CN113984940A

CN113984940A - 一种高通量快速检测高山杜鹃花挥发性成分的分析方法

Info

Publication number: CN113984940A
Application number: CN202111253946.5A
Authority: CN
Inventors: 许塔艳; 李朝婵; 全文选; 钱沉鱼
Original assignee: Guizhou Education University
Current assignee: Guizhou Education University
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2022-01-28

Abstract

本发明提供了一种高通量快速检测高山杜鹃花挥发性成分的分析方法，并可应用于不同种类高山杜鹃挥发性成分的检测与香味特征分析。本方法采用直接顶空固相微萃取技术与全二维气相四级杆串联飞行时间高分辨质谱仪结合的测定方法，具有前处理简单、快速，色谱的分离度高、峰容量多，并同时采用标准谱库匹配、精确分子量、保留指数确保定性结果的可靠性，可用于高山杜鹃花129种挥发性成分的定性与半定量分析。该方法设计简单实用，无需复杂前处理，能对高山杜鹃花中上百种挥发性成分进行同时分析，经方法学验证，重复性较好，分析时间短，适合于不同种类高山杜鹃花样品的分析。

Description

一种高通量快速检测高山杜鹃花挥发性成分的分析方法

技术领域

本发明涉及高山杜鹃花分析化学技术领域，更具体地说，它涉及一种高通量快速检测高山杜鹃花挥发性成分的分析方法。

背景技术

杜鹃花属(Rhododendron L.)是世界著名的园林观赏植物，欣赏价值很高，经济价值也很不错。全世界有杜鹃花属植物960种左右，中国约570种(占世界种类的59％)，其中有400多种是中国特有种。杜鹃花是灌木中最大的一种，分布在北半球的大部分地区，具有种类繁多、树形美观、花叶形态多样、色彩艳丽多变、花期较长等特点，因而享有“花中西施”美誉，是具有极高观赏价值的野生种质资源，各种植物被广泛用作园林植物。常绿杜鹃亚属是杜鹃花属中的四大亚属之一。近年来，一些从欧洲引进的由常绿杜鹃亚属种质资源育成的杜鹃花即“西洋杜鹃”成为了中国年宵花和高档园林绿化的新秀。此外，该属中的许多物种已经在欧洲，中国和北美的传统医学中使用。这些应用基于具有多种生物学特性的大量植物化学物质，包括抗微生物，抗炎，抗糖尿病和抗氧化活性。

观赏植物花朵释放的挥发性成分是构成观赏植物品质的重要因素，这些挥发性成分是植物的次生代谢产物，通常由芳香族化合物、萜烯类化合物和脂肪酸衍生物等相对分子质量较低、易挥发的化合物构成，同时这些成分还有益于人类身体健康，可以缓解紧张情绪、提高人体抵抗力，保持植物周围空气的新鲜，抑制有害微生物生长。如萜类化合物广泛存在于自然界，是构成某些植物的香精、树脂、色素等的主要成分，是一类重要的天然香料。萜类化合物也具有一定的生理活性，可祛痰、止咳、袪风、发汗、驱虫、镇痛等。随着社会经济快速发展和人们生活水平的逐渐提高，国际国内市场对高山杜鹃的品质要求越来越高，除了对新颖花色的追求以外，芳香型高山杜鹃势必成为世界杜鹃花育种者追求的热点目标之一，而针对杜鹃花朵挥发性成分分析的检测技术显得尤为重要。

目前，检测杜鹃花挥发及半挥发性化学成主要依靠传统一维气相色谱及气质联用进行分析。国内有报道采用一维气相色谱分析了杜鹃花蕾与花的挥发性成分，或是对不同种类高山杜鹃林内气体成分的分离分析(李朝婵等，2015)，还有分析杜鹃挥发性化合物组成(史先慧等，2018)。国外有人采用一维气相色谱对大字杜鹃不同颜色花的挥发性化合物进行分析(Park et al.,2018)；以及土耳其原产杜鹃花种类的挥发性物质的表征(Sevimet al.,2018)；还有对白花杜鹃挥发油中的化合物的提取分析(Liu et al.,2013)。但是，这些方法由于分辨率不足、峰容量小、组分共洗脱严重等问题，会造成对化合物分离分析灵敏度的下降，对于准确检测高山杜鹃花的组成和含量具有一定的局限性，同时也需要较为复杂的提取、分离和净化前处理过程。因此，发明一种高通量快速检测高山杜鹃花挥发性成分的分析方法具有重要意义。

发明内容

为解决高山杜鹃花挥发性成分检测成分不全，前处理繁琐等问题，本发明提供一种高通量快速检测高山杜鹃花挥发性成分的分析方法，以期达到对不同种类高山杜鹃花进行精准的定性和定量分析。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种高通量快速检测高山杜鹃花挥发性成分的分析方法，包括以下步骤：

步骤一：将高山杜鹃花样品粉末置于顶空瓶内，并密封；

步骤二：对顶空瓶进行辅助加热；

步骤三：使用固相微萃取纤维头直接进行萃取；

步骤四：将萃取后的固相微萃取纤维头放置在气相色谱进样口进行解析；

步骤五：将解析后的挥发性成分利用全二维气相进行色谱分离；

步骤六：利用四级杆串联飞行时间高分辨质谱信息对目标化合物进行定性分析；

步骤七：选择峰体积百分比法对目标化合物进行定量分析。

作为一种优选方案，步骤一中高山杜鹃花样品粉末为50～200mg，顶空瓶采用15～40mL规格；步骤二中加热温度为40～80℃，加热时间为10～40min；步骤三种萃取时间为10～40min；步骤四中解析温度为250～270℃，解析时间为2～10min。

作为一种优选方案，高山杜鹃花样品为高山杜鹃花的花朵部位。

作为一种优选方案，高山杜鹃花样品的前处理方法具体包括以下步骤：将新鲜高山杜鹃花在-90℃～-70℃下真空冷冻干燥之后粉碎。

作为一种优选方案，步骤三中，固相微萃取条件为：平衡温度为60～80℃，平衡吸附时间为10～20min。

作为一种优选方案，步骤五过程中，全二维气相色谱条件为：柱1为HP-5MS(30m×0.25mm,0.25μm)；柱2为DB-17MS(1.2m×0.18mm,0.18μm)；进样口温度为240～280℃，样品加热升温过程为：50℃保持3min，然后以4℃/min的速率升至200℃并保持0.5min，最后以10℃/min升温至250℃；吹扫时间为3.5min；调制周期为4s。

作为一种优选方案，步骤六过程中，质谱条件为：离子源温度为250℃；四级杆温度为150℃；传输线温度为280℃。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

本发明采用顶空固相微萃取方法直接进样，并结合全二维气相色谱法与高分辨质谱法联用，与常规一维气相色谱法相比，具有前处理简单、色谱分离完全、峰容量大大提高，实现了快速高通量的高山杜鹃花挥发性成分检测。该方法特点在于可排除传统一维气相色谱中组分共流出现象，异构体分离更全面，从而改善化合物的分离程度，增加色谱峰容量，实现高通量目标物的分析。本发明仅取少量高山杜鹃花样品，并在适当温度下将高山杜鹃花的挥发性成分直接蒸发至密闭的顶空瓶内，用商品化固相微萃取纤维头直接吸附，其间无任何有机溶剂或高温高压处理，也无需耗费有机溶剂，这一过程既保证了高山杜鹃花样品挥发性成分的稳定性，最大程度地降低了易挥发挥发性成分的损失，能一次性分离鉴定高山杜鹃花中129种不同极性的挥发性化学成分。其次，利用高分辨质谱信息进行定性确认，包括标准谱库匹配、精确分子量、保留指数确保定性结果的可靠性，再通过面积百分比相对定量法计算高山杜鹃花中不同组成挥发性化学成分的含量。该方法通过验证后，各项分析参数均较为稳定，可一次性快速、准确地对不同高山杜鹃花品种中多种挥发性化学成分进行高通量检测，且样品用量少、操作方便、分析速度快。

附图说明

图1是高山杜鹃花挥发性成分的一维与二维色谱分离比较图；

图2是不同种类高山杜鹃花挥发性成分含量差异图。

具体实施方式

本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包括”为一开放式用语，故应解释成“包括但不限定于”。“大致”是指在可接受的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。

本说明书及权利要求的上下左右等方位名词，是结合附图以便于进一步说明，使得本申请更加方便理解，并不对本申请做出限定，在不同的场景中，上下、左右、里外均是相对而言。

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1：分析方法稳定性测定：

利用本发明快速检测高山杜鹃花挥发性化学成分分析方法稳定性测试步骤如下：

前处理方法：将新鲜高山杜鹃花在-80℃下真空冷冻干燥之后粉碎，称取50mg高山杜鹃花干燥粉末样品置于22mL顶空瓶中，用瓶盖将其密封，并将上述样品置于70℃辅助加热器中加热20min，用手动固相微萃取装置进行顶空固相微萃取。固相微萃取条件为：纤维头为商品化的DVB/CAR/PDMS；平衡温度为70℃；平衡吸附时间15min；解析温度260℃；解析时间3min。最后利用全二维气相色谱四级杆串接飞行时间高分辨质谱对样品定性、定量分析。

全二维气相色谱条件：柱1为HP-5MS(30m×0.25mm,0.25μm)；柱2为DB-17MS(1.2m×0.18mm,0.18μm)；进样口温度为260℃；进样模式为不分流；程序升温：50℃保持3min，然后以4℃/min的速率升至200℃并保持0.5min，最后以10℃/min上升至250℃；吹扫时间为3.5min；调制周期为4s。样品运行时间：60min，

质谱条件：离子源为EI,70eV；离子源温度为250℃；四级杆温度为150℃；传输线温度为280℃；扫描质量范围为50－450m/z；采集速度为快速；分辨率:20000FWHM。

将上述检测数据用Canvas全二维色谱处理软件进行分析，选择检测信噪比大于30的化合物进行检索，并用NIST17最新版标准谱库进行匹配，根据峰体积百分比法进行相对含量分析，对同一样品每日进行3次平行测定，连续测定3天，并计算日内及日间相对标准偏差，高山杜鹃挥发及半挥发性化学成分的检测结果及方法参数见表1。

表1 高山杜鹃花挥发性化学成分的检测结果

注：^aRT(min)—一维气相色谱检测到化合物保留时间；^b1tR(min)—柱1保留时间(min)；^c2tR(sec)—柱2保留时间(sec)；^dRI_exp—实验保留指数；^eRI_lib—谱库保留指数；^f峰匹配度—采用NIST17最新标准谱图进行匹配.^g正向—正相似度；^h反向—反相似度；ⁱ精确质量数—分子离子质量数；^j理论—理论质量值；^k实测—实验质量值；^lRSD.(％)—相对标准偏差；^m日内—日内相对标准偏差(n＝5)；ⁿ日间—日间相对标准偏差(d＝3日)。

由上述表1知，经过质谱信息以及标准谱库匹配，筛选正、反匹配度均大于800以上的物质为目标化合物，共鉴定了高山杜鹃花中129种挥发及半挥发性化学成分，其中有18种化合物正相似度不低于900，800到900之间的有80个化合物，而反相似度800到900之间的有81个化合物，900以上的达到41种化合物，说明了目标化合物定性相对可靠，正反匹配度低于800的化合物通过保留指数和精确分子量来进一步确认。保留指数(RI)用于筛选目标组分可以有效减少NIST库搜索产生的可能化合物的数量，据此，RI辅助定性了120个化合物，共占总化合物的95.23％。此外，从方法的稳定性和重现性来看，针对同一样品每天检测5次，连续测定3天，计算其相对标准偏差。结果表明，在日内及日间相对标准偏差平均值均低于25％，其中日内相对标准偏差低于10％的化合物有88种，日间相对标准偏差的平均值低于10％化合物有85种，高于20％的化合物仅有1种。因此，从日内及日间相对标准标准偏差来看，该方法的稳定性和重现性均表现较好。上述这些化合物可作为高山杜鹃花主要的挥发及半挥发性化学成分，可作为高山杜鹃花挥发性成分的主要辨别依据。

附图1为相同分析条件下一维气相色谱总离子色谱图与全二维气相色谱图的对比，相比一维气相色谱，高山杜鹃花中129种挥发及半挥发性化学成分在全二维上分离度均更好：如19.35min-20.00min在一维上仅检测到峰1(芳樟醇)和峰2(2-壬烯-1-醇)两个峰，而在二维上可多分离出另外三个峰，即峰3(芳樟醇氧化物)、峰4(对伞花烃)和峰5(苯甲酸，甲酯)，据此，可说明二维可很好地解决峰共流出的现象，且由于其强大的分离能力，能分离出一维所不能检测到的一些痕量化合物。因此在一维上仅检测到45种化合物，而在全二维上可检测到129种化合物，能更加全面的解析高山杜鹃花的挥发性成分。

实施例2：

为了进一步验证本方法的实用性，采用本发明的上述方法分别对不同种类高山杜鹃花的挥发性成分进行检测与分析，其中包括露珠杜鹃、马缨杜鹃、桃叶杜鹃、迷人杜鹃等4个样本，通过上述方法检测高山杜鹃花129种挥发性挥发性成分的含量见表2：

表2 不同种类高山杜鹃花挥发及半挥发性化学成分的检测结果

注：以上检测值均为三次测量平均值；a相对含量(％)—以面积归一化法计算不同种类高山杜鹃花挥发性成分含量。

上述样品均为高山杜鹃花的花部，所用样品是真空冷冻条件下干燥后粉碎的样品，最大限度保障了高山杜鹃花的挥发性成分。

由表2可知，对不同种类高山杜鹃花的主要挥发性化学成分含量进行分析结果表明，香茅醛(4.178％-7.944％)、苯乙醛(2.987％-7.013％)、己醛(2.227％-6.648％)、2-壬烯-1-醇(1.092％-5.633％)、芳樟醇(1.262％-4.752％)、柠檬烯(3.269％-4.136％)和异蒲勒醇(2.744％-3.328％)为四个种类的高山杜鹃花中的主要成分。此外，异胡薄荷醇在迷人杜鹃所有化合物中含量最高(7.722％)，在露珠杜鹃中也占有较高的含量(3.392％)，而在马缨杜鹃和桃叶杜鹃中未检测到这两种化合物的存在；而1,2,3-三甲氧基-5-甲基苯在露珠杜鹃中的含量(6.046％)也远远高于在其他三个种类。

附图2为主要化合物在四个不同种类高山杜鹃花中的比例情况。上述这些成分是四个不同种类高山杜鹃花中挥发性的主要化学成分，大多为芳香族化合物，而不同高山杜鹃花中特有的芳香族化合物能使其产生特殊香味。例如，醛类物质通常给人以愉悦的感官感受，参与形成特殊的挥发性风格，香茅醛和苯乙醛可能对马缨杜鹃和迷人杜鹃花的花香与甜挥发性味有较大贡献，丁香醛清香带甜，在露珠杜鹃中的含量显著高于其他三个种类，可能是露珠杜鹃中特有的挥发性成分，而己醛会让露珠杜鹃花散发的花香中带有芬芳持久的水果挥发性；醇类化合物通常会带有特殊的花香或果香，马缨杜鹃中较其他三个种类高山杜鹃含量更高的2-壬烯-1-醇会增添其香味中稍带甜瓜的甜香；此外，桃叶杜鹃和迷人杜鹃中的芳樟醇和柠檬烯能使其花香四溢着柑橘清香的水果挥发性，柔和且持久。其余化合物虽阈值相对较低，但都以一定的比例相协调而发挥各自的呈香作用，最终得以构成不同高山杜鹃花种类的特殊香型。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims

1.一种高通量快速检测高山杜鹃花挥发性成分的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：将高山杜鹃花样品粉末置于顶空瓶内，并密封；

步骤二：对顶空瓶进行辅助加热；

步骤三：使用固相微萃取纤维头直接进行萃取；

步骤七：选择峰体积百分比法对目标化合物进行定量分析。

2.根据权利要求1所述的高通量快速检测高山杜鹃花挥发性成分的分析方法，其特征在于，所述步骤一中高山杜鹃花样品粉末为50～200mg，顶空瓶采用15～40mL规格；步骤二中加热温度为40～80℃，加热时间为10～40min；步骤三种萃取时间为10～40min；步骤四中解析温度为250～270℃，解析时间为2～10min。

3.根据权利要求2所述的高通量快速检测高山杜鹃花挥发性成分的分析方法，其特征在于，所述高山杜鹃花样品为高山杜鹃花的花朵部位。

4.根据权利要求2或3所述的高通量快速检测高山杜鹃花挥发性成分的分析方法，其特征在于，所述高山杜鹃花样品的前处理方法具体包括以下步骤：将新鲜高山杜鹃花在-90℃～-70℃下真空冷冻干燥之后粉碎。

5.根据权利要求2所述的高通量快速检测高山杜鹃花挥发性成分的分析方法，其特征在于，所述步骤三中，固相微萃取条件为：平衡温度为60～80℃，平衡吸附时间为10～20min。

6.根据权利要求1所述的高通量快速检测高山杜鹃花挥发性成分的分析方法，其特征在于，所述步骤五过程中，全二维气相色谱条件为：柱1为HP-5MS(30m×0.25mm,0.25μm)；柱2为DB-17MS(1.2m×0.18mm,0.18μm)；进样口温度为240～280℃，样品加热升温过程为：50℃保持3min，然后以4℃/min的速率升至200℃并保持0.5min，最后以10℃/min升温至250℃；吹扫时间为3.5min；调制周期为4s。

7.根据权利要求1所述的高通量快速检测高山杜鹃花挥发性成分的分析方法，其特征在于，所述步骤六过程中，质谱条件为：离子源温度为250℃；四级杆温度为150℃；传输线温度为280℃。