CN111307987A - 一种用于脂质组分分析的发菜的预处理方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于脂质组分分析的发菜的预处理方法及应用，通过此方法对发菜样品进行预处理，能够对发菜进行脂质组学分析，对脂类物质结构进行鉴定。本发明的技术方案为：发菜在培养基中生长至稳定期，收集发菜细胞，将发菜细胞悬浮液离心，去上清液，沉淀用生理盐水涡旋清洗，再次离心去上清液，加去离子水直接离心，用移液枪小心吸出上清液，取沉淀，过液氮猝灭，使发菜细胞停止代谢，于冷冻干燥机中冻干24~36h，直至完全无水分状态后，用粉碎机粉碎2~3次，过筛，于‑20℃冰箱中备用。本发明预处理的优点是对培养液进行清洗，可以排除培养液干扰实验结果，且发菜粉碎可以提高接触面积，做到充分提取，使检测结果更准确。

Description

一种用于脂质组分分析的发菜的预处理方法及应用
技术领域
本发明属于脂质组分检测分析领域，具体涉及一种用于脂质组分分析的发菜的预处理方法及应用。
背景技术
发状念珠藻(Nostoc flagelliforme)，俗称发菜，是一种名贵的可食性陆生固氮蓝藻，主要分布于荒漠草原和贫瘠土壤地区，是一种生物固氮资源和拓荒植物，具有重要的资源价值和生态价值。作为一种特色植物资源，发菜在结构和生理上表现出强烈的耐盐碱、抗紫外线、耐高温等能力，常被称为拓荒固沙的“先锋植物”。但目前有关其耐受逆境胁迫能力的分子机制尚不清楚。因此，围绕发菜响应环境胁迫的逆境耐受机制开展系统研究不仅可为发菜对环境的适应和保护机制的研究奠定基础，而且对保护资源和生态环境具有重要意义。
发菜生长缓慢，据研究统计，发菜年增长率仅6％，样品获取困难。在对发菜中脂质进行提取的过程中，因发菜丝质量较小且脆度不高，不易磨碎，虽脂质含量较高，但不易提取。本方法中加入甲基叔丁基醚，涡旋时间为1h，用于解决该困难，将发菜中脂质尽可能多的提出。
发菜应对盐胁迫的机制之一就是脂质成分的调节。脂类是生物膜最重要的组成成分之一，在细胞膜的主要结构成分中发挥了重要作用，而细胞膜就是胁迫的第一受体。细胞膜会受到由于细胞新陈代谢而产生的活化氧的攻击，产生脂质过氧化物，作为胁迫信号参与细胞内的信号传导。脂质在维持发菜的生理活性及耐受性方面起了至关重要的作用。然而，目前关于发菜中脂质的系统研究较为缺乏，因此，有必要发展大规模、高灵敏、高特异的发菜脂类物质分析方法。
发明内容
本发明的目的是要提供一种用于脂质组分分析的发菜的预处理方法，通过此方法对发菜样品进行预处理，能够对发菜进行脂质组学分析，对脂类物质结构进行鉴定。
为了达到上述目的，本发明提供的一种用于脂质组分分析的发菜的预处理方法，依次包括以下步骤：
发菜在培养基中生长至稳定期，收集发菜细胞，将发菜细胞悬浮液于8000rpm条件下离心 8～12min，去上清液，沉淀用3ml生理盐水涡旋清洗2～5min，共清洗3次，再次离心去上清液，加1mL去离子水直接离心，用移液枪小心吸出上清液，取沉淀，过液氮猝灭，使发菜细胞停止代谢，于冷冻干燥机中冻干24～36h，直至完全无水分状态后，用粉碎机粉碎2～3次，过60目筛子，于-20℃冰箱中备用。
按上述预处理方法制得的发菜冻干粉在超高相液相色谱-四极杆和轨道肼高分辨质谱联用UHPLC-Q Exactive MS脂质组学分析的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种用于脂质组分分析的发菜的预处理方法，预处理优点是对培养液进行清洗，可以排除培养液干扰实验结果。发菜粉碎可以提高接触面积，做到充分提取，使检测结果更准确。
附图说明
图1发菜样品中脂类物质组分的正离子流图；
图2发菜样品中脂类物质组分的负离子流图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式包括但不限于以下实施例表示的范围。
本发明提供的一种用于脂质组分分析的发菜的预处理方法，依次包括以下步骤：
发菜在BG11培养基中生长至稳定期收集发菜细胞，方法为：将发菜悬浮液于8000rpm条件下离心8～12min，去上清液，沉淀用3ml生理盐水涡旋清洗2～5min，共清洗3次，再次离心去上清液，加1mL去离子水直接离心，用移液枪小心吸出上清液，取沉淀。过液氮猝灭，使发菜细胞停止代谢，于冷冻干燥机中冻干24～36h，直至完全无水分状态。因发菜质量较小呈丝状，直接进行提取难以提取充分，因此用粉碎机粉碎2～3次，过60目筛子，于- 20℃冰箱中备用。
对所制备得到的发菜冻干粉，进行脂质组分分析，具体分析步骤如下：
取发菜冻干粉50mg，加入300ul甲醇溶液，1ml甲基叔丁基醚溶液，涡旋1小时，加入300ul水，涡旋30s，高速离心后，取500ul混合液冻干；配置乙腈、异丙醇、水复合溶液 (乙腈：异丙醇：水＝65：30：5，体积比)，将上述冻干样品加入100ul溶液中，涡旋，离心，取上清液80ul到进样小瓶作为分析样品；
采用超高相液相色谱-四极杆和轨道肼高分辨质谱联用UHPLC-Q Exactive MS的发菜脂质组学分析方法，对步骤一得到的样品进行分析。
所述样品测试中的液相色谱条件为：
流动相
A相：乙腈：水＝6：4，含10mmol乙酸铵；
B相：异丙醇：乙腈＝90:10,含10mmol乙酸铵；
色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C8 column(2.1×100mm,1.7μm)柱；
色谱洗脱方式：梯度洗脱；
进样量：5ul；
进样室温度12℃；
流速：0.26ml/min；
柱温：55℃。
所述样品测试中的质谱条件为：
加热式电喷雾模式下，正、负离子模式下的电压分别为3.8KV和3.0KV，离子传输管的温度为320℃，鞘气和辅助气的流速分别为45和10(in arbitrary units),辅助气的加热器温度为 350℃，S-lens设置为50.0。质谱全扫模式(full scan MS mode)下，仪器分辨率设置为 120000，自动增益控制目标(AGC target)设置为1×106离子容量，最大注入时间(maximum IT) 设置为200ms。质谱全扫加二级质谱采集模式下(full scan MS/data-dependent MS/MS(ddMS2))，全扫质谱和二级质谱：分辨率分别为120000和30000，自动增益控制目标分别为1×106和1×105，最大注入时间分别设置为100ms和50ms。全扫扫描范围为m/z150-1600，选择每个全扫循环中响应最强的前10个母离子进行二级质谱的采集。
图1和图2为未添加盐胁迫时发菜在正、负离子质谱扫描模式下获得的总离子流图。
对上述获得的发菜数据进行脂质结构鉴定，将上述获得的发菜样品总离子流图的原始数据导入上述Thermo ScientificTMLipidSearchTM脂质定性软件，根据对发菜中的脂类物质进行结构鉴定，总共鉴定出10种脂类，共575个，包括甘油三酯90个、(溶血)磷脂酰甘油 56个、磷脂酰肌醇7个等，包括脂质名称、分类、加合物等信息汇总结果具体见表1。
表1：发菜脂质结构鉴定结果
Figure RE-GDA0002487960130000041
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (2)

1.一种用于脂质组分分析的发菜的预处理方法，其特征在于：
发菜在培养基中生长至稳定期，收集发菜细胞，将发菜细胞悬浮液于8000rpm条件下离心8~12min，去上清液，沉淀用3ml生理盐水涡旋清洗2~5min，共清洗3次，再次离心去上清液，加1mL去离子水直接离心，用移液枪小心吸出上清液，取沉淀，过液氮猝灭，使发菜细胞停止代谢，于冷冻干燥机中冻干24~36h，直至完全无水分状态后，用粉碎机粉碎2~3次，过60目筛子，于-20℃冰箱中备用。
2.如权利要求1所述预处理方法制得的发菜冻干粉在超高相液相色谱-四极杆和轨道肼高分辨质谱联用UHPLC-Q Exactive MS脂质组学分析的应用。
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