CN104198558B

CN104198558B - 一种新型大肠杆菌电化学传感器的制备方法

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Publication number: CN104198558B
Application number: CN201410457945.6A
Authority: CN
Inventors: 许世超; 郑晓玥; 张晨; 赵丽明; 张雪平; 李润兰
Original assignee: Tianjin Polytechnic University
Current assignee: Tianjin Polytechnic University
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2014-09-05
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2034-09-05
Also published as: CN104198558A

Abstract

本发明解决所述大肠杆菌电化学传感器的技术方案是，通过在玻碳电极表面的羧基化和生物偶联技术将大肠杆菌连接在玻碳电极表面，制备大肠杆菌电化学传感器。以玻碳电极为基底，先在其表面进行氢氧化钠蚀刻使其羧基化，然后将大肠杆菌偶联在电极表面，其中偶联剂为1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)。其特征在于，获得高灵敏度的大肠杆菌电化学传感器。这种传感器稳定性好，检测灵敏度高，准确性好，其检测效率明显优于传统检测方法。该制备方法包括：1.大肠杆菌段化学传感器的制备；2.传感器电化学信号检测。该传感器制备方法简便，检测灵敏度高，准确性强，检测速度快，便于实际应用。

Description

一种新型大肠杆菌电化学传感器的制备方法

技术领域

本发明涉及大肠杆菌检测技术，具体为一种大肠杆菌电化学传感器的制备，并基于电信号的改变进行大肠杆菌快速检测。该传感器将电化学技术与生物技术有机结合，通过循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)的峰信号来检测液体环境中的大肠杆菌。

背景技术

大肠杆菌是人和动物肠道中的常居菌，常随人及动物粪便一块排出，广泛传播于自然环境中，对水资源造成污染。大部分大肠杆菌没有致病性，但是部分能产生肠毒素，导致人体肠胃炎等疾病。特别是O157型的大肠杆菌会引起腹泻，出血性大肠炎和溶血尿毒症等疾病。当它入侵到肠道外的其他组织器官时，会引起尿道炎，膀肤炎，阑尾炎等，对于免疫力下降的病人还可引起败血症。我国1997年在全国建立了大肠杆菌检测网络，卫生部在2002年制定了大肠杆菌O157：H7感染性腹泻应急处理方案。这些措施的实施对人体健康和经济发展具有十分重要的意义，而对大肠杆菌有效和快速的检测是这些工作得以顺利进行的前提和关键。

大肠杆菌的传统检测方法主要包括滤膜法和多管发酵法。滤膜法是目前国际上普遍采用的细菌检测技术，众多国家已接受并同意采用其来检测食物和水的卫生质量。这种方法是用经灭菌的孔径为0.45μm的微孔滤膜制成的过滤器过滤水样，从而将水样所含的细菌截留在滤膜上，再将滤膜放在品红硫酸钠的培养基上，恒温培养24h并控制温度为37℃。由于大肠菌群能发酵乳糖，所以会在滤膜上长出紫红色并具有一定金属光泽的菌落。通过计数滤膜上长出的明显大肠菌群菌落的数目，就可以计算得出每升水样中所含的大肠菌群数。如果需要对可疑菌落进行进一步的鉴定，可采用涂片染色镜检的方法初步检测，再将其接种到乳糖发酵管做进一步检测。但是，这种方法在检测浑浊度高，非大肠杆菌群的密度较大的水样时，局限性较大，检测精度和准确度均不高。多管发酵法从上世纪90年代开始逐渐被用来计数水体中肠道杆菌的数量，它主要根据大肠菌群细菌能够发酵乳糖，产生酸和气体，无芽孢，呈杆状，是革兰氏阴性菌等相关特性，经过三个步骤来检测样品中所含的大肠菌群总数。多管发酵法采用最有可能数来表示实验结果。它是依据统计学理论，估算被测样品中所含大肠杆菌的浓度及卫生质量的一种方法。然而，多管发酵法的在实际检测过程中受到诸多因素的影响，尤其是对样品进行假定的阶段，比如培养基本身对大肠菌群的抑制作用，浓度较高的非大肠菌群均会对其产生干扰。此外，采用多管发酵法对一个样品进行检测时，要进行多个稀释度的检测，并且检测的精确度和灵敏度较差，需要消耗很长的时间才能得到检测结果，因此这种方法效率不高，操作过程繁琐。

近年来，随着生物技术的飞速发展，大肠杆菌的检测技术也有了新的进步和发展。目前已经研究出来的新检测方法主要有荧光免疫检测技术(FIA)和以及酶联免疫吸附分析检测技术(ELISA)。荧光免疫检测技术是用荧光物质标记于抗体(或抗原)，跟对应的抗原(或抗体)结合后，测量其荧光强度，推算待测物质的浓度。采用该法来检测葡萄酒中的大肠杆菌O157：H7，可在6h内测出大肠杆菌O157：H7(10-105，cfu/mL)。这种检测方法具有灵敏度高，无放射性污染，操作流程短，标记物制备方便，检测重复性好，标准曲线线性范围宽等优点，是一种具有广阔应用前景的免疫标记分析方法。酶联免疫吸附分析法是将抗原或抗体吸附于固相载体，并且在载体上进行免疫酶染色，底物显色后，通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量。该方法操作简单，特异性强，反应灵敏准确，标记物稳定性好，在大肠杆菌的快速检测中应用较多。但是，上述两种新方法均需要专业且昂贵的检测仪器来对检测过程进行表征，并且需要专业性很强的人士来进行实验操作，因此这些方法并不利于普及推广。

电化学检测法作为一种高效，简单，快速，准确的分析检测方法，在分析检测领域引起了人们的广泛关注。其原理是大肠杆菌与所制备的电化学传感器进行偶联后，通过电信号的变化来进行大肠杆菌的定量检测。这种技术结合了化学，生物学，物理学以及电化学等学科。相对于传统检测方法，电化学检测过程中所制备的传感器具有组装简单，分辨率高，检测时间短，所需样品少，细胞损伤小等优点。因此，电化学传感器在医药工业，食品检测和环境保护等诸多领域拥有广阔的应用前景。综上所述，开发新型电化学大肠杆菌检测传感器并应用于大肠杆菌的检测，具有非常重要的实际意义和应用价值。

发明内容

针对现有大肠杆菌检测技术的不足，本发明要解决的主要技术问题是，开发一种新型的大肠杆菌电化学传感器。该传感器具有很好的灵敏性和准确性，适用于大肠杆菌检测分析技术。其检测速度，灵敏度和准确性均优于传统荧光检测方法，并且制备工艺简单，检测条件温和，适用性好，便于推广应用。

本发明解决所述大肠杆菌电化学传感器的技术方案是，通过在玻碳电极表面的羧基化和生物偶联技术将大肠杆菌连接在玻碳电极表面，制备大肠杆菌电化学传感器。以玻碳电极为基底，先在其表面进行氢氧化钠蚀刻使其羧基化，然后将大肠杆菌偶联在电极表面，其中偶联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。其特征在于，获得高灵敏度的大肠杆菌电化学传感器。这种传感器稳定性好，检测灵敏度高，准确性好，其检测效率明显优于传统检测方法。

本发明解决所述大肠杆菌电化学传感器的技术方案是，通过在玻碳电极表面的羧基化和生物偶联技术将大肠杆菌连接在玻碳电极表面，制备检测灵敏度高，准确性强，检测速度快的大肠杆菌电化学传感器。该制备方法包括：

1.大肠杆菌电化学传感器的制备包括下面两个步骤：

1.1玻碳电极的羧基化：玻碳电极在使用前应进行预处理。将玻碳电极在粒径为50nm的氧化铝泥浆中抛光处理1-30min，然后在0.1-1.0mol/L硝酸，无水乙醇和超纯水中依次超声清洗1-10min，最后用高纯氮气吹干电极表面。处理干净后的玻碳电极在0.01-1.0mol/L硫酸溶液中通过电化学工作站进行循环伏安法活化，符合要求后，在超纯水中浸泡备用。将上述处理好的玻碳电极，浸入0.01～2mol/L氢氧化钠溶液中进行表面羧基化，采用循环伏安法扫描1-100圈，扫描速度为10～200mV/s，扫描范围-2～2V.

1.2大肠杆菌的偶联：先取培育完成的一定浓度的大肠杆菌溶液0.1～100μL和0.01～5mL EDC/NHS偶联剂加入离心管中，然后将上述羧基化后的玻碳电极置于管内溶液中，在10～50℃下水浴0.1-5h。完成后将玻碳电极取出，用0.01～1.0mol/L，pH为7.0～9.0的Tris-HCl缓冲液清洗电极表面，即完成了大肠杆菌在电极表面的偶联，从而得到大肠杆菌电化学传感器。

2.传感器电化学信号检测

采用循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)进行检测，以玻碳电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，应用电化学工作站表征不同浓度大肠杆菌连接电极的差分脉冲伏安曲线。检测底液如无特别说明均为0.01～1.0mol/L的Tris～HCl缓冲液(pH＝7.0～9.0)，扫描电位-0.8～0.8V，扫描速度为10～100mV/s。观察峰型变化，记录还原峰电流值。

附图说明

图1为大肠杆菌电化学传感器组装示意图

图2为大肠杆菌偶联前后玻碳电极在铁氰化钾溶液中的循环伏安图：a.裸玻碳电极；b.羧基化的玻碳电极；c.偶联大肠杆菌后的玻碳电极

图3同一检测条件下不同浓度大肠杆菌溶液的差分脉冲伏安图：a.4.8×10²cfu/ml；b.6.4×10³cfu/ml；c.1.28×10⁴cfu/ml；d.1.6×10⁵cfu/ml；e.1.92×10⁶cfu/ml

具体实施方式：

下面结合实施例及其附图进一步叙述本发明。

本发明设计的大肠杆菌电化学传感器，其特征在于通过在玻碳电极表面的羧基化和生物偶联技术将大肠杆菌连接在玻碳电极表面，制备大肠杆菌电化学传感器。以玻碳电极为基底，先在其表面进行氢氧化钠蚀刻使其羧基化，然后将大肠杆菌偶联在电极表面，其中偶联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS).

实施例1

1.大肠杆菌电化学传感器的制备包括下面两个步骤：

1.1玻碳电极的羧基化：玻碳电极在使用前应进行预处理。将玻碳电极在粒径为50nm的氧化铝泥浆中抛光处理5min，然后在0.1mol/L硝酸，无水乙醇和超纯水中依次超声清洗1min，最后用高纯氮气吹干电极表面。处理干净后的玻碳电极在0.1mol/L硫酸溶液中通过电化学工作站进行循环伏安法活化，符合要求后，在超纯水中浸泡备用。将上述处理好的玻碳电极，浸入0.05mol/L氢氧化钠溶液中进行表面羧基化，采用循环伏安法扫描1圈，扫描速度为50mV/s，扫描范围-0.1～1.4V.

1.2大肠杆菌的偶联：先取培育完成的一定浓度的大肠杆菌溶液5μL和0.1mL EDC/NHS偶联剂加入离心管中，然后再将上述羧基化后的玻碳电极置于管内溶液中，在25℃下水浴1h。完成后将玻碳电极取出，用0.01mol/L，pH为7.2的Tris-HCl缓冲液清洗电极表面，即完成了大肠杆菌在电极表面的偶联，从而得到大肠杆菌电化学传感器。

2.传感器电化学信号检测

采用循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)进行检测，以玻碳电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，应用电化学工作站表征不同浓度大肠杆菌连接电极的差分脉冲伏安曲线。检测底液为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.0)，扫描电位-0.8～0.8V，扫描速度为20mV/s。观察峰型变化，记录还原峰电流值。

实施例2

1.大肠杆菌电化学传感器的制备包括下面两个步骤：

1.1玻碳电极的羧基化：玻碳电极在使用前应进行预处理。将玻碳电极在粒径为50nm的氧化铝泥浆中抛光处理10min，然后在1.0mol/L硝酸，无水乙醇和超纯水中依次超声清洗3min，最后用高纯氮气吹干电极表面。处理干净后的玻碳电极在1.0mol/L硫酸溶液中通过电化学工作站进行循环伏安法活化，符合要求后，在超纯水中浸泡备用。将上述处理好的玻碳电极，浸入1mol/L氢氧化钠溶液中进行表面羧基化，采用循环伏安法扫描5圈，扫描速度为100mV/s，扫描范围-0.5～1.5V.

1.2大肠杆菌的偶联：先取培育完成的一定浓度的大肠杆菌溶液20μL和2mL EDC/NHS偶联剂加入离心管中，然后再将上述羧基化后的玻碳电极置于管内溶液中，在35℃下水浴2h。完成后将玻碳电极取出，用0.05mol/L，pH为7.0的Tris-HCl缓冲液清洗电极表面，即完成了大肠杆菌在电极表面的偶联，从而得到大肠杆菌电化学传感器。

2.传感器电化学信号检测

采用循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)进行检测，以玻碳电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，应用电化学工作站表征不同浓度大肠杆菌连接电极的差分脉冲伏安曲线。检测底液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.2)，扫描电位-0.8～0.8V，扫描速度为40mV/s。观察峰型变化，记录还原峰电流值。

实施例3

1.大肠杆菌电化学传感器的制备包括下面两个步骤：

1.1玻碳电极的羧基化：玻碳电极在使用前应进行预处理。将玻碳电极在粒径为50nm的氧化铝泥浆中抛光处理10min，然后在0.5mol/L硝酸，无水乙醇和超纯水中依次超声清洗6min，最后用高纯氮气吹干电极表面。处理干净后的玻碳电极在0.5mol/L硫酸溶液中通过电化学工作站进行循环伏安法活化，符合要求后，在超纯水中浸泡备用。将上述处理好的玻碳电极，浸入1mol/L氢氧化钠溶液中进行表面羧基化，采用循环伏安法扫描10圈，扫描速度为150mV/s，扫描范围-1～2V.

1.2大肠杆菌的偶联：先取培育完成的一定浓度的大肠杆菌溶液50μL和5mL EDC/NHS偶联剂加入离心管中，然后再将上述羧基化后的玻碳电极置于管内溶液中，在45℃下水浴0.5h。完成后将玻碳电极取出，用0.02mol/L，pH为7.5的Tris-HCl缓冲液清洗电极表面，即完成了大肠杆菌在电极表面的偶联，从而得到大肠杆菌电化学传感器。

2.传感器电化学信号检测

采用循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)进行检测，以玻碳电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，应用电化学工作站表征不同浓度大肠杆菌连接电极的差分脉冲伏安曲线。检测底液为0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.2)，扫描电位-0.8～0.8V，扫描速度为80mV/s。观察峰型变化，记录还原峰电流值。

Claims

1.一种大肠杆菌电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)玻碳电极的羧基化：将玻碳电极浸入一定浓度的氢氧化钠溶液中，采用循环伏安法在一定的扫描速度和范围内扫描1-100圈进行电极表面羧基化；

(2)大肠杆菌的偶联：先取一定体积的大肠杆菌溶液和一定体积的偶联剂加入离心管中，然后将羧基化后的玻碳电极置于管内溶液中，在10～50℃下水浴0.1-5h，完成后将玻碳电极取出，用0.01～1.0mol/L,pH为6.0～9.0的Tris-HCl缓冲液清洗电极表面，即完成了大肠杆菌在电极表面的偶联，从而得到大肠杆菌电化学传感器，偶联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述传感器的电化学信号检测方法如下：采用循环伏安法和差分脉冲伏安法进行检测，以玻碳电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，应用电化学工作站表征不同浓度大肠杆菌连接电极的差分脉冲伏安曲线；检测底液均为Tris～HCl缓冲液，在一定的扫描电位和扫描速度下进行扫描，观察峰型变化，记录还原峰电流值。

3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌电化学传感器的制备方法，其特征在于，在步骤(1)之前，还对玻碳电极表面进行预处理，以去除玻碳电极表面的杂质并进行羧基化：先将玻碳电极在粒径为50nm的氧化铝泥浆中抛光处理1-30min，然后在0.1-1.0mol/L硝酸，无水乙醇和超纯水中依次超声清洗1-10min，最后用高纯氮气吹干电极表面；处理干净后的玻碳电极在0.01-1.0mol/L硫酸溶液中通过电化学工作站进行循环伏安法活化，符合要求后，在超纯水中浸泡备用。

4.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌电化学传感器的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，氢氧化钠溶液为0.01～2mol/L，循环伏安法的扫描速度为10～200mV/s，扫描范围为-2～2V。

5.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌电化学传感器的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，取0.1～100μL大肠杆菌溶液和0.01～5mL EDC/NHS偶联剂加入离心管。

6.根据权利要求2所述的大肠杆菌电化学传感器的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，采用循环伏安法和差分脉冲伏安法进行检测，检测底液均为0.01～1.0mol/L的Tris～HCl缓冲液，pH为7.0～9.0，扫描电位-0.8～0.8V，扫描速度为10～100mV/s。

7.一种如权利要求1-6任一项所述的方法制备的大肠杆菌电化学传感器。