CN109680035B - 一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法及其应用 - Google Patents

一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其将待筛选菌种活化后制备接种菌悬液，并分别置于含有肌醇和不含肌醇的培养体系中，采用酶标仪实时检测，判断菌种的生长特异性，在不含肌醇的培养体系中无明显生长的为肌醇缺陷型菌株。本发明还涉及一种肌醇缺陷型菌株在食品中肌醇测定的方法，其包括配制肌醇缺陷型菌株悬液；配制肌醇标准溶液，以进行标准曲线的制作；处理待测样品，以用于配制待测样品溶液，并在待测样品溶液中加入肌醇缺陷型菌株悬液，以根据标准曲线进行待测样品中肌醇含量的测定。本发明成功筛选到一株肌醇缺陷型菌株，进一步利用该菌建立了一种食品中肌醇含量测定的微生物方法，该测定方法具有良好的精密度，回收率及重现性。

Description

一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法及其应用
技术领域
本发明属于菌种筛选及食品中维生素测定技术领域，具体涉及一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法及其在测定食品中肌醇含量的应用。
背景技术
肌醇又称环己六醇，是一种具有生物活性的环状糖醇。1850年Beckett C等首次从动物组织抽提液中发现了肌醇。1940年Wooley.D.首次发现该抽提液中制得的肌醇具有抗脱毛作用，从而揭开了肌醇具有维生素活性这一特性。随着有关肌醇研究的深入，研究者发现肌醇理论上具有9种立体异构体，其中内消旋(1,2,3,5-顺式)环己醇具有维生素生物活性。
近年来，随着对肌醇研究的逐步深入，研究者发现肌醇具有诸多生理活性，广泛应用于医药、食品、饲料等行业。在饲料工业中，由于肌醇作为生物促进剂，在动物快速生长期，能够刺激机体加速生长及防止动物死亡，因此作为养殖业饲料必需的添加成分。在食品工业中，由于肌醇对人的多类型的细胞的生长是必须的，因此常作为营养强化剂添加于婴幼儿食品及保健食品中。在医药工业中，肌醇失衡被证实与阿尔茨海默病、双向性精神障碍、癫痫等神经退行性疾病相关，肌醇还可改善多囊卵巢综合症女性的胰岛素敏感性和排卵功能，治疗女性代谢疾病。此外，肌醇是氟代肌醇、脉通等药物的中间体，在治疗肿瘤、动脉粥样硬化等方面有较好的疗效，近年来肌醇也作为脂肪肝等疾病的辅助治疗药物。
肌醇广泛分布于自然界的动植物体内，特别是全谷物和柑橘类水果内，作为一种营养强化剂，常被添加于婴幼儿配方乳粉及特殊膳食食品中。目前，国内外有关肌醇检测的方法主要有色谱法(气相色谱法、GC-MS法、HPLC法、GC-MS法、离子色谱法)和微生物法。其中色谱法主要适用于含量较高，基质成分简单的强化食品中肌醇的测定；而微生物法基于其高灵敏度，更适合于基质复杂，含量较低的天然食品中级肌醇的测定。
根据文献报道，肌醇是酵母菌的生长因子，对于酵母菌的生长是必需的，但是有些酵母菌自身能够合成细胞生长所需的肌醇，有些酵母菌却是天然的肌醇缺陷型，必需依赖培养基中的外源肌醇。但目前，现有用于肌醇测定的菌株肌醇依赖性不强，属于弱缺陷性菌株，肌醇测定的结果不可靠。
发明内容
为了解决现有技术的缺陷，本发明基于特殊酵母菌的特性，筛选肌醇缺陷型酵母菌，并在GB5009.270-2016《食品安全国家标准食品中肌醇的测定》微生物法的基础上，进行优化改良，从而获得更可靠稳定的用于肌醇测定的微生物方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其包括如下步骤：
将待筛选菌种活化后制备接种菌悬液，并将所述接种菌悬液分别置于含有肌醇和不含肌醇的培养体系中，采用酶标仪实时检测，判断菌种的生长特异性，在不含肌醇的培养体系中无明显生长的菌株为肌醇缺陷型菌株。在不含肌醇的培养体系中，其吸光度应小于等于0.1。
为了进一步优化上述筛选方法，本发明还采取如下技术措施：
进一步地，接种菌悬液的制备步骤如下：将菌株活化后接种到培养基上，培养2～3天后，制成贮备菌种，贮于冰箱中；在使用的前一天将贮备菌种转接到培养基中，培养20h～24h；取培养基培养物，在无菌条件下离心，倾去上清液；加入已灭菌的生理盐水重新分散细胞，快速混合均匀，离心倾去上清液；重复离心和清洗步骤后，细胞分散液用生理盐水悬浮，制成混悬液；550nm波长下测定所述混悬液的透光率，调整加入的菌液量或者氯化钠溶液使所述混悬液透光率在60％～80％，获得接种菌悬液。
进一步地，所述含有肌醇的培养体系中的肌醇浓度为1～10μg/mL。更优选为1μg/mL。
进一步地，所述待测菌种包括酿酒酵母菌和葡萄汁酵母菌；所述肌醇缺陷型菌株包括酿酒酵母S.cerevisiae CICC 32249和葡萄汁酵母S.uvarum CICC 1465。
进一步地，所述筛选方法还包括步骤：对所述肌醇缺陷型菌的培养时间、测定准确率、培养终点进行验证，以确定用于肌醇测定的肌醇缺陷型菌；其中，所述用于肌醇测定的肌醇缺陷型菌为酿酒酵母S.cerevisiae CICC 32249和葡萄汁酵母S.uvarum CICC 1465，更优选为葡萄汁酵母S.uvarum CICC 1465。
进一步地，用于肌醇测定的肌醇缺陷型菌在培养至终点时间隔2h测定吸光度；其中，连续两次吸光度的差值在0.05之内，终止培养。
本发明的第二个目的是提供一种肌醇缺陷型菌株，所述菌株为酿酒酵母S.cerevisiae CICC 32249或葡萄汁酵母S.uvarum CICC 1465，更优选为葡萄汁酵母S.uvarum CICC 1465。
本发明的第三目的是酿酒酵母S.cerevisiae CICC 32249或葡萄汁酵母S.uvarumCICC 1465在测定食品中肌醇含量的应用。
本发明的第四个目的是提供一种利用上述肌醇缺陷型菌株以用于食品中肌醇的测定方法，其包括以下步骤：
步骤1)配制肌醇缺陷型菌株悬液；
步骤2)配制肌醇标准溶液，以用于配制标准曲线用溶液，并在所述标准曲线用溶液中加入所述肌醇缺陷型菌株悬液，以进行标准曲线的制作；
步骤3)处理待测样品，以用于配制待测样品溶液，并在所述待测样品溶液中加入所述肌醇缺陷型菌株悬液，以根据所述标准曲线进行待测样品中肌醇含量的测定。
为了进一步优化上述测定方法，本发明还采取如下技术措施：
进一步地，所述肌醇缺陷型菌株悬液的配制步骤包括：
将肌醇缺陷型菌株活化后接种到培养基上，培养2～3天后，制成贮备菌种，贮于冰箱中；在使用的前一天将贮备菌种转接到培养基中，培养20h～24h；取培养基培养物，在无菌条件下离心，倾去上清液；加入已灭菌的生理盐水重新分散细胞，快速混合均匀，离心倾去上清液；重复离心和清洗步骤后，细胞分散液用生理盐水悬浮，制成混悬液；550nm波长下测定所述混悬液的透光率，调整加入的菌液量或者氯化钠溶液使所述混悬液透光率在60％～80％，获得肌醇缺陷型菌株悬液。
进一步地，所述肌醇标准溶液的配制步骤包括：
取肌醇标准品干燥24h以上，称取预定量的肌醇标准品，用水充分溶解，定容至预定容量的棕色容量瓶中，贮存在冰箱中，获得预定浓度的肌醇标准储备液；并采用所述肌醇标准储备液配制肌醇标准中间液和肌醇标准工作液。更进一步地，取肌醇标准品干燥24h以上，称取50mg的肌醇标准品，用水充分溶解，定容至250mL棕色容量瓶中，贮存在冰箱中，获得肌醇标准储备液；并采用所述肌醇标准储备液配制肌醇标准中间液和肌醇标准工作液。进一步地，肌醇标准品储备液中肌醇的浓度为0.2mg/mL，肌醇标准中间液肌醇的浓度为10μg/mL，肌醇标准工作液肌醇的浓度为1μg/mL和2μg/mL。
进一步地，所述肌醇标准工作液需每次临用前配制。
进一步地，所述待测样品的处理步骤包括：
称取预定量的样品，加入盐酸溶液，混匀；在灭菌釜中水解；取出，冷却至室温，加入氢氧化钠溶液，冷却；用适宜浓度的氢氧化钠溶液或盐酸溶液调pH至4.5～6，定容，混匀，过滤，收集滤液，，调整稀释度，使待测液肌醇浓度于0.1μg/mL～1μg/mL，作为试样提取液。更进一步地，所述pH为5.2±0.1，采用水定容至250mL。
进一步地，所述待测样品经过预处理，其包括：薏米、乳粉样品粉碎、研磨、过筛；肉样品用打碎机制成食糜；南瓜、猕猴桃样品匀浆混匀；饮料样品用前振摇混合。
进一步地，所述待测样品溶液和所述标准曲线用溶液在加入所述肌醇缺陷型菌株悬液之前，需进行高压灭菌，迅速冷却。
进一步地，所述标准曲线用溶液包括水、培养基和肌醇工作液；所述待测样品溶液包括水、培养基和待测样品的提取液。
进一步地，所述食品包括薏米、乳粉、肉类、南瓜、猕猴桃、饮料等，也可为其他类型的样品。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
本发明成功筛选到两株肌醇缺陷型菌株酿酒酵母S.cerevisiae CICC 32249和葡萄汁酵母菌S.uvarum CICC 1465，并进一步利用葡萄汁酵母菌S.uvarum CICC1465建立了一种食品中肌醇含量测定的微生物方法，本发明所述的肌醇含量测定方法具有良好的精密度，回收率及重现性。
本发明改变了现行国家标准微生物法中的测试菌株，进一步明确并细化了方法中的相关操作步骤，规范了方法中的相关限制性原则及指标，使得方法的可操作性更强，保证了方法实施的严谨性，为相关食品安全监管部门及企业提供了更可靠的技术支撑。
附图说明
图1～图7为肌醇对不同菌株生长特异性的考察结果图；其中，图1：S.cerevisiaeATCC 9080；图2：S.cerevisiae ACCC 20065；图3：S.cerevisiae CICC32919；图4：S.cerevisiae CICC 32249；图5：S.uvarum CICC 31161；图6：S.uvarum ACCC 20202；图7：S.uvarum CICC 1465；其中：S2(0μg/mL)：不含有肌醇成分的培养体系；S10(1μg/mL)：含有肌醇成分的培养体系。
图8为S.cerevisiae CICC 32249 24h-48h的生长曲线图。
图9为S.uvarum CICC 1465 24h-48h的生长曲线图。
图10为S.uvarum CICC1465用于测定肌醇的标准曲线图。
图11为S.cerevisiae CICC32249用于测定肌醇的标准曲线图。
具体实施方式
本发明涉及一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其包括如下步骤：将待筛选菌种活化后制备接种菌悬液，并将所述接种菌悬液分别置于含有肌醇和不含肌醇的培养体系中，采用酶标仪实时检测，判断菌种的生长特异性，在不含肌醇培养体系无明显生长的菌株为肌醇缺陷型菌株。本发明还涉及一种利用上述所筛选的肌醇缺陷型菌株测定食品中肌醇的方法。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中采取的材料与方法如下：
(1)仪器与试剂
Infinite F200PRO型酶标仪(TECAN)；UV2450分光光度计(日本岛津公司)；PYX-DHS-600-BS型恒温培养箱(上海贺德实验设备有限公司)；SI-600R型振荡培养箱(韩国Jeiotech公司)；HV-110型压力蒸汽消毒器(日本Hirayama公司)。
肌醇测定培养基(青岛日水生物科技有限公司)；麦芽汁浸粉琼脂培养基(上海瑞楚生物科技有限公司)；麦芽汁肉汤培养基(上海瑞楚生物科技有限公司)；肌醇标准品(美国Sigma公司，LRAA9145，99.5％)；
(2)菌种
酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae CICC 32249、Saccharomycescerevisiae CICC 32919、Saccharomyces cerevisiae ATCC 9080、Saccharomycescerevisiae ACCC20065，葡萄汁酵母菌Saccharomyces uvarum CICC1465、Saccharomycesuvarum CICC 31161、Saccharomyces uvarum ACCC 20202。
(3)肌醇标准溶液的配置
肌醇标准储备液(0.2mg/mL)：肌醇标准品置于五氧化二磷的干燥器中干燥24h以上，称取50mg肌醇标准品(精确到0.1mg)，用水充分溶解，定容至250mL棕色容量瓶中，贮存在4℃冰箱中。肌醇标准中间液(10μg/mL)：吸取5.00mL肌醇标准储备液，用水定容到100mL棕色容量瓶中，贮存在4℃冰箱中。肌醇标准工作液(1μg/mL和2μg/mL)：吸取10mL肌醇标准中间液两次，分别用水定容到100mL容量瓶和50mL容量瓶中。该工作液需每次临用前配制。
(4)接种菌悬液的制备
将菌株活化后接种到麦芽浸粉琼脂斜面培养基上，30℃±1℃培养2～3天后，制成贮备菌种，贮于4℃冰箱中，保存期不要超过2周。
在使用的前一天将贮备菌种转接到10mL灭菌的麦芽浸粉液体培养基中，于30℃±1℃培养20h～24h。取麦芽浸粉液体培养基培养物，在无菌条件下2000r/min离心15min，倾去上清液。加入10mL已灭菌的生理盐水重新分散细胞，于旋涡混合器上快速混合均匀,离心15min，倾去上清液。重复离心和清洗步骤三次。最后一次细胞分散液用生理盐水悬浮，制成混悬液，备用。用分光光度计，以氯化钠溶液作空白，550nm波长下测定该接种菌悬液的透光率，调整加入的菌液量或者加入一定量的氯化钠溶液使该菌悬液透光率在60％～80％，尽快使用。
(5)样品的处理
样品前处理：薏米、乳粉样品粉碎、研磨、过筛；肉样品用打碎机制成食糜；南瓜、猕猴桃样品匀浆混匀；饮料样品用前振摇混合。
样品提取：分别准确称取一定量的上述样品于250mL锥形瓶中，固体试样加入80mL盐酸溶液(0.44mol/L)，液体试样加入100mL盐酸溶液(0.44mol/L)，混匀。将锥形瓶以铝箔纸覆盖，在灭菌釜中125℃水解1h。取出，冷却至室温，加入约2mL氢氧化钠溶液(600g/L)，冷却。用适宜浓度的氢氧化钠溶液或盐酸溶液调pH至5.2，转入250mL容量瓶中，定容至刻度。混匀，过滤，收集滤液，该滤液为试样提取液。调整稀释度，使待测液肌醇的浓度在0.1g/mL～1g/mL范围内。
(6)标准曲线及待测液系列管的制作
表1标准曲线用溶液的配置
Figure BDA0001980330030000071
注：1.试管No.S1－S2中不添加标准品溶液；S2中滴加菌液；
2.No.S3－S10中添加标准品溶液的浓度依次增高。三个重复。
表2待测样品的配置
Figure BDA0001980330030000072
向表1和表2中所有的试管各加入玻璃珠一颗，121℃5min高压灭菌，迅速冷却，将2.4中制备好的接种菌悬液向上述试管内(除S1)各加约150μL，混匀，30±1℃振荡培养。
96孔板中的加样制备：系列管按表1和表2制作后，取200μL制备液加入每孔，于酶标仪中，30±1℃振荡培养48h，培养过程中每小时检测一次。
实施例1
本实施例应用上述提及的材料及方法进行肌醇测定菌株的筛选。
本实施例采用酶标仪实时检测技术，比较四株酿酒酵母菌(S.cerevisiae CICC32249、S.cerevisiae CICC 32919、S.cerevisiae ATCC 9080、S.cerevisiae ACCC 20065)及三株葡萄汁酵母菌(S.uvarum CICC 1465、S.uvarum CICC 31161和S.uvarum ACCC20202)对肌醇的生长依赖性试验。比较上述七个标准菌株在肌醇浓度为0μg/mL(S2)和1μg/mL(S10)时，48h内的生长情况(图1～图7)。
根据图1～图7可以得出，与每株菌的S10生长趋势相比较，S.cerevisiae ATCC9080、S.cerevisiae ACCC 20065、S.cerevisiae CICC 32919、S.uvarum CICC 31161、S.uvarum ACCC 20202的S2均有明显的同步生长，而S.cerevisiae CICC 32249和S.uvarumCICC 1465的S2未有明显生长。因此，实验结果显示酿酒酵母S.cerevisiae CICC 32249和葡萄汁酵母S.uvarum CICC 1465为肌醇缺陷型菌株，具有用来特异性检测肌醇含量的潜力。
实施例2
本实施例应用上述提及的材料及方法对肌醇测定菌株培养时间进行考察。
为考察S.cerevisiae CICC 32249和S.uvarum CICC 1465的培养时间，本实施例对上述两株菌以标准曲线的S10管制备方式制备系列管，30℃±1培养24h后，每隔1h取样进行吸光度测定，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，分别绘制S.cerevisiae CICC 32249和S.uvarum CICC 1465 24h-48h的生长曲线(图8和图9)。
根据图8和图9的生长曲线图可得出，菌株S.uvarum CICC 1465在生长至38h-48h趋于稳定期，因而建议在采用S.uvarum CICC 1465菌株进行肌醇测定时，在38h-48h进行监控，确定终点培养时间；菌株S.cerevisiae CICC 32249在生长至40h-48h趋于稳定期，因而建议在采用S.cerevisiae CICC 32249菌株进行肌醇测定时，在38h-48h进行监控，确定终点培养时间。
实施例3
本实施例应用上述提及的材料及方法对肌醇测定菌株标准曲线进行考察。
本实验采用菌株S.cerevisiae CICC 32249和S.uvarum CICC 1465，按照表1进行标准曲线管的制作，按规定培养后测得的吸光度进行标准曲线的绘制。图10是菌株S.uvarum CICC 1465的标准曲线绘制实验结果，其拟合方程为：
Figure BDA0001980330030000081
r2＝0.99624
图11是菌株S.cerevisiae CICC 32249的标准曲线绘制实验结果，其拟合方程为：
Figure BDA0001980330030000091
r 2＝0.99466
根据图10和图11的标准曲线的拟合效果可以看出，菌株S.cerevisiae CICC32249和S.uvarum CICC 1465均采用四参数Logistic曲线拟合方式进行拟合，两株菌的标准曲线的r^2均>0.99，标准曲线拟合较好。
实施例4
本实施例应用上述提及的材料及方法对肌醇测定菌株测定准确率进行考察。
本实施例进一步比较酿酒酵母S.cerevisiae CICC 32249和葡萄汁酵母S.uvarumCICC 1465对于本方法的适用性。通过以肌醇对照品作为质控样品，经样品处理过程使其终浓度为2ug/mL，分别以酿酒酵母S.cerevisiae CICC 32249和葡萄汁酵母S.uvarum CICC1465进行肌醇测定，结果如表3。
表3S.cerevisiae CICC32249和S.uvarum CICC1465用于肌醇测定的比较
Figure BDA0001980330030000092
从表3可以看出，与酿酒酵母S.cerevisiae CICC 32249比较，葡萄汁酵母S.uvarum CICC 1465在微生物法中测定肌醇更准确，因而选择葡萄汁酵母S.uvarum CICC1465为后续实验的菌株。
实施例5
本实施例应用上述提及的材料及方法对培养终点期菌株生长变化量进行考察。
为确定S.uvarum CICC1465的培养终点，可将菌株在2h内的生长变化量作为参考值。结果见下表4。
表4S.uvarum CICC1465在培养终点2h内生长量的变化统计
Figure BDA0001980330030000093
Figure BDA0001980330030000101
根据表4可以看出，在培养至终点时，2h内菌液的吸光度的绝对差结果可达到≤5％。因此建议培养约38h后，同等条件下每隔2h监测最高浓度标准曲线管S10，测定其吸光度，如果两次吸光度的绝对差结果≤5％时，终止培养，一般培养时间不超过44h。
实施例6
本实施例应用上述提及的材料及方法对微生物法测定肌醇精密度、回收率、重现性分别进行考察。
(1)微生物法测定肌醇精密度
本实施例对猪肉、南瓜、南瓜粉、猕猴桃、薏米、猪肝粉、功能饮料及两种强化奶粉试样进行方法的精密度实验，通过比较每种试样分别在几次次独立实验下的测定结果差异，结果证明本方法在上述试样的测定中，精密度均在5％以内(见表5)。
表5精密度测定结果
Figure BDA0001980330030000102
(2)微生物法测定肌醇回收率
本实验以功能性饮料、强化奶粉、猪肉、南瓜、猕猴桃、薏米为基质物质，进行试样与样品1:1加标回收率实验，结果显示本方法在上述几种基质中的回收率为92％～106％(表6)。
表6回收率测定结果
Figure BDA0001980330030000103
Figure BDA0001980330030000111
(3)微生物法测定肌醇重现性考察
本实验分别对南瓜粉、薏米、猪肝粉、功能饮料四种试样，进行方法的重现性实验。结果显示本方法在上述样品的测试中，重现性RSD均在10％以内(表7)。
表7重现性测定结果
Figure BDA0001980330030000112
通过上述实施例可知，本发明成功筛选到一株肌醇缺陷型菌株葡萄汁酵母菌S.uvarum CICC 1465，进一步利用该菌建立了一种食品中肌醇含量测定的微生物方法。此外，本发明通过选用不同来源及含量的样品对建立的肌醇含量测定方法进行方法学验证，结果显示针对不同类别样品，方法的精密度，回收率及重现性均得到较好的效果。
本发明改变了现行国家标准微生物法中的测试菌株，进一步明确并细化了方法中的相关操作步骤，规范了方法中的相关限制性原则及指标，使得方法的可操作性更强，保证了方法实施的严谨性，为相关食品安全监管部门及企业提供了更可靠的技术支撑。因此，本发明建立的肌醇测定方法可用于食品中肌醇的测定。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (5)

1.一种测定食品中肌醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)配制肌醇缺陷型菌株悬液；
步骤2)配制肌醇标准溶液，以用于配制标准曲线用溶液，并在所述标准曲线用溶液中加入所述肌醇缺陷型菌株悬液，以进行标准曲线的制作；
步骤3)处理待测样品，以用于配制待测样品溶液，并在所述待测样品溶液中加入所述肌醇缺陷型菌株悬液，培养38-44小时，根据所述标准曲线进行待测样品中肌醇含量的测定；
所述肌醇缺陷型菌株为葡萄汁酵母S.uvarum CICC 1465。
2.根据权利要求1所述的测定食品中肌醇的方法，其特征在于，所述肌醇缺陷型菌株悬液的配制步骤包括：
将肌醇缺陷型菌株活化后接种到培养基上，培养2～3天后，制成贮备菌种，贮于冰箱中；在使用的前一天将贮备菌种转接到培养基中，培养20h～24h；取培养基培养物，在无菌条件下离心，倾去上清液；加入已灭菌的生理盐水重新分散细胞，快速混合均匀，离心倾去上清液；重复离心和清洗步骤后，细胞分散液用生理盐水悬浮，制成混悬液；550nm波长下测定所述混悬液的透光率，调整加入的菌液量或者氯化钠溶液使所述混悬液透光率在60％～80％，获得肌醇缺陷型菌株悬液。
3.根据权利要求1所述的测定食品中肌醇的方法，其特征在于，所述肌醇标准溶液的配制步骤包括：
取肌醇标准品干燥24h以上，称取预订量的肌醇标准品，用水充分溶解，定容至预定容量的棕色容量瓶中，贮存在冰箱中，获得预定浓度的肌醇标准储备液；并采用所述肌醇标准储备液配制肌醇标准中间液和肌醇标准工作液。
4.根据权利要求1所述的测定食品中肌醇的方法，其特征在于，所述待测样品的处理步骤包括：
称取预定量的样品，加入盐酸溶液，混匀；在灭菌釜中水解；取出，冷却至室温，加入氢氧化钠溶液，冷却；用适宜浓度的氢氧化钠溶液或盐酸溶液调pH至4.5～6，定容，混匀，过滤，收集滤液，调整其稀释倍数，使待测液肌醇的浓度在0.1μg/mL～1.0μg/mL范围内，作为试样提取液。
5.根据权利要求1所述的测定食品中肌醇的方法，其特征在于，所述待测样品溶液和所述标准曲线用溶液在加入所述肌醇缺陷型菌株悬液之前，需进行高压灭菌，迅速冷却。
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