CN104232733A - 肌醇检验接种菌悬液制备改良方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种肌醇检验接种菌悬液制备改良方法，包括步骤：A、复苏肌醇接种菌得到复苏菌种；B、将复苏菌种接种至肌醇测定培养基液中培养，得到接种菌基液；C、对接种菌基液进行吸光度检测，取吸光度为0.2～0.4的接种菌基液进行后续步骤；D、取接种菌基液于无菌离心管中，经离心、清洗后，加入0.9%的无菌盐水，震荡混匀制备成浓菌悬液；选取适量浓菌悬液加入到0.9%的无菌盐水中，控制浓度在0.55-0.65麦氏浊度范围内,得到接种菌悬液；E、取接种菌悬液用于检验肌醇含量。本发明步骤C中测定的吸光度大于0.4的接种菌基液取代步骤B的复苏菌种再次进行步骤B至E。本发明具有容易操作、准确度高的特点。

Description

肌醇检验接种菌悬液制备改良方法

技术领域

本发明涉及肌醇含量的测定方法，具体是食品和乳品中肌醇含量的微生物测定法。

背景技术

现有利用微生物测定肌醇含量的方法，主要包括以下步骤：1、复苏肌醇接种菌，得到复苏菌种；2、将复苏菌种转接到新配制的肉汤或斜面培养基上，于规定的温度培养16h～24 h；3、直接取肉汤培养物于无菌离心管中，或取斜面培养物于装有0.9%的无菌盐水离心管中进行离心、清洗、加入1mL0.9%的无菌盐水，震荡混匀制备成浓菌悬液；选取适量浓菌悬液加入到10mL0.9%的无菌盐水中，制备接种菌悬液，控制浓度在0.55-0.65麦氏浊度范围内；4、最后取接种菌悬液用于制作肌醇标准曲线及检验肌醇含量。

现有的这种肌醇测定法，菌种质量至关重要，由于肌醇接种菌体内积蓄一定量的肌醇，进而干扰了微生物的正常生长，使测定结果稳定性较差，特别是当待测物中该肌醇含量本来就少时，甚至出现标准曲线的梯度不明显、高浓度肌醇标准工作液的吸光值低于低浓度肌醇标准工作液的吸光度的反常现象，制作的标准曲线的相关性差或无法完成标准曲线的制作，直接影响检验结果的准确性。

发明内容

本发明的目的是提出一种肌醇检验接种菌悬液制备改良方法，其具有容易操作、准确度高的特点。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

肌醇检验接种菌悬液制备改良方法，包括以下步骤。

步骤A、复苏肌醇接种菌，得到复苏菌种。

步骤B、制备接种菌基液。

将步骤A的复苏菌种接种至肌醇测定培养基液中继续培养，得到接种菌基液。

步骤C、筛选接种菌基液。

使用分光光度计对步骤B的接种菌基液进行吸光度检测，取吸光度为0.2～0.4的接种菌基液进行后续步骤。 

步骤D、制备接种菌悬液。

取步骤C的接种菌基液于无菌离心管中，离心去掉上清液，吸取沉淀部分至无菌离心管中，加入无菌盐水进行清洗，离心去掉上清液，重复清洗2～3次，再加入无菌盐水，震荡混匀制备成浓菌悬液；选取适量浓菌悬液加入到无菌盐水中，控制浓度在0.55～0.65麦氏浊度范围内,得到接种菌悬液。

步骤E、取步骤D的接种菌悬液用于制作肌醇标准曲线及检验肌醇含量。

优化方案有：对步骤C中测定的吸光度大于0.4的接种菌基液进行步骤B，将步骤B中的复苏菌种改为接种菌基液。

本发明根据微生物的生长消耗自身物质的原理，将肌醇接种菌在肌醇测定培养基中进行饥饿培养，使菌体在没有待测肌醇的生长环境下生长，消耗掉自身体内积蓄的该肌醇，避免了其自身含有的肌醇对测定结果的影响。

本发明具有以下突出的实质性特点和显著的进步：通过本发明的测定方法绘制的标准曲线相关系数大，标准曲线呈良好的线性相关，肌醇含量测定结果准确性高。

附图说明

图1为本发明的测定流程示意图。

图2为本发明的接种菌基液吸光度为0.4时制作的标准曲线图。

图3为本发明的接种菌基液吸光度为0.2时制作的标准曲线图。

图4为本发明的接种菌基液吸光度为0.6时制作的标准曲线图。

图5为采用国标GB5413.25—2010中的肌醇微生物检测法制作的标准曲线图。

具体实施方式

以下实施例以微生物法检验食品中肌醇的含量为例，结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1

参考图1，利于微生物对食品中肌醇的含量进行检测的方法，包括以下步骤。

步骤A、 复苏肌醇接种菌，得到复苏菌种。

所述肌醇接种菌为葡萄汁酵母菌，将葡萄汁酵母菌活化后接种到麦芽浸粉琼脂斜面培养基上，30℃下培养16h后，再转接2-3代后得到复苏菌种。

步骤B、制备接种菌基液。

将步骤A的复苏菌种接种至肌醇测定培养基液中继续培养，30℃下培养16h后，得到接种菌基液，所述肌醇测定培养基液为5mL肌醇测试培养基和5mL水的混合液，肌醇测试培养基的成分及制备方法参见食品安全国家标准GB5413.25—2010《婴幼儿食品和乳品中肌醇的测定》。

步骤C、对接种菌基液进行筛选。

使用分光光度计对步骤B的接种菌基液进行吸光度检测，以5mL肌醇测试培养基和5mL蒸馏水的混合液为空白，以5mL接种菌基液和5mL蒸馏水的混合液为检测对象，检测步骤B的接种菌基液的吸光度为0.6。

取该吸光度为0.6的接种菌基液再次进行上述步骤B，将上述步骤B中的复苏菌种改为吸光度为0.6的接种菌基液，取经步骤B再次培养后的接种菌基液进行吸光度测定，测得经步骤B再次培养后的接种菌基液的吸光度为0.4。

步骤D、制备接种菌悬液。

取步骤B中吸光度为0.4的接种菌基液于无菌离心管中，3000r/min离心5分钟，去掉上清液，吸取沉淀部分至无菌离心管中，加入0.9%的无菌盐水进行清洗，又3000r/min离心3分钟，去掉上清液，重复清洗2～3次，再加入0.9%的无菌盐水，震荡混匀制备成浓菌悬液；选取适量浓菌悬液加入到0.9%的无菌盐水中，控制浓度在0.55～0.65麦氏浊度范围内,得到接种菌悬液。

步骤E、取步骤D的接种菌悬液用于制作肌醇标准曲线及检验肌醇含量。

步骤E1、制作标准曲线。

准备10个标准组培养管，按表1向每个标准组培养管内加入不同体积的蒸馏水、肌醇标准工作液和肌醇测定培养基，冷却，向每个标准组培养管内加入50μL接种菌悬液接种，培养后，通过分光光度计测定标准组培养管内不同量的肌醇的吸光度，测定结果见表2，其中S2的吸光度值以S1为参比液，S3～S10的吸光度值以S2为参比液，以肌醇标准工作液的肌醇量为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，标准曲线见图2。

步骤E2、将样品处理成待测液，并测定待测液的吸光度。

称取2份样品，分别为样品1和样品2，样品1的质量为2.0772g，样品2的质量为1.9850g，将样品1和样品2经盐酸溶解、消化、PH值调节、定容、过滤后制得待测液。

准备8个测试组培养管，分2组，每组4个，按表2向每个测试组培养管内加入不同体积的蒸馏水、待测液和肌醇测定培养基，其中4个测试组培养管中加入的待测液是由样品1制成的，分别标记为样品1-1、样品1-2、样品1-3、样品1-4，另4个测试组培养管中加入的待测液是由样品2制成的，分别标记为样品2-1、样品2-2、样品2-3、样品2-4；冷却，每个测试组培养管中加入50μL接种菌悬液接种，培养后，通过分光光度计测定待测液的吸光度，结果见表3。

步骤E3、计算样品中肌醇的含量。

根据表3中待测液的吸光度，从图2所示的标准曲线中查得待测液中肌醇的质量，根据稀释因子和称样量计算出每个测试组培养管中样品中肌醇的含量，结果见表3，再通过平均值计算出样品的肌醇含量为39.4 mg/100g，计算方法参考食品安全国家标准GB5413.25—2010《婴幼儿食品和乳品中肌醇的测定》。

样品1：m=2.0772g 、样品2: m=1.9850g，

为检验本方法的可靠性，在检测样品肌醇含量的同时进行以下操作步骤，通过加标回收率验证标准曲线的准确度。

加标回收率检验的具体步骤：称取样品，分别为加标样品1和加标样品2，加标样品1的质量为2.0710g，加标样品2的质量为2.2245g，加入0.4mg肌醇，经盐酸溶解、消化、PH值调节、定容、过滤后制得加标待测液。

准备8个加标组培养管，按表4向每个加标组培养管内加入不同体积的蒸馏水、加标待测液和肌醇测定培养基，其中4个加标组培养管中加入的加标待测液是由加标样品1制成的，分别标记为加标样品1-1、加标样品1-2、加标样品1-3、加标样品1-4，另4个加标组培养管中加入的加标待测液是由加标样品2制成的，分别标记为加标样品2-1、加标样品2-2、加标样品2-3、加标样品2-4；冷却，向每个加标组培养管中加入50μL接种菌悬液接种，培养后，通过分光光度计测定加标待测液的吸光度，其中S2的吸光度值以S1为参比液；S3～S10的吸光度值以S2为参比液，结果见表5。

 

根据表5中加标待测液的吸光度，从图2所示的标准曲线中查得加标待测液中肌醇的质量，根据稀释因子和称样量计算出每个测试组培养管中样品加标后的肌醇含量，结果见表5，再通过平均值计算出样品加标后的肌醇含量为56.1 mg/100g，计算方法参考食品安全国家标准GB5413.25—2010《婴幼儿食品和乳品中肌醇的测定》。

加标样品1：m=2.0710g 、加标样品2：m=2.2245g，

根据样品在加标前后的肌醇含量及样品中加入的肌醇量来计算加标回收率，计算方法如下：

样品加标量=加标量×2/(样品1质量+样品2质量)

加标回收率=（加标样品含量-样品含量）/(样品加标量×100)×100%

其中：加标量—加标回收率检验中加入肌醇的量，0.4mg。

样品1质量—加标回收率检验中称取样品1的量，2.0710g。

样品2质量—加标回收率检验中称取样品2的量，2.2245g。

加标样品含量—加标样品的肌醇含量，56.1  mg/100g。

样品含量—样品的肌醇含量，39.4 mg/100g。

计算得出加标回收率为89.7%。

本实施例通过相对偏差、重复性偏差及加标回收率对检测数据的可靠性进行综合评价，见表6。

由表6可见，当接种菌基液吸光度为0.4时，检测的加标回收率符合标准要求，样品及加标样品测定的重复性偏差低，符合精密度＜10%的要求，无样品机加标样品的肌醇含量数据＞±15%，数据可靠性高，测定结果准确。主要原因是经过二次饥饿培养后，葡萄汁酵母菌株体内积蓄的肌醇被该菌株自身的生命活动消耗了，不会对本次检测造成干扰，提高了检测数据的可靠性和准确度，达到肌醇检验要求。

实施例2

本实施例的检测方法与实施例1区别在于：

步骤C检测的接种菌基液吸光度为0.2，取吸光度为0.2的接种菌基液继续进行后续步骤D和步骤E。

步骤E1、制作的标准曲线见图3。

步骤E2、称取的2份样品，样品1的质量为2.0563g，样品2的质量为2.0095g，测定待测液的吸光度，结果见表7。

步骤E3、根据表7中待测液的吸光度，从图3所示的标准曲线中查得待测液中肌醇的浓度，结果见表7，计算出样品的肌醇含量为38.7mg/100g。

样品1：m=2.0563g 、样品2:2.0095g，

为检验检测的可靠性，同时通过加标回收率验证标准曲线的准确度，具体如下：

称取样品，分别为加标样品1和加标样品2，加标样品1的质量为2.0318g，加标样品2的质量为2.1051g，加入0.4mg肌醇，按上述“加标回收率检验的具体步骤”和表4进行操作，测定加标待测液的吸光度，结果见表8。

根据表8中加标待测液的吸光度和图3所示的标准曲线，计算出每个加标组培养管中样品加标后的肌醇含量，结果见表8，再通过平均值计算出样品加标后的肌醇含量为56.0 mg/100g。

加标样品1：m=2.0318g 、加标样品2：m=2.1051g，

参照实施例1的加标回收率的计算方法计算本次加标回收率。

其中：加标量—加标回收率检验中加入肌醇的量，0.4mg。

样品1质量—加标回收率检验中称取样品1的量，2.0318g。

样品2质量—加标回收率检验中称取样品2的量，2.1051g。

加标样品含量—加标样品的肌醇含量，56.0mg/100g。

样品含量—样品的肌醇含量，38.7 mg/100g。

计算得出加标回收率为89.5%。

本实施例通过相对偏差、重复性偏差及加标回收率对检测数据的可靠性进行综合评价，见表9。

由表9可见，当接种菌基液吸光度为0.2时，检测的加标回收率符合标准要求，样品及加标样品测定的重复性偏差低，符合精密度＜10%的要求，无样品机加标样品的肌醇含量数据＞±15%，数据可靠性高，测定结果准确。主要原因是经过饥饿培养后，葡萄汁酵母菌株体内积蓄的肌醇被该菌株自身的生命活动消耗了，不会对本次检测造成干扰，提高了检测数据的可靠性和准确度，达到肌醇检验要求。

实施例3

当经过实施例1的步骤A至步骤C后得到的接种菌基液的吸光度＜0.2时，吸光度＜0.2的接种菌基液经过步骤D和步骤E制得接种菌悬液，为满足接种和测试要求的量为前提，接种菌悬液的浓度＜0.4麦氏浊度，透光率＞80%，远远不能满足0.55-0.65的麦氏浊度范围，也达不到国标要求的透光率在60%-80%的范围，接种菌株的浓度达不到测试的要求，不能把样品中的肌醇充分利用，进而无法进行准确定量。因此，将吸光度＜0.2的接种菌基液丢弃。

本发明的对比实施例1

本对比实施例作为本发明的对比试验，其检测方法与实施例1区别在于：取步骤C检测的吸光度为0.6的接种菌基液进行后续步骤D和步骤E。

步骤E1、制作的标准曲线见图4。

步骤E2、称取的2份样品，样品1的质量为2.0772g，样品2的质量为2.0672g，测定待测液的吸光度，结果见表10。

步骤E3、根据表10中待测液的吸光度，从图4所示的标准曲线中查得待测液中肌醇的浓度，结果见表10，计算出样品的肌醇含量为51.5 mg/100g。

样品1：m=2.0772g 、样品2: m=2.0672g，

为检验检测的可靠性，同时通过加标回收率验证标准曲线的准确度，具体如下：

称取样品，分别为加标样品1和加标样品2，加标样品1的质量为2.0410g，加标样品2的质量为2.0150g，加入0.4mg肌醇，按上述“加标回收率检验的具体步骤”和表4进行操作，测定加标待测液的吸光度，结果见表11。

根据表11中加标待测液的吸光度和图4所示的标准曲线，计算出每个加标组培养管中样品加标后的肌醇含量，结果见表11，再通过平均值计算出样品加标后的肌醇含量为65.4 mg /100g。

样品1：m=2.0410g 、样品2: m=2.0150g，

参照实施例1的加标回收率的计算方法计算本次加标回收率。

其中：加标量—加标回收率检验中加入肌醇的量，0.4mg。

样品1质量—加标回收率检验中称取样品1的量，2.0410g。

样品2质量—加标回收率检验中称取样品2的量，2.0150g。

加标样品含量—加标样品的肌醇含量，65.4 mg/100g。

样品含量—样品的肌醇含量，51.5 mg/100g。

计算得出加标回收率为71%。

本对比实施例通过相对偏差、重复性偏差及加标回收率对检测数据的可靠性进行综合评价，见表12。

由表12可见，当接种菌基液吸光度为0.6时，检测的加标回收率低于标准要求，样品及加标样品测定的重复性偏差偏高，不符合精密度＜10%的要求，有1/4的样品肌醇含量数据＞±15%，有1/2的加标样品肌醇含量数据＞±15%，存在数据可靠性差，造成测定结果不准确。主要原因是葡萄汁酵母菌株体内积蓄一定量的肌醇，进而干扰葡萄汁酵母菌的正常生长，使标准曲线和样品管各点稳定性较差。

本发明的对比实施例2

本对比实施例的检测方法参考食品安全国家标准GB5413.25—2010《婴幼儿食品和乳品中肌醇的测定》中微生物法，制作的标准曲线见图5。

图5中标准曲线的相关系数明显低于由实施例1和实施例2的检测方法制作的标准曲线相关系数（如图2和图3所示），可见本发明的检测方法测定的结果准确性高。

Claims (2)

1.肌醇检验接种菌悬液制备改良方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤A、复苏肌醇接种菌，得到复苏菌种；

步骤B、制备接种菌基液；

将步骤A的复苏菌种接种至肌醇测定培养基液中继续培养，得到接种菌基液；

步骤C、对接种菌基液进行筛选；

使用分光光度计对步骤B的接种菌基液进行吸光度检测，取吸光度为0.2～0.4的接种菌基液进行后续步骤；

步骤D、制备接种菌悬液；

取步骤C的接种菌基液于无菌离心管中，离心去掉上清液，吸取沉淀部分至无菌离心管中，加入无菌盐水进行清洗，离心去掉上清液，重复清洗2～3次，再加入无菌盐水，震荡混匀制备成浓菌悬液；选取适量浓菌悬液加入到无菌盐水中，控制浓度在0.55～0.65麦氏浊度范围内,得到接种菌悬液；

步骤E、取步骤D的接种菌悬液制作肌醇标准曲线及检验肌醇含量。

2.根据权利要求1所述的肌醇检验接种菌悬液制备改良方法，其特征在于：在步骤C中，对吸光度大于0.4的接种菌基液进行步骤B，将步骤B中的复苏菌种改为接种菌基液。