CN109870536A - 一种基于液相色谱-质谱联用的高覆盖脂质组学分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于液相色谱‑质谱联用的高覆盖脂质组学分析方法。基于多种类型基质提取制作单独或混合样本，利用超高效液相色谱‑高分辨质谱数据依赖采集模式自动采集合并各样本脂质代谢物的二级质谱，采用定性分析软件提取脂质保留时间、母离子及其子离子信息；根据脂质质谱结构特征筛选母离子对应的特征子离子，得到特征离子对；将不同类型样本得到的特征离子对信息加和，进一步根据脂质数据库、脂质结构特征以及色谱保留规律对脂质离子对进行扩充，得到最终的脂质离子对库。利用UPLC‑QQQ‑MS通过动态多反应监测模式对脂质离子对进行扫描。与传统非靶向脂质组学分析方法相比，本发明具有更好的重复性、脂质覆盖度。

Description

一种基于液相色谱-质谱联用的高覆盖脂质组学分析方法

技术领域

本发明涉及分析化学、生物化学和医学领域，是一种基于超高效液相色谱/三重四级杆质谱联用的采用动态多反应监测模式进行高覆盖脂质组学分析的方法。

背景技术

脂质是细胞膜的重要组成部分，在细胞的信号传导、物质运输、能量储存等方面发挥重要的作用。脂质代谢异常与众多疾病如肥胖、高血压、糖尿病、心血管疾病、帕金森、癌症等的发生发展密切相关。脂质组成繁多，结构复杂，人体内脂质高低含量的差别高达6～7个数量级。因此，建立可靠、稳定、高覆盖、高灵敏的脂质代谢物分析方法对研究与脂代谢紊乱相关疾病的生理、病理具有积极的指导意义。脂质组学技术致力于通过分析复杂生物样本中尽可能多的脂质代谢物及其受到外界刺激/扰动后所发生的变化来研究与脂质代谢表型相关的生物现象及其功能。近年来，已被广泛应用于相关疾病的研究，用于发现与疾病预防及诊断相关的脂质标记物，为疾病的发生、发展机理及药物疗效的评价提高理论依据。常用的脂质组学分析方法主要有基于质谱技术的直接进样法即“鸟枪法”和基于色谱－质谱的联用技术。“鸟枪法”，分析通量高，但离子抑制问题明显，不利于低丰度及同分异构脂质的分析检测。基于色谱－质谱联用的脂质组学分析技术由于具有质谱检测前的色谱预分离过程，可大大减少离子抑制，提高检测灵敏度，改善痕量脂质及同分异构脂质代谢物的分离检测。

目前脂质组学的分析策略主要分为两种：非靶向分析和靶向分析。非靶向脂质组学分析是基于质谱技术的一种常用的脂质分析方法，只需将样本按照一定的步骤进行预处理，利用质谱的全扫描模式及数据依赖模式的二级离子扫描对待测样品分析，再利用软件对采集的全扫描谱图进行峰匹配，得到包含质荷比(m/z)，保留时间(色谱-质谱联用)及强度等信息的峰表，然后根据二级谱图及准确质量数对m/z进行归属；也可利用商业化的脂质定性软件，先对采集的二级谱图进行定性，再根据定性结果通过脂质定量软件对全扫描谱图进行靶向提取，得到脂质代谢物、保留时间(色谱-质谱联用)及强度等信息的峰表。通过多变量或单变量统计分析找出差异脂质代谢物，并进行进一步的生物学解释。非靶向脂质组学分析常用的质谱是高分辨的飞行时间质谱、四级杆-飞行时间串联质谱、四级杆-静电轨道阱串联质谱以及傅里叶变换-离子回旋共振质谱等，具有较高的质量准确度，利于脂质结构鉴定。但非靶向方法存在一定的局限性：如由于同时进行很宽范围的扫描，导致同时检测的离子数过多，使得质谱的线性响应较差，低丰度脂质难以检测，定量准确性也会受到影响；另外后续数据处理繁琐，峰匹配过程易受峰匹配参数的影响，会引入误差，由于匹配算法的局限，往往会得到错误的结果，影响数据的准确性，使得不同批次的数据难以重复。尽管商业化脂质定性、定量软件可利用脂质的一级、二级信息，直接给出脂质的定性定量结果，一定程度上提高了数据的准确性，但脂质定性软件高度依赖二级谱图，只能对有二级碎裂的脂质进行定性，导致多数丰度较低、没有二级碎裂的脂质信息会被掩盖。

靶向脂质组学分析是基于质谱的另一种常见的脂质分析策略。通常采用用三重四级杆，通过多反应监测模式进行检测。三重四级杆多反应监测时，第一个四级杆选择脂质的特征母离子，第二个四级杆相当于碰撞池，将选定的母离子在一定电压下碎裂，第三个四级杆则选择待测脂质的特征子离子。靶向脂质组学分析，线性范围宽，可以最大程度满足样品中脂质的检测；选择性高，基质干扰小，灵敏度高，有利于痕量物质的检测；重复性好，数据质量高，不同批次间具有可比性，适合大规模样品分析；另外，由于离子对是预设的，无需峰匹配。但靶向脂质组学分析针对的是具有重要生物功能的某一类脂质代谢物或特定通路上的关键脂质代谢物，检测的脂质数目有限，难以满足脂质组学中检测尽可能多的脂质代谢物的需求。

为了克服非靶向脂质组学和靶向脂质组学分析中的不足，本发明发展了一种基于超高效液相色谱/三重四级杆质谱的高覆盖脂质组学分析方法。为了覆盖尽可能多的脂质，选择不同类型样品基质，利用超高效液相色谱-高分辨质谱进行非靶向数据依赖的自动二级质谱分析，获得脂质的保留时间、母离子及子离子信息。同时，结合脂质数据库和脂质的结构特征，对脂质离子对进行扩充，并根据实测脂质的保留时间和保留规律，对扩充的脂质离子对进行保留时间预测，并将其与样品中获取的脂质特征离子对合并，建立高覆盖的脂质特征离子对库，以适应不同基质来源的样品如细胞、组织或血清/血浆的分析。后续分析可直接使用该特征离子对库，无需重复离子对的获取过程。根据脂质特征离子对库的保留时间和特征离子对信息，构建1个或几个超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测模式方法。实际待测的所有生物样本，首先采用质量控制样本，利用构建的1个或几个超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测模式方法获得实测样本中的有效脂质特征离子对，再对单个的待测生物样本，利用超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测模式对有效脂质特征离子对进行扫描分析。

发明内容

本发明针对非靶向和靶向脂质组学分析策略的不足，首先建立高覆盖的脂质特征离子对库。其次，提供了一种基于超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测(UHPLC/QQQ-MS-DMRM)的高覆盖脂质组学分析新方法。相较于传统的非靶向脂质组学分析，重复性好，线性范围宽，检测能力强，无需峰匹配，数据质量好等优点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1)选择不同类型的样品基质，包括但不限于人或动物的组织、细胞、血浆/血清或植物的组织、细胞中的一种或多种；对样本进行脂质提取，其提取体系可以是氯仿-甲醇-水体系或甲基叔丁基醚-甲醇-水体系，得到可供色谱/质谱分析的进样溶液(即脂质提取液冻干物的复溶液)；提取剂中加入8个外源代谢物PC38:0，LPC19:0，TG45:0，PE34:0/PE30:0，FFA16:0-d3，FFA18:0-d3，Cer35:1，SM30:1作为内标，用于色谱保留时间校正；单独或混合样本是指将各类型样品的进样溶液单独或等体积混合。

2)利用超高效液相色谱/组合四级杆-轨道阱质谱的数据依赖采集模式自动采集合并各样本所含脂质代谢物的二级质谱。

3)利用定性软件，如Thermo Xcalibur Qual Browser和LipidSearch提取各样本所测得脂质代谢物的保留时间、校正保留时间、母离子、子离子信息；根据脂质的质谱结构特征筛选母离子对应的特征子离子，进而构成特征离子对；将各样本中得到的特征离子对加和，这里所称的加和是指在任一样本中出现一次的特征离子对都作为一个最终的特征离子对，而在多个样本中均出现的离子对仅作为一个特征离子对。

4)根据脂质数据库Lipid Maps及脂质质谱结构特征，扩充脂质特征离子对；这里的扩充是指在实际样本中检测出的脂质基础上，进一步增加每类脂质的数目，而不涉及脂质类别的增加；基于实测脂质的保留时间及色谱保留规律，对扩充脂质离子对进行保留时间预测，将其与实测样本中的特征离子对合并，得到总的脂质特征离子对库；这里的色谱保留规律是指脂质的保留时间与碳数、保留时间与碳-碳双键数间的对应关系。

5)采用不同类别脂质标样混合物，优化每类脂质特征离子对的质谱去簇电压和碰撞能等质谱条件，作为该类脂质的最佳质谱条件；将脂质特征离子对库中的母离子、子离子、保留时间及优化的去簇电压和碰撞能输入到超高效液相色谱/三重四级杆质谱工作站；如果同一时间，输入超高效液相色谱/三重四级杆质谱工作站的特征离子对数目大于200个，则增加超高效液相色谱/三重四级杆质谱采集针数；使得每个超高效液相色谱/三重四级杆质谱方法，均保证同一时间采集的特征离子对不超过200个。

6)实际待测生物样本的高覆盖脂质组学分析分析：将建立的超高效液相色谱/三重四级杆质谱采集方法在正、负离子模式下用于单个样本或质量控制样分析；每个方法均对质量控制样本重复3次分析，与脂质离子对库对比，离子对出现至少2次以上且校正保留时间与特征离子对库中的校正保留时间偏差≤0.5min,视为有效离子对；这里的质量控制样是由待分析样品等体积混合制备而成。

7)实际样本采用与质量控制样本相同的超高效液相色谱/三重四级杆质谱联用方法，采用动态多反应监测模式，仅采集有效离子对，获得样品对应的谱图；再通过定量分析软件进行峰面积积分，得到待测样品的脂质代谢物及其定量信息。

8)将质量控制样品进行3次及以上平行处理，每个平行样重复进样两次。分别用超高效液相色谱/线性离子阱-静电轨道阱质谱进行非靶向脂质组学分析和超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测高覆盖脂质组学分析，统计检测脂质的个数及计算其相对标准偏差，用于评价方法的检测能力及方法的重复性。

9)配制脂质标样混合液，分为10个浓度梯度分别加入到质量控制样本中，每个浓度梯度，平行处理3个，每个处理重复进样两次(n＝3×2)，考察方法的线性；低、中、高三种浓度水平的脂质标样混合液分别于提取前和提取后加入到质量控制样本中，平行处理3个，每个处理重复进样两次(n＝3×2)，考察方法的回收率；低、中、高三种浓度水平的脂质标样混合液分别加入到质量控制样本中，平行处理3个，每个处理重复进样两次(n＝3×2)；连续三天重复这一处理过程，考察方法的日内、日间精密度。

由于上述技术方案的使用，与现有技术方案相比，本发明具有以下优点：

离子对的获取包括样品导向和数据库导向两个来源，获得的脂质离子对库的覆盖度更高；可适用于不同基质样本的动态多反应监测高覆盖脂质分析，无需重复非靶向脂质分析的过程；方法的重复性好，使得大规模样品分析时数据的可靠性得以保证；方法的线性范围宽，可以最大程度满足复杂样品中脂质代谢物的分析；由于每个脂质代谢物都是预先设定的，无需对得到的谱图进行峰匹配，简化了数据处理过程，提高了数据质量以及不同批次间数据分析结果的可重复性；相较于传统的非靶向脂质组学分析方法，可针对每类乃至每个代谢物进行质谱条件优化，具有更好的重复性、更高的检测能力和更准确的定量能力。

附图说明

图1高覆盖脂质组学分析方法建立流程图，A脂质特征离子对库的建立流程；B高覆盖脂质组学血浆样品分析流程。

图2扩充脂质特征离子对的保留时间预测。A保留时间与碳数关系；B保留时间与碳-碳双键数关系。

图3基于UPLC/QQQ-MS-DMRM血浆高覆盖脂质组学分析典型色谱图，A正离子模式，血浆UPLC/QQQ-MS-DMRM谱图；B负离子模式，血浆UPLC/QQQ-MS-DMRM谱图。

图4是非靶向脂质组学分析与本发明脂质组学方法分析检测能力与重复性比较图，A本发明方法与非靶向方法在血浆中检测的脂质数目；B正离子模式，本发明方法与非靶向重复性比较；C负离子模式，本发明方法与非靶向重复性比较。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1基于UPLC/QQQ-MS-DMRM的高覆盖脂质组学分析方法

基于UPLC/QQQ-MS-DMRM的高覆盖脂质组学分析方法建立的流程图如图1A所示，具体实施步骤如下:

1.不同类型生物样本的制备。

不同类型样本脂质代谢物的提取溶液中均加入8个外源代谢物作为内标，内标混合液PC38:0，6.7μg/ml；LPC19:0，3.3μg/ml；TG45:0，5.3μg/ml；PE34:0/PE30:0，3.3μg/ml；FFA16:0-d3，6.7μg/ml；FFA18:0-d3，6.7μg/ml；Cer35:1，1.7μg/ml；SM30:1，1.7μg/ml。

1)组织样本：冰上操作，称取10mg大鼠脑组织于2ml EP管中，加入研磨珠，加入30μl内标混合液，加入400μl的甲醇溶液，研磨25HZ*1min*2times，加入800μl的氯仿，振荡10min，加入240μl的超纯水，振荡5min，4℃静置10min，离心10000g*4℃*10min，取下层350μl冻干，大鼠肝组织的处理同上。

2)血浆样本：冰上操作，取50μl健康人血浆，加入30μl内标混合液，加入400μl的甲醇溶液，涡旋10s，加入800μl氯仿，振荡10min，加入240μl超纯水，振荡5min，4℃静置10min，离心10000g*4℃*10min,取下层350μl冻干。

3)细胞样本：冰上操作，细胞样品(～10⁶)，移走培养液，PBS清洗三次，加入30μl内标混合液，加入1ml甲醇，转移至5ml EP管中，涡旋10s，加入2.5ml甲基叔丁基醚(MTBE)，涡旋10min，加入700μl超纯水，涡旋10s，4℃静置10min，离心10000g*4℃*10min，取上层700μl冻干。

4)冻干物复溶(复溶液：二氯甲烷/甲醇＝2:1；稀释液：乙腈/异丙醇/水＝65:30:5；复溶液/稀释液＝1:3,V/V)，复溶样品单独或等量混合制备进样溶液。

2.二级质谱采集

超高效液相色谱(Waters，UPLC)配置组合型四级杆-轨道阱质谱(ThermoSCIENTIFIC，Q EXACTIVE HF)用于代谢物二级质谱采集。色谱柱为UPLC ACQUITY^TM C8column(2.1mmx100mmx1.7μm,Waters,Milford,USA)。流动相A：乙腈/水＝60:40(10mM乙酸铵)；B:异丙醇/乙腈＝90:10(10mM乙酸铵)。梯度：0-1.5min，保持B％为32％；1.5-15.5min，B％从32％线性升至85％；15.5-15.6min，B％从85％线性升至97％，并保持2.4min；18-18.1min，B％从97％回到32％后并平衡1.9min。柱温：55℃，进样量：5μl，流速0.26ml/min。质谱条件：HESI源，正、负离子两种采集模式，鞘气流速45，辅助气流速10，喷雾电压3.5KV，毛细管温度320℃。分别在25，35和45eV条件下自动二级质谱扫描，采集组织、细胞、血样中的脂质代谢物二级谱图。

3.特征脂质离子对的获取和总的脂质特征离子对库构建

利用定性软件(Thermo Xcalibur Qual Browser和LipidSearch)提取血浆、组织、细胞及混合样品中所测得脂质代谢物的保留时间、校正保留时间、母离子、子离子信息，结合脂质质谱的结构特征筛选母离子对应的子离子构成特征离子对；将各样本中得到的特征离子对加和，这里所称的加和是指任一样本中出现一次的特征离子对都算作最终特征离子对，而在多个样本中均出现的离子对算作一个特征离子对。采用该方法共得到1034个脂质特征离子对，对应22个脂质亚类。

结合脂质数据库Lipid Maps及脂质的结构特征，在1034个脂质特征离子对的基础上扩充脂质离子对。根据实测脂质的保留时间及脂质的保留时间与碳数、保留时间与碳-碳双键数的关系，如图2所示。以磷脂酰胆碱(PC)为例，图2A中利用样本中实测到8个不同链长饱和脂肪酸取代的PCs(PC30:0，PC32:0，PC33:0，PC34:0，PC35:0，PC36:0，PC38:0，PC40:0)，以它们的校正保留时间对碳数作图，得到线性关系曲线，将实际样本中未检测到或鉴定出的脂质如PC37:0的碳数(n＝37)代入方程，即可得到该PC37:0的预测保留时间为8.91min。图2B为将实测到7个不同双键数目的PCs(PC38:0，PC38:1，PC38:2，PC38:3，PC38:4，PC38:6，PC38:7)，以它们的校正保留时间对碳-碳双键数作图，得到线性关系曲线。同样，对样本中未检测到或鉴定出的同类脂质如PC38:5的碳-碳双键数(n＝5)代入线性曲线，即可得到该脂质的预测保留时间为6.53min。购买PC37:0和PC38:5的标样对预测值进行评价，PC37:0和PC38:5的实测值为分别为8.95min和6.5min，实验值和预测值非常接近，证明利用保留规律对脂质保留时间预测方法可行。

采用该方法对实际样本中未检测到的脂质离子对(扩充脂质离子对)进行保留时间预测，并将其与实测特征离子对合并，共得到3077个脂质特征离子对，22个脂质亚类(表1)。其中，质谱正离子模式共得到2524个离子对，负离子采集模式得到561个离子对。利用上述全部脂质特征离子对，及其对应的色谱保留时间或预测色谱保留时间以及质谱采集模式信息即构建得到总的脂质特征离子对库。

4.基于UPLC/QQQ-MS-DMRM方法的高覆盖脂质组学分析建立

基于各类脂质标样混合物，优化每类特征离子对的去簇电压和碰撞能等质谱条件，使其响应达到最大，作为该类脂质的最优化条件；考察同一时间离子对密集程度对质谱采集灵敏度、稳定性的影响，结果发现，在同一时间，当每分钟脂质离子对数目≤200时，对质谱检测的灵敏度和稳定性影响不大。

对脂质特征离子对库中的3077个离子对的同一采集时间离子对数目进行分析，其中负离子采集模式得到的561个离子对均满足在同一时间段，每分钟脂质离子对数目≤200个的条件，负离子模式下仅用一针采集即可。正离子模式得到的2524个离子对需拆分成2针，每针包含1262个脂质特征离子对，满足在同一时间段，每分钟离子对数目≤200个的条件。将每个方法的离子对和保留时间输入到超高效液相色谱(Waters，UPLC)/三重四级杆质谱(AB SCIEX，Q-Trap5500)工作站，完成方法建立。

表1 生物样本中实际检测及根据脂质数据库拓展后的脂质信息总表

实施例2.血浆高覆盖脂质组学分析

血浆高覆盖脂质组学分析的具体流程如图1B所示，具体实施步骤如下:

1.血浆样本预处理

首先等量混合待测血浆样品，作为质量控制样QC，取40μl QC，加入300μl甲醇溶液(含8个内标，PC38:0，0.67μg/ml；LPC19:0，0.33μg/ml；TG45:0，0.53μg/ml；PE34:0/PE30:0，0.33μg/ml；FFA16:0-d3，0.67μg/ml；FFA18:0-d3，0.67μg/ml；Cer35:1，0.17μg/ml；SM30:1，0.17μg/ml)，涡旋10s，加入1ml MTBE，振荡10min,加入300μl超纯水，涡旋30s，4℃静置10min,离心10000rpm*4℃*10min，取上层400μl冻干，复溶(复溶液：二氯甲烷/甲醇＝2:1；稀释液：乙腈/异丙醇/水＝65:30:5；复溶液/稀释液＝1:3,V/V)至120μl，用于质谱负离子模式分析；稀释液稀释三倍，用于质谱正离子模式分析。

2.基于UPLC/QQQ-MS-DMRM的血浆高覆盖脂质组学分析

采用实施例1建立的基于UPLC/QQQ-MS-DMRM采集方法，对QC样本的血浆脂质组进行分析，每个方法重复3次。在QC样品分析前，首先通过脂质的八个内标(PC38:0，LPC19:0，TG45:0，PE34:0/PE30:0，FFA16:0-d3，FFA18:0-d3，Cer35:1，SM30:1)对脂质离子库中的保留时间进行校正，得到校正保留时间，再将校正保留时间和特征离子对UPLC/QQQ(ABSCIEX，Q-Trap5500)输入工作站，对QC样品进行动态MRM分析。通过定性分析软件进行离子对提取，保留QC样品中离子对峰出现至少2次，且校正保留时间与特征离子对库中的校正保留时间偏差≤0.5min的离子对，实际共得到851个特征离子对，定义为有效离子对。对于单个血浆样品动态多反应监测分析，仅采集有效离子对，获得对应的谱图，如图3所示。

实施例3.基于UPLC/QQQ-MS-DMRM的高覆盖脂质组学分析的方法学考察

将上述待测血浆样品等体积混合，制备质量控制样(QC)，按下述不同考察对象分别进行预处理。

1.重复性考察

移取40μl QC,加入300μl甲醇溶液(含8个内标，PC38:0，0.67μg/ml；LPC19:0，0.33μg/ml；TG45:0，0.53μg/ml；PE34:0/PE30:0，0.33μg/ml；FFA16:0-d3，0.67μg/ml；FFA18:0-d3，0.67μg/ml；Cer35:1，0.17μg/ml；SM30:1，0.17μg/ml)，涡旋10s，加入1ml MTBE，振荡10min,加入300μl超纯水，涡旋30s，4℃静置10min,离心10000g*4℃*10min，取上层400μl冻干。复溶(复溶液：二氯甲烷/甲醇＝2:1；稀释液：乙腈/异丙醇/水＝65:30:5；复溶液/稀释液＝1:3,V/V)至200μl，负离子分析，稀释三倍，用于正离子分析。平行处理三个样本，每个样本进样分析两次。

2.本发明与传统非靶向脂质组学方法比较

将3个QC样品分别进行非靶向分析和本发明方法分析，每个样本进样两次。非靶向分析方法的采用超高效液相色谱/线性离子阱-轨道阱质谱的数据依赖采集模式，其色谱、质谱条件同实例1，自动采集脂质代谢物的二级质谱。非靶向脂质组学分析方法采集到的脂质组学数据利用二级质谱信息定性。两种方法鉴别出的脂质数目见图4A。从图中可知，在血浆样品中，本发明方法共检测到851个脂质特征离子对，非靶向采集方法只鉴别出521个脂质，表明本发明方法较传统非靶向方法有更高的脂质覆盖度。其中，非靶向方法与本发明方法分析相同的脂质共521个，利用这521个峰进行两个采集方法的重复性比较，如图4B，4C所示。从图4B中可知，采用正离子模式，本发明方法有78％的脂质其峰面积的RSD％≤10，而传统非靶向方法只有66％；本发明方法有94％的脂质峰面积RSD％≤20，非靶向方法只有83％；从图4C可知，采用质谱负离子模式，本发明方法有94％的脂质峰面积RSD％≤10，非靶向方法只有75％；本发明方法有98％的脂质峰面积RSD％≤20，非靶向方法只有89％。从上述比较可以看出，本发明不但可实现高覆盖脂质组分析，且具有更好的重复性。

3.方法的线性，回收率，日内、日间精密度

配制不同浓度的7种外源性脂质的混标溶液(标样浓度见表2)。移取40μl QC，加入30μl脂质混标溶液，加入300μl甲醇溶液，涡旋10s，加入1ml MTBE，振荡10min，加入300μl超纯水，涡旋30s，4℃静置10min，离心10000rpm*4℃*10min，取上层400μl冻干。每个浓度的混标均按上述方法加入QC样本，平行处理三份。提取物复溶，高覆盖脂质组学方法分析，重复进样两次，用于考察方法的线性。

在40μl QC中加入低、中、高三个浓度水平的7种外源性脂质内标溶液30μl，采用前述预处理方法测定其在QC样品中的日内、日间精密度。低、中浓度分别对应表2中的C4和C6；除TG(15:0/15:0/15:0)和FFA16:0-d₃外的5种脂质的高浓度对应表2中的C8，TG(15:0/15:0/15:0)和FFA16:0-d₃的高浓度是C6浓度的120％。连续三天重复样本处理，每天平行处理3份进样分析，每份样本进样分析2次(n＝3×3×2)。

考察低、中、高浓度的7种外源性脂质内标在QC样品中的回收率，样品前处理方法同前，30μl脂质混标溶液分别在提取前、提取后加入40μl QC。

方法表征结果如表3所示。脂质标样的线性范围均在10³～10⁴，相关系数均大于0.99，表明线性良好；检测限可以达到pg/ml级，脂质标样的低、中、高三个浓度的回收率均在77％～119％之间；日内精密度RSD均小于10％，日间精密度RSD均小于20％，表明本发明方法满足脂质组学分析要求。表2脂质标样的浓度梯度

表3 高覆盖脂质组学分析的方法验证

Claims (5)

1.一种基于液相色谱－质谱联用的高覆盖脂质组学分析方法，其特征在于：

①利用超高效液相色谱/组合型四级杆-轨道阱质谱的数据依赖采集模式自动采集由多种类型样品提取制作的单独或混合样本中所含脂质代谢物的二级质谱；②采用定性分析软件从二级质谱数据中提取所测得脂质的保留时间、母离子及其子离子信息；根据脂质质谱结构特征筛选母离子对应的特征子离子，构成特征离子对；将不同类型样本中得到的特征离子对信息加和；根据脂质数据库及脂质结构特征，对脂质离子对扩充，利用色谱保留规律对扩充的脂质离子对进行保留时间预测，并将其与实测样本中的离子对合并，得到总的脂质特征离子对库；③根据脂质特征离子对库的保留时间和特征离子对信息，对实际待测的所有生物样本的进行高覆盖脂质组学分析分析；首先利用构建的超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测模式方法在正、负离子模式下对单个样本或2个以上样本混合的质量控制样本(样本量大于1时)进行单针或多针采集，获得该样本中的有效脂质特征离子对，即与脂质离子对库比对中重合的离子对；④利用超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测在正、负离子模式下对单个待测生物样本仅对有效脂质特征离子进行扫描，获得相应的谱图，再通过定量分析软件进行峰面积积分，得到待测样品中脂质代谢物及其定量信息。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：单独或混合样本的制备及其所含脂质代谢物二级质谱的获取步骤如下，

1)选择不同类型的样品基质，包括但不限于人或动物的组织、细胞、血浆或血清、或植物的组织或细胞中的一种或多种；

对样本进行脂质提取，其提取体系可以是氯仿-甲醇-水体系或甲基叔丁基醚-甲醇-水体系，得到可供色谱/质谱分析的进样溶液(即脂质提取液冻干物的复溶液)；

提取剂中加入8个外源代谢物PC38:0，LPC19:0，TG45:0，PE34:0/PE30:0，FFA16:0-d3，FFA18:0-d3，Cer35:1，SM30:1作为内标，用于色谱保留时间校正；

单独或混合样本是指将各类型样品的进样溶液单独或等体积混合；

2)利用超高效液相色谱/组合型四级杆-轨道阱质谱的数据依赖采集模式自动采集合并各样本所含脂质代谢物的二级质谱。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：脂质特征离子对库的构建步骤如下，

1)利用定性软件，如Thermo Xcalibur Qual Browser和LipidSearch中一种或二种提取各样本所测得脂质代谢物的保留时间、校正保留时间、母离子、子离子信息；

2)根据脂质的质谱结构特征筛选母离子对应的特征子离子，进而构成特征离子对；

3)将各样本中得到的特征离子对加和，这里所称的加和是指在任一样本中出现一次的特征离子对都作为一个最终的特征离子对，而在多个样本中均出现的离子对仅作为一个特征离子对；

4)根据脂质数据库Lipid Maps及脂质质谱结构特征，扩充脂质特征离子对；这里的扩充是指在实际样本中检测出的脂质基础上，进一步增加每类脂质的数目，而不涉及脂质类别的增加；

5)基于实测脂质的保留时间及色谱保留规律，对扩充脂质离子对进行保留时间预测，将其与实测样本中的特征离子对合并，得到总的脂质特征离子对库；这里的色谱保留规律是指脂质的保留时间与碳数、保留时间与碳-碳双键数间的对应关系。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：高覆盖脂质组学分析方法建立步骤如下，

1)采用不同类别脂质标样混合物，优化每类脂质特征离子对的质谱去簇电压和碰撞能等质谱条件，作为该类脂质的最佳质谱条件；

2)将脂质特征离子对库中的母离子、子离子、保留时间及优化的去簇电压和碰撞能输入到超高效液相色谱/三重四级杆质谱工作站；

3)如果质谱同一时间，输入超高效液相色谱/三重四级杆质谱工作站的特征离子对数目大于200个，则增加超高效液相色谱/三重四级杆质谱采集针数；使得每个超高效液相色谱/三重四级杆质谱方法，均保证同一时间，采集的特征离子对不超过200个。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：实际待测生物样本的高覆盖脂质组学分析，具体步骤如下，

1)将建立的超高效液相色谱/三重四级杆质谱采集方法用于单个样本或质量控制样分析；每个方法均对质量控制样本重复3次分析，与脂质特征离子对库比对，离子对出现至少2次以上且校正保留时间与特征离子对库中的校正保留时间偏差≤0.5min,视为有效离子对；这里的质量控制样本是由2个以上待分析样品等体积混合制备而成；

2)实际样本采用与质量控制样本相同的超高效液相色谱/三重四级杆质谱联用方法，采用动态多反应监测模式，仅采集有效离子对，获得样品对应的谱图；再通过定量分析软件进行峰面积积分，得到待测样品的脂质代谢物及其定量信息。