CN111351879A - 一种基于lc-ms的细胞外泌体脂质组学分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于LC‑MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，采用差速离心富集外泌体配合内标法定量测量，再结合优化的液相色谱和质谱的分析参数，在待测物中加入多种类别的稳定同位素内标物质，能够有效减少离子抑制作用带来的定量影响，对细胞外泌体样本进行高覆盖度的脂质组学得到绝对定量分析，具有更好的稳定性，且能够极大的提升定量的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及一种基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法。
背景技术
外泌体是由细胞主动向外分泌的双层囊小体，可携带多种蛋白质、核酸和脂质等在体液中循环，具有物质“运输载体”的作用，能够将内含物质运输到周围细胞中进行细胞间的物质运输和信息交流，从而参与多种生理及病理学过程，如递呈抗原、促进肿瘤生长与迁移、修复损伤组织等。脂质是细胞膜的重要组成部分，在细胞的信号传导、物质运输、能量储存等方面发挥重要作用。脂质的代谢异常与外泌体携带运输脂质过程密不可分。因此，建立可靠、稳定、高覆盖的外泌体脂质代谢分析方法对研究外泌体相关的多种疾病的发生、发展机理及药物疗效的评价具有积极的指导意义。
目前还未有针对外泌体脂质组学绝对定量的研究报道。非靶向脂质组学分析是基于质谱技术的一种常用的脂质分析方法，利用高分辨质谱的全扫描模式及数据依赖模式的二级离子扫描对待测样品分析，再利用软件对采集的全扫描谱图进行峰匹配，得到包含质荷比(m/z)，保留时间及强度等信息的峰表，再利用商业化的脂质定性软件对采集的二级谱图进行定性。该方法存在一定的局限性：由于同时进行检测的离子过多，离子抑制严重，使得质谱的线性响应较差，无法通过常规标准曲线法对待测物进行绝对定量分析，仅能通过各待测物的质谱响应强度给出一个相对的定量结果，定量的准确性较差，往往会得到错误的结果。
发明内容
基于现有技术存在上述问题，本发明提供一种基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，采用差速离心富集外泌体配合内标法定量测量，再结合优化的液相色谱和质谱的分析参数，在待测物中加入多种类别的稳定同位素内标物质，能够有效减少离子抑制作用带来的定量影响，对细胞外泌体样本进行高覆盖度的脂质组学得到绝对定量分析，具有更好的稳定性，且能够极大的提升定量的准确性。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，包括如下步骤：
步骤S1，从待检测细胞中提取外泌体样品；
步骤S2，向步骤S1中获得的外泌体样品中添加同位素内标的外泌体脂质标准品，涡旋混合，加入预冷的甲醇，涡旋混合，再加入甲基叔丁基醚，涡旋混合，室温静置，离心取上层有机相，干燥后用异丙醇/乙腈混合液复溶，离心取上清液，备用；
步骤S3，取步骤S2最后获得的样品上清液进行液相色谱分析，色谱条件为，4℃自动进样器中，柱温45℃，流速为300μL/min，进样量2μL。液相梯度如下：0-2min，B液维持在30％；2-25min，B液从30％线性变化至100％；25-35min，B液维持在30％；A液为10mM甲酸铵乙腈水溶液；B液为10mM甲酸铵；
步骤S4，步骤S3中经液相色谱分离的样品直接进行质谱分析，质谱条件：ESI源，正离子模式，加热温度(Heater Temp)：300℃,鞘气流速(Sheath Gas Flow rate)：45arb,辅助气流速(Aux Gas Flow Rate)：15arb,吹扫气流速(Sweep Gas Flow Rate)：1arb，喷雾电压(I spray voltage)：3.0KV,离子传输管的温度(Capillary Temp)：350℃,透镜电压(S-Lens RF Level)：50％，一级扫描范围(MS1 scan ranges):200-1800；
负离子模式：加热温度(Heater Temp)：300℃,鞘气流速(Sheath Gas Flowrate)：45arb,辅助气流速(Aux Gas Flow Rate)：15arb,吹扫气流速(Sweep Gas FlowRate)：1arb,喷雾电压(I spray voltage)：2.5KV,离子传输管的温度(Capillary Temp)：350℃,透镜电压(S-Lens RF Level)：60％，一级扫描范围(MS1 scan ranges):250-1800。
根据以上方案，所述的步骤S1中提取外泌体的过程具体是，取细胞上清液样品，800g，离心15min；取上清液再2,000g，离心30min；取上清液再7,500g，离心30min；取上清液过0.22μm滤膜，取滤液100,000g离心2h，去除上清液，加入PBS重悬，再以100,000g离心2h，去除上清液，再次加入PBS重悬，得外泌体样品。
根据以上方案，所述的离心均为在4℃的环境下离心。
根据以上方案，所述的步骤S2中预冷甲醇是预先冷冻到4℃的甲醇；所述的步骤S2中室温静置的时间为20-40min；所述的步骤S2中的离心条件是10℃下14000g离心15min；所述的步骤S2中的干燥为用氮气吹干；所述的步骤S2中的异丙醇/乙腈混合液为体积比异丙醇：乙腈＝9：1的混合液。
所述的步骤S2中的同位素内标的外泌体脂质标准品包括卵磷脂(PC)、脑磷酯(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、溶血卵磷脂(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、胆固醇酯(Chol Ester)、甘油单酸酯(MG)、甘油二酸酯(DG)、甘油三酯(TG)、鞘磷脂(SM)、胆固醇(Cholesterol)和神经酰胺(Ceramide)，为了方便撰写，下文中脂质均采用英文缩写。
根据以上方案，所述的步骤S3中的A液的乙腈水溶液是体积比为乙腈：水＝6:4的乙腈水溶液；所述的步骤S3中的B液的乙腈异丙醇溶液是体积比为乙腈:异丙醇＝1:9的乙腈异丙醇溶液。
本发明的有益效果是：
1)采用正负离子分2次进样采集的方式，最大程度的保证了较高的覆盖度；
2)加入15种同位素内标，不仅可以对保留时间和质谱响应进行质量控制，还可以根据已知内标的浓度计算出所有鉴定到的脂类物质的含量，该方法具有更好的稳定性，且能够极大的提升定量的准确性。
附图说明
图1是实施例样本正离子模式下的BPC图谱；
图2是实施例样本负离子模式下的BPC图谱。
附图为实施例中必然出现的实验结果图，每次实验的结果图谱会因每次实际实验的差异而发生变法，图中的文字不清晰不会影响本技术方案的重复实施。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明的技术方案进行说明。
一种基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，本实施例针对人源293T细胞进行检测，包括如下步骤：
步骤S1，取人源293T细胞上清液样品100ml，在800g，4℃，离心15min；取上清液再2,000g，4℃，离心30min；取上清液再7,500g，4℃，离心30min；取上清液过0.22μm滤膜，取滤液置于超高速离心机中以100,000g，4℃，离心2h，去除上清液，留心管底微小白色沉淀，不必完全去掉所有上清，小心混匀，转移底部溶液样品至新离心管，加入PBS溶液重悬，并配平，再以100,000g离心2h，去除上清液，留心管底微小白色沉淀，再次加入50μl PBS重悬，将底部样品转移至新的离心管中，即得外泌体样品。
步骤S2，取步骤S1中获得的外泌体样品200μL，添加20μL的14种同位素内标的外泌体脂质标准品溶液，再加入20μL的Ceramide标准品溶液(25μg/mL，d18:1/12:0)，涡旋混合，加入240μL预冷至4℃的甲醇，涡旋混合，再加入800μL甲基叔丁基醚，涡旋混合，室温静置30min，10℃下14000g离心15min，取上层有机相，氮气吹干，再加入100μL异丙醇/乙腈(9:1，v/v)溶液，涡旋30s，10℃下14000g离心15min，备用。
14种同位素内标的外泌体脂质标准品如下：
外泌体脂质标准品溶液的溶剂为甲醇。
步骤S3，取步骤S2最后获得的样品上清液进行液相色谱分析，色谱条件为，4℃自动进样器中，柱温45℃，流速为300μL/min，进样量2μL。液相梯度如下：0-2min，B液维持在30％；2-25min，B液从30％线性变化至100％；25-35min，B液维持在30％；A液为10mM甲酸铵乙腈水溶液；B液为10mM甲酸铵；A液的乙腈水溶液是体积比为乙腈：水＝6:4的乙腈水溶液；B液的乙腈异丙醇溶液是体积比为乙腈:异丙醇＝1:9的乙腈异丙醇溶液。
步骤S4，步骤S3中经液相色谱分离的样品直接进行质谱分析，质谱条件：ESI源，正离子模式，加热温度：300℃,鞘气流速：45arb,辅助气流速：15arb,吹扫气流速：1arb，喷雾电压：3.0KV,离子传输管的温度：350℃,透镜电压：50％，一级扫描范围:200-1800；
负离子模式：加热温度：300℃,鞘气流速：45arb,辅助气流速：15arb,吹扫气流速：1arb,喷雾电压：2.5KV,离子传输管的温度：350℃,透镜电压：60％，一级扫描范围:250-1800。
采用软件分别对正负离子模式得到的数据，进行定性、定量分析。国际脂质分类和命名委员会(International Lipid Classification and Nomenclature Committee)将脂类化合物分为8大类型，每个类型又可以根据极性头基的不同分为不同的亚类(lipidclass)，每一亚类根据碳链不饱和度或长度等的差异分为不同的分子种属(lipidspecies)，构成脂类化合物的三级分类。
本实施例中正、负离子模式共鉴定到426个脂质特征离子对，18个脂质亚类，其中质谱正离子模式共得到268个离子对，负离子采集模式共得到158个离子对，具体脂质亚类(Lipid class)信息见表1。
表1外泌体样本中鉴定到的脂质类型及数量结果表。
| 序号 | 类型 | 数量 | 序号 | 类型 | 数量 | |
| 1 | AcCa | 2 | 10 | PC | 156 | |
| 2 | Cer | 12 | 11 | PE | 78 | |
| 3 | CerG1 | 12 | 12 | PG | 7 | |
| 4 | CerG2 | 5 | 13 | PI | 5 | |
| 5 | DG | 1 | 14 | PS | 12 | |
| 6 | FA | 4 | 15 | SM | 61 | |
| 7 | LPC | 16 | 16 | So | 4 | |
| 8 | LPE | 3 | 17 | TG | 45 | |
| 9 | MGDG | 2 | 18 | WE | 1 |
取三份外泌体样品进行三次重复的试验，三次重复试验的样本在正离子模式下的BPC图谱如图1，样本在负离子模式下的BPC图谱如图2。
三次重复的试验，同时进行质谱数据采集，提取样本中的内标XIC图谱，计算各内标的保留时间(RT)CV及质谱响应强度(Area)的CV，其中具体结果见表2。
表2外泌体样本中鉴定到的脂质类型及数量
由表可知，本方法所使用的全部内标保留时间CV值均小于2％；内标的质谱响应CV值均小于30％，内标重复性较好，保证了鉴定结果的稳定性。
以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (6)
1.一种基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，从待检测细胞中提取外泌体样品；
步骤S2，向步骤S1中获得的外泌体样品中添加同位素内标的外泌体脂质标准品，涡旋混合，加入预冷的甲醇，涡旋混合，再加入甲基叔丁基醚，涡旋混合，室温静置，离心取上层有机相，干燥后用异丙醇/乙腈混合液复溶，离心取上清液，备用；
步骤S3，取步骤S2最后获得的样品上清液进行液相色谱分析，色谱条件为，4℃自动进样器中，柱温45℃，流速为300μL/min，进样量2μL。液相梯度如下：0-2min，B液维持在30％；2-25min，B液从30％线性变化至100％；25-35min，B液维持在30％；A液为10mM甲酸铵乙腈水溶液；B液为10mM甲酸铵；
步骤S4，步骤S3中经液相色谱分离的样品直接进行质谱分析，质谱条件：ESI源，正离子模式，加热温度：300℃,鞘气流速：45arb,辅助气流速：15arb,吹扫气流速：1arb，喷雾电压：3.0KV,离子传输管的温度：350℃,透镜电压：50％，一级扫描范围:200-1800；
负离子模式：加热温度：300℃,鞘气流速：45arb,辅助气流速：15arb,吹扫气流速：1arb,喷雾电压：2.5KV,离子传输管的温度：350℃,透镜电压：60％，一级扫描范围:250-1800。
2.根据权利要求1所述的基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，其特征在于，所述的步骤S1中提取外泌体的过程具体是，取细胞上清液样品，800g，离心15min；取上清液再2,000g，离心30min；取上清液再7,500g，离心30min；取上清液过0.22μm滤膜，取滤液100,000g离心2h，去除上清液，加入PBS重悬，再以100,000g离心2h，去除上清液，再次加入PBS重悬，得外泌体样品。
3.根据权利要求2所述的基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，其特征在于，所述的离心均为在4℃的环境下离心。
4.根据权利要求1所述的基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，其特征在于，所述的步骤S2中预冷甲醇是预先冷冻到4℃的甲醇；所述的步骤S2中室温静置的时间为20-40min；所述的步骤S2中的离心条件是10℃下14000g离心15min；所述的步骤S2中的干燥为用氮气吹干；所述的步骤S2中的异丙醇/乙腈混合液为体积比异丙醇：乙腈＝9：1的混合液。
5.根据权利要求1所述的基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，其特征在于，所述的步骤S2中的同位素内标的外泌体脂质标准品包括PC、PE、PS、PG、PI、PA、LPC、LPE、CholEster、MG、DG、TG、SM、Cholesterol和Ceramide。
6.根据权利要求1所述的基于LC-MS的细胞外泌体脂质组学分析方法，其特征在于，所述的步骤S3中的A液的乙腈水溶液是体积比为乙腈：水＝6:4的乙腈水溶液；所述的步骤S3中的B液的乙腈异丙醇溶液是体积比为乙腈:异丙醇＝1:9的乙腈异丙醇溶液。
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