ES2239886B1 - Metodo y aparato para la determinacion de la viabilidad celular. - Google Patents
Metodo y aparato para la determinacion de la viabilidad celular.Info
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Abstract
Método y aparato para la determinación de la viabilidad celular. La invención comprende un método para la determinación de la viabilidad celular y un aparato especialmente diseñado para la aplicación de este método. El método utiliza la técnica de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo ("gravitational field flow fractionation", GrFFF) con detección de fluorescencia, y es adecuado para las cepas de levaduras comerciales. Funciona adecuadamente como lo demuestra la comparación de los resultados de viabilidad celular obtenidos mediante el GrFFF con los obtenidos utilizando las técnicas de citometría de flujo y de contador Coulter. Proporciona una buena linealidad, repetitibilidad, y un límite de detección suficientemente bajo para detectar 2E+04 células no viables. Además, el GrFFF puede ser fácilmente implementado en un sistema convencional de cromatografía de líquidos. Así, la sencillez y bajo coste del aparato lo hace ser una alternativa valiosa a los comerciales basados en técnicasde citometría de flujo y contador Coulter.
Description
Método y aparato para la determinación de la
viabilidad celular.
Esta invención se refiere al campo de análisis
celular y, en particular, a un método y un aparato para la
determinación de la viabilidad celular.
En los últimos años ha habido un incremento en
la aplicabilidad de técnicas de separación para la caracterización
de muestras que van desde macromoléculas hasta micropartículas
tales como células. Una de las técnicas más versátiles de
separación por elución que se aplica para la caracterización de
estas muestras es el fraccionamiento por campo y flujo ("field
flow fractionation", FFF) (cfr. J.C. Giddings et al.,
"Field-Flow
Fractionation-analysis of macromolecular, colloidal,
and particulate materials", Science 1993, vol. 260,
pp.1456-1465).
La FFF permite la separación de los componentes
de la muestra dentro de un canal estrecho, en forma de cinta,
colocado en un sistema convencional de cromatografía de líquidos.
El canal comprende dos placas paralelas y planas las cuales
experimentan la acción de un campo perpendicular generado
externamente. Un flujo laminar, generado por una bomba de alta
presión cuando pasa a través del canal, crea un perfil de flujo
parabólico en el espesor del canal. Las diferentes interacciones de
los componentes de la muestra con el campo externo permiten
concentrar o llevar estos componentes hacia una de las placas
mediante líneas de flujo del líquido portador a distintas
velocidades. La migración a través del canal de los componentes de
la muestra a diferentes velocidades produce la separación.
Pueden distinguirse diferentes tipos de técnicas
de FFF según la naturaleza del campo externo aplicado. Una de estas
técnicas es el fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo
("gravitational field flow fractionation", GrFFF), un tipo de
FFF de sedimentación que emplea el campo gravitatorio terrestre
aplicado perpendicularmente al canal. A través de los años, el GrFFF
ha demostrado ser adecuado para la caracterización de
micropartículas de varios tamaños y origen diferente, y de muestras
vivas. Esta técnica es muy ventajosa para la clasificación celular,
debido a su simplicidad, riesgo reducido de degradación de la
muestra y bajo coste.
En diversas áreas de la industria alimentaria,
las levaduras se utilizan frecuentemente en procesos de
fermentación tales como la producción de pan y derivados, la
elaboración de cerveza, y la producción de productos lácteos y
vino. Recientemente se han desarrollado nuevas metodologías para la
caracterización de levaduras secas y activas comerciales del vino
utilizando el fraccionamiento por campo y flujo (cfr. p.ej. R. Sanz
et al., "Gravitational Field-Flow
Fractionation for the characterisation of active dry wine
yeast", J. Chromatogr. A 2001, vol. 919, pp.
339-347). Las mejoras más importantes en la
industria de levaduras están relacionadas con el desarrollo de
cepas de levaduras seleccionadas. En la elaboración de vino, la
transformación del mosto en vino es esencialmente un proceso
microbiológico porque las levaduras, normalmente del género
Saccharomyces, generalmente conducen la fermentación
alcohólica. Para monitorizar la realización de las fermentaciones
basadas en levaduras, se necesita una evaluación de la calidad de
la levadura y, por consiguiente, se requiere una determinación de
la viabilidad celular de la levadura. Se han utilizado diversos
métodos para la determinación de la viabilidad celular, tales como
el teñido de azul de metileno y la evaluación de unidades de
colonias formadas (cf. e.g. R. Seward et al., "The effects
of ethanol, hexan-1-ol, and
2-phenylethanol on cider yeast growth, viability,
and energy status; synergistic inhibition", J. Inst.
Brew. 1996, vol. 102, pp. 439-443). Sin
embargo, estos métodos son laboriosos, conllevan tiempos de análisis
largos y están limitados por la subjetividad.
En el área de producción de vino y de producción
de cerveza, recientemente se han propuesto nuevos métodos para la
determinación de la viabilidad de levaduras en proceso de
fermentación basados en citometría de flujo (``flow citometry, FC)
(cfr. P. Malacrino et al., "Rapid detection of viable
yeasts and bacteria in wine by flow cytometry", J. Micobiol.
Methods 2001, vol. 45, pp. 127-134; M. Bouix
et al., "Rapid assessment of yeast viability and yeast
vitality during alcoholic fermentation", J. Inst. Brew.
2001, vol. 107, pp. 217-225). Estos métodos son
rápidos y se puede obtener una gran cantidad de información. Sin
embargo, la citometría de flujo es una técnica cara y requiere un
mantenimiento laborioso de los equipos.
También se han aplicado métodos basados en la
separación dielectroforética combinada con FFF para la separación
en continuo de células viables y no viables de levaduras, pero
tienen el inconveniente de que se necesita un equipo sofisticado
(cfr. G.H. Markx et al., "Dielectrophoretic separation of
cells: continuous separation", Biotechnology and
Bioengineering 1995, vol. 45, pp. 337-343).
Más recientemente, se ha propuesto un método de
electroforesis capilar para la determinación de la viabilidad
celular de diferentes microorganismos (cfr. Daniel W. Armstrong
et al., "Determination of Celi Viability in Single or
Mixed Samples Using Capillary Electrophoresis
Laser-Induced Fluorescence Microfluidic
Systems", Analytical Chemistry 2001, vol. 73, pp.
4551-4557). Sin embargo, se requiere una
instrumentación cara y tiempos de análisis largos para las muestras
de levaduras. Así, sería altamente deseable disponer de una técnica
más económica y simple para determinar la viabilidad celular, que
evite o minimice algunos de los inconvenientes anteriormente
mencionados.
La presente invención proporciona un método y un
aparato específicamente diseñado para utilizar este método, los
cuales superan algunos de los problemas encontrados en la técnica
actual. En la invención se combinan exactitud y simplicidad
manteniendo un bajo coste. Así, como parte de la invención se
proporciona un nuevo método de determinación de la viabilidad
celular, utilizando el fraccionamiento por campo gravitatorio y
flujo con detección de fluorescencia, que comprende los pasos de:
a) dispersar la muestra que contiene las células en un líquido
portador y teñir las células con un fluoróforo detectable; b)
inyectar la muestra tratada en el dispositivo de fraccionamiento
por campo gravitatorio y flujo 10 (cfr. Fig. 10); c)
detectar las células midiendo la fluorescencia emitida; y d)
procesar los datos de emisión para determinar el número de células
viables.
En una realización preferida, la muestra se
dispersa en un líquido portador por sonicación. Preferiblemente, el
líquido portador es una solución salina tamponada y, más
preferiblemente, una solución salina tamponada de fosfato
("phosphated buffered salive solution", PBS). El líquido
portador se utiliza también como fase móvil. En otra realización
preferida, el método de la presente invención utiliza como
fluoróforos ioduro de propidio ("propidium iodide", PI),
diacetato de fluoresceína ("fluorescein diacetate", FDA),
diacetato de carboxifluoresceína ("carboxy fluorescein
diacetate", cFDA), calceína, o SYTO 13, un colorante de
fluorescencia verde bien conocido de tipo ácido nucleico (cfr. R.P.
Haughland, "Nucleic acid detection"; En M.T.Z. Spence (ed.),
"Handbook of fluorescent probes and research chemicals",
Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, US, 1996,
pp.143-168). El fluoróforo más preferido es el
ioduro de propidio.
En otra realización preferida, el dispositivo de
fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo 10 utilizado
para llevar a cabo el método de la invención comprende: dos placas
paralelas 1 y 2, separadas por una lámina 15
donde está ubicado el canal 3, y unidas mediante una montura
rígida e indeformable; b) una entrada al canal 5; y c) una
salida del canal 6.
En otra realización preferida, el procesado de
los datos de emisión se hace con una curva de calibración.
Preferiblemente, la curva de calibración se obtiene representando
el área de pico frente a las células no viables correspondientes a
varias soluciones estándar. Más preferiblemente, el número de
células viables por gramo se calcula utilizando los resultados de
las células no viables y la concentración de las soluciones de la
muestra en número de células. Los datos de concentración de las
soluciones de la muestra pueden obtenerse por contador Coulter.
También preferiblemente, la curva de calibración se obtiene
representando el área de pico frente a las células viables
correspondientes a varias soluciones estándar. Más preferiblemente,
el número de células viables por gramo se obtiene directamente de
la curva de calibración. Aún más preferiblemente, las soluciones
estándar tienen una viabilidad celular bien definida. Todavía aún
más preferiblemente, la viabilidad celular de las soluciones
estándar se determina combinando las técnicas citometría de flujo y
contador Coulter. Se obtienen resultados precisos de viabilidad
celular utilizando ambas curvas de calibración, sin diferencias
significativas entre ellas.
En una realización específica de la presente
invención, las células son células de levadura. En otra realización
específica las células son células de bacteria. La idoneidad del
nuevo método se probó con varias cepas de levaduras comerciales. La
validación del método se realizó comparando los valores de
viabilidad obtenido por GrFFF con aquéllos obtenidos utilizando la
técnicas citometría de flujo/ contador Coulter. Se obtuvo linearidad
precisa (0.15-6 g/I), buena repetitibilidad
(desviación relativa estándar ("relative standard deviation",
RSD): 2.4%) y límite de detección suficientemente bajo para
detectar 2 x 10^{4} células no-viables.
El método de la presente invención puede ser
llevado a cabo con un aparato que permite la determinación de la
viabilidad celular, el cual también forma parte de la presente
invención. El aparato se ilustra por el ejemplo de la Fig. 11, y
tiene las siguientes partes: a) un sistema de bombeo 7; b) un
compartimento de almacenamiento del líquido portador 8; c)
una cámara del canal 9 que contiene el dispositivo de
fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo 10; d) un
sistema de inyección para introducir la muestra y el líquido
11; e) un sistema de detección de fluorescencia que comprende
una célula de flujo 12 y un detector de fluorescencia
13; y f) un sistema de adquisición y tratamiento de datos
14 para obtener los resultados de viabilidad celular.
El dispositivo de fraccionamiento por campo
gravitatorio y flujo 10 comprende: a) dos placas paralelas
1 y 2, separadas por una lámina 15 donde está
ubicado el canal 3, y unidas mediante una montura rígida e
indeformable y b) una entrada al canal 5; y c) una salida del
canal 6. Preferiblemente, las placas 1 y 2 son
de plástico y la lámina 15 es de poliester, poliestireno o
teflón. También preferiblemente, la montura rígida y no deformable
está formada por varias barras longitudinales 4 y varias
barras transversales 16. Más preferiblemente, las barras
longitudinales 4 y las barras transversales 16 de la
montura son de aluminio ya que se obtiene una distribución más
homogénea alrededor del contorno del canal cuando se aprieta. Aún
más preferiblemente, la salida del canal 6 se conecta a una
célula de flujo 12 de un sistema de detección de
fluorescencia.
El uso de fraccionamiento por campo gravitatorio
y flujo con detección de fluorescencia para determinar la
viabilidad celular tiene la ventaja de ser mucho más económico y
simple que otras técnicas conocidas en el estado de la técnica.
Además, el GrFFF puede ser fácilmente implementado en un sistema de
cromatografía de líquidos convencional. Puede ser aplicado a
cualquier tipo de levadura y no es destructivo. Así, la facilidad y
bajo coste de la fabricación del aparato de la presente invención
lo hace una alternativa valiosa a los comerciales basados en
citometría de flujo.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí
como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de
ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente
invención.
La Fig. 1 es un patrón de citometría de flujo
obtenido para una levadura estándar (1.40 g/l) utilizando FDA y PI
como fluoróforos. El eje X muestra la respuesta del FDA (células
viables) y el eje Y muestra la respuesta del PI (células no
viables).
La Fig. 2 es una curva de calibración de una
solución de levadura estándar. El eje Y representa el área de pico
(PA) y el eje X la concentración de células no viables (NVC) del
estándar que varía entre 0.2 g/l y 4 g/l.
La Fig. 3 es un patrón de citometría de flujo
obtenido para la cepa de levadura Enoferm BDX.
La Fig. 4 es un patrón de citometría de flujo
obtenido para la cepa de levadura Uvaferm ALB.
La Fig. 5 es un patrón de citometría de flujo
obtenido para la cepa de levadura Uvaferm BC.
La Fig. 6 es un fractograma de GrFFF obtenido
para la cepa de levadura Enoferm BDX.
La Fig. 7 es un fractograma de GrFFF obtenido
para la cepa de levadura Uvaferm ALB.
La Fig. 8 es un fractograma de GrFFF obtenido
para la cepa de levadura Uvaferm BC.
La Fig. 9 es una curva de calibración de una
solución estándar de levadura. El eje Y representa el área de pico
(PA) y el eje X la concentración de células viables (VC).
La Fig. 10 es un esquema general del dispositivo
de GrFFF 10.
La Fig. 11 es un esquema general del sistema de
instrumentación.
Las muestras utilizadas eran levaduras secas y
activas comerciales, las cuales estaban empaquetas al vacío y
mantenidas a 4°C para su buena conservación. Se analizaron doce
tipos de Saccharomyces: S. cerevisiae (Intec Red,
Intec Cerevisiae, Uvaferm BM45, Uvaferm VRB, Uvaferm BC, Uvaferm
ALB, Enoferm BDX, Actiflore, Bourgoblanc), S. bayanus (Intec
Bayanus, Enoferm QA23) y S. uvarum (Uvaferm UVA).
La Fig. 11 muestra un esquema de un aparato
según la presente invención. El dispositivo de GrFFF utilizado
corresponde básicamente al de la Fig. 10. Este consiste en dos
placas de plástico 1 y 2, separadas por una lámina de
poliéster 15 donde está ubicado el canal 3, y unidas
mediante una montura de aluminio compuesta por varias barras
longitudinales 4 y varias barras transversales 16.
Las dimensiones del canal tipo cinta utilizado fueron 0.0151 cm de
espesor, 2 cm de ancho y 30 cm de largo con un volumen muerto de
831 \mul. La cantidad de muestra inyectada fue de 20 \mul
introducida en el canal mediante una válvula de inyección (mod. 7125
Rheodyne, Cotati, CA, USA) con un flujo de inyección de 0.2 ml/min
generado mediante una bomba HPLC (mod. 510, Waters, Milford, MA,
USA) durante 45 segundos. Después del tiempo de inyección se paró
el flujo para permitir la relajación de las células de levadura; el
tiempo de parada fue de 2 minutos. El flujo de elución fue de 0.2
ml/min. La salida del canal 6 se conectó a un sistema de
detección que comprende una célula de flujo 12 y un detector
de fluorescencia 13. Todos los experimentos se llevaron a
cabo utilizando un detector de fluorescencia (mod.
FP-1520, Jasco Corporation, Tokyo, Japan) con una
ganancia 100 y una atenuación 64. Como fase móvil se utilizó un
tampón fosfato salino isotónico (PBS) a pH 7.4. Los experimentos se
hicieron a temperatura ambiente.
Tratamiento de la muestra: Las muestras
de levadura se resuspendieron en PBS a pH 7.4 y se sonicaron
durante 2 minutos. La concentración de la muestra estaba
comprendida en el intervalo de 1 a 3 g/l de acuerdo con los valores
de concentración que normalmente se utilizan en las bodegas. Para
teñir las células de levadura con yoduro de propidio (PI), 960
\mul de la dispersión de levadura fueron fortificados con 40
\mul de la solución de PI de concentración 1 mg/ml. El tiempo de
incubación fue de 1 minuto a temperatura ambiente. Después de este
tiempo, las muestras fueron inmediatamente inyectadas en el sistema
GrFFF para ser analizadas.
Para comparar el método GrFFF desarrollado para
la estimación de la viabilidad celular, se realizaron análisis de
las mismas muestras de levadura mediante FC en combinación con los
fluoróforos. Se usaron dos fluoróforos específicos, diacetato de
fluoresceína (FDA) y yoduro de propidio (PI). FDA proporciona
información relativa a las células viables. Por el contrario, PI
aporta información de las células no viables. Todos los análisis se
realizaron utilizando un citómetro de flujo Coulter Epics® XL
(Coulter Corporation, Hialeah, Florida, USA) operando a una presión
de 25,6 x 10^{3} N/m^{2}. El flujo para las levaduras se
mantuvo por debajo de 900-1000 eventos por segundo,
para evitar coincidencias. La calibración del instrumento consiste
en un alineamiento óptico basado en la señal optimizada de gotas
fluorescentes de 10 nm (Flowcheck, Epics Division, Coulter Corp.,
Hialeah, FL, USA). Como control de la estabilidad del instrumento
se utilizó tiempo frente a fluorescencia. La excitación de la
muestra se hizo con un láser de iones de argón refrigerado por aire
a 488 nm y 15 mW de potencia. El instrumento se configuró con la
configuración estándar; se recogió la dispersión lineal (FS),
dispersión lateral (SS), fluorescencia verde (525 nm) para FDA y
fluorescencia roja (675 nm) para PI.
La fluorescencia roja emitida por el PI se
recogió a través de un filtro con paso de banda de 675; el voltaje
del tubo fotomultiplicador se configuró a 886 V. La fluorescencia
verde se recogió utilizando un filtro dicroico de paso largo a 550
y un filtro de banda de paso a 525; el voltaje del tubo
fotomultiplicador se configuró a 654 V. La fluorescencia se
representó en histogramas logarítmicos.
Tratamiento de muestra: las muestras de
levadura se resuspendieron en tampón fosfato salino (PBS, pH 7.4)
para obtener una concentración final de 10^{6} células/ml. Se
introdujo una alícuota de 1 ml de cada solución de levadura en un
tubo de ensayo, y luego se añadió el FDA a cada tubo de ensayo
hasta obtener una concentración final de 10 \mug/ml. El tiempo de
incubación fue de 10 minutos a temperatura ambiente. Después, se
añadió también una solución de PI (1 mg/ml) a cada tubo de ensayo
hasta obtener una concentración final de 40 \mug/ml. Finalmente,
se aplicó 1 minuto de incubación adicional a temperatura
ambiente.
La concentración final de las soluciones de
levadura en número de células se obtuvo utilizando un contador
Coulter Multisizer II (Coulter Corp., Hialeah, FL, USA) con 256
canales y utilizando un tamaño de apertura de 70 \mum. El
intervalo contado fue de 1.4 a 30.1 \mum. La calibración
instrumental se realizó con látex de poliestireno de 18.5 \mum
(Coulter Electronics, Luton, UK) según el manual de instrucciones
del instrumento.
Tratamiento de la muestra: se sonicaron
las suspensiones de levadura activa y seca desde 0.2 a 3.5 g/l en
PBS durante 2 minutos y luego se diluyeron 1:1000 con el reactivo
específico isotónico (Isoton II, Coulter Corp.) previamente
filtrado en un filtro de poro 0.2 \mum. El volumen analítico fue
de 500 \mul y todas las medidas se realizaron por triplicado a
temperatura ambiente.
Se prepararon siete soluciones estándar de
levadura a partir de una cepa Saccharomyces cerevisiae a
diferentes concentraciones de células. La cepa de levadura
utilizada como estándar para la calibración fue una cepa de
levadura comercial disponible en la forma levadura activa y seca,
Intec Red, y la concentración de muestra fue de 0.2 a 3.5 g/l
dentro del intervalo de linealidad del método (0.15 a 6 g/l). Para
obtener la concentración celular y el porcentaje de viabilidad
celular se utilizaron dos técnicas clásicas. Para la concentración
total de células se utilizó el contador Coulter y los resultados se
expresaron en células/ml. Luego, el mismo estándar se tiñó con FDA y
PI para obtener el porcentaje de viabilidad celular por citometría
de flujo. Como ejemplo, la Fig. 1 muestra el esquema FC obtenido
para la solución estándar de Intec Red (1.40 g/l) en
2-D (eje x, respuesta FDA y eje y, respuesta PI). En
la parte izquierda está la región positiva para las células teñidas
con PI y a la derecha la región positiva para las células teñidas
con FDA. Para Intec Red un 62.2% de viabilidad fue obtenido
utilizando ambos fluoróforos sin diferencias significativas entre
ellos. Las células no viables totales/ml y las células viables
totales/ml se calcularon por combinación de los datos del contador
Coulter y de citometría de flujo. Los resultados para cada estándar
se muestran en la Tabla 1.
La calibración del GrFFF se realizó inyectando
en el sistema siete soluciones estándar después de teñirlas con
\mul. El GrFFF permitió una eficiente separación del volumen
muerto fluorescente impidiendo la interferencia del exceso de
fluoróforo en la matriz de muestra. El FDA no se utilizó como
fluoróforo en el GrFFF porque no fue lo bastante estable en la fase
móvil. Una señal alta debido a la hidrólisis del FDA impedía la
detección de las células teñidas. la curva de calibración del
sistema de GrFFF se obtuvo en una gráfica X,Y, las áreas de pico de
los fractogramas obtenidos mediante el GrFFF con PI frente a las
células no viables, calculadas a partir de FC y CC como se ha
comentado anteriormente. Los valores del área de pico se muestran
también en la Tabla 1. La Fig. 2 muestra la curva de calibración
obtenida para la levadura estándar Intec Red.
Se analizaron varias muestras de diferentes
tipos de levadura del vino activa y seca, de S. cerevisiae,
S. bayanus y S. uvarum con un amplio intervalo de
viabilidad, de 19% a 86%, utilizando el método GrFFF desarrollado.
También se analizaron por citometría de flujo. Se analizaron once
levaduras comerciales de diferentes Saccharomyces. Se
utilizó yoduro de propidio (PI) como fluoróforo. Las muestras
tratadas se inyectaron en el canal GrFFF. Las Fig. 6, Fig. 7 y Fig.
8 muestran a modo de ejemplo los fractogramas obtenidos para tres
muestras de levaduras comerciales, Enoferm BDX, Uvaferm ALB y
Uvaferm BC analizadas por GrFFF. El área mayor corresponde a la
cepa de levadura Uvaferm ALB y significa que hay un número elevado
de células no viables en la muestra. Se realizó la integración de
los picos de las muestras para obtener por calibración externa las
células no viables/g para cada muestra. Se calcularon las células
viables/g para cada muestra utilizando los resultados de las
células no viables y los datos de CC. Los resultados de viabilidad
se expresaron como células viables/g. Las Fig. 3, Fig. 4 y Fig. 5
ilustran los resultados obtenidos mediante FC. La citometría de
flujo muestra la región de células viables (+ FDA) y la región de
células no viables (+ PI). Para estas muestras se obtuvo
respectivamente una viabilidad del 35.9%, 52.8% y 43.8%. Para la
concentración celular total se utilizó el contador Coulter y los
resultados se expresaron en células/ml.
Se realizó también para cada muestra una
determinación directa de las células viables (VC)/g mediante el
GrFFF sin utilizar los datos del contador Coulter. Se utilizó una
curva de calibración (Fig. 9) con la concentración de células
viables obtenida a partir de los datos de FC y CC para el estándar
Intec Red. Los resultados obtenidos por FC/CC se resumen en la Tabla
2. Los resultados obtenidos por ambos métodos, el GrFFF en
combinación con el CC (GrFFF/CC) y los resultados directos a partir
del GrFFF, se muestran en la Tabla 3.
Para validar el método GrFFF para la
determinación de la viabilidad celular de levaduras, se calcularon
la repetitividad y el límite de detección expresado como número de
células no viables por ml. Se llevó a cabo una comparación
estadística entre los resultados obtenidos del análisis de once
cepas de levadura diferentes utilizando GrFFF y FC, ambas
combinadas con CC, y los resultados directos a partir de GrFFF. En
primer lugar, la repetitividad de las medidas con GrFFF, CC y FC se
estableció realizando cinco análisis consecutivos de la muestra
Intec Red escogida como estándar. La mejor repetitividad fue
obtenida para CC (0.5% RSD) y valores similares se obtuvieron para
FC y GrFFF, 2.5% RSD y 2.4% RSD, respectivamente. Estos resultados
muestran que ambos métodos, el método de referencia (FC) y el nuevo
método (GrFFF), proporcionarían resultados con la misma
incertidumbre (2.5% RSD) para la determinación de células no
viables.
El límite de detección del método GrFFF
propuesto, expresado como células no viables, se calculó a partir
de la curva de calibración como el nivel más bajo de concentración
que da un área igual al valor de la ordenada en el origen más tres
veces la desviación estándar estimada. El valor obtenido fue de
10^{6} células no viables/ml, correspondiendo a 2 x 10^{4}
células inyectadas en el dispositivo de GrFFF. Se aplicaron dos
pruebas estadísticas para comparar ambos métodos analíticos, la
prueba t para medias de dos muestras pareadas y el análisis
de la varianza (ANOVA dos factores con una sola muestra por grupo).
Para la prueba t para medias de dos muestras pareadas la
t calculada (n=11) fue de 0.47, que fue más pequeño que el
valor de la t crítica (0.05, 11), 2.23. Además, en ANOVA el
valor de la F calculada para los métodos fue de 0.22, a
diferencia del valor de la F crítica, el cual fue de 4.96.
Ambas pruebas estadísticas indicaron que no existían diferencias
significativas a un nivel de confianza del 95% entre los resultados
obtenidos utilizando GrFFF y FC/CC.
Para comparar los resultados del método GrFFF
directo con los obtenidos utilizando FC/CC, se aplicaron las mismas
pruebas estadísticas. Los análisis estadísticos de los resultados,
prueba t para medias de dos muestras pareadas (t
calculada 0.68, t crítica 2.23), ANOVA (F crítica
4.96, F calculada 0.46) mostraron que no existen diferencias
significativas entre el procedimiento GrFFF simplificado y el
método de referencia FC/CC.
Claims (34)
1. Método de determinación de la viabilidad
celular que utiliza la técnica de fraccionamiento por campo
gravitatorio y flujo con detección de fluorescencia, que comprende
las etapas de:
a) dispersar una muestra que contiene dichas
células en un líquido portador y teñir las células con un
fluoróforo detectable;
b) inyectar la muestra tratada en un dispositivo
fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo (10);
c) detectar las células midiendo la
fluorescencia emitida; y
d) procesar los datos de emisión para determinar
el número de células viables.
2. Método según la reivindicación 1, donde la
dispersión de la muestra en el líquido portador se realiza por
sonicación.
3. Método según la reivindicación 2, donde el
líquido portador es una solución salina tamponada.
4. Método según la reivindicación 3, donde la
solución salina tamponada es una solución salina tamponada de
fosfato.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, donde el fluoróforo se
selecciona entre el grupo que consiste en ioduro de propidio,
diacetato de fluoresceína, diacetato de carboxifluoresceína,
calceína y SYTO 13.
6. Método según la reivindicación 5, donde el
fluoróforo es ioduro de propidio.
7. Método según la reivindicación 1, donde el
dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo
(10) comprende:
a) dos placas paralelas (1) y (2),
separadas por una lámina (15) donde está ubicado el canal
(3), y unidas mediante una montura rígida e
indeformable;
b) una entrada al canal (5); y
c) una salida del canal (6).
8. Método según la reivindicación 7, donde las
placas (1) y (2) son de plástico.
9. Método según la reivindicación 7, donde la
lámina (15) está hecha de un material seleccionado entre el
grupo formado por poliester, poliestireno y teflón.
10. Método según la reivindicación 7, donde la
montura rígida e indeformable está compuesta por varias barras
longitudinales (4) y varias barras transversales
(16).
11. Método según la reivindicación 10, donde las
barras longitudinales (4) y las barras transversales
(16) están hechas de aluminio.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7-11, donde la salida del canal
(6) se conecta a una célula de flujo (12) de un
sistema de detección de fluorescencia.
13. Método según la reivindicación 1, donde el
procesado de los datos de emisión se hace con una curva de
calibración.
14. Método según la reivindicación 13, donde la
curva de calibración se obtiene representando el área de pico
frente a la concentración de células no viables correspondientes a
varias soluciones estándar.
15. Método según la reivindicación 14, donde el
número de células viables por gramo se calculan utilizando los
resultados de células no viables y la concentración de las
soluciones de la muestra expresada como número de
células.
células.
16. Método según la reivindicación 13, donde la
curva de calibración se obtiene representando el área de pico
frente a la concentración de células viables correspondientes a
varias soluciones estándar.
17. Método según la reivindicación 16, donde el
número de células viables por gramo se obtiene directamente de la
curva de calibración.
18. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 14-17, donde las soluciones
estándar tienen una viabilidad celular bien establecida.
19. Método según la reivindicación 18, donde la
viabilidad celular de las soluciones estándar se determinan por
combinación de las técnicas de citometría de flujo y de contador
Coulter.
20. Método según la reivindicación 1, donde las
células son células de levaduras.
21. Método según la reivindicación 1, donde las
células son células de bacterias.
22. Aparato para la determinación de la
viabilidad celular, que comprende:
a) un sistema de bombeo (7);
b) un compartimento de almacenamiento del
líquido portador (8);
c) una cámara (9) que contiene un
dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo
(10);
d) un sistema de inyección para introducir la
muestra y el líquido portador (11);
e) un sistema de detección de fluorescencia que
comprende una célula de flujo (12) y un detector de
fluorescencia (13); y
f) un sistema de adquisición y tratamiento de
datos (14) para obtener los resultados de viabilidad
celular.
23. Aparato según la reivindicación 21, donde el
dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo
(10) comprende:
a) dos placas paralelas (1) y (2),
separadas por una lámina (15) donde está ubicado el canal
(3), y unidas mediante una montura rígida e
indeformable;
b) una entrada al canal (5); y
c) una salida del canal (6).
24. Aparato según la reivindicación 23, donde
las placas (1) y (2) son de plástico.
25. Aparato según la reivindicación 23, donde la
lámina (15) está hecha de un material seleccionado entre el
grupo formado por poliester, poliestireno y teflón.
26. Aparato según la reivindicación 23, donde la
montura rígida e indeformable está compuesta por varias barras
longitudinales (4) y varias barras transversales
(16).
27. Aparato según la reivindicación 26, donde
las barras longitudinales (4) y las barras transversales
(16) son de aluminio.
28. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 23-27, donde la salida del canal
(6) se conecta a una célula de flujo (12) de un
sistema de detección de fluorescencia.
29. Dispositivo de fraccionamiento por campo
gravitatorio y flujo (10) para llevar a cabo el método de la
reivindicación 1 y para la integración en el aparato de la
reivindicación 21 que comprende:
a) dos placas paralelas (1) y (2),
separadas por una lámina (15) donde está ubicado el canal
(3), y unidas mediante una montura rígida e indeformable
compuesta por varias barras longitudinales (4) y varias barras
transversales (16);
b) una entrada al canal (5); y
c) una salida del canal (6).
30. Dispositivo de fraccionamiento por campo
gravitatorio y flujo según la reivindicación 29, donde las placas
(1) y (2) son de plástico.
31. Dispositivo de fraccionamiento por campo
gravitatorio y flujo según la reivindicación 29, donde la lámina
(15) está hecha de un material seleccionado entre el grupo
formado por poliester, poliestireno y teflón.
32. Dispositivo de fraccionamiento por campo
gravitatorio y flujo según la reivindicación 29, donde la montura
rígida e indeformable está compuesta por varias barras
longitudinales (4) y varias barras transversales
(16).
33. Dispositivo de fraccionamiento por campo
gravitatorio y flujo según la reivindicación 32, donde las barras
longitudinales (4) y las barras transversales (16)
están hechas de aluminio.
34. Dispositivo de fraccionamiento por campo
gravitatorio y flujo según cualquiera de las reivindicaciones
29-33, donde la salida del canal (6) se
conecta a una célula de flujo (12) de un sistema de detección
de fluorescencia.
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