CN103207218B - 电化学免疫传感器制备方法及其用于猪链球菌的检测方法 - Google Patents
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Abstract
电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：用纳米金修饰玻碳电极，然后用缓冲溶液洗涤后晾干，将猪链球菌2型抗体1滴涂于所述玻碳电极表面，4℃过夜，再将所述玻碳电极在牛血清白蛋白溶液中浸泡即得电化学免疫传感器。本发明电化学免疫传感器制备方法简单，使用方便，用于猪链球菌2型的检测方法简便易行，灵敏度高，响应时间短且检测成本低，检测结果准确、可靠，为心血管疾病的诊治创造了重要条件。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学免疫传感器，尤其涉及一种电化学免疫传感器的制备方法及其用于猪链球菌2型抗原的检测方法。
背景技术
猪链球菌(S. suis)是一种重要的人畜共患病原菌，表现为急性出血性败血症、心内膜炎、脑膜炎、关节炎、哺乳仔猪下痢和孕猪流产等。猪链球菌感染不仅可致猪败血症肺炎、脑膜炎、关节炎及心内膜炎，而且可感染特定人群发病，并致死亡，危害非常严重。猪链球菌病原体早已长期存在于猪群身上，因为外界环境发生的变化使得该病原体发生变异，从而突破种群障碍，通过伤口、消化道等途径传染给人。根据荚膜多糖(CPS)抗原成分不同，可以将猪链球菌分为35个血清型(1-34型和1/2型)。其中，猪链球菌2型(SS2)为最常见，也是毒力最强的血清型。猪链球菌是一种条件致病性病原菌，成年猪感染后一般不表现任何临床症状，但是，受到应激因素的刺激，往往会加剧发病率和死亡率。血清学调查或抗体水平监测有助于了解猪群中链球菌感染状况，为控制猪链球菌病提供科学的依据。
电化学免疫分析将分析化学与临床诊断相结合，利用抗原-抗体反应的特异性亲合作用建立了新型免疫分析技术，并广泛应用于临床各领域，是诊断疾病、疗效观察和医学科研的重要途径。然而，在临床检测中，通常对单个样品的检测成本较高，而批量的检测又会耽误病人的诊断时间，尤其对于心血管类急性疾病，快速准确的检测尤为重要。因此，基于对衡量标志物定量测定的要求，具有较高的灵敏度和短的响应时间的电流型免疫传感器逐渐成为人们关注的课题。
目前，用于猪链球菌2型检测的方法有ELISA、PCR、酶联免疫法、免疫色谱法及琼脂扩散试验等，但这些方法检测时间长，成本高，只适用于实验室诊断，不适合大量样品的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种电化学免疫传感器的制备方法，该电化学免疫传感器能够快速检测猪链球菌2型抗原。
本发明的另一个目的在于提供上述电化学免疫传感器用于猪链球菌2型的检测方法。
本发明的目的是这样实现的，电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：用纳米金修饰玻碳电极，然后用缓冲溶液洗涤后晾干，将猪链球菌2型抗体1滴涂于所述玻碳电极表面，4 ℃过夜，再将所述玻碳电极在牛血清白蛋白（BSA）溶液中浸泡即得电化学免疫传感器。
上述玻碳电极用纳米金修饰前依次经1.0，0.3和0.05 μm 的Al2O3糊抛光后用蒸馏水冲洗干净，再分别在蒸馏水、丙酮、蒸馏水中超声洗涤、晾干。
上述猪链球菌2型抗体1的浓度为70 ug/mL，用量为10 uL。
上述牛血清白蛋白（BSA）溶液的浓度为0.25 wt.%。
上述修饰电极在牛血清白蛋白（BSA）溶液中浸泡时间为2 h。
本发明的另一个目的是这样实现的，上述电化学免疫传感器用于猪链球菌2型的检测方法，其特征在于，
1）合成羧基二茂铁纳米球（nFc）；
2）制备羧基二茂铁纳米球功能化石墨烯（nFc/Gr）；
3）制备生物耦合物；
4）将上述电化学免疫传感器浸泡在待测猪链球菌2型样品中孵育40 min，再将制备好的生物耦合物滴涂于其玻碳电极表面，1 h 后洗去未结合的生物耦合物，在pH= 6.5的磷酸盐缓冲液（PBS）中加入2 mm 抗坏血酸作为测试底液，用示差脉冲伏安法（DPV）进行检测，其峰电流的大小与浓度有关，从而可求得待测样品中的猪链球菌2型抗原的浓度。
上述合成羧基二茂铁纳米球（nFc）为取0.1 g 羧基二茂铁粉末溶于25 mL 无水乙醇中，再在超声条件下以 30 mL/min 速度加入125 mL 去离子水，然后在超声条件下放置25 min，最后用去离子水洗涤、干燥。
上述制备羧基二茂铁纳米球功能化石墨烯（nFc/Gr）为先将5 mg 石墨烯分散在5 mL聚醚酰亚胺 (PEI)溶液中，在135 ℃ 下回流3 h，用去离子水离心洗涤两次，然后将其分散在pH=7.4的磷酸盐缓冲液 中，再用摩尔比为4:1的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）活化羧基二茂铁纳米球（nFc）表面的羧基，然后洗涤三次以分离多余的EDC/NHS，再将已活化的羧基二茂铁纳米球（nFc） 纳米球与PEI功能化石墨烯（PEI-Graphene）溶液在室温下混合，搅拌4 h，经去离子水离心洗涤分离得羧基二茂铁纳米球功能化石墨烯的复合物（nFc/Gr），将其分散在pH=7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
上述制备生物耦合物为先将500 ng/mL 的猪链球菌2型抗体2 （Ab2）500 μL加入上述羧基二茂铁纳米球功能化石墨烯的复合物（nFc/Gr）中，冰浴搅拌12 h，离心分离，再加入过量的牛血清白蛋白（BSA）溶液，冰浴搅拌5 h，离心分离制得Ab2-nFc/Gr生物耦合物。
本发明具有如下有益效果：
1、 本发明电化学免疫传感器制备方法简单，制备成本低，制备的电化学免疫传感器结构简单，使用方便。
2、 本发明制备的电化学免疫传感器用于猪链球菌2型的检测方法简便易行，灵敏度高、响应时间短且检测成本低，实现了临床对猪链球菌2型个体抗原的快速检测。
3、 本发明电化学免疫传感器用于猪链球菌2型的检测结果与采酶联免疫法的检测结果一致，样品回收率接近100%，证明本发明的检测结果是准确的、可靠的。
4、本发明为心血管疾病的诊治创造了重要条件。
附图说明
图1为本发明实施例猪链球菌2型浓度（Concentration of SS2）与电流（Current）响应线性图。
具体实施方式
实施例，电化学免疫传感器的制备方法，先将玻碳电极用纳米金修饰前依次经1.0μm、0.3μm和0.05 μm 的Al2O3糊抛光后用蒸馏水冲洗干净，再分别在蒸馏水、丙酮、蒸馏水中超声洗涤、晾干；然后用纳米金修饰玻碳电极，再用缓冲溶液PBS洗涤后晾干，将10 uL浓度为70 ug/mL的猪链球菌2型抗体1滴涂于修饰后的玻碳电极表面，4 ℃过夜，再在浓度为0.25 wt.%的牛血清白蛋白（BSA）溶液中浸泡2 h即得电化学免疫传感器。
本实施例电化学免疫传感器用于猪链球菌2型的检测方法如下：
1）合成羧基二茂铁纳米球（nFc）。取0.1 g 羧基二茂铁粉末溶于25 mL 无水乙醇中，再在超声条件下以 30 mL/min 速度加入125 mL 去离子水，然后在超声条件下放置25 min，最后用去离子水洗涤、干燥。
2）制备羧基二茂铁纳米球功能化石墨烯（nFc/Gr）。先将5 mg 石墨烯分散在5 mL聚醚酰亚胺 (PEI)溶液中，在135 ℃ 下回流3 h，用去离子水离心洗涤两次，然后将其分散在pH=7.4的磷酸盐缓冲液 中，再用摩尔比为4:1的EDC/NHS活化羧基二茂铁纳米球（nFc）表面的羧基，然后洗涤三次以分离多余的EDC/NHS，再将已活化的羧基二茂铁纳米球（nFc） 纳米球与PEI功能化石墨烯（PEI-Graphene）溶液在室温下混合，搅拌4 h，经去离子水离心洗涤分离得羧基二茂铁纳米球功能化石墨烯的复合物（nFc/Gr），将其分散在pH=7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
3）制备生物耦合物。先将500 ng/mL 的猪链球菌2型抗体2 （Ab2）500 μL加入上述羧基二茂铁纳米球功能化石墨烯的复合物（nFc/Gr）中，冰浴搅拌12 h，离心分离，再加入过量的牛血清白蛋白（BSA）溶液，冰浴搅拌5 h，离心分离制得Ab2-nFc/Gr生物耦合物。
4）将电化学免疫传感器分别浸泡在待测样品Ⅰ、样品Ⅱ、样品Ⅲ中孵育40 min，再将制备好的生物耦合物滴涂于其玻碳电极表面，1 h 后洗去未结合的生物耦合物，在pH= 6.5的磷酸盐缓冲液（PBS）中加入2 mm 抗坏血酸作为测试底液，用示差脉冲伏安法（DPV）进行检测，根据图1求得猪链球菌2型抗原的浓度，检测结果见下表1。
为了验证本发明电化学免疫传感器检测猪链球菌2型的准确性，将样品Ⅰ、样品Ⅱ、样品Ⅲ采用酶联免疫法进行检测，检测结果见下表1。
表1 本实施例三种样品中猪链球菌2型抗原的检测结果
通过表1中的数据可以看出，采用电化学免疫传感器检测猪链球菌2型的检测结果与采用酶联免疫法的检测结果非常接近；与三种样品的标准浓度相比，本实施例三种样品的回收率分别为104%，102.8%，97.45%,证明本发明电化学免疫传感器用于检测测猪链球菌2型的检测方法是准确的、可靠的。
猪链球菌2型抗原序列
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甲胎蛋白（AFP）序列
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Claims (4)
1.电化学免疫传感器用于猪链球菌的检测方法，包括电化学免疫传感器的制备和猪链球菌的检测两部分，其特征在于：
电化学免疫传感器的制备：
用纳米金修饰玻碳电极，然后用缓冲溶液洗涤后晾干，将猪链球菌2型抗体1滴涂于所述玻碳电极表面，4 ℃过夜，再将所述玻碳电极在牛血清白蛋白溶液中浸泡即得电化学免疫传感器；所述玻碳电极用纳米金修饰之前依次经1.0μm、0.3μm和0.05 μm 的Al2O3糊抛光后用蒸馏水冲洗干净，再分别在蒸馏水、丙酮、蒸馏水中超声洗涤、晾干；所述猪链球菌2型抗体1的浓度为70 ug/mL，用量为10 uL；所述牛血清白蛋白溶液的浓度为0.25 wt.%；所述修饰电极在牛血清白蛋白溶液中浸泡时间为2h；
电化学免疫传感器用于猪链球菌的检测：
1）合成羧基二茂铁纳米球；
2）制备羧基二茂铁纳米球功能化石墨烯；
3）制备生物耦合物；
4）将所述电化学免疫传感器浸泡在待测猪链球菌2型样品中孵育40 min，再将制备好的生物耦合物滴涂于其玻碳电极表面，1 h 后洗去未结合的生物耦合物，在pH= 6.5的磷酸盐缓冲液中加入2 mm 抗坏血酸作为测试底液，用示差脉冲伏安法进行检测；所述制备羧基二茂铁纳米球功能化石墨烯为先将5 mg 石墨烯分散在5 mL聚醚酰亚胺溶液中，在135 ℃ 下回流3 h，用去离子水离心洗涤两次，然后将其分散在pH=7.4的磷酸盐缓冲液 中，再用摩尔比为4:1的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺活化羧基二茂铁纳米球表面的羧基，然后洗涤三次以分离多余的EDC/NHS，再将已活化的羧基二茂铁纳米球与聚醚酰亚胺功能化石墨烯溶液在室温下混合，搅拌4 h，经去离子水离心洗涤分离得羧基二茂铁纳米球功能化石墨烯的复合物,将其分散在pH=7.4的磷酸盐缓冲液中。
2.如权利要求1所述的电化学免疫传感器用于猪链球菌的检测方法，其特征在于：所述合成羧基二茂铁纳米球为取0.1 g 羧基二茂铁粉末溶于25 mL 无水乙醇中，再在超声条件下以 30 mL/min 速度加入125 mL 去离子水，然后在超声条件下放置25 min，最后用去离子水洗涤、干燥。
3.如权利要求1或2所述的电化学免疫传感器用于猪链球菌的检测方法，其特征在于： 所述制备生物耦合物为先将500 ng/mL 的猪链球菌2型抗体2用量为 500 μL加入所述羧基二茂铁纳米球功能化石墨烯的复合物中，冰浴搅拌12 h，离心分离，再加入过量的牛血清白蛋白溶液，冰浴搅拌5 h，离心分离制得生物耦合物。
4.如权利要求1所述的电化学免疫传感器用于猪链球菌的检测方法，所述制备生物耦合物为先将500 ng/mL 的猪链球菌2型抗体2 用量为500 μL加入所述羧基二茂铁纳米球功能化石墨烯的复合物中，冰浴搅拌12 h，离心分离，再加入过量的牛血清白蛋白溶液，冰浴搅拌5 h，离心分离制得生物耦合物。
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