CN115308340B - 一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法，包括以下步骤：从冬油菜六叶期开始采集根系；冬油菜根系脂质提取；采用液相色谱‑质谱分析鉴定目标脂质分子结构，通过同位素内标对不同类别脂质进行定量分析；组间差异脂质筛选；确定在抗寒品种(系)与耐寒品种(系)中明显高表达的脂质为冬油菜越冬期抗寒标志物。本发明方法是在冬油菜越冬期，采集自然降温状态下不同抗寒级别冬油菜品种(系)根部组织；采用拟靶向脂质组学获得冬油菜根系脂质定性定量结果，对不同品种(系)的冬油菜根部的共有差异脂质分子进行方差分析，确定抗寒有关的标志物，可以用于冬油菜抗寒性评价、抗寒品种(系)选育等方面。
Description
技术领域
本发明属于冬油菜抗寒性鉴别技术领域，涉及一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法及应用，更具体的说是涉及通过拟靶向脂质组学的分析方法获得冬油菜根系脂质定性定量结果，对不同品种(系)的冬油菜根部的共有差异脂质分子进行方差分析，确定抗寒有关的标志物。
背景技术
北方旱寒区冬季漫长，极端低温达到-32℃。超强抗寒白菜型冬油菜是一种能在北方旱寒区稳定越冬，返青率高的越冬油料作物。越冬期冬油菜地上部分枯萎，只有根系保持活力。根系抗寒性是决定冬油菜在该区能否安全越冬的关键因子。
膜的流动性是维持正常膜功能的基础，脂类是细胞膜的重要结构组分。脂质在植物应对寒冷胁迫中发挥重要作用。脂类物质的变化是生物体响应外界因素变化的特征表现。脂质组学通过研究脂质提取物，可获得脂质组的信息，了解在特定生理状态下脂质的整体变化。
目前，油菜抗寒性鉴定主要用田间鉴定和实验室鉴定等方法。田间主要统计越冬率，实验室主要测定与抗寒相关的生理指标，很少有通过脂质分析对不同抗寒品种(系)进行分析鉴别。
因此研发一种采用拟靶向脂质组学分析法明确与冬油菜抗寒有关的特征标志代谢物，在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法及应用是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法及应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法，包括以下步骤：
1)从冬油菜六叶期开始采集根系，采样间隔期20-30天。每品种(系)采集3株根系洗去泥土，去离子水冲洗后晾干水分，切碎后混合获得1个混样，每品种(系)每次采集6个混样，-80℃保存备用；
2)冬油菜根系脂质提取，每品种(系)6次生物学重复；
3)采用液相色谱-质谱分析鉴定固醇脂类、脂肪酰类、甘油磷脂类、甘油酯类和鞘脂类目标脂质分子结构，通过同位素内标对不同类别脂质进行定量分析；
4)组间差异脂质筛选；
5)确定在抗寒品种(系)与耐寒品种(系)中明显高表达的脂质为冬油菜越冬期抗寒标志物。
进一步，上述冬油菜根系脂质提取的方法包括以下步骤：
每个生物学重复取60mg混样加入300μL甲醇和水的混合物，甲醇和水的体积比为1:1，-20℃的条件下静置2min；用频率为60Hz研磨机研磨2min；加入300μL氯仿，涡旋30s后25℃超声提取10min，超声功率为300W；-20℃静置20min，最后在4℃的条件下离心10min，离心转速为13000rpm，取200μL下层氯仿层装入LC-MS进样瓶中；
对残渣二次提取后取300μL下层氯仿层，放入所述LC-MS进样瓶中挥干；
用200μL异丙醇和甲醇的混合物，异丙醇和甲醇的体积比为1:1，复溶LC-MS瓶中的脂质残渣，然后加入混合同位素内标20μL，将溶液转移至1.5mL的离心管中，再在-20℃的条件下静置2h，最后在4℃的条件下离心10min，离心转速为13000rpm，取150μL上清液装入带内衬管的LC-MS进样瓶中，得到冬油菜根系脂质提取物。
进一步，液相色谱测定的条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，100mm×2.1mm,1.8um，流动相A：乙腈:水＝(60:40，V/V)，含0.1wt％甲酸和10mM甲酸铵；流动相B：乙腈:异丙醇＝(10:90，V/V)，含0.1wt％甲酸和10mM甲酸铵；柱温55℃，流速：0.35mL/min；
进样量：5μL；梯度洗脱条件如下：0～5min：55％B；5～10min：55％B～60％B；10～13min：60％B～70％B；13～15min：70％B～90％B；15～16min：90％B～100％B；16～18min：100％B。
进一步，上述质谱分析条件如下：气帘气35psi；离子喷雾电压-4500/5500V；源温度350℃；雾化气:40psi；辅助加热气:45psi，采用schedule-MRM模式对脂类物质进行高通量分析。
进一步，上述组间差异脂质筛选方法为：采用正交偏最小二乘方-判别分析中，变量权重值第一主成分的VIP值>1和T检验的p-value值<0.05作为筛选差异脂质的标准。
进一步，上述抗寒标志物的确定方法为：对不同品种(系)采样期共有差异脂质进行方差分析，确定在抗寒品种(系)与耐寒品种(系)中明显高表达的脂质为冬油菜越冬期抗寒标志物。
本发明还提供一种上述的在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法在冬油菜抗寒性评价、抗寒品种或品系选育中的应用。
本发明的有益效果：本发明方法是在冬油菜越冬期，采集自然降温状态下不同抗寒级别冬油菜品种(系)根部组织；采用拟靶向脂质组学获得冬油菜根系脂质定性定量结果，对不同品种(系)的冬油菜根部的共有差异脂质分子进行方差分析，确定抗寒有关的标志物，可以用于冬油菜抗寒性评价、抗寒品种(系)选育等方面。
附图说明
图1自然降温过程中2个冬油菜品种根系PE(16:0/16:2)变化。L7-陇油7号，LN-Lenox；CK：第一次采样，CT1：第二次采样，CT2：第三次采样，CT3：第四次采样，CT4第五次采样。
图2自然降温过程中2个冬油菜品种根系TAG(52:4/16:0)变化。L7-陇油7号，LN-Lenox；CK：第一次采样，CT1：第二次采样，CT2：第三次采样，CT3：第四次采样，CT4第五次采样。
图3自然降温过程中2个冬油菜品种根系TAG(52:6/16:0)变化。L7-陇油7号，LN-Lenox；CK：第一次采样，CT1：第二次采样，CT2：第三次采样，CT3：第四次采样，CT4第五次采样。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.实验材料：2个抗寒级别不同的冬油菜品种：超强抗寒品种陇油6号和弱抗寒品种Lenox，均采收于甘肃云登。
2.样品采集：从冬油菜六叶期开始采集根系，采样间隔期21天，共采样5次，每品种采集3株根系洗去泥土，水冲洗后晾干水分，切碎后混合获得1个混样，每品种每次采集6个混样，-80℃保存备用。
3.脂质提取及分析
(1)冬油菜根系脂质提取的方法包括以下步骤：
每个生物学重复取60mg混样加入300μL甲醇和水的混合物，甲醇和水的体积比为1:1，-20℃下静置2min；用频率为60Hz研磨机研磨2min；加入300μL氯仿，涡旋30s后25℃超声提取10min，超声功率为300W；-20℃静置20min，最后在4℃的条件下离心10min，离心转速为13000rpm，取200μL下层氯仿层装入LC-MS进样瓶中；
对残渣二次提取后取300μL下层氯仿层，放入所述LC-MS进样瓶中挥干，二次提取步骤和参数同第一次提取；
用200μL异丙醇和甲醇混合物，异丙醇和甲醇的的体积比为1:1，复溶LC-MS瓶中的脂质残渣，然后加入混合同位素内标20μL，将溶液转移至1.5mL的离心管中，再在-20℃的条件下静置2h，最后在4℃的条件下离心10min，离心转速为13000rpm，取150μL上清液装入带内衬管的LC-MS进样瓶中，得到冬油菜根系脂质提取物。
(2)液相色谱-质谱分析条件
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，100mm×2.1mm,1.8um，流动相A：乙腈:水＝(60:40，V/V)，含0.1wt％甲酸和10mM甲酸铵；流动相B：乙腈:异丙醇＝(10:90，V/V)，含0.1wt％甲酸和10mM甲酸铵；柱温55℃，流速：0.35mL/min；
进样量：5μL；梯度洗脱条件如下：0～5min：55％B；5～10min：55％B～60％B；10～13min：60％B～70％B；13～15min：70％B～90％B；15～16min：90％B～100％B；16～18min：100％B。
结果显示，2种冬油菜根系5次采样共检测到固醇脂类、脂肪酰类、甘油磷脂类、甘油酯类、鞘脂类等5大类脂质，共计432种脂类物质。(见表1)
表1 432种脂类物质
(3)不同类别脂质定量分析：通过同位素内标法对检测到的432种脂类物质进行定量分析，结果计算如下：将代谢物的积分峰面积带入计算公式计算后，最终得到实际样本中各代谢物的半定量数据。
质谱分析条件如下：气帘气35psi；离子喷雾电压-4500/5500V；源温度350℃；雾化气:40psi；辅助加热气:45psi，采用schedule-MRM模式对脂类物质进行高通量分析。
定量公式如下：
脂质含量(ng/mL或g)＝A1/A2*C*V/N
A1--目标脂质峰面积；
A2--目标脂质对应的脂质内标峰面积；
C--样本中加入对应脂质内标的内标浓度值(ng/mL)；
V--定容体积(0.2mL)；
N--称取的样本质量或取样体积。
4.数据分析
(1)多元统计分析：先采用无监督的主成分分析来观察各样本之间的总体分布和整个分析过程的稳定性，然后用有监督的偏最小二乘法分析及正交偏最小二乘法分析来区分各组间代谢轮廓的总体差异，找到组间的差异代谢物。
(2)单变量统计分析：用T检验和变异倍数分析来比较两组之间的代谢产物。
5.差异代谢物筛选
采用多维分析和单维分析相结合的办法，来筛选组间差异代谢产物。筛选的标准为OPLS-DA模型第一主成分的变量权重值VIP值>1，T检验的p-value值<0.05。
6.对不同品种(系)采样期共有差异脂质进行方差分析，确定在抗寒品种(系)与耐寒品种(系)中明显高表达的脂质为冬油菜越冬期抗寒标志物。
结果显示，陇油6号4个比较组共有差异代谢物7种，分别为PE(16:0/16:2),PA(18:2/18:3),TAG52:6(16:0),TAG48:3(16:0),TAG52:4(16:0),TAG52:3(16:0)和DAG(18:2/18:2)。弱抗寒品种Lenox 4个比较组共有差异代谢物5种，分别为PE(16:0/16:2)，TAG52:6(16:0),TAG52:4(16:0),DAG(18:2/18:3)和DAG(18:3/18:3)。2个品种共有差异脂质为PE(16:0/16:2)、TAG52:6(16:0)和TAG52:4(16:0)3种。方差分析结果显示，随着田间自然温度的降低，这3种差异脂质在2个冬油菜品种根部含量均升高，但超强抗寒品种陇油6号中含量高于弱抗寒品种Lenox中含量。说明PE(16:0/16:2)、TAG52:6(16:0)和TAG52:4(16:0)这3种脂质可作为自然降温过程中冬油菜抗寒标志性脂质分子。
图1-3为2个冬油菜品种不同采样时间段共有3种差异脂质方差分析结果。随着自然温度的降低，3种差异脂质在2品种根部含量均升高，但超强抗寒品种陇油6号中含量高于弱抗寒品种Lenox中含量。说明这3种脂质可作为自然降温过程中冬油菜抗寒标志性脂质分子。
对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从冬油菜六叶期开始采集根系，采样间隔期20-30天；每品种采集3株根系洗去泥土，去离子水冲洗后晾干水分，切碎后混合获得1个混样，每品种每次采集6个混样，-80℃保存备用；
2)冬油菜根系脂质提取，每品种6次生物学重复；
3)采用液相色谱-质谱分析鉴定固醇脂类、脂肪酰类、甘油磷脂类、甘油酯类和鞘脂类目标脂质分子结构，通过同位素内标对不同类别脂质进行定量分析；
4)组间差异脂质筛选；
5)确定在抗寒品种与耐寒品种中明显高表达的脂质为冬油菜越冬期抗寒标志物；
所述冬油菜根系脂质提取的方法包括以下步骤：
每个生物学重复取60mg混样加入300μL甲醇和水的混合物，甲醇和水的体积比为1:1，-20℃的条件下静置2min；用频率为60Hz研磨机研磨2min；加入300μL氯仿，涡旋30s后25℃超声提取10min，超声功率为300W；-20℃静置20min，最后在4℃的条件下离心10min，离心转速为13000rpm，取200μL下层氯仿层装入LC-MS进样瓶中；
对残渣二次提取后取300μL下层氯仿层，放入所述LC-MS进样瓶中挥干；
用200μL异丙醇和甲醇的混合物，异丙醇和甲醇的体积比1:1，复溶LC-MS瓶中的脂质残渣，然后加入混合同位素内标20μL，将溶液转移至1.5mL的离心管中，再在-20℃的条件下静置2h，最后在4℃的条件下离心10min，离心转速为13000rpm，取150μL上清液装入带内衬管的LC-MS进样瓶中，得到冬油菜根系脂质提取物；
还包括数据分析：（1）多元统计分析：先采用无监督的主成分分析来观察各样本之间的总体分布和整个分析过程的稳定性，然后用有监督的偏最小二乘法分析及正交偏最小二乘法分析来区分各组间代谢轮廓的总体差异，找到组间的差异代谢物；（2）单变量统计分析：用T检验和变异倍数分析来比较两组之间的代谢产物；
所述组间差异脂质筛选方法为：采用正交偏最小二乘法-判别分析中，变量权重值第一主成分的VIP值>1和T检验的p-value值<0.05作为筛选差异脂质的标准。
2.根据权利要求1所述的一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法，其特征在于，液相色谱测定的条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，100mm×2.1mm，1.8um，流动相A：乙腈:水＝60:40，V/V，含0.1wt％甲酸和10mM甲酸铵；流动相B：乙腈:异丙醇＝10:90，V/V，含0.1wt％甲酸和10mM甲酸铵；柱温55℃，流速：0.35mL/min；
进样量：5μL；梯度洗脱条件如下：0～5min：55％B；5～10min：55％B～60％B；10～13min：60％B～70％B；13～15min：70％B～90％B；15～16min：90％B～100％B；16～18min：100％B。
3.根据权利要求1所述的一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法，其特征在于，所述质谱分析条件如下：气帘气35psi；离子喷雾电压-4500/5500V；源温度350℃；雾化气:40psi；辅助加热气:45psi，采用schedule-MRM模式对脂类物质进行高通量分析。
4.根据权利要求1所述的一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法，其特征在于，所述抗寒标志物的确定方法为：对不同品种采样期共有差异脂质进行方差分析，确定在抗寒品种与耐寒品种中明显高表达的脂质为冬油菜越冬期抗寒标志物。
5.一种权利要求1-4任一项所述的在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法在冬油菜抗寒性评价、抗寒品种或品系选育中的应用。
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