CN111855753B - 一种水体中副溶血弧菌的现场检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水体中副溶血弧菌的现场检测试剂盒和检测方法，属于水质检测领域，所述试剂盒包括溴化N‑十二烷基异喹啉试剂、副溶血弧菌烈性噬菌体悬液和不同浓度梯度的副溶血弧菌菌悬液。利用所述试剂盒进行检测水体中副溶血弧菌的方法为将待检测水样装在检测管中，加入专用烈性噬菌体，能够特异性、快速地裂解其中的副溶血弧菌，生成多种小分子和离子，从而引起σ数值增加。由于σ增量与给检测管所装水体中副溶血弧菌的数量成正比，所以测定Δσ即可计算出待测水体样品中副溶血弧菌的定量信息。该方法可以在养殖现场快速确定含有多种微生物的复杂水体中副溶血弧菌的量，为渔业生产管理提供高时效性、准确的支撑数据。

Description

一种水体中副溶血弧菌的现场检测试剂盒和检测方法

技术领域：

本发明属于水质检测领域，具体地涉及一种水体中副溶血弧菌的现场检测试剂盒和检测方法。

背景技术：

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)属于革兰氏阴性菌，嗜盐，广泛存在于渔业环境和水生生物体中，检测水体中副溶血弧菌的常用方法主要是基于富集培养-分离培养-生化反应的国家标准(GB4789.7-2013)方法。该方法虽然是金标准，但操作复杂、劳动强度大、周期长，精确性严重依赖操作者的专业水平，因而无法实现现场、快速、精确测定。近年来，基于基因检测的分子生物学方法(黄梦诗，杨倩倩，张艳，谷阳光，赵俊，张旭志，丁东生，曲克明.海水中副溶血弧菌的可视化LAMP快速检测方法.中国渔业质量与标准，2017,7(6),58-65)和免疫学检测方法(李欣彤.上海地区海产品中副溶血弧菌的分离鉴定、分子分型及tdh基因的克隆表达[硕士毕业论文]；南京农业大学,2013)得到了快速发展，明显提高了副溶血弧菌的检测效率。然而，新方法囿于贵重仪器和专业分析场所，目前仍然不能实现副溶血弧菌的现场、快速、精确测定。因而尚不能为水产养殖等生产活动提供有效预警数据。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种水体中副溶血弧菌的现场检测试剂盒和检测方法，其工作原理是：待检测水样装在检测管中，具有确定的电容耦合非接触电导(σ)数值；加入副溶血弧菌烈性噬菌体，能够特异性、快速地裂解其中的副溶血弧菌，生成多种小分子和离子，从而引起σ数值增加。由于σ增量(Δσ)与给检测管内所装水体中副溶血弧菌的数量成正比，所以通过采用化学和生物过程在线监测系统测定Δσ即可计算出待测水体样品中副溶血弧菌的定量信息。该方法可以在现场快速确定含有多种微生物的复杂水体中副溶血弧菌的量，为渔业生产管理等活动提供高时效性、准确的支撑数据。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种水体中副溶血弧菌的现场检测试剂盒，所述试剂盒包括溴化N-十二烷基异喹啉试剂、副溶血弧菌烈性噬菌体悬液和浓度梯度为10¹¹、10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷、10⁶和10⁵CFU/ml副溶血弧菌的菌悬液。

本发明还提供利用上述试剂盒检测水体中副溶血弧菌的方法，包括以下步骤：

1)取待测水体，平均分成两份，分别装入S_A和S_B两个离心管；其中S_A加入溴化N-十二烷基异喹啉，在便携式超声波仪中超声5min，超声功率30W，使水体中所有种类的细菌完全裂解，制成阴性对照液S_阴；

2)取一定量S_阴液，加入已知浓度的副溶血弧菌菌悬液，制成含有10⁶CFU/ml副溶血弧菌的阳性对照液S_阳；

3)取相同体积的S_B(即待测样S_测)、S_阴和阳S_阳，分别装入检测管T_测、T_阴和T_阳,然后再分别加入等量副溶血弧菌烈性噬菌体悬液，混匀；

4)将检测管T_测、T_阴和T_阳同时、分别放入化学和生物过程在线监测系统的三个检测通道中，分别记录三个检测管中被测液的初始电容耦合非接触电导响应值σ_测初、σ_阴初和σ_阳初；静止30min后，再分别记录三个检测管中被测液的终点电容耦合非接触电导响应值σ_测终、σ_阴终和σ_阳终。

5)根据下面公式分别计算S_测、S_阴和S_阳的电容耦合非接触电导响应变化值：

Δσ_测＝σ_测终-σ_测初

Δσ_阴＝σ_阴终-σ_阴初

Δσ_阳＝σ_阳终-σ_阳初

6)将Δσ_测数值带入工作曲线函数关系式获得待测水体中副溶血弧菌的量(浓度)；根据σ_阴≤2μS/cm和Δσ_阳≥10μS/cm判定实验没有假阳性和假阴性。

进一步，工作曲线的制定步骤如下：

1)按照制备阳性对照样品S_阳的相同方法，分别制备含有10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵和10⁴CFU/ml副溶血弧菌的菌悬液S_阳10、S_阳9、S_阳8、S_阳7、S_阳6、S_阳5和S_阳4；

2)取相同体积S_阳10、S_阳9、S_阳8、S_阳7、S_阳6、S_阳5、S_阳4和阴性对照S_阴分别装入检测管T_阳10、T_阳9、T_阳8、T_阳7、T_阳6、T_阳5、T_阳4和T_阴,然后再分别加入等量副溶血弧菌烈性噬菌体VB_VpS_PG08的悬液，混匀；

3)将检测管T_阳10、T_阳9、T_阳8、T_阳7、T_阳6、T_阳5、T_阳4和T_阴共8个检测管同时、分别插入化学和生物过程在线监测系统的8个检测通道中，分别记录被测液的初始电容耦合非接触电导响应值σ_阳10初、σ_阳9初、σ_阳8初、σ_阳7初、σ_阳6初、σ_阳5初、σ_阳4初和σ_阴初；静止30min后，再分别记录8个检测管中被测液的终点电容耦合非接触电导响应值σ_阳10终、σ_阳9终、σ_阳8终、σ_阳7终、σ_阳6终、σ_阳5终、σ_阳4终和σ_阴终；

4)根据公式Δσ＝σ_终-σ_初，分别计算S_阳10、S_阳9、S_阳8、S_阳7、S_阳6、S_阳5、和S_阳4的电容耦合非接触电导初始响应值σ_初和终点响应值σ_终之间的差值，并将所得数据对logC(副溶血弧菌的浓度)作图，得到Δσ与logC之间的函数关系；同时，根据Δσ_阴≤2μS/cm判定实验没有假阳性结果。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1、本发明自动化程度较高，结果准确，重现性好，但只需要便携式仪器设备，可以实现现场测定。

2、无需分离、培养等步骤，应用本发明可以一步测定养殖水体中副溶血弧菌的定性和定量信息。

3、本发明具有较高的检测效率——从采集样品到获得结果仅需不到2h(单个样品)，而且可以同时测定多达数十个样品。

4、本发明操作简单易学，无须特殊培训，因而易于推广。

附图说明：

图1：电导率响应差值Δσ与logC(副溶血弧菌的浓度)之间的关系。

具体实施方式：

下面通过实施例来详细叙述和解释本发明的技术方法，本实施例不对本发明内容作任何形式的限制。

实施例1：青岛富源工厂化养殖用水水体中副溶血弧菌的现场快速检测。所述方法的目的为判断水体中是否含有副溶血弧菌及其浓度，以保证渔业用水安全，为非诊断目的。

一种水体中副溶血弧菌的现场快检试剂盒，所述试剂盒包括溴化N-十二烷基异喹啉试剂10ml、副溶血弧菌烈性噬菌体VB_VpS_PG08(购自青岛诺安百特生物技术有限公司)的悬液10ml和浓度梯度为10¹¹、10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷、10⁶和10⁵CFU/ml副溶血弧菌的菌悬液各10ml；上述试剂位于冷藏室中，温度保持在3-6℃，25ml离心管12个、单通道手动移液枪3支(5ml、1ml和0.1ml规格各1支)和相应一次性吸头各50个。

利用上述试剂盒，对水体进行检测，具体步骤如下：

步骤一、将便携式16通道化学和生物过程在线监测系统(型号C&B 16-A，青岛谷峰实验仪器有限公司产品)和便携式超声波清洗仪(型号P-KC30，30W，青岛锐研实验仪器有限公司产品)在对虾工厂化养殖车间的干燥、平整处放置妥当。将笔记本电脑(ThinkBook 14，联想公司产品)与化学和生物过程在线监测系统连接，开机，点击化学和生物过程在线监测系统的专用软件TER-GO，在用户界面设置测定电容耦合非接触电导数据的参数——输入频率为2.6MHz，输入电压为16V，记录次数为2次，记录间隔为30min。

步骤二、采用移液枪取50ml待测水体，平均分成两份，分别装入S_A和S_B两个25ml离心管中。

步骤三、打开便携式专用试剂箱(型号KJ-16，青岛谷峰实验仪器有限公司产品)，取出装有0.1mol/l溴化N-十二烷基异喹啉溶液的试剂瓶，采用移液枪向S_A离心管中加入100μl溴化N-十二烷基异喹啉溶液。

步骤四、旋紧S_A离心管密封盖，震荡，摇匀混合液。然后将该管放入便携式超声波仪中超声5min，使水体中所有种类的细菌完全裂解，制成不含有任何完整细菌的S_A0液。该液体可以作为阴性对照液S_阴。

步骤五、采用移液枪分别取S_A0液2ml放入另外7个离心管中(记作S_阳10、S_阳9、S_阳8、S_阳7、S_阳6、S_阳5和S_阳4)。从便携式专用试剂箱中取出冰盒保藏的(3-6℃)副溶血弧菌菌悬液(浓度分别为2×10¹¹CFU/ml、2×10¹⁰CFU/ml、2×10⁹CFU/ml、2×10⁸CFU/ml、2×10⁷CFU/ml、2×10⁶CFU/ml和2×10⁵CFU/ml)，采用移液枪向7个离心管中分别转入100μl不同浓度的副溶血弧菌菌悬液，使S_阳10、S_阳9、S_阳8、S_阳7、S_阳6、S_阳5和S_阳4的副溶血弧菌浓度分别为1×10¹⁰CFU/ml、1×10⁹CFU/ml、1×10⁸CFU/ml、1×10⁷CFU/ml、1×10⁶CFU/ml、1×10⁵CFU/ml和1×10⁴CFU/ml。

步骤六、制定工作曲线：

1)取S_阳10、S_阳9、S_阳8、S_阳7、S_阳6、S_阳5、S_阳4和S_阴各1ml分别装入一次性薄壁玻璃检测管T_阳10、T_阳9、T_阳8、T_阳7、T_阳6、T_阳5、T_阳4和T_阴中。

2)从专用试剂盒中取出冰盒保藏的(3-6℃)副溶血弧菌烈性噬菌体VB_VpS_PG08(效价2.2×10⁹PFU/ml)悬液，采用移液枪向上述8个检测管中分别移入20μl该噬菌体悬液，橡胶帽封口，上下颠倒、震荡五六次混匀。

3)将T_阳10、T_阳9、T_阳8、T_阳7、T_阳6、T_阳5、T_阳4和T_阴共8个检测管同时、分别插入化学和生物过程在线监测系统的8个工作通道中，按照设定参数记录被测液的电容耦合非接触电导初始响应值σ_初和终点响应值σ_终。

4)S_阳10、S_阳9、S_阳8、S_阳7、S_阳6、S_阳5、S_阳4和S_阴的初始电容耦合非接触电导响应值σ_初分别为4420、4412、4395、4459、4461、4437、4433和4446μS/cm；静止30min后的终点响应值σ_终分别为4462、4451、4428、4485、4482、4451、4437和4447μS/cm。

5)根据公式Δσ＝σ_终-σ_初，分别计算S_阳10、S_阳9、S_阳8、S_阳7、S_阳6、S_阳5、和S_阳4的初始电容耦合非接触电导响应值和终点响应值之间的差值分别为42、39、33、26、21、14和4μS/cm。将所得Δσ数值对logC(副溶血弧菌的浓度)作图，得到在1×10⁹CFU/ml-1×10⁵CFU/ml浓度范围内，logC与Δσ之间的函数关系为logC＝0.161Δσ+2.7186(相关系数R²＝0.9979,如图1所示)。因此，在本浓度范围内logC与Δσ具有良好的线性关系，该函数式可以作为工作曲线。此外，由于Δσ_阴≤2μS/cm，本次测定没有假阳性结果。

步骤七、样品上机测定：

1)分别取1ml待测样品S_B、S_A0(即S_阴)和S_阳6装入一次性玻璃检测管T_B、T_阴和T_阳，采用移液枪各移入20μl噬菌体悬液，橡胶帽封口，上下颠倒五六次混匀。

2)按照制定工作曲线的步骤记录每个检测管的初始电容耦合非接触电导响应值σ_初和终点响应值σ_终。

步骤八、根据公式

Δσ_B＝σ_B终-σ_B初

Δσ_A0＝σ_A0终-σ_A0初

Δσ_阳6＝σ_阳6终-σ_阳初

计算得到待测样品S_B、阴性对照S_A0和阳性对照S_阳6的电容耦合非接触电导响应差值Δσ分别为29、1和21μS/cm。将Δσ_B＝29μS/cm带入Δσ与logC之间的函数关系logC＝0.161Δσ+2.7186，计算得到该被检测水体中副溶血弧菌的浓度为2.4×10⁷CFU/ml。该结果在1×10⁹CFU/ml-1×10⁵CFU/ml浓度范围内，即处于工作曲线的线性区间内，因而数据可信。

注：由于阴性对照Δσ_A0和阳性对照Δσ_阳6的数值分别为1和21μS/cm，根据质控标准要求Δσ_阴≤2μS/cm和Δσ_阳≥10μS/cm，判定本检测无假阳性和假阴性。

Claims (2)

1.利用试剂盒检测水体中副溶血弧菌的方法，其特征在于所述试剂盒包括溴化N-十二烷基异喹啉试剂、副溶血弧菌烈性噬菌体悬液和浓度梯度为10¹¹、10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷、10⁶和10⁵CFU/ml副溶血弧菌的菌悬液；

所述方法包括以下步骤：

1)取待测水体，平均分成两份，分别装入S_A和S_B两个离心管；其中，S_B中的水体即为待测样S_测，S_A加入溴化N-十二烷基异喹啉，在便携式超声波仪中超声5min，超声功率30W，使水体中所有种类的细菌完全裂解，制成阴性对照液S_阴；

2)取一定量S_阴液，加入已知浓度的副溶血弧菌菌悬液，制成含有10⁶CFU/ml副溶血弧菌的阳性对照液S_阳；

3)取相同体积的S_测、S_阴和S_阳，分别装入检测管T_测、T_阴和T_阳,然后再分别加入等量副溶血弧菌烈性噬菌体悬液，混匀；

4)将检测管T_测、T_阴和T_阳同时、分别放入化学和生物过程在线监测系统的三个检测通道中，分别记录三个检测管中被测液的初始电容耦合非接触电导响应值σ_测初、σ_阴初和σ_阳初；静止30min后，再分别记录三个检测管中被测液的终点电容耦合非接触电导响应值σ_测终、σ_阴终和σ_阳终；

5)根据下面公式分别计算S_测、S_阴和S_阳的电容耦合非接触电导响应变化值：

Δσ_测＝σ_测终-σ_测初

Δσ_阴＝σ_阴终-σ_阴初

Δσ_阳＝σ_阳终-σ_阳初

6)将Δσ_测数值带入工作曲线函数关系式获得待测水体中副溶血弧菌的浓度；根据σ_阴≤2μS/cm和Δσ_阳≥10μS/cm判定实验没有假阳性和假阴性。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤6)所述工作曲线的制定步骤如下：

1)按照制备阳性对照样品S_阳的相同方法，分别制备含有10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵和10⁴CFU/ml副溶血弧菌的菌悬液S_阳10、S_阳9、S_阳8、S_阳7、S_阳6、S_阳5和S_阳4；

2)取相同体积S_阳10、S_阳9、S_阳8、S_阳7、S_阳6、S_阳5、S_阳4和阴性对照S_阴分别装入检测管T_阳10、T_阳9、T_阳8、T_阳7、T_阳6、T_阳5、T_阳4和T_阴,然后再分别加入等量副溶血弧菌烈性噬菌体悬液，混匀；

3)将检测管T_阳10、T_阳9、T_阳8、T_阳7、T_阳6、T_阳5、T_阳4和T_阴共8个检测管同时、分别插入化学和生物过程在线监测系统的8个检测通道中，分别记录被测液的初始电容耦合非接触电导响应值σ_阳10初、σ_阳9初、σ_阳8初、σ_阳7初、σ_阳6初、σ_阳5初、σ_阳4初和σ_阴初；静止30min后，再分别记录8个检测管中被测液的终点电容耦合非接触电导响应值σ_阳10终、σ_阳9终、σ_阳8终、σ_阳7终、σ_阳6终、σ_阳5终、σ_阳4终和σ_阴终；

4)根据公式Δσ＝σ_终-σ_初，分别计算S_阳10、S_阳9、S_阳8、S_阳7、S_阳6、S_阳5、和S_阳4的电容耦合非接触电导初始响应值σ_初和终点响应值σ_终之间的差值，并将所得数据对副溶血弧菌的浓度logC作图，得到Δσ与logC之间的函数关系；同时，根据Δσ_阴≤2μS/cm判定实验没有假阳性结果。

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