CN115261440B

CN115261440B - 对虾体内可培养细菌总数检测功能液、系统及方法

Info

Publication number: CN115261440B
Application number: CN202211169185.XA
Authority: CN
Inventors: 曲克明; 张旭志; 赵俊; 杨倩倩; 张艳
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2022-09-26
Filing date: 2022-09-26
Publication date: 2023-01-17
Anticipated expiration: 2042-09-26
Also published as: CN115261440A

Abstract

本发明涉及一种对虾体内可培养细菌总数检测功能液、系统及方法，属于微生物检测领域，所述功能液的成分及终浓度为0.5%胰蛋白胨、0.3%酵母浸粉、0.1%葡萄糖、0.05%1‑丁基‑3‑甲基咪唑四氟硼酸盐和0.02%十二烷基硫酸铵。本发明还提供了一种对虾体内可培养细菌总数的检测系统，所述检测系统包括自动电子微生物生长曲线分析仪，其激励频率设定为30KHz，检测管、所述功能液和对检测管封口的装置。本发明还提供了一种检测对虾体内可培养细菌总数的方法，所述方法在检测对虾样品时无需匀浆和取样步骤，可实现对完整对虾生物体体内可培养细菌总数的检测，操作简便，效率高。

Description

对虾体内可培养细菌总数检测功能液、系统及方法

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种对虾体内可培养细菌总数检测功能液、系统及方法。

背景技术

测定对虾生物体内的可培养细菌总数对生理研究、病理研究和养殖生产都具有重要意义。经典方法是平板计数法，过程步骤包括对虾生物体体表活性细菌的去除、清洗、匀浆、取样、样品稀释、涂平板、恒温培养和人工/计数仪计数，最后根据稀释比例计算出该目标对虾体内的可培养细菌总数。该方法测定周期长(即使是不计算转移过程所需时间)、操作繁琐、需要专业技术人员和专业实验室，而且，需要匀浆机、灭菌锅等辅助装备和器材，因而无法实现现场快检。而且，在匀浆、取样过程中往往会因细菌在基质中的分布不均匀而造成误差。近年来随着分子生物学和遗传信息学的发展，基于核酸分析(如PCR扩增和DNA测序等)的方法也开始应用于对虾等生物体内可培养可培养细菌总数的测定。这些方法虽然不像平板计数法那样需要经过20小时左右的培养过程，但是必需生物体体表活性细菌的去除、清洗、匀浆、PMA孵育(以区别DNA是否来自活性细胞)、DNA提取、DNA纯化、上机扩增或者测序，最后采用理论数学模型计算出该目标对虾体内的可培养细菌总数。这些方法存在操作繁琐、需要专业技术人员和实验室、需要昂贵的仪器设备等局限性。而且，只能分析数据库中已有相关基因信息的细菌种类。所以，目前基于核酸分析的方法也难以应用推广。

对虾生理、生命、消化、病理等相关的科学研究及对虾养殖生产环境的病害预警等众多领域亟需能够简便地现场快检生物体内可培养细菌总数的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种对虾体内可培养细菌总数检测功能液、系统及方法。所述方法工作过程为：将清除了体表活性细菌的对虾样品直接装入预装载了专用功能液的一次性检测管中，活性细菌在该专用功能液中增殖生长。该生长过程采用全自动电子微生物生长曲线分析仪测定并依据内置的算法计算出对虾样品体内的可培养细菌总数。

本发明的详细步骤和原理如下：

一种对虾体内可培养细菌总数检测功能液，所述功能液的成分及终浓度为0.5％胰蛋白胨、0.3％酵母浸粉、0.1％葡萄糖、0.05％1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和0.02％十二烷基硫酸铵。其中胰蛋白胨、酵母浸粉和葡萄糖给细菌生长提供营养，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和十二烷基硫酸铵使对虾动物体腔道保持松弛畅通状态且不对细菌增殖生长产生影响。

一种对虾体内可培养细菌总数的检测系统，所述检测系统包括自动电子微生物生长曲线分析仪，其激励频率设定为30KHz，检测管、所述功能液和对检测管封口的装置。

本发明还提供利用所述系统进行检测的方法，所述方法具体如下：检测管中预装有功能液，将待测定的对虾生物体样品去除体表附着的可培养细菌，然后直接装入检测管中并封口，将检测管插入全自动电子微生物生长曲线分析仪中测定细菌的生长动力学曲线，结束后点击“细菌总数定量”功能键，读出被测定对虾动物体内的可培养细菌总数。

进一步，所述的检测管指无细菌污染的U型聚碳酸酯管。

进一步，所述的除去对虾体表附着的可培养细菌的方法为用体积比为75±1％的乙醇浸泡20-50s。

进一步，所述的封口措施为采用0.22μm水系针式滤器(直径10mm)塞住一次性检测管的端口，目的是使检测管内外空气能够交换，同时保证外界空气中的微生物不能进入管内。

进一步，所述的全自动电子微生物生长曲线分析仪为基于高效电容耦合非接触电导检测原理的微生物生长曲线分析仪。

进一步，所述的全自动电子微生物生长曲线分析仪的激励频率设定为30KHz。

进一步，所述的全自动电子微生物生长曲线分析仪中对应“细菌总数定量”功能键内置的计算公式为LogN(CFU)＝-0.0066C_t(min)+8.7280，其中N为可培养细菌总数，C_t为细菌生长曲线达到最大生长速率的半波时长，其值由该生长曲线分析仪在测定结束后自动判断并示出。

本发明检测的原理：在全自动电子微生物生长曲线分析仪检测通道内，温度恒定在36℃。这种情况下，由于胰蛋白胨、酵母浸粉和葡萄糖以及对虾体内有机和无机成分能够给细菌生长提供充足的营养，对虾体内的可培养细菌快速增殖、生长。细菌增殖、生长过程分解导电性较差的大分子物质(如胰蛋白胨、酵母浸粉和葡萄糖等)生成导电性较好的小分子物质(如氨基酸、无机离子等)，造成被检测体系导电能力的增强。这种增强的过程被基于电容耦合非接触电导检测原理的分析仪在激励频率为30KHz时实时测定并记录，同时将导电能力的变化值(即表观电导率值，单位为V)对时间作图，形成细菌的生长动力学曲线。该动力学曲线显示的参数(全自动电子微生物生长曲线分析仪可自动辨识)C_t为细菌生长曲线达到最大生长速率的半波时长，本测定情况下该值与对虾体内可培养细菌总数N具有确定的函数关系。因此，通过全自动电子微生物生长曲线分析仪测定Ct值即可计算出对虾样本中可培养细菌总数N。

本发明与现有技术对比的有益效果：

(1)在检测对虾样品时无需匀浆和取样步骤，可实现对完整对虾体内可培养细菌总数的检测，操作简便，效率高。

(2)对操作人员专业背景没有要求，便于推广。

(3)全部可培养细菌全部进入被检测管，没有遗失风险，因而准确性好。

(4)无需专业实验室和其它辅助的装备和器材，可以在现场进行测定。

附图说明

图1为采用全自动电子微生物生长曲线分析仪测定的对虾体内细菌生长曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的内容作进一步的解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1

选用不同质量分数的胰蛋白胨、酵母浸粉和葡萄糖水溶液作为营养物质组合，采用自动电子微生物生长曲线分析仪测定已知接种数量的细菌，其结果如表1所示，结果表明最优的组合为0.5％胰蛋白胨、0.3％酵母浸粉和0.1％葡萄糖。

表1胰蛋白胨、酵母浸粉和葡萄糖正交实验与结果

序号	胰蛋白胨(％)	酵母浸粉(％)	葡萄糖(％)	接种细菌检出率(％)
					1	0.4	0.01	0.03	83
2	0.5	0.02	0.04	83
					3	0.6	0.03	0.05	85
4	0.4	0.04	0.06	81
					5	0.5	0.05	0.07	76
6	0.6	0.1	0.08	88
					7	0.4	0.2	0.09	83
8	0.5	0.3	0.1	99
					9	0.6	0.4	0.15	89
10	0.4	0.01	0.02	80
					11	0.5	0.02	0.15	71
12	0.6	0.03	0.1	70
					13	0.4	0.04	0.09	78
14	0.5	0.05	0.08	76
					15	0.6	0.1	0.07	79
16	0.4	0.2	0.06	83
					17	0.5	0.3	0.05	88
18	0.6	0.4	0.04	82

实施例2

选用不同质量分数的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和十二烷基硫酸铵组合使对虾动物体腔道保持松弛畅通状态，以便能够培养并测定生物体内可培养细菌总数。向0.5％胰蛋白胨、0.3％酵母浸粉和0.1％葡萄糖的水溶液中分别加入不同质量1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和十二烷基硫酸铵，制成系列含有不同质量分数1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和十二烷基硫酸铵的功能液。采用自动电子微生物生长曲线分析仪测定同一批次相同规格的对虾体内的可培养细菌，其结果如表2所示，最优的组合为0.05％1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和0.02％十二烷基硫酸铵。

表2 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和十二烷基硫酸铵正交实验与结果

序号	1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(％)	十二烷基硫酸铵(％)	细菌检出量(CFU)
				1	0.001	0.001	4120
2	0.002	0.002	5000
				3	0.003	0.003	5080
4	0.004	0.001	5450
				5	0.005	0.002	5660
6	0.006	0.003	4840
				7	0.007	0.001	4290
8	0.008	0.002	4850
				9	0.008	0.003	5060
10	0.007	0.001	4880
				11	0.006	0.002	5300
12	0.005	0.003	5300
				13	0.004	0.001	4650
14	0.003	0.002	4900
				15	0.002	0.003	4610
16	0.001	0.001	4120

实施例3现场测定黄海水产公司养殖车间南美白对虾体内可培养细菌总数

步骤一、在养殖池边将全自动电子微生物生长曲线分析仪(ER832型，澳大利亚eDAQ公司产品)和预装载了相应工作软件的笔记本电脑连接好。开机，设置激励频率为30KHz，培养温度为36℃。预热10分钟。待用。

步骤二、在养殖池中取对虾1只，用不锈钢镊子夹住，在75％的酒精中浸泡30秒。

步骤三、从酒精中取出，用无菌水反复冲洗该对虾以去除酒精残留。

步骤四、将该对虾样品装入U型聚碳酸酯一次性检测管(青岛锐研实验仪器有限责任公司产品，内径10mm，外径11mm，管长160mm)。该管内预装载有5mL成分为0.5％胰蛋白胨、0.3％酵母浸粉、0.1％葡萄糖、0.05％1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和0.02％十二烷基硫酸铵的专用功能液。

步骤五、采用0.22mμ的无菌针式滤器(直径10mm，默克密理博公司产品)塞住一次性检测管的管口。

步骤六、将该装入对虾样品且封好管口的一次性检测管插入全自动电子微生物生长曲线分析仪。设定好参数的该分析仪即开始在线测定检测管内被测定体系的导电能力的变化，并实时将导电能力的变化值(即表观电导率值，单位为V)对时间作图，形成细菌的生长动力学曲线。测定6小时后，所得细菌的生长动力学曲线如图1所示。

步骤七、生长曲线测定完成后，显示C_t＝251min。在笔记本电脑工作界面点击“细菌总数定量”功能键，电脑基于内置的计算公式Log N(CFU)＝-0.0066C_t(min)+8.7280报告被测定的对虾样品体内可培养细菌总数为1.2×10⁷CFU。

实施例4对比分析本发明技术的可靠性和高效性

步骤一、同实施例3步骤一。

步骤二、在海阳市黄海水产公司养殖池中取相同规格的南美白对虾20只，用计数电子秤(型号BCS-15-SN，感量0.1g，苏州佰伦斯公司产品)测定每只对虾的质量，结果显示为26.2±0.6g。说明样品具有较好的均匀性。

步骤三、将所有对虾样品在75％的酒精中浸泡30秒，然后取出，再用无菌水分别洗去每只对虾样品体表的酒精残留。

步骤四、将上述处理好的对虾样品随机分成A、B两组，每组10只。A组(总质量263.3g)样品每只对虾装进一个U型聚碳酸酯一次性检测管(青岛锐研实验仪器有限责任公司产品，内径10mm，外径11mm，管长160mm)中，并采用0.22mμ的无菌针式滤器(直径10mm，默克密理博公司产品)塞住每一个一次性检测管的管口。该管内预装载有5mL成分为0.5％胰蛋白胨、0.3％酵母浸粉、0.1％葡萄糖、0.05％1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和0.02％十二烷基硫酸铵的专用功能液。B组的10只装入一个50mL无菌离心管中，放在冰盒里(盒内温度4～8℃)带到青岛专业微生物监测实验室。

步骤五、采用实施例3中步骤六和步骤七完全相同的方法测定A组中10只对虾样品体内可培养细菌总数，结果为1.7±0.8×10⁷CFU/只样品。A组中10只对虾样品体内可培养细菌总数的测定共耗时约7小时。

步骤六、按照国家标准《食品微生物学检验菌落总数测定(GB4789.2—2016)》方法测定B组样品(总质量263.2g)中的可培养细菌总数。

6.1将10只对虾在无菌均质杯内8000r/min均质2min，然后称取25g样品置放入盛有225mL生理盐水的无菌均质袋中，用JX-05型拍击式均质器(拓赫机电科技(上海)有限公司产品)拍打2min，制成1∶10的样品匀液。

6.2用1mL无菌微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL生理盐水的无菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。

6.3按6.2操作，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸头。

6.4选择3个适宜稀释度的样品匀液，在进10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做三个平皿。同时，分别吸取1mL空白生理盐水加入三个无菌平皿内作空白对照。

6.5及时将20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

6.6待琼脂凝固后，将平板翻转，36±1℃培养48±2小时。

6.7肉眼观察并记录计数琼脂培养基平板上的菌落数量。

6.8选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数(每个稀释度的菌落数采用三个平板的平均数)。三个平板上的菌斑分别为32CFU、68CFU和56CFU，即50±18CFU。

6.9将平均值(52CFU)乘以相应稀释倍数，作为每g样品可培养细菌菌落总数的结果，其值为5.2×10⁵CFU/g。由于平均每只对虾的质量为26.32g，因此B组中每只对虾样品体内的可培养细菌总数平均约为1.4×10⁷CFU(5.2×10⁵CFU/g×26.32g)。

6.10不计算从养殖池到专业实验室转移对虾样品所需时间，测定B组中每只对虾样品体内可培养细菌总数的实验共耗时约52小时。

步骤七、数据对比分析。1)采用本发明技术测定每只对虾样品体内可培养细菌总数的平均值1.7±0.8×10⁷CFU，采用国家标准方法测定的数据为1.4×10⁷CFU。说明本发明技术具有较好的可靠性。2)采用本发明技术测定对虾样品体内可培养细菌的总数耗时约7小时，较国家标准方法节约了45小时，表明本发明技术具有更高的效率。

Claims

1.一种对虾体内可培养细菌总数检测功能液，其特征在于，所述功能液的成分及终浓度为0.5％胰蛋白胨、0.3％酵母浸粉、0.1％葡萄糖、0.05％1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和0.02％十二烷基硫酸铵，所述百分比均为质量分数。

2.一种对虾体内可培养细菌总数的检测系统，其特征在于，所述检测系统包括自动电子微生物生长曲线分析仪，其激励频率设定为30KHz，检测管、权利要求1所述功能液和对检测管封口的装置。

3.利用权利要求2所述系统进行检测的方法，所述方法具体如下：检测管中预装有功能液，将待测定的对虾样品去除体表附着的可培养细菌后，装入检测管中并封口，将检测管插入全自动电子微生物生长曲线分析仪中测定细菌的生长动力学曲线，结束后点击“细菌总数定量”功能键，读出被测定对虾体内的可培养细菌总数。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的检测管指无细菌污染的U型聚碳酸酯管。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的除去对虾体表附着的可培养细菌的方法为用体积比为75±1％乙醇浸泡20-50秒。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的封口措施为采用0.22μm水系针式滤器塞住一次性检测管的端口。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的全自动电子微生物生长曲线分析仪为基于高效电容耦合非接触电导检测原理的微生物生长曲线分析仪。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的全自动电子微生物生长曲线分析仪的激励频率设定为30KHz。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的全自动电子微生物生长曲线分析仪中对应“细菌总数定量”功能键内置的计算公式为Log N＝-0.0066C_t+8.7280，其中N为可培养细菌总数，C_t为细菌生长曲线达到最大生长速率的半波时长，单位为分钟，其值由该生长曲线分析仪在测定结束后自动判断并示出。