CN109342745A - 一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的构建方法及应用 - Google Patents

一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的制备方法。采用电沉积金为基底，PdCu@GO作为乙型肝炎病毒检测抗体标记物构建电化学免疫传感器，实现了对乙型肝炎病毒的定量检测，具有特异性强，灵敏度高，检测限低等优点，对乙型肝炎的检测具有重要的科学意义和应用价值。

Description

一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的构建方法及 应用
技术领域
本发明属于新型纳米复合材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的构建方法，应用于乙型肝炎病毒标志物的检测。
背景技术
乙型肝炎病毒感染是最受关注的健康问题之一，它可引发位居全球癌症死亡率第二名的肝癌。乙型肝炎病毒是乙型肝炎的致病因子，对人体危害很大，因而要求检测方法灵敏、快速、准确。近年来，由于电化学仪器使用方便，检测迅速，乙肝电化学免疫传感器的研究备受关注，用于乙肝病毒的定量检测。
夹心型电化学免疫传感器是集生物传感与电化学分析于一体，基于抗原和抗体特异性结合的一种分析方法，具有灵敏度高、检测限低和制备成本低的优点，对肿瘤标志物的实际检测具有重要价值。
本发明利用层层自组装技术，以电沉积金为基底，以PdCu@GO作为检测抗体标记物构建的一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器，具有检测范围、检测下限低、操作简单、检测速度快等优点，并且具有良好的重现性、稳定性和选择性，对乙型肝炎的早期诊断具有重要的应用价值。
发明内容
本发明提供了一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的构建方法及应用，实现了对乙型肝炎病毒标志物的灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的构建方法。
本发明的目的之二是将所制备的一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器用于乙型肝炎病毒标志物的检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤。
1. 一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的构建方法，步骤如下：
（1）将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）利用计时电流法，在-0.2 V下，将抛光好的玻碳电极置于5.0 mL、2.0 wt% ~ 3.0wt%的氯金酸溶液中，电镀25 ~ 35 s，在电极表面形成电沉积金薄膜，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（3）将6.0 µL、5.0 ~ 15.0 µg/mL的乙型肝炎病毒标志物捕获抗体滴加到电极表面，4℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1 ~ 2 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0 µL、20 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎病毒标志物抗原溶液，4 ℃冰箱中干燥；
（6）将6.0 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的PdCu@GO/检测抗体孵化物分散液滴涂于电极表面，在4 ℃冰箱中静置40 min，用pH=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，4 ℃干燥，制得一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器。
2. 一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的构建方法，所述相关材料的制备，步骤如下：
（1）PdCu@GO分散液的制备
① PdCu中空纳米立方的制备
将PdCl2水溶液（1.5 ~ 4.5 mL，6.7 mg/mL），CuSO4·5H2O（15 ~ 45 mg）和谷氨酸（50 ~150 mg）加入到40 ~ 120 mL乙二醇（EG）中，通过加入8.0 wt％的KOH/EG溶液，将pH值调节至约13，将悬浮液转移到不锈钢高压釜中并在160 ℃下加热7 h，离心洗涤得到中空PdCu纳米立方体分散液；
② 氧化石墨烯的制备
将5 ~ 15 g石墨和3.5 ~ 10.5 g硝酸钠置于烧瓶中，在冰浴搅拌下加入350 ~ 1050mL硫酸，剧烈搅拌下加入10 ~ 30 g高锰酸钾，并将烧瓶在室温下保持6天，然后向混合物中加入硫酸（200 ~ 600 mL，5 wt％），并在98 ℃下保持2 h，当温度降至50 ℃时，加入双氧水（10 ~ 30 mL，30 wt％）终止反应，离心洗涤，收集沉淀并冷冻干燥2天；
③ PdCu@GO的制备
向10.0 mg制备的氧化石墨烯加入5.0 mL ~ 15.0 mL制备的PdCu中空纳米立方分散液（1.0 mg/mL），然后将混合物超声1 h，离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0 mL缓冲溶液（pH=7.4）中；
（2）PdCu@GO/检测抗体HBs-Ab2孵化物分散液的制备
取2.0 ~ 6.0 mg的PdCu@GO分散液，加入1.0 ~ 2.0 mL、20 ~ 30 µg/mL的乙型肝炎病毒标志物检测抗体分散液，置于4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化6.0 ~ 8.0 h后，在3000rpm转速下离心5.0 ~ 10.0 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH=7.0磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，加入1.0 mL、pH=7.0磷酸盐缓冲溶液，分散均匀，得到PdCu@GO/检测抗体孵化物分散液，4 ℃下保存。
3. 如权利要求1所述的构建方法构建的一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器，用于乙型肝炎病毒标志物抗原的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站，在三电极体系下进行测试，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，以所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL包含5.0 mmol/L过氧化氢溶液、2.0 mmol/L邻苯二胺溶液的pH 5.2 ~ 8.4磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）利用差分脉冲伏安法对乙型肝炎病毒标志物抗原进行检测，扫描范围为0.0 ~ 0.6V，脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为50 ms，脉冲周期为50 ms，记录电流峰值；
（3）记录不同浓度下的乙型肝炎病毒标志物抗原所对应的电流峰值；
（4）利用工作曲线法，得到待测样品中乙型肝炎病毒标志物抗原的浓度。
本发明所用的原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）本发明利用电沉积金薄膜作为基底材料，可以有效增加电极表面的电子传递效率，同时，金纳米粒子具有良好的生物相容性，可以稳定结合大量的捕获抗体，从而提高电化学免疫传感器的灵敏度；
（2）本发明采用PdCu@GO作为检测抗体标记物用于免疫传感器的构建。PdCu中空纳米立方具有优良的导电性，同时可以增加催化活性位点，双金属纳米颗粒具有协同催化作用，可以有效地放大信号。氧化石墨烯具有大的比表面积，优良的导电性。PdCu@GO纳米复合材料不仅具有优良的导电性，而且具有协同放大催化信号的作用，因此可以增大免疫传感器的灵敏度；
（3）一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器对不同乙型肝炎病毒标志物的检测，其对乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag的线性检测范围是20 fg/mL ~ 100 ng/mL，最低检测下限为6.7 fg/mL；对乙型肝炎病毒e抗原HBe-Ag的线性检测范围是0.1 pg/mL ~ 50 ng/mL，最低检测下限为0.03 pg/mL；对乙型肝炎病毒核心抗原HBc-Ag的线性检测范围是0.03 pg/mL ~ 60 ng/mL，最低检测下限为0.01 pg/mL；表明一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器可以达到精确定量检测乙型肝炎病毒标志物的目的。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1 一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的构建方法
（1）将直径为3.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）利用计时电流法，在-0.2 V下，将抛光好的玻碳电极置于5.0 mL、2.0 wt%的氯金酸溶液中，电镀25 s，在电极表面形成电沉积金薄膜，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（3）将6.0 µL、5.0 µg/mL的乙型肝炎病毒标志物捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0 µL、20 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎病毒标志物抗原溶液，4 ℃冰箱中干燥；
（6）将6.0 µL、1.0 mg/mL的PdCu@GO/检测抗体孵化物分散液滴涂于电极表面，在4 ℃冰箱中静置40 min，用pH=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，4 ℃干燥，制得一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器。
实施例2 一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的构建方法
（1）将直径为4.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）利用计时电流法，在-0.2 V下，将抛光好的玻碳电极置于5.0 mL、2.5 wt%的氯金酸溶液中，电镀30 s，在电极表面形成电沉积金薄膜，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（3）将6.0 µL、10.0 µg/mL的乙型肝炎病毒标志物捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.5 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0 µL、20 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎病毒标志物抗原溶液，4 ℃冰箱中干燥；
（6）将6.0 µL、2.0 mg/mL的PdCu@GO/检测抗体孵化物分散液滴涂于电极表面，在4 ℃冰箱中静置40 min，用pH=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，4 ℃干燥，制得一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器。
实施例3 一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的构建方法
（1）将直径为5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）利用计时电流法，在-0.2 V下，将抛光好的玻碳电极置于5.0 mL、3.0 wt%的氯金酸溶液中，电镀35 s，在电极表面形成电沉积金薄膜，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（3）将6.0 µL、15.0 µg/mL的乙型肝炎病毒标志物捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、2 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0 µL、20 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎病毒标志物抗原溶液，4 ℃冰箱中干燥；
（6）将6.0 µL、3.0 mg/mL的PdCu@GO/检测抗体孵化物分散液滴涂于电极表面，在4 ℃冰箱中静置40 min，用pH=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，4 ℃干燥，制得一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器。
实施例4 所述PdCu@GO分散液的制备
① PdCu中空纳米立方的制备
将PdCl2水溶液（1.5 mL，6.7 mg/mL），CuSO4·5H2O（15 mg）和谷氨酸（50 mg）加入到40mL乙二醇（EG）中，通过加入8.0 wt％的KOH/EG溶液，将pH值调节至约13，将悬浮液转移到不锈钢高压釜中并在160 ℃下加热7 h，离心洗涤得到中空PdCu纳米立方体分散液；
② 氧化石墨烯的制备
将5 g石墨和3.5 g硝酸钠置于烧瓶中，在冰浴搅拌下加入350 mL硫酸，剧烈搅拌下加入10 g高锰酸钾，并将烧瓶在室温下保持6天，然后向混合物中加入硫酸（200 mL，5 wt％），并在98 ℃下保持2 h，当温度降至50 ℃时，加入双氧水（10 mL，30 wt％）终止反应，离心洗涤，收集沉淀并冷冻干燥2天；
③ PdCu@GO的制备
向10.0 mg制备的氧化石墨烯加入5.0 mL制备的PdCu中空纳米立方分散液（1.0 mg/mL），然后将混合物超声1 h，离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0 mL缓冲溶液（pH=7.4）中。
实施例5 所述PdCu@GO分散液的制备
① PdCu中空纳米立方的制备
将PdCl2水溶液（3.0 mL，6.7 mg/mL），CuSO4·5H2O（30 mg）和谷氨酸（100 mg）加入到80mL乙二醇（EG）中，通过加入8.0 wt％的KOH/EG溶液，将pH值调节至约13，将悬浮液转移到不锈钢高压釜中并在160 ℃下加热7 h，离心洗涤得到中空PdCu纳米立方体分散液；
② 氧化石墨烯的制备
将10 g石墨和7.0 g硝酸钠置于烧瓶中，在冰浴搅拌下加入700 mL硫酸，剧烈搅拌下加入20 g高锰酸钾，并将烧瓶在室温下保持6天，然后向混合物中加入硫酸（400 mL，5 wt％），并在98 ℃下保持2 h，当温度降至50 ℃时，加入双氧水（20 mL，30 wt％）终止反应，离心洗涤，收集沉淀并冷冻干燥2天；
③ PdCu@GO的制备
向10.0 mg制备的氧化石墨烯加入10.0 mL制备的PdCu中空纳米立方分散液（1.0 mg/mL），然后将混合物超声1 h，离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0 mL缓冲溶液（pH=7.4）中。
实施例6 所述PdCu@GO分散液的制备
① PdCu中空纳米立方的制备
将PdCl2水溶液（4.5 mL，6.7 mg/mL），CuSO4·5H2O（45 mg）和谷氨酸（150 mg）加入到120 mL乙二醇（EG）中，通过加入8.0 wt％的KOH/EG溶液，将pH值调节至约13，将悬浮液转移到不锈钢高压釜中并在160 ℃下加热7 h，离心洗涤得到中空PdCu纳米立方体分散液；
② 氧化石墨烯的制备
将15 g石墨和10.5 g硝酸钠置于烧瓶中，在冰浴搅拌下加入1050 mL硫酸，剧烈搅拌下加入30 g高锰酸钾，并将烧瓶在室温下保持6天，然后向混合物中加入硫酸（600 mL，5wt％），并在98 ℃下保持2 h，当温度降至50 ℃时，加入双氧水（30 mL，30 wt％）终止反应，离心洗涤，收集沉淀并冷冻干燥2天；
③ PdCu@GO的制备
向10.0 mg制备的氧化石墨烯加入15.0 mL制备的PdCu中空纳米立方分散液（1.0 mg/mL），然后将混合物超声1 h，离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0 mL缓冲溶液（pH=7.4）中。
实施例7 所述PdCu@GO/检测抗体HBs-Ab2孵化物分散液的制备
取2.0 mg的PdCu@GO分散液，加入1.0 mL、20 µg/mL的乙型肝炎病毒标志物检测抗体分散液，置于4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化6.0 h后，在3000 rpm转速下离心5.0 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH=7.0磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，加入1.0 mL、pH=7.0磷酸盐缓冲溶液，分散均匀，得到PdCu@GO/检测抗体孵化物分散液，4 ℃下保存。
实施例8 所述PdCu@GO/检测抗体HBs-Ab2孵化物分散液的制备
取4.0 mg的PdCu@GO分散液，加入1.5 mL、25 µg/mL的乙型肝炎病毒标志物检测抗体分散液，置于4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化7.5 h后，在3000 rpm转速下离心7.5 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH=7.0磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，加入1.0 mL、pH=7.0磷酸盐缓冲溶液，分散均匀，得到PdCu@GO/检测抗体孵化物分散液，4 ℃下保存。
实施例9 所述PdCu@GO/检测抗体HBs-Ab2孵化物分散液的制备
取6.0 mg的PdCu@GO分散液，加入2.0 mL、30 µg/mL的乙型肝炎病毒标志物检测抗体分散液，置于4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化8.0 h后，在3000 rpm转速下离心10.0 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH=7.0磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，加入1.0 mL、pH=7.0磷酸盐缓冲溶液，分散均匀，得到PdCu@GO/检测抗体孵化物分散液，4 ℃下保存。
实施例10 所述一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器对乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag的检测
（1）使用电化学工作站，在三电极体系下进行测试，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，以所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL包含5.0 mmol/L过氧化氢溶液、2.0 mmol/L邻苯二胺溶液的pH =7.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）利用差分脉冲伏安法对分析物进行检测，扫描范围为0.0 ~ 0.6 V，脉冲振幅为50mV，脉冲宽度为50 ms，脉冲周期为50 ms，记录电流峰值；
（3）记录不同浓度下的乙型肝炎病毒标志物抗原所对应的电流峰值；
（4）利用工作曲线法，得到所述免疫传感器对乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag的线性检测范围是20 fg/mL ~ 100 ng/mL，最低检测下限为6.7 fg/mL。
实施例11 所述一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器对乙型肝炎病毒e抗原HBe-Ag的检测
按照实施例10的方法对乙型肝炎病毒e抗原HBe-Ag进行检测，其线性检测范围是0.1pg/mL ~ 50 ng/mL，最低检测下限为0.03 pg/mL。
实施例12 所述一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器对乙型肝炎病毒核心抗原HBc-Ag的检测
按照实施例10的方法对乙型肝炎病毒核心抗原HBc-Ag进行检测，其线性检测范围是0.03 pg/mL ~ 60 ng/mL，最低检测下限为0.01 pg/mL。

Claims (4)

1.一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的构建方法及应用
一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）利用计时电流法，在-0.2 V下，将抛光好的玻碳电极置于5.0 mL、2.0 wt% ~ 3.0wt%的氯金酸溶液中，电镀25 ~ 35 s，在电极表面形成电沉积金薄膜，用超纯水冲洗电极表面，室温下晾干；
（3）将6.0 µL、5.0 ~ 15.0 µg/mL的乙型肝炎病毒标志物捕获抗体滴加到电极表面，4℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1 ~ 2 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0 µL、20 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎病毒标志物抗原溶液，4 ℃冰箱中干燥；
（6）将6.0 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的PdCu@GO/检测抗体孵化物分散液滴涂于电极表面，在4 ℃冰箱中静置40 min，用pH=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，4 ℃干燥，制得一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器。
2.如权利要求1所述的一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的构建方法，所述相关材料的制备，包括以下几个步骤：
（1）PdCu@GO分散液的制备
① PdCu中空纳米立方的制备
将PdCl2水溶液（1.5 ~ 4.5 mL，6.7 mg/mL），CuSO4·5H2O（15 ~ 45 mg）和谷氨酸（50 ~150 mg）加入到40 ~ 120 mL乙二醇（EG）中，通过加入8.0 wt％的KOH/EG溶液，将pH值调节至约13，将悬浮液转移到不锈钢高压釜中并在160 ℃下加热7 h，离心洗涤得到中空PdCu纳米立方体分散液；
② 氧化石墨烯的制备
将5 ~ 15 g石墨和3.5 ~ 10.5 g硝酸钠置于烧瓶中，在冰浴搅拌下加入350 ~ 1050mL硫酸，剧烈搅拌下加入10 ~ 30 g高锰酸钾，并将烧瓶在室温下保持6天，然后向混合物中加入硫酸（200 ~ 600 mL，5 wt％），并在98 ℃下保持2 h，当温度降至50 ℃时，加入双氧水（10 ~ 30 mL，30 wt％）终止反应，离心洗涤，收集沉淀并冷冻干燥2天；
③ PdCu@GO的制备
向10.0 mg制备的氧化石墨烯加入5.0 ~ 15.0 mL制备的PdCu中空纳米立方分散液（1.0 mg/mL），然后将混合物超声1 h，离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0 mL缓冲溶液（pH=7.4）中；
（2）PdCu@GO/检测抗体HBs-Ab2孵化物分散液的制备
取2.0 ~ 6.0 mg的PdCu@GO分散液，加入1.0 ~ 2.0 mL、20 ~ 30 µg/mL的乙型肝炎病毒标志物检测抗体分散液，置于4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化6.0 ~ 8.0 h后，在3000rpm转速下离心5.0 ~ 10.0 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH=7.0磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，加入1.0 mL、pH=7.0磷酸盐缓冲溶液，分散均匀，得到PdCu@GO/检测抗体孵化物分散液，4 ℃下保存。
3.如权利要求1所述的构建方法构建的一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器，用于乙型肝炎病毒标志物抗原的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站，在三电极体系下进行测试，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，以所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL包含5.0 mmol/L过氧化氢溶液、2.0 mmol/L邻苯二胺溶液的pH 5.2 ~ 8.4磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）利用差分脉冲伏安法对乙型肝炎病毒标志物抗原进行检测，扫描范围为0.0 ~ 0.6V，脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为50 ms，脉冲周期为50 ms，记录电流峰值；
（3）记录不同浓度下的乙型肝炎病毒标志物抗原所对应的电流峰值；
（4）利用工作曲线法，得到待测样品中乙型肝炎病毒标志物抗原的浓度。
4.如权利要求1所述的一种基于PdCu@GO的夹心型电化学免疫传感器的构建方法构建的免疫传感器，用于乙型肝炎病毒标志物抗原的测定，其特征在于，所述病毒标志物选自下列之一：乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag、乙型肝炎病毒e抗原HBe-Ag、乙型肝炎病毒核心抗原HBc-Ag。
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