CN116879436A - 一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，通过利用气相‑离子迁移谱对海洋动物源壳聚糖样品、海洋动物甲壳样品、非海洋动物源壳聚糖样品的挥发性有机成分做定性分析，建立海洋动物源壳聚糖样品、海洋动物甲壳样品和非海洋动物源壳聚糖样品气味组分的指纹谱图；对比指纹谱图，结合差谱分析，确定海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质和非海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质；将确定的海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质和非海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质的相对离子峰强度检测数据组成矩阵进行主成分分析进行海洋动物源壳聚糖鉴别。本发明为壳聚糖相关行业提供可靠的海洋动物源壳聚糖鉴别方法，为相关产品的监管提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及壳聚糖种类鉴别分析技术领域，具体涉及一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法。
背景技术
壳聚糖是甲壳素的部分脱乙酰产物，又称脱乙酰甲壳素，广泛存在于虾蟹壳、昆虫外骨骼、真菌细胞壁中，是自然界唯一大量存在的碱性多糖，化学名称为β-1,4-聚-葡萄糖胺。壳聚糖具有阳离子聚电解质性和多功能基团反应性，易于化学修饰，安全无毒，具有生物相容性和生物降解性，在工业、医学、生物学、食品等领域得到了深入的研究和广泛的应用。随着人们对壳聚糖及其衍生物应用研究的逐渐深入，壳聚糖及其制品的需求大幅度增长。壳聚糖作为一种天然多糖，具有无毒无刺激，组织相容性好，具有良好的生物可降解性，能被生物酶缓慢催化水解为低聚糖等优点，被广泛地应用于各行各业当中，特别是在医药、化妆品、食品等与人体接触或作用于人体的应用领域具有极高的应用价值，例如以壳聚糖及其衍生物为材料制备的手术缝合线具有可降解、促愈合、不易留疤的特点，制备的医用敷料具有促进创面愈合、止痛和抗感染的作用，化妆品专用壳聚糖具有良好的吸湿、保湿、调理、抑菌等功能等。
市售壳聚糖绝大多数是由海洋动物甲壳如蟹壳、蟹壳加工后获得的甲壳素再经强碱热解法脱乙酰制备，工艺成熟，产量巨大且成本低。另一部分市售壳聚糖的生产方法是以真菌为原料，通过一定的工艺处理，获得壳聚糖。壳聚糖是许多真菌细胞壁的主要组成部分，与传统强碱处理的海洋动物源的壳聚糖相比，真菌来源的壳聚糖原料易得，生产过程污染少，所得产品理化性质均一，优势明显。作为非动物源性材料，真菌源壳聚糖及其衍生物产品能够有效避免来自虾蟹等海洋动物过敏源的引入或者病毒的传播，在安全性方面会更加友好。但目前为止，真菌源壳聚糖的研究仍处于研究阶段，并没有得到产业化水平，且真菌源壳聚糖的产率很低，工艺尚不成熟，价格较高，货源稀少。
动物源原料及产品，在应用和产品控制上会有更加严格的监管。例如，在医疗器械监管领域，国家药品监督管理局发布的《动物源性医疗器械注册技术审查指导原则》中规定，动物组织及其衍生物应用到人体会增加病毒传播和免疫原性等方面的安全风险，且存在材料表征上的困难，因此对于动物源性医疗器械安全性的评价，需要考虑比常规医疗器械更多方面的内容，如要比非动物源的医疗器械多提供的动物种属产品来源、原材料加工工艺、病毒灭活研究报告等资料。该指导原则中明确了动物源壳聚糖属于动物组织衍生物，其在医疗器械中的应用要参照执行该指导原则中的有关要求。对于市场上出现的宣称来源于真菌细胞壁的壳聚糖，因尚且不受动物源产品监管法规的限制，可以免于动物源产品的特定研究，产品上市速度相对较快，且因为目前市场上的真菌壳聚糖及产品稀少，价格昂贵，利润空间大，容易出现不良商家以价格便宜的海洋动物源壳聚糖代替真菌源壳聚糖或者掺假的现象，这不仅会扰乱市场秩序，还会给消费者带来健康风险。目前，用于壳聚糖鉴别的方法主要是傅里叶变换红外光谱(FT-IR)，按照《中华人民共和国药典》(2015年版)四部，通则0402，红外分光光度法规定的方法测定，应符合6.2规定。但是该方法仅用于壳聚糖或壳聚糖盐的检测，无法区分壳聚糖是否为海洋生物源壳聚糖。因此，探究能够鉴别壳聚糖来源的检测判别方法，对于保障消费者健康和权益、规范市场秩序、推进立法管理等都具有重要的现实意义。
气相色谱-离子迁移谱(GC-IMS)将气相色谱的高效分离优势与离子迁移谱的痕量快速分析优势相结合，经过二次分离后得到关于气相色谱保留时间、离子迁移时间和信号强度的三维谱图。GC-IMS目前已被研究学者用于食品、药物、医疗等多领域的气味分析中，通过检测样品顶空气体中的挥发性有机物(VOCs)成分来对样品进行溯源、分类、鉴别或状态分析等。虾蟹作为典型的海洋动物，具有海洋动物所特有的海鲜腥味。虾蟹壳经过一定工艺处理后得到甲壳素，甲壳素再经特定工艺处理后得到壳聚糖，预期由虾蟹壳生产的壳聚糖会残留来自海洋生物的气味成分。
发明内容
基于上述背景技术，本发明提供了一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，借助GC-IMS检测系统分析壳聚糖气味成分，通过高灵敏的气体成分检测获得海洋动物源壳聚糖的气味组分，并建立海洋动物源壳聚糖气味指纹图谱，借助动态主成分分析插件和强大的数据库比对功能，完成样品的相似性分析，快速识别海洋生物源壳聚糖。本发明提供的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，具有样品前处理简单、需要样品量低、检测灵敏度高、分析速度快的特点，该方法可应用于对市场上流通的壳聚糖的来源进行种属鉴别，为壳聚糖相关行业提供可靠的海洋动物源壳聚糖鉴别方法，为相关产品的监管提供依据，进一步保障消费者权益及使用安全和身体健康。
本发明采用以下的技术方案：
一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理
海洋动物源壳聚糖样品：称量海洋动物源壳聚糖样品0.5±0.1g置于顶空瓶中，加入天门冬氨酸，摇匀，加入2mL纯化水将混合样品润湿，密封顶空瓶，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
进一步地，所述的天门冬氨酸加入质量与海洋动物源壳聚糖样品质量比例为0.2:0.5。
海洋动物甲壳样品：将海洋动物甲壳洗净，晾干，剪碎，研磨，称量样品0.5±0.1g置于顶空瓶中，加入天门冬氨酸，摇匀，加入2mL纯化水将混合样品润湿，密封顶空瓶，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
进一步地，海洋动物甲壳样品的天门冬氨酸加入量与海洋动物源壳聚糖样品中天门冬氨酸加入量相同。
进一步地，所述的海洋动物甲壳研磨度为样品粒径小于0.1cm。
进一步地，所述的海洋动物甲壳的研磨方式为冷冻研磨。
进一步地，所述的冷冻研磨条件为使用规格2mL的PP材质冷冻研磨管，海洋动物甲壳装量0.2g，直径3.0mm钢珠6颗，冷冻研磨机频率60HZ，预冷1min，-40℃冷冻研磨2min，间隔10s，重复研磨8次。
非海洋动物源壳聚糖样品：称量非海洋动物源壳聚糖样品0.5±0.1g置于顶空瓶中，加入天门冬氨酸，摇匀，加入2mL纯化水将混合样品润湿，密封顶空瓶，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
进一步地，非海洋动物源壳聚糖样品的天门冬氨酸加入量与海洋动物源壳聚糖样品中天门冬氨酸加入量相同。
(2)校准样品与质控样品准备
a)校准样品
吸取校准样品30μL置于顶空瓶中，加入2mL纯化水，密封顶空瓶，混匀，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
进一步地，所述的校准样品由2-丁酮(2-Butanone)、2-戊酮(2-Pentanone)、2-己酮(2-Hexanone)、2-庚酮(2-heptanone)、2-辛酮(2-Octanone)、2-壬酮(2-nonanone)按体积比为1:1:1:1:1:1的标准物质混合配制。
b)质控样品
空气空白质控样品：空顶空瓶密封，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
基质空白质控样品：称量天门冬氨酸于顶空瓶中，加入2mL纯化水润湿，密封顶空瓶，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
进一步地，基质空白质控样品的天门冬氨酸加入量与海洋动物源壳聚糖样品中天门冬氨酸加入量相同。
(3)气相-离子迁移谱(GC-IMS)测定
将步骤(1)和步骤(2)制备的全部样品进行气相-离子迁移谱(GC-IMS)分析；
检测收集相对离子峰强度、离子迁移时间和气相保留时间数据；
进一步地，所述的气相-离子迁移谱(GC-IMS)的检测系统测定条件为：样品孵化温度为70～80℃，样品孵化时间为15min，色谱柱为长15m、内径0.53mm、膜厚1μm的MXT-5金属毛细管气相色谱柱，电离源为氚(3H)，载气和吹扫气体均为99.999％高纯氮气，色谱柱温度60℃，初始流量2mL/min，保留2min后，于20min时升至100mL/min；漂移管温度为35～55℃，进样器温度为85℃，进样体积0.5mL，迁移谱漂移气体流量为150mL/min，样品的分析时间为30min。
进一步地，所述的样品孵化温度为80℃
(4)分析结果
提取步骤(3)分析收集的相对离子峰强度、离子迁移时间和气相保留时间数据，以步骤(2)制备的校准样品检测数据做校正，以步骤(2)制备的基质空白质控样品检测数据做背景扣除，使用气相-离子迁移谱(GC-IMS)检测系统自带软件对步骤(1)制备的海洋动物源壳聚糖样品、海洋动物甲壳样品、非海洋动物源壳聚糖样品的挥发性有机成分做定性分析，建立海洋动物源壳聚糖样品、海洋动物甲壳样品和非海洋动物源壳聚糖样品气味组分的指纹谱图；
对比海洋动物源壳聚糖样品和海洋动物甲壳样品指纹谱图，结合海洋动物源壳聚糖样品与海洋动物甲壳样品的差谱分析，以海洋动物源壳聚糖样品与海洋动物甲壳样品相似度较高特征峰确定为海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质，以非海洋动物源壳聚糖样品与海洋动物源壳聚糖相似度较低特征峰确定为非海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质；
将确定的海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质和非海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质的相对离子峰强度检测数据组成矩阵进行主成分分析(Principal ComponentAnalysis，PCA)，将得到的主成分按照贡献率大小从高到低进行排序，取前两个主成分得分数用于进行可视化分析；
进一步地，所述的海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质为正庚醇、正庚醛、2-己烯醛、正己醇、正戊醇、2-正丁基呋喃、丙酮酸乙酯、2-乙基吡嗪、4-甲基-2-戊醇、2-甲基-2-丙烯酸甲酯、正戊醛。
进一步地，非海洋动物源壳聚糖为真菌源壳聚糖。
进一步地，真菌源壳聚糖为双孢菇菌伞壳聚糖，气味组分特征物质为4-烯丙基苯甲醚、樟脑、5-甲基-2-噻吩甲醛、未定性、1,3,3-三甲基-2-氧杂双环[2.2.2]辛烷、苯甲醇、2-乙酰吡咯、2,6-二甲基苯胺、四氢噻吩-3-酮、2-羟甲基呋喃、2-甲基吡嗪、3-甲硫基丙醛、3-异硫氰基-1-丙烯、苯乙烯、2,3-丁二醇、环戊酮、四氢呋喃、5-甲基-2-噻吩甲醛。
(5)海洋动物源壳聚糖鉴别
待鉴别壳聚糖样品按照步骤(1)中海洋动物源壳聚糖样品的前处理方法进行样品前处理，按照步骤(3)的方法进行测定，使用按照步骤(4)确定的主成分分析方法进行海洋动物源壳聚糖鉴别，即可完成基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖。
本发明具有的有益效果是：
(1)提供一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，该方法可应用于对市场上流通的壳聚糖是否为海洋动物源壳聚糖进行鉴别，为壳聚糖相关行业提供可靠的海洋动物源壳聚糖鉴别方法，为相关产品的监管提供依据，进一步保障壳聚糖及产品的消费者权益及使用者的产品使用安全和身体健康；
(2)提供的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，具有样品前处理简单及需要样品量低的优点。已知可获得的海洋动物甲壳和壳聚糖均含有大量氨气组分，会严重干扰气相-离子迁移谱(GC-IMS)的化合物出峰及定性分析。本发明提供的样品前处理方法，可以有效排除样品本身带来的氨气干扰，确保检测及分析结果的准确性；本发明提供的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法的待测样品用量为0.5g，具有需要样品量低的优点；
(3)提供的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，具有测试时间短的优点。本发明提供的方法，经实施例验证的壳聚糖样本在30min分钟内出峰完全，分析时间设定为30min，能够确保待鉴别壳聚糖样品数据采集和分析的完整性；本方法提供的样品孵化时间为15min，通过孵化时间重叠上一份样品测试分析时间的方式进行，除第一份样品外，后续样品孵化时间均包含在分析时间中，进一步缩短测试时间；
(4)提供的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，充分发挥气相-离子迁移谱(GC-IMS)具有的检测灵敏度高的优点，适合分析海洋动物组织及其衍生物相关复杂的气味组分，为本发明提供方法的应用奠定了技术基础。
附图说明
图1显示为实施例1中校准样品、基质空白质控样品、海蟹源壳聚糖样品、海虾源壳聚糖样品、海蟹甲壳样品、海虾甲壳样品、真菌源壳聚糖样品的三维指纹谱图；
图2显示为图1中海虾源壳聚糖样品、海蟹甲壳样品、海虾甲壳样品、真菌源壳聚糖样品以海蟹源壳聚糖样品为参照的二维差谱谱图；
图3显示为实施例1中2份海蟹源壳聚糖样品、2份海虾源壳聚糖样品、2份真菌源壳聚糖样品的GalleryPlot图和空白基质样品对应选峰区域；
图4显示为实施例1中海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质和真菌源壳聚糖气味组分特征物质相对离子峰强度检测数据组成矩阵的主成分分析(Principal ComponentAnalysis，PCA)图；
图5显示为实施例2中待鉴别壳聚糖样品的鉴别结果，同时显示为实施例3中海蟹甲壳样品、海虾甲壳样品使用实施例1建立矩阵的主成分分析结果；
图6显示为实施例3中不同粒径海蟹甲壳样品的GC-IMS二维谱图，左图样品粒径0.5～1.0cm，中图样品粒径为0.1～0.5cm，右图样品粒径为<0.1cm；
图7显示为实施例4经添加不同比例天门冬氨酸前处理的海蟹甲壳样品的GC-IMS二维谱图；
图8显示为实施例4经添加不同比例天门冬氨酸前处理的海蟹源壳聚糖样品的GC-IMS二维谱图；
图9显示实施例5为海蟹源壳聚糖样品在不同孵化温度条件下的CG-IMS二维谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明采用的检测设备为德国G.A.S.公司生产的型号为的风味分析仪，氮气采用济南德洋特种气体有限公司生产的纯度为99.999％的高纯氮气，样品称量采用千分之一天平，样品研磨采用上海测博生物科技发展中心(有限合伙)生产的型号为CBCL-48的冷冻研磨仪，样品前处理采用的天门冬氨酸纯度≥99.0％。
本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例1
建立一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法。
一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法的建立，具体采用以下技术步骤：
(1)样品前处理
海蟹源壳聚糖样品：称量海蟹源壳聚糖样品0.500g置于顶空瓶中，加入天门冬氨酸0.200g，摇匀，加入2mL纯化水将混合样品润湿，密封顶空瓶，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
所述的海蟹源壳聚糖是以海蟹甲壳为原料制备的壳聚糖；
海虾源壳聚糖样品：称量海虾源壳聚糖样品0.500g置于顶空瓶中，加入天门冬氨酸0.200g，摇匀，加入2mL纯化水将混合样品润湿，密封顶空瓶，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
所述的海虾源壳聚糖是以海虾甲壳为原料制备的壳聚糖；
海蟹壳样品：将海蟹壳洗净，晾干，剪碎，研磨至粒径小于0.1cm，称量样品0.500g置于顶空瓶中，加入天门冬氨酸0.200g，摇匀，加入2mL纯化水将混合样品润湿，密封顶空瓶，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
海虾壳样品：将海虾壳洗净，晾干，剪碎，研磨至粒径小于0.1cm，称量样品0.500g置于顶空瓶中，加入天门冬氨酸0.200g，摇匀，加入2mL纯化水将混合样品润湿，密封顶空瓶，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
所述的研磨方式为冷冻研磨；
所述的冷冻研磨，其条件为规格2mL的PP材质冷冻研磨管，海洋动物甲壳装量0.2g，直径3.0mm钢珠6颗，冷冻研磨机频率60HZ，预冷1min，-40℃冷冻研磨2min，间隔10s，重复研磨8次；
真菌源壳聚糖样品：称量真菌源壳聚糖样品0.500g置于顶空瓶中，加入天门冬氨酸0.200g，摇匀，加入2mL纯化水将混合样品润湿，密封顶空瓶，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
所述的真菌源壳聚糖是以白蘑菇为原料制备的双孢菇菌伞壳聚糖；
步骤(1)所述的所有样品均平行制备2份；
(2)校准样品与质控样品准备
a)校准样品
吸取校准样品30μL置于顶空瓶中，加入2mL纯化水，密封顶空瓶，混匀，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
所述的校准样品由2-丁酮(2-Butanone)、2-戊酮(2-Pentanone)、2-己酮(2-Hexanone)、2-庚酮(2-heptanone)、2-辛酮(2-Octanone)、2-壬酮(2-nonanone)体积比为1:1:1:1:1:1的标准物质混合配制；
b)质控样品
空气空白质控样品：空顶空瓶密封，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
基质空白质控样品：称量天门冬氨酸0.200g于顶空瓶中，加入2mL纯化水润湿，密封顶空瓶，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
(3)气相-离子迁移谱(GC-IMS)测定
将上述步骤(1)和步骤(2)制备的全部样品进行气相-离子迁移谱(GC-IMS)分析；
气相-离子迁移谱(GC-IMS)检测系统测定条件为：样品孵化温度为70～80℃，样品孵化时间为15min，色谱柱为长15m、内径0.53mm、膜厚1μm的MXT-5金属毛细管气相色谱柱，电离源为氚(3H)，载气和吹扫气体均为99.999％高纯氮气，色谱柱温度60℃，初始流量2mL/min，保留2min后，于20min时升至100mL/min；漂移管温度为35～55℃，进样器温度为85℃，进样体积0.5mL，迁移谱漂移气体流量为150mL/min，样品的分析时间为30min；
检测收集相对离子峰强度、离子迁移时间和气相保留时间数据；
(4)分析结果
提取上述步骤(3)分析收集的相对离子峰强度、离子迁移时间和气相保留时间数据，以步骤(2)制备的校准样品检测数据做校正，以步骤(2)制备的基质空白质控样品检测数据做背景扣除，使用气相-离子迁移谱(GC-IMS)检测系统自带软件对步骤(1)制备的2份海蟹源壳聚糖样品、2份海虾源壳聚糖样品、2份真菌源壳聚糖样品的挥发性有机成分做定性分析，检测及分析结果见图1、图2所示。
其中，图1为校准样品、基质空白质控样品、海蟹源壳聚糖样品、海虾源壳聚糖样品、海蟹甲壳样品、海虾甲壳样品、真菌源壳聚糖样品的三维指纹谱图，其中x轴为相对离子迁移时间，y轴表示气相色谱保留时间，z轴表示峰强度，整个指纹谱图背景为蓝色，x轴1.0处红色峰为RIP峰(反应离子峰，经归一化处理)，RIP峰两侧的每一个点代表一种挥发性有机物的单体或者二聚体，颜色代表物质的浓度，颜色越深表示浓度越大，白色表示浓度较低，红色表示浓度较高。图1校准样品谱图显示6种标准物质均出峰正常，可以用于后续检测的数据校正；基质空白质控样品的结果，显示环境空气和样品处理用天门冬氨酸及纯化水为样品检测带来较少的基质干扰，出现的干扰信号峰在数据结果分析时均排除，确保基质干扰的消除；海蟹源壳聚糖样品、海虾源壳聚糖样品、海蟹甲壳样品、海虾甲壳样品、真菌壳聚糖样品的结果，显示在30min分析时间内，各样品出峰完全；
图2为图1中海虾源壳聚糖样品、海蟹甲壳样品、海虾甲壳样品、真菌源壳聚糖样品以海蟹源壳聚糖样品为参照的二维差谱谱图，扣减后的谱图中，相同浓度物质抵消为白色，红色表示该物质浓度比参比中高，蓝色表示该物质浓度比参比中低，颜色越深表示差异越大。图2显示海蟹源壳聚糖样品与海虾源壳聚糖样品的气味组分最为相似，与真菌源壳聚糖样品差异较大；
图3为2份海蟹源壳聚糖样品、2份海虾源壳聚糖样品、2份真菌源壳聚糖样品的GalleryPlot图和空白基质样品对应选峰区域。图3中红框标出海蟹源壳聚糖样品、海虾源壳聚糖样品、海蟹甲壳样品、海虾甲壳样品的气味组分相似度较高的11个特征峰，确定为海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质；绿框标出真菌源壳聚糖样品与海蟹源壳聚糖样品、海虾源壳聚糖样品相似度较低的18个特征峰，确定为真菌源壳聚糖气味组分特征物质；使用检测系统内置的NIST气相保留指数数据库及IMS数据库对所述29个特征峰进行定性分析，其结果见表1所示。
表1
由表1和图3可得，该方法中所述的海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质为正庚醇、正庚醛、2-己烯醛、正己醇、正戊醇、2-正丁基呋喃、丙酮酸乙酯、2-乙基吡嗪、4-甲基-2-戊醇、2-甲基-2-丙烯酸甲酯、正戊醛，真菌源壳聚糖气味组分特征物质为4-烯丙基苯甲醚、樟脑、5-甲基-2-噻吩甲醛、未定性、1,3,3-三甲基-2-氧杂双环[2.2.2]辛烷、苯甲醇、2-乙酰吡咯、2,6-二甲基苯胺、四氢噻吩-3-酮、2-羟甲基呋喃、2-甲基吡嗪、3-甲硫基丙醛、3-异硫氰基-1-丙烯、苯乙烯、2,3-丁二醇、环戊酮、四氢呋喃、5-甲基-2-噻吩甲醛。
将所述确定的海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质和真菌源壳聚糖气味组分特征物质的相对离子峰强度检测数据组成矩阵进行主成分分析(Principal ComponentAnalysis，PCA)，将得到的主成分按照贡献率大小从高到低进行排序，取前两个主成分的得分数进行可视化分析，分析结果如图4所示。
图4为海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质和真菌源壳聚糖气味组分特征物质相对离子峰强度检测数据组成矩阵进行主成分分析，结果显示海蟹源壳聚糖和海虾源壳聚糖与真菌壳聚糖在主成分PC-1(86％)上具有很强的区分度，可用于鉴别海洋动物源壳聚糖。
实施例2
本实施例提供一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法鉴别海洋动物源壳聚糖。
本实施例使用实施例1建立的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，对市场上购买的海洋动物源壳聚糖进行鉴别，具体采用以下技术步骤：
待鉴别壳聚糖样品按照实施例1步骤(1)中海洋动物源壳聚糖样品的前处理方法进行样品前处理，按照实施例1步骤(3)的方法进行测定，分析收集待鉴别壳聚糖样品的相对离子峰强度、离子迁移时间和气相保留时间数据；
所述的待鉴别壳聚糖样品为市场上购买的6份以海洋动物甲壳为原料生产的壳聚糖；
待鉴别壳聚糖样品数据代入实施例1建立的主成分分析矩阵，鉴别结果如图5所示；
图5显示为6份待鉴别壳聚糖样品的鉴别结果，显示均与实施例1建立的海洋动物源壳聚糖主成分相近，与真菌源壳聚糖主成分区分度显著，证明了本发明提供的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法可应用于海洋动物源壳聚糖的鉴别；
实施例3
本实施例提供一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法中，海洋动物甲壳样品前处理中的研磨方法分析。
本实施例目的在于验证本发明提供的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法中的海洋动物甲壳样品前处理过程中的研磨方法，主要为研磨条件和效果验证，具体采用以下技术步骤：
制备3种粒径不同的海蟹甲壳样品，各称量样品0.500g置于顶空瓶中，加入天门冬氨酸0.200g，摇匀，加入2mL纯化水将混合样品润湿，密封顶空瓶，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
所述的3种粒径不同的海蟹甲壳样品粒径别为1.0～0.5cm、0.5～0.1cm、<0.5cm；
所述的粒径为1.0～0.5cm、0.5～0.1cm的海蟹甲壳样品为使用剪刀直接剪制；
所述的粒径为<0.5cm的海蟹甲壳样品为使用冷冻研磨仪研制，冷冻研磨条件为规格2mL的PP材质冷冻研磨管，海洋动物甲壳装量0.2g，直径3.0mm钢珠6颗，冷冻研磨机频率60HZ，预冷1min，-40℃冷冻研磨2min，间隔10s，重复研磨8次；
按照实施例1步骤(3)的方法测试所述3种粒径不同的海蟹甲壳样品，测试结果如图6；
图6显示为不同粒径海蟹甲壳样品的GC-IMS二维谱图，结果显示，同一海蟹甲壳样品随着粒径减小，GC-IMS检测到的信号峰增多，越能充分体现样品的气味组分情况。故本发明提供的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法中，优选使用粒径<0.5cm的海洋动物甲壳样品；
实施例4
本实施例提供一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法中，样品前处理方法中的天门冬氨酸添加方法分析。
海洋动物甲壳和壳聚糖在使用气相离子迁移谱(GC-IMS)测定时，会有源于样品本身的氨气分子干扰测试，氨气分子相比于其他待分析检测的挥发性有机物更容易结合氢质子，导致样品的挥发性有机物无法出峰或者无法正确定性分析。本发明提供的基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法中，样品前处理使用添加天门冬氨酸的方法消减海洋动物甲壳和壳聚糖样品中的氨气。本实施例目的在于验证本发明提供的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法中天门冬氨酸的添加方法，主要为添加条件和效果验证，具体采用以下技术步骤：
制备不同天门冬氨酸添加比例的样品，加2mL纯化水润湿，同时制备零添加样品做对照，样品制备方法如表2所示。
表2
依照表2中制备的各样品按照实施例1步骤(3)的方法测定，检测结果如图7、图8所示。
图7、图8分别为经添加不同比例天门冬氨酸前处理的海蟹甲壳和海蟹源壳聚糖样品的GC-IMS二维谱图。C0.5和S0.5为对照样品，其RIP峰左侧的连续强峰为干扰物信号峰，RIP峰右侧能够检测到的信号峰数量少其强度弱；C0.5+W2mL和S0.5+W2mL结果显示，水的加入可以增强信号峰的强度，但无法消除干扰；C0.5+0.05、C0.5+0.1、C0.5+0.2和S0.5+0.05、S0.5+0.1、S0.5+0.2结果显示，天门冬氨酸添加比例增加，可以有效削减干扰物信号峰，RIP右侧的挥发性有机物检测信号峰明显增多，强度增强，更有利于充分表征样品气味组分情况。故本发明提供的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法中，优选样品量0.5±0.1g、天门冬氨酸0.2g、纯化水2mL的样品前处理方法。
实施例5
本实施例提供一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法中样品孵化温度分析。
为确定一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法建立的最佳试验条件，在上述系列实施例的基础上，以样品孵化温度进行单因素实验，具体采用以下技术步骤：
按照实施例1步骤(1)的方法制备6份海蟹源壳聚糖样品，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
按照实施例1步骤(3)中气相-离子迁移谱(GC-IMS)检测系统测定条件设置除样品孵化温度以外的其他参数；
上述6份海蟹源壳聚糖样品设置样品孵化温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，CG-IMS测试结果如图9所示。
图9为海蟹源壳聚糖样品在不同孵化温度条件下的CG-IMS二维谱图，结果显示，随着孵化温度从30℃上升至70℃，挥发性有机物信号峰数量增多，强度增强，温度达到70℃后，采集的信号峰趋于稳定。故本发明提供的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法中设定样品孵化温度为70～80℃，优选样品孵化温度为80℃。
由上得出，本发明提供了一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，该方法可应用于对市场上流通的壳聚糖是否为海洋动物源壳聚糖进行鉴别，为壳聚糖相关行业提供可靠的海洋动物源壳聚糖鉴别方法，为相关产品的监管提供依据，进一步保障壳聚糖及产品的消费者权益及使用者的产品使用安全和身体健康；
提供的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，具有样品前处理简单及需要样品量低的优点。已知可获得的海洋动物甲壳和壳聚糖均含有大量氨气组分，会严重干扰气相-离子迁移谱(GC-IMS)的化合物出峰及定性分析。本发明提供的样品前处理方法，可以有效排除样品本身带来的氨气干扰，确保检测及分析结果的准确性；本发明提供的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法的待测样品用量为0.5g，具有需要样品量低的优点；
提供的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，具有测试时间短的优点。本发明提供的方法，经实施例验证的壳聚糖样本在30min分钟内出峰完全，分析时间设定为30min，能够确保待鉴别壳聚糖样品数据采集和分析的完整性；本方法提供的样品孵化时间为15min，通过孵化时间重叠上一份样品测试分析时间的方式进行，除第一份样品外，后续样品孵化时间均包含在分析时间中，进一步缩短测试时间；
提供的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，充分发挥气相-离子迁移谱(GC-IMS)具有的检测灵敏度高的优点，适合分析海洋动物组织及其衍生物相关复杂的气味组分，为本发明提供方法的应用奠定了技术基础。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品前处理
海洋动物源壳聚糖样品：称量海洋动物源壳聚糖样品0.5±0.1g置于顶空瓶中，加入天门冬氨酸，摇匀，加入2mL纯化水将混合样品润湿，密封顶空瓶，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
海洋动物甲壳样品：将海洋动物甲壳洗净，晾干，剪碎，研磨，称量样品0.5±0.1g置于顶空瓶中，加入天门冬氨酸，摇匀，加入2mL纯化水将混合样品润湿，密封顶空瓶，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
非海洋动物源壳聚糖样品：称量非海洋动物源壳聚糖样品0.5±0.1g置于顶空瓶中，加入天门冬氨酸，摇匀，加入2mL纯化水将混合样品润湿，密封顶空瓶，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
(2)校准样品与质控样品准备
a)校准样品
吸取校准样品30μL置于顶空瓶中，加入2mL纯化水，密封顶空瓶，混匀，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
b)质控样品
空气空白质控样品：空顶空瓶密封，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
基质空白质控样品：称量天门冬氨酸于顶空瓶中，加入2mL纯化水润湿，密封顶空瓶，置于顶空进样器相应位置，准备进样；
(3)气相-离子迁移谱测定
将步骤(1)和步骤(2)制备的全部样品进行气相-离子迁移谱分析；
检测收集相对离子峰强度、离子迁移时间和气相保留时间数据；
(4)分析结果
提取步骤(3)分析收集的相对离子峰强度、离子迁移时间和气相保留时间数据，以步骤(2)制备的校准样品检测数据做校正，以步骤(2)制备的基质空白质控样品检测数据做背景扣除，使用气相-离子迁移谱检测系统自带软件对步骤(1)制备的海洋动物源壳聚糖样品、海洋动物甲壳样品、非海洋动物源壳聚糖样品的挥发性有机成分做定性分析，建立海洋动物源壳聚糖样品、海洋动物甲壳样品和非海洋动物源壳聚糖样品气味组分的指纹谱图；
对比海洋动物源壳聚糖样品和海洋动物甲壳样品指纹谱图，结合海洋动物源壳聚糖样品与海洋动物甲壳样品的差谱分析，以海洋动物源壳聚糖样品与海洋动物甲壳样品相似度较高特征峰确定为海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质，以非海洋动物源壳聚糖样品与海洋动物源壳聚糖相似度较低特征峰确定为非海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质；
将确定的海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质和非海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质的相对离子峰强度检测数据组成矩阵进行主成分分析，将得到的主成分按照贡献率大小从高到低进行排序，取前两个主成分得分数用于进行可视化分析；
(5)海洋动物源壳聚糖鉴别
待鉴别壳聚糖样品按照步骤(1)中海洋动物源壳聚糖样品的前处理方法进行样品前处理，按照步骤(3)的方法进行测定，使用按照步骤(4)确定的主成分分析方法进行海洋动物源壳聚糖鉴别，即可完成基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，其特征在于，天门冬氨酸加入质量与样品质量比例为0.2:0.5。
3.根据权利要求1所述的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，其特征在于，所述的海洋动物甲壳研磨度为样品粒径小于0.1cm。
4.根据权利要求3所述的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，其特征在于，所述的海洋动物甲壳的研磨方式为冷冻研磨；冷冻研磨条件为使用规格2mL的PP材质冷冻研磨管，海洋动物甲壳装量0.2g，直径3.0mm钢珠6颗，冷冻研磨机频率60HZ，预冷1min，-40℃冷冻研磨2min，间隔10s，重复研磨8次。
5.根据权利要求1所述的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，其特征在于，所述的校准样品由2-丁酮(2-Butanone)、2-戊酮(2-Pentanone)、2-己酮(2-Hexanone)、2-庚酮(2-heptanone)、2-辛酮(2-Octanone)、2-壬酮(2-nonanone)按体积比为1:1:1:1:1:1的标准物质混合配制。
6.根据权利要求1所述的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，其特征在于，所述的气相-离子迁移谱的检测系统测定条件为：样品孵化温度为70～80℃，样品孵化时间为15min，色谱柱为长15m、内径0.53mm、膜厚1μm的MXT-5金属毛细管气相色谱柱，电离源为氚(3H)，载气和吹扫气体均为99.999％高纯氮气，色谱柱温度60℃，初始流量2mL/min，保留2min后，于20min时升至100mL/min；漂移管温度为35～55℃，进样器温度为85℃，进样体积0.5mL，迁移谱漂移气体流量为150mL/min，样品的分析时间为30min。
7.根据权利要求1所述的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，其特征在于，所述的海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质为正庚醇、正庚醛、2-己烯醛、正己醇、正戊醇、2-正丁基呋喃、丙酮酸乙酯、2-乙基吡嗪、4-甲基-2-戊醇、2-甲基-2-丙烯酸甲酯、正戊醛。
8.根据权利要求1所述的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，其特征在于，非海洋动物源壳聚糖为真菌源壳聚糖。
9.根据权利要求8所述的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，其特征在于，真菌源壳聚糖为双孢菇菌伞壳聚糖。
10.根据权利要求8或9所述的一种基于气味鉴别海洋动物源壳聚糖的方法，其特征在于，非海洋动物源壳聚糖气味组分特征物质为4-烯丙基苯甲醚、樟脑、5-甲基-2-噻吩甲醛、未定性、1,3,3-三甲基-2-氧杂双环[2.2.2]辛烷、苯甲醇、2-乙酰吡咯、2,6-二甲基苯胺、四氢噻吩-3-酮、2-羟甲基呋喃、2-甲基吡嗪、3-甲硫基丙醛、3-异硫氰基-1-丙烯、苯乙烯、2,3-丁二醇、环戊酮、四氢呋喃、5-甲基-2-噻吩甲醛。
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