CN111060626B - 基于植物代谢组学的新疆一枝蒿植物产地/品种标志物及判别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于植物代谢组学的新疆一枝蒿植物产地/品种标志物及判别方法。本发明采集了阿勒泰富蕴地区的人工栽培品种和野生品种新疆一枝蒿植物,哈密地区的人工栽培品种和野生品种新疆一枝蒿植物,采用基于液相色谱‑质谱联用技术的植物代谢组学分析方法,检测不同来源样本的代谢组。通过分析有对照品的25个代谢物在不同组别样本中检测水平差异,建立一组新疆一枝蒿植物品种、产地评估标志物组,为不同品种/产地新疆一枝蒿质量标准建立提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于植物代谢组学的新疆一枝蒿植物产地/品种标志物及判别方法。
背景技术
新疆一枝蒿为菊科蒿属多年生草本植物岩蒿的全草,是传统维吾尔族用药。主要分布于我国新疆维吾尔族自治区的天山山脉及阿尔泰山脉附近,一般生长在海拔1600~3000m的亚高山草原、针叶林开阔地(方险峰.新疆一枝蒿药材的研究.新疆化工,2017,3-4:5-9.)。该植物具有抗炎、抗菌、抗过敏、抗病毒、保肝等药理活性,药用价值很高(刘勇民,沙吾提·伊克木.维吾尔药志(上).乌鲁木齐:新疆人民出版社,1986,7:1-3.)。由其为主要成分制成的“复方一枝蒿冲剂”、“一枝蒿口服液”等复方制剂和中药成品已经广泛应用于临床治疗(陶海英,孙玉华,胡正梅,刘发.复方一枝蒿颗粒的抗炎、抗菌作用和对免疫功能的影响.中药药理与临床,2007,23(2):64-66.)。由于新疆一枝蒿独特的生态特性,其药材资源全部依靠野生采挖,该植物自然繁殖极为困难。近年来,由于被大量开发利用、加上矿山开采、过度放牧等原因,药材资源已经匮乏,因而人工栽培品种的受到重视与关注,逐渐被临床应用。但是,不同产地来源的新疆一枝蒿,以及人工栽培品种与野生品种新疆一枝蒿之间所含物质是否一致尚未阐明。
前期,已有关于新疆一枝蒿研究的报道,基本集中于其化学成分研究(刘勇民,于德泉.新疆一枝蒿化学成分的研究.药学学报,1985,39(7):310-313.;宋卫霞,吉腾飞,司伊康,苏亚伦.新疆一枝蒿化学成分的研究.中国中药杂志,2006,39(21):1125-1127.;吉腾飞,杨建波,宋卫霞,王爱国,苏亚伦,袁玲.新疆一枝蒿化学成分研究Ⅱ.中国中药杂志,2007,32(12):1187-1189.;宿珍.新疆一枝蒿生物碱成分研究.中国科学院新疆理化技术研究所,2008.;Gu D,Yang Y,Abdulla R,et al.Characterization and identification ofchemical compositions in the extract of Artemisia rupestris L.by liquidchromatography coupled to quadrupole time-of-flight tandem massspectrometry.Rapid Communications in Mass Spectrometry Rcm,2012,26(1):83-100.;Chen Z,Wang S,Zeng K W,et al.Rupestonic acids B-G,NO inhibitorysesquiterpenoids from Artemisia rupestris..Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters,2014,24(17):4318.)、提取工艺研究(Su Z,Wu H K,He F,et al.NewGuaipyridine Sesquiterpene Alkaloids from Artemisia rupestris L.HelveticaChimica Acta,2010,93(1):33-38.;Fang M Z,Chao Q F,Lan Y,et al.Optimization ofFlavonoids Extraction from Artemisia rupestris L.by Response SurfaceMethodology.Food Science,2010,31(16):83-86.)、药理活性研究(李治建,古力娜,斯拉甫·艾白.中药药理与临床,2012,28(3):149-150;万英洁,夏建新,唐丽.新疆一枝蒿化学成分、药理作用及临床应用研究进展.中国中药杂志,2017,42(23):4565-4573.),大都采用传统天然产物分析方法,针对某几个或某一类代谢物开展。但是,生物体内源性代谢组十分复杂,包含初级代谢物和次级代谢产物,生长条件或者品种的改变均会对其产生影响,进而影响其药理活性。目前,从全局视角评价新疆一枝蒿物质基础的研究仍然较为缺乏。并且,已有的大多数研究采用的是自然干燥的植物样品,其中的化学成分在常温条件下长时间干燥的过程中已经产生了变化,不利于对其所含成分或者质量进行客观、真实的评价。
代谢组学是研究生物体系受外部刺激或扰动后所产生的内源性代谢物的整体及其变化规律的科学(Nicholson J K,Lindon J C,Holmes E.Xenobiotica,1999,29(11):1181-1189.)。在植物领域,代谢组学已经应用于探究高盐、高温、缺氧等条件对于其内源性代谢组的影响。采用代谢组学分析方法研究药用植物,首先要求采集新鲜植物且立即冷冻,尽可能地保证获得真实、可靠的整体代谢组;其次,与传统天然产物方法相比,植物代谢组学具有高通量、高灵敏度等优势,结合多变量统计分析,能够更加全面地评估药用植物质量。总而言之,代谢组学能够以全面视角评价药用植物体内的物质基础,有助于推进药用植物质量标准的建立。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于植物代谢组学的新疆一枝蒿植物产地/品种标志物及判别方法,本发明采用基于液相色谱-质谱联用技术的植物代谢组学分析方法,检测不同来源样本的代谢组,通过分析25个新疆一枝蒿植物中已知的代表性代谢物在不同组别样本中水平差异,建立一组新疆一枝蒿植物品种、产地评估标志物组,为不同品种/产地新疆一枝蒿质量标准的建立提供基础。
本发明首先提供了一种根据代谢物的丰度差异来判别新疆一枝蒿植物的产地的方法,同时适用于野生品种和人工栽培品种:
对采集自新疆的哈密地区和阿勒泰富蕴地区的新疆一枝蒿植物的样本A和样本B进行前处理,然后采用高效液相色谱-质谱联用法检测,得到黄芩苷、异鼠李素、花旗松素、生松素和蔓荆子黄素的色谱峰面积;若所述样本A中所述异鼠李素、所述花旗松素、所述生松素的响应值高于所述样本B中的响应值,所述样本A中所述黄芩苷和所述生松素的响应值低于所述样本B中的响应值,则所述样本A归属于新疆的哈密地区,所述样本B归属于新疆的阿勒泰富蕴地区。
进一步地,可根据判别模型进行判别:将采用高效液相色谱-质谱联用法检测得到的黄芩苷、异鼠李素、花旗松素、生松素和蔓荆子黄素的响应值分别代入模型(1)和模型(2)中,比较U(Y)1和U(Y)2的数值大小,若U(Y)1>U(Y)2,则判定所述样本来自于新疆的哈密地区,若U(Y)1<U(Y)2,则判定所述样本来自于新疆的阿勒泰富蕴地区;
U(Y)1=1.945E-7Y(黄芩苷)+1.137E-7Y(异鼠李素)+4.405E-6Y(花旗松素)+6.776E-6Y(生松素)+8.622E-9Y(蔓荆子黄素)-12.941(1)
U(Y)2=1.797E-6Y(黄芩苷)+5.845E-8Y(异鼠李素)-7.966E-7Y(花旗松素)+1.072E-5Y(生松素)-5.187E-9Y(蔓荆子黄素)-20.994(2)
模型中,Y(黄芩苷)、Y(异鼠李素)、Y(花旗松素)、Y(生松素)和Y(蔓荆子黄素)分别表示黄芩苷、异鼠李素、花旗松素、生松素和蔓荆子黄素的色谱峰面积。
当已知样品为人工栽培品种或野生品种时,可通过如下方法辅助判别新疆一枝蒿植物的产地:
1)对采集自新疆的哈密地区和阿勒泰富蕴地区的人工栽培新疆一枝蒿的样本C和样本D进行前处理,然后采用高效液相色谱-质谱联用法检测,得到咖啡酸、异鼠李素、芦丁、花旗松素、蔓荆子黄素、芹黄素、栎草亭-7-O-葡萄糖苷、一枝蒿酮酸、黄芩苷、生松素的色谱峰面积;若所述样本C中所述咖啡酸、所述异鼠李素、所述芦丁、所述花旗松素、所述蔓荆子黄素、所述芹黄素、所述栎草亭-7-O-葡萄糖苷和所述一枝蒿酮酸的响应值高于所述样本D中的响应值,所述黄芩苷和所述生松素的响应值低于所述样本D中的响应值,则辅助判别所述样本C来自于新疆的哈密地区,所述样本D来自于新疆的阿勒泰富蕴地区;
在哈密地区样本中具有更高丰度的代谢物,相比于阿勒泰富蕴地区,大都高出1~2倍;需要强调的是,来自哈密地区的茎样本中,芦丁的响应值比阿勒泰富蕴地区高出8.3倍;同时表明哈密地区采集的人工栽培品种新疆一枝蒿植物质量更优。
2)对采集自新疆的哈密地区和阿勒泰富蕴地区的人工栽培新疆一枝蒿的样本C和样本D进行前处理,然后采用高效液相色谱-质谱联用法检测,得到咖啡酸、绿原酸、黄芩苷、木犀草素、生松素、金丝桃苷、异鼠李素、花旗松素、金腰乙素、蔓荆子黄素和一枝蒿酮酸的色谱峰面积;若所述样本C中所述咖啡酸、所述绿原酸、所述黄芩苷、所述木犀草素、所述生松素和所述金丝桃苷的响应值高于所述样本D中的响应值,所述样本C中所述异鼠李素、所述花旗松素、所述金腰乙素、所述蔓荆子黄素和所述一枝蒿酮酸的响应值低于所述样本D中的响应值,则辅助判别所述样本C归属于新疆的阿勒泰富蕴地区,所述样本D归属于新疆的哈密地区;
与人工栽培品种的情况相反,在野生品种中,大部分标志物在阿勒泰富蕴地区样本中具有更高丰度。其中,差异倍数最大的是黄芩苷,其在花中差异倍数高达17倍;此外,金丝桃苷的差异倍数超过了5倍,表明阿勒泰富蕴地区采集的野生品种新疆一枝蒿植物质量更优。
本发明进一步提供了一种根据代谢物的丰度差异来判别新疆一枝蒿植物的品种的方法,同时适用于新疆的哈密地区和阿勒泰富蕴地区的新疆一枝蒿:
对采集自新疆的哈密地区和富蕴地区的新疆一枝蒿的样本E和样本F进行前处理,然后采用高效液相色谱-质谱联用法检测,得到咖啡酸、蒙花苷、芹黄素、金丝桃苷、黄杞苷和一枝蒿酮酸的色谱峰面积;若所述样本E中所述咖啡酸、所述蒙花苷和所述芹黄素的响应值高于所述样本F中的响应值,所述样本E中所述金丝桃苷、所述黄杞苷和所述一枝蒿酮酸的响应值低于所述样本F中的响应值,则所述样本E归属于野生品种,所述样本F归属于人工栽培品种。
进一步地,可根据判别模型进行判别:将采用高效液相色谱-质谱联用法检测得到的咖啡酸、蒙花苷、芹黄素、金丝桃苷、黄杞苷和一枝蒿酮酸的响应值分别代入模型(3)和模型(4)中,比较U(Y)3和U(Y)4的数值大小,若U(Y)3>U(Y)4,则判别所述样本为人工栽培品种,若U(Y)3<U(Y)4,则判别所述样本为野生品种;
U(Y)3=1.332E-8Y(咖啡酸)+2.086E-10Y(蒙花苷)-1.485E-8Y(金丝桃苷)-9.14E-7Y(芹黄素)+9.097E-8Y(黄杞苷)-3.434E-9Y(一枝蒿酮酸)-20.106(3)
U(Y)4=1.181E-7Y(咖啡酸)+9.107E-9Y(蒙花苷)-9.929E-9Y(金丝桃苷)+3.661E-7Y(芹黄素)+3.533E-8Y(黄杞苷)-7.743E-10Y(一枝蒿酮酸)-24.944(4)
模型中,Y(咖啡酸)、Y(蒙花苷)、Y(金丝桃苷)、Y(芹黄素)、Y(黄杞苷)和Y(一枝蒿酮酸)分别表示咖啡酸、蒙花苷、芹黄素、金丝桃苷、黄杞苷和一枝蒿酮酸的色谱峰面积。
当已知样品为新疆的哈密地区或阿勒泰富蕴地区时,可通过如下方法辅助判别新疆一枝蒿植物的品种:
a)对采集自新疆的哈密地区的新疆一枝蒿的样本G和样本H进行前处理,然后采用高效液相色谱-质谱联用法检测,得到咖啡酸、蒙花苷、黄杞苷、花旗松素、芦丁、木犀草素、金丝桃苷、芹黄素、栎草亭-7-O-葡萄糖苷和一枝蒿酮酸的色谱峰面积;若所述样本G中所述咖啡酸、所述蒙花苷、所述黄杞苷和所述花旗松素的响应值高于所述样本H中的响应值高于所述样本H中的响应值,所述样本G中所述芦丁、所述木犀草素、所述金丝桃苷、所述芹黄素、所述栎草亭-7-O-葡萄糖苷和所述一枝蒿酮酸的响应值低于所述样本H中的响应值,则辅助判别所述样本G为野生品种,所述样本H为人工栽培品种;
整体来看,在人工品种中丰度高的代谢物与野生品种中丰度高的代谢物数量基本相等,两个品种没有显著优劣之分。其中,蒙花苷、黄杞苷、花旗松素在野生品种中丰度显著高于人工栽培品种,木犀草素、金丝桃苷、一枝蒿酮酸在人工栽培品种中的丰度显著高于野生品种。
b)对采集自新疆的阿勒泰富蕴地区的新疆一枝蒿的样本I和样本J进行前处理,然后采用高效液相色谱-质谱联用法检测,得到咖啡酸、蒙花苷、黄芩苷、蔓荆子黄素、黄杞苷、绿原酸、木犀草素、芦丁、金丝桃苷、芹黄素和一枝蒿酮酸的色谱峰面积;若所述样本I中所述咖啡酸、所述蒙花苷、所述黄芩苷、所述蔓荆子黄素、所述黄杞苷、所述绿原酸、所述木犀草素和所述芦丁的响应值高于所述样本J中的响应值,所述样本I中所述金丝桃苷、所述芹黄素和所述一枝蒿酮酸的响应值低于所述样本J中的响应值,则辅助判别所述样本I为野生品种,所述样本J为人工栽培品种;
比较各代谢物的检出水平,多数在野生品种中丰度更高,尤其是蒙花苷、黄杞苷、芦丁。在人工栽培品种中,仅一枝蒿酮酸响应值明显高于野生品种。由该结果得出,阿勒泰富蕴地区的野生新疆一枝蒿植物质量明显优于人工栽培品种。
本发明方法涉及的样本取自新疆一枝蒿的花、茎和/或枝叶。
本发明方法中,所述前处理包括如下步骤:
1)将新疆一枝蒿样本制备成冻干粉末;
2)采用甲醇水溶液在高速分散条件下提取所述冻干粉末,离心后的上清液经浓缩得到浓缩物;
3)所述浓缩物复溶于乙腈水溶液中,离心后的上清液过滤膜。
本发明方法中,步骤1)中,制备所述冻干粉末的步骤如下:
在液氮中将所述新疆一枝蒿样本研磨成粉末,并置于冷冻干燥机中脱水;
步骤2)中,所述提取在冰浴条件下进行;
所述甲醇水溶液的用量为1mL所述甲醇水溶液:45~55mg所述冻干粉末,优选为1mL所述甲醇水溶液:50mg所述冻干粉末;
所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为3~5:1,优选为4:1;
所述提取的时间为3~5min,优选3min:提取条件如下:25000rpm下提取1min,3000rpm下提取1min,25000rpm下提取1min;
步骤3)中,所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为1:1;
所述滤膜为孔径为0.22μm的微孔滤膜。
本发明方法中,所述高效液相色谱-质谱联用法的条件如下:
液相色谱条件为:
色谱柱:Acquity UPLC HSS T3柱;
流动相:A相为甲酸水溶液,甲酸的体积含量为0.1%;B相为甲酸乙腈溶液,甲酸的体积含量为0.1%;
流速:0.3mL/min;
洗脱梯度的程序为:
0~20min,流动相B的体积分数为5%上升至50%;
20~27min,流动相B的体积分数由50%上升至98%;
27~30min,流动相B的体积分数保持为98%;
质谱条件为:
离子源:电喷雾源;
扫描模式:全扫描,扫描范围为m/z 100~1000;
喷雾电压:-3KV;
离子源温度:380℃。
本发明采集了阿勒泰富蕴地区的人工栽培品种和野生品种新疆一枝蒿植物,哈密地区的人工栽培品种和野生品种新疆一枝蒿植物,采用基于液相色谱-质谱联用技术的植物代谢组学分析方法,检测不同来源样本的代谢组。通过分析有对照品的25个代谢物在不同组别样本中检测水平差异,建立一组新疆一枝蒿植物品种、产地评估标志物组,为不同品种/产地新疆一枝蒿质量标准建立提供基础。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例采用的实验仪器如下:超高效液相色谱(Ultimate 3000,美国Thermo公司);Q-OT-qIT杂合型质谱仪(Orbitrap Fusion Lumos,美国Thermo公司);移液器(美国Thermo公司);冷冻干燥机与真空离心浓缩仪(德国Christ公司);离心机与混匀仪(德国Eppendorf公司);超声波清洗器(中国昆山市超声仪器有限公司);高速分散机(德国IKA公司);0.22μm滤膜(美国Agilent公司)。
下述实施例采用的实验试剂如下:对照品蔓荆子黄素、芦丁、一枝蒿酮酸、木犀草素、异槲皮素、洋艾素购置于宝鸡辰光生物公司;金腰乙素购置于成都克洛玛生物公司;蒙花苷、香草酸、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、绿原酸购置于中国食品药品检定研究院;花旗松素、山奈酚、生松素、芹黄素、异鼠李素、黄杞苷、黄芩苷、咖啡酸、丁香酸、金丝桃苷、金合欢素、山奈素、栎草亭-7-O-葡萄糖苷购置于成都康邦生物公司;石吊兰素购置于南京森倍加生物公司。乙腈、甲醇(德国Merck公司);甲酸(美国ROE公司);所有试剂均为色谱纯;实验用水为某品牌纯净水。
一、实验方法
1.1样品前处理
采集后立即置于干冰中暂存,并尽快转移至-80℃冰箱。取不同来源新疆一枝蒿植物的花、茎、枝叶样本各14份,使用研钵在液氮中研磨成粉末,并置于冷冻干燥机脱水48h。称取50mg冻干粉末于匀浆管中,冰浴条件下使用1mL甲醇-水(80:20,V/V)在高速分散器中提取3min(25000rpm,1min;3000rpm,1min;25000rpm,1min)。超声10min后在4℃,13500rpm条件下离心10min,上清液置于真空离心浓缩仪中浓缩3h。将浓缩物复溶于1mL乙腈-水(50:50,V/V),超声混匀后离心10min,使用0.22μm微孔滤膜过滤上清液,备检。
对照品用甲醇配成1mg/ml的储备溶液,置于4℃保存备用。
1.2液相色谱-质谱联用分析条件
超高效液相色谱为Ultimate 3000(美国Thermo公司),色谱柱为Acquity UPLCHSS T3柱(100mm×2.1mm,1.8μm,Waters公司)。水(含0.1%甲酸,A)和乙腈(含0.1%甲酸,B)为流动相;流速为0.3mL/min,进样量为5μL,柱温为40℃;洗脱梯度如下:0~20min,5%~50%B;20~27min,50%~98%B;27~30min,98%B;每次进样前用初始流动相平衡8min。
质谱仪为Q-OT-qIT杂合型质谱仪(Orbitrap Fusion Lumos,美国Thermo公司),配置离子源为电喷雾源(ESI)。采用负离子检测模式;扫描模式为全扫描;扫描范围:m/z 100~1000;分辨率:60000;喷雾电压:-3KV;鞘气:35psi;辅助气:15psi;离子源温度:380℃。
二、实验结果
2.1标准品保留时间测定
25个具有对照品的代表性已知代谢物包含20个黄酮类化合物、3个有机酸类、1个倍半萜类和1个绿原酸。将其储备液稀释后运用上述液相色谱条件进行UHPLC-(-)ESI-MS测定,结果如表1。
表1 25个标准品UHPLC-(-)ESI-MS测定。
2.2产地标志物筛选及其判别模型的建立
获得的UHPLC-(-)ESI-MS原始二维数据阵中,花、茎、枝叶样品中分别能够检测到18、16和11个已知代谢物。结合单变量统计分析、原始轮廓图和受试者操作曲线(ROC)分析,筛选阿勒泰富蕴地区和哈密地区生长的新疆一枝蒿植物中具有显著统计学差异,没有严重的组间ROC的曲线下面积(AUC)大于0.8的代谢物作为产地标志物。
人工栽培品种中差异代谢物在不同产地组检出的差异倍数及ROC分析情况如表2所示,共有10个产地标志物,花中检测出2个,茎中检测出6个,叶中检测出2个。整体来看,上述代谢物在哈密地区样本中具有更高的丰度,相比于阿勒泰富蕴地区,大都高出1~2倍。需要强调的是,来自哈密地区的茎样本中,芦丁的响应值比阿勒泰富蕴地区高出8.3倍;结果表明,本发明研究中的哈密地区采集的人工栽培品种新疆一枝蒿植物质量更优。
在野生品种中差异代谢物在不同产地组检出差异倍数及ROC分析情况如表2所示,共有11个产地标志物,花中检测出5个,茎中检测出4个,叶中检测出4个。与人工栽培品种的情况相反,在野生品种中,大部分标志物在阿勒泰富蕴地区样本中具有更高响应值。其中,差异倍数最大的是黄芩苷,其在花中差异倍数高达17倍;此外,金丝桃苷的差异倍数超过了5倍。相反地,金腰乙素、一枝蒿酮酸、花旗松素、蔓荆子黄素、异鼠李素在哈密地区的响应值高于阿勒泰富蕴地区。结果表明,本发明中的阿勒泰富蕴地区采集的野生品种新疆一枝蒿质量更优。
综合分析上述两部分数据,发现黄芩苷、异鼠李素、花旗松素、生松素、蔓荆子黄素为共有标志物并且在两个产地组的水平差异一致。详细地,异鼠李素、花旗松素和花旗松素无论在人工栽培品种还是野生品种中,哈密地区样品响应值均高于阿勒泰富蕴地区;黄芩苷和生松素无论在人工栽培品种还是野生品种中,阿勒泰富蕴地区样本响应值均高于哈密地区。当品种未知时,可以通过上述5个标志物进行药材产地鉴别。
进一步地,将上述5个代谢物数据导入SPSS,采用Bayes判别分析构建模型,所得线性判别函数如下所示。未知样本的数据代数上述两个函数式,若U1>U2,即为哈密地区,若U1<U2,即为阿勒泰富蕴地区。
U(Y)1=1.945E-7Y(黄芩苷)+1.137E-7Y(异鼠李素)+4.405E-6Y(花旗松素)+6.776E-6Y(生松素)+8.622E-9Y(蔓荆子黄素)-12.941
U(Y)2=1.797E-6Y(黄芩苷)+5.845E-8Y(异鼠李素)-7.966E-7Y(花旗松素)+1.072E-5Y(生松素)-5.187E-9Y(蔓荆子黄素)-20.994
表2新疆一枝蒿产地标志物。(a为哈密地区样本响应值较高,b为阿勒泰富蕴地区样本响应值较高)
2.3品种标志物筛选及其判别模型的建立
获得的UHPLC-(-)ESI-MS原始二维数据阵中,花、茎、枝叶样品中分别能够检测到18、16和11个已知代谢物。结合单变量统计分析、原始轮廓图和受试者操作曲线(ROC)分析,筛选人工栽培品种和野生品种新疆一枝蒿中具有显著统计学差异,没有严重的组间ROC的曲线下面积(AUC)大于0.8的代谢物作为品种标志物。
哈密地区来源样本的差异代谢物在不同品种组检出差异倍数及ROC分析情况如表3所示,共有10个品种标志物,花中检测出10个,茎中检测出3个,枝叶中检测出1个。整体来看,在人工栽培品种中丰度高的代谢物与野生品种中丰度高的代谢物数量基本相等,两个品种没有显著优劣之分。其中,蒙花苷、黄杞苷、花旗松素在野生品种中丰度显著高于人工栽培样本,木犀草素、金丝桃苷、一枝蒿酮酸在人工栽培品种中的丰度显著高于野生品种。
阿勒泰富蕴地区来源样本的差异代谢物在不同品种组检出水平及差异倍数情况如表3所示,共有11个品种标志物,花中检测出7个,茎中检测出5个,枝叶中检测出4个。比较各代谢物的检出水平,多数在野生品种中丰度更高,尤其是蒙花苷、黄杞苷、芦丁。在人工栽培品种中,仅一枝蒿酮酸响应值明显高于野生品种。由该结果得出,阿勒泰富蕴地区的野生新疆一枝蒿植物质量明显优于人工栽培品种。
综合分析上述两部分数据,发现咖啡酸、蒙花苷、金丝桃苷、芹黄素、黄杞苷、一枝蒿酮酸为共有标志物并且在两个品种组的含量差异一致。详细地,咖啡酸、蒙花苷、芹黄素无论在哈密地区还是阿勒泰富蕴地区新疆一枝蒿植物中,野生样本响应值均高于人工栽培品种;金丝桃苷、黄杞苷、一枝蒿酮酸无论在哈密地区还是阿勒泰富蕴地区新疆一枝蒿中,人工栽培品种响应值均高于野生品种。当产地未知时,可以通过上述5个标志物进行药材品种鉴别。
进一步地,将上述6个代谢物数据导入SPSS,采用Bayes判别分析构建模型,所得线性判别函数如下所示。未知样本的数据代数上述两个函数式,若U3>U4,即为人工栽培品种,若U3<U4,即为野生品种。
U(Y)3=1.332E-8Y(咖啡酸)+2.086E-10Y(蒙花苷)-1.485E-8Y(金丝桃苷)-9.14E-7Y(芹黄素)+9.097E-8Y(黄杞苷)-3.434E-9Y(一枝蒿酮酸)-20.106
U(Y)4=1.181E-7Y(咖啡酸)+9.107E-9Y(蒙花苷)-9.929E-9Y(金丝桃苷)+3.661E-7Y(芹黄素)+3.533E-8Y(黄杞苷)-7.743E-10Y(一枝蒿酮酸)-24.944
表3新疆一枝蒿品种标志物(c为人工栽培品种中响应值较高,d为野生品种中响应值较高)
综上所述,本发明采用基于LC-MS技术植物代谢组学分析方法,对采集自哈密地区、阿勒泰富蕴地区的人工栽培品种和野生品种新疆一枝蒿开展分析,旨在筛选新疆一枝蒿与产地、品种相关的标志物,为其质量标准的建立提供参考信息。选择25个新疆一枝蒿植物中已知的代表性成分,考察其在不同组别样本中的检测水平。为了避免该植物不同组织器官代谢组差异,本发明将该植物的花、茎、枝叶区分进行了分析,以获得可靠的标志物。结合统计分析、原始轮廓图和ROC分析,最终寻找到14个产地标志物和13个品种标志物。具体如下:
1)已知为人工栽培品种时,判别产地,采用咖啡酸、黄芩苷、异鼠李素、花旗松素、生松素、蔓荆子黄素、一枝蒿酮酸、芦丁、芹黄素、栎草亭-7-O-葡萄糖苷作为(质量评估)标志物;
2)已知为野生品种时,判别产地,采用咖啡酸、黄芩苷、异鼠李素、花旗松素、生松素、蔓荆子黄素、一枝蒿酮酸、绿原酸、木犀草素、金腰乙素、金丝桃苷作为(质量评估)标志物;
3)已知产地为哈密时,判别品种,采用咖啡酸、蒙花苷、金丝桃苷、芹黄素、黄杞苷、一枝蒿酮酸、芦丁、木犀草素、花旗松素、栎草亭-7-O-葡萄糖苷作为(质量评估)标志物;
4)已知产地为阿勒泰富蕴时,判别品种,采用咖啡酸、蒙花苷、金丝桃苷、芹黄素、黄杞苷、一枝蒿酮酸、芦丁、木犀草素、绿原酸、蔓荆子黄素作为(质量评估)标志物。
综合分析后,当品种未知时,采用黄芩苷、异鼠李素、花旗松素、生松素、蔓荆子黄素5个标志物构建的判别分析模型进行产地判别;当产地未知时,采用咖啡酸、蒙花苷、金丝桃苷、芹黄素、黄杞苷、一枝蒿酮酸6个标志物构建的判别分析模型进行品种判别。
Claims (3)
1.一种归属新疆一枝蒿植物产地的方法,包括如下步骤:
对采集自新疆的哈密地区和阿勒泰富蕴地区的新疆一枝蒿的样本A和样本B进行前处理,然后采用高效液相色谱-质谱联用法检测,得到黄芩苷、异鼠李素、花旗松素、生松素和蔓荆子黄素的色谱峰面积;若所述样本A中所述异鼠李素、所述花旗松素、所述蔓荆子黄素的响应值高于所述样本B中的响应值,所述样本A中所述黄芩苷和所述生松素的响应值低于所述样本B中的响应值,则所述样本A归属于新疆的哈密地区,所述样本B归属于新疆的阿勒泰富蕴地区;
所述样本A和所述样本B取自新疆一枝蒿的花、茎和/或枝叶;
所述前处理包括如下步骤:
1)将新疆一枝蒿样本制备成冻干粉末;
2)采用甲醇水溶液提取所述冻干粉末,离心后的上清液经浓缩得到浓缩物;
3)所述浓缩物复溶于乙腈水溶液中,离心后的上清液过滤膜;
步骤1)中,制备所述冻干粉末的步骤如下:
在液氮中将所述新疆一枝蒿样本研磨成粉末,并置于冷冻干燥机中脱水;
步骤2)中,所述提取在冰浴条件下进行;
所述甲醇水溶液的用量为1mL所述甲醇水溶液:45~55mg所述冻干粉末;
所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为3~5:1;
所述提取的时间为3~5min;
步骤3)中,所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为1:1;
所述滤膜为孔径为0.22μm的微孔滤膜;
所述高效液相色谱-质谱联用法的条件如下:
液相色谱条件为:
色谱柱:Acquity UPLC HSS T3柱;
流动相:A相为甲酸水溶液,甲酸的体积含量为0.1%;B相为甲酸乙腈溶液,甲酸的体积含量为0.1%;
流速:0.3mL/min;
洗脱梯度的程序为:
0~20min,流动相B的体积分数为5%上升至50%;
20~27min,流动相B的体积分数由50%上升至98%;
27~30min,流动相B的体积分数保持为98%;
质谱条件为:
离子源:电喷雾源;
扫描模式:全扫描,扫描范围为m/z 100~1000;
喷雾电压:-3KV;
离子源温度:380℃。
2.一种判别新疆一枝蒿植物产地的方法,包括如下步骤:
对采集自新疆的哈密地区和富蕴地区的新疆一枝蒿的样本进行前处理,然后采用高效液相色谱-质谱联用法检测,得到黄芩苷、异鼠李素、花旗松素、生松素和蔓荆子黄素的色谱峰面积,并分别代入模型(1)和模型(2)中,比较U(Y)1和U(Y)2的数值大小,若U(Y)1>U(Y)2,则判别所述样本来自于新疆的哈密地区,若U(Y)1<U(Y)2,则判别所述样本来自于新疆的阿勒泰富蕴地区;
U(Y)1=1.945E-7Y(黄芩苷)+1.137E-7Y(异鼠李素)+4.405E-6Y(花旗松素)+6.776E-6Y(生松素)+8.622E-9Y(蔓荆子黄素)-12.941 (1)
U(Y)2=1.797E-6Y(黄芩苷)+5.845E-8Y(异鼠李素)-7.966E-7Y(花旗松素)+1.072E-5Y(生松素)-5.187E-9Y(蔓荆子黄素)-20.994 (2)
模型中,Y(黄芩苷)、Y(异鼠李素)、Y(花旗松素)、Y(生松素)和Y(蔓荆子黄素)分别表示黄芩苷、异鼠李素、花旗松素、生松素和蔓荆子黄素的响应值;
所述样本取自新疆一枝蒿的花、茎和/或枝叶;
所述前处理包括如下步骤:
1)将新疆一枝蒿样本制备成冻干粉末;
2)采用甲醇水溶液提取所述冻干粉末,离心后的上清液经浓缩得到浓缩物;
3)所述浓缩物复溶于乙腈水溶液中,离心后的上清液过滤膜;
步骤1)中,制备所述冻干粉末的步骤如下:
在液氮中将所述新疆一枝蒿样本研磨成粉末,并置于冷冻干燥机中脱水;
步骤2)中,所述提取在冰浴条件下进行;
所述甲醇水溶液的用量为1mL所述甲醇水溶液:45~55mg所述冻干粉末;
所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为3~5:1;
所述提取的时间为3~5min;
步骤3)中,所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为1:1;
所述滤膜为孔径为0.22μm的微孔滤膜;
所述高效液相色谱-质谱联用法的条件如下:
液相色谱条件为:
色谱柱:Acquity UPLC HSS T3柱;
流动相:A相为甲酸水溶液,甲酸的体积含量为0.1%;B相为甲酸乙腈溶液,甲酸的体积含量为0.1%;
流速:0.3mL/min;
洗脱梯度的程序为:
0~20min,流动相B的体积分数为5%上升至50%;
20~27min,流动相B的体积分数由50%上升至98%;
27~30min,流动相B的体积分数保持为98%;
质谱条件为:
离子源:电喷雾源;
扫描模式:全扫描,扫描范围为m/z 100~1000;
喷雾电压:-3KV;
离子源温度:380℃。
3.一种辅助判别人工栽培或野生新疆一枝蒿植物产地的方法,包括如下1)或2)的步骤:
1)对采集自新疆的哈密地区和阿勒泰富蕴地区的人工栽培新疆一枝蒿的样本C和样本D进行前处理,然后采用高效液相色谱-质谱联用法检测,得到咖啡酸、异鼠李素、芦丁、花旗松素、蔓荆子黄素、芹黄素、栎草亭-7-O-葡萄糖苷、一枝蒿酮酸、黄芩苷、生松素的色谱峰面积;若所述样本C中所述咖啡酸、所述异鼠李素、所述芦丁、所述花旗松素、所述蔓荆子黄素、所述芹黄素、所述栎草亭-7-O-葡萄糖苷、所述一枝蒿酮酸的响应值高于所述样本D中的响应值,所述黄芩苷、所述生松素的响应值低于所述样本D中的响应值,则辅助判定所述样本C来自于新疆的哈密地区,所述样本D来自于新疆的阿勒泰富蕴地区;
2)对采集自新疆的哈密地区和阿勒泰富蕴地区的野生新疆一枝蒿的样本C和样本D进行前处理,然后采用高效液相色谱-质谱联用法检测,得到咖啡酸、绿原酸、黄芩苷、木犀草素、生松素、金丝桃苷、异鼠李素、花旗松素、金腰乙素、蔓荆子黄素和一枝蒿酮酸的色谱峰面积;若所述样本C中所述咖啡酸、所述绿原酸、所述黄芩苷、所述木犀草素、所述生松素和所述金丝桃苷的响应值高于所述样本D中的响应值,所述样本C中所述异鼠李素、所述花旗松素、所述金腰乙素、所述蔓荆子黄素和所述一枝蒿酮酸的响应值低于所述样本D中的响应值,则辅助判别所述样本C来自于新疆的阿勒泰富蕴地区,所述样本D来自于新疆的哈密地区;
所述样本C和所述样本D取自新疆一枝蒿的花、茎和/或枝叶;
所述前处理包括如下步骤:
1)将新疆一枝蒿样本制备成冻干粉末;
2)采用甲醇水溶液提取所述冻干粉末,离心后的上清液经浓缩得到浓缩物;
3)所述浓缩物复溶于乙腈水溶液中,离心后的上清液过滤膜;
步骤1)中,制备所述冻干粉末的步骤如下:
在液氮中将所述新疆一枝蒿样本研磨成粉末,并置于冷冻干燥机中脱水;
步骤2)中,所述提取在冰浴条件下进行;
所述甲醇水溶液的用量为1mL所述甲醇水溶液:45~55mg所述冻干粉末;
所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为3~5:1;
所述提取的时间为3~5min;
步骤3)中,所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为1:1;
所述滤膜为孔径为0.22μm的微孔滤膜;
所述高效液相色谱-质谱联用法的条件如下:
液相色谱条件为:
色谱柱:Acquity UPLC HSS T3柱;
流动相:A相为甲酸水溶液,甲酸的体积含量为0.1%;B相为甲酸乙腈溶液,甲酸的体积含量为0.1%;
流速:0.3mL/min;
洗脱梯度的程序为:
0~20min,流动相B的体积分数为5%上升至50%;
20~27min,流动相B的体积分数由50%上升至98%;
27~30min,流动相B的体积分数保持为98%;
质谱条件为:
离子源:电喷雾源;
扫描模式:全扫描,扫描范围为m/z 100~1000;
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