes regiones constantes (\mu, \delta y \chi), y también abriga 800 kb de locus \kappa humano que contiene 32 genes V\kappa, segmentos J\kappa y genes C\kappa. Los anticuerpos producidos en estos ratones se parecen mucho a lo que se aprecia en humanos en todos los aspectos, incluyendo la redisposición, la unión y el repertorio de genes. Los anticuerpos humanos se expresan preferentemente sobre anticuerpos endógenos, debido a la eliminación en el segmento J_{H} endógeno, que evita la redisposición génica en locus de murina.

Alternativamente, la tecnología de visualización de fagos (McCafferty et al., Nature 348, 552-553 [1990]) se puede utilizar para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina a partir de donadores no inmunizados. Según esta técnica, los genes del dominio V de anticuerpo se clonan en marco en un gen de proteína de recubrimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se muestra como fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena única del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también producen la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta esas propiedades. Así, el fago imita alguna de las propiedades de la célula B. La visualización del fago se puede realizar en una variedad de formatos; para su revisión ver, por ejemplo, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Se pueden usar varias fuentes de segmentos de genes V para la visualización de fagos. Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) aisló una disposición diversa de anticuerpos de anti-oxazolona a partir de una pequeña librería combinatoria aleatoria de genes V derivados de bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V a partir de donadores humanos no inmunizados se puede construir y los anticuerpos en una disposición diversa de antígenos (incluyendo auto-antígenos) se pueden aislar esencialmente siguiendo las técnicas descritas por parte de Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993). En una respuesta inmune natural, los genes del anticuerpo acumulan mutaciones con un alto índice (hipermutación somática). Algunos de los cambios introducidos conferirán mayor afinidad, y las células B que muestra inmunoglobilina de superficie de alta afinidad se replican y diferencian preferentemente durante la posterior aplicación del antígeno. Este proceso natural se puede imitar utilizando la técnica conocida como "mezcla de cadena" (Marks et al., Bio/Technol. 10, 779-783 [1992]). En este procedimiento, la afinidad de los anticuerpos humanos "primarios" obtenidos mediante la visualización de fagos se puede mejorar mediante el reemplazo de manera secuencial de genes de región V de cadena pesada o ligera con repertorios de variantes (repertorios) que se producen naturalmente de genes de dominio V obtenidos a partir de donadores no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades en el rango nM. Una estrategia para hacer repertorios de anticuerpos de fagos muy grandes (también conocida como "las librerías madre de todo") se han descrito por parte de Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993). La mezcla de cadena también se puede usar para derivar anticuerpos humanos a partir de anticuerpos de roedores, donde el anticuerpo humano tiene similares afinidades y especificidades al anticuerpo de roedor inicial. Según este procedimiento, al cual también se llama "impresión de epítope", el gen de dominio V de cadena pesada o ligera de los anticuerpos de roedor obtenidos mediante la técnica de visualización de fagos se reemplaza con un repertorio de genes de dominio V humanos, creando quimeras roeador-humano. La selección en resultados de antígeno en aislamiento de variable humana es capaz de restablecer un sitio de unión de antígeno funcional, es decir, el epítope gobierna (imprime) la elección de compañero. Cuando se proceso se repite para reemplazar el dominio V de roedor restante, se obtiene un anticuerpo humano (ver la solicitud de patente PCT WO 93/06213, publicada el 1 de abril de 1993). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos de roedores mediante injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen ningún marco o residuos CDR de origen
roedor.

Tal como describe en detalle posteriormente, los anticuerpos de la invención pueden comprender opcionalmente monoméricos, anticuerpos, anticuerpos diméricos, así como formas multivalentes de anticuerpos. Los expertos en la materia pueden construir estos dímeros o formas multivalentes mediante técnicas conocidas en la técnica y utilizando aquí anticuerpos DR4. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes también son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de cadena ligera de inmunoglobilina y cadena pesada modificada. La cadena pesada está truncada generalmente en cualquier punto en la región Fc para evitar la reticulación de cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes son sustituidos con otro residuo de aminoácido o se eliminan para evitar la reticulación.

\vskip1.000000\baselineskip

(iii) Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para por lo menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para el receptor DR4, el otro es para cualquier otro antígeno, y preferiblemente para otro receptor o subunidad receptor. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a un receptor DR4 y otro receptor de apóptosis/señalización están dentro del alcance de la presente invención.

Los procedimientos para hacer anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de los padres de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Millstein and Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)). Debido a la disposición aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de los cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza usualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante problemática, y las producciones del producto son bajas. Procedimientos similares se describen en la publicación de la solicitud PCT WO 93/08829 (publicada el 13 mayo de 1993), y en Traunecker et al., EMBO 10, 3655-3659 (1991).

Según una aproximación diferente y más preferida, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpos-antígenos) se funden con las secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferiblemente es con un dominio de constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la articulación, regiones CH2 y CH3. Se prefiere que tenga la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para la unión de cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones manuales de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones cuando las relaciones diferentes de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptido en relaciones iguales producen altas producciones o cuando las relaciones no tienen significancia particular. En una realización preferida de esta aproximación, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (proporcionando una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solamente una mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera de separación fácil. Esta aproximación se describe en la publicación PCT WO 94/04690, publicada el 3 marzo de
1994.

Para detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).

\vskip1.000000\baselineskip

(iv) Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados están también dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos de manera covalente. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para marcar células del sistema inmune con células no deseadas (patente US 4.676.980), y para el tratamiento de infección VIH (publicaciones de las solicitudes PCT WO 91/00360 y WO 92/200373; EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden hacer utilizando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica, se describen en la patente US 4.676.980, junto con una serie de técnicas de reticulación.

\vskip1.000000\baselineskip

(v) Fragmentos de anticuerpos

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-DR4 (que incluye anticuerpos de murina, humanos y humanizados, y variantes de anticuerpos) es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban a través de digestión proyeolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir ahora directamente mediante células huésped recombinantes. Fragmentos de Fab'-SH, por ejemplo, se podrán recuperar directamente a partir de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos de F(ab')_{2} (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En otra realización, el F(ab')_{2} se forma utilizando la unión de leucina GCN4 para promover la unión de la molécula de F(ab')_{2}. Según otra aproximación, fragmentos de Fv, Fab o F(ab')_{2} se pueden aislar directamente a partir del cultivo de células huésped recombinantes. Una variedad de técnicas para la producción de fragmentos anticuerpos serán evidentes para los expertos en la materia. Por ejemplo, la digestión se puede realizar utilizando papaína. Ejemplos de digestión de papaína se describen en el documento WO 94/29348 publicado el 22 diciembre de 1994 y la patente US 4.342.566. La digestión de papaína de anticuerpos típicamente produce dos fragmentos de unión de antígeno idénticos, llamados fragmentos Fab, cada uno con un único sitio de unión del antígeno, y un fragmento Fc residual. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de combinación de antígenos y todavía es capaz de la reticulación del antígeno.

Los fragmentos Fab producidos en la digestión del anticuerpo también contienen los dominios constantes de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH_{1}) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab, difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el terminal carboxi del dominio de cadena pesada CH_{1}, incluyendo una más cisteínas de la región de articulación del anticuerpo. Fab'-SH es la designación aquí para Fab', en la cual los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes se basan en un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tenían citeínas de articulación entre los mismos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos anticuerpos también son conocidos.

\vskip1.000000\baselineskip

(vi) Variantes de la secuencia de aminoácidos de anticuerpos

Las variantes de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos anti-DR4 se prepararon mediante la introducción apropiada de cambios de nucleótidos en el ADN del anticuerpo anti-DR4, o mediante síntesis de péptidos. Estas variantes incluyen, por ejemplo, eliminaciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-R4 de los ejemplos aquí descritos. Cualquier combinación de eliminación, inserción, y sustitución se realiza para llegar a la construcción final, previendo que la construcción final posee las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-translacionales del anticuerpo anti-DR4 humanizado o variante, tal como el cambio del número o la posición de los sitios de glicosilación.

Un procedimiento útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo anti-DR4 que son localizaciones preferidas para mutagénesis se llama "mutagénesis de escaneado de alanina", tal como se describe por parte de Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o un grupo de residuos objetivo se identifican (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplazan mediante un aminoácido neutro o cargado de manera negativa (más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antígeno DR4. Aquellas localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan a continuación mediante la introducción de más variantes u otras variantes en los sitios de sustitución. Así, aunque el sitio para la introducción de una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación por sí misma no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de la mutación en un sitio lado, se realiza un escaneado o mutagénesis aleatoria en el codón por región objetivo y las variantes del anticuerpo anti-DR4 expresadas se filtran para la actividad deseada.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones de los terminales amino y/o carboxil que varían en longitud desde un residuo a polipéptido se contienen una centena o más residuos, así como inserciones entre la secuencia para residuos de aminoácidos simples o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-DR4 con un residuo de metionil de terminal N por el anticuerpo unido con una marca de epítope. Otras variantes de inserción de la molécula del anticuerpo anti-DR4 incluyen la fusión del terminal N o C del anticuerpo anti-DR4 de una enzima con polipéptido que aumenta la vida media del suero del anticuerpo (ver a continuación).

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen por lo menos un residuo aminoácidos en la molécula del anticuerpo anti-DR4 retirada y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables, pero las alteraciones FR también se contemplan. Las sustituciones conservativas se muestran en la tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si estas sustituciones producen un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones de ejemplo" en la tabla 1, o como también se describe a continuación en referencia a las clases de aminoácidos y los productos filtrados.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

3

4

Las modificaciones sustanciales de las propiedades biológicas del anticuerpo se realizan mediante la selección de sustituciones que difieren de manera significativa en su defecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la columna del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación laminar o helicoidal, (b) la carga de hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena del sitio. Los residuos que se producen de manera natural se dividen en grupos basados en las propiedades de cadena lateral común:

(1): hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2): hidrofíloco neutral: cys, ser, thr;

(3): ácido: asp, glu;

(4): básico: asn, gln, his, lys, arg;

(5): residuos influencian la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6): aromático: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas permitirán el intercambio de un elemento de una de estas clases por otra clase.

Cualquier residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación adecuada del anticuerpo anti-DR4 humanizado o variante también se puede sustituir, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar una reticulación aberrante. Por el contrario, las uniones de cisteína se pueden añadir al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).

Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional indica la sustitución de uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo padre (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) varian-
te(s) resultante(s) seleccionada(s) para el desarrollo adicional tendrá(n) propiedades biológicas mejoradas respecto al anticuerpo padre a partir del cual se han generado.

Una manera conveniente para la generación de estas variantes sustitucionales es la maduración de afinidad utilizando visualización de fagos. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones amino en cada sitio. Las variantes del anticuerpo si generadas se muestran en una forma monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusiones del producto de gen III de M13 empaquetado en cada partícula. Las variantes mostradas de fagos se filtran a continuación por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se describe aquí. Para identificar los sitios de región hipervariable candidatos para su modificación, se puede realizar mutagénesis de escaneado de alanina para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen de manera significativa a reunión del antígeno. Alternativamente, o además, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el DR4 humano. Estos residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos para sustitución, según las técnicas aquí elaboradas.

Una vez se generan estas variantes, el panel de variante se somete a filtrado tal como se describe aquí y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes se puede seleccionar para su desarrollo adicional.

(vii) Variantes de glicosilación de anticuerpos

Los anticuerpos se glicosilatan en posiciones conservadas en sus regiones constantes (Jefferis y Lund, Chem. Immunol. 65:111-128 [1997]; Wright and Morrison, TibTECH 15:26-32 [1997]). Las cadenas laterales de polisacáridos de las inmunoglobulinas afectan la función de las proteínas (Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318; [1996]; Wittwe and Howard, Biochem. 29:4175-4180 [1990]), y la interacción intramolecular entre las porciones de la glicoproteína que puede afectar a la conformación y presenta una superficie tridimensional de la glicoproteína (Hefferis y Lund, supra; Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416 [1996]). Los oligosacáridos también pueden servir para marcar una glicoproteína dada para ciertas moléculas basadas en estructuras de reconocimiento específicas. Por ejemplo, se ha indicado que en IgG agalactosilatado, la mitad del oligosacárido "se mueve" fuera del espacio inter-CH2 y los residuos de acetilglucosamina de terminal N se vuelven disponibles para unirse a la proteína de unión de mannosa (Malhotra et al., Nature Med. 1:237-243 [1995]). La retirada mediante glicopeptidasa de los oligosacáridos de CAMPATH-1H (un anticuerpo IgG1 monoclonal de murina humanizado recombinante que reconoce el antígeno CDw52 de linfocitos humanos) producido en células de Ovario de Hámster Chino (CHO) produjo una reducción completa en lisis mediada de complemento (CMCL) (Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-2318 [1996]), mientras que la retirada selectiva de residuos de ácido siálico utilizando neuraminidasa resultó en ninguna pérdida de DMCL. La glicosilación de anticuerpos también ha reportado que afecta a la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). En particular, células CHO con expresión regulada con tetraciclinea de \beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glicosiltransferasa que cataliza la formación de GlcNAc bisectante, se reportó que tenía una actividad ADCC mejorada (Umana et al., Mature Biotech. 17:176-180 [1999]).

Las variantes de glicosilación de anticuerpos son variantes en las que el diseño de glicosilación de un anticuerpo está alterado. Mediante alteración se indica la eliminación de una o más mitades de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, añadiendo una o más mitades de carbohidrato al anticuerpo, cambiando la composición de la glicosilación (diseño de glicosilación), la extensión de la glicosilación, etc. Las variantes de glicosilación pueden prepararse, por ejemplo, eliminando, cambiando y/o añadiendo uno o más sitios de glicosilación en la secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo.

La glicosilación de anticuerpos es típicamente de enlace N o enlace O. El enlace N se refiere a la fijación de la mitad de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. La secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X ES cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la fijación enzimática de la mitad de carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación de enlace O se refiere a la fijación de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación el anticuerpo se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para sitios de glicosilación de enlace N). La alteración también puede realizar mediante la adición, o sustitución, de uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para sitios de oscilación de enlace O).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-DR4 se preparan mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no están limitados a los mismos, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que se producen de manera natural) por la preparación mediante mutagénesis mediada (o dirigir al sitio) con oligonucleótidos, mutagénesis PCR, y mutagénesis de cassette de una versión variante o no variante preparada previamente del anticuerpo anti-DR4.

La glicosilación (incluyendo el diseño de glicosilación) de los anticuerpos también se puede alterar sin alterar la secuencia de nucleótidos subyacentes. La glicosilación depende mucho de la célula huésped utilizada para expresar el anticuerpo. Como el tipo de célula utilizada para la expresión de las glicoproteínas recombinantes, por ejemplo anticuerpos, como elementos terapéuticos potenciales es raramente la célula nativa, se pueden esperar variaciones significativas en el diseño de glicosilación de los anticuerpos (ver, por ejemplo, Hse et al., J. Biol. Chem. 272:9062-9070 [1997]). Además de la elección de las células huésped, los factores que afectan a la glicosilación durante la producción recombinante de anticuerpos incluyen el modo de crecimiento, la formulación del medio, la densidad del cultivo, la oxigenación, el pH, los esquemas de purificación y similares. Se han propuesto varios procedimientos para alterar el diseño de glicosilación conseguido en un organismo huésped particular incluyendo la introducción o sobrexpresión de ciertas enzimas implicadas en la producción de oligosacáridos (patentes US 5.047.335; 5.510.261 y 5.278.299). La glicosilación, o ciertos tipos de glicosilación, se puede retirar de manera enzimática de la glicoproteína, por ejemplo utilizando endoglicosidasa H (Endo H). Además, la célula huésped recombinante se puede dirigir genéticamente, por ejemplo, haciendo la defectuosa en ciertos tipos de procesamiento de polisacáridos. Éstas y otras técnicas similares son conocidas en la técnica.

La estructura de la glicosilación de anticuerpos se puede analizar fácilmente mediante técnicas convencionales de análisis de carbohidratos, incluyendo cromatografía de lectina, NMR, espectrometría de masa, HPLC, GPC, análisis composicional de monosacários, digestión enzimática secuencial, y HPAEC-PAD, que utiliza cromatografía de intercambio de aniones con alto pH para separar los oligosacáridos basados en la carga. Los procedimientos para liberar oligosacáridos para propósitos analíticos también son conocidos, incluyen, sin limitación, tratamiento enzimático (comúnmente realizado utilizando péptido-N-glicosidasa F/endo-\beta-galactosidasa), eliminación utilizando ambiente alcalino duro para liberar principalmente las estructuras de enlace O, y procedimientos químicos que utilizan hidracina anhidra para liberar los oligosacáridos de enlace O y N.

(viii) Anticuerpos de ejemplo

La invención aquí descrita tiene una serie de realizaciones de ejemplo. Una variedad de realizaciones típicas de la invención se describen a continuación. Las siguientes realizaciones se ofrecen solamente por propósitos ilustrativos, y no están pensadas para limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

Tal como se describe en los ejemplos a continuación, una pluralidad de anticuerpos monoclonales anti-DR4 humanos se han identificado y preparado. Ciertos de sus anticuerpos indicados como 1G11, 1E10 y 2A2, se han depositado con ATCC (PTA-3361, PTA-3359 y PTA-3360 respectivamente). En una realización, los anticuerpos monoclonales de la invención tendrán las mismas características biológicas que los anticuerpos monoclonales secretados mediante la(s) línea(s) celular(es) de hibridoma indicadas anteriormente que se han depositado con ATCC. El término "características biológicas" se utiliza para indicar las actividades in vitro y/o in vivo o las propiedades del anticuerpo monoclonal, tal como la capacidad de unirse específicamente al DR4 o bloquear, inducir o mejorar la activación del DR4 (o actividades relacionadas con el DR4). A modo de ejemplo, un anticuerpo de bloqueo puede bloquear la unión del ligando Apo-2 al DR4 o bloquear la apóptosis inducida por el ligando Apo-2 en una célula de mamífero (tal como una célula cancerígena); opcionalmente, este ligando Apo-2 consistirá en los aminoácidos 114-281 (SEQ ID NO: 3). Tal como se describe en la presente memoria (ver por ejemplo las figuras 3, 6 y 8), el anticuerpo monoclonal 1G11 se caracteriza por unirse específicamente al DR4, capaz de inducir la apóptosis, y capaz de bloquear la unión del ligando Apo-2 al DR4. Esta observación sugiere que un anticuerpo anti-DR4 que tiene un epítope que es el mismo que el sitio de unión del ligando Apo-2 en el DR4, o alternativamente, se solapa con el sitio de unión del ligando Apo-2 en el DR4 o crea una conformación estérica que evita que el ligando Apo-2 se una con el DR4, los esencial o requerida para la actividad apoptótica o contra los tumores. Sin embargo, un anticuerpo DR4 que tiene este epítope o conformación estérica puede presentar una eficiencia mejorada o potencia de esta actividad apoptótica o contra los tumores. Las propiedades y actividades de los anticuerpos DR4 también se describen en los ejemplos a continuación (y también se hace referencia en la tabla 2). Los anticuerpos monoclonales de la presente invención se unirán con los mismos epítopes que los anticuerpos 1G11, 1E10 y 2A2 aquí descritos. Esto su puede determinar mediante la realización de varios ensayos, tal como se describe aquí y en los ejemplos. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la misma especificidad que los anticuerpos DR4 específicamente indicados aquí, uno puede comparar su actividad en los ensayos de bloqueo de DR4 o ensayos de inducción de apóptosis, tal como los descritos en los ejemplos a continuación.

Los anticuerpos humanos, quiméricos, híbridos o recombinantes (así como, por ejemplo, dicuerpos o tricuerpos aquí descritos) pueden comprender un anticuerpo que tiene cadenas pesadas o ligeras de longitud completa o fragmentos de las mismas, tales como un fragmento Fab, Fab', F(ab')_{2} o Fv, un monómero o dímero de esta cadena ligera o cadena pesada, una única cadena Fv en la cual estas cadenas pesadas o ligeras se unen mediante una molécula de enlace, o que tienen dominios variables (o dominios hipervariables) de estas cadenas ligeras o pesadas combinadas con todavía otros tipos de dominios de anticuerpos.

Los anticuerpos DR4, tal como se describen aquí, poseen una o más actividades o propiedades biológicas deseadas. Estos anticuerpos DR4 son anticuerpos humanos. Tal como se describe posteriormente, los anticuerpos DR4 se puede construir o dirigir utilizando varias técnicas para conseguir estas actividades o propiedades deseadas. El anticuerpo DR4 tendrá una afinidad de unión de receptor DR4 por lo menos entre 10^{8} M^{-1} y 10^{12} M^{-1} e incluso más preferiblemente, por lo menos entre 10^{9} M^{-1} y 10^{12} M^{-1}. La afinidad de unión del anticuerpo DR4 se puede determinar si experimentación indebida probando el anticuerpo DR4 según las técnicas conocidas en la técnica, incluyendo análisis Scatchard (ver Munson et al., supra).

El anticuerpo DR4 de la invención se puede unir al mismo epítope en DR4 al cual se une el Apo-2L, o unir un epítope en DR4 y coincida o se solape con el epítope en DR4 al cual se une Apo-2L. El anticuerpo DR4 interactúa con tal manera que crea una conformación estérica que evita que el ligando Apo-2 se una al DR4. La propiedad de unión del epítope de un anticuerpo DR4 de la presente invención se puede determinar utilizando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, DR4 del anticuerpo se puede probar en un ensayo in vitro, como un ensayo de inhibición competitiva, para determinar la capacidad del anticuerpo DR4 a bloquear o inhibir la unión del Apo-2 al DR4. Opcionalmente, el anticuerpo DR4 se puede probar en un ensayo de inhibición competitiva para determinar la capacidad del anticuerpo DR4 de inhibir la unión de un polipéptido Apo-2L a una construcción DR4-Ig o a una célula que expresa DR4. Opcionalmente, el anticuerpo DR4 será capaz de bloquear o inhibir la unión del Apo-2L al DR4 por lo menos en un 50%, preferiblemente por lo menos en un 75% e incluso más preferiblemente en por lo menos un 90%, lo cual se podrá determinar, a modo de ejemplo, en un ensayo de inhibición competitiva in vitro utilizando una forma soluble de ligando Apo-2 (TRAIL) (tal como la secuencia de dominio extracelular 114-281 descrita en Pitti et al., J. Biol. Chem., supra) y un DR4 ECD-IgG (tal como se describe en el ejemplo 1). La propina de unión del epítope de un anticuerpo DR4 también se puede determinar utilizando ensayos in vitro para probar la capacidad del anticuerpo DR-4 a bloquear la apóptosis inducida con Apo-2L. Opcionalmente, el anticuerpo DR4 será capaz de bloquear por inhibir la apóptosis inducida por Apo-2L en un tipo de célula cancerosa de mama en por lo menos un 50%, preferiblemente por lo menos en un 75%, e incluso más preferiblemente por lo menos en un 90% o 95%, lo cual se puede determinar, por ejemplo, en un ensayo in vitro.

El anticuerpo DR4 comprenderá un anticuerpo agonista que tiene una actividad comparable con el ligando Apo-2 (TRAIL). Preferiblemente, este anticuerpo de agonista DR4 inducirá la apóptosis en por lo menos un tipo de línea de célula cancerígena o tumoral o tumor primario. La actividad apoptótica de un anticuerpo D4 agonista se puede determinar usando ensayos conocidos in vitro o in vivo. Ejemplos de una variedad de estos ensayos in vitro y in vivo son bien conocidos en la técnica. La actividad apoptótica in vivo se puede determinar utilizando técnicas conocidas tales como la unión de Anexina V. La actividad apoptótica in vivo se puede determinar, por ejemplo, midiendo la reducción en el límite o el volumen del tumor.

Tal como se indica anteriormente, los anticuerpos aquí descritos tiene una serie de propiedades que incluyen la capacidad de modular ciertas interacciones y/o procesos fisiológicos. Tal como se muestra en los ejemplos 5 y 7, los anticuerpos aquí descritos pueden inducir apóptosis mediada con DR4. En una realización típica de la invención, los anticuerpos aquí descritos inducen de manera agonística la apóptosis mediada con DR4 en células 9D (una línea celular linfoide humana que expresa DR4) tal como se mide mediante tintado con anexina V. En una organización específica de la invención, la actividad agonista del anticuerpo se mejora mediante la reticulación de los anticuerpos con IgG Fc anti-humano. En una realización preferida de la invención, esta apóptosis mejorada es comparable con la actividad apoptótica del Apo-2L en células 9D. En una realización muy preferida, las células 9D expuestas al anticuerpo DR4 presentan un nivel de apóptosis que está en aproximadamente el 20%, y más preferiblemente en aproximadamente el 10%, el nivel de apóptosis observada en células 9D expuestas a Apo-2L.

Tal como se muestra en el ejemplo 6, los anticuerpos aquí descritos también pueden inhibir la unión de ligando Apo-2 con el DR4. En una realización ilustrativa, los anticuerpos aquí descritos bloquean la unión de ligando Apo-2 bioteñido con el DR4-IgG humano, tal como se mide en un ensayo inmunoadsorbente vinculado con enzimas.

Tal como se observó en el ensayo de poli ADP-ribosa polymerasa (PARP) mostrado en el ejemplo 8, las células tratadas con los anticuerpos DR4 humanos aquí descritos generan un PARP degradado (85Kd). En una realización típica de esta propiedad que se muestra en la figura 4, las células 9D tratadas con anticuerpo anti-DR4 humano y reticuladas con IgG Fc anti-humano demuestran la presencia de un PARP 85 Kd dividido. En realizaciones muy preferidas de la invención, la relación relativa de PARP intacto (116 Kd) respecto al PARP degradado (85 Kg) observado en células 9D tratadas con células de anticuerpo anti-DR4 humano es comparable con la relación relativa de PARP intacto (116 Kd) respecto al PARP degradado (85 Kg) observado en células 9D tratadas con ligando Apo-2 (ver, por ejemplo, la figura 4).

Los anticuerpos aquí descritos también presentan una pluralidad de características relacionadas con su capacidad a unirse de manera inmunoespecífica a epítopes DR4. Por ejemplo, los anticuerpos aquí descritos tiene la capacidad de unirse a epítopes específicos en la molécula DR4 humana. Además, los anticuerpos aquí descritos comprenden secuencias de aminoácidos específicas que permiten su unión a estos epítopes DR4 humanos. Los anticuerpos aquí descritos también tiene la capacidad de inhibir de manera competitiva la unión inmunoespecífica de anticuerpos que reconocen un epítope idéntico o casi idéntico en una molécula DR4. En una realización típica representada en el ejemplo 2, la competición del anticuerpo para la unión de los epítopes DR4 se evalúa en una competición ELISA. En realizaciones preferidas de la invención, el epítope DR4 que se une a un primer anticuerpo no marcado compite con un epítope DR4 que se une con un segundo anticuerpo no marcado. En esta realización, si el anticuerpo marcado y el anticuerpo no marcado reconocen el mismo epítope, o uno que se solapa, el anticuerpo no marcado competirá con el anticuerpo marcado por la unión del epítope DR4 resultante en una unión disminuida del anticuerpo marcado.

Una realización típica de la invención es un anticuerpo anti-DR4 aislado que tiene las mismas características biológicas de un anticuerpo monoclonar producido mediante una línea celular de hibridoma a partir del grupo que consiste en el Números de Acceso de la American Type Culture Collection: PTA-3359, PTA-3360 y PTA-3361. La invención proporciona un anticuerpo monoclonar receptor anti-DR4 aislado, que comprende un anticuerpo que se une al receptor DR4 que comprende los aminoácidos 1 a 218 de SEQ ID NO:1, e inhibe de manera competitiva la unión de un anticuerpo monoclonal producido mediante un hibridoma depositado como PTA-3359, PTA-3360 o PTA-3361 con el receptor DR4, se une al mismo epítope del receptor DR4 al cual se une un anticuerpo monoclonal producido mediante un hibridoma depositado como PTA-3359, PTA-3360 o PTA-3361, tiene una afinidad de unión con el receptor DR4 de por lo menos 10^{8} M^{-1} a 10^{12} M^{-1}, anticuerpo humano, inhibe la unión del ligando Apo-2 que comprende los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO: 3 al receptor DR4 que comprende los aminoácidos 1 a 218 de SEQ ID NO:1 e induce la apoptosis en por lo menos un tipo de célula de mamífero. Las realizaciones específicas de la invención incluyen los hibridomas depositados como ATCC PTA-3359, PTA-3360 y PTA-3361. Las realizaciones específicas relacionadas de la invención incluyen los anticuerpos monoclonales producidos mediante los hibridomas depositados como ATCC PTA-3359, PTA-3360 y PTA-3361.

Típicamente, los anticuerpos del receptor anti-DR4 del ligando Apo-2 de bloque de la invención indujeron apoptosis en por lo menos un tipo de células de mamífero. En una realización preferida, los anticuerpos del receptor anti-DR4 de la invención neutralizan la actividad apoptótica del ligando Apo-2 que comprende los aminoácidos 114-281 de SEQ ID NO:3 en por lo menos un tipo de células cancerígenas de mamífero. Preferiblemente, las células cancerígenas de mamífero son células de colon o células de pulmón.

Típicamente, los anticuerpos de los receptores anti-DR4 aquí descritos, al unirse al receptor DR4 expresado en o sobre una célula de mamífero, activan una o más moléculas seleccionadas entre el grupo que consiste en caspasa 3, caspasa 8, caspasa 10 y FADD en el citoplasma de la célula de mamífero. Realizaciones muy preferidas de la invención incluyen un anticuerpo monoclonal del receptor anti-DR4 aislado, que comprende un anticuerpo que se une al receptor DR4 que comprende los aminoácidos 1 a 218 de SEQ ID NO:1, inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo monoclonal producido mediante un hibridoma depositado como ATCC PTA-3359, PTA-3360 o PTA-3361 en el receptor DR4 e induce la apoptosis en por lo menos un tipo de célula de mamífero. En realizaciones representativas, las células de mamífero son células cancerígenas, típicamente células de cáncer de colon o pulmón. En una realización específica, las células de mamífero son células 9D.

Otra realización de la invención es un anticuerpo monoclonal de receptor anti-DR4 aislado, que comprende un anticuerpo que se une al receptor DR4 que comprende los aminoácidos 1 a 218 de SEQ ID NO:1, en el que el anticuerpo inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo monoclonal producido mediante el hibridoma depositado como ATCC PTA-3359, PTA-3360 o PTA-3361 con el receptor DR4, y en el que el anticuerpo inhibe la unión del ligando Apo-2 que comprende los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO:3 con el receptor DR4 que comprende los aminoácidos 1 a 218 de SEQ ID NO:1, y en el que también, al unirse al receptor DR4 expresado en o sobre una célula de mamífero, activa una o más moléculas seleccionadas entre el grupo que consiste en caspasa 3, caspasa 8, caspasa 10 y FADD en el citoplasma de una célula de mamífero.

Realizaciones adicionales de la invención incluyen un anticuerpo receptor anti-DR4 aquí descrito que está vinculado con uno o más polímeros no proteináceos seleccionados entre el grupo que consiste en polietileno glicol, polipropileno glicol, y polioxialquileno. En una realización alternativa, un anticuerpo de receptor anti-DR4 aquí descrito está vinculado con un agente o enzima citotóxica. En otra realización, un anticuerpo de receptor anti-DR4 aquí descrito está vinculado con radioisótopo, un compuesto fluorescente o un compuesto quimioluminiscente. Opcionalmente, un anticuerpo de receptor anti-DR4 aquí descrito es glicosilatado o alternativamente, no glicosilatado.

Tal como se describe en detalle a continuación, los anticuerpos de la invención se pueden usar en una variedad de procedimiento de modulación de procesos fisiológicos. Una realización de la invención incluye el uso de un anticuerpo anti-DR4 aquí descrito para la preparación de un medicamento para inducir apoptosis en células de mamífero. Las células de mamífero son típicamente células cancerígenas. El anticuerpo de receptor anti-DR4 usado en estos procedimientos en un anticuerpo humano. Otra realización de la invención es un procedimiento de inducción de apoptosis en células de mamífero que comprende la exposición de células de mamífero que expresan receptor DR4 a una cantidad terapéuticamente efectiva de un anti-DR4 aislado.

3. Triacuerpos

Los triacuerpos también están dentro del alcance de la invención. Estos anticuerpos están descritos, por ejemplo en Iliades et al., supra y Kortt et al., supra.

4. Otras Modificaciones

Otras modificaciones de los anticuerpos DR4 se contemplan aquí. Los anticuerpos de la presente invención se pueden modificar conjugando el anticuerpo a un agente citotóxico (como una molécula de toxina) o una enzima de activación de promedicamento que convierte un promedicamento (por ejemplo un agente quimioterapéutico de peptidil, ver WO81/01145) en un fármaco contra el cáncer activo. Ver, por ejemplo, WO 88/07378 y patente US 4.975.278. Esta tecnología también es llamada "Terapia de promedicamento mediada con enzimas dependiente del anticuerpo" (ADEPT).

El componente de la enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un promedicamento de tal manera que la convierte en su forma citotóxica más activa. Enzimas que son útiles en el procedimiento de esta invención incluyen, pero no están limitadas a las mismas, fosfatasa alcalina útil para convertir promedicamentos que contienen fostato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir promedicamentos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina deaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco contra el cáncer, 5-fluorouracil; proteasas, tales como proteasa serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir promedicamentos que contienen péptidos en fármacos libres; caspasas tales como caspasa-3; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir promedicamentos que contienen sustituyentes de aminoácidos D; enzimas de división de carbohidratos tales como beta-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir promedicamentos glicosilatadas en fármacos libres; beta-lactamasa útil para convertir fármacos derivatizados con beta-lactamos en fármacos libres; y amidasas de penicilina, tal como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útil para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetil o fenilacetil, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, también se pueden usar anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas", para convertir los promedicamentos de la invención en fármacos activos libres (ver, por ejemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Los conjugados de anticuerpo-abzima se pueden preparar tal como se describe aquí para el suministro de la abzima a una población de células tumorales.

Las enzimas se pueden unir de manera covalente con los anticuerpos mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tal como el uso de reagentes de reticulación heterobifuncional. Alternativamente, se pueden construir proteínas de fusión que comprenden por lo menos la región de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención enlazadas con por lo menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención usando técnica de ADN recombinante bien conocida en la técnica (ver, por ejemplo, Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984).

Se contemplan modificaciones de anticuerpos adicionales. Por ejemplo, el anticuerpo se puede vincular con una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos, o copolímeros de polietileno glicol y polipropileno glicol. El anticuerpo también se puede atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente), en sistemas ed suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones: Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed., (1980). Para aumentar la vida media del suero del anticuerpo, uno puede incorporar un epítope de unión de receptor salvaje en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo), tal como se describe en la patente US 5.739.277, por ejemplo. Tal como se usa aquí, el término "epítope de unión de receptor salvaje" se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo, IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, o IgG_{4}) que es responsable de aumentar la vida media del suero in vivo de la molécula IgG.

Los anticuerpos anti-DR4 aquí descritos también se pueden formular como inmunoliposomas. Las liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tal como se describen en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); y las patentes US. 4.485.045 y 4.544.545. Las liposomas con tiempo de circulación mejorada se describen en la patente US 5.013.556. Liposomas particularmente útiles se pueden generar mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada de PEG (PEG-PE). Las liposomas se extruden a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar a las liposomas descritas en Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como Doxorubicina) está opcionalmente contenido en la liposoma. Ver Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989).

Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos DR4 "reticulados". El término "reticulado" tal como se usa aquí se refiere a la unión de por lo menos dos moléculas IgG juntas para forma una (o única) molécula. Los anticuerpos DR4 se pueden reticular usando varias moléculas de enlace, preferiblemente los anticuerpos DR4 se reticulan usando una molécula anti-IgG, complemento, modificación química o ingeniería molecular. Se aprecia por parte de los expertos en la materia que el complemento tiene una afinidad relativamente alta a las moléculas de anticuerpo una vez los anticuerpos se unen a la membrana superficial de la célula. En consecuencia, se cree que el complemento se puede usar como molécula de reticulación para enlazar dos o más anticuerpos anti-DR4 unidos a la membrana de la superficie de la célula. La reticulación de los anticuerpos anti-DR4 humanos también se describe en los ejemplos usando Fc IgG anti-ratón de cabra o IgG Fc anti-humano de cabra.

5. Procedimientos Recombinantes

La invención también proporciona ácidos nucléicos aislados que codifican anticuerpos DR4 como se describe aquí, vectores y células huésped que comprenden el ácido nucléico, y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo.

Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucléico que lo codifica es aislado e insertado en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo es fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican el anticuerpo). Muchos vectores están disponibles. Los componentes vectores generalmente incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento reforzador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción.

Los presentes procedimientos incluyen procedimientos para la producción de anticuerpos anti-DR4 quiméricos o recombinantes que comprende las etapas de proporcionar un vector que comprende una secuencia de ADN que codifican un anticuerpo anti-DR4 de cadena ligera o cadena pesada (o ambas una cadena ligera y una cadena pesada), transfectar o transformar una célula huésped con el vector, y cultivar la célula(s) huésped bajo condiciones suficientes para producir el producto recombinante de anticuerpo anti-DR4.

(i) Componente de secuencia de señal

El anticuerpo anti-DR4 de esta invención puede producirse de forma recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de corte específico en el término N de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia de señal heteróloga seleccionada preferentemente es una que es reconocida y procesada (por ejemplo, cortada mediante una peptidasa señal) por la célula huésped. Para células huésped procarióticas que no reconocen y procesan la secuencia de señal del anticuerpo nativo, la secuencia señal es sustituida por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, a partir del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o guías enterotoxina II estables al calor. Para secreción de levadura la secuencia de señal nativa puede ser sustituida mediante, por ejemplo, la guía invertasa de levadura, guía del factor \alpha (incluyendo guías del \alpha-factor Saccharomyces y Kluyveromyces), o guía de fosfatasa ácida, la guía C. albicans glucoamilasa, o la señal descrita en WO 90/13646. En la expresión celular mamífera, están disponibles las secuencias de señal mamífera así como guías de secreción viral, por ejemplo, la señal del herpes simple gD.

El ADN para dicha región precursora está ligada en el marco de lectura del ADN que codifica el anticuerpo.

(ii) Origen del componente de replicación

Tanto los vectores de expresión y clonado contienen una secuencia de ácido nucléico que permite que el vector se replique en una o más células huéspedes seleccionadas.

Generalmente, en vectores de clonado esta secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico huésped, e incluye orígenes de secuencias de replicación o replicantes autónomamente. Dichas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras, y virus. El origen de replicación a partir del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas, el origen plásmido 2\mu es adecuado para levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células mamíferas. Generalmente, el origen del componente de replicación no es necesario para vectores de expresión mamíferos (el origen SV40 puede típicamente ser utilizado sólo porque contiene el promotor temprano).

(iii) Selección del componente de gen

Los vectores de expresión y clonado pueden contener un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias autotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que son exitosamente transformadas con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y por lo tanto sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de dicha selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenolico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores adecuados seleccionables para células mamíferas son aquellos que permiten la identificación de células competentes para tomar el ácido nucléico del anticuerpo, tales como DHFR, timidina quinasa, metalotioneina-I y -II, preferentemente genes metalotioneina de primate, adenosina deaminasa, ornitina decarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR son identificadas primero mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR de tipo salvaje es la línea de células de ovario de hámster Chino (CHO) deficiente en DHFR actividad.

Alternativamente, células huésped (particularmente huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-DR4, proteína de tipo salvaje DHFR, y otro marcador seleccionable tal como aminoglicosido 3'-fosfotransferasa (APH) pueden ser seleccionadas mediante crecimiento de células en un medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosidico, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Ver Patente U.S. No. 4.965.199.

Un gen adecuado de selección para utilizar en levadura es el gen txp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). El gen txp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la habilidad de crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión de trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un ambiente efectivo para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptofano. De forma similar, cepas de levadura Leu2-deficientes (ATCC 20.622 o 38.626) son complementadas mediante plásmidos conocidos que soportan el gen Leu2.

Además, vectores derivados a partir del plásmido circular 1,6 \mum pKD1 pueden utilizarse para la transformación de levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, un sistema de expresión para producción a gran escala de quinosina de ternero recombinante se informó para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). También se han descrito vectores de expresión multi-copia estables para la secreción de albumina de suero recombinante madura humana mediante cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

(iv) Componente promotor

Los vectores de expresión y clonado usualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está operativamente unido al ácido nucléico del anticuerpo. Promotores adecuados para utilizar con huéspedes procarióticos incluyen el promotor phoA, sistemas promotores \beta-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor triptofano (trp), y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, otros promotores bacterianos conocidos son adecuados. Promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente unida al ADN que codifica el anticuerpo anti-DR4.

Son conocidas secuencias de promotor para eucariotas. Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen una región AT-rica ubicada aproximadamente 25 a 30 bases antes del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases antes del inicio de la transcripción de varios genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de muchos genes eucarióticos hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias son adecuadamente insertadas en vectores de expresión eucariótica.

Ejemplos de secuencias de promoción adecuadas para utilizar con huéspedes levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.

Otros promotores levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada mediante las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores adecuados para utilizar en la expresión de levaduras son adicionalmente descritos en 73.657. Los mejoradores de levadura también son ventajosamente utilizados con promotores de levadura.

La transcripción del anticuerpo anti-DR4 a partir de vectores en células huéspedes mamíferas está controlada, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de los genomas de virus tales como virus polioma, virus de la difteria aviar, adenovirus (tales como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B y más preferentemente Virus Simian 40 (SV40), a partir de promotores heterólogos mamíferos, por ejemplo, el promotor actina o un promotor inmunoglobulina, a partir de promotores de shock térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 son convenientemente obtenidos como un fragmento de restricción SV40 que también contiene el origen viral de replicación SV40. El promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano es convenientemente obtenido como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino como un vector se describe en la Patente U.S. No. 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la Patente U.S. No. 4.601.978. Ver también Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) sobre la expresión de cDNA \beta-interferon humano en células de ratones bajo el control de un promotor timidina quinasa a partir de virus simplex de herpes. Alternativamente, el terminal largo del virus rous de sarcoma repetido puede ser utilizado como el promotor.

(v) Componente elemento mejorador

La transcripción de un AND que codifica el anticuerpo anti-DR4 de esta invención mediante eucariotas superiores con frecuencia es incrementado a mediante la inserción de una secuencia mejoradora en el vector. Muchas secuencias mejoradores son conocidas a partir de genes mamíferos genes (globina, elastasa, albumina, \alpha-fetoproteína, e insulina). Típicamente, sin embargo, se utilizará un mejorador a partir de un virus de célula eucariótica. Ejemplos incluyen el mejorador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (bp 100-270), el mejorador promotor temprano de citomegalovirus, el mejorador polioma en el lado tardío del origen de replicación, y mejoradores adenovirus. Ver también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos mejoradores para la activación de promotores eucarióticos. El mejorador puede ser empalmado en el vector en una posición 5' o 3' a la secuencia codificadora del anticuerpo, pero está preferentemente ubicada en el sitio 5' a partir del promotor.

(vi) Componente de terminación de transcripción

Los vectores de expresión usados en células huéspedes eucarióticas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanas, o células nucleadas a partir de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el mARN. Dichas secuencias están comúnmente disponibles a partir de las regiones 5' y, ocasionalmente 3', no traducidas de ADNs o cADNs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mARN que codifica el anticuerpo multivalente. Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino. Ver WO94/11026 y el vector de expresión allí descrito.

(vii) Células huéspedes de selección y transformación

Las células huéspedes adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores aquí son las procariotas, levadura, o células eucarióticas descritas anteriormente. Las procariotas adecuadas para este propósito incluyen eubacteria, tal como organismos Gram-negativo o Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en in DD 266.710 publicado el 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped de colonación E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cadenas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), y E. coli W3110 (ATCC 27.325) son adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos más que limitativos.

Además de las procariotas, los micriobios eucarióticos tales como hongos filamentos o levaduras son huéspedes de clonado o expresión adecuados para vectores de codificación de anticuerpo DR4. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de panadero, es la más comúnmente usada entre los microorganismos huésped eurocarióticos menores. Sin embargo, una serie de otros géneros, especies, y cadenas están comúnmente disponibles y son útiles aquí, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos glicosilatados se deriva de organismos multicelulares. Ejemplos de células invertebradas incluyen células de plantas e insectos. Numerosas cadenas y variantes baculovirales y correspondientes células huésped de insectos permisivas de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de fruta), y Bombyx mori se han identificado. Una variedad de cadenas virales para transfección están públicamente disponibles, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cadena Bm-5 de Bombyx mori NPV, y estos virus se pueden usar como el virus aquí según la presente invención, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden usar cultivos de células de plantas de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco como huéspedes.

Sin embargo, el interés ha sido el mayor en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) ha llegado a ser un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos últimos son línea CV1 de riñón de mono transformada mediante SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embriónico humano (293 ó 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcino cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC. CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; una línea de hetapoma humano (Hep G2); y células de mieloma o linfoma (por ejemplo células Y0, J558L, P3 y NS0) (ver la patente US 5.807,715).

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonado descritos anteriormente para la producción y clonado de anticuerpos en medio nutriente convencional modificados como apropiados para la inducción de promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

(viii) Cultivo de células huésped

Las células huésped usadas para producir el anticuerpo de esta invención se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente tales como Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), las patentes US 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Re. 30.985 se pueden usar como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede suplementar como sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferina o factor de crecimiento epidermal), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN^{TM}), elementos de traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquiera otros suplementos necesarios también se pueden incluir en concentraciones apropiadas que serán conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tal como la temperatura, pH, y similares, son las previamente usadas con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para los expertos en la materia.

(ix) Purificación

Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir de manera intracelular, en el espacio periplásmico, o secretar directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce de manera intracelular, como primera etapa, los residuos en partículas, células huésped o fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. En breve, pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los residuos celulares se pueden retirar mediante centrifugación. Donde el anticuerpo se secreta en el medio, los supernatantes de estos sistemas de expresión generalmente se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF se puede incluir en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición del anticuerpo preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La conveniencia de la proteína A como ligando de afinidad depende de las especies y el isótopo de cualquier región Fc de inmunoglobulina Fc que esté presente en el anticuerpo. La proteína A se puede usar para purificar anticuerpos que están basados en cadenas pesadas \gamma1, \gamma2, o \gamma4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para \gamma3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual se fija el ligando de afinidad es muy a menudo agarosa, pero otras matrices están disponibles. Matrices mecánicamente estables tales como de vidrio de poro controlado o de poli(estirenodivinil)benzeno permiten índices de flujo más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden conseguir con agarosa. Si el anticuerpo comprende un dominio C_{H}3, la resina Bakerbond ABX^{TM} (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteínas tales como fraccionación en una columna de intercambio de iones, precipitación de etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina SEPHAROSE^{TM}, cromatografía sobre una resina de intercambio de aniones o cationes (tales como una columna de ácido poliaspártico), cromatofocalización, SDS-PAGE, y precipitación de sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar.

B. Usos para los Anticuerpos DR4

Los anticuerpos DR4 de la invención tienen varias utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos agonísticos DR4 se pueden utilizar en procedimientos médicos para el tratamiento de condiciones patológicas en mamíferos, tales como cáncer o enfermedades relacionadas inmunes. En los procedimientos médicos, el medicamento que comprende el anticuerpo DR4, preferiblemente un anticuerpo agonístico, se administra a un mamífero, en solitario o en combinación con otros agentes o técnicas terapéuticas.

El diagnóstico en mamíferos de las diferentes condiciones patológicas aquí descritas se puede hacer por parte del experto en la materia. Técnicas de diagnóstico están disponibles en la técnica que permiten, por ejemplo, el diagnóstico o detección de cáncer o enfermedades inmunes relacionadas en un mamífero. Por ejemplo, los cánceres se pueden identificar a través de técnicas, incluyendo, pero no estando limitadas a las mismas, palpación, análisis de sangre, rayos x, NMR y similares. Las enfermedades inmunes relacionadas también se pueden identificar fácilmente. En eritematosis de lupus sistémica, el mediador central de la enfermedad es la producción de anticuerpos auto-reactivos en proteínas/tejidos propios y la posterior generación de inflamación inmune mediada. Múltiples órganos y sistemas son afectados clínicamente, incluyendo riñón, plumón, sistema de músculos y esqueleto, mucocutáneo, ojo, sistema nervioso central, sistema cardiovascular, sistema gastrointestinal, médula ósea y sangre.

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria autoinmune sistémica crónica que principalmente involucra la membrana sinovial de múltiples articulaciones con lesión resultante en el cartílago articular. La patogénesis es T linfocito dependiente y está asociada con la producción de factores reumatoides, auto-anticuerpos dirigidos contra el mismo IgG, con la formación resultante de complejos inmune que logran altos niveles en el fluido de la articulación y la sangre. Estos complejos en la articulación pueden inducir el infiltrado marcado de linfocitos y monocitos en el sinovio y subsiguientes cambios sinoviales marcados; el espacio de la articulación/fluido es infiltrado mediante células similares con la adición de numerosos neutrofilos. Los tejidos afectados son primariamente las articulaciones, con frecuencia en un patrón simétrico. Sin embargo, también se produce la enfermedad extra-articular en dos formas principales. Una forma es el desarrollo de lesiones extra-articulares con enfermedad de la articulación progresiva en curso y lesiones típicas de fibrosis pulmonar, vasculitis, y úlceras cutáneas. La segunda forma de enfermedad extra-articular es el llamado síndrome de Felty que se produce más tarde en el curso de la enfermedad RA, algunas veces después de que la articulación se haya vuelto estática, e implica la presencia de neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia. Esto puede ser acompañado por vasculitis en múltiples órganos con formaciones de infartos, úlceras de piel y gangrena. Los pacientes con frecuencia también nódulos reumatoides en el tejido subcutis que recubre articulaciones afectadas; en la etapa tardía de los nódulos tienen centros necróticos rodeados por un infiltrado de células inflamatorias mezcladas. Otras manifestaciones que pueden ocurrir en RA incluyen: pericarditis, pleuritis, arteritis coronaria, pneumonitis interstitial con fibrosis pulmonar, queratoconjuntivitis seca, y nódulos reumatoides.

La artritis crónica juvenil es una enfermedad inflamatoria idiopática crónica que comienza con frecuencia a menos de 16 años de edad. Su fenotipo tiene algunas similitudes con la RA; algunos pacientes que son positivos al factor reumatoide son clasificados como artritis reumatoide juvenil. La enfermedad se subclasifica en tres categorías principales: pauciarticular, poliarticular, y sistémica. La artritis puede ser severa y es típicamente destructiva y conduce a anquilosis de la articulación y crecimiento retardado. Otras manifestaciones pueden incluir uveítis anterior crónica y amiloidosis sistémica.

Las espondiloartropatías son un grupo de desórdenes con algunas características clínicas comunes y la asociación común con la expresión del producto del gen HLA-B27. Los desórdenes incluyen: espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter (artritis reactiva), artritis asociada con enfermedad inflamatoria de los intestinos, espondilitis asociada con psoriasis, espondiloartropatía juvenil y espondiloartropatía nodiferenciada. Características distinrivas incluyen sacroileitis con o sin espondilitis; artritis inflamatoria asimétrica; asociación con HLA-B27 (un alelo serológicamente definido del locus HLA-B de clase I MHC); inflamación ocular, y ausencia de autoanticuerpos asociados con otra enfermedad reumatoide. La célula más implicada como clave para la inducción de la enfermedad es el linfocito CD8+ T, una célula que apunta al antigen presentado por las moléculas de clase I MHC. Las células CD8+ T pueden reaccionar contra el alelo de clase I MHC HLA-B27 como si fuera un péptido extraño expresado por moléculas MHC clase I. Se ha presumido que un epitope de HLA-B27 puede imitar a un epitope antigenico bacteriano o de otro microbio e inducir así una respuesta de células CD8+ T.

La esclerosis sistémica (escleroderma) tiene una etiología desconocida. Un sello de la enfermedad es la induración de la piel; probablemente esto es inducido por un proceso inflamatorio activo. El escleroderma puede ser localizado o sistémico; las lesiones vasculares son comunes y la lesión de célula endotelial en la microvasculatura es un evento temprano e importante en el desarrollo de la esclerosis sistémica; la lesión vascular puede ser inmuno mediada. Una base inmunológica está implicada con la presencia de infiltrados celulares mononucleares en las lesiones cutáneas y la presencia de anticuerpos anti-nucleares en muchos pacientes. Con frecuencia ICAM-1 es regulado al alza sobre la superficie celular de los fibroblastos en lesiones de piel sugiriendo que la interacción de las células T con estas células puede tener un rol en la patogénesis de la enfermedad. Otros órganos implicados incluyen: el tracto gastrointestinal: atrofia del músculo liso y fibrosis que resultan en peristalsis/motilidad anormal; riñón: proliferación subendotelial íntima concéntrica que afectan arterias pequeñas arqueadas e interlobulares con flujo sanguíneo cortical renal reducido resultante, resulta en proteinuria, azotemia e hipertensión; músculo esquelético: atrofia, fibrosis intersticial; inflamación; pulmón: pneumonitis intersticial y fibrosis intersticial; y corazón: necrosis de banda de contracción, cicatrización/fibrosis.

Miopatías inflamatorias idiopáticas incluyendo dermatomiositis, polimiositis y otros son desórdenes de inflamación muscular crónico de etiología desconocida que resulta en debilidad muscular. La lesión/inflamación muscular con frecuencia es simétrica y progresiva. Los anticuerpos están asociados con la mayoría de formas. Estos anticuerpos miositis-específicos están dirigidos contra e inhiben la función de componentes, proteína y ARN, implicados en síntesis de proteína.

El síndrome de Sjogren es debido a una inflamación inmuno-mediada y subsiguiente destrucción funcional de las glándulas lagrimales y las glándulas salivales. La enfermedad puede estar asociada con o acompañada por enfermedades inflamatorias del tejido conectivo. La enfermedad está asociada con la producción de anticuerpos contra antígenos Ro y La, ambos de los cuales son pequeños complejos ARN-proteína. Las lesiones resultan en queratoconjuntivitis seca, xerostomía, con otras manifestaciones o asociaciones incluyendo cirosis biliar, neuropatía periférica o sensorial, y púrpura palpable.

Las vasculitis sistémicas son enfermedades en las cuales la lesión primaria es inflamación y subsiguiente daño a los vasos sanguíneos que resulta en isquemia/necrosis/degeneración de tejidos suministrados por los vasos afectados y eventual disfunción de órgano final en algunos casos. Las vasculitis también pueden producirse como una lesión secundaria o secuela de otras enfermedades inmune-inflamatorias mediadas tales como artritis reumatoide, esclerosis sistémica, etc., particularmente en enfermedades también asociadas con la formación de complejos inmunes. Enfermedades en el grupo de vasculitis sistémica primaria incluyen: vasculitis necrotizante sistémica: poliarteritis nodosa, angitis alérgica y granulomatosis, poliangitis; granulomatosis de Wegener; granulomatosis linfomatoide; y arteritis de células gigantes. Vasculitis misceláneas incluyen: síndrome de nodo linfático mucocutáneo (MLNS o enfermedad de Kawasaki), vasculitis CNS aisladas, enfermedad de Behet, tromboangitis obliterans (enfermedad de Buerger) y venulitis cutáneas necrotizante. El mecanismo patogénico de la mayoría de tipos de vasculitis enumerados se cree que se deben primariamente a la deposición de complejos de inmunoglobulina en la pared del vaso y la subsiguiente inducción de una respuesta inflamatoria ya sea vía ADCC, activación del complemente, o ambas.

La sarcoidosis es una condición de etiología desconocida que se caracteriza por la presencia de granulomas epitelioides en prácticamente cualquier tejido en el cuerpo; implicación del pulmón es la más común. La patogénesis implica la persistencia de macrofagos y células linfoides activadas en sitios de la enfermedad con las subsiguientes secuelas crónicas resultantes de la liberación productos activos local y sistemáticamente liberados por este tipo de células.

La anemia hemolítica autoinmune incluyendo anemia autoinmune hemolítica, pancitopenia inmune, y hemoglobinuria paroxismal nocturna es un resultado de la producción de anticuerpos que reaccionan con antígenos expresados sobre la superficie de las células rojas de la sangre (y en algunos casos otras células de la sangre incluyendo también plaquetas) y es un reflejo de la extracción de esas células revestidas de anticuerpos a través de una lisis mediada por complemento y/o mecanismos ADCC/Fc-receptor-mediados.

En trombocitopenia autoinmune incluyendo púrpura trombocitopénica, y trombocitopenia inmuno-mediada en otras presentaciones clínicas, la destrucción/extracción de plaquetas se produce como resultado tanto de un anticuerpo o complemento que se une a las plaquetas y la subsiguiente extracción mediante lisis de complemento, ADCC o mecanismos FC-receptor mediados.

La tiroiditis incluyendo enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis juvenil linfocítica, y tiroiditis atrófica, son el resultado de una respuesta autoinmune contra antígenos tiroideos con producción de anticuerpos que reaccionan con proteínas presentes en y con frecuencia específicas para la glándula tiroides. Existen modelos experimentales que incluyen modelos espontáneos: ratas (ratas BUF y BB) y pollos (cepa de pollos obesos); modelos inducibles: inmunización de animales tanto con tiroglobulina, antígeno tiroide microsomal (peroxidasa tiroidea).

La diabetes mellitus tipo I o diabetes insulino-dependiente es la destrucción autoinmune de islotes pancreáticos de células \beta; esta destrucción está mediada por auto-anticuerpos y células T auto-reactivas. Los anticuerpos de la insulina o del receptor insulina también puede producir el fenotipo de no sensibilidad a la insulina.

Las enfermedades renales inmunes mediadas, incluyendo glomerulonefritis y nefritis tubulointersticial, son el resultado de lesión mediada por anticuerpos o linfocitos T al tejido renal tanto directamente como un resultado de la producción de anticuerpos autoreactivos o de células T contra antígenos renales o indirectamente como un resultado de la deposición de anticuerpos y/o complejos inmunes en el riñón que son reactivos contra otros antígenos no renales. Por lo tanto otras enfermedades inmuno-mediadas que resultan en la formación de complejos inmunes pueden también inducir enfermedad renal inmuno mediada como una secuela indirecta. Tanto los mecanismos inmunes directo e indirecto resultan en respuesta inflamatoria que produce/induce el desarrollo de la lesión en tejidos renales con el deterioro resultante de la función del órgano y en algunos casos progresión al fallo renal. Tanto los mecanismos inmunes humoral y celular pueden estar implicados en la patogénesis de las lesiones.

Las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, incluyendo esclerosis múltiple; polineuropatía idiopática desmielinizante o síndrome Guillain-Barr; y polineuropatías desmielinizantes inflamatorias crónicas, se cree que tienen una base to autoinmune y resultan en la desmielinización del nervio como un resultado de daño causado a los oligodendrocitos o a la mielina directamente. En EM está la evidencia para sugerir que la inducción y la progresión de la enfermedad es dependiente de los linfocitos T. La esclerosis múltiple es una enfermedad desmielinizante que es linfocito T -dependiente y tiene tanto un curso recaída-remisión o un curso crónico progresivo. La etiología es desconocida; sin embargo, infecciones virales, predisposición genética, ambiente, y autoinmunidad, todos contribuyen. Las lesiones contienen infiltrados predominantemente de linfocitos T mediados, células microgliales y macrófagos infiltrados; linfocitos CD4+T son el tipo celular predominante en las lesiones. El mecanismo de la muerte de la célula oligodendrocito y la subsiguiente desmielinización no es conocido pero está probablemente dirigido por linfocitos T.

La enfermedad inflamatoria y fibrotica del pulmón, incluyendo neumonías eosinofilicas; fibrosis idiopática pulmonar, y neumonitis hipersensible puede implicar una respuesta desregulada inmuno-inflamatoria. La inhibición de esta respuesta sería de beneficio terapéutico.

La enfermedad de la piel autoinmune o inmuno-mediada incluyendo enfermedades vesiculares de la piel, eritema multiforme, y dermatitis de contacto son mediadas por auto-anticuerpos, cuya génesis es linfocito T -dependiente.

La psoriasis es una enfermedad inflamatoria linfocito T - mediada. Las lesiones contienen infiltrados de linfocitos T, macrófagos y células de proceso antígeno, y algunos neutrófilos.

Las enfermedades alérgicas, incluyendo asma; rinitis alérgica; dermatitis atópica; hipersensibilidad alimentaria; y urticaria son linfocito T dependientes. Estas enfermedades están predominantemente mediadas por inflamación linfocito T inducida, inflamación IgE mediada o una combinación de ambas.

Las enfermedades asociadas a los transplantes, incluyendo rechazo del injerto y enfermedad injerto-versus-huésped (GVHD) son linfocito T -dependiente; la inhibición de la función del linfocito T es ameliorativa.

Otras enfermedades en las cuales la intervención de la respuesta inmune y/o inflamatoria tiene beneficio son enfermedades infecciosas que incluyen pero no están limitadas a infección viral (incluye pero no está limitada a AIDS, hepatitis A, B, C, D, E) infección bacteriana, infecciones fúngicas, e infecciones protozoarias y parasíticas (moléculas (o derivados/agonistas) que estimulan la MLR pueden ser utilizados terapéuticamente para mejorar la respuesta inmune a agentes infecciosos), enfermedades de inmunodeficiencia (moléculas/derivados/agonistas) que estimulan la MLR pueden ser utilizados terapéuticamente para mejorar la respuesta inmune a condiciones de inmunodeficiencia heredada, adquirida, inducida infecciosas (como en la infección HIV), o iatrogénica (es decir como de la quimioterapia)), y neoplasia.

El anticuerpo es preferentemente administrado al mamífero en un portador; preferentemente un portador farmacéuticamente aceptable. Portadores adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., editado por Oslo et al. Típicamente, una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable se utiliza en la formulación para tornar isotónica a la formulación. Ejemplos del portador incluyen salino, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferentemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8, y más preferentemente desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 7,5. Portadores adicionales incluyen preparaciones de liberación sostenida como matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrofóbicos que contienen el anticuerpo, dichas matrices están en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas, liposomas o micropartículas. Será evidente para aquellas personas entendidas en la técnica que ciertos portadores pueden ser más preferibles dependiendo de, por ejemplo, la ruta de administración y concentración del anticuerpo que se administra.

El anticuerpo puede ser administrado al mamífero mediante inyección (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraportal), o mediante otros procedimientos tales como infusión que aseguran su suministro al flujo sanguíneo en una forma efectiva. El anticuerpo también puede ser administrado mediante técnicas de perfusión aisladas, tales como perfusión aislada al tejido, para ejercer efectos terapéuticos locales. Se prefiere la inyección local o intravenosa.

Dosis efectivas y calendarios de administración para administrar el anticuerpo pueden determinarse empíricamente, y realizar dichas determinaciones está dentro de la habilidad en la técnica. Aquellos entendidos en la técnica entenderán que la dosis de anticuerpo que debe ser administrada variará dependiendo de, por ejemplo, el mamífero que recibirá el anticuerpo, la ruta de administración, el tipo particular de anticuerpo utilizado y otras drogas que se administran al mamífero. La guía en la selección de las dosis apropiadas para anticuerpos se encuentra en la literatura sobre usos terapéuticos de anticuerpos, por ejemplo, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 y pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389. Una dosis diaria típica del anticuerpo utilizado sólo puede oscilar desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal o más por día, dependiendo de los factores antes mencionados.

El anticuerpo también puede ser administrado al mamífero en combinación con cantidades efectivas de uno o más de otros agentes terapéuticos. El uno o más de otros agentes terapéuticos o terapias puede incluir, pero no está limitado a, quimioterapia (agentes quimioterapéuticos), terapia de radiación, inmunoadyuvantes, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, y citoquinas. Otros agentes conocidos por inducir apoptosis en células de mamífero también pueden emplearse, y tales agentes incluyen TNF-alfa, TNF-beta, ligando CD30, ligando 4-1BB y ligando Apo-2, así como otros anticuerpos que pueden inducir apoptosis. La una o más terapias pueden incluir anticuerpos terapéuticos (distintos del anticuerpo DR4), y dichos anticuerpos pueden incluir anticuerpos receptor anti-Her (tales como Herceptin^{TM}), anticuerpos anti-VEGF, anticuerpos anti-CD20 (tales como Rituxan®) y anticuerpos contra otros receptores para el ligando Apo-2, tales como anticuerpos anti-Apo-2 (DR5), o anticuerpos contra otros miembros de la familia de receptor TNF tal como Enbrel®.

Las quimioterapias contempladas por la invención incluyen sustancias químicas o fármacos que son conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles, tales como Doxorrubicina, 5-Fluorouracil, etopósido, camptotecina, Leucovorina, arabinósido de citosina, ciclofosfamida, Tiotepa, Busulfan, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatina, Melfalán, Vinblastina y Carboplatina. La preparación y calendario de dosificación para dicha quimioterapia puede utilizarse según las instrucciones de fabricante o como se determinó empíricametne por el profesional entendido. La preparación y calendarios de dosificación para dicha quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

La quimioterapia es preferentemente administrada en un portador farmacéuticamente aceptable, tales como aquellos antes descritos. La forma de administración de la quimioterapia puede ser la misma empleada para el anticuerpo DR4 o puede ser administrada al mamífero a través de un modo diferente. Por ejemplo, el anticuerpo DR4 puede ser inyectado mientras que la quimioterapia se administra oralmente al mamífero.

La terapia de radiación puede ser administrada al mamífero según los protocolos comúnmente empleados en la técnica y conocidos para el artesano entendido. Dicha terapia puede incluir radiación de cesio, iridio, yodo o cobalto. La terapia de radiación puede ser radiación de todo el cuerpo, o puede estar dirigida localmente a un sitio o tejido específico en o sobre el cuerpo. Típicamente, la terapia de radiación se administra en pulsos durante un período de tiempo desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 2 semanas. La terapia de radiación puede, sin embargo, ser administrada durante largos períodos de tiempo. Opcionalmente, la terapia de radiación puede ser administrada como una única dosis o como dosis múltiples, secuenciales.

El anticuerpo puede ser administrado secuencialmente o de forma concurrente con uno o más de otros agentes terapéuticos. Las cantidades de anticuerpo y agente terapéutico dependen, por ejemplo, en el tipo de fármacos que se utilizan, la condición patológica que se trata, y el calendario y las rutas de administración pero generalmente serán menores que si cada una se utilizara individualmente.

A continuación de la administración del anticuerpo al mamífero, la condición fisiológica del mamífero puede ser monitorizada en diferentes formas bien conocidas para el experto en la materia.

Se contempla que los antagonistas o anticuerpos de bloqueo DR4 también pueden utilizarse en la terapia. Por ejemplo, un anticuerpo DR4 puede ser administrado a un mamífero (tal como se describió anteriormente) para bloquear la unión del receptor DR4 al Apo-2L, incrementando así la biodisponibilidad de Apo-2L administrada durante la terapia Apo-2L para inducir apoptosis en células de cáncer.

Los efectos terapéuticos de los anticuerpos DR4 de la invención pueden ser examinados en ensayos in vitro y utilizando modelos animales in vivo. Una variedad de modelos animales conocidos puede utilizarse para entender aún más el rol de los anticuerpos DR4 aquí identificados en el desarrollo y patogénesis de por ejemplo, enfermedad relacionada inmune o cáncer, y para probar la eficacia de los agentes terapéuticos candidatos. La naturaleza in vivo de dichos modelos los hace particularmente predictivos de las respuestas en pacientes humanos. Los modelos animales de enfermedades relacionadas inmunes incluyen tanto animales no-recombinantes y recombinantes (transgénicos). Los modelos animales no-recombinantes incluyen, por ejemplo, roedores, por ejemplo, modelos de murina. Dichos modelos pueden ser generados introduciendo células en ratones singeneicos utilizando técnicas estándar, por ejemplo inyección subcutánea, inyección en la vena de la cola, implantación en el vaso, implantación intraperitoneal, e implantación bajo la cápsula renal.

Se conocen modelos de animales, por ejemplo, para enfermedades de injerto-contra-huésped. Una enfermedad injerto-contra-huésped se produce cuando las células inmunocompetentes se transplantan en pacientes inmunosuprimidos o tolerantes. Las células del donante reconocen y responde a los antígenos del huésped. La respuesta puede variar desde inflamación severa que amenaza la vida a casos leves de diarrea y pérdida de peso. Los modelos de enfermedad de injerto-contra-huésped proporcionan medios para determinar la reactividad de las células T contra antígenos MHC y antígenos menores de transplante. Un procedimiento adecuado se describe en detalle en Current Protocols in Immunology, unidad 4.3.

Un modelo de animal para rechazo de aloinjertos de piel es un medio de probar la capacidad de las células T a mediar en la destrucción de tejido in vivo que es indicativo y una medida de su papel en inmunidad anti-viral y tumoral. Los modelos más comunes y aceptados usan injerton de piel de cola de murina. Repetidos experimentos han mostrado que el rechazo de aloinjertos de piel está mediado mediante células T, células T de ayuda y células T efectoras asesinas, y no anticuerpos. [Auchincloss, H. Jr. y Sachs, D. H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992]. Un procedimiento adecuado se describe en detalle en Current Protocols in Immunology, unidad 4.4. Otros modelos de rechazo de transplantes que se pueden usar para probar las composiciones de la invención son los modelos de transplante de corazón alogénicos descritos por parte de Tanabe, M. et al., Transplantation, (1994) 58:23 y Tinubu, S. A. et al., J. Immunol., (1994) 4330-4338.

Modelos de animales para hipersensibilidad de tipo retrasado también proporcionan un ensayo de función inmune mediada con células. Las reacciones de hipersensibilidad de tipo retrasado son una respuesta inmune in vivo mediada con células T caracterizada por una inflamación que no alcanza un pico hasta después de que haya pasado un periodo de tiempo después de la estimulación con un antígeno. Estas reacciones también se producen en enfermedades autoinmunes específicas de tejidos, tales como esclerosis múltiple (MS) y encefalomielitis autoinmune experimental (EAE, un modelo para MS). Un procedimiento adecuado se describe en detalle en Current Protocols in Immunology, unidad 4.5.

Un modelo animal para la artritis es la artritis inducida con colágeno. Este modelo comparte las características clínicas, histológicas e inmunológicas de la artritis reumatoida autoinmune humana y es un modelo aceptable para la artritis autoinmune humana. Los modelos de ratón y rata se caracterizan por sinovitis, erosión de cartílago y hueso subcondral. Los anticuerpos DR4 de la invención se pueden probar para su actividad contra la artritis autoinmune usando los protocolos descritos en Current Protocols in Immunology, arriba, unidades 15.5. Ver también el modelo que usa un anticuerpo monoclonal en integrinas CD18 y VLA-4 descrito en Issekutz, A. C. et al., Immunology, (1996) 88:569.

Un modelo de asma se ha descrito en el que hiper-reactividad de vías aéreas inducidas con antígeno, eosinofilia pulmonar e inflamación son inducidas mediante la sensibilización de un animal con ovalbúmina y a continuación proporcionando al animal la misma proteína que la suministrada mediante aerosol. Varios modelos de animales (cobaya, rata, primateo no humano) muestran síntomas similares a asma atópico en humanos al proporcionarles antígenos de aerosol. Los modelos de murina tienen muchas de las características del asma humana. Procedimientos adecuados para probar las composiciones de la invención para actividad y efectividad en el tratamiento del asma se describen por parte de Wolyniec, W. W. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., (1998) 18:777 y las referencias ahí citadas.

Además, los anticuerpos DR4 de la invención se pueden probar en modelos de animales para enfermedades similares a la psoriasis. Los anticuerpos DR4 de la invención se pueden probar en el modelo de ratón scid/scid descrito por parte de Schon, M. P. et al., Nat. Med., (1997) 3:183, en los que los ratones demuestran lesiones de piel histopatológicas parecidas a la psoriasis. Otro modelo adecuado es la quimera piel humana/ratón scid preparado tal como se describe por parte de Nickoloff, B. J. et al., Am. J. Path., (1995) 146:580.

Varios modelos animales son bien conocidos para probar la actividad contra el cáncer de una composición terapéutica candidata. Estos incluyen xenoinjerto de tumor humano en ratones desnudos atímicos o ratones scid/scid, o modelos de tumores de murina genéticos tales como ratones p53 knockout mice.

Los modelos de animales recombinantes (transgénicos) se pueden dirigir introduciendo la porción de codificación de las moléculas aquí identificadas en el genoma de animales de interés, usando técnicas estándar para producir animales transgénicos. Los animales que pueden servir como un objetivo para manipulación transgénica incluyen, sin limitación, ratones, ratas, conejos, coballas, ovejas, cabras, cerdos y primates no humanos, por ejemplo babuinos, chimpancés y monos. Las técnicas conocidas en la técnica para introducir un transgén en estos animales incluyen microinyección pronucleica (Hoppe y Wanger, patente US 4.873.191); transferencia génica mediada con retrovirus en líneas germinales (por ejemplo, Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6148-615); marcado génico en células madres embriónicas (Thompson et al., Cell, 56, 313-321 [1989]); electroporación de embriones (Lo, Mol. Cel. Biol., 3, 1803-1814 [1983]); transferencia génica mediada con esperma (Lavitrano et al., Cell, 57, 717-73 [1989]). Para revisión, ver, por ejemplo, patente US 4.736.866.

Para el propósito de la presente invención, los animales transgénicos incluyen los que llevan el transgén solamente en parte de sus células ("animales mosaico"). El transgén se puede integrar como un transgén único, o en concatámeros, por ejemplo tándems cabeza-a-cabeza o cabeza-a-cola. La introducción selectiva de un transgén en un tipo de célula particular también es posible siguiendo, por ejemplo, la técnica de Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6232-636 (1992).

La expresión del transgén en animales transgénicos se puede monitorizar mediante técnicas estándar. Por ejemplo, análisis Southern blot o amplifiación PCR se pueden usar para verificar la integración del transgén. El nivel de expresión de ARNm se puede analizar a continuación usando técnicas tales como hibridización in situ, análisis Northern blot, PCR, o inmunocitoquímica. Los animales también se pueden examinar para signos de patología de enfermedades inmunes, por ejemplo mediante examen histológico para determinar la infiltración de células inmunes en tejidos específicos o para la presencia de tejido canceroso o maligno.

Alternativamente, se pueden construir animales "knock out" que tienen un gen defectuoso o alterado codificando un polipéptido aquí identificado, como resultado de recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica el polipéptido y ADN genómico alterado que codifica el mismo polipéptido introducido en una célula embriónica del animal. Por ejemplo, se puede usar ADNc que codifica un polipéptido particular para clonar ADN genómico que codifica ese polipéptido según las técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que codifica un polipéptido particular se puede eliminar o reemplazar con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que se puede usar para monitorizar la integración. Típicamente, varias kilobases de ADN de complemento inalterado (en los extremos 5' y 3') están incluidos en el vector [ver por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de los vectores de recombinación homóloga]. El vector se introduce en una línea de células madre embriónicas (por ejemplo mediante electroporación) y se seleccionan células en las que el ADN introducido se ha recombinado de manera homógola con el ADN endógeno [ver por ejemplo, Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan a continuación en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar quimeras de agregación [ver por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Un embrión quimérico se puede implanter a continuación en un animal adoptivo hembra pseudopreñado y el embrión se lleva a término para crear un animal "knock out". La progenie que conecta el ADN recombinado de manera homóloga en sus células germinales se puede identificar mediante técnicas estándar y usar para alimentar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado de manera homóloga. Los animales knockout se puede caracterizar por ejemplo por su capacidad para defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido.

En otra realización de la invención, se prevén procedimientos para utilizar el anticuerpo en ensayos de diagnóstico. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden usar en ensayos de diagnóstico para detectar la expresión o sobreexpresión de DR4 en células y tejidos específicos. Se pueden usar varias técnicas de ensayo de diagnóstico conocidas en la técnica, tal como ensayos de imagen in vivo, ensayos de unión competitiva in vitro, ensayos de sándwich directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. Los anticuerpos usados en los ensayos de diagnóstico se pueden marcar con una fracción detectable. La fracción detectable ha de ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la fracción detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferina, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano. Cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo en la fracción detectable se puede utilizar, incluyendo los procedimientos descritos por parte de Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219-230 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407-412 (1982).

Los anticuerpos DR4 también son útiles para la purificación de afinidad de DR4 a partir de cultivo de células recombinantes o fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra DR4 se inmovilizan en un soporte adecuado, tal como resina Sephadex o papel de filtro, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se contacta a continuación con una muestra que contiene el DR4 a purificar, y a continuación el soporte se lava con un solvente adecuado que retirará substancialmente todo el material en la muestra excepto el DR4, que se une al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado que liberará el DR4 del anticuerpo.

En otra realización de la invención, se prevén artículos de manufactura y equipos que contienen materiales útiles para el tratamiento de condiciones patológicas o detectar o purificar DR4. El artículo de manufactura comprende un contenedor con una etiqueta. Contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales y tubos de prueba. Los contenedores se pueden formar a partir de una variedad de materiales, tal como vidrio o plástico. El contenedor contiene una composición que tiene un agente activo que es efectivo para el tratamiento de condiciones patológicas o para detectar o purificar DR4. El agente activo en la composición en un anticuerpo DR4 y preferiblemente comprende anticuerpos monoclonales específicos para DR4. La etiqueta en el contenedor indica que la composición se usa para el tratamiento de condiciones patológicas o detectar o purificar DR4, y también puede indicar direcciones para uso in vivo o in vitro, tal como las descritas anteriormente. EL equipo de la invención comprende el contenedor descrito anteriormente y un segundo contenedor comprende un tampón. También puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas e inserciones de empaquetado con instrucciones de uso.

Los siguientes ejemplos se ofrecen solamente por motives ilustrativos, y no están pensados para limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

Ejemplos

Se utilizaron reagentes comercialmente disponibles indicados en los ejemplos según las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. La fuente de esas células identificada en los siguientes ejemplos, y a lo largo de toda la memoria, mediante los números de acceso ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Una serie de reagentes y protocolos aquí descritos también se describen en los documentos WO 99/37684, WO 00/73349, WO 98/32856 y WO 99/64461.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

Expresión de DR4 ECD como una Immunoadhesina

Se prepare una construcción de inmunoadhesina DR4 ECD soluble. Una secuencia DR4 ECD madura (aminoácidos 1 a 218, mostrados en la figura 1) se clonó en un vector de marca pCMV-1 (Kodak) después de la secuencia de señal de marca y se fundieron con la región CH1, de articulación y Fc de una cadena pesada G_{1} de inmunoglubina humana, tal como se ha descrito previamente [Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990)]. La inmunoadhesina se expresó mediante transfección transiente 293 células humanas y se purificó a partir de supernatantes celulares mediante cromatografía de afinidad de proteína A, tal como se describe por parte de Haak-Frendscho et al., Immunology 79(4): 594-9, (1993).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Producción y caracterización de anticuerpos monoclonales anti-DR4 humano Producción de Anticuerpos

Ratones transgénicos que producen IgG2 o IgG4 humano (Xenoratones, descritos en Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 [1997]) se hiperinmunizaron a través de la almohadilla del pie trasera con 2 \mug de proteína inmunoadhesina DR4 ECD (descrita en el ejemplo 1) en adyuvante Ribi adjuvant tal como se describe en Mendez et al. (supra). Los ratones se inmunizaron de esta manera dos veces a la semana durante 5 semanas. La figura 2 muestra el título de suero endógeno de xenoratón respecto a DR4 y CD4-IgG.

Tres días después de la activación final, los nodos linfáticos popliteales se retiraron de los ratones y se preparó una suspensión de célula única en medio DMEM (obtenido de Biowhitakker Corp.) suplementado con 1% penicilina-estreptomicina. Las células de los nodos linfáticos se fundieron a continuación con células de mieloma P3X63Ag8U.1 (ATCC CRL 1580) usando 35% polietileno glicol y se cultivaron en placas de cultivo de 96 pozos. Los nodos linfáticos de 5 xenoratones produjeron 28 X 10^{6} células que se colocaron en placas con 1 X 10^{5} células/pozo, con un total de 288 pozos. El bazo del Xenoratón #263 (título 1:20.000) produjo 42 X 10^{6} células que se colocaron en 2 X 10^{5} células/pozo, con un total de 498 pozos. Los hibridomas resultantes de la fusión se seleccionaron en medio HAT. Diez días después de la fusión, los supernatantes del cultivo de hibridoma se filtraron en un ELISA para probar la presencia de anticuerpos monoclonales que se unen a la proteína inmunoadhesina ECD DR4 (descrita en el ejemplo 1).

En el ELISA, placas de microtítulo de 96 pozos (Maxisorp; Nunc, Kamstrup, Dinamarca) se recubriendo añadiendo 50 \mul de 2 \mug/ml DR4-Ig en tampón de recubrimiento (50 mM de tampón de carbonato pH 9,6) a cada pozo y se incubaron a 4ºC durante toda la noche. Las placas se lavaron a continuación tres veces con tampón de lavado (PBS que contiene 0,05% Tween 20). Los pozos en las placas de microtítulo se bloquearon a continuación con 200 \mul de 2,0% albúmina de suero bovino en PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron a continuación otra vez tres veces con tampón de lavado.

Después de las etapas de lavado, 100 \mul de los supernatantes de hibridoma o anticuerpo purificado de proteína G-sefarosa (10 \mug/ml) se añadieron a los pozos designados. 100 \mul de medio acondicionado de células de mieloma se añadieron a otros pozos designados como controles. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora en un aparato de batido y a continuación se lavaron tres veces con tampón de lavado.

A continuación, 50 \mul de unión de cadena kappa anti-humana de cabra HRP-conjugada (comprada a Cappel Laboratories), diluídos en 1:5000 en tampón de ensayo (0,5% albúmina de suero bovino, 0,05% Tween-20 en PBS), se añadieron a cada pozo y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en un aparato de batido. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado, seguido por la adición de 50 \mul de substrato (TMB Microwell Peroxidase Substrate; Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) en cada pozo y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. La reacción se detuvo añadiendo 50 \mul de solución de detección de un componente TMB (Dietil Glicol; Kirkegaard & Perry) a cada pozo, y se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas de microtítulo automatizado.

Los supernatantes de hibridoma inicialmente filtrados en el ELISA se consideran por su capacidad para unirse a DR4-IgG pero no a CD4-IgG. Los supernatantes que se probaron positivos en el ELISA también se analizaron mediante análisis FACS usando células 9D (una línea celular linfoide B humana que expresa DR4; Genentech, Inc.) y IgG anti-humano de cabra PE-conjugado (H & L). Para este análisis, 25 \mul de células suspendidas (a 4 X 10^{6} células/ml) en tampón celular más corto (PBS que contiene 1% FCS y 0,02% NaN_{3}) se añadieron a los pozos de microtítulo con fondo en U, se mezclaron con 100 \mul de supernatante de cultivo o anticuerpo purificado (10 \mug/ml) en tampón celular más corto, y se incubaron durante 30 minutos sobre hielo. Las células se lavaron a continuación dos veces, se resuspendieron en 150 \mul de tampón celular más corto y a continuación se analizaron mediante FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Los hibridomas que producen anticuerpos anti-DR4 se subclonaron mediante disolución de limitación y se volvieron a ensayar a continuación para confirmar la actividad agonista.

Se generaron anticuerpos monoclonales anti-DR4 a partir de la función de xenoratón y se designaron "1E10.16.4" (también indicados aquí como "1E10"), "1G11.14.7" (también indicados aquí como "1G11") y "2A2.16.7" (también indicados aquí como "2A2"). Los anticuerpos 1E10 y 2A2 tienen contaminación de cadena ligera MOPC. 1G11 es un anticuerpo monoclonal humano completo.

Para identificar y caracterizar la contaminación IgG de ratón, en un ELISA, se recubrieron placas de microtítulo de 96 pozos (Maxisorp; Nunc, Kamstrup, Dinamarca) añadiendo 100 \mul de cadena ligera Kappa anti-ratón de cabra (Southern biotechnology, Birmingham, AL) diluidos en 1:640 en tampón de recubrimiento (50 mm de tampón de carbonato p 9,6) a cada pozo e incubándose a 4ºC durante toda la noche. Las placas se lavaron a continuación tres veces con tampón de lavado (PBS que contenía 0,05% Tween 20). Los pozos se bloquearon a continuación con 200 \mul de 2% albúmina de suero bovino en PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron a continuación otra vez tres veces con tampón de lavado. Después de las etapas de lavado, 100 \mul de anticuerpo purificado (1,0 \mug/ml) en tampón de ensayo (0,5% albúmina de suero bovino, 0,05% Tween 20 en PBS) se añadieron a los pozos designados. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora en un aparato de batido y a continuación se lavaron tres veces con tampón de lavado. A continuación, 100 \mul de IgG Fc anti-humano HRP-cabra específico (ICN) diluidos 1:1000 en tampón de ensayo se añadieron a cada pozo y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en una batidora. Las placas se lavaron a continuación tres veces con tampón de lavado, seguido por la adición de 5 \mul de substrato (TMB Microwell peroxidase substrate, Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) a cada pozo y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 50 \mul de solución de detección de componente TMB-1 (Dietil Glicol; Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) a cada pozo para detener la reacción y la absorbancia a 450 nm se leyó a continuación en un lector de placas de microtítulo automa-
tizado.

Un resumen de las características de estos anticuerpos se proporciona en la tabla 2 adjunta.

TABLA 2 Resumen de las características del anticuerpo anti-DR4 humano

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

Mapeado de Epítope Competición ELISA

Se realizó una competición ELISA para examinar las propiedades de unión del epítope de los anticuerpos anti-DR4 descritos anteriormente. En este ensayo, se usó DR4-Ig (1 \mug/ml) tal como se describe en el ejemplo 1 como antígeno de captura para recubrir la placa de microtítulo. Un anticuerpo monoclonal anti-DR4 biotinilado específico (anticuerpo moniclonal de murina 4H6 @ 1 \mug/ml; ATCC HB-12455) se añadió a la placa recubierta en solitario o en presencia de otro anticuerpo monoclonal anti-DR4 que no estaba marcado ni usado en exceso (50 \mug/ml) comparado con el anticuerpo marcado. Si el anticuerpo biotinilado y el anticuerpo no marcado reconocen ambos el mismo epítope o el solado, competirán para unirse al DR4 inmobilizado, resultando en una unión disminuida del anticuerpo marcado. Si reconocen diferentes epítopes y no solapados, no habrá ninguna competición entre los mismos, y la unión del anticuerpo marcado con el DR4 inmobilizado no se verá afectada. Los resultados de este ensayo se muestran en la figura 7.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Isotipificación del Anticuerpo

Los isotipos de los anticuerpos anti-DR4 humanos (tal como se describen anteriormente) se determinaron mediante el recubrimiento de placas de microtítulo con Ig anti-ratón de cabra de isotipo específico (Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) y Ig anti-humano de cabra (Cappel, ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa CA) durante toda la noche a 4ºC. Las placas se lavaron a continuación con tampón de lavado (tal como se describen en el ejemplo 2 anterior). Los pozos en las placas de microtítulo se bloquearon a continuación con 200 \mul de 2% de albúmina de suero bovino y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Las placas se lavaron otra vez tres veces con tampón de lavado.

A continuación, 100 \mul de 5 \mug/ml de anticuerpos DR4 purificados o 100 \mul del supernatante de cultivo de hibridoma se añadieron a los pozos designados. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y a continuación se añadieron 50 \mul de IgG anti-ratón de cabra HRP-conjugado (tal como se ha descrito anteriormente) a cada pozo. Las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. El nivel de HRP unido a la placa se detectó usando sustrato de HRP, tal como se ha descrito anteriormente.

El análisis de la isotipificación mostró que los anticuerpos 1G11, 1E10 y 2A2 son IgG_{2} humano.

\newpage

Ejemplo 4

Ensayo ELISA para Probar la Unión de los Anticuerpos DR4 a otros Receptores Apo-2L

Se realizó un ELISA para determinar si los anticuerpos DR4 descritos en el ejemplo 2 podían unirse a otros receptores Apo-2L conocidos además del DR4. Específicamente, los anticuerpos DR4 se probaron para unirse el Apo-2 [ver, por ejemplo, Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997)]. El ELISA se realizó esencialmente tal como se describe en el ejemplo 2 anterior.

Los resultados se muestran en la figura 3.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Ensayo para la Capacidad de los Anticuerpos DR4 a induir Apóptosis de manera Agonística

Se probaron supernatantes de hibridoma y anticuerpos purificados (tal como se describe en el ejemplo 2 anterior) para su actividad para inducir apóptosis de células 9D mediadas con DR4. Las células 9D humanas (5x10^{5}) se suspendieron en 100 microlitros de medios RPMI completo (RPMI más 10% FCS, glutamina, aminoácidos no esenciales, penicilina, estreptomicina y piruvato de sodio) y se añadieron a 24 pozos de macrotítulo (5x10^{5} células/0,5 ml/pozo). Las células 9D (5 X 10^{5} células/0,5 ml) se incubaron con 100 \mul de 10 \mug/ml Mabs purificado (ver ejemplo 2 anterior) o anticuerpos de control IgG en 200 \mul de medio RPMI completo a 4ºC durante 15 minutos. Las células se incubaron a continuación durante 5 minutos a 37ºC con o sin 10 \mug de anticuerpo IgG Fc anti-humano de cabra (ICN Pharmaceuticals) en 300 \mul de RPMI completo. En este punto, las células se incubaron durante 6 horas a 37ºC y en presencia de 7% CO_{2}. Las células se cultivaron y lavaron a continuación una vez con PBS. La apóptosis de las células se determinó mediante tintado de FITC-anexina V que se une a fosfatidilserina según las recomendaciones del fabricante (Clontech). Las células se lavaron en PBS y se resuspendieron en 200 \mul de tampón de unión. Diez \mul de anexina-V-FITC (1 \mug/ml) y 10 \mul de ioduro de propidio se añadieron a las células. Después de incubación durante 15 minutos en oscuridad, las células 9D se analizaron mediante FACS. La figura 5 muestra un ensayo de apóptosis mediante teñido de anexina V.

Tal como se muestra en la figura 6, el anticuerpo DR4 1G11, indujo apóptosis en las células 9D comparado con el anticuerpo de control 4H6. La actividad agonística del 1G11 se mejoró mediante la reticulación del receptor DR4 en presencia de IgG Fc anti-humano de cabra (Figura 6). Esta apóptosis mejorada (figura 6) mediante los dos anticuerpos DR4 es comparable con la actividad apoptótica del Apo-2L en células 9D.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Ensayo de la Capacidad del Anticuerpo DR4 para Bloquear la Unión del Apo-2L al DR4

Los anticuerpos purificados (tal como se describen en el ejemplo 2 anterior) se probaron para su actividad para bloquear la unión del ligando Apo-2 al DR4. En el ELISA, placas de microtítulo de 96 pozos (Maxisorp; Nunc, Kamstrup, Dinamarca) se recubrieron añadiendo 50 \mul de DR4-IgG en tampón de recubrimiento (50 mM de tampón de carbonato pH 9,6) en cada pozo y se incubaron a 4ºC durante toda la noche. Las placas se lavaron a continuación tres veces con tampón de lavado (PBS que contenía 0,05% Tween 20). Los pozos se bloquearon a continuación con 200 \mul de 2% albúmina de suero bovino en PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron a continuación otra vez tres veces con tampón de lavado.

Después de las etapas de lavado, se añadieron a los pozos designados 100 \mul de una disolución serie de dos pliegues de anticuerpo purificado (50 \mug/ml) en tampón de ensayo (0,5% albúmina de suero bovino, 0,05% Tween 20 en PBS). A continuación las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora en un aparato de batido y se lavaron tres veces con tampón de lavado.

A continuación, 100 \mul de Apo-2L biotinilado diluído en 1:1000 en tampón de ensayo se añadieron a cada pozo y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en una batidora. Las placas a continuación se lavaron tres veces con tampón de lavado seguido por la adición de 100 \mul de estreptavidina-HRP (Zymed, South San Francisco CA) diluída con 1:1000 en tampón de ensayo y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente en un aparato de batido y a continuación se lavaron tres veces con tampón de lavado.

Después de la adición de 50 \mul de substrato (substrato de peroxidasa TMB Microwell, Kirkegaard & Perry,
Gaithersburg, MD) a cada pozo, se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. 50 \mul de solución de detención del componente TMB-1 (Diethyl Glycol; Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) se añadieron a cada pozo para detener la reacción, y se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de placa de microtítulo automatizado.

Los resultados se muestran en la figura 8.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7

Ensayo de Apóptosis de Células 9D Usando Anticuerpos DR4 Reticulados

La actividad apoptótica de los anticuerpos reticulados 1G11 y 4H6 DR4 sobre células 9D también se examinó. Las células 9D (5x10^{5}) se suspendieron en medio RPMI completo de 100 microlitros (RPMI más 10% FCS, glutamina, aminoácidos no esenciales, penicilina, estreptomicina y piruvato de sodio) y se incubaron con 1 microgramo de anticuerpo DR4/100 microlitros en hielo durante 15 minutos. Las células se incubaron con 100 microgramos/ml de IgG-Fc anti-humano de cabra (Cappel Laboratories) en 300 microlitros de medio completo toda la noche a 37ºC en presencia de 7% CO_{2}.

Al final de la incubación, las células se lavaron una vez con PBS y se suspendieron en 200 microlitros de tampón de unión (Clontech). A continuación, 10 microlitros de FITC-Anexina V (Clontech) y 10 microlitros de ioduro de propidio se añadieron a las células. [Ver, Moore et al., Cell Biol., 57:265 (1998)]. Después de la incubación durante 15 minutos en oscuridad, las células se analizaron mediante FACScan.

Los resultados se muestran en la figura 6. Los resultados muestran que los anticuerpos anti-DR4 1G11 y 4H6 que indujeron apóptosis de células 9D de los anticuerpos DR4 reticulados (en concentraciones de aproximadamente 1-2 microgramos/ml) era comparable con la actividad apoptótica de Apo-2L en concentraciones similares.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8

Ensayo de poli ADP-ribosa polimerasa (PARP)

Se realizó un ensayo PARP para determinar si la actividad inducida mediante los anticuerpos anti-DR4 IgG2 se consiguió mediante apóptosis o mediante lisis de complemento convencional.

Se incubaron células 9D (5x10^{5} células en 100 \mul de medio completo) con 100 \mul de anticuerpo (10 \mug/ml) durante 15 minutos en hielo. A continuación, se añadieron 300 \mul de IgG Fc anti-humano de cabra (Cappel) a las células. Las células se incubaron a continuación toda la noche a 37ºC. Al final de la incubación, las células se microcentrifugaron, cosecharon y lavaron una vez en tampón de lavado celular (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1 mM CaCl_{2}, 1 mM MgCl_{2}). Las cuentas de células se lisaron a continuación con 50 \mul de tampón de lisis celular (tampón de lavado de células más 1%. NP40) que contenía inhibidores de proteasa, se incubaron en hielo durante 30 minutos, y a continuación se agitaron a 13.000 rpm durante 10 minutos.

El lisado celular se mezcló con un volumen igual de tampón de reducción 2X SDS. Después de hervir 2 minutos, las proteínas se separaron en un gel 7,5% SDS PAGE y se transfirieron a membranas immunoblot PVDF (Gelman). Después de bloquear los sitios de unión no específicos con tampón de bloqueo (Boehringer Mannheim), se detectó poli-(ADP-ribosa)-polimerasa usando anti-poli(ADP-ribosa)-polimerasa de HRP-conejo (Boehringer Mannheim). Este anticuerpo detectará el PARP intacto (116 Kd) y el degradado (85 Kd) que se genera como una etapa temprana de apóptosis. La unión de la anti-poli-(ADP-ribosa)-polimerasa anti-HRP-conejo se detectó usando reagentes de señal de inmunoensayo quimioluminiscente según las instrucciones del fabricante (Amersham, Arlington Heights, IL).

Los resultados se muestran en la figura 4. Tal como se muestra en la figura 4, las células tratadas con una serie de anticuerpos anti-DR4 humanos y reticuladas con anticuerpos IgG Fc anti-humanos demostraron la presencia de PARP 85 Kd separado, que indica que el mecanismo de la muerte de células 9D inducido por los respectivos anticuerpos fue debido a apóptosis.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9

Ensayo de Muerte Celular Usando DR4 mAbs

Los efectos de varios de los anticuerpos monoclonales DR4 sobre muerte celular se examinaron en líneas de células cancerígenas humanas (adenocarcinoma de pulmón SK-MES-1 y H460, carcinoma de colon COLO 205, carcinoma de mama MDA-MB-231, y rabdomiosarcoma KYM-1). Se ensayó Apo2L como control. Los anticuerpos anti-DR4 (2A2, 1G11, y 1E10) o Apo2L (aminoácidos 114-281 de SEQ ID NO:3) se diluyeron en serie en medio y se incubaron en ausencia o presencia de fragmento de IgG Fc F(ab')2 anti-humano de ratón (1 \mug/mL de concentración final) durante 30 minutes a 37ºC antes de la adición a las células. Las placas se incubaron a 37ºC durante 24 ó 48 horas (tal como se indica en cada una de las Figs. 9-13). Se añadió AlamarBlue a los pozos durante las últimas 3 a 5 horas del tiempo de incubación. Al final del periodo de incubación, se leyó la fluorescencia usando un fluorómetro de 96 pozos con excitación a 530 nm y emisión de 590 nm. Los resultados se expresan en unidades de fluorescencia relativa (RFU). Para el análisis de los datos, se utilizó un programa de encaje de curvas de 4 parámetros (Kaleidagraph).

Los resultados se muestran en las figuras 9A-9C; 10A-10C; 11A-11C; 12A-12C and 13A-13C. Los anticuerpos DR4 2A2 y 1G11 demostraron una significativa actividad asesina contra todas las líneas celulares ensayadas, mientras que el anticuerpo DR4 1E10 mostró una actividad asesina significativa contra células KYM-1, alguna actividad contra células H460, COLO205, y MDA-MB-231, y poca actividad contra células SK-MES-1. La actividad de los tres anticuerpos se observó particularmente bajo reticulación Fc. Todas las líneas celulares ensayadas expresan receptores DR4 y DR5, así que no se espera que los anticuerpos presentaran una muerte celular menor que el Apo2L, ya que el Apo2L reconoce y se une a receptores DR4 y DR5 y los anticuerpos 2A2, 1G11, y 1E10 son selectivos para DR4.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10

Activación de la caspasa mediante DR4 mAbs

Es conocido que el receptor DR4 señaliza la activación de la apóptosis a través de la proteasa iniciadora de apóptosis, caspasa-8, y la caspasa-3 de proteasa que excuta la apóptosis (Kischkel et al., Immunity, 12:611 (2000)). Para probar la activación de estas caspasas en las células cancerígenas mediante los anticuerpos monoclonales DR4 aquí descritos, se examinaron tres líneas de células cancerígenas (carcinoma de colon COLO205, carcinoma de pulmón de células no pequñas H460, y rabdomiosarcoma Kym-1). Las células (10^{7}/línea) se incubaron durante 4 horas (1) sin tratamiento (UT), (2) con Apo2L (1 \mug/ml), (3) sin Apo2L, (4) con Apo2L reticulado ("Apo2L.XL") (reticulado usando anticuerpo M2, 1 \mug/ml, Sigma, St. Louis, MO, dirigido contra una etiqueta de marca del terminal N en el polipéptido de ligando Apo-2), o (5) con anticuerpo DR4 4H6 o 1G11 (1 \mug/ml), (6) sin anticuerpo DR4, o (7) con anticuerpo DR4 reticulado (indicado mediante "4H6.XL" o "1G11.XL", reticulado usando anticuerpo anti-Fc (1 \mug/ml). Después de un lavado con salino tamponado con fosfato, las células se lisaron durante 30 minutos sobre hielo con tampón de lisis (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10% glicerol, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 0,57 mM PMSF, cocktail de inhibidor de proteasa (compete^{TM}, Roche Molecular Biochemicals) y se centrifuó a 15000 x g durante 15 minutos a 4ºC. Después de varios lavados con el tampón de lisis, los lisatos se analizaron en geles 10% SDS-PAGE seguido por electrotransferencia y detección a través de western blot con anticuerpos de anti-caspasa-8 o anti-caspasa-3 (Uspstate Biotechnology, NY). Los resultados se muestran en la figura 14.

Depósito de Material

Los siguientes materiales se han depositado con la American - Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA (ATCC):

7

Este depósito se realizó bajo las provisiones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito de Procedimientos de Patente y los Reglamentos bajo el mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito. El depósito estará disponible por parte de la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sometido a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura una disponibilidad permanente y no restringida de la progenie del cultivo del depósito al público bajo la publicación de la pertinente patente estadounidense o bajo la disposición al público de cualquier de cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, lo que suceda primero, y asegura la disponibilidad de la progenie al determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas de Estados Unidos capacitado para ello según 35 USC Sección 122 y las reglas del Comisionado para ello (incluyendo 37 CFR Sección 1.14 con particular referencia a 886 OG 638).

El titular de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales bajo depósito debe morir o perderse o destruirse cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, los materiales se reemplazarán con prontitud bajo notificación con otro del mismo. La disponibilidad del material depositado no debe construirse como una licencia para la práctica de al invención en contravención con los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno según sus leyes de patentes.

La memoria escrita anterior se considera que es suficiente para permitir que un experto en la materia ponga en práctica la invención. La presente invención no está limitada en su alcance mediante la construcción depositada, ya que la realización depositada está pensada como una simple ilustración de ciertos aspectos de la invención y cualesquiera construcciones que sean funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de esta invención. El depósito de material aquí no constituye una admisión de que la descripción escrita aquí contenida sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo su mejor modo.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 9701633 A [0002] [0031]

\bullet WO 9725428 A [0002] [0031]

\bullet WO 9828426 A [0002] [0007] [0007] [0012]

\bullet WO 9846751 A [0002]

\bullet WO 9818921 A [0002]

\bullet EP 417563 A [0009]

\bullet WO 9839361 A [0013]

\bullet WO 9832856 A [0016] [0032] [0229]

\bullet WO 9851793 A [0017]

\bullet WO 9841629 A [0017]

\bullet WO 9835986 A [0017]

\bullet EP 870827 A [0017]

\bullet WO 9846643 A [0017]

\bullet WO 9902653 A [0017]

\bullet WO 9909165 A [0017]

\bullet WO 9911791 A [0017]

\bullet WO 9904001 A [0020]

\bullet WO 9907738 A [0020]

\bullet WO 9933980 A [0020]

\bullet WO 0073349 A [0022] [0229]

\bullet US 4816567 A [0052] [0053] [0091]

\bullet US 5545807 A [0055]

\bullet US 5545806 A [0055]

\bullet US 5569825 A [0055]

\bullet US 5625126 A [0055]

\bullet US 5633425 A [0055]

\bullet US 5661016 A [0055]

\bullet US 5750373 A [0055]

\bullet US 5821333 A [0059]

\bullet US 5500362 A [0063]

\bullet US 5821337 A [0063]

\bullet WO 9306213 A [0101]

\bullet WO 9308829 A [0104]

\bullet WO 9404690 A [0105]

\bullet US 4676980 A [0107] [0107]

\bullet WO 9100360 A [0107]

\bullet WO 92200373 A [0107]

\bullet EP 03089 A [0107]

\bullet WO 9429348 A [0108]

\bullet US 4342566 A [0108]

\bullet US 5047335 A [0125]

\bullet US 5510261 A [0125]

\bullet US 5278299 A [0125]

\bullet WO 8101145 A [0144]

\bullet WO 8807378 A [0144]

\bullet US 4975278 A [0144]

\bullet US 5739277 A [0147]

\bullet US 4485045 A [0148]

\bullet US 4544545 A [0148]

\bullet US 5013556 A [0148]

\bullet WO 9013646 A [0153]

\bullet US 4965199 A [0161]

\bullet EP 73657 A [0167]

\bullet US 4419446 A [0169]

\bullet US 4601978 A [0169]

\bullet WO 9411026 A [0171]

\bullet DD 266710 [0172]

\bullet EP 402226 A [0173]

\bullet EP 183070 A [0173]

\bullet EP 244234 A [0173]

\bullet US 5807715 A [0176]

\bullet US 4767704 A [0178]

\bullet US 4657866 A [0178]

\bullet US 4927762 A [0178]

\bullet US 4560655 A [0178]

\bullet US 5122469 A [0178]

\bullet WO 9003430 A [0178]

\bullet WO 8700195 A [0178]

\bullet US RE30985 E [0178]

\bullet US 4873191 A, Hoppe and Wanger [0221]

\bullet US 4736866 A [0221]

\bullet WO 9937684 A [0229]

\bullet WO 9964461 A [0229]

Documentos de la patente no citados en la descripción

\bulletGruss; Dower. Blood, 1995, vol. 85, 3378-3404 [0002]

\bulletSchmid et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1986, vol. 83, 1881 [0002]

\bulletDealtry et al. Eur. J. Immunol., 1987, vol. 17, 689 [0002]

\bulletPitti et al. J. Biol. Chem., 1996, vol. 271, 12687-12690 [0002]

\bulletWiley et al. Immunity, 1995, vol. 3, 673-682 [0002] [0003]

\bulletBrowning et al. Cell, 1993, vol. 72, 847-856 [0002]

\bulletArmitage et al. Nature, 1992, vol. 357, 80-82 [0002]

\bulletMarsters et al. Curr. Biol., 1998, vol. 8, 525-528 [0002]

\bulletChicheportiche et al. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 32401-32410 [0002]

\bulletHahne et al. J. Exp. Med., 1998, vol. 188, 1185-1190 [0002]

\bulletMoore et al. Science, 1999, vol. 285, 260-263 [0002]

\bulletShu et al. J. Leukocyte Biol., 1999, vol. 65, 680 [0002]

\bulletSchneider et al. J. Exp. Med., 1999, vol. 189, 1747-1756 [0002]

\bulletMukhopadhyay et al. J. Biol. Chem., 1999, vol. 274, 15978-15981 [0002]

\bulletPitti et al. J. Biol. Chem., 1996, vol. 271, 12697-12690 [0003]

\bulletMariani et al. J. Cell. Biol., 1997, vol. 137, 221-229 [0003]

\bulletHymowitz et al. Molec. Cell, 1999, vol. 4, 563-571 [0003]

\bulletHymowitz et al. Biochemistry, 2000, vol. 39, 633-644 [0003]

\bulletBodmer et al. J. Biol. Chem., 2000, vol. 275, 20632-20637 [0003]

\bulletThomas et al. J. Immunol., 1998, vol. 161, 2195-2200 [0003]

\bulletJohnsen et al. Cytokine, 1999, vol. 11, 664-672 [0003]

\bulletGriffith et al. J. Exp. Med., 1999, vol. 189, 1343-1353 [0003]

\bulletSong et al. J. Exp. Med., 2000, vol. 191, 1095-1103 [0003]

\bulletRieger et al. FEBS Letters, 1998, vol. 427, 124-128 [0004]

\bulletAshkenazi et al. J. Clin. Invest., 1999, vol. 104, 155-162 [0004] [0031]

\bulletWalczak et al. Nature Med., 1999, vol. 5, 157-163 [0004]

\bulletKeane et al. Cancer Research, 1999, vol. 59, 734-741 [0004]

\bulletMizutani et al. Clin. Cancer Res., 1999, vol. 5, 2605-2612 [0004]

\bulletGazitt. Leukemia, 1999, vol. 13, 1817-1824 [0004]

\bulletYu et al. Cancer Res., 2000, vol. 60, 2384-2389 [0004]

\bulletChinnaiyan et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, vol. 97, 1754-1759 [0004]

\bulletGliniak et al. Cancer Res., 1999, vol. 59, 6153-6158 [0004]

\bulletRoth et al. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1999, vol. 265, 1999 [0004]

\bulletJo et al. Nature Med., 2000, vol. 6, 564-567 [0004]

\bulletNagata. Nature Med., 2000, vol. 6, 502-503 [0004]

\bulletLawrence et al. Nature Med., Letter to the Editor, 2001, vol. 7, 383-385 [0004]

\bulletQin et al. Nature Med., Letter to the Editor, 2001, vol. 7, 385-386 [0004]

\bulletGruss et al. Blood, 1995, vol. 85, 3378 [0005]

\bulletZheng et al. Nature, 1995, vol. 377, 348-351 [0005]

\bulletRenshaw et al. J. Exp. Med., 1994, vol. 180, 1889 [0005]

\bulletMackay et al. J. Exp. Med., 1999, vol. 190, 1697 [0005]

\bulletKrammer et al. Curr. Op. Immunol., 1994, vol. 6, 279-289 [0006]

\bulletNagata et al. Science, 1995, vol. 267, 1449-1456 [0006]

\bulletYonehara et al. J. Exp. Med., 1989, vol. 169, 1747-1756 [0006]

\bulletAnderson et al. Nature, 1997, vol. 390, 175-179 [0007] [0012]

\bulletWong et al. J. Exp. Med., 1997, vol. 186, 2075-2080 [0008]

\bulletWong et al. J. Leukocyte Biol., 1999, vol. 65, 715-724 [0008]

\bulletJosien et al. J. Immunol., 1999, vol. 162, 2562-2568 [0008]

\bulletJosien et al. J. Exp. Med., 2000, vol. 191, 495-501 [0008]

\bulletBachmann et al. J. Exp. Med., 1999, vol. 189, 1025-1031 [0008]

\bulletGreen et al. J. Exp. Med., 1999, vol. 189, 1017-1020 [0008]

\bulletKong et al. Nature, 1999, vol. 397, 315-323 [0008]

\bulletKong et al. Nature, 1999, vol. 402, 304-308 [0008]

\bulletHohman et al. J. Biol. Chem., vol. 264, 14927-14934 [0009]

\bulletBrockhaus et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1990, vol. 87, 3127-3131 [0009]

\bulletLoetscher et al. Cell, 1990, vol. 61, 351 [0009]

\bulletSchall et al. Cell, 1990, vol. 61, 361 [0009]

\bulletSmith et al. Science, 1990, vol. 248, 1019-1023 [0009]

\bulletLewis et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, vol. 88, 2830-2834 [0009]

\bulletGoodwin et al. Mol. Cell. Biol., 1991, vol. 11, 3020-3026 [0009]

\bulletNophar, Y. et al. EMBO J., 1990, vol. 9, 3269 [0009]

\bulletKohno, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1990, vol. 87, 8331 [0009]

\bulletHale et al. J. Cell. Biochem., 1991, vol. 15F, 113 [0009]

\bulletBanner et al. Cell, 1993, vol. 73, 431-435 [0010]

\bulletJohnson et al. Cell, 1986, vol. 47, 545 [0010]

\bulletRadeke et al. Nature, 1987, vol. 325, 593 [0010]

\bulletStamenkovic et al. EMBO J., 1989, vol. 8, 1403 [0010]

\bulletMallet et al. EMBO J., 1990, vol. 9, 1063 [0010]

\bulletItoh et al. Cell, 1991, vol. 66, 233-243 [0010]

\bulletUpton et al. Virology, vol. 160, 20-29 [0010]

\bulletSmith et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, vol. 176, 335 [0010]

\bulletUpton et al. Virology, 1991, vol. 184, 370 [0010]

\bulletLacey et al. Cell, 1998, vol. 93, 165-176 [0012]

\bulletSimonet et al. Cell, 1997, vol. 89, 309 [0012]

\bulletYasuda et al. Endocrinology, 1998, vol. 139, 1329 [0012]

\bulletYun et al. J. Immunol., 1998, vol. 161, 6113-6121 [0012]

\bullet Von Bulow et al. Science, 1997, vol. 278, 138-141 [0013]

\bulletLaabi et al. EMBO J., 1992, vol. 11, 3897-3904 [0014]

\bulletLaabi et al. Nucleic Acids Res., 1994, vol. 22, 1147-1154 [0014]

\bulletGras et al. Int. Immunology, 1995, vol. 7, 1093-1106 [0014]

\bulletMadry et al. Int. Immunology, 1998, vol. 10, 1693-1702 [0014]

\bulletMarsters et al. Curr. Biol., 1996, vol. 6, 750 [0015]

\bulletMarsters et al. Curr. Biol., 1996, vol. 6, 1669 [0015]

\bulletChinnaiyan et al. Science, 1996, vol. 274, 990 [0015]

\bulletKitson et al. Nature, 1996, vol. 384, 372 [0015]

\bulletBodmer et al. Immunity, 1997, vol. 6, 79 [0015]

\bulletScreaton et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, vol. 94, 4615-4619 [0015]

\bulletPan et al. Science, 1997, vol. 276, 111-113 [0016] [0019]

\bulletSheridan et al. Science, 1997, vol. 277, 818-821 [0017]

\bulletPan et al. Science, 1997, vol. 277, 815-818 [0017]

\bulletScreaton et al. Curr. Biol., 1997, vol. 7, 693-696 [0017]

\bulletWalczak et al. EMBO J., 1997, vol. 16, 5386-5387 [0017]

\bulletWu et al. Nature Genetics, 1997, vol. 17, 141-143 [0017]

\bulletHymowitz et al. Molecular Cell, 1999, vol. 4, 563-571 [0017]

\bulletPan et al. FEBS Letters, 1998, vol. 431, 351-356 [0018]

\bulletPan et al. FEBS Lett., 1998, vol. 431, 351 [0018]

\bulletSheridan et al. Science, vol. 277, 818-821 [0019]

\bulletMcFarlane et al. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 25417-25420 [0019]

\bulletSchneider et al. FEBS Letters, 1997, vol. 416, 329-334 [0019]

\bulletDegli-Esposti et al. J. Exp. Med., 1997, vol. 186, 1165-1170 [0019]

\bulletMongkolsapaya et al. J. Immunol., 1998, vol. 160, 3-6 [0019]

\bulletMarsters et al. Curr. Biol., 1997, vol. 7, 1003-1006 [0019]

\bulletPan et al. FEBS Letters, 1998, vol. 424, 41-45 [0019]

\bulletDegli-Esposti et al. Immunity, 1997, vol. 7, 813-820 [0019]

\bulletPitti et al. Nature, 1998, vol. 396, 699-703 [0019]

\bulletBrojatsch et al. Cell, 1996, vol. 87, 845-855 [0020]

\bulletMontgomery et al. Cell, 1996, vol. 87, 427-436 [0020]

\bulletMarsters et al. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 14029-14032 [0020]

\bulletNocentini et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, vol. 94, 6216-6221 [0020]

\bulletEmery et al. J. Biol. Chem., 1998, vol. 273, 14363-14367 [0020]

\bulletTewari et al. Curr. Op. Genet. Develop., 1996, vol. 6, 39-44 [0021]

\bulletVerma et al. Genes Develop., 1996, vol. 9, 2723-2735 [0021]

\bulletBaldwin. Ann. Rev. Immunol., 1996, vol. 14, 649-681 [0021]

\bulletLotz et al. J. Leukocyte Biol., 1996, vol. 60, 1-7 [0021]

\bulletAshkenazi; Dixit. Science, 1998, vol. 281, 1305-1308 [0022]

\bulletGolstein. Curr. Biol., 1997, vol. 7, 750-753 [0022]

\bulletNagata. Cell, 1997, vol. 88, 355-365 [0022]

\bulletLocksley et al. Cell, 2001, vol. 104, 487-501 [0022]

\bulletPan et al. Science, 1997, vol. 276, 111 [0030] [0032]

\bulletPitti et al. J. Biol. Chem, 1996, vol. 271, 12687 [0031]

\bulletMarsters et al. Curr. Biol., 1997, vol. 6, 79 [0031]

\bulletWiley, S. et al. Immunity, 1995, vol. 3, 637 [0031]

\bulletSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold. Spring Harbor Press, 1989 [0040]

\bulletChothia et al. J. Mol. Biol., 1985, vol. 186, 651-663 [0048]

\bulletNovotny; Haber. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 4592-4596 [0048]

\bulletKabat, E.A. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. 1987 [0050]

\bulletMage et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. Marcel Dekker, Inc, 1987, 79-97 [0052]

\bulletKohler; Milstein. Nature, 1975, vol. 256, 495 [0053] [0084]

\bulletMcCafferty et al. Nature, 1990, vol. 348, 552-554 [0053]

\bulletVaughan et al. Nature Biotechnology, 1996, vol. 14, 309-314 [0055]

\bulletSheets et al. PNAS, (USA), 1998, vol. 95, 6157-6162 [0055]

\bulletHoogenboom; Winter. J. Mol. Biol., 1991, vol. 227, 381 [0055]

\bulletMarks et al. J. Mol. Biol., 1991, vol. 222, 581 [0055]

\bulletMarks et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 779-783 [0067]

\bulletLonberg et al. Nature, 1994, vol. 368, 856-859 [0055]

\bulletMorrison. Nature, 1994, vol. 368, 812-13 [0055]

\bulletFishwild et al. Nature Biotechnology, 1996, vol. 14, 845-51 [0055]

\bulletNeuberger. Nature Biotechnology, 1996, vol. 14, 826 [0055]

\bulletLonberg; Huszar. Intern. Rev. Immunol., 1995, vol. 13, 65-93 [0055]

\bulletCole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. Alan R. Liss, 1985, 77 [0055]

\bulletBoerner et al. J. Immunol., 1991, vol. 147 (1), 86-95 [0055]

\bulletBurton. Molec. Immunol., 1985, vol. 22, 161-206 [0058] [0060]

\bulletRavetch; Kinet. Annu. Rev. Immunol., 1991, vol. 9, 457-92 [0063] [0065]

\bulletClynes et al. PNAS (USA), 1998, vol. 95, 652-656 [0063]

\bulletDaëron. Annu. Rev. Immunol, 1997, vol. 15, 203-234 [0065]

\bulletCapel et al. Immunomethods, 1994, vol. 4, 25-34 [0065]

\bullet de Haas et al. J. Lab. Clin. Med., 1995, vol. 126, 330-41 [0065]

\bulletGuyer et al. J. Immunol., 1976, vol. 117, 587 [0065]

\bulletKim et al. J. Immunol., 1994, vol. 24, 249 [0065]

\bulletGazzano-Santoro et al. J. Immunol. Methods, 1996, vol. 202, 163 [0066]

\bulletBarbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA, 1994, vol. 91, 3809-3813 [0067]

\bulletSchier et al. Gene, 1995, vol. 169, 147-155 [0067]

\bulletYelton et al. J. Immunol., 1995, vol. 155, 1994-2004 [0067]

\bulletJackson et al. J. Immunol., 1995, vol. 154 (7), 3310-9 [0067]

\bulletHawkins et al. J. Mol. Biol., 1992, vol. 226, 889-896 [0067]

\bulletBoldin et al. J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, 7795-7798 [0069]

\bulletPeter. Cell Death Differ., 2000, vol. 7, 759-760 [0069]

\bulletNagata. Cell, 1998, vol. 88, 355-365 [0069]

\bulletAshkenazi et al. Science, 1999, vol. 281, 1305-1308 [0069]

\newpage

\bullet Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs. Murakami et al. The Molecular Basis of Cancer. WB Saunders, 1995, 13 [0074]

\bulletWilman. Prodrugs in Cancer Chemotherapy. Biochemical Society Transactions, 1986, vol. 14, 375-382 [0075]

\bullet Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery. Stella et al. Directed Drug Delivery. Humana Press, 1985, 247-267 [0075]

\bulletAgnew. Chem Intl. Ed. Engl., 1994, vol. 33, 183-186 [0077]

\bulletGoding. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press, 1986, 59-103 [0086]

\bulletKozbor. J. Immunol., 1984, vol. 133, 3001 [0087] [0098]

\bulletBrodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. Marcel Dekker, Inc, 1987, 51-63 [0087] [0098]

\bulletMunson; Pollard. Anal. Biochem., 1980, vol. 107, 220 [0088]

\bulletMorrison et al. Proc. Nat. Acad. Sci., 1984, vol. 81, 6851 [0091]

\bulletIliades et al. FEBS Letters, 1997, vol. 409, 437-441 [0094]

\bulletKortt et al. Protein Engineering, 1997, vol. 10, 423-433 [0094]

\bulletJones et al. Nature, 1986, vol. 321, 522-525 [0095]

\bulletRiechmann et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-327 [0095]

\bulletVerhoeyen et al. Science, 1988, vol. 239, 1534-1536 [0095]

\bulletJakobovits et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 2551-255 [0099]

\bulletJakobovits et al. Nature, 1993, vol. 362, 255-258 [0099]

\bulletMendez et al. Nature Genetics, 1997, vol. 15, 146-156 [0100] [0231]

\bulletMcCafferty et al. Nature, 1990, vol. 348, 552-553 [0101]

\bulletJohnson, Kevin S.; Chiswell, David J. Current Opinion in Structural Biology, 1993, vol. 3, 564-571 [0101]

\bulletClackson et al. Nature, 1991, vol. 352, 624-628 [0101]

\bulletMarks et al. J. Mol. Biol., 1991, vol. 222, 581-597 [0101]

\bulletGriffith et al. EMBO J., 1993, vol. 12, 725-734 [0101]

\bulletMarks et al. Bio/Technol., 1992, vol. 10, 779-783 [0101]

\bulletWaterhouse et al. Nucl. Acids Res., 1993, vol. 21, 2265-2266 [0101]

\bulletMillstein; Cuello. Nature, 1983, vol. 305, 537-539 [0104]

\bulletTraunecker et al. EMBO, 1991, vol. 10, 3655-3659 [0104]

\bulletSuresh et al. Methods in Enzymology, 1986, vol. 121, 210 [0106]

\bulletMorimoto et al. J. Biochem. Biophys. Methods, 1992, vol. 24, 107-117 [0108]

\bulletBrennan et al. Science, 1985, vol. 229, 81 [0108]

\bulletCarter et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 163-167 [0108] [0179]

\bulletCunningham; Wells. Science, 1989, vol. 244, 1081-1085 [0111]

\bulletJefferis; Lund. Chem. Immunol., 1997, vol. 65, 111-128 [0120]

\bulletWright; Morrison. TibTECH, 1997, vol. 15, 26-32 [0120]

\bulletBoyd et al. Mol. Immunol., 1996, vol. 32, 1311-1318 [0120]

\bulletWittwe; Howard. Biochem., 1990, vol. 29, 4175-4180 [0120]

\bulletWyss; Wagner. Current Opin. Biotech., 1996, vol. 7, 409-416 [0120]

\bulletMalhotra et al. Nature Med., 1995, vol. 1, 237-243 [0120]

\bulletBoyd et al. Mol. Immunol., 1996, vol. 32, 1311-2318 [0120]

\bulletUmana et al. Mature Biotech., 1999, vol. 17, 176-180 [0120]

\bulletHse et al. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 9062-9070 [0125]

\bulletMassey. Nature, 1987, vol. 328, 457-458 [0145]

\bulletNeuberger et al. Nature, 1984, vol. 312, 604-608 [0146]

\bulletRemington's Pharmaceutical Sciences. 1980 [0147]

\bulletEpstein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 3688 [0148]

\bulletHwang et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4030 [0148]

\bulletMartin et al. J. Biol. Chem., 1982, vol. 257, 286-288 [0148]

\bulletGabizon et al. J. National Cancer Inst., 1989, vol. 81 (19), 1484 [0148]

\bulletStinchcomb et al. Nature, 1979, vol. 282, 39 [0162]

\bulletJones. Genetics, 1977, vol. 85, 12 [0162]

\bullet Van den Berg. Bio/Technology, 1990, vol. 8, 135 [0163]

\bulletFleer et al. Bio/Technology, 1991, vol. 9, 968-975 [0163]

\bulletReyes et al. Nature, 1982, vol. 297, 598-601 [0169]

\bulletYaniv. Nature, 1982, vol. 297, 17-18 [0170]

\bulletGraham et al. J. Gen Virol., 1977, vol. 36, 59 [0176]

\bulletUrlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4216 [0176]

\bulletMather. Biol. Reprod., 1980, vol. 23, 243-251 [0176]

\bulletMather et al. Annals N.Y. Acad. Sci., 1982, vol. 383, 44-68 [0176]

\bulletHam et al. Meth. Enz., 1979, vol. 58, 44 [0178]

\bulletBarnes et al. Anal. Biochem, 1980, vol. 102, 255 [0178]

\bulletLindmark et al. J. Immunol. Meth., 1983, vol. 62, 1-13 [0180]

\bulletGuss et al. EMBO J., 1986, vol. 5, 15671575 [0180]

\bullet Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co, 1980 [0203]

\bullet Handbook of Monoclonal Antibodies. Noges Publications, 1985, 303-357 [0205]

\bulletSmith et al. Antibodies in Human Diagnosis and Therapy. Raven Press, 1977, 365-389 [0205]

\bullet Chemotherapy Service. Williams & Wilkins, 1992 [0207]

\bulletAuchincloss, H. Jr.; Sachs, D. H. Fundamental Immunology. Raven Press, 1989, 889-992 [0215]

\bulletTanabe, M. et al. Transplantation, 1994, vol. 58, 23 [0215]

\bulletTinubu, S. A. et al. J. Immunol., 1994, 4330-4338 [0215]

\bulletIssekutz, A. C. et al. Immunology, 1996, vol. 88, 569 [0215]

\bulletWolyniec, W. W. et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1998, vol. 18, 777 [0218]

\bulletSchon, M. P. et al. Nat. Med., 1997, vol. 3, 183 [0219]

\bulletNickoloff, B. J. et al. Am. J. Path., 1995, vol. 146, 580 [0219]

\bullet Van der Putten et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 6148-615 [0221]

\bulletThompson et al. Cell, 1989, vol. 56, 313-321 [0221]

\bulletLo. Mol. Cel. Biol., 1983, vol. 3, 1803-1814 [0221]

\bulletLavitrano et al. Cell, 1989, vol. 57, 717-73 [0221]

\bulletLasko et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 6232-636 [0222]

\bulletThomas; Capecchi. Cell, 1987, vol. 51, 503 [0224]

\bulletLi et al. Cell, 1992, vol. 69, 915 [0224]

\bulletBradley. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. 1987, 113-152 [0224]

\bulletZola. Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, Inc, 1987, 147-158 [0225]

\bulletHunter et al. Nature, 1962, vol. 144, 945 [0225]

\bulletDavid et al. Biochemistry, 1974, vol. 13, 1014-1021 [0225]

\bulletPain et al. J. Immunol. Meth., 1981, vol. 40, 219-230 [0225]

\bulletNygren. J. Histochem. and Cytochem, 1982, vol. 30, 407-412 [0225]

\bulletAruffo et al. Cell, 1990, vol. 61, 1303-1313 [0230]

\bulletHaak-Frendscho et al. Immunology, 1993, vol. 79 (4), 594-9 [0230]

Claims

1. Anticuerpo monoclonal anti-DR4 humano, que comprende un anticuerpo que se une a un receptor DR4 que comprende los aminoácidos 1 a 218 de SEQ 10 NO:1, en el que el anticuerpo se une al mismo epítope receptor DR4 al cual se une el anticuerpo monoclonal producido mediante el hibridoma depositado como ATCC PTA-3359 o ATCC PTA-3360 o ATCC PTA-3361 y tiene una afinidad de unión a dicho receptor DR4 de por lo menos 10^{6} M^{-1} a 10^{12} M^{-1}, e inhibe la unión de ligando Apo-2 al receptor DR4 e induce la apóptosis al unirse al receptor DR4 en por lo menos un tupo de célula de mamífero.

2. Anticuerpo receptor anti-DR4 según la reivindicación 1, que está enlazado con:

(a) uno o más polímeros no proteináceos seleccionados entre el grupo que consiste en polietileno glicol, polipropileno glicol, y polioxialquileno; o

(b) un agente o enzima citotóxica;

(c) un radioisótipo, compuesto fluorescente o compuesto quimioluminiscente.

3. Anticuerpo receptor anti-DR4 según la reivindicación 1, que es glicosilatado.

4. Anticuerpo receptor anti-DR4 según la reivindicación 1, que es no glicosilatado.

5. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, producido mediante el hibridoma depositado como ATCC PTA-3359 o ATCC PTA-3360 o ATCC PTA-3361.

6. Hibridoma depositado como ATCC PTA-3359 o ATCC PTA-3360 o ATCC PTA-3361.

7. Anticuerpo receptor anti-DR4 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su utilización en un procedimiento de tratamiento médico.

8. Utilización de un anticuerpo receptor anti-DR4 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

9. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal receptor anti-DR4 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.