CN113109486A - 一种基于gc-ims分析叶片鉴别核桃种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于气相色谱‑离子迁移谱分析叶片鉴别核桃种的方法，属于植物种鉴定技术领域。其中，所述方法包括以下步骤：获得待鉴别核桃的叶片样本，液氮处理后磨样；利用气相色谱‑离子迁移谱对叶片中的挥发性物质进行分析；根据获得的挥发性物质与参比种进行比对，从而获得待鉴别核桃种。利用本发明，通过气相色谱‑离子迁移谱分析核桃叶片中萜烯类、酯类、醛类、醇类和酮类等挥发性物质，为核桃叶片资源的开发利用提供一定的研究基础，并进一步对核桃种鉴别提供技术依据和支持。

Description

一种基于GC-IMS分析叶片鉴别核桃种的方法

技术领域

本发明属于植物品种鉴定技术领域，具体地，涉及一种基于气相色谱-离子迁移谱(GC-IMS)分析叶片鉴别核桃种的方法。

背景技术

核桃是我们日常食用的坚果之一，核桃属被子植物门双子叶植物纲胡桃科植物，乔木落叶果树，是世界四大干果(扁桃、核桃、开心果及榛子)之一。核桃在新疆的种植面积大，资源非常丰富，目前的研究多集中在品种选育和栽培管理等方面，药学研究则仅涉及根或果皮或叶的粗提物抗肿瘤活性研究。核桃的枝、叶、根皮、外果皮、坚果内隔及果仁可入药，疾病疗效很高。核桃叶含有很多种营养物质，如除含有维生素B、C、D、E及胡萝卜素外，还含有丰富的核桃醌、黄酮等生物活性物质，核桃叶提取物对油脂的氧化有一定的抑制作用。

核桃叶片取材容易，价格便宜，对环境无污染，目前对核桃叶挥发性有机物气味方面的研究还较少。传统对核桃叶的挥发性化合物的检测方法最常用的是气相色谱—质谱联(GC-MS)法，但其耗时、灵敏性低。气相色谱-离子迁移谱(GC-IMS)是一种用于分析样品中挥发性化合物的检测方法，GC-IMS首先利用气相色谱对样品进行预分离，然后通过IMS检测器进行挥发性组分的分析，该方法具有简单、快速、灵敏且对检测样品无损的优点，目前已成功应用于食品、生物和水产气味分析、品质检测等多个领域。

温185核桃、新新2核桃、纸皮核桃、美国红核桃、紫金核桃、山核桃、美国东部黑核桃、美国比尔黑核桃是核桃种，目前只有通过分子手段或树体、果实外观形态鉴别不同核桃种。现有技术还没有利用GC-IMS技术在核桃叶挥发性有机物成分的气味的研究。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，发明人以8个核桃的核桃叶片为实验材料，利用GC-IMS技术采集其气味指纹，采用主成分分析法分析不同种核桃叶片的挥发性物质气味指纹图谱差异，以可视化的形式展示不同品种核桃叶片的特征挥发性成分，旨在建立以核桃叶片的挥发性有机物成分鉴别核桃种的方法。为了达到该目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于气相色谱-离子迁移谱分析叶片鉴别核桃种的方法，包括以下步骤：

S1，获得待鉴别核桃的叶片样本，液氮处理后磨样；

S2，利用气相色谱-离子迁移谱对叶片中的挥发性物质进行分析；

S3，根据步骤S2获得的挥发性物质与参比品种进行比对，从而获得待鉴别核桃种。

在本发明的一些实施方案中，步骤S2中，取待鉴别核桃叶，放入顶空进样瓶中，40-50℃孵化，经顶空进样用气相色谱-离子迁移谱仪进行测定。

在本发明的一些实施方案中，进一步地，气相色谱-离子迁移谱仪的条件设定如下：

顶空进样条件：

顶空孵化温度：55-65℃；孵化时间：15-30min；加热方式：振荡加热；顶空进样针温度：80-90℃；进样量：1000μL，不分流模式；载气：氮气；清洗时间：0.4-0.6min，GC条件：

色谱柱温度：55-65℃；运行时间：45-60min；载气：氮气；流速：初始4.5-6.0mL/min，保持8-12min后在5min内线性增至120-180mL/min；漂移管长度：5cm；管内线性电压：400V/cm，

IMS条件：

漂移管温度：35-50℃；漂移气：氮气；流速：120-180mL/min；IMS探测器温度：40-60℃。

在本发明的一些具体实施方案中，气相色谱-离子迁移谱仪的条件设定如下：

顶空进样条件：

顶空孵化温度：60℃；孵化时间：20min；加热方式：振荡加热；顶空进样针温度：85℃；进样量：1000μL，不分流模式；载气：纯氮气(纯度>99.999％，推断和清洗进样针)；清洗时间：0.50min。

GC条件：

色谱柱温度：60℃；运行时间：50min；载气：高纯N₂；流速：初始5.0mL/min，保持10min后在5min内线性增至150mL/min。漂移管长度：5cm；管内线性电压：400V/cm。

IMS条件：

漂移管温度：40℃；漂移气(高纯N₂)；流速：150mL/min；IMS探测器温度：45℃。

在本发明的一些实施方案中，所述挥发性物质包括萜烯类、酯类、醛类、醇类和/或酮类。

在本发明的一些实施方案中，所述挥发性物质包括单体和/或二取体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述挥发性物质选自β-石竹烯、石竹烯二聚体、香叶醇、甲基麦芽酚、芳樟醇、壬醛、罗勒烯、罗勒烯二聚体、双戊烯、双戊烯二聚体、桉叶油醇、桉叶油醇二聚体、正己酸乙酯、正己酸乙酯二聚体、甲基庚烯酮、β-蒎烯、β-蒎烯二聚体、水芹烯、二甲基硫、α-蒎烯、α-蒎烯二聚体、乙酸戊酯、乙酸戊酯二聚体、苯甲醛、正己醇、正己醇二聚体、2-已烯醛、正己醛、正己醛二聚体、叶醇、反式-3-己烯-1-醇、庚醛、丁酸乙酯、异丁酸乙酯、异丁酸乙酯二聚体、丙酸乙酯、丙酸乙酯二聚体、2-甲基丁醛、异戊醛、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、异戊酸乙酯、2-甲基-1-丁醇、戊醇、丁酮、正丙醇、反式-2-戊烯醛、反式-2-戊烯醛二聚体、3-戊酮、3-戊酮二聚体、乙偶姻、异丁醛、3-甲基-1-戊醇、乙酸异戊酯、乙酸异戊酯二聚体、1-戊醇、1-戊醇二聚体、异丁醇、异丁醇二聚体和丁酸己酯中的至少一种。

在本发明的一些优选实施方案中，所述挥发性物质包括β-石竹烯、石竹烯二聚体、香叶醇、甲基麦芽酚、芳樟醇、壬醛、罗勒烯、罗勒烯二聚体、双戊烯、双戊烯二聚体、桉叶油醇、桉叶油醇二聚体、正己酸乙酯、正己酸乙酯二聚体、甲基庚烯酮、β-蒎烯、β-蒎烯二聚体、水芹烯、二甲基硫、α-蒎烯、α-蒎烯二聚体、乙酸戊酯、乙酸戊酯二聚体、苯甲醛、正己醇、正己醇二聚体、2-已烯醛、正己醛、正己醛二聚体、叶醇、反式-3-己烯-1-醇、庚醛、丁酸乙酯、异丁酸乙酯、异丁酸乙酯二聚体、丙酸乙酯、丙酸乙酯二聚体、2-甲基丁醛、异戊醛、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、异戊酸乙酯、2-甲基-1-丁醇、戊醇、丁酮、正丙醇、反式-2-戊烯醛、反式-2-戊烯醛二聚体、3-戊酮、3-戊酮二聚体、乙偶姻、异丁醛、3-甲基-1-戊醇、乙酸异戊酯、乙酸异戊酯二聚体、1-戊醇、1-戊醇二聚体、异丁醇、异丁醇二聚体和丁酸己酯。

在校本发明中，在步骤S2中，所述分析为定量分析。

在本发明的一些具体实施方案中，在步骤S3中，根据参比品种的挥发性物质含量和待鉴别品种的挥发性物质含量生成谱图，通过谱图的相似性获得待鉴别核桃种。

在本发明的又一些具体实施方案中，在步骤S3中，所述参比品种的挥发性物质含量和待鉴别品种的挥发性物质含量进行聚类分析，通过聚类分析的距离获得待鉴别核桃种。

在本发明中，所述参比品种可以包括目前已知的全部或者部分核桃品种。在本发明的一些实施方案中所述参比品种包括温185核桃、新新2核桃、纸皮核桃、美国红核桃、紫金核桃、山核桃、美国东部黑核桃、美国比尔黑核桃。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明对核桃叶片的挥发性有机物测定较为完整，检测了较多的挥发性物质，为核桃叶片资源的鉴别、开发利用提供一定的研究基础。

本发明利用气相色谱-离子迁移谱技术，在无需真空且无需样品前处理前提下，经顶空进样后可快速检测核桃叶片中的挥发性有机物，得到了核桃叶片挥发性有机物气味指纹图谱，为利用核桃叶片进行核桃种鉴别提供了技术依据和支持。

利用本发明的方法鉴别核桃种，方便快捷并且准确性高。

附图说明

图1示出了8个核桃叶中挥发性有机物的GC-IMS三维谱图。注：图中1、2、3、4、5、6、7和8代表核桃样品温185核桃、新新2核桃、纸皮核桃核桃、美国红核桃、紫金核桃、山核桃、美国东部黑核桃和美国比尔黑核桃。

图2示出了核桃叶片气相离子迁移谱。

图3示出了核桃叶片的GC-IMS差图谱。

图4示出了8个核桃叶中挥发性有机物的Gallery Plot图(指纹图谱)。

图5示出了8个核桃叶样品的的PCA(主成分分析)图。

图6示出了8个核桃叶样品的指纹图谱相似度分析。

具体实施方式

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。

术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中未作具体说明的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例

1材料

实验样品的采集于温宿县佳木镇新疆佳木果树学国家长期科研基地，采摘时间2020年7月1日，收集8种核桃树上的叶片为实验材料，具体品种见表1，每种核桃树分4个方位进行收集，采摘相同部位且采摘的叶片完整，叶片采摘均为成龄叶片，每个采样点随机取叶片数为20片,每品种采样数共计80片，样品采摘成熟度相似。将收集到的叶片进行简单的筛选，去除泥土及其它杂质。按照样本编号进行称重，后分别按照样本品号进行标注，立即液氮处理后磨样。

表1核桃叶片样品

2 GC-IMS测定条件

2.1顶空进样条件

顶空孵化温度：60℃；孵化时间：20min；加热方式：振荡加热；顶空进样针温度：85℃；进样量：1000μL，不分流模式；载气：纯氮气(纯度>99.999％，推断和清洗进样针)；清洗时间：0.50min。

2.2 GC条件

色谱柱温度：60℃；运行时间：50min；载气：高纯N₂；流速：初始5.0mL/min，保持10min后在5min内线性增至150mL/min。漂移管长度：5cm；管内线性电压：400V/cm。

2.3 IMS条件

漂移管温度：40℃；漂移气(高纯N₂)；流速：150mL/min；IMS探测器温度：45℃。

每个品种取20片核桃叶，取5.0g样品，放入20.0mL顶空进样瓶中45℃孵化15.0min，经顶空进样用

风味分析仪进行测试，每个品种做3个平行样品，经分析可给出样品中挥发性有机物的差异谱图；软件内置的NIST数据库和IMS数据库可对物质进行定性分析。

3结果与分析

使用仪器配套的分析软件VOCal，用于查看分析谱图和数据的定性定量，应用软件内置的NIST数据库和IMS数据库可对物质进行定性分析。

3.1不同品种核桃叶片挥发性物质差异对比

采用GC-IMS仪器LAV分析软件中的Reporter插件程序生成的不同核桃叶片样品挥发性成分三维对比图如图1所示，二维谱图如图2所示。图1和图2中整个图背景为蓝色，纵坐标代表气相色谱的保留时间(Retention time，Rt)，横坐标代表离子迁移时间(Drifttime，Dt)，横坐标1处竖线为RIP峰(反应离子峰，经归一化处理)，RIP峰两侧的每一个点代表一种挥发性有机物。以点的颜色和面积表示挥发性成分量大小，点的颜色越深、面积越大表示该物质含量越高，白色表示浓度较低，红色(附图显示峰较多的深灰色)表示浓度较高，颜色越深表示浓度越大。从图中可以直观比较不同核桃叶片的挥发性成分差异。二维GC-IMS谱图更加直观、易于阅读，可以准确地提供一幅关于芳香化合物信息特征和强度的全面图像，对深入的统计分析非常有用。

由图2可知，8个核桃叶片样品挥发性成分可以通过GC-IMS技术得到较好的分离检测，8种核桃叶片的挥发性有机物种类差异很大，其含量在8种核桃叶片中含量也存在较大差异，如图2中两种美国黑核桃叶中的挥发性有机物比较相似，上部框线的红色区域(图中为灰色)内挥发性物质在温185、新新2和纸皮核桃中含量较多，而在美国东部黑核桃和美国比尔黑核桃中含量相对少；下部框线区域内的挥发性物质在美国东部黑核桃和美国比尔黑核桃含量相对较高，而在温185核桃、新新2核桃、纸皮核桃核桃、美国红核桃、紫金核桃和山核桃中含量很低。

为了更加明显地观察这种差异，发明人采用了差异对比模式：选取其中一个样品的谱图(温185和美国东部黑核桃)作为参比，其他样品的谱图扣减参比。如果二者挥发性有机物一致，则扣减后的背景为白色，而红色(图中为浅灰色)代表该物质的浓度高于参比，蓝色(图中为深灰色)代表该物质的浓度低于参比。如图3所示差异图中更容易看出不同核桃叶片中挥发性有机物的差异，其中温185核桃、新新2核桃、纸皮核桃核桃中的挥发性有机物较为相似，而美国东部黑核桃和美国比尔黑核桃中的挥发性有机物比较相似。

3.2不同品种核桃叶片挥发性物质气味指纹图谱

发明人进一步运用Gallery Plot插件指纹图谱对比，直观且定量地比较不同样品之间的挥发性有机物差异。

不同核桃叶片的VOCs指纹图谱如图4所示，图中每一行代表一个核桃叶片样品中选取的全部信号峰，每一列代表同一挥发性有机物在不同核桃叶片样品中的信号峰，从图中可以看出每种样品的完整挥发性有机物信息以及样品之间挥发性有机物的差异，物质名称后面括号中的M、D和P分别代表单体、二聚体和多聚体。

将8种采集的挥发性有机物指纹图谱大致划分成3个不同颜色区域，采摘不同品种核桃叶中的挥发性有机物差异很大，3所示的横线下的物质在一种核桃叶中的含量远高于其他核桃叶，如甲硫醚和β-石竹烯等在温185中的含量远高于其他核桃叶；乙酸异戊酯等在新新2中的含量远高于其他核桃叶；乙偶姻等在美国红核桃叶中的含量远高于其他核桃叶；丙醇在山核桃叶中的含量远高于其他核桃叶；庚醛在美国东部黑核桃叶中的含量远高于其他核桃叶。

图4中，1所示的横线下的物质在温185核桃、新新2核桃、纸皮核桃核桃中的含量远高于美国红核桃、紫金核桃、山核桃、美国东部黑核桃和美国比尔黑核桃，包括芳樟醇、麦芽酚、3-甲基-1-戊醇、异丁醛和3-甲基丁醛等。芳樟醇是具有铃兰特征的花香气味，是香料香精的重要原料，此外还能使人镇静、放松，另外在香水、化妆品等方面应用广泛。麦芽酚广泛用于饮料、酒类、香烟、化妆品等方面。

图4中，2所示的横线下的物质在两种美国黑核桃叶中的含量远高于温185核桃、新新2核桃、纸皮核桃核桃、美国红核桃、紫金核桃和山核桃，包括丙酸乙酯和异丁酸乙酯等。丙酸乙酯具有果香特征的气味。

图4中，3所示的横线下的物质在4-6种核桃叶中的含量远高于其他核桃叶，如顺-3-己烯-1-醇、反-3-己烯-1-醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、反-2-己烯醛和反-2-戊烯醛在温185核桃、新新2核桃、纸皮核桃核桃叶以及美国红核桃叶中的含量远高于紫金核桃、山核桃和美国东部黑核桃和美国比尔黑核桃叶；其中顺-3-己烯-1-醇和反-2-己烯醛与猕猴桃汁基于电子鼻和GC-MS的酶解下香气成分中的挥发性有机物相一致。罗勒烯、α-蒎烯、柠檬烯、β-蒎烯等萜烯类物质和2-甲基丁醛、己醛的含量在温185核桃、新新2核桃、纸皮核桃核桃叶以及美国红核桃叶、紫金核桃叶中的含量较高，而在两种美国黑核桃叶以及山核桃叶中的含量较低。有机物蒎烯和罗勒烯对星天牛雄成虫产生较强的引诱作用。而3-戊酮和1,8-桉树脑在两种美国黑核桃叶中的含量远低于温185核桃、新新2核桃、纸皮核桃核桃、美国红核桃、紫金核桃和山核桃。

图4中其他挥发性有机物同样在8种核桃叶中具有不同的含量。

此外，从图3中可知，通过GC-IMS技术可很好区分8个不同品种核桃叶片，且可直观看出8个不同产地品种核桃叶片VOCs差异，根据挥发性物质气相色谱保留时间和离子迁移时间对其进行定性分析。经GC-IMS分析，共计检测出61种挥发性物质，通过内置的NIST2014气相保留指数数据库与G.A.S的IMS迁移时间数据库进行二维定性，确定了61种具体挥发性物质，如表2所示。

表2 8种核桃叶片的挥发性化合物的定性分析

根据表2可知，同一种挥发性有机物的含量在不同核桃叶片样品中存在显著差异。结合图4和表2分析可以得出8种核桃叶片样品共检测出挥发性物质61种，主要包括萜烯类7种、酯类9种、醛类8种、醇类12种和酮类4种等，包括单体和部分物质的二聚体。其中鉴定的单体、二聚体的化学式和CAS号相同，仅形态不同，结果如表2，图4与表2中挥发性有机物质相互对应。

由此，也可以看出，通过分析核桃叶片中挥发性物质的含量，可以用来鉴别或鉴定核桃品种。

3.3不同品种核桃叶片相似度分析

发明人进一步运用Dynamic PCA插件进行动态主成分分析，用于将样品聚类分析，以及快速确定未知样品挥发物质的种类。

8个品种核桃叶片样品的PCA分析图如图5所示，该图可以直观显示不同样品间的差异，样品之间距离近则代表差异小，距离远则代表差异明显。图5可以看出，8种核桃叶样品各自聚为一类，可以很好地在PCA图上分开；两种美国黑核桃叶中的挥发性有机物很相似，二者距离很近(美国东部黑核桃和美国比尔黑核桃)；代表三种新疆早实性核桃叶片(温185、新新2和纸皮核桃)的点相对比较接近，说明他们中的挥发性有机物较为相似；而温185、新新2和纸皮核桃叶中的挥发性有机物与美国东部黑核桃、美国比尔黑核桃叶及山核桃叶相差最大。

8个品种核桃叶的指纹图谱相似度分析结果如图6所示，同样是样品之间距离近则代表差异小，距离远则代表差异明显。图6同样可以看出，两种美国黑核桃叶中的挥发性有机物很相似，二者距离很近(美国东部黑核桃和美国比尔黑核桃)，主成分分析的结果和指纹图谱的分析结果相一致。可见不同属之间如新疆早实性核桃叶片(温185核桃、新新2核桃、纸皮核桃核桃)和美国黑核桃叶片同山核桃种挥发性有机物存在较大差异。

综上所述，本发明利用气相色谱-离子迁移谱技术，得到了8个不同核桃品种叶片挥发性有机物气味指纹图谱，在无需真空且无需样品前处理前提下，经顶空进样后可快速检测核桃叶片中的挥发性有机物。从获得的核桃叶片挥发性有机物气味指纹图谱可见，8种核桃叶片共检测鉴定出61种挥发性物质，包括一些物质的二聚体。8种核桃叶片样本的挥发性有机物都含有萜烯类、酯类、醛类、醇类和少量酮类。而8种核桃叶片中的大多数挥发性有机物组分相同，但含量存在较大差异；少部分物质在同一种或者同一属中含量远高于其他叶片，两种美国黑核桃叶中的挥发性有机物比较相似，温185、新新2和纸皮核桃叶以及美国红核桃叶、紫金核桃叶中的萜烯含量远高于山核桃叶和两种美国黑核桃叶，包括芳樟醇、麦芽酚、3-甲基-1-戊醇、异丁醛和3-甲基丁醛等；另一部分物质在两种美国黑核桃叶中的含量远高于其他核桃叶，包括丙酸乙酯和异丁酸乙酯等，这些挥发性有机物含量差异致使不同品种及不同属之间的核桃叶片的气味不同。核桃叶片因气味组分及含量多少而表现出不同气味，可根据具体气味成分差异将其进行区别。

由此可见，气相色谱-质谱联用技术可作为鉴别样品中萜烯类、酯类、醛类、醇类和酮类等挥发性气味化合物的有效工具。通GC-IMS能快速准确对不同品种核桃样品进行定性分析，阐明核桃叶片指纹图谱的挥发性有机物气味的物质差异，为核桃叶片资源的开发利用提供一定的研究基础。

此外，本发明对核桃叶片的挥发性有机物测定较为完整，检测了较多的挥发性物质。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种基于气相色谱-离子迁移谱分析叶片鉴别核桃种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，获得待鉴别核桃的叶片样本，液氮处理后磨样；

S2，利用气相色谱-离子迁移谱对叶片中的挥发性物质进行分析；

S3，根据步骤S2获得的挥发性物质与参比品种进行比对，从而获得待鉴别核桃种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，取待鉴别核桃叶，放入顶空进样瓶中，40-50℃孵化，经顶空进样用气相色谱-离子迁移谱仪进行测定。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，气相色谱-离子迁移谱仪的条件设定如下：

顶空进样条件：

顶空孵化温度：55-65℃；孵化时间：15-30min；加热方式：振荡加热；顶空进样针温度：80-90℃；进样量：1000μL，不分流模式；载气：氮气；清洗时间：0.4-0.6min，

GC条件：

色谱柱温度：55-65℃；运行时间：45-60min；载气：氮气；流速：初始4.5-6.0mL/min，保持8-12min后在5min内线性增至120-180mL/min；漂移管长度：5cm；管内线性电压：400V/cm，

IMS条件：

漂移管温度：35-50℃；漂移气：氮气；流速：120-180mL/min；IMS探测器温度：40-60℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述挥发性物质包括萜烯类、酯类、醛类、醇类和/或酮类。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述挥发性物质包括单体和/或二取体。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述挥发性物质选自β-石竹烯、石竹烯二聚体、香叶醇、甲基麦芽酚、芳樟醇、壬醛、罗勒烯、罗勒烯二聚体、双戊烯、双戊烯二聚体、桉叶油醇、桉叶油醇二聚体、正己酸乙酯、正己酸乙酯二聚体、甲基庚烯酮、β-蒎烯、β-蒎烯二聚体、水芹烯、二甲基硫、α-蒎烯、α-蒎烯二聚体、乙酸戊酯、乙酸戊酯二聚体、苯甲醛、正己醇、正己醇二聚体、2-已烯醛、正己醛、正己醛二聚体、叶醇、反式-3-己烯-1-醇、庚醛、丁酸乙酯、异丁酸乙酯、异丁酸乙酯二聚体、丙酸乙酯、丙酸乙酯二聚体、2-甲基丁醛、异戊醛、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、异戊酸乙酯、2-甲基-1-丁醇、戊醇、丁酮、正丙醇、反式-2-戊烯醛、反式-2-戊烯醛二聚体、3-戊酮、3-戊酮二聚体、乙偶姻、异丁醛、3-甲基-1-戊醇、乙酸异戊酯、乙酸异戊酯二聚体、1-戊醇、1-戊醇二聚体、异丁醇、异丁醇二聚体和丁酸己酯中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述分析为定量分析。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，根据参比品种的挥发性物质含量和待鉴别品种的挥发性物质含量生成谱图，通过谱图的相似性获得待鉴别核桃种。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述参比品种的挥发性物质含量和待鉴别品种的挥发性物质含量进行聚类分析，通过聚类分析的距离获得待鉴别核桃种。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述参比品种包括温185核桃、新新2核桃、纸皮核桃、美国红核桃、紫金核桃、山核桃、美国东部黑核桃、美国比尔黑核桃。

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