CN108459051B - 一种自动记录大肠杆菌生长曲线的装置及应用方法 - Google Patents

Abstract

一种自动记录大肠杆菌生长曲线的装置及应用方法，属于分析测试技术领域，它包括检测池，所述检测池的上下左右前后六面皆有保温层，上顶面保温层有一排八个圆形孔，所述的圆形孔用于插入培养管，检测池内部温度由可调电子温控器控制，在检测池内的上中部和下中部分别固定有一排八个电极，两两处于一条垂直线上作为一个工作电极对，装有培养液的培养管从上顶面保温层上的圆形孔插入工作电极对；检测池底部设置有进气针，进气针正好位于培养管的正下方，进气针与检测池外的导气管相连通。本发明使用电容耦合非接触电导传感器采集数据，并采用新型算法进行结果分析，不用光电转换装置，仪器简易，成本低，且测定时不受样品溶液浊度、散光等影响，可以实现在线、实时监测，且操作简易。

Description

一种自动记录大肠杆菌生长曲线的装置及应用方法

技术领域

本发明属于分析测试技术领域，具体地涉及一种自动记录大肠杆菌生长曲线的装置及应用方法。

背景技术

对于生长动力学研究、分型、临床检验、生物基因工程、食品卫生检测等诸多科研、生产、管理与生活活动来讲，细菌生长曲线(生长速率)的测定都具有重要意义。

自十八世纪以来，人们发明了多种细菌生长曲线的测定方法，包括经典的菌落计数-时间作图法、酶联免疫法、电化学(伏安和阻抗)传感器法、电化学生物传感器法、浊度法、基因检测法(如PCR法)等。这些早期的方法中往往需要按照一定的时间间隔持续取样，操作繁琐、周期长、劳动强度大。

近年来，具有更理想功能的光学测定方法得到了广泛研究与应用。如Hall等开发了一种软件，可以通过测定培养液OD₆₀₀值来实现高通量测定细菌生长速率(B.G.Hall,H.Acar,A.Nandipati,M.Barlow,Growth Rates Made Easy,Mol.Biol.Evol.,2013,31,232)；McBirney等通过采用多波长散射光源降低了背景噪音及副产物对测定的不利影响，对传统光密度法(OD₆₀₀)进行了有效改善(S.E.McBirney,K.Trinh,A.Wong-Beringer,A.M.Armani,Using wavelength-normalized optical spectroscopy to improve theaccuracy of bacteria growth rate quantification,Proc.of SPIE,2017,10068,17)；Groisman等将高精密荧光显微镜和微流控装置相结合，开发了一种观测固定范围内细菌生长的方法(A.Groisman,C.Lobo,H.Cho,J.K.Campbell,Y.S.Dufour,A.M.Stevens,A.Levchenko,A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeastcells,Nat.Methods,2005,2,685)。这些基于光学原理的方法具有较好的灵敏度和较高的效率，但是受限于透光度较好的测定体系，而且往往需要贵重仪器和专业实验室，使用成本较高。

比较而言，基于电化学的方法不需要大型贵重仪器设备，近年来也得到了较快发展。Yang等研究了电导和pH法监测细菌培养过程的可行性，并进而建了快速测定细菌生长曲线方法(L.Yang,P.P.Banada,Y.Liu,A.K.Bhunia,R.Bashir,Conductivity and pH DualDetection of Growth Profile of Healthy and Stressed Listeria monocytogenes,Biotechnol.Bioeng.,2005,92,685)；Dweik等相继报道了系列基于免疫方式的间接电化学阻抗法测定细菌生长曲线(M.,R.C.Stringer,S.G.Dastider,Y.Wu,M.Almasri,S.Barizuddin,Specific and targeted detection of viable Escherichia coli O157:H7using a sensitive and reusable impedance biosensor with dose and timeresponse studies,Talanta,2012,94,84；Efficient and rapid detection ofSalmonella using microfluidic impedance based sensing,S.G.Dastider,S.Barizuddin,N.S.Yuksek,M.Dweik,M.F.Almasri,J.Sensors,2015,2015,293461)；Varshney等则发展了一种通过直接测定培养液阻抗值变化的方法来分析细菌的生长曲线(M.Varshney,Y.Li,Double interdigitated array microelectrode-based impedancebiosensor for detection of viable Escherichia coli O157:H7in growth medium,Talanta,2008,74,5185)。应用这些基于电化学技术的测定方法时，由于工作电极和待测液接触，因而不可避免产生钝化现象，影响连续测定的稳定性。因而，非接触传感电化学技术也得到了探索。如Ong等和Huang等分别利用远程查询谐振电路，将应答传感器固定在培养液中，通过实时测定培养液容器与应答传感器之间的电容变化趋势来推算出细菌的生长曲线(K.G.Ong,J.Wang,R.S.Singh,L.G.Bachas,C.A.Grimes,Monitoring of bacteriagrowth using a wireless,remote query resonant-circuit sensor:application toenvironmental sensing,Biosens.Bioelectron.,2001,16,305；S.Huang,P.Pang,X.Xiao,L.He,Q.Cai,C.A.Grimes,A wireless,remote-query sensor for real-time detectionof Escherichia coli O157:H7concentrations,Sensor.Actuat.B-Chem.,2008,131,489)。这种非接触电化学方法不用考虑电极污染与钝化现象，但仍需将应答电极置于待测液体内，其表面微观状况及洁净状态依然会产生改变，进而对测定的精确性造成影响。此外，对该电极的清理及固定工作要求较高，因而操作较为繁琐。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种自动记录大肠杆菌生长曲线的装置及应用方法。所述装置采用电容耦合非接触电导传感器(C⁴D)作为敏感元件测定培养液的电导变化值，结合一种简便算法来记录大肠杆菌的生长曲线，检测过程中电极与待测液没有接触，因而解决了电极污染与钝化的技术问题，提供了一种更加理想的细菌生长曲线测定方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种自动记录大肠杆菌生长曲线的装置，它包括检测池，所述检测池的上下左右前后六面皆有保温层,上顶面保温层有一排八个圆形孔,所述的圆形孔用于插入培养管,检测池内部温度由可调电子温控器控制,在检测池内的上中部和下中部分别固定有一排八个电极,两两处于一条垂直线上作为一个工作电极对,装有培养液的培养管从上顶面保温层上的圆形孔插入工作电极对；检测池底部设置有进气针，进气针正好位于培养管的正下方，进气针与检测池外的导气管相连通。

进一步，在检测池内的底部设置有风扇，用于维持检测池内空间温度的均匀性。

进一步，所述的电极为圆筒形，检测池上顶面保温层上的圆形孔与每对工作电极处于同一垂直线上，形成一个检测通道。

进一步，检测池上7个检测通道分别依次标记为通道1、通道2至通道7，另外一个通道标记为通道N。

进一步，装有对照样的培养管插入标记为N的检测通道中。

本发明还提供一种所述装置的使用方法，将接完待测大肠杆菌样品的LB培养液和阴性对照样培养液分别装入培养管，将所有培养管同时、分别插入检测池标记为1-7的检测通道中，而装有对照样的培养管插入标记为N的检测通道中，直至底部，进气针刺破培养管底部并进入培养管；使用C⁴D测定每个培养管内培养液的电导率值S_n、S₁、S₂、S₃……，根据设定算法：

记录每个检测通道内的电导值变化率(S_cx)，将之对培养时间(秒)作图，绘制出大肠杆菌生长曲线。

注：S_n——阴性对照样培养液电导率值；“x”代表第1、2、3……x个检测通道,S_cx——第x检测通道电导值变化率值。

进一步，检测池内恒温精度±0.2℃。

进一步，培养管为圆底硬质PVC管，外径3.0mm；壁厚0.4mm，管长12.0mm。

进一步，底部进气针为一次性锥形玻璃针，通入空气、氧气或者高纯氮气，气流速度2.0mL/min；进气间隔为10秒。

进一步，每检测一次更换一个进气针。

进一步，细菌培养液的电导率数值采集频率为10s/次。

本发明工作原理：

培养过程中，大肠杆菌通过新陈代谢作用将培养基中大分子营养物质(如蛋白质、脂肪、碳水化合物等)转化分解为导电性较好的小分子物质和离子，从而导致混合液电导率的增加，这种电导值变化率和细菌生长速率呈正相关，因此可以据之推测出细菌生长动力学曲线。

C⁴D检测时，两个筒状金属电极间隔一定距离套在绝缘性培养管的外壁，通过管壁与管内的被测培养液形成耦合电容，两电极间被测培养液构成等效电阻，这样将一定频率的交流信号施加在一个电极(称之为激励电极)上，在另一个电极(称之为接收电极)处即可检测到反映被测培养液电导特性的电信号。该方法中电极与被测培养液不接触，有效地解决了电极钝化、极化、腐烛等问题，并且具有结构简单、鲁棒性好等优点，因而可以用来记录细菌生长培养过程。

本发明仪器和方法与现有技术对比的有益效果：

(1)较之于采用光学技术，本发明得到的直接是电信号，不用光电转换装置，因而仪器简易，成本低。

(2)测定时不受样品溶液浊度、散光等影响，因而无需相关前处理。

(3)无需电极处理步骤，可以实现在线、实时监测，且操作简易。

(4)既可以用来测定有氧情况(通氧气或者空气)、也可以用来测定无氧情况(不通气或通氮气)；

(5)既可以测定静态培养曲线(不通气体)，也可以用来测定动态培养曲线(通气体搅拌)。

附图说明

图1本发明检测池结构示意图：1保温层，2培养管，3可调电子温控器，4风扇，5工作电极对，6导气管，7进气针。

图2:实施例1电导值变化率(S_cx)与培养时间(秒)的工作曲线；

图3:实施例2电导值变化率值S_cx与培养时间(秒)的工作曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的装配及使用作进一步的解释。但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1测定大肠杆菌O157:H7在LB液体培养基中的静态生长曲线

步骤一、一种自动记录大肠杆菌生长曲线的装置，如图1所示，它包括检测池，所述检测池的上下左右前后六面皆有保温层1,上顶面保温层有一排八个圆形孔,所述的圆形孔用于插入培养管2,检测池内部温度由可调电子温控器3控制,在检测池内的上中部和下中部分别固定有一排八个电极,两两处于一条垂直线上作为一个工作电极对5,装有培养液的培养管从上顶面保温层上的圆形孔插入工作电极对；检测池底部设置有进气针7，进气针正好位于培养管的正下方，进气针与检测池外的导气管6相连通。

在检测池内的底部设置有风扇4，用于维持检测池内空间温度的均匀性。

所述的电极为圆筒形，检测池上顶面保温层上的每个圆形孔与一个工作电极对处于同一垂直线上，形成一个检测通道。

检测池上7个检测通道分别依次标记为通道1、通道2至通道7，另外一个通道标记为通道N。装有对照样的培养管插入标记为N的检测通道中。

其中电极为八对铜管，内径3.0mm，外径3.6mm，长9.0mm，两两同轴固定，间隔40mm；风扇型号5010(深圳市圣超盟电子科技有限公司)；可调电子温控器选用XMT614型(西曼电子公司)；12.0mm长进气针为中孔石英玻璃，外直径2.6mm，内直径1.0mm，顶端锥部长3.0mm(锥度1:3)，插在聚四氟乙烯导气管上，工作时竖直立于电极正下方，更换时，先将导气管转动90°，然后取下已经用过的针，再插入洁净进气针。装配好检测池后，将电源线及信号线与八通道C⁴D主机(型号ER815，澳大利亚eDAQ公司)连接，然后连接便携式计算机(型号E470c，联想公司，内装C⁴D驱动程序TERA TERM(澳大利亚eDAQ公司))。培养管为圆底硬质PVC管，外径3.0mm；壁厚0.4mm，管长12.0mm。

步骤二、灭菌所有可能造成污染的器皿、工具、耗材、LB液体培养基(50mL)和固体培养基，然后置于无菌室内冷却至室温。

步骤三、将在冷冻管中保存的大肠杆菌O157:H7菌种活化，并将之接种到培养皿内的固体培养基上。

步骤四、恒温培箱中37℃培养8小时。

步骤五、取两个2.0mL离心管，分别加入1.0mL灭菌的LB液体培养基。

步骤六、从培养皿中挑取一个生长状态好、特征明显的单个菌落，接种到一个离心管中，混匀，然后转移到一个PVC管中，封口膜密封管口，做好标记。另外一个离心管中的培养基同样转移到一个PVC管中，密封，标记为阴性对照样。

步骤七、将检测池温度设为37℃，精度±0.2℃；在便携式计算机上启动C⁴D工作软件TERA TERM，将C⁴D激励电压设定为24V，激励频率设定为1.8MHz，信号采集周期为10s。

步骤八、将两个PVC培养管同时、分别插入检测池的两个检测通道内(其中对照样插入N通道)。

注：由于测定的是静态培养生长曲线，此时不开通气阀进气。

步骤九、点击“开始”，根据设定算法：

C⁴D连续、自动记录PVC培养管内培养液的电导值变化率值(数值无量纲),其中,S_n——阴性对照样培养液电导率值；“x”代表第1、2、3……x个检测通道,S_cx——第x检测通道电导值变化率值。

步骤十、40000s后，停止记录。将每个检测通道内的电导值变化率(S_cx)，对培养时间(秒)作图，绘制大肠杆菌生长曲线。得到典型曲线如图2所示。其中阳性曲线呈S型，分别对应大肠杆菌生长的调整期、指数期和稳定期；阴性则显示为一条直线。

实施例2测定LB液体培养基中不同接种量大肠杆菌O157:H7在供氧条件下的生长曲线

步骤一至步骤四同实施例1中步骤一至步骤四。

步骤五、取一个2.0mL离心管，加入1.0mL灭菌的LB液体培养基。从培养皿中挑取10个生长状态好、特征明显的单个菌落，接种到该离心管中，混匀，然后用相同的LB液体培养基稀释成7个梯度。

步骤六、另取八个2.0mL离心管，分别加入1.0mL灭菌的LB液体培养基。然后再分别向其中的7个加入0.1mL上述各梯度大肠杆菌菌悬液，剩下一个加入0.1mL超纯水作为阴性对照。混匀，然后分别转移到一个PVC管中，做好标记。

步骤七、将检测池温度设为37℃，精度±0.2℃；在便携式计算机上启动C⁴D工作软件TERA TERM，将C⁴D激励电压设定为24V，激励频率设定为1.8MHz，信号采集周期为10s。设定氧气气流速度2.0mL/min，进气间隔为10秒。

步骤八、将8个PVC培养管同时、分别插入检测池的不同检测通道内(其中对照样插入N通道)。

步骤九、点击“开始”，开通气阀，根据设定算法：

C⁴D开始连续、自动记录PVC培养管内培养液的电导值变化率值S_cx。其中S_n——阴性对照样培养液电导率值；S_x——被测样培养液电导率值，“x”代表第1、2、3……个检测通道。

步骤十、40000s后，停止记录。将1-7每个检测通道内培养液的电导值变化率值S_cx对培养时间(秒)作图，绘制出大肠杆菌生长曲线。得到典型曲线如图3所示。其中阳性曲线呈S型，分别对应大肠杆菌生长的调整期、指数期和稳定期；阴性则显示为一条直线。随着初始接种量的增加，调整期依次缩短。

Claims (8)

1.一种自动记录大肠杆菌生长曲线的装置，其特征在于它包括检测池，所述检测池的上下左右前后六面皆有保温层，上顶面保温层有一排八个圆形孔，所述的圆形孔用于插入培养管，检测池内部温度由可调电子温控器控制，在检测池内的上中部和下中部分别固定有一排八个电极，两两处于一条垂直线上作为一个工作电极对，装有培养液的培养管从上顶面保温层上的圆形孔插入工作电极对；检测池底部设置有进气针，进气针正好位于培养管的正下方，进气针与检测池外的导气管相连通。

2.根据权利要求1所述的一种自动记录大肠杆菌生长曲线的装置，其特征在于在检测池内的底部设置有风扇，用于维持检测池内空间温度的均匀性。

3.根据权利要求1所述的一种自动记录大肠杆菌生长曲线的装置，其特征在于所述的电极为圆筒形，检测池上顶面保温层上的圆形孔与每对工作电极处于同一垂直线上，形成一个检测通道。

4.根据权利要求1所述的一种自动记录大肠杆菌生长曲线的装置，其特征在于检测池上7个检测通道分别依次标记为通道1、通道2至通道7，另外一个通道标记为通道N。

5.根据权利要求1所述一种自动记录大肠杆菌生长曲线的装置，其特征在于培养管为圆底硬质PVC管，外径3.0 mm；壁厚0.4 mm，管长12.0 mm。

6.根据权利要求1所述装置的使用方法，其特征在于将接完待测大肠杆菌样品的LB培养液和阴性对照样培养液分别装入培养管，将所有待检测培养管分别、同时插入检测池标记为1-7的检测通道中，而装有对照样的培养管插入标记为N的检测通道中，直至底部，进气针刺破培养管底部并进入培养管；使用电容耦合非接触电导传感器测定每个培养管内培养液的电导率值S_n、S₁、S₂、S₃……，根据设定算法：

记录每个检测通道内的电导值变化率值，将之对培养时间作图，绘制大肠杆菌生长曲线；

注：S_n——阴性对照样培养液电导率值； “x” 代表第1、2、3……x个检测通道， S_cx——第x检测通道电导值变化率值。

7.根据权利要求6所述装置的使用方法，其特征在于底部进气针为一次性锥形玻璃针，通入空气、氧气或者高纯氮气，气流速度2.0 mL/min；进气间隔为10秒，每检测一次更换一个进气针。

8.根据权利要求6所述装置的使用方法，其特征在于细菌培养液的电导率数值采集频率为10 s/次。